IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA DE ALÉRGENOS DE

 IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA DE ALÉRGENOS DE Dermatophagoides farinae EM CÃES COM DERMATITE ATÓPICA Victor do Espirito Santo CUNHA*1; Tielli MAGNUS1, Juliane POSSEBOM2; Desydere Trindade PEREIRA3; Javier ALVAREZ4 1-­‐ FDA Allergenic (victor@fda-­‐allergenic.com.br) ; 2-­‐ PonLxcia Universidade Católica (PUC) do Paraná; 3-­‐ Universidade Federal de Santa Maria (UFSM); 4-­‐ ALERGOVET Madrid INTRODUÇÃO §  Extratos alergênicos de uma mesma espécie podem apresentar diferenças significaLvas de potência quando oriundos de diferentes laboratórios, ou mesmo entre diferentes lotes do mesmo laboratório (DREBORG, 1993). §  A potência de um extrato alergênico depende diretamente da quanLdade de alérgenos presentes no extrato. §  Alérgenos de D. farinae (DF) já foram idenLficados através de Western Blo0ng com soros de cães com DAC e parecem diferir dos alérgenos idenLficados pelos soros de pessoas alérgicas (MCCALL et al., 2001; WEBER et al., 2003) OBJETIVOS §  IdenLficar alérgenos de DF em extrato alergênico comercial. §  Confirmar a importância de DF como fonte de alérgenos para DAC. §  Averiguar a qualidade do extrato testado para diagnósLco e ASIT. METODOLOGIA §  Soros: provenientes de 13 cães com diagnósLco clínico de DAC (FAVROT et al., 2010) e teste sorológico posiLvo para DF (PetElisa®, ALERGOVET) e 2 cães controles (ausência de sintomas e teste sorológico negaLvo para DF). §  Western Blo0ng: extrato de DF (FDA Allergenic) foi separado em gel de poliacrilamida a 10% sob condições redutoras e desnaturantes (SDS-­‐PAGE) e então transferidos para membrana de nitrocelulose com poros de 0,45 µm (100 V por 90 min) (BOLLAG et al., 1996). Após bloqueio (BSA 3%), a membrana foi incubada com os soros diluídos (1:3) em BSA 0,5%, overnight (2 a 8°C). Após lavagem (PBS/T 0,03%), a membrana foi incubada em temperatura ambiente por 2 h com conjugado policlonal anL-­‐IgE de cão (ICL GE-­‐40P, 1:1000 em BSA 0,5%) e, finalmente, após lavagem com PBS/T, reveladas com substrato True BlueTM (KPL). RESULTADOS E DISCUSSÃO O perfil de proteínas do extrato de DF testado está apresentado na Figura 1. Os soros de cães alérgicos a DF idenLficaram ao menos sete bandas com pesos moleculares entre 37 e 102kD (Figura 2). Todos (100%) idenLficaram duas bandas com aproximadamente 100kD, provavelmente Der f 15, conforme estudos anteriores (DREBORG, 1993). Dez soros (77%) reconheceram uma banda com aproximadamente 75kD, nove (69%) uma banda com peso molecular pouco abaixo de 75kD, e oito (62%) duas bandas com aproximadamente 50 e 60kD. Uma proteína de 60kD de DF, chamada Der f 18, já foi idenLficada como alérgeno principal para cães (MCCALL et al., 2001). Der f 18 é homólogo às quiLnases de insetos e, como Der f 15, está localizado no sistema digesLvo dos ácaros, mas não nas pelotas fecais. Uma banda de aproximadamente 37kD foi reconhecida pelos soros de sete cães alérgicos (54%), indicando ser outro alérgeno principal de DF para cães com DAC. Uma proteína de 37kD de DF foi reconhecida pelos soros de cães alérgicos e idenLficada como Der f 10 (MCCALL et al., 2001). PPM A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 C1 C2
100 kD
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Figura 1. SDS-­‐PAGE com lote Referência (PPIR – FDA Allergenic) e lote testado de extrato alergênico de D. farinae. PPM – Padrão de Pesos Moleculares CONCLUSÕES §  Diferentemente dos soros controles, soros de cães com DAC reconhecem diversos alérgenos de DF, comprovando a importância desta espécie para a DAC no Brasil. §  O extrato de DF testado é apropriado para diagnósLco específico e ASIT em cães com DAC sensíveis a DF. 75 kD
50 kD
37 kD
25 kD
20 kD
Figura 2. Western Blo0ng com extrato de D. farinae e soros de 13 cães alérgicos (A1-­‐A13) e 2 controles (C1-­‐C2). PPM – Padrão de Pesos Moleculares. REFERÊNCIAS §  BOLLAG, D.M. et al. Protein Methods. 2a ed. New York: Wiley-­‐Liss. 1996, 415p. §  DREBORG, S. StandardizaLon of allergenic preparaLons by in vitro and in vivo methods. Allergy, v.48, suppl.
14, p.63-­‐70. 1993. §  MCCALL, C. et al. CharacterizaLon and cloning of a major high molecular weight house dust mite allergen (Der f 15) for dogs. Vet Immunol Immunophatol, v.78, p.231-­‐247, 2001. §  FAVROT, C. et al. A prospecLve study on the clinical features of chronic canine atopic dermaLLs and its diagnosis Vet. Dermatol., v. 21, p. 23-­‐31, 2010. §  WEBER, E. et al. IdenLficaLon, characterizaLon, and cloning of a complementary DNA encoding a 60 kDa house dust mite allergen (Der f 18) for human beings and dogs. J Allergy Clin Immunol, v.112, p.79-­‐86, 2003.