introdução às espectroscopias de absorção e fluorescência

Transcrição

CADERNO DE FÍSICA DA UEFS 12 (02): 41-55, 2014
INTRODUÇÃO ÀS ESPECTROSCOPIAS DE ABSORÇÃO E
FLUORESCÊNCIA: APLICAÇÕES FARMACÊUTICAS
INTRODUCTION AT ABSORPTION AND FLUORESCENCE SPECTROSCOPY: PHARMACEUTICAL
APPLICATIONS
Ferreira, E. S1,4; Oliveira, L. C1,2; Ochoa, E3; Miltão, M. S. R1,4; Andrade-Neto, A. V1,4; Alves, Á. S.1,4 e
Leyva-Cruz, J. A1,4.
1
Laboratório de Física de Materiais, Departamento de Física, UEFS, FSA, BA, 44036900, Brasil.
2
Estudante do Curso de Farmácia, Departamento de Saúde, UEFS, FSA, BA, 44036900, Brasil.
3
4
Facultad de Química. Universidad de La Habana. 10400, Cuba.
Laboratório de Instrumentação em Física, Departamento de Física, UEFS, FSA, BA, 44036900, Brasil.
Há relatos populares de que infusões da planta Pithecoctenium crucigerum (L.) A.H. Gentry (popularmente conhecida por
Pente de Macaco) possuam propriedades antiofídicas. Além disso, análises cromatográficas de distintas partes desta planta
revelam a presença de diversos tipos de metabólitos com potenciais propriedades farmacêuticas. Apesar disso, os poucos
trabalhos sobre o tema encontrados na literatura não fazem qualquer menção à fluorescência do estrato da mesma. Nesse
sentido, obtivemos os estratos etílicos da planta Pithecoctenium crucigerum extraídos pelos métodos de infusão e
decocção, os quais foram posteriormente utilizados em ensaios de viabilidade funcional de um aparato experimental de
caracterização óptica por espectroscopia de fluorescência e de absorção UV-Visível, de baixo custo e com potencial para
aplicações em diversas áreas do conhecimento. Neste trabalho, apresentamos um estudo bibliográfico sobre técnicas
espectroscópicas e suas aplicações na caracterização de estratos vegetais de interesse farmacêutico, mostrando pela
primeira vez que, quando excitado em 409 nm, o estrato de Pithecoctenium crucigerum emite uma nítida e larga banda de
fluorescência na região do visível, apresentando um pico de intensidade em 523 nm e um ombro em torno de 650 nm. O
ajuste desta banda com gaussianas apresentou picos em 504,8 nm, 545,2 nm e 615,9 nm. Este resultado permite a
suposição de que o estrato possa ser constituído por pelo menos três tipos de fluoróforos, podendo um deles ser algum
derivado de cumarina, visto que, segundo a literatura, alguns derivados desta substância também apresentam espectros de
fluorescências com picos de intensidade em 505 nm.
Palavras-chave: Espectroscopia de fluorescência, UV-Vis, Pithecocyenium crucigerum
There are popular reports that plant infusions Pithecoctenium crucigerum (L.) A.H. Gentry (popularly known as Monkey
Comb) have antiofídicas properties. In addition, chromatographic analysis of different parts of the plant exhibiting the
presence of various types of metabolites with potential medicinal properties. Nevertheless, the few studies on this subject
in the literature make no mention of the fluorescence of the stratum of it. Accordingly, the obtained ethyl strata
Pithecoctenium crucigerum plant extracted by decoction and infusion methods, which were then used in functional assays
viability of an experimental apparatus for optical characterization by fluorescence spectroscopy, and UV-Visible
absorption, low cost and the potential for applications in various areas of knowledge. We present a bibliographic study of
spectroscopic techniques and their applications in the characterization of plant strata of pharmaceutical interest, showing
for the first time, when excited at 409 nm, the stratum of Pithecoctenium crucigerum sends a clear and broad fluorescence
band in the region visible, having a peak intensity at 523 nm, and a shoulder around 650 nm. The setting of this band with
Gaussian showed peaks at 504.8 nm, 545.2 nm and 615.9 nm. This result allows the assumption that the stratum can be
composed of at least three kinds of fluorophores, one of which may be a coumarin derivative, since, according to
literature, this substance some derivatives also exhibit fluorescence intensity spectra with peaks at 505 nm.
Keywords: Fluorescence spectroscopy, UV-Vis, Pithecocyenium crucigerum
INTRODUÇÃO
O conhecimento da população sobre a eficácia terapêutica de produtos naturais, aliado à facilidade de
acesso aos mesmos, contribuíram para que estes se tornassem o meio mais antigo empregado no tratamento de
enfermidades [1]. Algumas famílias botânicas contribuem significativamente para a disponibilidade de
metabólitos com propriedades medicinais, tais como a família Bignoniaceae, que é constituída por cerca de
41
Ferreira et al
800 espécies de plantas arbustivas, arbóreas e trepadeiras, encontradas nas regiões tropicais e subtropicais de
todo o mundo [2]. No Brasil há uma grande variedade de espécies desta família, podendo ser encontradas
desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul [3,4]. Algumas dessas espécies apresentam atividades antitumoral,
antiulcera, antimicrobiana, antinflamatória, antimalárica, cercaricida e analgésica [5]. Tais atividades são
atribuídas à presença de metabólitos, tais como naftoquinonas, lapachol, alantoína, flavonona hesperidina,
esteroides fenóis, grupos siringila, triterpenos flavonóides etc. Dentre as espécies de Bignoniaceae, a
Pithecoctenium crucigerum (L.) A. H. Gentry - conhecida popularmente como pente de macaco - vem
despertando interesse por causa de relatos sobre a eficácia de suas infusões na cura de mordidas de cobras,
abrindo espaço para pesquisas sobre alguma ação sobre o sistema imunológico. Estudos cromatográficos dos
extratos etanóicos da semente e folha, e do extrato hexânico da folha, revelaram a presença dos seguintes
metabólitos: heterosídeos, flavonóides (flavonas, flavonóis e xantonas), alcalóides e derivados de cumarinas e
caponinas espumídicas [6]. Estudos do estrato do caule e da semente dessa espécie revelou a presença de
glicosídeos
iridóides
e
de
três
derivados
(6'-O-cyclopropanoyltheviridoside,
10-O-
hydroxybenzoyltheviridoside e 10-O-vanilloyltheviridoside), juntamente com cinco glicosídeos feniletanóides
(verbascosídeo, isoverbascoside, forsythoside B, D e jionosídeo leucosceptosídeo B), e interessantes
atividades contra o radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) [7]. Apesar desta espécie ter despertado o
interessante de vários pesquisadores, ainda há poucos trabalhos na literatura sobre o assunto. Além disso, não
encontramos qualquer informação sobre a existência de fluorescência no estrato etanóico desta planta.
Na área da Física Médica Experimental, as técnicas espectrofotométricas desempenham um papel
imprescindível na caracterização de materiais em geral. Em especial, a técnica de espectroscopia de absorção
no visível e ultravioleta é um dos métodos analíticos mais utilizados em determinações analíticas em diversas
áreas, sendo aplicada para determinações da concentração de compostos orgânicos e inorgânicos [8-9], bem
como na identificação de princípios ativos de fármacos ou grupos funcionais das moléculas em estudo. Ainda
mais importante é a utilização destas técnicas para a determinação quantitativa de compostos que contenham
cromóforos (substância que tem muitos elétrons capazes de absorver energia), principalmente daqueles que
apresentam potencial para futuras aplicações médicas farmacêuticas.
A deficiência de elétrons em moléculas de compostos orgânicos e inorgânicos é o principal fator
responsável pelo processo de absorção nos mesmos. Entretanto, no que diz respeito a materiais inorgânicos,
as energias envolvidas nas transições “d-d” dependem de outros fatores, tais como o tipo de metal envolvido,
dos átomos doadores, da basicidade, bem como da geometria e do número dos grupos coordenados [9]. Nos
compostos orgânicos que possuem ligações duplas, a absorção acontece para energias na faixa do ultravioleta
distante. Já os compostos de ligações conjugadas, que são ligações simples e duplas alternadamente,
absorvem energias menores. Assim, quanto mais extenso for o número de ligações conjugadas, menores serão
as energias absorvidas, podendo chegar à região do visível. Alguns compostos, ao absorverem energia,
possuem a capacidade de devolver uma fração da energia absorvida, a qual recebe o nome de luminescência e
o composto recebe o nome de fluoróforo.
Quando uma molécula é excitada por meio de fótons, sua luminescência recebe o nome de
fotoluminescência. Formalmente, a fotoluminescência é classificada em fluorescência e fosforescência [10].
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Introdução às Espectroscopias...
A fotoluminescência emitida por um determinado sistema pode fornecer informações valiosas sobre a
presença e a concentração de uma determinada substância ou molécula em solução, por exemplo. Além disso,
a fluorescência de um determinado fluoróforo pode ser utilizada como sonda para investigação de pH
(potencial hidrogeniônico), força iônica e interações entre moléculas de interesse biológico etc. Assim, a
espectroscopia de absorção e de fluorescência constitui uma ferramenta muito importante para diversas áreas
do conhecimento, destacando-se principalmente nas áreas de química, física, biologia, farmácia e bioquímica.
Neste trabalho, apresentamos uma revisão sobre as técnicas de espectroscopia de absorção no
ultravioleta-visível e espectroscopia de florescência. Tais conhecimentos abrangem instrumentação na área de
física médica, técnicas analíticas utilizadas em pesquisas relacionadas a identificações de compostos
orgânicos e inorgânicos e, principalmente, na identificação do princípio ativo de substâncias com interesse
farmacêutico e médico. Também são apresentados os resultados preliminares do estudo dos espectros de
absorção e emissão de fluorescência do extrato etílico do caule da planta Pithecoctenium crucigerum, coletada
no distrito de Bomfim de Feira, Feira de Santana-BA, visando verificar a capacidade do aparato experimento
em identificar a presença de metabólitos no extrato estudado.
ABSORÇÃO ÓPTICA
O processo de absorção de luz por uma molécula, segundo o ponto de vista clássico, ocorre quando a
freqüência de uma onda eletromagnética incidente é igual ou próxima à freqüência natural de vibração da
molécula. Entretanto, a visão clássica do processo de absorção é limitada, haja vista que há pelo menos duas
questões fundamentais que ela não consegue explicar, a saber:
a) a relação entre a quantidade de energia absorvida por átomos ou moléculas com a frequência de
radiação. Esta relação é estabelecida pela teoria da mecânica quântica através da relação de Einstein:
E = hν,
(1)
onde h é a constante de Planck. Assim, a radiação assume um aspecto corpuscular, sem equivalente clássico;
b) a existência de linhas espectrais agudas emitidas por átomos ou moléculas após terem sido
previamente excitados. Esta questão também pode ser explicada pela teoria da mecânica quântica. Segundo
esta teoria, átomos e moléculas só podem existir a determinados níveis de energia (também chamados de
estados eletrônicos). Isto é uma conseqüência do aspecto mecânico-ondulatório da matéria. Os níveis de
energia são subdivididos em níveis de energia vibracional, os quais podem ter uma transição para estados
excitados de maior energia ao absorver radiação. Para que transições entre níveis eletrônicos aconteçam é
necessário que a radiação incidente tenha energias pertencentes à faixa do espectro eletromagnético chamado
de UV-visível. Transições entre os níveis vibracionais acontecem na faixa do infravermelho, e transições
entre os níveis rotacionais acontecem na faixa das microondas. [10].
Estas duas questões constituem basicamente os pontos pelos quais o ponto de vista clássico se difere
da mecânica quântica.
Absorbância e a lei de Beer-Lambert
43
Ferreira et al
A intensidade de luz que passa através de um material absorvedor é reduzida de acordo com a lei de
Beer [11]:
(2)
I=Ioe-αl,
onde I é a medida de intensidade após a passagem da luz pelo material, Io é a intensidade inicial, α é o
coeficiente de absorção e l é o comprimento do caminho percorrido. Com um pouco de álgebra, isto pode ser
convenientemente escrito das seguintes formas:
 I
log 10 
 Io

 I
 = log 10 e − αl => −log 10 

 Io
( )

 = αl.log 10 (e ) = 0,43αl

.
Assim, cada um destes termos é chamado de absorbância da amostra, representada pela letra A. A
absorbância pode ser escrita por:
A = − log10 (
I
I 
) = log o  ,
Io
 I 
(3)
que também pode ser expressa por A= αllog10(e) = 0,43αl. O coeficiente de absorção α está relacionado com
a parte imaginária n” do índice de refração complexo por:
α=
4πn"
λ
,
(4)
onde λ é o comprimento de onda da luz.
Posteriormente, Lambert introduziu a concentração de uma espécie absorvedora na lei de Beer para
que esta pudesse se usada nos trabalhos com soluções. Então, a absorbância de uma amostra passa ser
expressa por:
I
A = − log10 ( o ) = ε.c.l
I
,
(5)
e passa a ser chamada de lei de Beer-Lambert, onde l é o comprimento do caminho óptico, medido em
centímetros, c é a concentração molar da solução, em [mol/litro] ou [M], e ε é o coeficiente de absorção
molar, em [litros/(mol.cm)]. O valor de ε de uma determinada amostra depende do comprimento de onda λ da
radiação incidente. Este é normalmente medido com o comprimento de onda que fornece o máximo de
absorbância. Como a absorbância é proporcional à concentração da solução, a curva de A versus c deve levar
a uma reta. Entretanto, em concentrações elevadas, mudanças na posição ou intensidade do máximo de
absorção, causada pela formação de agregados moleculares, tais como dímeros ou trímeros, frequentemente
resulta em desvios da lei de Beer-Lambert. A interação entre as moléculas e o solvente (solvatocromismo)
pode também gerar desvios dessa lei.
Emissão de Fluorescência
Considerando a referência [10] como base para o estudo desse tópico, temos que. Moléculas em seu
estado natural, também chamado de estado fundamental, apresentam uma determinada configuração cuja
energia total é a menor possível. Após absorver radiação, a molécula assume uma nova configuração de maior
energia, chamada de estado excitado. Estando no estado excitado, a pode voltar ao estado inicial por
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diferentes “caminhos”, emitindo ou não radiação. O processo de desativação no qual se observa a emissão de
fótons provenientes de transições entre estados singletos é chamado de fluorescência. Na Figura 1estão
ilustrados os processos de absorção e emissão de fluorescência.
S
2
Conversão
Relaxação
S
Cruzamento
1
Absorção – 1015
s
hν
νA
2
SO 1
O
T
1
hν
νA
hν
νF
hν
νP
Fluorescência –
Fosforescência – 1
Figura 1: Diagrama de Jablonski. Figura modifica a partir da referência [10].
A absorção de radiação ocorre em tempos da ordem de 10-15 segundos. Após a absorção, vários
processos podem ocorrer, uma vez que é permitido à molécula estar em níveis vibracionais mais altos, em um
mesmo nível eletrônico S1 ou S2. Então, passado um tempo da ordem de 10-12 segundos, a molécula assume
um nível vibracional de menor energia, ainda nesse mesmo nível eletrônico, por meio de um processo
chamado de relaxação vibracional. Como o tempo de vida médio de um estado eletrônico excitado é da ordem
de 10-8 segundos, tal processo de relaxação interna se completa antes da emissão fluorescente. São possíveis
ainda, transições de um nível eletrônico para outro de menor energia através de processos não radiativos,
como colisões com moléculas do solvente. O processo de relaxação entre níveis eletrônicos excitados é
denominado conversão interna. As transições para o estado fundamental (singleto), a partir de um estado
tripleto dão origem ao fenômeno da fosforescência, envolvendo tempos de até milissegundos.
Fluorescência com Resolução Temporal
O tempo de vida de fluorescência de uma substância geralmente representa o valor médio de tempo
que a molécula permanece no estado excitado antes de retornar para o estado fundamental [10]. Medidas de
tempo são freqüentemente necessárias na espectroscopia de fluorescência. Esses dados podem revelar a taxa
de transferência de energia e a taxa de reações no estado excitado. A natureza precisa do decaimento
fluorescente pode revelar detalhes sobre as interações dos fluoróforos com a vizinhança.
Medições do tempo de vida fluorescente são difíceis, pois esses tempos se encontram tipicamente na
faixa de nanossegundos, fazendo-se necessário o uso de dispositivos eletrônicos de alta velocidade e
detectores adequados. Existem três métodos amplamente usados para medir tempos de vida de fluorescência:
o método de pulsos, método estroboscópico e o método harmônico ou modulação de fases. No método de
45
Ferreira et al
pulsos, a amostra é excitada com um breve pulso de luz e é medido o intervalo de tempo transcorrido entre a
absorção e a emissão da fluorescência.
Considere a excitação de um fluoróforo com um pulso de luz extremamente curto, resultando em uma
população inicial (No) de fluoróforos no estado excitado. A taxa de decaimento da população inicialmente
excitada é:
dN
= − (γ + k)N(t)
dt
,
(6)
onde N(t) é o número de moléculas que estão no estado excitado em um tempo t seguinte à excitação; γ é a
taxa emissiva, e k é a taxa de decaimento não radiativo [10]. Lembrando que N(t) = No em t = 0, a integração
da Eq. (18) fica:
−t
N(t) = N o e τ
,
(7)
onde τ = (γ+ k)-1 é o tempo de vida do estado excitado. Como consequência, espera-se que a intensidade de
fluorescência F(t), que é proporcional à população no estado excitado [F(t) = γ N(t)], decaia
exponencialmente.
O tempo de vida também pode ser considerado como sendo o valor médio de tempo que um fluoróforo
permanece no estado excitado. Esta média é dada por:
∑ t N (t)
< t >=
∑ N (t)
i
i
i
i
.
Para um grande número de fluoróforos e pequenos intervalos de tempo, essa soma fica:
i
∞
∫ ti N i (t )
< t >=
0
∞
∞
−t
0
∞
−t
(8)
∫ te τ
=
∫ N i (t )
∫e τ
0
0
.
(9)
O denominador é igual a τ. Seguindo com a integração por partes, o numerador é igual a τ2. Daí, para
um decaimento exponencial, o tempo médio que um fluoróforo permanece no estado excitado é igual ao
tempo de vida:
< t > = τ.
(10)
É importante mencionar que a Eq.(10) não é verdadeira para as leis de decaimento muito complexas,
tais como decaimentos multi-exponenciais ou não-exponenciais. Na maioria das vezes, os decaimentos
observados são multi-exponenciais, sendo ajustados por uma soma de exponenciais do tipo:
F (t ) = ∑ α i e
−
t
τt
,
(11)
onde τi é o tempo de vida da componente i do decaimento, e αi, é o correspondente fator pré-exponencial.
Assim, o tempo de vida médio é dado por:
46
∑α τ
< t >=
∑α τ
2
i i
i
i i
i
.
(12)
Posição Espectral
Para moléculas fluorescentes em solução, observa-se uma diferença entre as energias de excitação e
emissão. A energia de emissão é sempre menor que a energia de excitação, ou a emissão ocorre em
comprimentos de onda maiores que aqueles da absorção. Esse efeito é conhecido como deslocamento de
Stokes. Essa perda de energia entre a excitação e a emissão pode ocorrer devida a diversos fatores, tais como
efeitos do solvente, reações no estado excitado, formação de complexos e transferência de energia.
Deslocamentos observados na emissão fluorescente são informações acerca do ambiente ao redor da
sonda. No caso do resíduo triptofano em proteínas, por exemplo, a emissão ocorre em comprimentos de onda
maiores quando o mesmo se encontra exposto ao solvente, e em comprimentos de onda menores quando o
resíduo está no interior da proteína. Essa propriedade é observada na maioria das sondas fluorescentes
intrínsecas, e permite obter informações sobre a polaridade do meio ao redor da sonda.
Compostos o-Abz-peptídeos apresentam deslocamentos para o vermelho entre 5 e 8 nanômetros na
banda de absorção e, entre 20 e 30 nanômetros na banda de emissão, em relação ao o-Abz isolado. Essas
mudanças ocorrem em decorrência das alterações na estrutura eletrônica do fluoróforo promovidas pela
ligação covalente entre seu grupo carboxila e o terminal amino dos peptídeos.
Supressão de fluorescência
A intensidade de fluorescência pode ser reduzida por vários processos. Tal redução na intensidade é
chamada quenching ou supressão. A supressão pode ocorrer por diversos mecanismos, principalmente por
supressão colisional ou dinâmica, supressão estática, transferência de energia, transferência de elétrons, etc. A
supressão colisional ocorre quando os fluoróforos do estado excitado são desativados após contato com
alguma outra molécula, o qual é chamado de quencher ou supressor. Nesse caso, o fluoróforo retorna ao
estado fundamental durante um eventual encontro com o supressor. As moléculas não são quimicamente
alteradas nesse processo. Para supressão colisional, a redução na intensidade é descrita pela a equação de
Stern-Volmer [10]:
Fo
= 1 + K D [Q] = 1 + τ o k q [Q].
F
(13)
Nesta expressão, KD é a constante de supressão de Stern-Volmer, kq é a constante de supressão
bimolecular, τo é o tempo de vida sem a supressão, e [Q] é a concentração do supressor. O mecanismo de
supressão varia com o par fluoróforo-supressor. Os dados relativos à supressão são usualmente apresentados
como um gráfico de Fo/F versus [Q]. A razão disto é porque se espera que Fo/F tenha uma dependência linear
com a concentração do supressor.
47
Ferreira et al
A supressão estática ocorre quando o fluoróforo forma um complexo não fluorescente com o
supressor. Quando este complexo absorve luz, ele retorna imediatamente ao estado fundamental sem emissão
de um fóton. A expressão que descreve esse processo é dada por:
Fo
= 1 + K S [Q]
F
.
(14)
A dependência de Fo/F com [Q] é linear e idêntica à dependência observada para o quenching
dinâmico, exceto que a constante de supressão é agora a constante de associação. Há basicamente duas
maneiras bem conhecidas de se determinar qual dos dois processos é o responsável pela supressão da
fluorescência. O primeiro consiste em variar a temperatura. Se, com o aumento da temperatura, o coeficiente
de inclinação da reta aumentar, se trata de supressão dinâmica, mas se a inclinação diminuir, então se trata de
supressão estática. O método mais definitivo para distinguir a supressão estática da dinâmica é aquele no qual
se utiliza medidas do tempo de vida de fluorescência. A supressão estática remove uma fração dos fluoróforos
da observação. Os fluoróforos que formam complexos não são fluorescentes; nesse caso, a única
fluorescência observada é a dos fluoróforos não complexados. A fração não complexada não é perturbada e,
portanto, o tempo de vida τ é o próprio τo. Por isso, para a supressão estática, a razão τo/τ = 1; do contrário,
τo/τ = Fo/F.
Em alguns casos, o fluoróforo pode ser suprimido tanto por colisões quanto por formação de
complexos com o mesmo supressor. A característica peculiar do gráfico de Stern-Volmer é um gráfico com
curvatura para cima. Então, a expressão que descreve esse processo é dada por:
Fo
= 1 + (K D + K S )[Q] + K D K S [Q] 2
F
.
(15)
A porção dinâmica da supressão observada pode ser determinada por medidas de tempos de vida da
fluorescência. Isto é, τo/τ = 1 +KD[Q].
A supressão também pode ocorrer por mecanismos triviais, tais como atenuação da luz incidente pelo
fluoróforo ou por outra espécie absorvedora, chamados de efeito filtro [10]. Este se dá pela absorção ou
espalhamento da fluorescência emitida, promovendo uma falsa impressão da existência de supressão estática
e dinâmica. Neste caso, a curva obedecerá à equação:
y = (1 + Ax ) e Bx ,
(16)
na qual A é a taxa de supressão estática ou dinâmica, e B é o coeficiente de atenuação da fluorescência
devido à absorção ou espalhamento promovido pelo supressor. É importante falar que o efeito filtro pode estar
presente em todos os processos de supressão mencionados. Portanto, sempre que houver suspeita de sua
existência, os dados devem ser corrigidos com o fator eBx.
MATERIAIS E MÉTODO
Neste capítulo, serão apresentados os equipamentos utilizados, materiais e os métodos empregados
durante a elaboração deste trabalho.
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Na Figura 2, podemos observar as fotos das folhas (a), do caule (b), do fruto (c) e das sementes do
fruto (d) da planta Pithecoctenium crucigerum. Esta foi a planta utilizada para implementar as técnicas
espectroscopias para aplicações farmacêuticas.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 2: Fotos das folhas (a) e caule (b) da planta Pithecoctenium crucigerum. Em (c), o fruto e em (d), sementes
da mesma. Figuras retiradas da internet [11].
Extração do Princípio Ativo
Após a coleta de amostras da planta pente de macaco, feita na região de Bomfim de Feira, no
Município de Feira de Santana-BA, foi realizada a extração do princípio ativo usando os métodos de Infusão e
Decocção. O primeiro método ocorre pela permanência do material vegetal em água fervente durante certo
tempo, em um recipiente tapado. Como a infusão é aplicável a partes vegetais moles, foram usadas as folhas
maceradas, a fim de que estas possam ser mais facilmente penetradas e extraídas pela água [12]. A Decocção
consiste em manter o material vegetal em contato com um solvente durante certo tempo (neste casso, usamos
o álcool etílico).
Espectrômetro
O setup experimental montado para a obtenção dos espectros é composto basicamente por um
espectrômetro UV-NIR, modelo USB4000, da Ocean Optics, ao qual são conectadas duas fibras óticas; uma
que traz informações da amostra estuda e outra que conecta espectrômetro leva ao computador, onde as
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Ferreira et al
informações são processadas através do uso do software SpectraSuite. Como fonte de excitação da amostra,
foram utilizadas uma fonte de luz branca caseira, de 60 W, e um laser diodo, do tipo apontador, com emissão
máxima em 409 nm. O porta amostra foi construído artesanalmente com sucatas (ver Figura 3). Em todas as
medidas foram utilizadas cubetas de Quartzo de caminho óptico igual a 10 mm, adquiridas da ThorLab. Na
Figura 3, pode ser observada uma foto do sistema experimental montado para a obtenção dos espectros de
absorção e de fluorescência.
Figura 3: Fotografia do sistema experimental para a implementação das técnicas de espectroscopia por absorção
UV-Vis e de espectroscopia de fluorescência, usando o espectrômetro portátil USB4000.
Em detalhe é mostrado o espectrômetro, as fibras óticas, uma fonte UV laser diodo do tipo apontador
(409 nm), usada como fonte de excitação, e a porta amostra artesanal. Finalmente, observa-se o software
Spectra Suite funcionando no computador, conectado ao espectrômetro USB 4000.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Com o objetivo de implementar as técnicas de espectroscopia de absorção UV-visível e de
fluorescência, no Lab. de Física de Materiais do DFIS, para futuras aplicações farmacêuticas, experimentos
foram realizados usando a descrição experimental de seção anterior. Após a obtenção dos estratos da planta
estudada, estes foram levados para a obtenção do espectro de absorção. Para este fim, foi utilizada uma
lâmpada comercial de luz branca de 60 W de potência. Note, na Figura 4, que a amostra começa a absorver
em 700 nm, se estendendo até 450 nm, onde apresenta máxima absorbância. É importante mencionar que a
amostra apresentou intensa absorção em comprimentos de onda menores que 450 nm, constatado com
experimentos realizados com um laser de diodo, de emissão máxima em 409 nm. Sendo assim, a câmara
escura que contêm o porta-amostras foi modificado para permitir a realização de medidas de fluorescência.
Isto é feito colocando-se as fibras ópticas dispostas perpendicularmente com o porta-amostras.
Figura 4: Espectro de absorção da solução etílica do estrato não processado da amostra pente de macaco usando
uma lâmpada comercial de luz branca de 60 W.
50
Após a modificação do sistema, as amostras foram excitadas com laser de diodo e o espectro de
fluorescência foi obtido com a utilização de um filtro UV, colocado entre a amostra e fibra óptica de detecção.
A Figura 5 mostra a distância espectral entre a banda de excitação do laser e abanda de emissão de
fluorescência do estrato de Pithecoctenium crucigerum. Note que a banda de fluorescência apresenta um pico
de fluorescência em 523 nm e um ombro em torno de 650 nm. Note que estes resultados podem incorrer na
existência de mais de um fluoróforos presente no estrato.
Intensidade de fluorescência (u.a)
12000
10000
λEx = 409 nm
λEm = 523 nm
Fluorescência da amostra
Espectro de emissão
da lâmpada
8000
6000
4000
2000
0
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Comprimento de onda (nm)
Figura 5: Espectro de excitação da fonte UV (laser diodo de 409 nm) e do espectro de fluorescência do estrato não
processado da amostra de Pithecoctenium crucigerum, utilizando um filtro UV.
Haja vista que a banda de emissão de fluorescência observada pode de ser o resultado da superposição
de bandas de emissão de compostos fluorescentes que possuem bandas de absorção parcial ou totalmente
coincidentes. No intuito de descobrir compostos fluorescente presentes na natureza, foi verificado na literatura
que as cumarinas, ou benzo-α-pirona, constituem uma classe de metabólitos secundários fluorescentes
largamente encontrados na natureza. Vários outros derivados de cumarina podem ser encontrados em grandes
variedades de plantas [13,14]. As cumarinas são altamente sensíveis às características do ambiente local, tais
como pH, concentração, tipo de solvente e tipo de íons presentes no solvente. Por causa disto, derivados de
cumarina têm sido largamente utilizadas como sonda fluorescente de íons metálicos, dentre outras aplicações
[15-16]. Além disto, estes compostos apresentam uma ampla variabilidade de atividades biológicas,
apresentando
atividades
antimicrobianas,
antiviral,
antioxidante,
antinflamatório,
antitumoral
e
antiespasmódico [17-20]. Decorre daí o nosso interesse em investigar a possibilidade de existência de
derivados de cumarina na solução estudada. Derivados de cumarina podem apresentar picos de intensidade de
fluorescência desde 415 nm a 510 nm, aproximadamente [13] (ver Figura 6). Note que os picos de intensidade
de fluorescência de derivados de cumarina podem variar dentro de uma faixa de comprimentos de onda que é
compatível com a banda de fluorescência do estrato de Pithecoctenium crucigerum. Some–se a isto o fato de
que as cumarinas e seus derivados são metabólitos secundários extraídos de várias espécies de plantas, e
teremos como resultado a hipótese de que derivados de cumarinas podem estar presentes no estrato da solução
de Pithecoctenium crucigerum.
51
Ferreira et al
Figura 6: Espectros de fluorescência de derivados de cumarinas, retirados da referência [13].
Visando fortalecer esta hipótese, foi realizada uma deconvolução em Gaussianas do espectro de
Intensidade de Fluorescência(u.a)
fluorescência. O resultado é mostrado abaixo, na Figura 7.
12000
Fluorescência da amostra
Ajuste Gaussiano
Gaussianas utilizadas
no ajuste
10000
8000
504,8 nm
545,2 nm
6000
615,9 nm
4000
2000
0
200
300
400
500
600
700
800
900
Comprimento de onda (nm)
Figura 7: Espectros de Fluorescência do estrato não processado da amostra Pithecoctenium crucigerum., ajustado
com uma Gaussiana e suas respectivas Gaussianas deconvoluída para picos em 504,8 nm, 545,2 nm e 615,9 nm,
respectivamente.
Na Figura 7, é possível ver o espectro de fluorescência (linha preta) do estrato não processado da
amostra de Pithecoctenium crucigerum. Também observamos as respectivas Gaussianas deconvoluídas para
picos em 504 nm, 545 nm e 615 nm, respectivamente. Interessante é analisar o pico em 504,8 nm, o qual
corrobora a hipótese sugerida anteriormente (a presença de derivados da cumarina na solução). È importante
mencionar, entretanto, que estes resultados são apenas qualitativos, sendo necessárias a separação e
purificação dos componentes da amostra por técnicas de cromatografia ou equivalentes que possam sustentar
as anteriores.
CONCLUSÃO
Um estudo bibliográfico sobre técnicas espectroscópicas e métodos de preparação de amostras para
aplicações médicas-farmacêuticas foi realizado. As técnicas espectroscopia de absorção no UV-Visível e
espectroscopia de fluorescência foram implantadas no Laboratório de Física de Materiais do DFIS por meio
52
de um aparata experimental de baixo custo. Estratos etílicos da planta pente de macaco foram obtidos usando
os métodos de Infusão e Decocção. Testes preliminares de verificação da funcionalidade do aparato
experimental para a caracterização de sistemas farmacêuticos por meio de espectros de absorção e emissão de
fluorescência de estratos da planta Pithecoctenium crucigerum foram realizados e apresentaram potencial para
aplicações de estudos de amostras de interesse farmacêuticos. Estratos etílicos de Pithecoctenium crucigerum
emitem intensa e larga banda de fluorescência na região do visível, com dois picos de intensidade em 523 nm
e um ombro em torno de 650 nm, quando excitado em 409 nm. Estes resultados podem incorrer na existência
de mais de um fluoróforos na solução, tendo os derivados de cumarina como possíveis candidatos. Este
trabalho marca o início do funcionamento da uma linha de pesquisa voltada para caracterização óptica de
sistemas de interesse biológico e farmacêutico no Laboratório de Física de Materiais do Departamento de
Física da UEFS.
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55

introdução às espectroscopias de absorção e fluorescência

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