SERION ELISAantigen

Transcrição

SERION ELISAantigen

YOUR
GLOBAL
PARTNER
IN
Manufacturer
Fabricante
Κατασκευαστής
Fabricante
Výrobce
SERION ELISA antigen Candida
DIAGNOSTICS
SERION ELISA antigen
Candida
Institut Virion\Serion GmbH
Instructions - English
Instrucciones de empleo - Español
Oδηγίες χρήσης - Ελληνικά
Instruções de emprego - Português
Pokyny - Česky
E-Mail: [email protected]
Internet: www.virion-serion.de
(Version/Versión/Έκδοση/Versão/Verze 1.12/09-1)
KAL200-2
Friedrich-Bergius-Ring 19
D - 97076 Würzburg, Germany
Telefon: +49 (0) 9 31 / 30 45 0
Fax: +49 (0) 9 31 / 30 45 100
EN
DIAGNOSTIC RELEVANCE
3
SERION ELISA antigen - TEST PRINCIPLE
4
KIT COMPONENTS
5
MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
6
STORAGE AND STABILITY
7
TEST PROCEDURE SERION ELISA antigen
7.1
General Notes
7.2
Sample Preparation and Storage
7.3
Preparation of Kit Reagents
7.4
Overview - Test Procedure
7.5
Manual Test Procedure
7.6
Automated Test Procedure
7.7
Positive Control / Accuracy Control
8
GR
2
PT
INTENDED USE
CZ
1
ES
CONTENTS
TEST EVALUATION
8.1
Single-Point Quantification with the 4PL Method
8.2
Criteria of Validity
8.3
Calculation SERION ELISA antigen Candida
8.4
Limits of Quantification
8.5
Borderline Range
8.6
Interpretation of Results
8.7
Reference Range of healthy Individuals
9
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
9.1
Sensitivity and Specificity
9.2
Reproducibility
10
SAFETY MEASURES
10.1 Statements of Warning
10.2 Disposal
11
REFERENCES
current version No.: V 1.12/09-1
previous version: --
Pos : 1 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Allgemei ne Texte ELISA antigen/Einl eitung " Enz ymimmunoass ay" C andi da antigen @ 8\mod_1265790547166_18.doc @ 28520 @
Enzyme-immunoassay for determination of Candida Antigen
for in vitro diagnostic use
Pos : 2 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für nur ei n D okument/Bestellnummer n/C andida antigen: Bestell nummer @ 11\mod_1346680555914_18.doc @ 52000 @
Order Nr.: ESR200
Pos:
3 /Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
für alle Dokumente/ELISA
antigen/Allgemeine
Texte ELISA
antigen/Kapitelüberschrift
"Anwendungsbereich" @
8\mod_1265792390921_18.doc
@ 28662
@1
1
INTENDED USE
Pos : 4 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für nur ei n D okument/Anwendungsbereic h/C andi da antigen: Anwendungsbereic h @ 8\mod_1265794146291_18.doc @ 29056 @
SERION ELISA antigen Candida is a quantitative and qualitative immunoassay for the
detection of Candida antigen in human serum or plasma. The assay is recommended for
the detection of systemic candidosis.
Pos : 5 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Allgemei ne Texte ELISA antigen/Kapitelüberschrift "Diag nostisc he Bedeutung" @ 8\mod_1265792408092_18.doc @ 28678 @ 1
2
DIAGNOSTIC RELEVANCE
Pos : 6 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für nur ei n D okument/Di agnostisc he Bedeutung/Candida antigen: Diag nos tisc he Bedeutung @ 11\mod_1346939232903_18.doc @ 52277 @
Candida albicans is an ubiquitous yeast which, like all Candida species, belongs to the
family of yeast-like fungi. Apart from the yeast form which primarily causes superficial
infections, so called pseudo mycelia are a further morphologic manifestation of yeast-like
fungi. Germ tubes and the development of pseudo mycelia mainly occur in cases of
systemic mycosis. Candida ssp. produce and excrete a range of destructive enzymes that
enable the facultative pathogen microorganisms to penetrate mucous membrane barriers
and blood vessels barriers.
Candida ssp. are primarily transmitted by smear contamination from person to person. The
primary portal of entry is the oral cavity. Changes in the fungistatic properties of the skin,
which are a consequence of a slightly acidic pH value and the antagonistic bacterial flora,
can facilitate the establishment of superficial candidiasis of the skin surface. Systemic
mycosis results from colonization of mucous membranes, particularly in the
gastrointestinal tract.
Candida ssp. are able to adhere to the epithelia of a variety of mucosal membranes by
adherence proteins and other cell surface structures. The schematic below shows
hypothetical steps that may lead to disseminated infections in cases of severe underlying
conditions. An exact description of the various stages is not practical (Fig. 1).
english
2
passing of the
transfer to the
nasopharyngeal tract
stomach lumen
intestine lumen
entry into
transfer to
blood circulation
lymphoid system
persorption of
Candida- ssp.
invasion of
multiple organs
Figure 1:
progression of Candida-infections
Candidiasis can generally be classified into two major groups whose main characteristics
are listed in the table below.
Candida-infections
superficial
deep mycosis (invasive)
localization
skin, mucosa
prime organs
immunocompetence
of the host
+
+,-/-
risk factors
pregnancy
chemo therapy
diabetes
iatrogene immune suppression
AIDS
central vein catheter
dysfunction of the skin
radiotherapy
deficient oral hygiene
high-grade burns
surgery
clinical progression
harmless in most cases,
life-threatening in most cases
no danger of life
therapy
effective therapy
effectiveness
of
therapy
depends on stage of infection
Table 1: Characteristics of Candida-infections
english
3
EN
colonization of the
The diagnosis of candidiasis on the basis of serological methods is not straight forward:
On the one hand transient yeast colonization may induce an antibody response, on the
other hand systemic Candida mycosis in immunosuppressed patients may only lead to
minor changes in antibody activities. Such situations make critical interpretation of
serological findings necessary. In addition, systemic Candida-infections may not cause
typical symptoms.
Currently it is not possible to conclude that the results of different test systems for antiCandida antibody detection are comparable or even exchangeable. Specificity of detected
antibodies significantly depends on the test system (ELISA or HAT) or on the antigen
preparation used. The detection of IgM antibodies with HAT is better than the IgG
detection due to higher agglutination properties of IgM molecules. HAT mainly detects
antibodies against cell wall antigens of yeast-like fungi which makes serological
interpretation even more complex but gives the opportunity for differentiation. Changes in
antibody concentrations may be detectable with ELISA but not with HAT, making a
combination of the two techniques advantageous, e.g. in case of decreasing IgM antibody
activity and simultaneously increasing IgG antibody activity.
Currently no single technique in isolation allows for a definitive serological diagnosis of
candidiasis. Surveillance of at risk patients and therapy control requires the use of a
variety of methods including serology and antigen detection. The SERION ELISA antigen
Candida test is of particular help in such situations by detecting Candida specific antigen in
patient samples.
Pos:
7@
/Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
alle Dokumente/ELISA
antigen/Testprinzip/Testprinzip
ELISA
antigen @für
8\mod_1265792007310_18.doc
@
28639
1
3 SERION ELISA antigen - TEST PRINCIPLE
The ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) is an immunoassay, which is
particularly suited to the determination of antibodies and antigens in the field of infectious
serology. The reaction is based on the specific interaction of antibodies with their
corresponding antigen. The test strips of the SERION ELISA antigen microtiter plate are
coated with specific antibodies directed against the pathogen of interest. If antigens in the
patient´s sample are present, they bind to the fixed antibody. A secondary antibody, which
has been conjugated with the enzyme peroxidase, detects and binds to the immune
complex. The colourless substrate hydrogen peroxide (H2O2) and the chromogen tetramethylbenzidine (TMB) are converted into a blue coloured product. Addition of stopping
solution changes the colour to yellow. The signal intensity of this reaction product is
proportional to the concentration of the antigen in the sample and is measured
photometrically.
Pos : 8 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für nur ei n D okument/Inhalt und Z us ammens etz ung/C andi da antigen: Inhalt und Zusammens etzung @ 11\mod_1346845806738_18.doc @ 52090 @ 1
english
4
EN
4
KIT COMPONENTS
Test Components
Break apart microtiter test strips each with eight antibody coated single wells,
(altogether 96) MTP ,
1 frame.
Pieces /
Volume
12 pieces
Standard serum STD ,
Candida albicans antigen in human serum supplemented with fetal calf serum (FCS);
negative for anti-HIV Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-HCV Ab;
preservative: < 0.1 % sodium azide.
3 x 3 ml
Negative control serum NEG ,
Human serum supplemented with fetal calf serum (FCS);
negative for anti-HIV Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-HCV Ab;
preservative: < 0.1 % sodium azide.
2 x 3 ml
Anti-Candida albicans conjugate (ready-to-use) PODCR ,
Anti-Candida albicans antibody conjugated to horseradish-peroxidase;
stabilised with protein stabilisation solution containing detergent;
preservative: 0.1 % ProClin® 300.
Washing solution concentrate (sufficient for 1500 ml) WASH ,
TRIS-buffered salt solution with Tween 20; 30-fold concentrated;
preservative: < 0.1 % ProClin® 300.
13 ml
2 x 25 ml
Dilution buffer SAMB ,
Acid solution without preservative.
15 ml
Stopping solution STOP ,
0.5 N sulfuric acid.
13 ml
TMB-substrate solution (ready-to-use) TMB ,
TMB-hydrogen peroxide substrate solution;
preservative: < 0.01 % Kathon CG.
13 ml
Quality control certificate with standard curve and evaluation table INFO ,
(quantification of antigens in U/ml).
Pos: 9 /Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
für benötigte
antigen/Zusätzlich
benötigte
Materialien/Zusätzlich
Materialien @
8\mod_1265796058727_18.doc
@ 29303
@1
english
5
2 pieces
5
-
MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
common laboratory equipment
photometer for microtiter plates with filter, wavelength 450 nm,
recommended reference wavelength 620 nm - 690 nm (e.g. 650 nm)
incubator 37 °C
heating block 110 °C
moist chamber
distilled water
Click-Clips (order no. VT120)
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Lagerung
und Haltbarkeit/Lagerung
@
11\mod_1346935956390_18.doc
@ 52260
@ 1 und Haltbarkeit
english
6
EN
6
STORAGE AND STABILITY
Reagent
Storage
Stability
Microtiter strips
unopened
(coated with antibody)
see expiry date;
after opening at 2 – 8 °C in closed aluminum bag with minimum shelf-life:
desiccant
4 weeks
Strips which are not used must be stored dry and air shelf-life in case of
tight in the closed aluminum bag.
proper use and
storage: until expiry
date
Control sera /
Standard sera
after opening at 2 – 8 °C
Conjugate
ready-to-use solution at 2 – 8 °C
see expiry date;
Avoid contamination e.g. by using sterile tips.
18 months as of date
of production
unopened
see expiry date;
Dilution buffer
see expiry date;
of production
of production
Washing solution
after opening at 2 – 8 °C
Discard cloudy solutions.
6 months
Concentrate after opening at 2 – 8 °C
see expiry date;
of production
working dilution at 2 – 8 °C
working dilution at room temperature
2 weeks
1 week
Bottles used for the working dilution should be
cleaned regularly. Discard cloudy solutions.
TMB substrate
ready-to-use solution at 2 – 8 °C,
stored protected from light
Avoid contamination e.g. by using sterile tips.
see expiry date;
of production
Discard if solution turns blue (extinction at 650 nm
against aqua dest. > 0.2 OD).
Stopping solution
After opening at room temperature
Pos : 11 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Ü berschrift: D urchführung @ 8\mod_1265792572851_18.doc @ 28750 @ 1
english
7
see expiry date
7
TEST PROCEDURE SERION ELISA antigen
Pos : 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Allgemei ne Hinweis e ELISA antig en @ 11\mod_1346845965842_18.doc @ 52107 @ 2
7.1
General Notes
Only use SERION ELISA antigen reagents when using SERION ELISA antigen
immunoassays. The components must not be exchanged for reagents of other
manufacturers. Standard and control sera as well as the conjugate of SERION ELISA
antigen immunoassays are defined exclusively for the test kit to be used and must not be
used in other lots. Dilution buffer, washing solution, substrate and stop solution can be
used for all SERION ELISA antigen immunoassays irrespective of the lot and the test.
Unopened, all components of the SERION ELISA antigen tests may, if stored accordingly,
be used up to the expiry dates given on the labels. Reagents may not be used after date of
expiry.
Dilution or alteration of the reagents may result in a loss of sensitivity.
Avoid exposure of reagents to strong light during storage and incubation. Reagents must
be tightly closed after use to avoid evaporation and contamination.
To open the aluminium bag of the microtiter plate please cut off the top of the marked side
only, in order to guarantee proper resealing. Do not use the strips if the aluminium bag is
damaged or if the bag with remaining strips and desiccant was not properly resealed.
Use aseptic techniques when removing aliquots from the reagent tubes to avoid
contamination. To avoid false positive results ensure not to contact or splash the top-walls
of wells while pipetting conjugate. Take care not to mix the caps of the bottles and/or vials.
In particular, the TMB-substrate solution is sensitive to oxidising substances and heavy
metal ions. It must be stored away from light at all times and only opened in low light
conditions immediately prior to use. This solution is coloured light blue-green.
Skin contact with substrate and stop solution should be avoided.
Reproducibility of test results is dependent on thorough mixing of the reagents. Agitate the
flasks containing control sera before use and also all samples after dilution (e.g. by using a
vortex mixer).
Be sure to pipette carefully and comply with the given incubation times and temperatures.
Significant time differences between pipetting the first and last well of the microtiter plate
when dispensing samples and control sera, conjugate or substrate can result in different
pre-incubation times, which may influence the precision and reproducibility of the results.
Optimum results can only be achieved if the instructions are strictly followed.
The SERION ELISA antigen immunoassay is only valid if the lot-specific validation criteria
on the quality control certificate are fulfilled.
english
8
EN
Adequate washing avoids test unspecificities. Therefore, the washing procedure should be
carried out carefully. All of the flat bottom wells should be filled with equal volumes of
washing buffer. At the end of the procedure ensure that the wells are free of all washing
buffer in order to avoid uncontrolled dilution effects. Avoid foaming!
Take care not to damage the inscription (pathogen / AG) on the microtiter test strips during
washing and aspiration to avoid confusion.
Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estdurc hführung/Pr obenvor ber eitung und Lagerung/Candida antigen: Probenvorbereitung und Lager ung @ 11\mod_1346846025700_18.doc @ 52141 @ 2
7.2
Sample Preparation and Storage
Lipaemic, hemolytic or icteric samples (serum or plasma) should only be tested with
caution. Obviously contaminated samples should not be tested. Serum or plasma (EDTA,
citrate, heparin) collected according to standard laboratory methods are suitable samples.
Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estdurc hführung/Pr obenver dünnung/Candida antigen: Probenverdünnung @ 11\mod_1346846162855_18.doc @ 52209 @ 3
7.2.1 Sample Preparation
Before running the test, specimens (patient samples, standard and negative control) (V1)
must be diluted in dilution buffer (V2) as follows:
V1 + V2 = 3+1
add
each to
300 µl sample (V1)
100 µl dilution buffer (V2)
After dilution and before pipetting into the microtiter plate, the samples must be mixed
thoroughly to prepare a homogenous solution.
Finally, the samples must be heated at 110 °C (+/- 5 °C) for 10 minutes. It is essential to
keep both the time and temperature stated! Standard reagent vessels are not suitable for
this thermolysis step and we recommend the use of safe-lock reaction vessels or similar
vessels with a screw closure.
Usage of a heating block thermostat requires controlling of the actual temperature by a
calibrated thermometer. Consider the device-specific pre-heating period of the heating
block. If necessary, the heating block must be adjusted to the required temperature.
During thermolysis, a white cloudy precipitate will form and should be removed by
centrifugation in a pre-cooled (4 °C) table top centrifuge at 10,000 × g for 10 minutes. The
clear supernatant can then be used in the test.
Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Probenl agerung ELISA antig en @ 8\mod_1265791164461_18.doc @ 28565 @ 3
7.2.2 Sample Storage
The treated patient’s samples should not be stored for more than 24 hours at 2 – 8 °C.
Untreated samples should not be stored at 2 – 8 °C for more than 7 days. Extended
storage is possible at ≤ -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing of samples.
Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/R eagenzienvorbereitung ELISA antigen @ 11\mod_1346845998930_18.doc @ 52124 @ 2333333
english
9
7.3
Preparation of Kit Reagents
Bring all reagents to room temperature before testing.
7.3.1 Microtiter Test Strips
The microtiter test strips in frames are packed with a desiccant in an aluminum bag.
Take unrequired cavities out of the frame and put them back into the aluminum bag.
Close bag carefully to ensure airtight conditions.
7.3.2 Control Sera / Standard Sera
Control and standard sera must be diluted with sample buffer and subsequently
denatured. For each test run – independent of the number of microtiter test strips to
be used – control and standard sera must be included. The standard sera should be
set up in duplicate.
7.3.3 Conjugate (ready-to-use)
Avoid contamination of the ready-to-use conjugate, e.g. by using sterile tips.
7.3.4 Wash solution
Dilute washing buffer concentrate (V1) 1:30 with aqua dest. to a final volume of V2.
Example:
Buffer concentrate (V1)
Final volume (V2)
25 ml
750 ml
1 ml
30 ml
7.3.5 TMB Substrate (ready-to-use)
Avoid contamination of the ready-to-use substrate solution, e.g. by using sterile tips.
The TMB substrate is coloured light blue-green and any solutions which exhibit a
strong colour (extinction at 650 nm against distilled water of >0.2 OD) should be
discarded.
7.3.6 Stopping Solution (ready-to-use)
Pos : 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/T es tablauf/Übersc hrift T establauf @ 8\mod_1265793631810_18.doc @ 28923 @ 2
english
10
EN
7.4
Overview - Test Procedure
Pos : 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/T es tablauf/Tes tablauf Candida antigen @ 11\mod_1346681847716_18.doc @ 52068 @
quantitativ
Preparation of samples, control and standard serum
Sample dilution
(Patient samples, control and standard serum)
300 µl Sample + 100 µl Dilution buffer
INCUBATION 10 min. / 110 °C
CENTRIFUGATION 10 min. / 10,000 × g / 4 °C
Retain supernatant, discard pellet
Add supernatant from samples (100 µl)
moist chamber
WASH (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipette conjugate solution PODCR (100 µl)
moist chamber
WASH (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipette substrate solution TMB (100 µl)
moist chamber
Pipette stop solution STOP (100 µl)
READ EXTINCTION at 450 nm (ref. 650 nm)
Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estdurc hführung/Tes tdurc hführ ung/C andi da antigen: Manuelle Testdurc hführ ung @ 11\mod_1346846068724_18.doc @ 52158 @ 2
english
11
7.5
Manual Test Procedure
1. Pretreatment of samples (patient samples, standard and control serum) as described.
2. Place the required number of cavities in the frame and prepare a protocol sheet.
3. Add each 100 µl of the supernatants from the standard serum (in duplicate),
negative control and patient samples into the appropriate wells of microtiter test
strips. Spare one well for substrate blank, e.g.:
Candida antigen quantitative
cavity A1
Substrate blank
cavity B1
Negative control
cavity C1
Standard serum
cavity D1
Standard serum
cavity E1
Patient sample 1....
4. Sample incubation for 60 minutes (+/- 3 min.) at 37 °C (+/- 1 °C) in moist chamber.
5. After incubation wash all wells with washing solution (by automated washer or
manually):
- aspirate or shake out the incubation solution
- fill each well with 300 µl washing solution
- aspirate or shake out the washing buffer
- repeat the washing procedure 4 times (altogether 5 times!)
- dry by tapping the microtiter plate on a paper towel
6. Addition of conjugate
Add 100 µl of the ready-to-use conjugate into the appropriate wells (except
substrate blank).
7. Conjugate incubation for 60 minutes (+/- 3 min.) at 37 °C (+/- 1 °C) in moist
chamber.
8. After incubation wash all wells with washing solution (see above).
9. Addition of substrate
Add 100 µl of ready-to-use TMB-substrate solution into each well (including well for
substrate blank!).
10. Substrate incubation for 30 minutes (+/- 1 min.) at 37 °C (+/- 1 °C), protected from
light in moist chamber.
11. Stopping of the reaction
Add 100 µl stopping solution into each well. Agitate the microtiter plate gently to mix.
12. Read extinction
Read optical density (OD) within 60 minutes at 450 nm against substrate blank,
reference wavelength between 620 nm and 690 nm (e.g. 650 nm).
Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Automatis che T estdurchführung @ 8\mod_1265792441716_18.doc @ 28694 @ 2
english
12
EN
7.6
Automated Test Procedure
SERION ELISA are suited for processing on automats and evaluated for use with
ImmunomatTM and Gemini. The automated processing is performed analogous to manual
use. Please note, that under special working-conditions internal laboratory adaptations of
the incubation times may be necessary.
Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Positi vkontrolle / Ric htig keits kontrolle @ 9\mod_1280219364971_18.doc @ 34540 @ 2
7.7
Positive Control / Accuracy Control
For the periodic verification of the test method, in order to fulfil the requirements of
laboratory internal quality management systems, we recommend using SERION ELISA
controls to determine precision and accuracy of SERION ELISA antigen test runs. The use
of SERION ELISA controls is described in specific instruction manuals.
Pos : 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Kapitelüberschrift: T ESTAU SWERTUN G + Erreger @ 8\mod_1265792998663_18.doc @ 28845 @ 1
english
13
8
TEST EVALUATION
Pos : 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/T estaus wertung: Ein- Punkt- Quantifizier ung @ 11\mod_1346846096430_18.doc @ 52175 @ 2
8.1
Single-Point Quantification with the 4PL Method
Optimised assignment of extinction signals to quantitative values is guaranteed by using
non-linear functions, which adjust a sigmoide curve without any further transformation to
OD-values. Determination of antigen concentrations with the SERION ELISA antigen is
carried out by the 4 parameter logistic-log-model (4 PL) which is ideal for exact curvefitting. It is based on the formula:
D-A
OD = A +
1 + e B(C - ln Conc.)
The parameters A, B, C, and D are representative for the exact shape of the curve:
1. lower asymptote
2. slope of the curve
3. turning point
4. upper asymptote
parameter A
parameter B
parameter C
parameter D
For each lot the standard curve is evaluated by Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg,
Germany) in repeated test runs under optimal conditions. Time consuming and cost
intensive construction of the standard curve by the user is not necessary.
For evaluation of antigen concentrations a lot specific standard curve as well as a lot
specific evaluation table is included with each SERION ELISA antigen test kit. The
evaluation software SERION evaluate as well as the Microsoft® Excel-based software tool
SERION activity are available on request.
To compensate for normal test variations and also for test run control a standard serum is
used in each individual test run. For this control serum a reference value with a validity
range is determined by the quality control of the producer. Within this range a correct
quantification of antigen concentration is ensured.
Pos : 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/T estg ültig keits kriteri en @ 8\mod_1265793547923_18.doc @ 28907 @ 2
english
14
EN
8.2
Criteria of Validity
-
The substrate blank must be < 0.25 OD.
-
The negative control must produce a negative test result.
-
By use of quantitative SERION ELISA antigen tests the mean OD-value (after
subtraction of the substrate blank!) of the standard serum must be within the validity
range, which is given on the lot specific quality control certificate.
-
The variation of OD-values of the standard serum may not be higher than 20 %.
If these criteria are not met, the test is not valid and must be repeated.
Pos : 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Aus wertung: Ü bersc hrift @ 8\mod_1265792620271_18.doc @ 28766 @ 2
8.3
Calculation SERION ELISA antigen Candida
Pos : 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Nic htautomatisi erte Aus wertung ELISA antigen @ 11\mod_1346846114323_18.doc @ 52192 @ 3
8.3.1 Non-automated Evaluation
For the SERION ELISA antigen test evaluation a lot-specific quality control certificate with
standard curve and an evaluation table is included in the test kit. The substrate blank must
be substracted from all OD values prior to evaluation.
Pos:
27 /Arbeitsanleitungen ELISA
antigen/Gültig
für@alle Dokumente/ELISA
antigen/Testauswertung/Testauswertung
Methoden
11\mod_1346849110626_18.doc
@ 52243
@
Method 1: Qualitative Evaluation
To fix the cut-off ranges multiply the mean value of the measured standard OD with the
numerical data of the quality control certificate (see special case formulas), e.g.:
OD = 0.502 x MW(STD) with upper cut-off
OD = 0.352 x MW(STD) with lower cut-off
If the measured mean absorbance value of the standard serum is 0.970 OD, the range of
the cut-off is in between 0.341 - 0.487 OD.
Method 2:
Continuous Determination of Antigen Activities using the Standard Curve
So called interassay variations (day to day deviations and laboratory to laboratory
deviations) are compensated by multiplication of the current measured value obtained with
a patient’s sample with the correction factor F. This factor is calculated as follows:
OD-reference value (of standard serum)
F =
OD-current value (of standard serum)
english
15
The procedure is necessary to adjust the current test level of the user with the lot-specific
standard curve. First, daily deviations have to be corrected by calculating the correction
factor F.
1.
The mean of the two OD-values of the standard serum has to be calculated and
checked that it is within the given validity range.
2.
Calculation of the factor F: the given reference value is divided by the mean of the
extinction of the standard serum:
F = reference value extinction STD serum / mean value extinction STD serum.
3.
All measured values of patient samples are multiplied by F.
4.
Antigen activities in IU/ml or U/ml can be determined from the standard curve with
the corrected values.
Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Automatisc he Aus wertung @ 8\mod_1265792721689_18.doc @ 28782 @ 3
8.3.2 Automatic Test Evaluation with Software SERION evaluate
After input of the four parameters and the reference value of the standard serum, antigen
activities are calculated online from processed and measured SERION ELISA antigen test
runs by the evaluation software SERION evaluate.
If the optical density of the standard is out of the valid range, the following message will
appear.
„Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24.” or
„Standard values differ more than 20 % in following groups: Group 1-24.”
In such cases the test run is invalid and should be repeated.
Parameters and reference value need to be changed only if there is a change of lot
(evaluation table shows parameters and reference values). Correct input of the lot specific
data can be checked on the basis of the standard serum activity (in IU/ml or U/ml)
assigned to the standard serum. The calculated mean value of the units has to correspond
to the unit value indicated on the lot specific certificate. There is an automatic correction of
the measured values. In the standard version the printout displays the following:
Sample code
OD-value
U/ml
Evaluation
Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Quantifizi erungsgrenz en @ 8\mod_1265793123986_18.doc @ 28861 @ 2
english
16
EN
8.4
Limits of Quantification
The limits of quantification are specified on the quality control certificate of the SERION
ELISA antigen test. The linearity of dilution within this range has been demonstrated in
comprehensive evaluation studies. In case a patient sample shows a test result above the
upper limit of quantification, the sample may be tested at a higher dilution. The thereby
determined antigen activity must be multiplied by the additional dilution factor.
Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Grenz wertbereic h @ 9\mod_1280134439293_18.doc @ 34518 @ 2
8.5
Borderline Range
The borderline range of the SERION ELISA antigen Candida test is specified on the
quality control certificate and indicates the range for borderline test results. Values
obtained, when testing a patient’s sample, which fall below this range indicate a negative
test result; values above the borderline range are interpreted positive. In cases where the
results are within the borderline range a definitive interpretation of the result is not
possible. In such cases, the test should be repeated in parallel with a follow-up sample
taken one to two weeks later (serum pair).
Pos : 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Kapitelüberschrift: Inter pretati on der Ergebniss e @ 8\mod_1265792956649_18.doc @ 28813 @ 2
8.6
Interpretation of Results
Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estaus wertung/Candi da antigen/Candi da antig en: Interpr etation der Ergebni sse @ 11\mod_1346846245660_18.doc @ 52226 @
Positive test results for patient samples indicate a Candida fungemia. Results can only be
interpreted in combination with the clinical picture and other detection methods.
A result can be considered as positive when at least 2.6 units are measured in the test.
Such a result indicates that the sample contains the quantity of Mannan that is associated
with 2.6 ng of Candida protein. However, it cannot distinguish between live or dead
organisms, respectively.
Negative test results do not exclude an acute infection, especially if high antibody titers are
found. In such cases it may be that the antigen is completely masked by antibodies and
even the denaturing procedure during sample preparation is not sufficient to allow
detection of the antigen. In addition, the point in time during an infection when a sample is
obtained, an unsuitable sample, poor sample preparation and storage can all lead to a
negative result.
Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Kapitelüberschrift: R eferenz ber eich ges under Pr obanden @ 8\mod_1265792966477_18.doc @ 28829 @ 2
8.7
Reference Range of healthy Individuals
Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estaus wertung/Candi da antigen/Candi da antig en: R efer enzbereic h g esunder Probanden @ 11\mod_1346681759863_18.doc @ 52051 @
Testing of random blood donor sera, collected in the region of southern Germany, with the
SERION ELISA antigen Candida test resulted in the following distribution. From 103 sera
tested with the SERION ELISA antigen Candida test, 92 (89.3 %) were negative, six sera
(5.8 %) gave a positive result and five samples (4.9 %) were determined to be borderline.
Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Leistungsmer kmal e/Kapitelüberschrift Leis tungs mer kmale @ 8\mod_1265793732010_18.doc @ 28956 @ 1
english
17
9
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Leistungsmer kmal e/Kapitelüberschrift: Sensiti vi tät und Spezifität @ 8\mod_1265793737103_18.doc @ 28988 @ 2
9.1
Sensitivity and Specificity
Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/Leis tungs mer kmale/Candi da antig en/Candi da antig en: Sensiti vität und Spezifität @ 11\mod_1346681729877_18.doc @ 52017 @
The SERION ELISA antigen Candida test was validated by the analysis of 148 serum
samples from blood donors and 93 specimens from patients, who showed signs of
candidiasis during intensive care treatment, in comparison to the results obtained with a
commercially avaliable assay of a leading European manufacturer. Sera classified as
borderline were not included in the calculation of sensitivity and specificity values.
Performance Characteristics
Sensitivity
Specificity
> 99.9 %
97.8 %
In another internal study, cross-reactivity with the species Candida guillermondii, Candida
glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis and Candida tropicalis with the SERION
ELISA antigen Candida was demonstrated in order to guarantee a comprehensive
Candida diagnosis.
Due to a similiarity of mannan with hydroxyethylstarch (HES), which is used in plasma
expanders for treatment of circulatory failure (hypovolemic, hemorrhagic and septic
shock), potential cross-reactivity was assessed. However, no cross-reaction with HES was
measureable when using the SERION ELISA antigen Candida test.
Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Leistungsmer kmal e/Kapitelüberschrift Pr äzisi on @ 8\mod_1265793734510_18.doc @ 28972 @ 2
9.2
Reproducibility
Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/Leis tungs mer kmale/Candi da antig en/Candi da antig en: Pr äzision @ 11\mod_1346681737927_18.doc @ 52034 @
Intraassay reproducibility was determined by testing sera of different reactivities 20 times
in one test run. Interassay reproducibility was determined by testing sera of different
reactivities in 10 independent test runs.
Standard deviation
Coefficient of Variation (CV %) =
x 100
Mean value
SERION ELISA antigen Candida:
Mean Value
Intraassay
Mean Value
Interassay
(OD)
(CV %)
(OD)
(CV %)
negative
borderline
0.223
0.507
9.6
2.4
0.225
0.476
7.3
5.3
positive
1.413
2.5
1.356
2.7
positive
2.851
2.0
2.442
8.1
Sample
english
18
EN
Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Allgemeine T exte ELISA antigen/Sicherheits maßnahmen @ 8\mod_1265797262616_18.doc @ 29413 @ 122
10 SAFETY MEASURES
10.1 Statements of Warning
The SERION ELISA antigen is designed for use by qualified personnel who are familiar
with good laboratory practice.
All kit reagents and human specimens should be handled carefully, using established good
laboratory practice.
-
This kit contains human blood components. Although all control- and cut-off sera
have been tested and found negative for anti-HIV-ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virussurface Antigen) and anti-HCV-ab, they should be considered potentially infectious.
-
Do not pipette by mouth.
-
Do not smoke, eat or drink in areas in which specimens or kit reagents are handled.
-
Wear disposable gloves, laboratory coat and safety glasses while handling kit
reagents or specimens. Wash hands thoroughly afterwards.
-
Patient’s material and other potentially infectious material should be
decontaminated after the test run.
Reagents should be stored safely and be unaccessible to unauthorized access e.g.
children.
-
10.2 Disposal
Please observe the relevant statutory requirements!
Pos : 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Liter atur /Kapi tel übersc hrift: Literatur @ 8\mod_1265793744978_18.doc @ 29004 @ 1
english
19
11 REFERENCES
Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/Liter atur/C andida antigen: Literatur @ 8\mod_1265797355862_0.doc @ 29429 @
[1]
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
Fegeler, W., Kipp, F. (2004) Candida- und Aspergillus-Antikörper-ELISA –
Erwartungs-werte positiver Antikörpernachweise aus Seren der klinischmykologischen Routine-diagnostik. Mycoses 47, 41–7.
[3]
Fukazawa, Y. (1989) Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical
basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Serol. 47, 3762.
[4]
Jones, J.M. (1990) Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Clin. Microbiol.
Rev. 3, 32-45.
[5]
Matthews, R.C., Burnie, J.P., Tabaqchali, S. (1987) Isolation of Immunodominant
Antigens from Sera of Patient with Systemic Candidiasis and Characterization of
Serological Response to Candida albicans. J. Clin. Microbiol. 25, 230-7.
[6]
Müllensiefen, M., Ringelmann,
Candidosen. Lab. med. 15, 410-3.
[7]
Repentigny, L. (1989) Serological Techniques for Diagnosis of Fungal Infections.
Eur. J. Clin. Microbio. Infec. 8, 362-75.
[8]
Robert Koch-Institut (2008) Epidemiologisches Bulletin 29.
[9]
Ruhnke, M., Rosseau, S., Graf, B. (2004) Invasive Pilzinfektionen auf der Intensivstationen. Arzneimitteltherapie 22, 360-70.
[10]
Rüchel, R., Debusmann, F. (2008) Serologie in der Diagnostik von Mykosen.
Chemother. J. 17, 264-6.
[11]
Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D.
(2002) Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a
strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida
species. Med. Microbiol. 51, 433-42.
[12]
Sendid, B. et al. (2006) Candidaemia and antifungal therapy in a French University
Hospital: rough trends over a decade and possible links. Infect. Dis. 6, 80.
[13]
Tietz, H.-J., Tausch, I. (1993) Differenzierte Candidaserologie auf dem Prüfstand.
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
Walsh, T.J. et al. (1991) Detection of Circulating Candida Enolase by Immunoassay
in Patients with Cancer and Invasive Candidiasis. New Engl. J. Med. 324, 1026-31.
[15]
Werle, E., Kappe, R., Fiehn, W., Sonntag, H.-G. (1994) Nachweis von AntiCandida-Antikörpern der Klassen IgM, IgG und IgA mittels Enymimmunoassays in
sequentiellen Serumproben hospitalisierter Patienten. Mycoses 36, 71-8.
[16]
Zöller, L., Krämer, I., Kappe, R., Sonntag, H.G. (1991) Enzyme Immuno Assay for
Invasive Candida Infections: Reactivity of somatic Antigens of Candida albicans. J.
Clin. Microbiol. 29, 1860-7.
R.
=== Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===
english
20
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
1
USO PREVISTO
2
PERTINENCIA DIAGNÓSTICA
3
SERION ELISA antigen – PRINCIPIO DE LA PRUEBA
4
COMPONENTES DEL KIT
5
MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
6
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
7
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA SERION ELISA antigen
7.1
Notas generales
7.2
Preparación y conservación de la muestra
7.3
Preparación de reactivos del kit
7.4
Visión general- procedimiento de la prueba
7.5
Procedimiento de pruebas manual
7.6
Procedimiento automatizado
7.7
Control positivo / control de exactitud
8
ES
CONTENIDO
EVALUACIÓN DE LAS PRUEBAS
8.1
Cuantificación de punto simple con el método 4PL
8.2
Criterios de validez
8.3
Cálculos del SERION ELISA antigen Candida
8.4
Límites de cuantificación
8.5
Intervalo dudoso
8.6
Interpretación de resultados
8.7
Intervalos de referencia de individuos sanos
9
CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
9.1
Sensibilidad y especificidad
9.2
Reproducibilidad
10
MEDIDAS DE SEGURIDAD
10.1
Declaraciones de advertencia
10.2
Eliminación
11
BIBLIOGRAFÍA
Nº de la versión actual: V 1.12/09-1
Versión previa: --
Enzimoinmunoensayo para la determinación de antígeno de Candida
Para uso diagnóstico in vitro
Nº de pedido:
ESR200
Pos : 3 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Allgemei ne Texte ELISA antigen/Kapitelüberschrift " Anwendungs ber eich" @ 8\mod_1265792390921_28.doc @ 28664 @ 1
1
USO PREVISTO
SERION ELISA antigen Candida es un inmunoensayo cuantitativo y cualitativo para la
detección de antígeno de Candida en el suero humano o plasma. El ensayo está
recomendado para la detección de candidiasis sistémica.
2
PERTINENCIA DIAGNÓSTICA
Candida albicans es un hongo ubicuo que, como todas las especies de Candida,
pertenece a la familia de los hongos de tipo de levadura. Dejando aparte la forma de
hongo que causa principalmente infecciones superficiales, los así llamados
pseudomicelios son otra manifestación morfológica de los hongos de tipo levadura. En
casos de micosis sistémica aparecen principalmente tubos germinales y el desarrollo de
pseudomicelios. Candida produce y excreta una serie de enzimas destructoras que
capacitan al posible microorganismo patógeno para penetrar en los vasos sanguíneos y
las barreras de las mucosas.
Las especies Candida ssp. se transmiten principalmente mediante contaminación por
suciedad de una persona a otra, siendo la principal vía de entrada la cavidad oral. Los
cambios en las propiedades fungistáticas de la piel, que son una consecuencia del valor
pH ligeramente ácido y de la flora bacteriana antagonista, pueden facilitar el
establecimiento de candidiasis superficial en la superficie de la piel. La micosis sistémica
es el resultado de la colonización de las membranas mucosas y en particular del tracto
gastrointestinal.
Candida ssp. puede adherirse a los epitelios de una gama de membranas mucosas
mediante proteínas de adherencia y a otras estructuras de la superficie celular. El
esquema a continuación muestra los pasos hipotéticos que pueden conducir a infecciones
diseminadas en caso de condiciones subyacentes severas. Una descripción exacta de los
diversos estadíos no es práctica (figura 1).
español
2
entrada en la
circulación sanguínea
transferencia al
lumen intestinal
Paso al lumen
estomacal
ES
Colonización del
tracto nasofaríngeo
persopción de
células de
cándida
transferencia al
sistema linfático
invasión de
múltiples
órganos
Figura 1: progresión de infecciones por cándida
La candidiasis se puede clasificar por lo general en dos grupos principales cuyas
características más importantes se enumeran en la tabla a continuación.
infecciones por Cándida
superficial
micosis profunda (invasiva)
localización
piel, mucosas
órganos principales
inmunocompetencia
del hospedador
+
+,-/-
factores de riesgo
embarazo
quimioterapia
diabetes
inmunosupresión iatrogénica
SIDA
catéter venoso central
disfunción de la piel
radioterapia
deficiente higiene bucal
quemaduras de alto grado
cirugía
progresión clínica
inocuo en la mayoría de los casos,
no es potencialmente mortal
tratamiento
tratamiento eficaz
en
la
la eficacia del tratamiento
depende del estadío de la
infección
Tabla 1: Características de las infecciones por Cándida
español
potencialmente mortal
mayoría de los casos,
3
El diagnóstico de una candidiasis basándose en métodos serológicos no es fácil en
absoluto. Por un lado la colonización pasajera por el hongo puede inducir una respuesta
de anticuerpos, mientras que, por otro lado, la micosis sistémica por Candida en pacientes
inmunodeprimidos puede dar como resultado únicamente cambios mínimos en las
actividades de los anticuerpos. Tales situaciones hacen necesaria la interpretación crítica
de los resultados serológicos. Además, las infecciones sistémicas por Candida pueden no
producir síntomas típicos.
Actualmente no es posible concluir que los resultados de diferentes sistemas de pruebas
para la detección de anticuerpos de Candida sean comparables o siquiera
intercambiables. La especificidad de los anticuerpos detectados depende
significativamente del sistema de pruebas (ELISA o HAT) o de la preparación de
antígenos utilizados. La detección de anticuerpos IgM con HAT es mejor que la detección
de IgG debido a las propiedades de aglutinación mayores de las moléculas de IgM. HAT
detecta principalmente anticuerpos frente a antígenos de la pared celular de hongos de
tipo levadura lo que hace la interpretación serológica aún más compleja pero proporciona
la oportunidad de una diferenciación.
Los cambios en las concentraciones de anticuerpos pueden ser detectables con ELISA
pero no con HAT, haciendo ventajosa una combinación de ambas técnicas, p.ej. en caso
de disminución de la actividad de anticuerpo IgM y simultáneamente aumento de la
actividad de anticuerpo IgG.
En la actualidad no existe una técnica única en aislamiento para un diagnóstico serológico
definitivo de la candidiasis. La vigilancia de los pacientes en riesgo y el control de la
terapia requieren el uso de diversos métodos, incluida la serología y la detección de
antígenos. La prueba SERION ELISA antigen Candida resulta de particular ayuda en tales
situaciones gracias a la detección de antígenos específicos de Candida en muestras de
pacientes.
Pos:
7@
/Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
ELISA
antigen @für
8\mod_1265792007310_28.doc
@
28641
1
3 SERION ELISA antigen – PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) es un inmunoensayo, que es
particularmente apropiado para la determinación de anticuerpos y antígenos en el campo
de la serología de las enfermedades infecciosas. La reacción está basada en la
interacción específica de los anticuerpos con su antígeno correspondiente. Las tiras de
prueba de la placa de microtitulación SERION ELISA antigen están recubiertas con
anticuerpos específicos dirigidos frente al patógeno de interés. Si hay presencia de
antígenos en la muestra del paciente, se unen al anticuerpo fijado. Un anticuerpo
secundario, que ha sido conjugado con la enzima peroxidasa, detecta el complejo inmune
y se une a éste. El sustrato incoloro del peróxido de hidrógeno (H2O2) y el cromógeno
tetrametilbenzidina (TMB) se convierten en un producto de color azul. La adición de
solución de parada cambia el color a amarillo. La intensidad de la señal de este producto
de reacción es proporcional a la concentración del antígeno en la muestra y se mide por
fotometría.
und
Pos: 8 /Arbeitsanleitungen ELISA
antigen/Gültig
für nur ein Dokument/Inhalt
Zusammensetzung/Candida
antigen:
Inhalt
@
11\mod_1346845806738_28.doc
@ 52092
@ 1 und Zusammensetzung
español
4
4
COMPONENTES DEL KIT
partes /
Volumen
Pocillos de microtitulación en tiras separables, cada una de ellas con ocho 12 partes
pocillos individuales recubiertos de anticuerpo
(En total son 96) MTP ,
1 bastidor.
3 x 3 ml
Suero patrón STD ,
Antígeno de Candida albicans en suero humano complementado con suero fetal de
ternera (FCS)
negativo para Ac anti-VIH, Acs HB (HBs-Ag, antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B) y Ac anti-VHC;
conservante: azida sódica < 0,1 %.
2 x 3 ml
Suero control negativo NEG ,
Suero humano complementado con suero fetal de ternera (FCS)
negativo para Ac anti-VIH, Acs HB (HBs-Ag, antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B) y Ac anti-VHC;
conservante: azida sódica < 0,1 %.
Conjugado anti-Candida albicans (listo para usar) PODCR ,
Conjugado de anticuerpo anti-Candida albicans con peroxidasa de rábano picante;
estabilizado con solución de estabilización de proteínas que contiene detergente;
conservante: ProClin® 300 0,1 %.
13 ml
Concentrado de dilución de lavado (suficiente para 1500 ml) WASH ,
Solución salina tamponada TRIS con Tween 20, concentración 30x
conservante: ProClin® 300 < 0,1 %.
2 x 25 ml
Solución amortiguadora de dilución SAMB ,
15 ml
Solución ácida sin conservantes.
Solución de parada STOP ,
Ácido sulfúrico 0,5 N.
13 ml
Solución sustrato TMB (listo para usar) TMB ,
Solución sustrato peróxido de hidrógeno TMB,
conservante: Kathon CG < 0,01 %.
13 ml
Certificado de control de calidad con curva patrón y tabla de evaluación INFO , 2 partes
(cuantificación de antígenos en U/ml).
ELISA
antigen/Gültig
für benötigte
antigen/Zusätzlich
benötigte
Materialien @
8\mod_1265796058727_28.doc
@ 29305
@1
español
5
ES
Componentes de la prueba
5
-
MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
equipo habitual de laboratorio
fotómetro para placas de microtitulación con filtro, longitud de onda 450 nm,
longitud de onda de referencia recomendada 620 nm - 690 nm (p.ej., 650 nm)
incubador a 37 °C
bloque térmico 110 °C
cámara de humectación
agua destilada
Clips de cierre por presión (Click-Clips, nº de pedido VT120)
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Lagerung
@
11\mod_1346935956390_28.doc
@ 52262
@ 1 und Haltbarkeit
español
6
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Reactivo
Conservación
Estabilidad
Tiras de
microtitulación
(recubiertas con
anticuerpo)
sin abrir
ver fecha de caducidad;
tras la apertura entre 2 – 8 °C en una bolsa de período de conservación
aluminio cerrada con desecante
mínimo: 4 semanas
Las tiras que no se utilizan se deben conservar secas período de conservación
y herméticamente cerradas en la bolsa de aluminio en caso de utilización y
conservación adecuadas
cerrada.
hasta la fecha de
caducidad
Sueros control /
Sueros patrón
tras la apertura entre 2 – 8 °C
Conjugado
solución lista para usar entre 2 – 8 °C
Evite la contaminación p.ej., utilizando puntas
estériles.
18 meses desde la
fecha de producción
sin abrir
Solución
amortiguadora de
dilución
Solución de lavado
24 meses desde la
24 meses desde la
tras la apertura entre 2 – 8 °C
Deseche las soluciones si están turbias
6 meses
Concentrado tras la apertura entre 2 – 8 °C
24 meses desde la
dilución de trabajo entre 2 – 8 °C
2 semanas;
dilución de trabajo a temperatura ambiente
1 semana
Los frascos utilizados para la dilución de trabajo se
deben limpiar regularmente. Deseche las soluciones
si están turbias
Sustrato TMB
solución lista para usar entre 2 – 8 °C,
conservar protegida de la luz
Evite la contaminación p.ej.,
estériles.
utilizando puntas
24 meses desde la
Desechar si la solución se vuelve azul (extinción a
650 nm frente al agua destilada > 0,2 DO).
Solución de parada
Tras la apertura a temperatura ambiente
español
7
ver fecha de caducidad
ES
6
7
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA SERION ELISA antigen
7.1
Notas generales
Utilice únicamente reactivos SERION ELISA antigen al utilizar inmunoensayos SERION
ELISA antigen. Los componentes no deben intercambiarse con reactivos de otros
fabricantes. Los sueros patrón y control, así como el conjugado de los inmunoensayos
SERION ELISA antigen están definidos exclusivamente para el kit de pruebas que se va a
utilizar y no deben utilizarse en otros lotes.
La solución amortiguadora de dilución, la solución de lavado, el sustrato y la solución de
parada se pueden utilizar para todos los inmunoensayos SERION ELISA antigen
independientemente del lote y de la prueba.
Si no han sido abiertos, todos los componentes de las pruebas SERION ELISA antigen
pueden, si se conservan como corresponde, ser utilizados hasta las fechas de caducidad
proporcionadas en las etiquetas. Los reactivos no se pueden utilizar después de la fecha
de caducidad.
La dilución o alteración de los reactivos puede dar como resultado una pérdida de
sensibilidad.
Evite la exposición de los reactivos a la luz intensa durante la conservación e incubación.
Los reactivos deben estar firmemente cerrados tras su uso para evitar evaporación y
contaminación.
Para abrir la bolsa de aluminio de la placa de microtitulación, corte la parte superior del
lado marcado únicamente, para garantizar poder cerrarla de nuevo adecuadamente. No
utilice las tiras si la bolsa de aluminio está dañada o si la bolsa con las tiras restantes y el
desecante no ha sido cerrada de nuevo adecuadamente.
Utilice técnicas asépticas al retirar alícuotas de los tubos de reactivos para evitar la
contaminación. Para evitar resultados falsos positivos, asegúrese de no entrar en contacto
o salpicar las paredes superiores de los pocillos mientras se pipetea el conjugado. Tenga
cuidado para no mezclar los tapones de los frascos y/o viales.
En particular, la solución de sustrato TMB es sensible a sustancias oxidantes y a iones
metálicos pesados. Se debe conservar protegida de la luz en todo momento y abrir
solamente en condiciones de baja luminosidad inmediatamente antes de su uso. Esta
solución tiene un color azul-verde claro.
Se deberá evitar el contacto del sustrato y la solución de parada con la piel.
La reproducibilidad de los resultados de las pruebas es dependiente de una mezcla a
fondo de los reactivos. Agite los matraces que contienen sueros control antes de usar
también todas las muestras tras la dilución (por ejemplo, utilizando un mezclador de
vórtice).
español
8
Solamente se pueden lograr resultados óptimos si se siguen estrictamente las
instrucciones.
El inmunoensayo SERION ELISA antigen es válido únicamente si se cumplen los criterios
de validación específicos del lote en el certificado de control de calidad.
Un lavado adecuado evita la falta de especificidad de la prueba. Por lo tanto, el
procedimiento de lavado se debe llevar a cabo cuidadosamente. Todos los pocillos de
fondo plano se deben rellenar con volúmenes iguales de solución amortiguadora de
lavado. Al final del procedimiento asegúrese de que los pocillos no tienen nada de
solución amortiguadora de lavado para evitar efectos de dilución no controlados. ¡Evite la
formación de espuma!
Tenga cuidado para no dañar la inscripción (patógeno / AG) en las tiras de prueba de
microtitulación durante el lavado y aspiración para evitar confusiones.
7.2
Preparación y conservación de la muestra
Las muestras lipémicas, hemolíticas o ictéricas (Suero o plasma) únicamente deben
analizarse con precaución. No se deben realizar pruebas de muestras evidentemente
contaminadas. El suero o plasma (EDTA, citrato, heparina) recogido de acuerdo con
métodos normalizados de laboratorio son muestras apropiadas.
español
9
ES
Asegúrese de pipetear con cuidado y respetar los tiempos y temperaturas de incubación
proporcionados. Diferencias significativas de tiempos entre el pipeteo del primer y el
último pocillo de la placa de microtitulación al dispensar muestras de sueros control,
conjugado o sustrato pueden dar como resultado diferentes tiempos de preincubación, lo
que puede influir en la precisión y reproducibilidad de los resultados.
7.2.1 Preparación de las muestras
Antes de efectuar el análisis, las muestras (muestras de pacientes, patrón y control
negativo) (V1) se deben diluir en solución amortiguadora (V2) como sigue:
V1 + V2 = 3+1
añadir
300 µl
de muestra (V1)
a
100 µl
solución amortiguadora de dilución (V2)
Tras la dilución y antes de pipetear a la placa de microtitulación, se deben mezclar a
fondo las muestras para preparar una solución homogénea.
Finalmente se deberán calentar las muestras a 110 °C (+/- 5 °C) durante 10 minutos. ¡Es
esencial mantener tanto el tiempo como la temperatura indicados! Los vasos de reactivos
estándar no son apropiados para esta etapa de termólisis y recomendamos la utilización
de vasos de reacción safe-lock o similares con un cierre roscado.
Si se utiliza un termostato de bloque térmico, la temperatura real se deberá controlar
utilizando un termómetro calibrado. Considere el período de precalentamiento específico
del dispositivo del bloque térmico. Si es necesario, el bloque térmico debe ajustarse a la
temperatura necesaria. Durante la termólisis, se formará un precipitado blanco turbio, que
debe eliminarse mediante centrifugación en una centrífuga de sobremesa prerrefrigerada
(4 °C) a 10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante claro se puede utilizar a
continuación en la prueba.
7.2.2 Conservación de las muestras
Las muestras del paciente tratadas no se deben conservar durante más de 24 horas entre
2 y 8 °C. las muestras no tratadas no se deben conservar entre 2-8°C durante más de 7
días. Es posible extender la conservación a ≤ -20 °C. Evite la congelación y
descongelación repetida de las muestras.
español
10
7.3
Preparación de reactivos del kit
ES
Lleve todos los reactivos hasta la temperatura ambiente antes de realizar las
pruebas.
7.3.1 Tiras de prueba de microtitulación
Las tiras de pruebas de microtitulación han sido envasadas junto con un desecante
en una bolsa de aluminio. Extraiga del bastidor los huecos no necesarios y
póngalos dentro de la bolsa de aluminio. Cierre cuidadosamente la bolsa para
garantizar condiciones herméticas.
7.3.2 Sueros control / sueros patrón
Los sueros de control y patrón deben diluirse con solución amortiguadora de
muestra para desnaturalizarse a continuación. Para cada ejecución de las pruebas
– independientemente del número de tiras de pruebas de microtitulación que se
vayan a utilizar - se deben incluir los sueros control y patrón. Los sueros patrón
deberán configurarse por duplicado.
7.3.3 Conjugado (listo para usar)
Evite la contaminación del conjugado listo para usar p.ej., utilizando puntas
estériles.
7.3.4 Solución de lavado
Diluya concentrado de solución amortiguadora de lavado (V1) 1:30 con agua
destilada hasta un volumen final de V2.
Ejemplo:
Concentrado de solución
amortiguadora (V1)
25 ml
1 ml
Volumen final (V2)
750 ml
30 ml
7.3.5 Sustrato TMB (listo para usar)
Evite la contaminación de la solución de sustrato lista para usar p.ej., utilizando
puntas estériles.
El sustrato TMB tiene un color verde azulado claro y cualquier solución que
muestre un color fuerte (extinción a 650 nm frente a agua destilada de > 0,2 DO)
debe desecharse.
7.3.6 Solución de parada (lista para usar)
español
11
7.4
Visión general- procedimiento de la prueba
cuantitativo
Preparación de las muestras y de los sueros de control y patrón
Dilución de la muestra
(muestras de paciente, sueros de control y patrón)
300 µl de muestra + 100 µl solución amortiguadora de
dilución
INCUBACIÓN 10 min. / 110 °C
CENTRIFUGACIÓN 10 min. / 10.000 × g / 4 °C
Retener sobrenadante, desechar pellet
Añadir sobrenadante de las muestras (100 µl)
LAVAR (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipetear solución de conjugado PODCR (100 µl)
Pipetear solución de sustrato TMB (100 µl)
Pipetear solución de parada STOP (100 µl)
LEER EXTINCIÓN a 450 nm (ref. 650 nm)
español
12
Procedimiento de pruebas manual
1. Tratamiento previo de las muestras (muestras de pacientes, suero patrón y de control)
como se describe.
2. Coloque el número necesario de huecos en el bastidor y prepare una hoja de
protocolo.
3. Añada 100 µl de cada uno de los sobrenadantes del suero estándar (en
duplicado), el control negativo y las muestras de pacientes en los pocillos
apropiados de las tiras de prueba de microtitulación.
Candida antigen cuantitativo
cavidad A1
Sustrato en blanco
cavidad B1
Control negativo
cavidad C1 Suero patrón
cavidad D1 Suero patrón
cavidad E1
Muestra del paciente 1....
4. Incubación de la muestra durante 60 minutos (+/- 3 min) a 37℃ (+/- 1°C) en la
cámara de humectación.
5. Tras la incubación lave todos los pocillos con solución de lavado (dispositivo
automatizado o manualmente):
- aspire o agite la solución de incubación
- llene cada pocillo con 300 µl de solución de lavado
- aspire o agite la solución amortiguadora de lavado
- repita el procedimiento de lavado 4 veces (¡en total son 5 veces!)
- séquelo dando ligeros golpecitos a la placa de microtitulación sobre una toallita de
papel
6. Adición de conjugado
Añada 100 µl of del conjugado listo para usar a los pocillos apropiados (excepto el
sustrato en blanco)
7. Incubación del conjugado durante 60 minutos (+/- 3 min) a 37 °C (+/- 1 °C) en la
cámara de humectación.
8. Tras la incubación lave todos los pocillos con solución de lavado (ver más arriba)
9. Adición de sustrato
Añada 100 µl de solución de sustrato TMB listo para usar (¡incluyendo el pocillo
para el sustrato en blanco!)
10. Incubación del sustrato durante 30 minutos (+/- 1 min.) a 37 °C (+/- 1°C) protegido
de la luz en la cámara de humectación.
11. Parada de la reacción
Añada 100 µl de solución de parada a cada pocillo, agite suavemente la placa de
microtitulación para mezclar.
12. Extinción de la lectura
Lea la densidad óptica (DO) en los siguientes 60 minutos a 450 nm frente al sustrato
blanco, oscilando la longitud de onda de referencia entre 620 nm y 690 nm (p.ej., 650
nm).
español
13
ES
7.5
7.6
Procedimiento automatizado
SERION ELISA es apto para el procesado en equipos automáticos y ha sido evaluado
para su uso con ImmunomatTM y Gemini. El proceso automatizado se realiza de manera
análoga al uso manual. Se advierte que bajo condiciones de trabajo especiales internas
del laboratorio pueden ser necesarias adaptaciones de los tiempos de incubación.
7.7
Control positivo / control de exactitud
Para la verificación periódica del método de prueba, y para satisfacer los requisitos de los
sistemas de gestión de calidad internos de laboratorio, recomendamos la utilización de
SERION ELISA controls para determinar la precisión y exactitud de las cargas de pruebas
SERION ELISA antigen. La utilización de SERION ELISA controls se describe en
manuales de instrucciones específicos.
español
14
8
EVALUACIÓN DE LAS PRUEBAS
8.1
Cuantificación de punto simple con el método 4PL
La asignación optimizada de las señales de extinción para valores cuantitativos se
garantiza mediante la utilización de funciones no lineales, que se ajustan a una curva
sigmoide sin ninguna transformación adicional a valores de DO. La determinación de las
concentraciones de antígeno con SERION ELISA antigen se lleva a cabo mediante el
modelo logarítmico logístico de cuatro parámetros (4 PL) que es ideal para un ajuste
exacto de las curvas. Está basado en la fórmula:
D-A
DO = A +
1 + e B(C - En Conc.)
Los parámetros A, B, C, y D son representativos para la forma exacta de la curva:
1. asíntota inferior
2. pendiente de la curva
3. punto de inflexión
4. asíntota superior
parámetro A
parámetro B
parámetro C
parámetro D
Para cada lote, la curva patrón es evaluada por el Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg,
Alemania) en pruebas repetidas bajo condiciones óptimas. No es necesaria una costosa y
dilatada construcción de la curva estándar por el usuario.
Para la evaluación de concentraciones de antígeno se incluye una curva estándar
específica del lote y también una tabla de evaluación específica del lote con cada kit de
pruebas SERION ELISA antigen. El software de evaluación SERION evaluate, así como
el instrumento de software basado en Microsoft® Excel SERION activity están disponibles
bajo petición.
Para compensar las variaciones normales de las pruebas y también para el control de la
ejecución de las pruebas se utiliza un suero patrón en cada carga de pruebas individual.
Para este suero control, se determina un valor de referencia con un intervalo de validez
mediante el control de calidad del fabricante. Dentro de este intervalo está garantizada
una correcta cuantificación de la concentración de antígenos.
español
15
ES
8.2
Criterios de validez
-
El blanco de sustrato debe ser < 0,25 DO.
-
El control negativo debe producir un resultado negativo de la prueba.
-
Mediante el uso de pruebas cuantitativas SERION ELISA antigen el valor de DO
medio (¡después de restar el blanco de sustrato!) del suero patrón debe estar
dentro del intervalo de validez, que se proporciona en el certificado de control de
calidad específico del lote.
-
La variación de valores DO del suero patrón no puede ser superior al 20 %.
Si no se cumplen estos criterios, la prueba no es válida y se debe repetir.
8.3
Cálculos del SERION ELISA antigen Candida
8.3.1 Evaluación no automatizada
Para la evaluación de la prueba SERION ELISA antigen se incluye en el kit de pruebas un
certificado de control de calidad específico del lote con una curva patrón y una tabla de
evaluación. El blanco de sustrato se debe restar de todos los valores de DO antes de la
evaluación.
Pos:
27 /Arbeitsanleitungen ELISA
antigen/Gültig
Methoden
11\mod_1346849110626_28.doc
@ 52245
@
Método 1: Evaluación cualitativa
Para fijar los intervalos de corte multiplique el valor medio de la DO estándar medida con
los datos numéricos del certificado de control de calidad (ver fórmulas de casos
especiales), p.ej.:
DO = 0,502 x PM(STD) con corte superior
DO = 0,352 x PM(STD) con corte inferior
Si el valor de absorbancia medio medido del suero patrón es 0,970 DO, el intervalo de
corte está entre 0,341-0,487 DO.
español
16
Determinación continua de actividades de antígeno utilizando la curva
Las así llamadas variaciones interensayo (desviaciones de un día a otro y de un
laboratorio a otro) se compensan mediante la multiplicación del valor medido actual
obtenido con una muestra del paciente con el factor de corrección F. este factor se calcula
como sigue:
Valor de referencia DO (de suero patrón)
F =
Valor actual DO (de suero patrón)
El procedimiento es necesario para ajustar el nivel actual de la prueba del usuario con la
curva estándar específica del lote. En primer lugar, las desviaciones diarias tienen que ser
corregidas calculando el factor de corrección F.
1.
Se debe calcular la media de los dos valores DO del suero patrón y comprobar que
se encuentra dentro del intervalo de validez dado.
2.
Cálculo del factor F: el valor de referencia dado se divide por la media de la
extinción del suero patrón:
F = valor referencia extinción suero STD / valor medio extinción suero STD.
3.
Todos los valores medidos de las muestras de pacientes se multiplican por F.
4.
Las actividades de antígeno en UI/ml o U/ml se pueden determinar a partir de la
curva estándar con los valores corregidos.
español
17
ES
Método 2:
estándar
8.3.2 Evaluación automática de la prueba con el software SERION evaluate
Después de la entrada de los cuatro parámetros y el valor de referencia del patrón de
suero, las actividades de antígenos se calculan en línea a partir de cargas de pruebas
SERION ELISA antigen procesadas y medidas mediante el software de evaluación
SERION evaluate.
Si la densidad óptica del patrón está fuera del intervalo válido, aparecerá el siguiente
mensaje.
“Valores estándar fuera de intervalos en los siguientes grupos: grupo 1-24.” o
“Los valores estándar difieren más del 20% en los siguientes grupos: grupo 1-24.”
En dichos casos la ejecución de la prueba es invalida y debe repetirse.
Los parámetros y el valor de referencia deben ser modificados únicamente si existe un
cambio de lote (la tabla de evaluación muestra parámetros y valores de referencia). La
entrada correcta de los datos específicos del lote se puede comprobar basándose en la
actividad del suero patrón (en UI/ml o U/ml) asignada al suero patrón. El valor medio
calculado de las unidades debe corresponderse con el valor unitario indicado en el
certificado específico del lote. Hay una corrección automática de los valores medidos. En
la versión estándar el resultado muestra lo siguiente:
Código de la muestra
Valor DO
U/ml
Evaluación
8.4
Límites de cuantificación
Los límites de cuantificación se especifican en el certificado de control de calidad de la
prueba SERION ELISA antigen. La linealidad de la dilución dentro de este intervalo ha
sido demostrada en estudios de evaluación exhaustivos. En caso de que una muestra del
paciente muestre un resultado de la prueba por encima del límite superior de
cuantificación, se puede ensayar la prueba a una dilución mayor. La actividad de antígeno
determinada así se debe multiplicar por el factor de dilución adicional.
8.5
Intervalo dudoso
El intervalo dudoso de la prueba SERION ELISA antigen Candida se especifica en el
certificado de control de calidad e indica el intervalo para resultados dudosos de las
pruebas. Los valores obtenidos, al analizar una muestra de un paciente, que caen por
debajo de este intervalo indican un resultado negativo de la prueba; los valores por
encima del intervalo dudoso se interpretan como positivos. En los casos en los que los
resultados están dentro del intervalo dudoso no es posible una interpretación definitiva del
resultado. En tales casos, se debe repetir la prueba en paralelo con una muestra de
seguimiento tomada de 1 a 2 semanas más tarde (par de suero).
español
18
8.6
Interpretación de resultados
Unos resultados positivos de la prueba para las muestras del paciente indican una
fungemia por Candida. Los resultados pueden ser interpretados solamente en
combinación con el cuadro clínico y otros métodos de detección.
Un resultado puede ser considerado positivo cuando en la prueba se miden al menos 2,6
unidades. Tal resultado indica que la muestra contiene la cantidad de manano que se
correlaciona con 2,6 ng de proteína de Candida. Sin embargo no puede discriminar entre
organismos vivos o muertos respectivamente.
Los resultados negativos de la prueba no excluyen una infección aguda, en especial si se
hallan títulos altos de anticuerpo. En tales casos puede ser que el antígeno haya sido
enmascarado por completo por anticuerpos y que incluso el procedimiento de
desnaturalización durante la preparación de la muestra no sea suficiente para permitir la
detección del antígeno. Además, el momento en el tiempo durante una infección en el que
se obtiene una muestra, y una eficiente preparación y conservación de la muestra pueden
conducir a un resultado negativo.
8.7
Intervalos de referencia de individuos sanos
Las pruebas de sueros de donantes de sangre elegidos al azar, recogidos en la región del
sur de Alemania, con las pruebas de SERION ELISA antigen Candida dieron como
resultado la distribución siguiente. De 103 sueros ensayados con la prueba de SERION
ELISA antigen Candida, 92 (89,3 %) fueron negativos, seis sueros (5.8 %) dieron un
resultado positivo y cinco muestras (4,9 %) se consideraron dudosas.
9
CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
9.1
Sensibilidad y especificidad
La prueba SERION ELISA antigen Candida fue validada mediante el análisis de 148
muestras de suero de donantes de sangre y 93 muestras de pacientes, que presentaron
signos de candidiasis durante el tratamiento de cuidados intensivos, en comparación con
los resultados obtenidos con un ensayo disponible comercialmente de un importante
fabricante europeo. Los sueros clasificados como dudosos no se incluyeron en el cálculo
de los valores de sensibilidad y especificidad.
Características de funcionamiento
Sensibilidad
Especificidad
> 99.9 %
97.8 %
En otro estudio interno, se demostró la reactividad cruzada con las especies Candida
guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis y Candida tropicalis
con la prueba SERION ELISA antigen Candida a fin de garantizar un amplio diagnóstico
de Candida.
español
19
ES
Debido a una similitud del manano con el almidón hidroxietílico (HES), que se utiliza en
los expansores de plasma para el tratamiento de fallos circulatorios (shock hipovolémico,
hemorrágico y séptico), se evaluó la reactividad cruzada potencial. No obstante, no se
midió ninguna reacción cruzada con HES cuando se usó la prueba SERION ELISA
antigen Candida.
9.2
Reproducibilidad
La reproducibilidad intraensayo se determinó mediante ensayo de sueros de diferentes
reactividades 20 veces en una carga de pruebas. La reproducibilidad interensayo se
determinó mediante ensayo de sueros de diferentes reactividades en 10 cargas
independientes de pruebas.
Desviación típica
Coeficiente de variación (CV %) =
x 100
Valor de la media
Muestra
Valor de la
media
(DO)
Intraensayo
(CV %)
Valor de la
media
(DO)
Interensayo
(CV %)
negativo
0,223
9,6
0,225
7,3
dudoso
0,507
2,4
0,476
5,3
positivo
1,413
2,5
1,356
2,7
positivo
2,851
2,0
2,442
8,1
español
20
10 MEDIDAS DE SEGURIDAD
ES
10.1 Declaraciones de advertencia
El SERION ELISA antigen está diseñado para ser utilizado por personal cualificado y
familiarizado con las buenas prácticas de laboratorio.
Todos los reactivos del kit y las muestras humanas deben manipularse con cuidado, de
acuerdo a la buena práctica de laboratorio establecida.
-
Este kit contiene componentes de sangre humana. Aunque todos los sueros de
control y de corte han sido analizados y el resultado ha sido negativo para anti-HIVab (anticuerpo anti VIH), HBs-Ag (antígeno de superficie del virus de hepatitis B) y
anti-HCV-ab (anticuerpo anti VHC), se deberán considerar como potencialmente
infecciosos.
-
No pipetear con la boca.
-
No fume, coma ni beba en zonas en las que se manipulen muestras o reactivos del
kit.
-
Utilice guantes desechables, bata de laboratorio y gafas de seguridad mientras
manipula reactivos del kit o muestras. Lávese las manos a fondo después.
-
El material del paciente y demás material potencialmente infeccioso se debe
descontaminar después de la ejecución de la prueba.
Los reactivos se deben conservar de modo seguro y deben ser inaccesibles a un
acceso no autorizado p.ej., niños.
-
10.2 Eliminación
Cumpla con los requisitos reglamentarios pertinentes.
español
21
11 BIBLIOGRAFÍA
[1]
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
[3]
[4]
Rev. 3, 32-45.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
[15]
[16]
R.
español
22
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
1
ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ
2
∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΣΧΕΤΙΚΟΤΗΤΑ
3
SERION ELISA antigen – ΑΡΧΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
4
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΚΑΙ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ KIT
5
ΥΛΙΚΟ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΑΛΛΑ ∆ΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ
6
ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ
7
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ SERION ELISA antigen
7.1
Γενικές Σηµειώσεις
7.2
Προετοιµασία δείγµατος και φύλαξη
7.3
Προετοιµασία των αντιδραστηρίων του κιτ
7.4
Επισκόπηση - ∆ιαδικασία δοκιµασίας
7.5
Χειροκίνητη διαδικασία δοκιµασίας
7.6
Αυτόµατη διαδικασία δοκιµασίας
7.7
Θετικός έλεγχος/ Έλεγχος ακρίβειας
8
GR
ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
8.1
Ποσοτικό προσδιορισµός µε τη µέθοδο 4PL
8.2
Κριτήρια ισχύος δοκιµασίας
8.3
Υπολογισµός SERION ELISA antigen Candida
8.4
Όρια ποσοτικού προσδιορισµού
8.5
Εύρος οριακών τιµών
8.6
Ερµηνεία των αποτελεσµάτων
8.7
Εύρος αναφοράς υγιών ατόµων
9
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ
9.1
Ευαισθησία και Ειδικότητα
9.2
Επαναληψιµότητα
10
ΜΕΤΡΑ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ
10.1
Προειδοποιήσεις/ Προφυλάξεις
10.2
∆ιάθεση
11
ΑΝΑΦΟΡΕΣ
τρέχουσα έκδοση αριθ. Β: V 1.12/09-1
προηγούµενη έκδοση Β: --
Ενζυµοανοσολογική µέθοδος για την ανίχνευση του αντιγόνου της Candida
για διαγνωστική χρήση in vitro
Αριθµ. Παραγγελίας:
ESR200
1 ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ
To SERION ELISA antigen Candida είναι µία ποσοτική και ποιοτική ανοσολογική µέθοδος
για την ανίχνευση αντιγόνου Candida στον ανθρώπινο ορό ή πλάσµα. Η µέθοδος
συνιστάται για την ανίχνευσης και συστηµικής καντιτίασης.
2
∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΣΧΕΤΙΚΟΤΗΤΑ
Το λευκάζον ωίδιο είναι ένας παντού ευρισκόµενος ζυµοµύκητας, ο οποίος ανήκει όπως
όλα τα είδη ωιδίων στην οικογένεια των ζυµοµυκήτων Πέρα από τη ζυµοµυκητιακή µορφή,
η οποία εµφανίζεται κυρίως σε επιφανειακές λοιµώξεις, τα ονοµαζόµενα ψευδοµυκήλια
αποτελούν µία ακόµη µορφολογική εκδήλωση των ζυµοµυκήτων. Οι βλαστικοί σωλήνες
και η δηµιουργία ψευδοµυκήλιων συµβαίνει συνήθως σε περιπτώσεις συστηµατικών
µυκητιάσεων Το υποείδος Candida παράγει και εκκρίνει µία πληθώρα καταστρεπτικών
ενζύµων, τα οποία προσφέρουν στους ευκαιριακά παθογόνους µικροοργανισµούς τη
δυνατότητα διείσδυσης διαµέσου φραγµών βλεννογόνων και αιµοφόρων αγγείων.
Το υποείδος Candida µεταδίδεται κατά κύριο λόγο µέσω εκκρίσεων από άτοµο σε άτοµο.
Η κύρια πύλη εισόδου είναι η στοµατική κοιλότητα. Μεταβολές στις µυκητοστατικές
ιδιότητες του δέρµατος, οι οποίες αποτελούν συνέπεια ελαφρώς όξινου pH και της
ανταγωνιστικής βακτηριακής χλωρίδας, µπορούν να διευκολύνουν την εγκατάσταση
επιπολής καντιντίασης στην επιφάνεια του δέρµατος. Η συστηµατική µυκητίαση οφείλεται
σε εποικισµό βλεννογόνων, ιδιαίτερα του γαστρεντερικού σωλήνα.
Το υποείδος Candida έχει την ικανότητα να προσκολλάται στα επιθήλια διαφόρων
βλεννογόνων µεµβρανών µε τη βοήθεια συγκολλητικών πρωτεϊνών και άλλων
επιφανειακών δοµών. Το ακόλουθο σχεδιάγραµµα απεικονίζει τα υποθετικά βήµατα, που
είναι δυνατόν να οδηγήσουν σε διάσπαρτες λοιµώξεις σε περιπτώσεις βαριών παθήσεων
στο υπόβαθρο. Η ακριβής διάκριση των διαφόρων σταδίων δεν είναι πρακτική (εικόνα 1).
Ελληνικά
2
∆ηµιουργία αποικίας στην
περιοχή στόµα-φάρυγγας
Πέρασµα στον
Αυλό του στοµάχου
Είσοδος στον αυλό
των εντέρων
Έισοδος στο
Λεµφικό σύστ.
Έκκριση των
Κυττάρων των
ωιδίων
GR
Έίσοδος στην
κυκλοφορία
Προσβολή
Πληθώρας οργάνων
Εικόνα 1: πρόοδος των λοιµώξεων από ωίδια
Γενικά µπορούν να διαχωριστούν οι λοιµώξεις από ωίδια σε δύο µεγάλες οµάδες, των
οποίων τα βασικά χαρακτηριστικά αναφέρονται συνοπτικά στον ακόλουθο πίνακα
Λοιµώξεις από Candida
εντόπιση
επιφανειακές
Εν
τω
(διηθητική)
βάθει
δέρµα, βλεννογόνος
πρωτοπαθή όργανα
Ανοσολογική
+
ικανότητα του ξενιστή
+,-/-
Παράγοντες κινδύνου κύηση
χηµειοθεραπεία
µυκητίαση
διαβήτης
ιατρογενής ανοσοκαταστολή
ΑΙDS
Κεντρικός φλεβικός καθετήρας
δερµατολογικές διαταραχές
ακτινοθεραπεία
µειωµένη υγιεινή του στόµατος
Εγκαύµατα µεγάλου βαθµού
χειρουργεία
κλινική πρόοδος
τις περισσότερες φορές, ακίνδυνη
κανένας κίνδυνος για τη ζωή
θεραπεία
αποτελεσµατική θεραπεία
Πίνακας 1: Χαρακτηριστικά των λοιµώξεων από Candida
Ελληνικά
3
τις
περισσότερες
επικίνδυνη για τη ζωή
φορές
αποτελεσµατικότητα
της
θεραπείας εξαρτώµενη από το
στάδιο της λοίµωξης
Η διάγνωση της καντιντίασης µε βάση ορολογικές µεθόδους δεν είναι σαφής: Από την µία
πλευρά, ο προσωρινός αποικισµός µε ζυµοµύκητες είναι δυνατό να προκαλέσει
αντισωµατική απόκριση ενώ από την άλλη πλευρά οι συστηµατικές µυκητιάσεις από
Candida σε ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς µπορούν να επιφέρουν µικρές µόνο
µεταβολές στις δραστηριότητες των αντισωµάτων. Αυτές οι καταστάσεις καθιστούν
αναγκαία την κριτική αξιολόγηση ορολογικών ευρηµάτων. Επιπλέον, οι συστηµατικές
λοιµώξεις µε Candida µπορεί να µην προκαλέσουν κλασικά συµπτώµατα.
Βάσει των τωρινών µας γνώσεων δεν είναι δυνατόν να συγκριθούν τα αποτελέσµατα
διαφόρων συστηµάτων δοκιµασιών για τον καθορισµό των αντισωµάτων ενάντια στο ωίδιο
ή ακόµη και να υπάρξει ανταλλαγή µεταξύ τους. Η εξειδίκευση των αντισωµάτων που
καθορίστηκαν σε ένα δείγµα εξέτασης εξαρτάται βασικά από το σύστηµα δοκιµασιών
(ELISA ή HAT) ή από το παρασκεύασµα του αντιγόνου που χρησιµοποιήθηκε. Κατά την
δοκιµασία ΗΑΤ ανιχνεύονται τα αντισώµατα IgΜ καλύτερα από ότι τα αντισώµατα IgG,
λόγω της υψηλότερης ικανότητας συγκόλλησης των IgΜ µορίων. Η ΗΑΤ ανιχνεύει κυρίως
αντισώµατα ενάντια σε αντιγόνα του κυτταρικού τοιχώµατος των βλαστοµύκητων, πράγµα
το οποίο κάνει την ορολογική ερµηνεία ακόµη πιο σύνθετη, προσφέρει όµως και την
δυνατότητα της διαφοροποίησης.
Οι µεταβολές στη συγκέντρωση των αντισωµάτων µπορεί να ανιχνεύονται µε ELISA όµως
όχι µε ΗΑΤ καθιστώντας πλεονεκτικό το συνδυασµό των δύο τεχνικών, π.χ. σε περίπτωση
µείωσης της δραστηριότητας των αντισωµάτων IgM και ταυτόχρονη αύξηση της
δραστηριότητας των αντισωµάτων IgG.
Προς το παρόν δεν υπάρχει µεµονωµένη τεχνική που να επιτρέπει οριστική ορολογική
διάγνωση της καντιντίασης. Η παρακολούθηση ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο και ο
έλεγχος της θεραπείας απαιτούν τη χρήση διαφόρων µεθόδων, συµπεριλαµβανοµένων
ορολογικών ελέγχων και ανίχνευσης αντιγόνων. Η εξέταση SERION ELISA antigen
Candida είναι ιδιαίτερα χρήσιµη σε αυτές τις καταστάσεις, ανιχνεύοντας ειδικό αντιγόνο
Candida σε δείγµατα ασθενών.
Pos:
/Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
ELISA
antigen @für
8\mod_1265792007310_53.doc
@
286467 @
1
3 SERION ELISA antigen – ΑΡΧΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
Το ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) είναι µία ανοσολογική µέθοδος, η οποία
είναι κατάλληλη ιδιαίτερα για τον καθαρισµό αντισωµάτων και αντιγόνων στα πλαίσια της
ορολογίας των λοιµώξεων. Η αντίδραση βασίζεται στην ειδική αλληλεπίδραση των
αντισωµάτων µε τα αντίστοιχα αντιγόνα τους. Οι ταινίες δοκιµασίας της πλάκας
µικροτιτλοποίησης του SERION ELISA antigen είναι επικαλυµµένη µε ειδικά αντισώµατα
τα οποία κατευθύνονται ενάντια στο παθογόνο ενδιαφέροντος. Εάν υπάρχουν αντιγόνα
στο δείγµα του ασθενή, αυτά συνδέονται µε το σταθεροποιηµένο αντίσωµα. Ένα δεύτερο
αντίσωµα, το οποίο έχει συζευχθεί µε την ενζυµική υπεροξειδάση, ανιχνεύει και συνδέεται
µε το ανοσολογικό σύµπλεγµα. Το άχρωµο υπόστρωµα υδρογονική υπεροξειδάση (H2O2)
και η χρωµογόνος τετραµεθυλοβενζιδίνη (TMB) µετατρέπονται σε ένα χρωµατισµένο µπλε
προϊόν. Η προσθήκη διαλύµατος διακοπής µεταβάλλει το χρώµα σε κίτρινο. Η ένταση
σήµατος αυτού του προϊόντος αντίδρασης είναι ανάλογη µε τη συγκέντρωση του αντιγόνου
στο δείγµα και µετράται φωτοµετρικά.
und
antigen/Gültig
antigen:
Inhalt
@
11\mod_1346845806738_53.doc
@ 52097
Ελληνικά
4
4
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΚΑΙ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ KIT
Τεµάχια /
Όγκος
Αποσπάσιµες ταινίες δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης µε οκτώ επικαλυµµένες µε 12 τεµάχια
αντίσωµα µεµονωµένες κοιλότητες.
(συνολικά 96) MTP ,
1 πλαίσιο δοκιµασίας.
3 x 3 ml
Πρότυπος ορός STD ,
Αντιγόνο Candida albicans σε ανθρώπινο ορό µε προσθήκη εµβρυϊκού ορού βοός
(FCS),
αρνητικό για αντίσωµα αντι-HIV, αντιγόνο HBs (αντιγόνο επιφάνειας ηπατίτιδας B) και
αντίσωµα αντι-HCV;
συντηρητικό: < 0.1 % αζίδιο νατρίου.
2 x 3 ml
Αρνητικός ορός ελέγχου NEG ,
Ανθρώπινος ορός µε προσθήκη εµβρυϊκού ορού βοός (FCS),
αρνητικό για αντίσωµα αντι-HIV, αντιγόνο HBs (αντιγόνο επιφάνειας ηπατίτιδας B) και
αντίσωµα αντι-HCV;
συντηρητικό: < 0.1 % αζίδιο νατρίου.
13 ml
Σύζευξη αντι-Candida albicans (έτοιµο προς χρήση) PODCR ,
Αντι-Candida albicans αντίσωµα συζευγµένο µε ραφανιδική υπεροξειδάση
Σταθεροποιηµένο µε πρωτεϊνούχο διάλυµα σταθεροποίησης το οποίο περιέχει
απολυµαντικό
συντηρητικό: 0.1 % ProClin® 300.
Συµπύκνωµα διαλύµατος πλύσης (επαρκές για 1500 ml) WASH ,
Αλατούχο διάλυµα ρυθµισµένο µε TRIS µε Tween 20, 30πλάσιας συµπύκνωσης
συντηρητικό: < 0.1 % ProClin® 300.
2 x 25 ml
Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης SAMB ,
Όξινο διάλυµα χωρίς συντηρητικά.
15 ml
∆ιάλυµα διακοπής STOP ,
0.5 N θειικό οξύ.
13 ml
∆ιάλυµα υποστρώµατος TMB, (έτοιµο προς χρήση) ΤΜΒ
13 ml
∆ιάλυµα υδρογονικής υπεροξειδάσης υποστρώµατος TΜB,
συντηρητικό: < 0.01 % Kathon CG.
∆ίπλωµα ελέγχου ποιότητας µε πρότυπη καµπύλη και πίνακα τιµών INFO ,
(ποσοτικοποίηση αντιγόνων σε U/ml).
ELISA
antigen/Gültig
für benötigte
antigen/Zusätzlich
benötigte
Materialien @
8\mod_1265796058727_53.doc
@ 29310
@1
Ελληνικά
5
2 τεµάχια
GR
Συστατικά της δοκιµασίας
5
-
ΥΛΙΚΟ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΑΛΛΑ ∆ΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ
κοινός εργαστηριακός εξοπλισµός
φωτόµετρο για πλάκες µικροτιτλοποίησης µε φίλτρο, µήκος κύµατος 450 nm,
συνιστώµενο µήκος κύµατος αναφοράς 620 nm - 690 nm (π.χ. 650 nm)
επωαστήρας 37 °C
Θερµαντική πλάκα 110 °C
θάλαµος υγρασίας
αποσταγµένο νερό
Συνδετήρες Click (αριθµ. παραγγελίας VT120)
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Lagerung
@
11\mod_1346935956390_53.doc
@ 52267
@ 1 und Haltbarkeit
Ελληνικά
6
ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ
Αντιδραστήριο
Φύλαξη
Σταθερότητα
Ταινίες
µικροτιτλοποίησης
(επικαλυµµένες µε
αντίσωµα)
κλειστό
βλέπε ηµεροµηνία λήξης,
µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C σε κλειστό περιέκτη ελάχιστη διάρκεια ζωής
αλουµινίου µε αποξηραντικό µέσο
τέσσερις εβδοµάδες
Ταινίες οι οποίες δε χρησιµοποιούνται πρέπει να διάρκεια ζωής σε
φυλάσσονται στον κλειστό περιέκτη αλουµινίου σε ξηρό περίπτωση ορθής
περιβάλλον.
χρήσης και φύλαξης
µέχρι την ηµεροµηνία
λήξης
Οροί ελέγχου /
Πρότυποι οροί
µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C
Σύζευξη
έτοιµο προς χρήση διάλυµα στους 2 – 8 °C
24 µήνες από την
ηµεροµηνία παραγωγής
Αποφύγετε την µόλυνση π.χ. µε τη χρήση αποστειρωµένων 18 µήνες από την
άκρων προχοϊδων.
Ρυθµιστικό διάλυµα
αραίωσης
∆ιάλυµα πλύσης
κλειστό
µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C
Απορρίψτε τα διαλύµατα σε περίπτωση που είναι θολά
6 µήνες
Συµπύκνωµα µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C
ηµεροµηνία παραγωγή
αραίωση εργασίας στους 2 – 8 °C
2 εβδοµάδες
αραίωση εργασίας σε θερµοκρασία δωµατίου
1 εβδοµάδα
Οι φιάλες οι οποίες χρησιµοποιούνται για την αραίωση
εργασίας θα πρέπει να καθαρίζονται τακτικά. Απορρίψτε τα
διαλύµατα σε περίπτωση που είναι θολά
Υπόστρωµα ΤMB
έτοιµο προς χρήση διάλυµα στους 2 – 8 °C,
φυλάσσεται προστατευµένο από το φως
Αποφύγετε την µόλυνση π.χ. µε τη χρήση αποστειρωµένων ηµεροµηνία παραγωγή
άκρων προχοϊδων.
Απορρίψτε
εάν
το
διάλυµα
χρωµατιστεί
µπλε
(απορρόφηση στα 650 nm έναντι αποσταγµένου ύδατος .
> 0,2 OD).
∆ιάλυµα διακοπής
Μετά από το άνοιγµα σε θερµοκρασία δωµατίου
Ελληνικά
7
GR
6
7
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ SERION ELISA antigen
7.1
Γενικές Σηµειώσεις
Να χρησιµοποιείτε µόνο αντιδραστήρια SERION ELISA antigen όταν χρησιµοποιείτε τις
ανοσολογικές δοκιµασίες SERION ELISA antigen. Τα συστατικά στοιχεία δεν πρέπει να
αντικαθιστώνται από αντιδραστήρια άλλων κατασκευαστών. Οι πρότυποι οροί και οι οροί
ελέγχου όπως και το σύζευγµα των ανοσολογικών δοκιµασιών SERION ELISA antigen
έχουν οριστεί ειδικά για το κιτ δοκιµασίας που πρόκειται να χρησιµοποιηθούν και δεν
πρέπει να χρησιµοποιούνται µε άλλες παρτίδες.
Το ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης, το διάλυµα πλύσης, το υπόστρωµα και το διάλυµα
διακοπής µπορούν να χρησιµοποιηθούν µε όλες τις ανοσολογικές δοκιµασίες SERION
ELISA antigen ανεξαρτήτως παρτίδας και δοκιµασίας.
Σε κλειστή συσκευασία, όλα τα συστατικά στοιχεία των δοκιµασιών SERION ELISA
antigen, µπορούν, όταν φυλάσσονται αναλόγως, να χρησιµοποιηθούν µέχρι και την
ηµεροµηνία λήξης που αναφέρεται στις ετικέτες. Τα αντιδραστήρια δεν πρέπει να
χρησιµοποιούνται µετά από την ηµεροµηνία λήξης.
Αραίωση εναλλαγή των αντιδραστηρίων είναι δυνατό να προκαλέσουν απώλεια της
ευαισθησίας.
Αποφύγετε την έκθεση των αντιδραστηρίων σε έντονο φως κατά τη διάρκεια της φύλαξης
και επώασης. Τα αντιδραστήρια πρέπει να φυλάσσονται καλά κλεισµένα µετά από τη
χρήση, ώστε να αποφεύγονται η εξάτµιση και η µόλυνσή τους.
Για να ανοίξετε τον περιέκτη αλουµινίου της πλάκας µικροτιτλοποίησης κόψτε µόνο την
κορυφή στη σηµαδεµένη πλευρά, ώστε να µπορεί να ξανακλείσει κατάλληλα. Μη
χρησιµοποιείτε τις ταινίες εάν ο περιέκτης αλουµινίου έχει υποστεί βλάβη ή εάν ο
περιέκτης µε τις υπολειπόµενες ταινίες δεν έχει ξανακλείσει σωστά.
Χρησιµοποιείτε άσηπτες τεχνικές όταν αποµακρύνετε τµήµατα από τους σωληνίσκους
αντιδραστηρίων ώστε να αποφεύγεται η επιµόλυνση. Για να αποφευχθούν ψευδώς θετικά
αποτελέσµατα, εξασφαλίστε ότι δεν ακουµπάτε ή πιτσιλάτε τα άνω τοιχώµατα των
κοιλοτήτων κατά το πιπετάρισµα της σύζευξης. Προσέχετε να µη ανταλλάσσετε τα καπάκια
των φιαλών και/ ή φιαλιδίων.
Ιδιαίτερα το διάλυµα υποστρώµατος TMB είναι ευαίσθητο σε οξειδωτικές ουσίες και ιόντα
βαρέων µετάλλων. Πρέπει να φυλάσσεται µακριά από το φως όλες τις ώρες και µόνο µη
ανοιγµένο σε συνθήκες χαµηλού φωτισµού άµεσα πριν από τη χρήση. Αυτό το διάλυµα
έχει ανοιχτόχρωµο µπλε-πράσινο χρώµα.
Θα πρέπει να αποφεύγεται η δερµατική επαφή µε το υπόστρωµα και το διάλυµα διακοπής.
Η δυνατότητα αναπαραγωγής των αποτελεσµάτων της δοκιµασίας εξαρτάται από τη
λεπτοµερή µίξη των αντιδραστηρίων . Ανακινείστε τις φιάλες που περιέχουν τους ορούς
ελέγχου πριν από τη χρήση και επίσης όλα τα δείγµατα µετά από την αραίωση (π.χ. µε τη
χρήση ενός αναµίκτη vortex).
Ελληνικά
8
Τα βέλτιστα αποτελέσµατα µπορούν να επιτευχθούν µόνο εάν τηρούνται αυστηρά οι
οδηγίες.
Η ανοσολογική µέθοδος SERION ELISA antigen ισχύει µόνο εάν εκπληρώνονται τα ειδικά
για την παρτίδα κριτήρια επικύρωσης στο πιστοποιητικό ποιοτικού ελέγχου.
Η επαρκής πλύση αποφεύγει τις µη ειδικεύσεις της δοκιµασίας. Για το λόγο αυτό, η
διαδικασία πλύσης θα πρέπει να διεξάγεται προσεκτικά. Όλες οι κοιλότητες στον επίπεδο
πυθµένα θα πρέπει να πληρώνονται µε όµοιους όγκους ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης.
Στο τέλος της διαδικασίας εξασφαλίστε ότι οι κοιλότητες είναι πλήρως ελεύθερες από
ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης προκειµένου να αποφευχθούν ανεξέλεγκτες επιδράσεις
αραίωσης. Αποφύγετε τη δηµιουργία αφρού!
∆ώστε προσοχή να µην προκαλέσετε βλάβη στην επιγραφή (παθογόνο/ AG) στις ταινίες
δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης κατά τη διάρκεια της πλύσης και αναρρόφησης ώστε να
αποφευχθεί η σύγχυση.
7.2
Προετοιµασία δείγµατος και φύλαξη
Λιπαιµικά, αιµολυµένα ή ικτερικά δείγµατα (ορός ή πλάσµα) θα πρέπει να δοκιµάζονται
µόνο µε προσοχή. Τα προφανώς µολυσµένα δείγµατα δεν πρέπει να δοκιµάζονται. Ο
ορός ή το πλάσµα (EDTA, κιτρικό άλας, ηπαρίνη) που συλλέγονται σύµφωνα µε τις
πρότυπες εργαστηριακές µεθόδους είναι κατάλληλα δείγµατα.
Ελληνικά
9
GR
Βεβαιωθείτε ότι πιπετάρετε προσεκτικά και σύµφωνα µε τους δεδοµένους χρόνους και τις
θερµοκρασίες επώασης . Σηµαντικές χρονικές διαφορές µεταξύ του πιπεταρίσµατος της
πρώτης και της τελευταίας κοιλότητας της πλάκας µικροτιτλοποίησης όταν διανέµονται
δείγµατα και οροί ελέγχου, η σύζευξη ή το υπόστρωµα είναι δυνατό να οδηγήσουν σε
διαφορετικούς χρόνους προεπώασης, οι οποίοι µπορούν να επηρεάσουν την ακρίβεια και
τη δυνατότητα αναπαραγωγής των αποτελεσµάτων.
7.2.1 Προετοιµασία δειγµάτων
Πριν τη διενέργεια της δοκιµασίας, τα δείγµατα (δείγµατα του ασθενή, πρότυπα και
Αρνητικός ορός ελέγχου) (V1) πρέπει να αραιώνονται σε ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης (V2)
ως εξής:
V1 + V2 = 3+1
προσθήκη
300 µl
δείγµα (V1)
σε κάθε
100 µl
Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης (V2)
Μετά από την αραίωση πριν το πιπετάρισµα στην πλάκα µικροτιτλοποίησης πρέπει τα
δείγµατα πρέπει να αναµιγνύονται καλά, ώστε να προκύπτει ένα οµοιογενές διάλυµα.
Τέλος, τα δείγµατα πρέπει να θερµαίνονται στους 110 °C (+/- 5 °C) για 10 λεπτά. Είναι
απαραίτητο να τηρούνται και τα δύο, ο χρόνος και η καθορισµένη θερµοκρασία! Οι
κανονικοί δοκιµαστικοί σωλήνες δεν είναι κατάλληλοι για αυτό το βήµα θερµόλυσης και
συνιστούµε τη χρήση δοκιµαστικών σωλήνων µε ασφαλής σφράγισµα ή όµοιους σωλήνες
µε βιδωτό κούµπωµα.
Η χρήση θερµοστάτη θερµαντικής πλάκας απαιτεί τον έλεγχο της τρέχουσας
θερµοκρασίας µε βαθµονοµηµένο θερµόµετρο. Λάβετε υπόψη το, ειδικό για τη συσκευή,
διάστηµα προκαταρκτικής θέρµανσης της θερµαντικής πλάκας. Εάν είναι απαραίτητο, η
θερµαντική πλάκα πρέπει να ρυθµίζεται στην απαιτούµενη θερµοκρασία. Κατά τη διάρκεια
της θερµόλυσης, θα σχηµατιστεί ένα λευκό, θολό ίζηµα, το οποίο θα πρέπει να
αποµακρυνθεί µέσω φυγοκέντρισης σε προψυγµένο (4 °C) επιτραπέζιο φυγοκεντρητή σε
10.000 × g για 10 λεπτά. Το διαυγές υπερκείµενο µπορεί κατόπιν να χρησιµοποιηθεί στην
εξέταση.
7.2.2 Φύλαξη δειγµάτων
Τα επεξεργασµένα δείγµατα ασθενή δε θα πρέπει να φυλάσσονται περισσότερο από 24
ώρες στους 2 – 8 °C. Τα µη επεξεργασµένα δείγµατα δε θα πρέπει να φυλάσσονται στους
2-8°C για περισσότερες από 7 ηµέρες. Παρατεταµένη φύλαξη είναι δυνατή στους ≤ -20
°C. Aποφύγετε την επαναλαµβανόµενη κατάψυξη και απόψυξη των δειγµάτων.
Ελληνικά
10
7.3
Προετοιµασία των αντιδραστηρίων του κιτ
Προσαρµόστε όλα τα αντιδραστήρια σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τη
δοκιµασία.
Οι ταινίες δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης σε πλαίσια είναι συσκευασµένες µε ένα
αποξηραντικό µέσο σε έναν περιέκτη αλουµινίου. Πάρτε τις µη απαιτούµενες
κοιλότητες από το πλαίσιο και τις επανατοποθετήστε τις στον περιέκτη αλουµινίου.
Κλείστε τον περιέκτη προσεκτικά για να εξασφαλίσετε αεροστεγείς συνθήκες.
7.3.2 Οροί ελέγχου / Πρότυποι οροί
Οι οροί ελέγχου και οι πρότυποι οροί πρέπει να αραιώνονται µε ρυθµιστικό διάλυµα
δείγµατος και κατόπιν να µετουσιώνονται. Για κάθε εκτέλεση δοκιµασίας –
ανεξαρτήτως του αριθµού ταινιών δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης που
χρησιµοποιούνται – πρέπει να συµπεριλαµβάνονται οι οροί ελέγχου και οι πρότυποι
οροί. Οι πρότυποι οροί πρέπει να τοποθετούνται εις διπλούν .
7.3.3 Σύζευγµα (έτοιµο προς χρήση)
Αποφύγετε την επιµόλυνση του έτοιµου
χρησιµοποιώντας αποστειρωµένα ρύγχη.
για
χρήση
συζεύγµατος
π.χ.
7.3.4 ∆ιάλυµα πλύσης
Αραιώστε το συµπύκνωµα του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης (V1) 1:30 µε
αποσταγµένο νερό σε τελικό όγκο V2.
Παράδειγµα:
Συµπύκνωµα ρυθµιστικού
διαλύµατος (V1)
25 ml
Τελικός όγκος (V2)
1 ml
30 ml
750 ml
7.3.5 Υπόστρωµα TMB (έτοιµο προς χρήση)
Αποφύγετε την επιµόλυνση του έτοιµου για χρήση διαλύµατος υποστρώµατος π.χ.
χρησιµοποιώντας αποστειρωµένα ρύγχη.
Το υπόστρωµα TMB έχει χρωµατιστεί µε ανοιχτό µπλε-πράσινο χρώµα και κάθε
διάλυµα µε ισχυρό χρώµα (εξασθένιση στα 650 mm έναντι απεσταγµένου νερού >
0.2 OD) πρέπει να απορρίπτεται.
7.3.6 ∆ιάλυµα διακοπής (έτοιµο προς χρήση)
Ελληνικά
11
GR
7.3.1 Ταινίες δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης
7.4
Επισκόπηση - ∆ιαδικασία δοκιµασίας
ποσοτικά
Προετοιµασία δειγµάτων, πρότυπου ορού και ορού ελέγχου
Αραίωση δειγµάτων
(∆είγµατα ασθενών, ορός ελέγχου και πρότυπος ορός)
300 µl δείγµατος + 100 µl ρυθµιστικού διαλύµατος αραίωσης
ΕΠΩΑΣΗ 10 min. / 110 °C
ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΙΣΗ 10 min. / 10,000 × g / 4 °C
Κρατήστε το υπερκείµενο, απορρίψτε το ίζηµα
Προσθέστε υπερκείµενο από δείγµατα (100 µl)
ΠΛΥΣΗ (5 x 300 µl DIL WASH )
Πιπετάρετε διάλυµα συζεύγµατος PODCR (100 µl)
ΠΛΥΣΗ (5 x 300 µl DIL WASH )
Πιπετάρετε διάλυµα υποστρώµατος TMB (100 µl)
Πιπετάρετε διάλυµα διακοπής STOP (100 µl)
∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΤΗΝ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΣΤΑ 450 nm
(αναφ. 650 nm)
Ελληνικά
12
Χειροκίνητη διαδικασία δοκιµασίας
1. Προκαταρκτική επεξεργασία δειγµάτων (δείγµατα ασθενών, πρότυπος ορός και ορός
ελέγχου), σύµφωνα µε την περιγραφή.
2. Τοποθετήστε τον απαιτούµενο αριθµό κοιλοτήτων στο πλαίσιο και προετοιµάστε
ένα φύλλο πρωτοκόλλου .
3. Προσθέστε 100 µl από κάθε υπερκείµενο από τον πρότυπο ορό (εις διπλούν),
αρνητικό έλεγχο και δείγµατα ασθενών στις κατάλληλες κοιλότητες των ταινιών
εξέτασης µικροτιτλοποίησης. Αφήστε µία κοιλότητα για το τυφλό υπόστρωµα, π.χ. .:
Candida antigen ποσοτική
κοιλότητα A1 Υπόστρωµα τυφλό
κοιλότητα B1 Αρνητικός έλεγχος
κοιλότητα C1 Πρότυπος ορός
κοιλότητα D1 Πρότυπος ορός
κοιλότητα E1 ∆είγµα ασθενή 1....
4. Επώαση δείγµατος για 60 λεπτά (+/- 3 min) στους 37 °C (+/- 1 ℃) σε θάλαµο
υγρασίας
5. Μετά από την επώαση πλύνετε όλες τις κοιλότητες µε διάλυµα πλύσης (µε αυτόµατο
πλύσης ή χειροκίνητα).
- αναρροφήστε ή ανακινήστε για να εξάγετε το διάλυµα επώασης
- γεµίστε κάθε κοιλότητα µε 300 µl διαλύµατος πλύσης
- αναρροφήστε ή ανακινήστε για να εξάγετε το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης
- επαναλάβετε τη διαδικασία πλύσης 4 φορές (συνολικά 5 φορές!)
- στεγνώστε χτυπώντας την πλάκα µικροτιτλοποίησης σε µία χαρτοπετσέτα
6. Προσθήκη του συζεύγµατος
Προσθέστε 100 µl από το έτοιµο προς χρήση σύζευγµα Fehler!
Dokumentvariable nicht definiert. στις κατάλληλες κοιλότητες (εξαίρεση τυφλό
υπόστρωµα)
7. Επώαση συζεύγµατος για 60 λεπτά (+/- 3 min) στους 37 °C (+/- 1 ℃) σε θάλαµο
υγρασίας
8. Μετά από την επώαση πλύνετε όλες τις κοιλότητες µε διάλυµα πλύσης (βλέπε
παραπάνω)
9. Προσθήκη υποστρώµατος
Προσθέστε 100 µl έτοιµου προς χρήση διαλύµατος υποστρώµατος TMB σε κάθε
κοιλότητα (συµπεριλαµβανοµένου τυφλού υποστρώµατος!)
10. Επώαση υποστρώµατος για 30 λεπτά (+/- 1 min) στους 37 °C (+/- 1 °C) σε θάλαµο
υγρασίας, προστατευµένο από το ηλιακό φως
11. ∆ιακοπή της αντίδρασης
Προσθέστε 100 µl διαλύµατος διακοπής σε κάθε κοιλότητα. Ανακινήστε ελαφρά
την πλάκα µικροτιτλοποίησης για την ανάµιξη.
12. Ανάγνωση εξασθένισης
∆ιαβάστε την οπτική πυκνότητα (OD) εντός 60 λεπτών στα 450 nm έναντι τυφλού
υποστρώµατος, µήκος κύµατος αναφοράς µεταξύ 620 nm και 690 nm (π.χ. 650 nm).
Ελληνικά
13
GR
7.5
7.6
Αυτόµατη διαδικασία δοκιµασίας
Το SERION ELISA είναι προσαρµοσµένο για την επεξεργασία σε αυτόµατα µηχανήµατα
και ρυθµισµένα για τη χρήση µε ImmunomatTM και Gemini. Η αυτόµατη διαδικασία είναι
ανάλογα σχεδιασµένη µε τη χειροκίνητη χρήση. Παρακαλώ λάβετε υπόψη ότι υπό ειδικές
συνθήκες εργασίας, ίσως να είναι απαραίτητες εσωτερικές εργαστηριακές προσαρµογές.
7.7
Θετικός έλεγχος/ Έλεγχος ακρίβειας
Για την περιοδική επαλήθευση της µεθόδου δοκιµασίας, προκειµένου να ικανοποιηθούν οι
απαιτήσεις συστηµάτων διαχείρισης εσωτερική εργαστηριακής ποιότητας, συνιστούµε τη
χρήση ελέγχων SERION ELISA controls για τον καθορισµό ακρίβειας και αξιοπιστίας των
κύκλων δοκιµασίας SERION ELISA antigen. Η χρήση ελέγχων SERION ELISA controls
περιγράφεται σε ειδικά εγχειρίδια οδηγιών.
Ελληνικά
14
8
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
Ποσοτικό προσδιορισµός µε τη µέθοδο 4PL
Η βελτιστοποιηµένη απονοµή σηµάτων απορρόφησης στις ποσοτικές τιµές εξασφαλίζεται
µε τη χρησιµοποίηση µη γραµµικών λειτουργιών, οι οποίες ρυθµίζουν µια σιγµοειδή
καµπύλη χωρίς περαιτέρω µετασχηµατισµό στις τιµές οπτικής πυκνότητας (OD). Ο
προσδιορισµός των συγκεντρώσεων αντιγόνων µε το SERION ELISA antigen διενεργείται
µε το µοντέλο λογιστικής 4 παραµέτρων (4 PL) το οποίο είναι ιδανικό για την ακριβή
προσαρµογή της καµπύλης. Βασίζεται στον τύπο:
D-A
OD = A +
1 + e B(C - ln Conc.)
Οι παράµετροι A, B, C, και D είναι αντιπροσωπευτικές για την ακριβή µορφή της
καµπύλης:
1. χαµηλότερη ασύµπτωτος
2. κλίση της καµπύλης
3. σηµείο καµπής
4. ανώτερη ασύµπτωτος
παράµετρος A
παράµετρος B
παράµετρος C
παράµετρος D
Για κάθε παρτίδα η πρότυπη καµπύλη υπολογίζεται από το Ινστιτούτο Virion\Serion ΕΠΕ
(Würzburg, Γερµανία) σε επαναλαµβανόµενους κύκλους δοκιµασίας υπό ιδανικές
συνθήκες. ∆εν απαιτείται κατανάλωση χρόνου και πολύ δαπανηρή κατασκευή πρότυπης
καµπύλης από το χρήστη.
Για τον υπολογισµό των συγκεντρώσεων αντιγόνων µίας ειδικής για την παρτίδα
πρότυπης καµπύλης καθώς επίσης και ενός ειδικού για την καµπύλη πίνακα υπολογισµού
συµπεριλαµβάνονται σε κάθε κιτ δοκιµασίας SERION ELISA antigen. Το λογισµικό
υπολογισµού SERION evaluate όπως και το εργαλείο λογισµικού της Microsoft®
βασισµένο σε Excel, SERION activity διατίθενται κατόπιν αιτήσεως .
Για την εξισορρόπηση των φυσιολογικών εναλλαγών της δοκιµασίας και για τον έλεγχο της
ποιότητας του κύκλου της δοκιµασίας χρησιµοποιείται σε κάθε µεµονωµένο κύκλο
δοκιµασίας ένας πρότυπος ορός. Για αυτόν τον ορό ελέγχου προσδιορίζεται µία τιµή
αναφοράς µε εύρος ισχύος στον ποιοτικό έλεγχο του κατασκευαστή. Εντός αυτών των
ορίων εξασφαλίζεται ο ορθός ποσοτικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης αντιγόνων.
Ελληνικά
15
GR
8.1
8.2
Κριτήρια ισχύος δοκιµασίας
-
Το κενό υπόστρωµα πρέπει να είναι < 0.25 OD.
-
Ο αρνητικός έλεγχος πρέπει να παράγει αρνητικό αποτέλεσµα δοκιµασίας.
-
Κατά τη χρήση ποσοτικών δοκιµασιών SERION ELISA antigen η µέση τιµή OD
(µετά από την αφαίρεση του κενού υποστρώµατος!) του πρότυπου ορού πρέπει να
βρίσκεται εντός του εύρους ισχύος, το οποίο ορίζεται στο πιστοποιητικό ποιοτικού
ελέγχου ειδικό για την παρτίδα.
-
Η µεταβολή των τιµών OD του πρότυπου ορού ή δεν µπορεί να είναι υψηλότερη
από 20 %.
Εάν δεν τηρούνται αυτά τα κριτήρια, η δοκιµασία δεν έχει ισχύ και πρέπει να
επαναλαµβάνεται.
8.3
Υπολογισµός SERION ELISA antigen Candida
8.3.1 Μη- αυτόµατος υπολογισµός
Για την αξιολόγηση της δοκιµασίας SERION ELISA antigen συµπεριλαµβάνεται στο κιτ της
δοκιµασίας ένα ειδικό για την παρτίδα πιστοποιητικό ελέγχου ποιότητας µε πρότυπη
καµπύλη και πίνακα αξιολόγησης.
Το κενό υποστρώµατος πρέπει να αφαιρείται
από όλες τις τιµές OD πριν από τον υπολογισµό.
antigen/Gültig
Methoden
11\mod_1346849110626_53.doc
@ 52250
@
Mέθοδος 1: Ποιοτικός υπολογισµός
Για τον καθορισµό του εύρους cut-off πολλαπλασιάζεται η µέση τιµή της µετρηµένου
πρότυπης OD µε τα αριθµητικά στοιχεία του πιστοποιητικού ποιοτικού ελέγχου (βλ. τους
ειδικούς τύπους περίπτωσης), π.χ.:
OD = 0.502 x MW(STD) µε ανώτερο cut-off
OD = 0.352 x MW(STD) µε χαµηλότερο cut-off
Εάν η µετρηµένη µέση αξία απορρόφησης του πρότυπου ορού είναι 0.970 OD, το εύρος
του cut-off είναι µεταξύ 0.341-0.487 OD.
Ελληνικά
16
Mέθοδος 2: Συνεχής προσδιορισµός δραστηριοτήτων αντιγόνων χρησιµοποιώντας την
πρότυπη καµπύλη
OD-τιµή αναφοράς (του πρότυπου ορού)
F =
OD-τρέχουσα τιµή (του πρότυπου ορού)
Η διαδικασία είναι απαραίτητη για να ρυθµιστεί το τρέχον επίπεδο δοκιµασίας του χρήστη
µε την πρότυπη καµπύλη, ειδική για την παρτίδα.
Αρχικά, πρέπει οι
καθηµερινές αποκλίσεις να διορθώνονται υπολογίζοντας το διορθωτικό παράγοντα F.
1.
Ο µέσος όρος των δύο τιµών OD του πρότυπου ορού πρέπει να υπολογίζεται και
να επιβεβαιώνεται ότι βρίσκεται εντός του δεδοµένου εύρους ισχύος.
2.
Υπολογισµός του παράγοντα F: Η δεδοµένη τιµή αναφοράς διαιρείται µε τη µέση
τιµή της απορρόφησης του πρότυπου ορού:
F = τιµή αναφοράς απορρόφησης STD ορού / µέση τιµή απορρόφησης STD ορού.
3.
Όλες οι µετρηµένες τιµές των δειγµάτων ασθενή πολλαπλασιάζεται µε τον
παράγοντα F.
4.
Οι δραστηριότητες αντιγόνων σε IU/ml ή U/ml µπορούν να προσδιοριστούν από την
πρότυπη καµπύλη µε τις διορθωµένες τιµές.
Ελληνικά
17
GR
Οι αποκαλούµενες παραλλαγές διαδοκιµασίας (αποκλίσεις ηµέρα µε την ηµέρα και
αποκλίσεις από εργαστήριο σε εργαστήριο) αντισταθµίζονται µε τον πολλαπλασιασµό της
τρέχουσας µετρηµένης αξίας που λαµβάνεται από το δείγµα ενός ασθενή µε τον
παράγοντα διόρθωσης F. Αυτός ο παράγοντας υπολογίζεται ως εξής :
8.3.2 Aυτόµατος υπολογισµός δοκιµασίας µε λογισµικό SERION evaluate
Μετά από την εισαγωγή των τεσσάρων παραµέτρων και την τιµή αναφοράς του πρότυπου
ορού, οι δραστηριότητες αντιγόνων υπολογίζονται on-line από επεξεργασµένη και
µετρηµένη δοκιµασία SERION ELISA antigen, που τρέχει µε τον υπολογισµό από το
λογισµικό SERION evaluate.
Εάν η οπτική πυκνότητα του προτύπου είναι εκτός του εύρους ισχύος, εµφανίζεται το
παρακάτω µήνυµα.
„Πρότυπες τιµές εκτός εύρους στις ακόλουθες οµάδες: Οµάδα 1-24.” ή
„Η πρότυπες τιµές διαφέρουν περισσότερο από 20 % στις ακόλουθες οµάδες:
Οµάδα 1-24.”
Σε τέτοιες περιπτώσεις ο κύκλος δοκιµασίας είναι άκυρος και πρέπει να επαναληφθεί.
Οι παράµετροι και η τιµή αναφοράς πρέπει να µεταβάλλεται µόνο όταν υπάρχει αλλαγή
παρτίδας (πίνακας υπολογισµού εµφανίζει παραµέτρους και τιµές αναφοράς). Η σωστή
εισαγωγή ειδικών για την παρτίδα στοιχείων µπορεί να ελεγχθεί στη βάση της
δραστηριότητας του πρότυπου ορού (σε IU/ml ή U/ml) σύµφωνα µε τον πρότυπο ορό. Η
υπολογισµένη µέση τιµή των µονάδων πρέπει να αντιστοιχεί στη αξιολόγηση που
εµφανίζεται στο ειδικό για την παρτίδα πιστοποιητικό. Υπάρχει αυτόµατη διόρθωση των
µετρηµένων τιµών. Στην πρότυπη εκδοχή εκτύπωσης εµφανίζεται το εξής:
Κωδικός δείγµατος
τιµή OD
U/ml
Υπολογισµός
Ελληνικά
18
Όρια ποσοτικού προσδιορισµού
Τα όρια ποσοτικού προσδιορισµού καθορίζονται στο πιστοποιητικό ελέγχου ποιότητας της
δοκιµασίας SERION ELISA antigen. Η γραµµικότητα της αραίωσης εντός του εύρους έχει
καταδειχτεί σε περιεκτικές µελέτες υπολογισµού. Σε περίπτωση που ένα δείγµα ασθενή
παρουσιάζει αποτέλεσµα δοκιµασίας πάνω από το ανώτερο όριο του ποσοτικού
προσδιορισµού, το δείγµα θα πρέπει να εξεταστεί σε υψηλότερη αραίωση. Η µε αυτόν τον
τρόπο καθορισµένη δραστηριότητα αντιγόνων πρέπει να πολλαπλασιάζεται µε τον
πρόσθετο παράγοντα αραίωσης.
8.5
Εύρος οριακών τιµών
Το εύρος οριακών τιµών της δοκιµασίας SERION ELISA antigen Candida καθορίζονται
στο πιστοποιητικό ελέγχου ποιότητας και εµφανίζουν το εύρος για τα οριακά
αποτελέσµατα της δοκιµασίας. Οι τιµές οι οποίες προκύπτουν κατά το δοκιµασία του
δείγµατος ενός ασθενή, που µειώνονται κάτω από αυτό το όριο εµφανίζουν ένα αρνητικό
αποτέλεσµα δοκιµασίας, τιµές επάνω από το όριο των οριακών τιµών ερµηνεύονται ως
θετικές. Σε περιπτώσεις όπου τα αποτελέσµατα βρίσκονται εντός των ορίων των οριακών
τιµών, δεν είναι δυνατή η ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η
δοκιµασία θα πρέπει να επαναλαµβάνεται παράλληλα µε ένα δείγµα παρακολούθησης, το
οποίο λαµβάνεται µία µε δύο εβδοµάδες αργότερα από τον ασθενή (ζεύγος δείγµατος).
8.6
Ερµηνεία των αποτελεσµάτων
Θετικά αποτελέσµατα δοκιµασίας για δείγµατα ασθενών καταδεικνύουν µία µυκηταιµία
από Candida. Τα αποτελέσµατα µπορούν να ερµηνευτούν µόνο σε συνδυασµό µε την
κλινική εικόνα και άλλες µεθόδους ανίχνευσης.
Ένα αποτέλεσµα µπορεί να θεωρηθεί θετικό εάν τουλάχιστον 2.6 µονάδες έχουν µετρηθεί
στη δοκιµασία. Ένα τέτοιο αποτέλεσµα καταδεικνύει ότι το δείγµα περιέχει την ποσότητα
Mannan, η οποία σχετίζεται µε 2.6 ng πρωτεΐνης Candida. Ωστόσο δεν είναι δυνατή η
διάκριση µεταξύ ζωντανού και νεκρού οργανισµού, αντίστοιχα.
Αρνητικά αποτελέσµατα δοκιµασίας δεν αποκλείουν µία οξεία λοίµωξη, ειδικά εάν βρεθούν
υψηλοί τίτλοι αντισωµάτων. Σε τέτοιες περιπτώσεις µπορεί το αντιγόνο να είναι πλήρως
καλυµµένο από αντισώµατα και ακόµη και η διαδικασία µετουσίωσης κατά τη διάρκεια της
προετοιµασίας του δείγµατος µπορεί να µην είναι επαρκής ώστε να επιτρέπει την
ανίχνευση του αντιγόνου. Επιπλέον, η χρονική στιγµή κατά τη διάρκεια µίας λοίµωξης,
όταν παρατηρείται ένα δείγµα, ένα ακατάλληλο δείγµα, φτωχή προετοιµασία του δείγµατος
και η φύλαξη µπορούν αν οδηγήσουν σε αρνητικό αποτέλεσµα.
Ελληνικά
19
GR
8.4
8.7
Εύρος αναφοράς υγιών ατόµων
∆οκιµασία τυχαίων ορών αιµοδοτών, που συλλέχθηκαν στη νότια Γερµανία, µε δοκιµασίες
SERION ELISA antigen Candida έδωσαν αποτελέσµατα στην εξής κατανοµή. Από 103
ορούς που εξετάστηκαν µε τη δοκιµασία SERION ELISA antigen Candida, 92 (89.3 %)
ήταν αρνητικοί, έξι οροί (5.8 %) παρείχαν θετικό αποτέλεσµα και πέντε δείγµατα (4.9 %)
θεωρήθηκαν οριακά.
9
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ
9.1
Ευαισθησία και Ειδικότητα
Η δοκιµασία SERION ELISA antigen Candida επικυρώθηκε µε την ανάλυση 148
δειγµάτων ορού από δωρητές αίµατος και 93 δειγµάτων από ασθενείς που εκδήλωσαν
σηµεία καντιντίασης κατά τη διάρκεια της παραµονής τους σε µονάδα εντατικής θεραπείας,
σε σύγκριση µε τα αποτελέσµατα που λήφθηκαν µε έναν εµπορικά διαθέσιµο
προσδιορισµό ενός κορυφαίου Ευρωπαίου κατασκευαστή. Οι οροί οι οποίοι
ταξινοµήθηκαν ως οριακοί δεν συµπεριλήφθηκαν στους υπολογισµούς της ευαισθησίας και
εξειδίκευσης.
Χαρακτηριστικά απόδοσης
Ευαισθησία
Εξειδίκευση
> 99.9 %
97.8 %
Σε µία άλλη εσωτερική µελέτη, η καταδείχθηκε η διασταυρούµενη αντιδραστικότητα µε τα
είδη Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis και
Candida tropicalis µε το SERION ELISA antigen Candida µε σκοπό τη διασφάλιση µίας
αναλυτικής διάγνωσης της Candida.
Λόγω της οµοιότητας του Mannan µε το υδροξυαίθυλο-άµυλο (HES), το οποίο
χρησιµοποιείται σε διογκωτές πλάσµατος για τη θεραπεία κυκλοφορικής ανεπάρκειας
(υπογκαιµικό, αιµορραγικό και σηπτικό σοκ), αξιολογήθηκε η δυνητική διασταυρούµενη
αντιδραστικότητα.
Εντούτοις,
δεν
διαπιστώθηκε
µετρήσιµη
διασταυρούµενη
αντιδραστικότητα µε το HES κατά τη χρήση της δοκιµασίας SERION ELISA antigen
Candida.
Ελληνικά
20
9.2
Επαναληψιµότητα
GR
Η ακρίβεια εντός της ίδιας σειράς δοκιµασιών διαπιστώθηκε µε ορούς διαφορετικής
αντίδρασης σε πολλαπλές δοκιµασίες 20 φορές σε έναν κύκλο δοκιµασίας. Η ακρίβεια
µεταξύ δοκιµασιών διαπιστώθηκε µε ορούς διαφορετικής αντίδρασης σε 10 ανεξάρτητους
κύκλους δοκιµασίας.
Πρότυπη απόκλιση
Συντελεστής µεταβολής (CV %) =
x 100
Μέση τιµή
∆είγµα
Μέση τιµή
(OD)
Στην ίδια
δοκιµασία
(CV %)
Μέση τιµή
(OD)
Μεταξύ
δοκιµασιών
(CV %)
αρνητικά
0,223
9,6
0,225
7,3
οριακά
0,507
2,4
0,476
5,3
θετικά
1,413
2,5
1,356
2,7
θετικά
2,851
2,0
2,442
8,1
Ελληνικά
21
10 ΜΕΤΡΑ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ
10.1 Προειδοποιήσεις/ Προφυλάξεις
Το SERION ELISA antigen σχεδιάστηκε για τη χρήση από εκπαιδευµένο προσωπικό το
οποίο είναι καλά εξοικειωµένο µε τις εργαστηριακές πρακτικές.
Όλα τα αντιδραστήρια του κιτ και τα ανθρώπινα δείγµατα θα πρέπει να χειρίζονται µε
προσοχή, χρησιµοποιώντας τις καθιερωµένες πρακτικές εργαστηριακές µεθόδους.
-
Αυτό το κιτ περιέχει στοιχεία ανθρώπινου αίµατος. Αν και όλοι οι οροί ελέγχου και οι
οροί cut-off έχουν εξεταστεί και βρέθηκαν αρνητικοί για το αντίσωµα αντι--HIV,
αντιγόνο HBs (αντιγόνο επιφάνειας ιός ηπατίτιδας Β) και αντίσωµα αντι-HCV, θα
πρέπει να θεωρούνται δυνητικά µολυσµατικοί.
-
Μην πιπετάρετε µε το στόµα.
-
Μην καπνίζετε, τρώτε ή πίνετε σε περιοχές στις οποίες χειρίζεστε δείγµατα οι
αντιδραστήρια του κιτ.
-
Φοράτε γάντια µίας χρήσης, προστατευτικά ρούχα και γυαλιά κατά τη διάρκεια
χειρισµού των αντιδραστηρίων του κιτ ή των δειγµάτων.
Πλύνετε σχολαστικά τα χέρια σας µετά από το χειρισµό.
-
Το υλικό των ασθενών και άλλο δυνητικά µολυσµατικό υλικό θα πρέπει να
απολυµαίνεται µετά από κάθε κύκλο δοκιµασίας.
Τα αντιδραστήρια θα πρέπει να φυλάσσονται µε ασφάλεια και να µη µπορούν να τα
προσεγγίσουν αναρµόδια άτοµα, π.χ. παιδιά.
-
10.2 ∆ιάθεση
Παρακαλώ λάβετε υπόψη τις σχετικές νοµικές απαιτήσεις!
Ελληνικά
22
11 ΑΝΑΦΟΡΕΣ
[1]
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
[3]
[4]
Rev. 3, 32-45.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
[15]
[16]
R.
Ελληνικά
23
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
GR
1
UTILIZAÇÃO PREVISTA
2
RELEVÂNCIA DIAGNÓSTICA
3
SERION ELISA antigen – PRINCÍPIO DO TESTE
4
CONTEÚDO DO KIT
5
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
6
ARMAZENAMENTO E VALIDADE DOS REAGENTES
7
Execução do teste SERION ELISA antigen
7.1
Instruções gerais
7.2
Preparação e armazenamento das amostras
7.3
Preparação dos reagentes do kit
7.4
Execução do teste – apresentação sinóptica
7.5
Procedimento de teste manual
7.6
Realização do teste pelo método automatizado
7.7
Controle positivo / Controle da exatidãoo
8
PT
ÍNDICE
AVALIAÇÃO DO TESTE
8.1
Quantificação de um ponto de acordo com o método-4PL
8.2
Critérios de validade do teste
8.3
Cálculos SERION ELISA antigen Candida
8.4
Limites de quantificação
8.5
Intervalo “borderline” (nos valores-limite)
8.6
Interpretação dos resultados
8.7
Intervalo de referência de indivíduos saudáveis
9
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
9.1
Sensibilidade e especificidade
9.2
Reprodutibilidade
10
MEDIDAS DE SEGURANÇA
10.1
Advertências e medidas de precaução
10.2
Eliminação de resíduos
11
LITERATURA
versão atual Nº.: V 1.12/09-1
versão anterior: --
Ensaio imunoenzimático para a determinação de antígenos de Candida
Para utilização no diagnóstico in vitro
Artigo n.o:
ESR200
1 UTILIZAÇÃO PREVISTA
O teste SERION ELISA antigen Candida é um imunoensaio quantitativo e qualitativo para
a pesquisa do antígeno de Candida em soro humano ou plasma. O ensaio é
recomendado para a detecção de candidíase sistémica.
2
RELEVÂNCIA DIAGNÓSTICA
A Candida albicans é uma levedura ubíqua que, à semelhança de todas as espécies de
Candida, pertence à família dos fungos leveduriformes. Além das leveduras que
provocam sobretudo infecções superficiais, os chamados pseudomicélios constituem uma
outra manifestação morfológica dos fungos leveduriformes. Em casos de micose invasiva,
podem ocorrer tubos germinais e o desenvolvimento de pseudomicélios. A Candida
produz e excreta diversas enzimas destrutivas, que permitem ao microorganismo
patogênico facultativo penetrar através de barreiras como vasos sanguíneos e
membranas mucosas.
A Candida spp. é transmtida sobretudo pelo contato de secreções de pessoa para
pessoa. A principal porta de entrada é a cavidade oral. Quaisquer mudanças nas
propriedades fungistáticas da pele causadas por acidificação leve do pH ou alterações da
flora bacteriana antagonista podem levar ao surgimento de candidíase superficial na
superfície da pele. A micose sistêmica ocorre quando há colonização de membranas
mucosas, sobretudo no trato gastrointestinal.
As Candida são capazes de aderir ao epitélio de diversas membranas mucosas graças a
proteínas de adesão e a outras estruturas à superfície das células. O esquema que se
segue mostra os passos hipotéticos que podem levar à disseminação de infecções em
casos de condições subjacentes graves. Não é prático proporcionar uma descrição exata
das várias fases (Figura 1).
português
2
colonização das vias
nasofaríngeas
entrada na circulação
sanguínea
passagem pelo lúmen
do estômago
transferência para
o lúmen intestinal
transferência para o
persorção de células
de Candida
sistema linfático
PT
invasão de
múltiplos órgãos
Figura 1: progressão das infecções por Candida.
A candidíase pode geralmente ser classificada em dois grupos principais, cujas
características mais relevantes se encontram na tabela abaixo.
infecções por Candida
superficial
micose profunda (invasiva)
localização
pele, mucosas
órgãos principais
imunocompetência
do hospedeiro
+
+,-/-
fatores de risco
gravidez
quimioterapia
diabetes
supressão imunitária iatrogénica
AIDS
cateter venoso central
disfunção da pele
radioterapia
higiene oral deficiente
queimaduras de alto grau
cirurgia
progressão clínica
inofensiva na maioria dos casos,
nenhum perigo de vida
terapêutica
terapêutica eficaz
potencialmente fatal na maioria
dos casos
eficácia da terapêutica depende
da fase da infecção
Tabela 1: características das infecções por Candida.
O diagnóstico sorológico de candidíase envolve algumas dificudades. Por um lado, a
colonização transitória por leveduras pode induzir uma resposta de anticorpos; por outro
lado, a micose sistêmica por Candida em pacientes imunodeprimidos pode induzir apenas
alterações ligeiras nas atividades de anticorpos. Nesses casos, os resultados sorológicos
português
3
devem ser interpretados de maneira crítica. Além disso, algumas candidíases sistêmicas
não causam os sintomas típicos.
Atualmente, não é possível concluir que os resultados de diferentes sistemas de teste
para a detecção de anticorpos contra Candida são comparáveis ou mesmo permutáveis.
A especificidade dos anticorpos detectados depende significativamente do sistema de
teste (ELISA ou HAT) ou da preparação de antígeno utilizada. A detecção de anticorpos
IgM por HAT é melhor do que a detecção de IgG, devido às melhores propriedades de
aglutinação das moléculas de IgM. HAT detecta sobretudo anticorpos contra antígenos da
parede celular de fundos leveduriformes, o que torna a interpretação serológica ainda
mais complexa, mas permite a diferenciação.As variações das concentrações de
anticorpos podem ser detectáveis por ELISA, mas não por HAT, tornando vantajosa a
combinação das duas técnicas, por exemplo, no caso de decréscimo da atividade humoral
de IgM e do aumento simultâneo da atividade de anticorpos IgG.
Ainda não existe uma técnica única que permita o diagnóstico sorológico de Candida. O
acompanhamento de pacientes sob risco requer diversos métodos, incluindo sorologia e
detecção de antígenos. O teste SERION ELISA antigen é especialmente importante para
detector antígenos específicos de Candida em amostras de pacientes.
Pos:
7@
/Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
ELISA
antigen @für
8\mod_1265792007310_38.doc
@
28643
1
3
SERION ELISA antigen – PRINCÍPIO DO TESTE
O teste ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) é um imunoensaio particularmente
adequado à determinação de anticorpos e antígenos no domínio da serologia infecciosa.
A reação baseia-se na interação específica dos anticorpos com o seu antígeno
correspondente. As tiras de teste das placas de microtitulação do SERION ELISA antigen
são revestidas com anticorpos específicos do agente patogênico em causa. Se estiverem
presentes antígenos na amostra do doente, ligam-se ao anticorpo fixado. Um anticorpo
secundário, que foi conjugado com a enzima peroxidase, detecta o complexo imunitário e
liga-se a ele. O substrato incolor, peróxido de hidrogénio (H2O2), e o cromogénio
tetrametilbenzidina (TMB) são convertidos num produto de cor azul. A adição de solução
de parada muda a cor para amarelo. A intensidade do sinal do produto desta reação é
proporcional à concentração do antígeno na amostra, sendo medida por fotometria.
antigen/Gültig
und
antigen:
Inhalt
@
11\mod_1346845806738_38.doc
@ 52094
português
4
4
CONTEÚDO DO KIT
Unidades /
volume
Tiras de microtitulação separáveis, com oito poços individuais revestidos com 12 unidades
anticorpos
(total de 96) MTP
1 moldura de microplaca.
3 x 3 ml
Soro padrão STD
Antígeno de Candida albicans em soro humano suplementado com soro fetal bovino
(FCS);
negativo para Ac anti-HIV, Ag HBs (antígeno de superfície do vírus da hepatite B) e
Ac anti-HCV;
conservante: azida de sódio a < 0,1 %.
2 x 3 ml
Soro de controle negativo NEG ,
Soro humano suplementado com soro fetal bovino (FCS);
negativo para Ac anti-HIV, Ag HBs (antígeno de superfície do vírus da hepatite B) e
Ac anti-HCV;
conservante: azida de sódio a < 0,1 %.
Conjugado anti-Candida albicans (pronto a utilizar) PODCR ,
Anticorpo anti-Candida albicans conjugado com peroxidase de rábano,
estabilizado com solução estabilizadora de proteínas contendo detergente;
conservante: ProClin® 300 a 0,1 %.
13 ml
Concentrado de solução de lavagem (suficiente para 1500 ml) WASH ,
Solução de cloreto de sódio tampão TRIS e Tween 20; concentrada 30 vezes;
conservante: ProClin® 300 a <0,1 %.
2 x 25 ml
Tampão de diluição SAMB ,
Solução ácida sem conservante.
15 ml
Solução de parada STOP ,
ácido sulfúrico a 0,5 N.
13 ml
Solução de substrato TMB (pronto a utilizar) TMB ,
Solução de substrato TMB-peróxido de hidrogénio (pronto a utilizar),
conservante: Kathon CG a <0,01 %.
13 ml
Certificado de controle de qualidade com curva padrão e tabela de valores
INFO,
(quantificação dos antígenos em U/ml).
2 unidades
ELISA
antigen/Gültig
für benötigte
antigen/Zusätzlich
benötigte
Materialien @
8\mod_1265796058727_38.doc
@ 29307
@1
português
5
PT
Componentes do teste
5
-
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
equipamento corrente de laboratório
fotómetro para placas de microtitulação com filtro, comprimento de onda 450 nm,
comprimento de onda de referência recomendado na gama de 620 nm a 690 nm
(p. ex. 650 nm)
incubadora 37 °C
bloco de aquecimento 110ºC
câmara húmida
água destilada
clipes de pressão (artigo n.o VT120)
Pos:
10 /Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Lagerung
@
11\mod_1346935956390_38.doc
@ 52264
@ 1 und Haltbarkeit
português
6
ARMAZENAMENTO E VALIDADE DOS REAGENTES
Reagente
Armazenamento
Validade
Tiras de
microtitulação
(revestidas com
anticorpo)
Ainda fechadas
ver o prazo de validade;
Após a abertura, entre 2 e 8 °C na bolsa de alumínio prazo de validade
fechada, junto com o excicante
mínimo: 4 semanas;
As tiras não utilizadas devem ser armazenadas
secas e estanques na bolsa de alumínio
hermeticamente fechada.
no caso de utilização e
conservação corretas:
até expirar o prazo de
validade
Soros de controle /
soros padrão
Após a abertura: entre 2 e 8 °C
Conjugados
Solução pronta a utilizar: entre 2 e 8 °C
Evitar contaminação – p. ex., utilizando somente
pontas de pipetas esterilizadas
18 meses a partir da
data de fabrico
Ainda fechado
Tampão de diluição
data de fabrico
data de fabrico
Solução de lavagem
Após a abertura: entre 2 e 8 °C
Rejeitar as soluções turvas
6 meses
Concentrado após a abertura: entre 2 e 8 °C
data de fabrico
Diluição de utilização entre 2 e 8 °C
2 semanas;
Diluição de utilização à temperatura ambiente
1 semana
Limpar regularmente os recipientes utilizados para a
diluição de utilização. Rejeitar as soluções turvas.
Substrato TMB
Solução pronta a utilizar: entre 2 e 8 °C,
armazenada ao abrigo da luz
Evitar contaminação – p. ex., utilizando somente
pontas de pipetas esterilizadas
data de fabrico
Descartarse a solução ficar azul (extinção a 650 nm
contra água destilada > 0,2 DO).
Solução de parada
Após a abertura, à temperatura ambiente
português
7
ver o prazo de
validade;
PT
6
7
Execução do teste SERION ELISA antigen
7.1
Instruções gerais
Utilize os reagentes do SERION ELISA antigen apenas quando utilizar o ensaio SERION
ELISA antigen. Os componentes não podem ser trocados por reagentes de outros
fabricantes. Os soros padrão, os soros de controle e o conjugado dos imunoensaios
SERION ELISA antigen estão ajustados para o lote específico do kit de teste e não
podem ser utilizados em outros lotes.
O tampão de diluição, a solução de lavagem, o substrato e a solução de parada poderão
ser utilizados em todos os testes SERION ELISA antigen, independentemente do lote e
do kit.
Antes da abertura, todos os componentes dos testes SERION ELISA antigen poderão ser
utilizados até o seu limite de validade (vide as indicações da etiqueta), desde que sejam
armazenados corretamente. Os reagentes não deverão ser utilizados para além do limite
da validade.
Qualquer alteração ou a diluição incorreta dos reagentes poderá causar uma perda da
sensibilidade.
Os reagentes de teste deverão ser protegidos da luz forte durante o armazenamento e a
incubação. Após a utilização devem ser bem fechados, a fim de evitar que sequem ou
sejam contaminados.
A bolsa de alumínio para a placa de microtitulação somente deve ser cortada nos lugares
previstos do lado marcado, para que possa ser vedada novamente. Não utilizar as tiras se
a bolsa de alumínio estiver danificada ou se a bolsa com as tiras restantes e o dessecante
não tiver sido corretamente vedada.
Para evitar a contaminação, empregar sempre técnicas assépticas para extrair as
alíquotas de reagentes. Para evitar falsos resultados positivos, a ponta da pipeta nunca
deverá tocar, nem molhar, o bordo superior dos poços durante a pipetagem do conjugado.
Ao fechar os frascos, deverá ter-se atenção para que as suas tampas não sejam
trocadas.
Em particular, a solução de substrato TMB é sensível a substâncias oxidantes e a íons de
metais pesados. Esta tem de ser sempre armazenada ao abrigo da luz e aberta apenas
em condições de obscuridade e imediatamente antes de ser utilizada. Esta solução
apresenta uma cor azul-esverdeada clara.
Deve evitar-se o contato da pele com o substrato e a solução de parada.
A reprodutibilidade dos resultados depende, de entre outros fatores, da mistura cuidadosa
dos reagentes preparados. Antes de utilizar os soros de controle e o conjugado, os
recipientes deverão ser bem agitados. As amostras também devem ser bem misturadas
após a diluição (p. ex. com um vórtex).
português
8
A pipetagem deve ser efetuada cuidadosamente, observando-se os tempos e
temperaturas de incubação prescritos. Grandes diferenças de tempo entre a pipetagem
do primeiro e do último poço na adição de amostras/soros de controle, conjugado e
substrato levam a “tempos de pré-incubação” diferentes, o que poderá influenciar
consideravelmente a precisão e a reprodutibilidade dos valores medidos.
Só o cumprimento rigoroso destas instruções garante resultados corretos.
Uma lavagem correta evita testes inespecíficos. Por isso, as instruções de utilização dos
aparelhos de lavagem utilizados deverão ser observadas. Os poços de fundo plano
devem ser cheios uniformemente com solução de lavagem. Ao fim do procedimento, é
importante certificar-se de que a solução de lavagem foi completamente removida dos
poços, a fim de evitar efeitos de diluição incontroláveis. Evitar a formação de espuma!
Durante a lavagem e a aspiração, tome cuidado para não danificar a inscrição (agente
patogênico / AG) das tiras de microtitulação a fim de evitar equívocos.
7.2
Preparação e armazenamento das amostras
Amostras lipémicas, hemolíticas ou ictéricas (soro ou plasma) só deverão ser utilizadas
sob reserva. Não deverão ser aproveitadas amostras contaminadas por bactérias. São
adequadas as amostras de soro ou de plasma (EDTA, citrato, heparina) colhidas de
acordo com os métodos laboratoriais convencionais.
português
9
PT
O teste SERION ELISA antigen só será válido se forem observados os critérios de
validação específicos para o lote. Estes critérios estão indicados no certificado de controle
de qualidade contido no kit.
7.2.1 Preparação dos espécimes
Antes do início do teste, diluir as amostras (amostras dos pacientes, padrões e controles
negativo) (V1) em tampão de diluição (V2) do seguinte modo:
V1 + V2 = 3+1
em
300 µl
de amostra (V1)
por
100 µl
de tampão de diluição (V2)
Após cada diluição, e antes da pipetagem na microplaca, as amostras devem ser bem
misturadas a fim de se obter uma solução homogênea.
Por fim, as amostras devem ser aquecidas a 110 ºC (+/- 5 °C) durante 10 minutos. É
essencial cumprir o tempo e a temperatura indicados! Os recipientes de reação
convencionais não são adequados para este passo de termólise, pelo que recomendamos
o uso de recipientes de reação safe-lock ou semelhantes com fecho de rosca.
Se for usado um bloco aquecedor com termostato, a tempertur2a deve ser controlada
utilizando-se um termômetro calibrado e levando em consideração o tempo de préaquecimento do bloco. Se necessário, o bloco deve ser ajustado até a temperatura
necessária. Durante a termólise, um precipitado branco leitoso de formará e precisará ser
removido por centrifugação em uma centrífuga de bancada refrigerada a 10.000 g por 10
minutos. Em seguida, o sobrenadante claro obtido poderá ser usado para exame.
7.2.2 Armazenamento das amostras
As amostras dos doentes tratadas não deverão ser armazenadas durante mais de 24
horas, quando mantidas a 2º-8ºC. As amostras não tratadas não devem ser armazenadas
a 2º-8ºC por mais de 7 dias. É possível prolongar o armazenamento congelando a ≤-20°C.
Evitar um descongelamento e recongelamento repetido das amostras.
português
10
7.3
Preparação dos reagentes do kit
Deixar todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente antes de utilizá-los.
7.3.1 Tiras de microtitulação
As tiras de microtitulação em suas molduras estão embaladas juntamente com um
agente dessecante numa sacola de alumínio. Retirar da moldura os poços que não
serão utilizados e colocá-los novamente na sacola de alumínio, fechando-a
hermeticamente.
Os soros de controle e padrão têm de ser diluídos com tampão da amostra e
depois desnaturados. Qualquer que seja o número das tiras de microtitulação
utilizadas, todos os teste devem incluir soros padrão e de controle. Os soros
padrão devem ser incluídos em duplicata.
7.3.3 Conjugado (pronto para usar)
Evite contaminar conjugados prontos para uso (p. ex. use pontas de pipetas
estéreis).
7.3.4 Solução de lavagem
Diluir o concentrado de solução de lavagem (V1) 1:30 com água destilada a um
volume final (V2).
Exemplo:
Concentrado de tampáo (V1)
Volume final (V2)
25 ml
750 ml
1 ml
30 ml
7.3.5 Substrato TMB (pronto para uso)
Evite contaminar a solução de substrato pronta para uso (p.ex. use pontas de
pipetas estéreis).
A solução TMB apresenta coloração verde-azulada clara. Todas as soluções que
apresentarem cores intensas (atenuação >0,2 DO maior que a da água destilada)
devem ser descartadas.
7.3.6 Solução de paragem (pronta a utilizar)
antigen/Gültig
für
antigen/Testdurchführung/Testablauf/Überschrift
Testablauf
@
8\mod_1265793631810_38.doc
@ 28927
@2
português
11
PT
7.3.2 Soros de controlo / soros padrão
7.4
Execução do teste – apresentação sinóptica
quantitativo
Preparação de amostras, controles e soro padrão
Diluição da amostra
(amostras de pacientes, soros padrão e de controle)
Amostra 300 µl + tampão de diluição 100 µl
INCUBAÇÃO 10 min./ 110 °C
CENTRIFUGAÇÃO 10 min. / 10.000 × g / 4 °C
Guardar o sobrenadante e eliminar pellet
Adicionar sobrenadante das amostras (100 µl)
INCUBAÇÃO 60 min./ 37 °C câmara úmida
Pipetar solução de conjugado PODCR (100 µl)
Adição da solução de substrato TMB (100 µl)
Adicionar solução de paragem STOP (100 µl)
LER ABSORBÂNCIA a 450 nm (ref. 650 nm)
português
12
7.5
Procedimento de teste manual
1. Pré-tratamento de amostras (amostras de pacientes, padrões e soros de controle) da
forma descrita.
2. Colocar o número necessário de poços na moldura de microplaca e preparar a
folha de protocolo.
3. Pipetar 100 µl dos sobrenadantes do soro padrão (em duplicata), controle
negativo e amostras de pacientes nas cavidades apropriadas das tiras de
micropoços de teste. Separe um poço para o branco do substrato, separando um
poço para o branco do substrato, p. ex.:
poço A1
branco de substrato
poço B1
controle negativo
poço C1
soro padrão
poço D1
soro padrão
poço E1
Amostra do doente 1…
4. Incubação das amostras durante 60 minutos (+/- 3 min.) a 37ºC (+/- 1°C) em câmara
úmida.
5. No fim do tempo de incubação, lavar todos os poços (aparelho de lavagem ou à
mão):
- aspirar ou separar solução de incubação
- encher cada poço com 300 µl de solução de lavagem
- aspirar ou separar o tampão de lavagem
- repetir o procedimento de lavagem 4 vezes (ou 5 vezes!)
- esvaziar a microplaca, batendo-a sobre toalhas de papel
6. Adição de conjugado
Adicionar 100 µl da solução de conjugado pronta para uso nos poços apropriados
(exceto o branco de substrato)
7. Incubação do conjugado durante 60 minutos (+/- 3 min.) a 37°C (+/- 1ºC) em
câmara úmida.
8. depois de incubar, lave todos os poços com a solução de lavagem (ver acima).
9. Adição de substrato
Adicione 100 µl de solução de substrato TMB pronta para usar em cada cavidade,
incluindo a cavidade do branco.
10. Incube o substrato por 30 minutos (+/- 1 min) a 37 ºC (+/- 1 min) ao abrigo da luz e
em câmara úmida.
11. Parada da reação
Adicionar 100 µl da solução de parada a cada um dos poços e agitar suavemente a
placa de microtitulação para misturar.
12. Leitura da densidade óptica
Ler a densidade óptica (DO) após 60 minutos a 450 nm contra o branco do substrato;
comprimento de onda de referência entre 620 nm e 690 nm (p. ex. 650 nm).
português
13
PT
Candida antigen quantitativo
7.6
Realização do teste pelo método automatizado
Os testes SERION ELISA são adequados para o processamento automatizado, tendo
sido avaliados com os equipamentos ImmunomatTM e Gemini. O processamento
automatizado é realizado de maneira análoga ao método manual. Leve em consideração
que, sob condições de trabalho especiais, poderá ser necessário ajustar os tempos de
incubação internos do laboratório.
7.7
Controle positivo / Controle da exatidãoo
Para a verificação periódica do método de teste, em conformidade com os requisitos dos
sistemas internos de gestão da qualidade laboratorial, recomendamos a utilização dos
SERION ELISA controls para determinar a precisão e a exatidão dos testes realizados
com o SERION ELISA antigen. A utilização dos SERION ELISA controls encontra-se
descrita num manual de instruções específico.
português
14
8
AVALIAÇÃO DO TESTE
8.1
Quantificação de um ponto de acordo com o método-4PL
PT
As funções não lineares que ajustam as curvas sigmoidais diretamente – sem outras
transformações – aos valores DO são as que fornecem a maior exatidão possível na
atribuição dos sinais de absorção a valores quantitativos. A determinação da
concentração de antígenos com o SERION ELISA antigen realiza-se de acordo com o
modelo “4-parameter logistic-log” (4PL), que é ideal para um ajuste exato da curva. A
função matemática é descrita pela fórmula seguinte:
D-A
DO = A +
1 + e B(C – em conc.)
Os parâmetros A, B, C e D representam exatamente o perfil da curva e definem:
1. a assímptota inferior
2. declive da curva
3. o ponto de inflexão da curva
4. a assímptota superior
parâmetro A
parâmetro B
parâmetro C
parâmetro D
O Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg, Alemanha) averigua as curvas padrão para
cada lote do kit em testes repetidos, realizados sob condições ótimas. Os elevados custos
e tempo despendidos na construção da curva padrão são assim poupados ao utilizador.
Para avaliar as concentrações de antígenos, em cada embalagem do kit SERION ELISA
antigen é fornecida uma curva padrão e uma tabela de valores específicas para o lote. O
software de avaliação SERION evaluate e a ferramenta para Microsoft® Excel SERION
avidity estão disponíveis sob solicitação.
Para compensar variações normais de testes, e para poder verificar a qualidade dos
testes realizados, utiliza-se um soro padrão em cada teste. No controle de qualidade do
fabricante, são atribuídos a este soro de controle um valor de referência e um intervalo de
validade. Dentro deste intervalo, a quantificação da concentração de antígenos é segura e
fiável.
português
15
8.2
Critérios de validade do teste
-
O branco do substrato tem de ter um valor de DO < 0,25.
-
O controle negativo tem de produzir um resultado de teste negativo.
-
Nos testes quantitativos SERION ELISA antigen, o valor médio de DO do soro
padrão (após a subtracção do branco de substrato) tem de encontrar-se dentro do
intervalo de validade indicado no certificado de controle de qualidade específico
para o lote.
-
A variação dos valores de DO do soro padrão não deverá ser maior que 20%.
Se estes critérios não forem satisfeitos, o teste será inválido e deverá ser repetido.
8.3
Cálculos SERION ELISA antigen Candida
8.3.1 Avaliação não automatizada
Para a avaliação dos testes SERION ELISA antigen, é fornecido em cada kit um
certificado de controle de qualidade, específico para o lote que contém a curva padrão e
uma tabela de valores. O valor do branco do substrato deverá ser subtraído de todos os
valores de DO antes da avaliação.
antigen/Gültig
Methoden
11\mod_1346849110626_38.doc
@ 52247
@
Método 1: Avaliação qualitativa
Para a determinação do intervalo cut-off, multiplica-se o valor médio da DO do soro
padrão pelos valores numéricos indicados no certificado de controle de qualidade (vide as
fórmulas para os sistemas especiais), p. ex.:
DO = 0,502 x valor médio (PADRÃO) no limite superior de cut-off
DO = 0,352 x valor médio (PADRÃO) no limite inferior de cut-off
Se, por exemplo, o valor médio de absorção do soro padrão for de 0,970, o intervalo cutoff será de 0,341 a 0,487.
português
16
Método 2: Determinação contínua das atividades de antígenos utilizando a curva
padrão
As variações de testes que ocorrem de dia para dia ou de laboratório para laboratório (as
chamadas variações interensaio) são compensadas através da multiplicação do valor de
medição atual das amostras dos doentes pelo fator de correção F. Este fator é calculado
da seguinte forma:
valor DO de referência (do soro padrão)
F =
PT
valor DO atual (do soro padrão)
Este procedimento é necessário para ajustar o nível atual do teste do utilizador à curva
padrão específica do lote. Primeiro as variações diárias deverão ser corrigidas por meio
do cálculo do fator F.
1.
Calcular o valor médio dos dois valores DO do padrão e verificar se o valor se
encontra na gama de validade indicada.
2.
Cálculo do fator F: o valor de referência indicado deverá ser dividido pelo valor
médio da absorção do soro padrão:
F = valor de referência absorção soro padrão / valor médio absorção soro padrão.
3.
Todos os valores de medição das amostras dos doentes são multiplicados por F.
4.
Com base na curva padrão e nos valores de medição corrigidos, podem ser
determinadas as atividades dos antígenos em UI/ml ou U/ml.
português
17
8.3.2 Avaliação automática do teste com o software SERION evaluate
Depois de introduzidos os quatro parâmetros e o valor de referência do soro padrão, as
atividades dos antígenos são calculadas pelo programa de avaliação SERION evaluate
após o processamento e a medição dos testes SERION ELISA evaluate.
Se a densidade óptica do padrão estiver fora do intervalo de validade, a seguinte
mensagem será mostrada (em inglês):
„Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24.” ou
„Standard value differ more than 20 % in following groups: Group 1-24.”
Nestes casos, o teste é inválido, devendo ser repetido.
Os parâmetros e o valor de referência só deverão ser mudados em caso de troca do lote
(os parâmetros e o valor de referência estão indicados na tabela de valores). É possível
verificar se os dados específicos do lote foram introduzidos corretamente com base na
atividade (em UI/ml ou U/ml) atribuída ao soro padrão. O valor médio das unidades
resultante deverá corresponder ao valor de unidade indicado no certificado específico do
lote. Uma correção dos valores de medição é efetuada automaticamente. Na impressão
dos valores de medição (versão padrão) aparecerá:
Código da amostra:
Valor de DO
U/ml
Avaliação
8.4
Limites de quantificação
Os limites de quantificação estão especificados no certificado de controle de qualidade do
teste SERION ELISA antigen. A linearidade da diluição dentro deste intervalo foi
demonstrada em estudos de avaliação abrangentes. No caso de a amostra do doente
apresentar um resultado acima do limite de quantificação, a amostra poderá ser analisada
com uma diluição maior. A atividade do antígeno determinada deste modo deverá ser
multiplicada pelo fator de diluição adicional.
8.5
Intervalo “borderline” (nos valores-limite)
O intervalo “borderline” (nos valores-limite) do teste SERION ELISA antigen Candida está
especificado no certificado de controle de qualidade do teste e indica a gama de valoreslimite dos resultados do teste. Valores de teste obtidos de amostras de doentes que se
situem abaixo deste intervalo indicam resultados negativos; valores que se situem acima
deste intervalo são interpretados como positivos. Nos casos em que os resultados se
encontrem dentro do intervalo “borderline” (valores-limite), não é possível uma
interpretação definitiva. Nestes casos, o teste deve ser repetido paralelamente a uma
outra amostra, colhida do doente uma ou duas semanas depois (par sérico).
português
18
8.6
Interpretação dos resultados
Amostras de doentes com resultados positivos indicam fungemia por Candida. Os
resultados só podem ser interpretados de acordo com o quadro clínico e com outros
métodos de detecção.
Resultados negativos no teste não excluem infecções aguda, sobretudo quando se
encontram títulos elevados de anticorpos. Nestes casos, pode acontecer que o antígeno
esteja totalmente mascarado pelos anticorpos e que mesmo o procedimento de
desnaturação durante a preparação da amostra não seja suficiente para permitir a
detecção do antígeno. Além disso, o momento da infecção em que a amostra é obtido,
uma amostra inadequada, uma má preparação da amostra e um armazenamento
inconveniente podem provocar resultados negativos.
8.7
Intervalo de referência de indivíduos saudáveis
A análise de soros de dadores de sangue aleatórios, colhidos na região do sul da
Alemanha, com o teste SERION ELISA antigen Candida resultou na distribuição que se
segue. Dos 103 soros analisados com o teste SERION ELISELISA antigen Candida, 92
(89,3 %) foram negativos, seis (5,8%) foram positivos e cinco (4,9%) foram considerados
limites.
9
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
9.1
Sensibilidade e especificidade
O teste SERION ELISA antigen Candida foi validade por uma análise de 148 amostras de
soro de doadores de sangue e 93 amostras de pacientes em unidades de terapia
intensiva que apresentavam sinais de candidíase. Os resultados foram comparados com
os de um ensaio disponível comercialmente produzido por um importante fabricante
europeu. Os soros classificados como limítrodes não foram incluídos nos cálculos de
sensibilidade e especificidade.
português
Características de desempenho
Sensibilidade
Especificidade
> 99,9 %
97,8 %
19
PT
Um resultado pode ser considerado positive quando o teste mede pelo menos 2,6
unidades. Um resultado desta natureza indica que a amostra contém a quantidade de
Mannan associada a 2,6 ng de proteína de Candida. Contudo, o ensaio não consegue
distinguir entre organismos vivos ou mortos.
Em outro estudo interno, a reatividade cruzada com espécies de Candida guillermondii,
Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis e Candida tropicalis com o teste
SERION ELISA antigen Candida foi demonstrada para garantir um diagnóstico completo
de Candida.
Como a manana e o hidroxietilamido (HES) usado como expansor plasmático em casos
de falência circulatória (p.ex. choque hemorrágico, hipovolêmico ou séptico), a
possibilidade de reatividade cruzada foi avaliada. O teste SERION ELISA antigen Candida
não revelou nenhuma reação cruzada com HES.
9.2
Reprodutibilidade
A reprodutibilidade intra-ensaio foi averiguada com soros de reatividade diferente em
preparação múltipla (n = 20) dentro de uma preparação do ensaio. Para a determinação
da reprodutibilidade interensaio, foram testados soros com reatividades diferentes em 10
preparações realizadas independentemente.
Desvio padrão
Coeficiente de variação (CV %) =
x 100
Valor médio
Valor médio
Intra-ensaio
Valor médio
Interensaio
(OD)
(CV %)
(OD)
(CV %)
negativo
0,223
9,6
0,225
7,3
no valor limite
0,507
2,4
0,476
5,3
positivo
1,413
2,5
1,356
2,7
positivo
2,851
2,0
2,442
8,1
Amostra
português
20
10 MEDIDAS DE SEGURANÇA
10.1 Advertências e medidas de precaução
O SERION ELISA antigen destina-se a ser utilizado unicamente por pessoal especializado
familiarizado com as boas práticas de laboratório.
-
Este kit de teste contém componentes de soros humanos. Embora todos os soros
de controle sejam negativos para Ac anti-HIV, Ag HBs (antígeno de superfície do
vírus da hepatite B) e Ac anti-HCV, eles deverão ser considerados potencialmente
infecciosos.
-
Não pipetar com a boca.
-
Nas áreas onde se trabalha com reagentes de teste ou com amostras de doentes,
não deverá ser permitido comer, beber ou fumar.
-
Na manipulação de reagentes de teste e de amostras de doentes, deve-se utilizar
bata de laboratório, luvas descartáveis e óculos de proteção. A seguir, lavar muito
bem as mãos.
-
As amostras dos doentes e todos os materiais potencialmente infecciosos deverão
ser descontaminados após a realização do teste.
Guardar os reagentes fora do alcance de pessoas não autorizadas, incluindo
crianças.
-
10.2 Eliminação de resíduos
Observar as respectivas disposições legais vigentes.
português
21
PT
À manipulação dos reagentes de teste e das amostras dos doentes aplicam-se os
princípios das boas práticas de laboratório.
11 LITERATURA
[1]
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
[3]
[4]
Rev. 3, 32-45.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
[15]
[16]
R.
português
22
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
EN
OBSAH
POUŽITÍ
2
DIAGNOSTICKÁ RELEVANCE
3
SERION ELISA antigen - PRINCIP TESTU
4
SLOŽENÍ KITU
5
POŽADOVANÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ PŘEDMĚTEM DODÁVKY
6
UCHOVÁVÁNÍ A STABILITA
7
SERION ELISA antigen - POSTUP PŘI TESTU
7.2
Příprava vzorku a uchovávání
7.3
Příprava reagencií soupravy
7.4
Přehled postupu použitého při testu
7.5
Postup manuálního testu
7.6
Postup použitý při automatickém testu
7.7
Pozitivní kontrola/kontrola přesnosti
8
HODNOCENÍ TESTU
8.1
Jednobodová kvantifikace pomocí metody 4PL
8.2
Kritéria platnosti
8.3
Výpočet SERION ELISA antigen Candida
8.4
Meze kvantifikace
8.5
Hraniční rozpětí
8.6
Interpretace výsledků
8.7
Referenční rozsah zdravých jednotlivců
9
CHARAKTERISTIKY VÝSLEDKŮ
9.1
Citlivost a specificita
9.2
Reprodukovatelnost
10
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ
10.1
Výstražná upozornění
10.2
Likvidace
11
EL
PT
Obecné poznámky
CZ
7.1
ES
1
ODKAZY
Současná verze č. V: V 1.12/09-1
předchozí verze: --
Enzymová imunoanalýza ke stanovení kandidového antigenu
pro použití v diagnostice in vitro
Objednávkové č.:
ESR200
1 POUŽITÍ
Test SERION ELISA antigen Candida je kvantitativní a kvalitativní imunologické stanovení
k detekci kandidového antigenu v séru nebo plazma. Stanovení je doporučováno k detekci
systémové kandidózy.
2
DIAGNOSTICKÁ RELEVANCE
Candida albicans je všeobecně rozšířená kvasinka, která jako všechny druhy Candida,
patřící do čeledi kvasinkovitých hub. Kromě kvasinkovité formy, která způsobuje primárně
superficiální infekce, jsou dalším morfologickým projevem kvasinkovitých hub tzv.
pseudomycelia. V případech invazivních mykóz se vyskytují zárodečné klíčky a dochází ke
tvorbě pseudomycelií. Druhy Candida produkují a vylučují velký počet destruktivních
enzymů, které umožňují fakultativně patogenním organismům, aby pronikly bariérami
sliznic a cév.
Druhy Candida se primárně přenáší těsným kontaktem mezi osobami. Primární vstupní
branou jsou ústa. Změny fungistatických vlastností kůže následkem mírně kyselého pH a
konkurenční bakteriální flóry mohou usnadnit vznik povrchové kandidózy na povrchu kůže.
Systémová mykóza je výsledkem kolonizace sliznic, zejména v gastrointestinálním traktu.
Druhy kandida dokáží ulpívat na epitelu pestré škály sliznic díky adhezním proteinům a
dalším buněčným povrchovým strukturám. Následující schéma ukazuje hypotetické kroky,
které mohou způsobit rozšíření infekcí v případě závažných základních podmínek: Přesný
popis různých stadií není v rámci tohoto textu možný. (Obrázek 1)
Kolonizace
nasofaryngeálního traktu
Vstup do
krevního okruhu
Průchod lumenem
žaludku
Přenos do
uzlinového systému
Invaze
do více orgánů
Obrázek 1: Progrese infekcí kandidami
česky
2
Přechod do
lumenu střeva
persorpce
kandid -buněk
Lokalizace
superficiální
hluboká mykóza (invazivní)
kůže, sliznice
hlavní orgány
ES
infekce kandidami
+,-/-
Rizikové faktory
těhotenství
chemoterapie
diabetes
iatrogenní potlačení imunity
AIDS
katétr centrální vény
dysfunkce kůže
radioterapie
nedostatečná ústní hygiena
popáleniny vysokého stupně
PT
EL
Imunitní způsobilost +
hostitele
ve většině případů neškodné
bez nebezpečí života
terapie
efektivní terapie
ve
většině
ohrožující
případů
CZ
chirurgický zákrok
Klinická progrese
život
účinnost terapie závisí na stádiu
infekce
Tabulka 1: Charakteristiky infekcí kandidami
Diagnóza infekcí kandidami pomocí sérologických metod není jednoduchá: na jedné
straně může přechodná kolonizace kvasinkami vyvolat odezvu protilátek, na druhé straně
může systémová mykóza způsobená kandidami u pacientů s imunosupresí vést pouze
k nevýrazným změnám aktivity protilátek. Takové situace vyžadují kritickou interpretaci
sérologických nálezů. Navíc systémové infekce kandidami nemusí způsobovat typické
symptomy.
V současnosti není možné přijmout závěr, že výsledky různých testovacích systémů pro
zjištění protilátek proti kandidám jsou buď srovnatelné, nebo dokonce zaměnitelné.
Specificita detekovaných protilátek významně závisí na systému testu (ELISA nebo HAT)
nebo na použité antigenovém přípravku. Detekce protilátek IgM pomocí HAT je vyšší než
detekce protilátek IgG díky vyšším aglutinačním vlastnostem molekul IgM. HAT hlavně
detekuje protilátky proti antigenům buněčné stěny kvasinkovitých hub, které ještě dále
komplikují sérologickou interpretaci, ale dává příležitost k diferenciaci.
Změna v koncentraci protilátek může být detekovatelná pomocí testů ELISA, ale ne
pomocí HAT, proto je výhodná kombinace obou postupů, např. v případě poklesu aktivity
protilátek IgM a za současného zvýšení aktivity protilátek IgG.
V současnosti neexistuje žádný jediný postup, který by sám o sobě umožňoval definitivní
sérologickou diagnózu kandidózy. Sledování ohrožených pacientů a terapeutická kontrola
česky
3
EN
Kandidózy se obecně dělí do dvou hlavních skupin, jejichž hlavní charakteristiky jsou
uvedeny v následující tabulce.
vyžadují nasazení řady metod včetně sérologie a detekce antigenů. Test SERION ELISA
antigen Candida je v takových situacích zvlášť užitečný, protože umožňuje zjistit specifický
antigen kandidy ve vzorcích pacientů.
3
SERION ELISA antigen - PRINCIP TESTU
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay [enzymová imunosorpční kvantitativní
analýza]) je imunoanalýza, která je zvláště vhodná ke stanovení protilátek a antigenů na
poli infekční sérologie. Reakce je založena na specifické interakci protilátek s jejich
odpovídajícím antigenem. Testovací pruhy mikrotitrační desky SERION ELISA antigen
jsou pokryty specifickými protilátkami proti zájmovému patogenu. Pokud jsou ve vzorku
séra pacienta přítomny antigeny, váží se na fixovanou protilátku. Sekundární protilátka,
která byla konjugována s enzymovou peroxidázou, detekuje imunní komplex a váže se na
něj. Peroxid vodíku bezbarvého substrátu (H2O2) a chromogen tetramethylbenzidin (TMB)
se převedou na modře zabarvený produkt. Přídavek zastavovacího roztoku změní barvu
na žlutou. Intenzita signálu tohoto reakčního produktu je přímo úměrná koncentraci
antigenu ve vzorku a měří se fotometricky.
antigen/Gültig
und
antigen:
Inhalt
@
11\mod_1346845806738_73.doc
@ 52101
česky
4
EN
4
SLOŽENÍ KITU
2 x 3 ml
Sérum negativní kontroly NEG ,
Lidské sérum doplňené o telecí fetální sérum (FCS);
negativní na protilátky proti HIV Ab, HBs-Ag (povrchový antigen viru hepatitidy B) a
proti HCV Ab;
konzervační prostředek: < 0,1 % azidu sodného.
Konjugát protilátek proti Candida albicans (připravený k použití) PODCR ,
Protilátka proti Candida albicans konjugovaná na křenovou peroxidázu;
stabilizováno proteinovým stabilizačním roztokem a detergentem
konzervační prostředek: 0,1 % ProClin® 300.
13 ml
Koncentrát promývacího roztoku (dostačuje pro 1500 ml) WASH ,
Tris pufrovaný fyziologický roztok s Tween 20; 30násobně koncentrovaný;
konzervační prostředek: < 0,1 % ProClin® 300.
2 x 25 ml
Ředící pufr SAMB ,
15 ml
roztok kyseliny bez konzervačního prostředku.
Zastavovací roztok STOP ,
0,5 N kyselina sírová.
13 ml
Roztok TMB substrátu (připravený k použití) TMB ,
Roztok substrátu TMB-hydrogen peroxidu,
konzervační prostředek: < 0,01 % Kathon CG.
13 ml
Osvědčení o kontrole kvality se standardní křivkou a vyhodnocovací tabulkou
INFO ,
(kvantifikace antigenů v U/ml).
2 kusů
ELISA
antigen/Gültig
für benötigte
antigen/Zusätzlich
benötigte
Materialien @
8\mod_1265796058727_73.doc
@ 29314
@1
česky
5
EL
PT
3 x 3 ml
Standardní sérum STD ,
Antigen Candida albicans v lidském séru doplňeném o telecí fetální sérum (FCS);
negativní na protilátky proti HIV Ab, HBs-Ag (povrchový antigen viru hepatitidy B) a
proti HCV Ab;
konzervační prostředek: < 0,1 % azidu sodného.
CZ
Kusy/
objem
Oddělené proužky mikrotitračního testu, každý s osmi oddělitelnými jamkami 12 kusů
potaženými protilátkou,
(společně 96) MTP ,
1 rámeček.
ES
Složky testu
5
POŽADOVANÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ PŘEDMĚTEM DODÁVKY
-
běžné laboratorní vybavení
spektrofotometr pro mikrotitrační desky s filtrem, vlnová délka 450 nm, doporučená
referenční vlnová délka 620 nm - 690 nm( např. 650 nm)
inkubátor 37 ℃;
topný blok 110 °C
zvlhčovací komora
destilovaná voda
Zaklikávací svorky (objednávkové č. VT120)
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Lagerung
@
11\mod_1346935956390_73.doc
@ 52271
@ 1 und Haltbarkeit
česky
6
EN
Stabilita
Mikrotitrační proužky neotevřené
(potažené protilátkou)
viz datum exspirace;
po otevření při 2 - 8 °C v uzavřeném sáčku minimální životnost:
z hliníkové fólie se sušicím činidlem
4 týdny;
Proužky, které
vzduchotěsně
z hliníkové fólie.
se nepoužijí, se musí uložit trvanlivost
v případě
v suchu v uzavřeném sáčku správného používání a
skladování do data
exspirace
Kontrolní séra
/standardní séra
po otevření při 2 - 8°C
Konjugát
roztok připravený k použití při 2 - 8°C
Chraňte před kontaminací např. použitím sterilních
konců.
18 měsíců ode dne
výroby
neotevřené
Ředicí pufr
výroby
výroby
Promývací roztok
po otevření při 2 - 8°C
Zakalené roztoky zlikvidujte
6 měsíců
Koncentrát po otevření při 2 - 8°C
výroby
pracovní naředění při 2 - 8°C
2 týdny
pracovní naředění při pokojové teplotě
1 týden
Láhve použité pro pracovní naředění se musí
pravidelně čistit. Zakalené roztoky zlikvidujte
Substrát TMB
roztok připravený k použití při 2 - 8°C,
chraňte před světlem!
Chraňte před kontaminací např. použitím sterilních výroby
konců.
Zlikvidujte, pokud roztok zmodrá (extinkce při 650 nm
v porovnání s destilovanou vodou > 0,2 OD).
Zastavovací roztok
Po otevření při pokojové teplotě
česky
7
EL
Uchovávání
PT
Reagens
ES
UCHOVÁVÁNÍ A STABILITA
viz datum exspirace
CZ
6
7
SERION ELISA antigen - POSTUP PŘI TESTU
7.1 Obecné poznámky
Při používání kvantitativního imunologického testu SERION ELISA antigen používejte
pouze reagencie SERION ELISA antigen. Složky se nesmí vyměnit za reagencie od jiných
výrobců. Standardní a kontrolní séra a konjugát kvantitativních imunologických testů
SERION ELISA antigen jsou definovány výlučně pro testovací sadu, která má být použita,
a nesmí se použít v jiných šaržích.
Ředicí pufr, promývací roztok, substrát a zastavovací roztok lze používat se všemi
imunologickými testy SERION ELISA antigen bez ohledu na šarži a test.
Pokud zůstanou neotevřené, mohou být všechny složky testů SERION ELISA antigen
používány až do doby uvedené na štítcích, jestliže jsou správně skladovány. Reagencie
se nesmí používat po uplynutí doby životnosti.
Ředění či pozměňování reagencií může způsobit ztrátu citlivosti.
Během skladování a inkubace chraňte reagencie před silným světlem. Reagencie musí být
po použití pevně uzavřeny, aby se zabránilo odpařování a kontaminaci.
Sáček z hliníkové fólie mikrotitrační desky otevřete tak, že oddělíte pouze horní část
vyznačené strany, aby bylo zaručeno, že jej bude možné znovu správně uzavřít. Proužky
nepoužívejte, bude-li hliníkový sáček poškozen, nebo pokud sáček obsahující zbývající
proužky a vysušovací činidlo nebyl řádně znovu uzavřen.
Přemístění alikvotních množství ze zkumavek s reagenciemi provádějte aseptickými
postupy, aby se zabránilo kontaminaci. Aby nedošlo k falešně pozitivním výsledkům,
dbejte na to, aby při pipetování konjugátu nedošlo ke kontaktu s horní částí stěn jamek ani
k jejich zkrápění. Dávejte pozor na to, aby se nepomíchaly láhve nebo injekční lahvičky.
Zejména roztok TMB substrátu je citlivý na oxidační látky a ionty těžkých kovů. Musí se
chránit po celou dobu před světlem a otevírá se pouze bezprostředně před použitím za
slabého světla. Roztok má slabě zelenomodré zabarvení.
Zabraňte kontaktu roztoku substrátu a zastavovacího roztoku s kůží.
Reprodukovatelnost výsledků testu je závislá na důkladném promísení reagencií. Před
použitím důkladně protřepejte baňky obsahující kontrolní séra a stejně tak postupujte u
všech vzorků po naředění (např. pomocí vířivého mixéru).
Dbejte na pečlivé pipetování a dodržování stanovených inkubačních časů a teplot.
Významné časové rozdíly mezi pipetováním do první a poslední jamky mikrotitrační desky
při dávkování vzorků/kontrolních sér, konjugátu či substrátu mohou vést k různým
„předinkubačním“ dobám, které mohou ovlivnit přesnost a reprodukovatelnost výsledků.
Optimálních výsledků lze dosáhnout pouze v případě, že budete pokyny přesně dodržovat.
česky
8
EN
EL
Adekvátní promývání zabraňuje nespecifickým výsledkům testů. Proto je zapotřebí při
promývání postupovat pečlivě. Všechny jamky s plochým dnem se musí naplnit stejným
objemem promývacího pufru. Na konci výkonu dbejte na to, aby byl z jamek odstraněn
veškerý promývací pufr, aby nedošlo k efektům nekontrolovaného ředění. Zabraňte vzniku
pěny!
ES
Kvantitativní imunoanalýza SERION ELISA antigen je platná pouze v případě, že budou
splněna hodnotící kritéria specifická pro danou šarži uvedená na osvědčení o kontrole
kvality.
Dbejte na to, abyste nepoškodili popis (patogen/AG) na proužcích mikrotitračních testů
během promývání a aspirace, jinak by mohlo dojít k záměně.
Příprava vzorku a uchovávání
Lipemické, hemolytické nebo ikterické vzorky (sérum nebo plazma) by se měly testovat
velmi opatrně. Očividně kontaminované vzorky by se testovat neměly. Mezi vhodné vzorky
patří sérum nebo plazma (EDTA, citrát, heparin) odebrané podle standardních
laboratorních postupů.
7.2.1 Příprava vzorků
Před prováděním testu se musí vzorky (vzorky od pacienta, standard a negativní kontroly)
(V1) naředit ředícím pufrem (V2) následujícím způsobem:
V1 + V2 = 3 + 1
přidejte
300 µl
vzorku (V1)
k
100 µl
ředícího pufru (V2)
Po naředění a před pipetováním na mikrotitrační destičku se vzorky musí důkladně
promíchat, aby vznikl homogenní roztok.
Nakonec se vzorky musí ohřívat 10 minut při teplotě 110 °C (+/- 5 °C). Zásadně důležité je
dodržovat stanovené teplotní podmínky a dobu! Standardní reagenční nádoby nejsou pro
tento termolytický krok vhodné, a proto doporučuje používat reakční nádoby Safe-Lock
nebo podobné nádoby se šroubovým uzávěrem.
Při použití termostatu ohřívacího bloku je zapotřebí kontrolovat skutečnou teplotu
kalibrovaným teploměr. Zohledněte délku předehřívání ohřívacího bloku specifickou pro
zařízení. Ohřívací blok musí v případě potřeby být nastaven na požadovanou teplotu. Při
tepelném rozkladu vznikne bílý zakalený precipitát, který je třeba odstranit odstřeďováním
na předchlazené (4 °C) stolní odstředivce při 10 000 x g po 10 minut. Čirý supernatant pak
může být použit v testu.
česky
9
CZ
7.2
PT
7.2.2 Uchovávání vzorků
Vzorky od léčeného pacienta by se neměly uchovávat déle než 24 hodin při teplotě 2 až
8°C. Neléčené vzorky je zapotřebí uchovávat při 2 – 8 °C nejvýše 7 dnů. Prodloužené
uchovávání je možné při ≤-20 °C. Zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování
vzorků.
7.3
Příprava reagencií soupravy
Před prováděním testů nechte všechny reagencie dosáhnout pokojové teploty.
7.3.1 Proužky mikrotitračního testu
Proužky mikrotitračního testu v rámečcích jsou zabaleny s vysušovacím činidlem
v sáčku z hliníkové fólie. Z rámečku odstraňte nežádoucí kavity a vložte jej zpět
hliníkového do sáčku s vylisovaným uzávěrem. Pečlivě uzavřete sáček, aby se
zajistila vzduchotěsnost.
7.3.2 Kontrolní séra /standardní séra
Kontrolní a standardní séra musí být naředěna pufrem vzorku a následně
denaturována. Do každého provedeného testu – nezávisle na počtu použitých
proužků mikrotitračního testu – musí být zahrnuta kontrolní a standardní séra.
Standardní séra je třeba vytvořit dvojmo.
7.3.3 Konjugát (připravený k použití)
Konjugát připravený k použití chraňte před kontaminací např. použitím sterilních
konců.
7.3.4 Promývací roztok
Nařeďte koncentrát promývacího pufru (V1) 1 : 30 destilovanou vodou na konečný
objem V2.
Příklad:
Konečný objem
Koncentrát pufru (V1)
(V2)
25 ml
750 ml
1 ml
30 ml
7.3.5 Substrát TMB (připravený k použití)
Roztok substrátu připravený k použití chraňte před kontaminací např. použitím
sterilních konců.
Substrát TMB je světle modro-zelený a jakékoli roztoky, které vykazují intenzivní
zbarvení (extinkce proti destilované vodě při 650 nm >0,2 OD), je třeba zlikvidovat.
7.3.6 Zastavovací roztok (připravený k použití)
česky
10
Přehled postupu použitého při testu
EN
7.4
kvantitativní
ES
Ředění vzorků
(Vzorky od pacientů, kontrolní a standardní sérum)
Vzorek 300 µl + ředicí pufr 100 µl
EL
INKUBACE 10 min / 110 °C
ODSTŘEDĚNÍ 10 min / 10 000 × g / 4 °C
PT
Příprava vzorků a kontrolních a standardních sér
Přidat supernatant ze vzorků (100 µl)
zvlhčovací komora
PROMÝVÁNÍ (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipetování roztoku konjugátu PODCR (100 µl)
zvlhčovací komora
PROMÝVÁNÍ (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipetování roztoku substrátu TMB (100 µl)
zvlhčovací komora
Pipetování zastavovacího roztoku STOP (100 µl)
ODEČTENÍ EXTINKCE při 450 nm (ref. 650 nm)
česky
11
CZ
Uchovat supernatant, zlikvidovat peletu
7.5
Postup manuálního testu
1. Předběžné zpracování vzorků séra (vzorky od pacientů, standardní a kontrolní sérum)
jak popsáno.
2. Umístěte do rámečku požadovaný počet jamek a připravte si pipetovací protokol.
3. Do příslušných jamek pásků mikrotitračního testu přidejte 100 µl supernatantů ze
standardního séra (dvojmo), negativní kontrolní sérum a vzorky od pacientů.
Jednu jamku nechte volnou pro holý substrát, např.:
Candida antigen kvantitativní
Jamka A1
Holý substrát
Jamka B1
Negativní kontrolní sérum
Jamka C1
Standardní sérum
Jamka D1
Standardní sérum
Jamka E1
Vzorek od pacienta 1...
4. Inkubace vzorku po 60 minut (+/- 3 minuty) při 37 ℃ (+/- 1 °C) ve zvlhčovací komoře.
5. Po inkubaci promyjte všechny jamky promývacím roztokem (automatickou
promývačkou nebo manuálně):
- odsajte nebo vytřepte inkubační roztok
- naplňte každou jamku 300 µl promývacího roztoku
- odsajte nebo vytřepte promývací pufr
- opakujte promývací proces 4krát (dohromady 5krát!)
- vysušte odkapáním mikrotitrační desky na filtračním papíru
6. Přidání konjugátu
Přidejte 100 µl konjugátu připraveného k použití do příslušných jamek (s výjimkou
holého substrátu).
7. Inkubace konjugátu po 60 minut (+/- 3 minuty) při 37 °C (+/- 1 °C) ve zvlhčovací
komoře.
8. Po inkubaci promyjte všechny jamky promývacím roztokem (viz výše).
9. Přidání substrátu
Přidejte 100 µl roztoku substrátu TMB připraveného k použití do každé jamky
(včetně jamky pro holý substrát!).
10. Inkubace substrátu po 30 minut (+/-1 minuta) při 37 °C (+/- 1 °C) chráněného před
světlem ve zvlhčovací komoře.
11. Zastavení reakce
Přidejte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky. Promíchejte jemným
protřepáváním mikrotitrační desky.
12. Odečtení extinkce
Odečtěte extinkci (OD) během 60 minut při vlnové délce 450 nm proti holému
substrátu, referenční vlnová délka mezi 620 nm a 690 nm (např. 650 nm).
česky
12
SERION ELISA je vhodná pro zpracování na automatech, vyhodnocení použití pomocí
přístroje Immunomat™ a Gemini. Automatické zpracování se provádí analogicky jako při
manuálním použití. Prosím, nezapomeňte, že za zvláštních pracovních podmínek může
být v laboratoři nezbytná vnitřní úprava inkubační doby.
EN
Postup použitý při automatickém testu
ES
7.6
Pozitivní kontrola/kontrola přesnosti
Pro stanovení přesnosti a spolehlivosti průběhu testů SERION ELISA antigen a periodické
o věření testovací metody doporučujeme používat SERION ELISA antigen, aby byly
splněny požadavky vnitřních systémů řízení kvality laboratoře. Používání SERION ELISA
controls je popsáno v příslušných návodech k obsluze.
PT
7.7
EL
CZ
česky
13
8
HODNOCENÍ TESTU
8.1
Jednobodová kvantifikace pomocí metody 4PL
Optimalizované přiřazení extinkčních signálů kvantitativním hodnotám je zaručeno
použitím nelineárních funkcí, které upravují esovitou křivku bez jakékoliv další
transformace hodnot extinkce. Určení koncentrací antigenu pomocí metody SERION
ELISA angiten se provádí logisticko-logaritmickým modelem (4 PL, čtyřparametrová), která
je ideální pro přesné stanovení křivky. Je založena na vzorci:
D-A
OD = A +
1+e
B(C -ln koncentrace)
Parametry A, B, C a D jsou pro přesný tvar křivky vypovídající:
1. dolní asymptota
2. Sklon křivky
3. bod zlomu
4. horní asymptota
parametr A
parametr B
parametr C
parametr D
U každé šarže se vyhodnocuje standardní křivka v Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg,
Německo) pomocí opakovaných chodů testů za optimálních podmínek. Není tedy nutné,
aby uživatel prováděl časově náročnou a nákladnou konstrukci standardní křivky.
Každá testovací souprava SERION ELISA antigen obsahuje specifickou standardní křivku
pro hodnocení koncentrací antigenu a specifickou hodnotící tabulku pro danou šarži. Na
požádání je k dispozici hodnotící software SERION evaluate společně se softwarovým
nástrojem SERION activity, který je založen na programu Microsoft® Excel.
Při každém individuálním testu se používá standardní sérum pro kompenzaci běžných
odchylek testu a rovněž pro kontrolu průběhu testu. Pro toto kontrolní sérum stanoví
referenční hodnotu s rozsahem platnosti kontrola kvality výrobce. V tomto rozsahu je
zajištěna správná kvantifikace koncentrace antigenu.
česky
14
EN
-
Extinkce holého substrátu musí být < 0,25.
-
Negativní kontrola musí dát negativní výsledek testu.
-
Při použití kvantitativních testů SERION ELISA antigen musí být průměrná hodnota
extinkce standardního séra v rozsahu platnosti, který je určen konkrétním
osvědčením kontroly kvality pro danou šarži (po odečtení holého substrátu!)
-
Odchylka hodnot extinkce standardního séra nesmí být vyšší než 20 %.
ES
Kritéria platnosti
EL
8.2
Pos: 25@/Arbeitsanleitungen
ELISA antigen/Gültig
für8\mod_1265792620271_73.doc
antigen/Testauswertung/Auswertung:
Überschrift @
@
28777
2
8.3 Výpočet SERION ELISA antigen Candida
PT
Pokud tato kritéria nebudou splněna, test není platný a musí být opakován.
CZ
8.3.1 Neautomatizované hodnocení
Pro hodnocení testu SERION ELISA antigen je k testovací soupravě přidáno osvědčení
kontroly kvality specifické pro danou šarži se standardní křivkou společně s
vyhodnocovací tabulkou. Hodnota holého séra musí být před vyhodnocováním odečtena
od všech hodnot extinkce.
antigen/Gültig
Methoden
11\mod_1346849110626_73.doc
@ 52254
@
Metoda 1: Kvalitativní hodnocení
Pro určení horní a dolní hranice normálních hodnot (cut-off value), prosím, vynásobte
průměrnou hodnotu naměřené standardní extinkce číselnými údaji z osvědčení o kontrole
kvality (viz speciální případové vzorce), např.:
EXTINKCE = 0,502 x MW(STD) s horní hranicí normálních hodnot
EXTINKCE = 0,352 x MW(STD) s dolní hranicí normálních hodnot
Jestliže je naměřená průměrná hodnota absorbance standardního séra 0,970, rozsah
horní a dolní hranice normálních hodnot (cut-off) je 0,341 až 0,487.
česky
15
Metoda 2:
Průběžné stanovení aktivit antigenu pomocí standardní křivky.
Takzvané meziesejní odchylky (odchylky mezi jednotlivými dny a odchylky mezi
laboratořemi) se kompenzují vynásobením aktuálně naměřené hodnoty, získané ze vzorku
od pacienta, korekčním faktorem F. Tento faktor se vypočítá následovně:
Referenční hodnota extinkce (standardního séra)
F =
Aktuální hodnota extinkce (standardních sér)
Je nezbytné upravit aktuální úroveň testu uživatele pomocí standardní křivky specifické
pro jednotlivou šarži. Za prvé se musí denní odchylky opravit vypočítáním opravného
faktoru F:
1.
Musí se vypočítat průměr dvou hodnot extinkce standardního séra a zkontrolovat,
zdali je v daném rozsahu platných hodnot.
2.
Výpočet faktoru F: daná referenční hodnota se vydělí průměrnou extinkcí
standardního séra:
F = referenční hodnota extinkce standardního séra / průměrná hodnota extinkce
standardního séra
3.
Všechny naměřené hodnoty vzorků od pacienta se vynásobí F.
4.
Aktivity antigenu v IU/ml nebo U/ml lze určit ze standardní křivky pomocí
opravených hodnot.
česky
16
Jestliže je extinkce standardu mimo platný rozsah, objeví se následující hlášení.
„Standardní hodnoty mimo rozsahy v následujících skupinách: Skupina 1-24.“ nebo
„Standardní hodnoty se liší o více než 20 % v následujících skupinách: Skupina 1-24.“
EN
ES
Po zadání čtyřech parametrů a referenční hodnoty standardního séra, se aktivity antigenu
vypočítají v režimu online ze zpracovaných a naměřených průběhů testu SERION ELISA
antigen pomocí softwaru SERION evaluate.
EL
8.3.2 Automatické hodnocení testu pomocí softwaru SERION evaluate
Kód vzorku
Hodnota extinkce
U/ml
Vyhodnocení
8.4
Meze kvantifikace
Meze kvantifikace jsou uvedeny na osvědčení kontroly kvality testu SERION ELISA
antigen. Linearita ředění byla v tomto rozsahu prokázána komplexními hodnotícími
studiemi. V případě, že vzorek pacienta dává výsledek testu nad horní mezí kvantifikace,
vzorek lze testovat při vyšším ředění. Takto stanovená aktivita antigenu se musí vynásobit
faktorem dodatečného ředění.
8.5
Hraniční rozpětí
Hraniční rozpětí testu SERION ELISA antigen Candida je stanoveno na osvědčení
kontroly kvality a indikuje rozpětí hraničních výsledků testů. Hodnoty získané při testování
vzorku pacienta, které spadají pod toto rozpětí, indikují negativní výsledek testu; hodnoty
nad hraniční rozpětí jsou vykládána jako pozitivní. V případě, že výsledky budou uvnitř
v hraničním rozpětí, definitivní interpretace výsledků není možná. V takových případech
test je třeba opakovat souběžně se sledovacím vzorkem odebraným o 1 až 2 týdny
později.
česky
17
CZ
Parametry a referenční hodnota se musí změnit pouze v případě, že došlo ke změně
šarže (vyhodnocovací tabulka ukazuje parametry a referenční hodnoty). Správné zadání
údajů specifických pro danou šarži lze zkontrolovat na základě aktivity standardního séra
(v IU/ml nebo U/ml) přiřazené standardnímu séru. Vypočítaná průměrná hodnota jednotek
musí odpovídat jednotkové hodnotě uvedené na osvědčení specifickém pro danou šarži. U
naměřených hodnot se provádí automatická oprava. Ve standardní verzi je na výtisku
uvedeno následující:
PT
V takových případech je průběh testu neplatný a měl by být opakován.
8.6
Interpretace výsledků
Pozitivní výsledky u vzorků od pacientů jsou projevem kandidémie. Výsledky lze pouze
interpretovat v kombinaci s klinickým obrazem a ostatním detekčními metodami.
Výsledek lze považovat za pozitivní, když bude v testu naměřeno nejméně 2,6 jednotky.
Takový výsledek naznačuje, že vzorek obsahuje takové množství mannanu, které je
spojeno s 2,6 ng proteinu kandidy. Nedokáže však rozlišit mezi živými a mrtvými
organismy.
Negativní výsledky testů nevylučují akutní infekci, zvláště pokud se zjistí vysoké titry
protilátek. V takovém případě může dojít k tomu, že antigen bude zcela maskován
protilátkami a ani proces denaturace během přípravy vzorku nestačí k tomu, aby umožnil
detekci antigenu. Kromě toho může vést k negativnímu výsledku časový bod v průběhu
infekce, kdy je získán vzorek, nevhodný vzorek, špatná příprava vzorku a jeho
uchovávání.
8.7
Referenční rozsah zdravých jednotlivců
Testování náhodných sér dárců krve shromážděných v oblasti jižního Německa testy
SERION ELISA antigen Candida poskytlo následující rozdělení. Ze 103 sér od dárců krve
testovaných testem SERION ELISA antigen Candida bylo 92 (89,3 %) negativních, šest
sér (5,8 %) reagovalo pozitivně a pět vzorků (4,9 %) bylo stanoveno jako hraniční.
9
CHARAKTERISTIKY VÝSLEDKŮ
9.1
Citlivost a specificita
Test SERION ELISA antigen Candida byl validován analýzou 148 vzorků séra od dárců
krve a 93 vzorků od pacientů, kteří vykázali příznaky kandidózy při léčbě v rámci intenzivní
péče, ve srovnání s výsledky při použití komerčně dostupného testu vedoucího
evropského výrobce. Vzorky séra hodnocené jako hraniční nebyly do výpočtu specificity a
citlivosti zahrnuty.
Charakteristiky výsledků
Citlivost
Specificita
> 99,9 %
97,8 %
V jiné interní studii byla prokázána zkřížená reaktivita testu SERION ELISA antigen
Candida s druhy Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida
parapsilosis a Candida tropicalis s cílem zaručit komplexní diagnózu kandid.
česky
18
EN
ES
Vzhledem k podobnosti mannanu a hydroxyethylškrobu (HES), který se používá v
přípravcích pro zvýšení objemu plazmy při léčbě oběhového selhání (hypovolemický,
hemoragický a septický šok), byla vyhodnocena potenciální zkřížená reaktivita. Žádná
zkřížená reaktivita s HES však nebyla při použití testu SERION ELISA antigen Candida
měřitelná.
Reprodukovatelnost
PT
Vnitroesejní reprodukovatelnost byla dvacetkrát stanovena testováním sér různé reaktivity
v jednom průběhu testu. Vnitroesejní reprodukovatelnost byla stanovena testováním
vzorků sér různé reaktivity v 10 nezávislých průběhů testu.
EL
9.2
Směrodatná odchylka
Variační koeficient (CV %) =
x 100
CZ
Průměrná hodnota extinkce
Vzorek
Průměrná
hodnota
extinkce
Vnitroesejní
(VK %)
(OD)
Průměrná
hodnota
extinkce
Meziesejní
(VK %)
(OD)
negativní
0,223
9,6
0,225
7,3
mezní
0,507
2,4
0,476
5,3
pozitivní
1,413
2,5
1,356
2,7
pozitivní
2,851
2,0
2,442
8,1
česky
19
10 BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ
10.1 Výstražná upozornění
Test SERION ELISA antigen je určen k používání kvalifikovaným personálem, který je
obeznámen se správnou laboratorní praxí.
Se všemi reagenciemi v soupravě a vzorky humánních biologických materiálů se musí
pečlivě nakládat při uplatnění zásad zavedené správné laboratorní praxe.
-
Tato souprava obsahuje složky lidské krve. Ačkoliv všechna kontrolní séra a séra
pro stanovení horní a dolní hranice normálních hodnot (cut-off sera) byla negativní
s ohledem na protilátky proti HIV-ab, HBs-Ag (povrchový antigenu viru hepatitidy B)
a HCV-ab , je zapotřebí je považovat za potenciálně infekční.
-
Nepipetujte ústy.
-
Nekuřte, nejezte ani nepijte v místech, kde se nakládá se vzorky nebo reagenciemi
kitu.
-
Používejte rukavice na jedno použití, laboratorní plášť a bezpečnostní brýle při práci
s reagenciemi v kitu nebo vzorky. Poté si důkladně omyjte ruce.
-
Materiál od pacienta a další potenciálně infekční materiál musí být po proběhnutí
testu dekontaminován.
Reagencie musí být uchovávány na bezpečném místě a chráněny před
neoprávněnými osobami, např. dětmi.
-
10.2 Likvidace
Prosím, dodržujte příslušné zákonné požadavky!
česky
20
EN
11 ODKAZY
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
[3]
[4]
Rev. 3, 32-45.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
[15]
[16]
R.
česky
einer
differenzierten
Candida-Serologie.
21
(1991)
Labor-Diagnostik
systemischer
PT
EL
ES
[1]
CZ
SERION ELISA antigen
(V 12/09-1)
Symbole auf den Etiketten/ symbols on labels/ symboles et étiquettes/ simboli sulle etichette/ символы на
этикетках/símbolos sobre las etiquetas/ σύµβολα στις ετικέτες/ símbolos nos rótulos / Symboly na štítcích /
symboler på etiketter/ symboler på etiketterna/ Symbole na etykietach/ symboly na označení/ Simboli na
oznakah/ symbol på etiketter
Hersteller/ Manufacturer/ Fabricant/ Produttore/ Производитель/ Fabricante/ Κατασκευαστής/
Fabricante/ Výrobce/ Fremstiller/ Tillverkare/ Producent/ Výrobca/ Izdelovalec/ Produsent
Ausreichend für 96 Tests/ sufficient for 96 tests/ suffisant pour 96 tests/ sufficiente per 96 test/
достаточно для 96 тестов / suficiente para 96 pruebas/ επαρεκεί για 96 δοκιµασίες/ suficiente para
96 ensaios/ stačí na 96 testů/ nok til 96 test/ tillräckligt för 96 tester/ Wystarcza na 96 testów/
postačuje na 96 testov/ Zadostuje za 96 testov/ Tilstrekkelig til 96 tester
96
96
LOT
Charge/ lot/ lot / lotto/ lote/ παρτίδα/ lote/ šarže/ lot/ lot/ seria/ šarža/ serija/ lot /lot
REF
Referenz oder Bestellnummer/ reference or order number/ numéro de référence ou de commande/
numero di riferimento o ordinazione/ ссылка или номер для заказа / referencia o número de
pedido/ Αριθµός αναφοράς ή παραγγελίας/ referência ou número para encomenda/ reference nebo
číslo objednávky/ reference eller bestillingsnummer/ referens eller beställningsnummer/ Numer
referencyjny lub numer zamówienia/ referenčné číslo alebo číslo objednávky/ referenčna ali
kataloška številka/ Referanse eller ordrenummer
8°C
2°C
Lagern zwischen 2 und 8 Grad Celsius/ store between 2 and 8 degree celsius/ entre 2 et 8 degré
celsius/ conservare a temperatura compresa tra 2 e 8 gradi centigradi/ хранить при температуре
от 2 до 8 градусов цельсия / conservar entre 2 y 8 grados celsius/ Φύλαξη µεταξύ 2 και 8 βαθµούς
Κελσίου/ Armazenar entre 2º e 8º Celsius/ uchovávejte při teplotě 2 až 8 °C/ opbevares mellem 2
og 8 grader celsius/ förvara vid 2 till 8 grader Celsius/ Przechowywać w temp. pomiędzy 2 a 8
stopni Celsjusza/ skladovať pri teplote 2 až 8 stupňov Celzia/ Shranjujte pri temperaturi od 2 do 8 C/
Oppbevares mellom 2 og 8 grader Celsiu
CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG/ CE marking according to IVD guideline
98/79 EC/ Étiquetage CE selon les directives DIV/ marcatura CE in conformità alla direttiva IVD
98/79 EC/ маркировка СЕ согласно директивам IVD 98/79 /marca CE según la directiva IVD
98/79 CE/ Σήµανση CE σύµφωνα µε την οδηγία IVD 98/79 EΕ/ Marcação CE de acordo com a
Directiva 98/79/ značení CE podle směrnice IVD 98/79/ES/ CE-mærkning iht. IVD-retningslinje
98/79/EF/ CE-märkning enligt riktlinjerna för IVD i direktiv 98/79/EC/ Oznakowanie CE zgodne z
wytycznymi dot. diagnostyki in vitro 98/79 EC/ označenie CE podľa smernice IVD 98/79/ES/ oznaka
CE, skladna s smernico IVD 98/79/ES/ CE-merking i henhold til IVD-retningslinjer 98/79/EØF
0197
CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG gemäß Anhang II, Liste B/ CE marking
according to IVD guideline 98/79 EC according to annex II, list B/ Étiquetage CE selon les directives
DIV 98/79 CE selon l'annexe II, liste B/ marcatura CE in conformità alla direttiva IVD 98/79 EC
secondo l’allegato II, elenco B/ маркировка СЕ согласно директивам IVD 98/79, приложение II,
список В / marca CE según la directiva IVD 98/79 CE de acuerdo con el anexo II, lista B/ Σήµανση
CE σύµφωνα µε την οδηγία IVD 98/79 EΕ, σύµφωνα µε το παράρτηµα ΙΙ, κατάλογο Β/ Marcação
CE de acordo com a Directiva 98/79/ CE relativo aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro,
segundo a lista B do anexo II/ značení CE podle směrnice IVD 98/79/ ES podle příloh II, seznamu
B/ CE-mærkning iht. IVD-retningslinje 98/79 /EF iflg. anneks II, liste B/ CE-märkning enligt
riktlinjerna för IVD i direktiv 98/79/EC, bilaga II, lista B/ Oznakowanie CE zgodne z wytycznymi dot.
diagnostyki in vitro 98/79 EC, zgodnie z aneksem II, lista B/ označenie CE podľa smernice IVD
98/79 ES v znení dodatku II, zoznam B/ oznaka CE, skladna s smernico IVD 98/79/ES in
seznamom B v Dodatku II/ CE-merking i henhold til IVD-retningslinjer 98/79/EØF, tillegg II, liste B
Verfallsdatum/ expiry date/ date d'expiration/ data di scadenza/ срок годности до/ fecha de
caducidad/ ηµεροµηνία λήξης/ data de validade/ datum exspirace/ udløbsdato/ förfallodatum/ data
upływu ważności/ dátum exspirácie/ datum izteka roka uporabnosti/ utløpsdatp
MTP
Mikrotiterplatte (brechbare Streifen)/ microtiter plate (breakable strips)/ plaque de microtitration
(bandelettes détachables)/ piastra per microtitolazione (strisce separabili)/ микротитровальная
панель (отрывные стрипы) /placa de microtitulación (tiras rompibles)/ Πλάκα µικροτιτλοποίησης
(αποσπωµενες ταινίες)/ placa de microtitulação (tiras quebráveis)/ mikrotitrační deska (rozlomitelné
proužky)/ mikrotiterplade (afbrækkelige strimler)/ mikrotiterplatta (brytbara strips)/ Płytka
mikrotitracyjna (paski do odrywania)/ mikrotitračná platnička (rozlomiteľné prúžky)/ vsebnik za
mikrotitriranje (z razdelki, ki jih je mogoče odlomiti)/ Mikrotiterplate (avbrytbare strips)
AK
Antikörper/ antibodies/ Anticorps/ anticorpi/ антитела / anticuerpos/ αντίσωµα/ anticorpos/
protilátky/ antistoffer/ antikroppar/ Przeciwciała/ protilátky/ protitelesa/ Antistoffer
STD
Standardserum/ standard serum/ Sérum standard/ siero standard/ стандартная сыворотка /suero
patrón/ πρότυπος ορός/ soro padrão/ standardní sérum/ standardserum/ standardserum/ Surowica
standardowa/ štandardné sérum/ standardni serum/ Standardserum
NEG
Negativkontrolle/ negative control/ Contrôle négatif/ controllo negativo/ отрицательные контроли
/control negativo/ αρνητικός έλεγχος/ controlo negativo/ negativní kontrola/ negativ kontrol/ negativ
kontroll/ Kontrola negatywna/ negatívna kontrola/ negativna kontrola/ Negativ kontroll
PODCR
Peroxidase Konjugat (gebrauchsfertig)/ peroxidase conjugate (ready-to-use)/ conjugué peroxydase
(prêt à l'emploi)/ coniugato con perossidasi (pronto per l’uso)/ конъюгат пероксидазы (готовый к
применению)/ conjugado de peroxidasa (listo para usar)/ Συζευξη υπεροξειδάσης (έτοιµο προς
χρήση)/ conjugado com peroxidase (pronto a utilizar)/ konjugát peroxidázy (připravený k použití)/
peroxidasekonjugat (klar til brug)/ peroxidaskonjugat (bruksfärdigt)/ Koniugat peroksydazy (gotowy
do użycia)/ konjugát peroxidázy (pripravený na použitie)/ konjugat peroksidaze (pripravljena za
uporabo)/ Peroksidasekonjugat (bruksklart)
SAMB
Probenpuffer/ buffer of specimens/ tampon pour échantillons/ tampone per campioni/ буфер проб
/solución amortiguadora de muestras/ Ρυθµιστικό διάλυµα δειγµάτων/ tampão para espécimes/ pufr
vzorků/ prøvebuffer/ provbuffert/ Bufor próbek/ vzorkový pufor/ pufer za vzorce/ Prøvebuffer
WASH
Waschlösungskonzentrat/ washing solution concentrate/ concentré de solution de lavage /
soluzione di lavaggio concentrata / промывочный концентрат /concentrado de solución de lavado/
συµπύκνωµα έκπλυσης/ concentrado de solução de lavagem/ koncentrát promývacího roztoku/
vaskeopløsningskoncentrat/ tvättlösningskoncentrat/ Stężony roztwór do płukania/ koncentrát
premývacieho roztoku/ koncentrat za raztopino za izpiranje/ Vaskeløsningskonsentrat
TMB
TMB Substratlösung/ TMB substrate solution/ solution de substrat TMB/ soluzione substrato TMB/
раствор субстрата ТМВ /solución sustrato TMB/ ∆ιάλυµα υποστρώµατος ΤΜΒ/ solução do
substrato TMB/ roztok substrátu TMB/ TMB-substratopløsning/ TMB-substratlösning/ Roztwór TMB
substrat/ substrátový roztok TMB/ raztopina substrata TMB/ TMB-substratløsning
STOP
Stopplösung/ stopping solution/ solution d'arrêt/ soluzione di arresto/стоп-раствор/ solución de
parada/ διάλυµα διακοπής/ solução de paragem/ zastavovací roztok/ stopopløsning/ stopplösning/
roztwór zatrzymujący reakcję/ ukončovací roztok/ raztopina za ustavitev reakcije/ stoppeløsning
CERT
Zertifikat/ certificate/ certificat/ certificato/ сертификат /certificado/ Πιστοποιητικό/ certificado/
certifikát/ certifikat/ certifikat/ Certyfikat/ certifikát/ certifikat/ Sertifikat
INFO
Gebrauchsanweisung, Zertifikat (Standardkurve und Auswertetabelle), CD/ instructions, certificate
(standard curve and evaluation table), CD/ instructions, certificat (courbe de référence et tableau
d'évaluation), CD/ istruzioni per l’uso, certificato (curva standard e tabella interpretativa), CD/
Инструкция по применению, сертификат (стандартная кривая и таблица для оценки),
компактный диск /instrucciones, certificado (curva patrón y tabla de evaluación), CD/ Οδηγίες
χρήσης, Πιστοποιητικό (πρότυπη καµπύλη και πίνακας υπολογισµού), CD/ instruções, certificado
(curva padrão e tabela de avaliação), CD/ (standardní křivka a vyhodnocovací tabulka), CD/
brugsanvisning, certifikat (standardkurve og evalueringstabel), CD/ instruktioner, certifikat
(standardkurva och utvärderingstabell), CD/ Instrukcje, certyfikat (krzywa standardowa i tabela do
określania wyników/ CD/ pokyny, certifikát (štandardná krivka a hodnotiaca tabuľka), disk CD/
navodila, certifikat (standardna krivulja in ocenjevalna tabela), CD/ Instruksjoner, sertifikat
(standardkurve og evalueringstabell), CD
RTU
gebrauchsfertig/ ready-to-use/ prêt à l'emploi/ pronto per l'uso/ готовый к использованию /listo
para usar/ έτοιµο προς χρήση/ pronto a utilizar/ připravený k použití/ klar til brug/ bruksfärdig/
gotowy do użycia/ pripravené na použitie/ pripravljen za uporabo/ klar til bruk
CONC
Konzentrat/ concentrate/ concentré/ concentrato/ концентрат / concentrado/ Συµπύκνωµα/
concentrado/ koncentrát/ koncentrat/ koncentrat/ Koncentrat/ koncentrát/ koncentrat/ Konsentrat
DIL
verdünnen oder lösen in/ dilute or disolve in/ diluez ou dissoudre dans/ diluire o sciogliere in/
разбавить или растворить в /diluir o disolver en/ αραίωση ή διάλυση σε/ diluir ou dissolver em/
nařeďte nebo rozpusťte v/ fortynd eller opløs i/ späd eller lös i/ Rozcieńczyć lub rozpuścić w/
rozriediť alebo rozpustiť v/ razredčite ali raztopite v/ Fortynnes eller løses opp i
AQUA
destilliertes Wasser/ aqua detillata/ eau distillée/ acqua distillata/ дистиллированная вода /agua
destilada/ αποσταγµένο νερό/ água destilada/ destilovaná voda/ destilleret vand/ destillerat vatten/
woda destylowana/ destilovaná voda/ destilirana voda/ Destillert vann
IVD
In-vitro Diagnostik Anwendung/ in-vitro diagnostic use/ utilisation en diagnostic in-vitro/ uso
diagnostico in vitro/ использование в диагностике ин-витро /uso diagnóstico in-vitro/ ∆ιάγνωση,
χρήση in-vitro/ para diagnóstico in vitro/ diagnostické použití in-vitro/ til in-vitro diagnostik/ in vitrodiagnostisk användning/ do diagnostyki in vitro/ diagnostické použitie in-vitro/ uporaba pri
diagnostiki in vitro/ In vitro-diagnostisk bruk
200
Candida

SERION ELISAantigen

Transcrição

Documentos relacionados

Curriculum Vitae - Universidad Nacional Experimental del Táchira

DIAGNÓSTICO Y SITUACIONES CLÍNICAS DE LA INFECCIÓN

OMS generale ok 2.ps, page 5 @ Preflight ( impaginati

listado de tasas consulares vigentes

(EN-PT-ES) de termos, abreviações e acrônimos usados com

Catálogo MeetYou

78859 FLY BOOMERANG AUSSIEE_INS_web

HP Officejet J3600

Mapa Curricular - Instituto Tecnológico de Chetumal

résumés - Association mondiale de la Route