ATPases - LAFeBS

31/10/2012
Transporte ativo
e ATPases
Profa. Jennifer Lowe
IBCCF – UFRJ
[email protected]
Composição e Estrutura Molecular das Membranas Biológicas
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Modelo do Mosaico Fluido
Singer e Nicolson (1972)
Comparação da Concentração de Íons
Intra e Extracelular (mamífero):
COMPONENT
INTRACELLULAR
CONCENTRATION (mM)
EXTRACELLULAR
CONCENTRATION (mM)
Cations
Na+
5-15
K+
140
5
Mg2+
0.5
1-2
Ca2+
10-4
1-2
7 × 10-5 (10-7.2 M or pH 7.2)
4 × 10-5 (10-7.4 M or pH 7.4)
5-15
110
H+
145
Anions*
Cl*
The cell must contain equal quantities of positive and negative charges (that is, be electrically neutral). Thus,
in addition to Cl-, the cell contains many other anions not listed in this table; in fact, most cellular constituents
are negatively charged (HCO3-, PO43-, proteins, nucleic acids, metabolites carrying phosphate and carboxyl
groups, etc.). The concentrations of Ca2+ and Mg2+ given are for the free ions. There is a total of about 20 mM
Mg2+ and 1-2 mM Ca2+ in cells, but this is mostly bound to proteins and other substances and, for Ca2+, stored
within various organelles.
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Composição dos Compartimentos
Intracelular e Extracelular
Tipos de Transporte Através das Membranas Biológicas
Transporte passivo
Transporte ativo
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Classes de Transportadores
•Número de substratos transportados
•Direção na qual é transportado.
Trocador cloretobicarbonado em
eritrócitos
Transportador
de glicose em
eritrócitos
Transportador
de glicose em células
de epitélio intestinal
Transporte Ativo
Movimento de moléculas através da membrana contra um
gradiente de concentração ou gradiente eletroquímico.
Primário
ATPases: P, V, F e ABC
Secundário
Na+ e H+
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Transporte ativo secundário
- transportadores acoplados –
O gradiente iônico fornece energia para o transporte ativo secundário
Transporte Ativo Secundário
Presente em Praticamente Todos os Organismos
Captação de lactose em bactéria E. coli.
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Molécula de ATP
Ligação fosfo-anidro
ATP
• Usado direta e indiretamente como fonte de energia
química nos sistemas biológicos.
• Todos os tipos celulares são impermeáveis ao ATP –
reciclado dentro da célula.
• Todas as células catalisam o ciclo de síntese e
hidrólise de ATP.
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Transferência de fosforila
• Utilizada para impulsionar reações, que sem ela
seriam endergônicas.
• ATP é um carreador ativado de fosforilas porque a
transferência de fosforila é um processo exergônico.
• Altera a energia de conformação de uma proteína ou
serve como sinal para modificar a atividade de uma
proteína.
Moeda Energética da Célula
- Reações acopladas -
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ATPases
• Enzimas que se ligam a molécula de ATP, hidrolisam esta
molécula para realizar suas funções em uma célula.
–
–
–
–
–
Manutenção dos gradientes eletroquímicos (ATPases )
Enovelamento de proteínas (HSPs)
Função intracelular (miosina)
Função extracelular (ecto-ATPases)
Função nuclear
• ATPases não transportadoras e ATPases transportadoras.
ATPases Transportadoras
• Proteínas integrais de membrana responsáveis por
diversos processos biológicos e/ou fisiológicos por
serem capazes de fornecer a energia necessária por
elas requeridas.
–
–
–
–
–
–
Controle do volume celular
Potencial de repouso e sua recuperação
Relaxamento muscular
Balanço do pH intracelular
Digestão de alimentos
Transporte vetorial entre dois compartimentos celulares
contra gradiente de potencial eletroquímico
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ATPases Transportadoras
• Grande estudo nos últimos 50-60 anos por
diversas razões:
– Facilmente classificadas em poucas categorias
(famílias)
– ATPases transportadoras tem papel relevante em
doenças humanas
– Estudos de relação estrutura-função
– Prêmio Nobel de Química
Importâncias da ATPases na Fisiologia Humana
• Manutenção dos potenciais de membrana
• Regulação da composição e volume dos fluidos corporais
• Manutenção dos gradientes eletroquímicos (transporte ativo
primário e consequentemente o transporte ativo
secundário)
– Captação de nutrientes
– Excreção de metabólitos, de substâncias estranhas e/ou
tóxicas ao organismo
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Alterações funcionais de sistemas biológicos
• Mutações nos genes
• Doenças genéticas
–
–
–
–
–
Proteínas
Não-funcionais
Parcialmente funcionais
Falhas no endereçamento de proteínas
Falhas no enovelamento de proteínas
Alteração nos processos regulatórios
Classificação das ATPases
• F-ATPases
• P-ATPases
• V-ATPases
• ABC-ATPases
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Estrutura Geral das ATPases
F-ATPases - ATPsintase
H+
H+
Mit.
ATP
ADP + Pi
ATP
ADP + Pi
Citosol.
H+
H+
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Geschwind JF, Ko YH, Torbenson MS, Magee C, Pedersen PL.
Novel therapy for liver cancer: direct intraarterial injection of a potent inhibitor of ATP production.
Cancer Res. 2002 Jul 15;62(14):3909-13.
3-Bromopyruvate
Once transported inside a tumor cell, 3-BrPA inhibits ATP production by glycolysis by inhibiting mitochondrially bound hexokinase , a metabolic feature of many highly
malignant tumors, and by inhibiting also ATP production by oxidative phosphorylation.
Complete regression of an advanced abdominal
tumor (HCC) after 3-BrPA Therapy. (A) Advanced
HCC in “Two Dottie.” (B) Human equivalent. (C)
Different treatment stages. (D) Tumor
histopathology.
Biochem Biophys Res Commun. 2004 Nov 5;324(1):269-75.
Advanced Cancers: eradication in all cases using 3-bromopyruvate
therapy to deplete ATP.
Ko YH, Smith BL, Wang Y, Pomper MG, Rini DA, Torbenson MS,
Hullihen J, Pedersen PL.
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P-ATPases
• P1: ATPases de metais pesados
–
–
–
–
Cd2+-ATPase
Cu+-ATPase
Hg2+-ATPase
Zn2+-ATPase
• P2: ATPases clássicas
– Na+,K+-ATPase
– Ca2+-ATPase (PMCA e SERCA)
– H+,K+-ATPase
• P3: ATPases bacterianas
– K+-ATPases
Lutsenko e Kaplan, 1995
Biochemistry 34(48):15607-13
Árvore filogenética das P- ATPases
Fosfolipideos
Metais pesados
Bacterianas
Sem especificidade
Mg2+
Ca2+; PMCA
H+
Ca2+, Mn2+; SERCA
Na+?; Ca2+?
Na+/K+; H+/K+
Axelsen, K.B. & Palmgren, M.G., 1998
J. Mol. Evol. 46:
46 84-101
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P-ATPases
• Formam um intermediário fosforilado durante seu ciclo
catalítico;
Catalytic cycle of P-type ATPases. The bold arrows correspond to the forward cycle of P-ATPases requiring ATP. The
four steps are reversible. cyt., cytoplasmic; extra-cyt., extracytoplasmic.
Catty, P. et al., 2011. J
Biol Chem. 2011 21;286(42):36188-97.
Resíduo de ácido
aspártico altamente
conservado entre
todas as P-ATPases
(motif DKTGT)
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Acil-fosfato e Ester-fosfato
Hydroxylamine
Catalytic phosphorylation
OH
I
C=O
O
I
C=O
Aspartate
Acyl-phosphate
Regulatory phosphorylation
Serine
(Threonine/Tyrosine)
Ester-phosphate
P-ATPases
Na+,K+-ATPase
Bomba eletrogênica - 3Na+ para fora da célula
e 2K+ para dentro da célula.
Jens Skou, 1957
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Na+,K+-ATPase
• Doenças humanas relacionadas:
• Doença do rim policístico – Mutação do gene PKD1 promove alteração
da localização da Na+,K+-ATPase. Assim há formação de cistos difusos,
incontáveis e atingem os dois rins. É responsável por 10% dos casos de
insuficiência renal terminal. Manifesta-se geralmente por cistos renais na
3ª - 4ª década de vida, podendo ser detectada antes dos 20 anos.
P-ATPases
Ca2+-ATPase
Toyoshima et al., 2000
SERCA - Única ATPase
cristalizada transporta 2Ca2+
para dentro do
retículo.
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Ca2+-ATPase
• Função
• Manter os níveis Ca2+ intracelulares baixos
• Responsável pela formação e manutenção dos
estoques intracelulares de Ca2+
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Ca2+-ATPase
• Doenças relacionadas:
Doença de Brody – doença genética rara de origem muscular, devido a deficiência da captação de Ca2+
no retículo sarcoplasmático. Pacientes sofrem de intenso relaxamento muscular. Mutação no gene
ATP2A1 altera a expressão de SERCA1, a isoforma da Ca2+-ATPase de músculo estriado.
Berchtold et al., 2000. Physiological Reviews, 80(3): 1215-1265
Doença de Darier – doença genética rara cutânea, devido a mutação no gene ATP2A2, que codifica a
isoforma SERCA2. Doença caracterizada por dermatoses e acantólise (diminuição ou perda da união
entre as células). Importância da sinalização do Ca2+ na homeostasia da epiderme.
Hovnanian A. 2004 Biochem Biophys Res Commun. 322(4):1237-44.
Cu+ ATPase
DOENÇAS DE MENKES E WILSON
Doença genética causada por mutações nas diferentes Cu+-ATPases
DEFICIÊNCIA DE COBRE
Hipotonia
Kinky hair
Má formação de
tecido conectivo
ACUMÚLO DE COBRE
Hepatotoxicidade
Anéis de Kayser-Fleischer
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Outras P-ATPases:
• H+,K+-ATPase
• H+-ATPase
• ATPases de Metais Pesados Não Essenciais
– Cd2+
– Hg2+
– Pb2+
H+,K+-ATPase gástrica
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Omeprazol
• Inibidor específico da bomba de prótons gástrica, responsável
pela produção de HCl nas células parietais.
• O medicamento Losec foi o fármaco mais vendido do mundo
durante vários anos.
• US$ 6,3 bilhões, equivalem a quase metade do mercado
norte-americano de remédios para doenças gastrointestinais
e do metabolismo.
Metal pesado não essencial
- resistência em plantas e bactérias • Mercúrio:
– Operon mer
– Fitoremediação: uso das plantas para degradar, remover ou
estabilizar substâncias tóxicas do solo ou das águas
contaminadas.
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Importância das P-ATPases
Transportadoras de Íons
Transporte de íons através das membranas biológicas, seja mediado ou contra
gradiente eletroquímico, são processos de fundamentai importância nas áreas
da biofísica e bioquímica.
Os avanços mais recentes sobre a caracterização da estrutura da bomba SERCA
em diferentes estágios fisiológicos desencadearam o entusiasmo para
desvendar os detalhes mecanísticos de processos de antitransporte de íons
nas ATPases do tipo P.
Caraterização computacional, mutacional, cristalografia de raios-X ou outras
técnicas estruturais fornecem valiosas informações para entender a variação
de estados fisiológicos caracterizados pela ligação de cátions, de inibidores e
sítios de ligação de nucleotídeos, assim como suas consequências funcionais.
Inibidores que bloqueiam uma bomba de íons em um determinado estágio
definido parece ter uma grande relevância terapêutica.
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V-ATPases
Transportadora de H+, diminuindo o pH de organelas e assim ativando
proteases e outras enzimas hidrolíticas.
V-ATPases
Papel fisiológico
Nishi & Forgac (2002)
Nature Reviews Molecular
Cell Biology 3; 94-103
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V-ATPases
Função na membrana plasmática
Nishi & Forgac (2002)
Nature Reviews Molecular
Cell Biology 3; 94-103
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Transportadores do tipo ABC
ABC-ATPases
(ATP Binding Cassete)
CFTR
Transporta íons cloreto em
diversas células para formar
muco (pulmão, pâncreas,
intestino, fígado e etc)
ΔF508
G542X
G551D
N1303K
W1282X
Não enovela corretamente e é
degradada rapidamente.
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Fibrose Cística
•
Ou mucoviscidose afeta principalmente os pulmões e o tubo
digestivo. Estimam-se que 2,5 milhões de pessoas no Brasil possam
transmiti-la.
•
É a principal doença diagnosticada pelo teste do pezinho, porque é
a mais comum entre as doenças genéticas graves da infância.
•
Se manifesta principalmente pela tosse crônica encatarrada,
pneumonias freqüentes, obstrução intestinal nos primeiros dias
após o nascimento, baixo peso e altura, fezes volumosas, mal
digeridas e com restos de alimentos e excesso de gordura.
•
Suor salgado é a característica do paciente (menor reabsorção de
sódio pelas glândulas). Os portadores também têm uma mistura de
sintomas respiratórios e gastrointestinais de graus variáveis (muco
espesso).
Resistência a Múltipla Drogas
Transportadores do tipo ABC e enzimas de detoxificação em hepatócitos
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Glicoproteína P
(ex.: extrusão de quimioterápicos)
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