Análises de expressão e de toxicidade em plantas de algodão

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
Departamento de Agronomia
Programa de Pós-Graduação em Agronomia
Melhoramento Genético de Plantas
Análises de expressão e de toxicidade em
plantas de algodão contendo o gene cry1Ia
que confere resistência à insetos
Carliane Rebeca Coelho da Silva
Orientação: Prof Dr. Péricles de Albuquerque Melo Filho
Co-orientação: Dra. Roseane Cavalcanti dos Santos
Introdução
 Revisão de literatura
 Objetivos
 Material e Métodos
 Resultados Esperados
Revisão Bibliográfica
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Aspectos econômicos do algodoeiro
Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada
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Aspectos econômicos do algodoeiro
Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada
Cultivo comercial abrange mais de 100 países,
com área anual superior a 40 milhões de hectares;
 Principais produtores mundiais de algodão

Aspectos econômicos do algodoeiro
Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada
Cultivo comercial abrange mais de 100 países,
com área anual superior a 40 milhões de hectares;
Situação nacional:
Estimativa para safra 2009/10:
Caroço – 2 milhões de toneladas
Área – 843 mil ha
 Principais estados produtores:
 Principais estados produtores:
 Principais estados produtores:
 Principais estados produtores:

Classificação Taxonômica e Botânica do
Gênero Gossypium
 Filo: Angiospermae
 Classe: Dicotiledoneae
 Ordem: Malvales
 Família: Malvaceae
 Tribo: Hibisceae

Classificação Taxonômica e Botânica do
Gênero Gossypium
 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m

Classificação Taxonômica e Botânica do
Gênero Gossypium
 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m
 Característica da espécie: presença de bráctea
protegendo o botão floral

Classificação Taxonômica e Botânica do
Gênero Gossypium
 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m
 Característica da espécie: presença de bráctea
protegendo o botão floral
 Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a
emergência

Classificação Taxonômica e Botânica do
Gênero Gossypium
 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m
 Característica da espécie: presença de bráctea
protegendo o botão floral
 Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a
emergência
 A flor é do tipo hermafrodita com sistema de
reprodução intermediário

Classificação Taxonômica e Botânica do
Gênero Gossypium
 Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m
 Característica da espécie: presença de bráctea
protegendo o botão floral
 Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a
emergência
 A flor é do tipo hermafrodita com sistema de
reprodução intermediário
 Fruto: maçã que após a maturação transforma-se
em capulho

Principais problemas na cultura do algodão
Alto custo de produção: U$ 1,500 - 3,000/ha
Cerca de 40% são destinados a:
mecanização da lavoura
controle de plantas invasoras
controle de pragas e doenças
 Principais pragas:
Anthonomus grandis
(bicudo do algodoeiro)
Plutela xylostella
(tarças-das-crucíferas)
Anticarsia gemmatalis
(lagarta da soja)
Pectinophora gossypiella
(lagarta rosada)
Spodoptera frugiperda
(lagarta do cartucho do milho)
Heliothis virescens
(lagarta da maçã)

Transgenia
Técnica de transferência de gens entre espécies
vivas que, em condições naturais, não se cruzam

Transgenia
Técnica de transferência de gens entre espécies
vivas que, em condições naturais, não se cruzam
Aplicabilidade da transgenia no melhoramento de plantas
a) Possibilidade de transferir genes sem a limitação
imposta pelas barreiras naturais
(ex. Incompatibilidades cromossômicas)

Transgenia
b) Maior controle na transferência de genes
específicos (ex. Alguns genes são transferidos em
grupo)

Transgenia
b) Maior controle na transferência de genes
específicos (ex. Alguns genes são transferidos em
grupo)
c) Redução de tempo para obtenção da cultivar
melhorada (ex. Leva-se entre 5 a 15 anos no
melhoramento convencional)

Transgenia
b) Maior controle na transferência de genes
específicos (ex. Alguns genes são transferidos em
grupo)
c) Redução de tempo para obtenção da cultivar
melhorada (ex. Leva-se entre 5 a 15 anos no
melhoramento convencional)
d) Possibilidade de transferência de genes exógenos
(ex. gene de bactéria para planta)

Área com LGM no mundo
Evolução da área cultivada com LGM (em milhões de ha) no
período de 1996 a 2008 nos paises industrializados e em
crescimento. Fonte: James (2008)

Países que adotam as LGM
Fonte: James (2008)

Principais Métodos de Transformação
Absorção de DNA mediada via polietilenoglicol (PEG)
Biobalística
Vetores biológicos (espécies de gênero Agrobacterium)
 Transformação via microinjeção
Tecnologia Bt
Mecanismo de ação da toxina do Bt
VANTAGENS
Especificidade
Redução do uso de pesticidas (menor dano ambiental)
Objetivos

Objetivo Geral
Avaliar a expressão e a toxicidade da proteína cry1Ia em
plantas transformadas de algodão por meio de testes
moleculares e bioensaios conduzidos com a lagarta
militar.

Metas:
Confirmar a inserção do transgene por meio de
ensaios moleculares e análise de seqüenciamento no
período de 12 meses
Estimar o nível de expressão da proteína por meio de
Dot-ELISA e Western blot no período de 06 meses
Estimar a taxa de mortalidade dos transgenes em
Spodoptera por meio de bioensaios de toxicidade no
período de 06 meses
Material e Métodos
Material Vegetal
cv BRS 293
Transformação Via microinjeção
Surgimento dos primeiros botões florais
O volume de 10 µL (50 ng/µL).
Foram microinjetadas 20 maçãs/planta
 Amplificação dos Fragmentos por PCR
Extração de DNA (Kit DNA Easy)
Ensaios de PCR (Taq polimerase)
Quantificação (Gel de agarose 1%)
Alíquotas 30 ng/μl
 Amplificação dos Fragmentos por PCR
Primers (1F/3R, 2F/2R e 1F/2R)
Produtos de PCR (gel de agarose 0,8%)
Syber Green (LGC)
Fotodocumentação (luz ultravioleta).
 Análise de Integração do DNA por Southern blot
Formas mais simples de determinar em que altura
certos genes estão sendo expressos
DNA genômico digerido com enzimas específicas
Transferência para membrana de nylon
Pré-hibridização
Hibridização com sonda fria (BioNick, Invitrogen)
Southern blot (SAMBROOK, 1989)
 Análise do Seqüenciamento
LGBS/UFRPE
Primer 2F/2R (fragmento de 360 pb)
Purificação (Kit SNAP, Invitrogen)
Amostra: 100 ng/ul
MegaBace1000 (Amersham/GE Healthcare)
Análise da seqüência (Sequence Analyzer)
Edição (BioEdit version 7.0.9.0)
Alinhamento (Blastn (Basic Local Alignment Search Tool)
 Extração e Quantificação das proteínas
Extração (ARAGÃO, 1998)
Centrifugação (11.000 rpm / 30 min / 4ºC)
Separação do sobrenadante
Re-centrifugação (11.000 rpm / 10 min / 4ºC)
Quantificação
Método de Bradford (1976).
 Dot-Elisa
Material vegetal
Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )
Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)
24 transformantes
Ensaio qualitativo
 Dac-ELISA
Material vegetal
Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )
Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)
24 transformantes
Dac-ELISA
Técnica utilizada para detectar expressão protéica
Técnica imunológica: uso de anticorpos
Quantitativa.
Muito sensível.
 Placa especifica com 96 poços sendo três repetições
 Western blot
 Estuda o perfil de expressão protéica.
Tecnica comparativa
 Os extratos protéicos são separados por eletroforese,
sistema SDS-PAGE
 As proteínas transferidas para membrana de
nitrocelulose.
 Os procedimentos posteriores seguirão de acordo com o
descrito em Sambrook et al (1989).
 Bioensaio
Material vegetal
Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )
Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)
 24 transformantes
Bioensaio
Folhas liofilizadas (metodologia descrita por Martins et al., 2001)
Larvas de Spodoptera no segundo estágio
Placas com 24 poços, contendo oito repetições
Leitura feita a partir de 48h até o sétimo dia
Taxa de mortalidade será calculada pela por meio da formula de
Abbot (1925).
Resultados esperados
Identificar eventos de elite expressando a proteína CryIa
em uma dosagem igual ou superior a 50 ng/µg de tecido.
Cronograma:
Atividades moleculares (2010)
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F
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A
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Planejamento das atividades e revisão da literatura
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Ensaios de PCR
Análise de integração do DNA via Southern
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Análise de seqüenciamento
Extração e Quantificação das proteínas
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O
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Dot ELISA
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Western blot
Ensaios de toxicidade
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Atividades complementares (2009/2010)
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A
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Revisão de literatura
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Redação de artigos para eventos científicos
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Elaboração de relatório
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Elaboração da dissertação
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Atividades complementares (2011)
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F
Defesa da dissertação
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A
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J
A
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Agradecimentos: