Teste Rápido

DESENVOLVIMENTO DE TESTES RÁPIDOS PARA TRIAGEM DE
JOVENS E ADULTOS CANDIDATOS A VACINAÇÃO PARA
HEPATITE A
VINÍCIUS DA MOTTA DE MELLO
Orientadora: Dra. Vanessa de Paula
Co – orientadora: Dra. Luciane Amado
Laboratório de Desenvolvimento Tecnológico em Virologia – IOC
Características do Vírus da Hepatite A (HAV)
 Família Picornaviridae;
 Gênero Hepatovirus;
 Capsídeo com simetria icosaédrica
(27 a 32 nm);
 Não envelopado;
(Fonte: http://www.ioc.fiocruz.br/noticia/2006/)
 RNA fita simples polaridade positiva;
 Suas proteínas estruturais são VP1,
VP2, VP3 e VP4.
(Fonte: http://www.prof2000.pt/)
Proteínas Estruturais do Capsídeo Viral
 Maior proteína formadora
do capsídeo viral;
 Proteína mais imunogênica
do vírus;
 Formadora do maior
epitomo de ligação de
anticorpos.
(Fonte: adaptado de MS, 2009; VIRALZONE,
2010; MARTIN & LEMON ,2006; HOLLINGER
& EMERSON,2007),
A infecção pelo HAV é considerada um problema de
saúde pública no Brasil.
 Transmissão fecal-oral;
(Fonte: http://pib.socioambiental.org)
 Pessoa-pessoa;
 Alimentação e água;
 Condições sanitárias, socioeconômicas e de higiene
precárias.
(Fonte: http://medicinanatural.blogspot.com.br)
Soroprevalência Mundial da Hepatite A
• 1,4 milhões de pessoas
foram infectadas pela
vírus no mundo (WHO,
2013).
Estimativa de
Soroprevalência de
Hepatite A
CDC, 2013
(Fonte adaptado:
http://www.cdc.gov/ncido
d/diseases/hepatitis/slid
eset/hep16.gif)
Alta
Intermediária
Baixa
Muito Baixa
Soroprevalência de Anti-HAV no Brasil
• Estudos feitos aproximadamente com
3.600 indivíduos (1 – 40 anos);
76,2%
• A doença se apresenta em diferentes
padrões de endemicidade no Brasil;
• Doença que atinge principalmente
crianças.
Prevalência anti-HAV
Intermediária
Baixa
55,7%
Ximenes et al., 2014
Deslocamento da Faixa Etária da Infecção pelo HAV
Gráfico 1: Casos de hepatite A por idade e ano, Brasil, 2000-2014
Casosassintomáticos
assintomáticos
Casos
Casos sintomáticos, com maior
índice de mortalidade.
(Fonte:
(Fonte:http://www.sorria.com.br/uma-crianca-muito-especial/)
http://www.sorria.com.br/uma-crianca-muito-especial/)
Boletim
Epidemiológico
Hepatites Virais, Ministério
(Fonte: http://www.espacodesaudevidaativa.com.br/pvbcm.htm)
da Saúde, 2015
Justificativa
 Atualmente é o teste padrão ouro para
diagnósticos sorológicos;
ELISA
Teste Rápido
 Seu resultado é mais demorado (Entre
4h a 5h);
 E necessitário um aparato laboratorial
para ser realizado.
(Fonte: http://www.bio-rad.com/en-us/product/elisaimmuno-explorer-kit
Teste Rápido
 Seu resultado se dá em poucos minutos (15 a
20 min);
 Não é necessário um aparato laboratorial para
ser realizado;
 Ajudaria no controle de surtos;
 Auxiliaria na avaliação da resposta vacinal;
 E também na ampliação das estratégias de
imunização nacional.
Objetivo
Desenvolver testes rápidos baseados na técnica
de imunocromatografia de fluxo lateral para
detecção de anticorpos anti-HAV.
Material e Métodos
Clonagem e
Expressão da
proteína VP1
em sistema
Bacteriano
(Escherichia
coli TOP10 e
BL21)
Purificação
e Dialise
das
proteínas
expressas
Caraterização
e avaliação
das Proteínas
(SDS-Page,
western
blotting, e dotblotting)
Testagem
dos
protótipos de
testes
rápidos
Resultados
Figura 1: CLONAGEM VP1 EM E. COLI TOP 10 E E. COLI BL21
Confirmação pET-TOPO/VP1
PCR do DNA plasmidial e Sequenciamento
A
PM
1Kb
Cl 49
PM
1Kb
B
CL 49
900pb
A - E. Coli TOP 10
900pb
B - E. Coli BL21
Resultados
Figura 2: PROTEÍNA VP1 EXPRESSA EM E. coli BL21
VP1 - 50,9 KDa
Western Blotting revelado com
soro anti-HAV reativo.
Eluições das proteínas:
D1 à D4 e H1 à H3
Pesos moleculares: BR = Broad
Range; BM = Benchmark
Resultados
Figura 3: PROTEÍNA VP1 PURIFICADA E DIALISADA
D
D
ÑD
BR
K
ÑD
ÑD
D
D
Western blotting revelado com
soro anti-HAV reativo.
VP1 - 50,9 KDa
Eluições das proteínas:
D = Dialisada; ÑD = Não Dialisada
Pesos moleculares: BR = Broad
Range; K = Kaleidoscope
Resultados
FIGURA 4: CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS PROTEÍNAS VP1 DO HAV
(DOT BLOTTING)
A
B
PBS
HAV
VP1
Avalição das proteínas pelo método de Dot blotting; controle negativo PBS (Vermelho), controle positivo HAV
(Amarelo), proteínas VP1 (Azul). A: Dot Blotting revelado com soro anti-HAV reativo; B: : Dot Blotting revelado
com soro anti-HAV negativo
Resultados
Avaliação dos protótipos de testes rápidos
Tabela 1: Avaliação dos protótipos de testes rápidos
Amostras Avaliadas
Nº de amostras testadas
Amostras (+)
Amostras (-)
Testes (+)
6
4
Testes (-)
1
3
Total de Testes utilizados
7
7
Conclusões
• Foi possível clonar e expressar a proteína recombinante VP1 do HAV em E.
Coli;
• Foi possível a expressão e caracterização das proteínas recombinantes de VP1;
• As proteínas foram imunogênicas nós protótipos de teste rápido, no entanto
não obtivemos uma boa sensibilidade e uma boa especificidade, mostrando
que o teste precisa ser melhorado.
Agradecimentos
Laboratório de Desenvolvimento
Tecnológico em Virologia
Dra. Vanessa de Paula
Dra. Luciane Amado
Obrigado!
Contatos:
 Vinicius Mello - E-mail: [email protected]
 Drª Vanessa de Paula – E-mail: [email protected]