Euphorbiaceae - Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO
LEANDRA MACEDO DE ARAÚJO GOMES
Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus
quercifolius Pohl (Euphorbiaceae) em roedores
PETROLINA
2014
LEANDRA MACEDO DE ARAÚJO GOMES
Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus
quercifolius Pohl (Euphorbiaceae) em roedores
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como
parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Recursos Naturais do
Semiárido, para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais do
Semiárido.
Orientador: Prof. Dr. Julianeli Tolentino de
Lima
Co-orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto
Guedes da Silva Almeida
PETROLINA
2014
Gomes, Leandra Macedo de Araújo
G633e
Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus quercifolius Pohl
(EUPHORBIACEAE) em roedores/Leandra Macedo de Araújo Gomes. – Petrolina,
2014.
184f.
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) - Universidade
Federal do Vale do São Francisco, Petrolina, 2014.
Orientador: Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima.
1. Plantas da Caatinga – Medicina popular. 2. Plantas medicinais – Usos e
costumes. 3. Euphorbiaceae - Atividade anti-inflamatória. I. Título. II. Universidade
Federal do Vale do São Francisco.
CDD 615.537
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas
SIBI/UNIVASF
Bibliotecário: Lucídio Lopes de Alencar
Dedico este trabalho aos meus pais
Orlandino Macedo Gomes e Marinalva
Macedo de Araújo, ao meu irmão José
Gustavo Macedo de Araújo Gomes,
meus avós, familiares e amigos que
acreditaram na minha vontade de vencer
e me apoiaram em todos os momentos,
sempre cheios de amor para me ofertar.
AGRADECIMENTOS
Externalizar os sentimentos e transformá-los em palavras, não é
uma tarefa fácil, e durante esses dois longos anos de realização do mestrado
serei eternamente grata a todos aqueles que passaram por minha vida e
deixaram um pouquinho de si. Talvez faltem palavras para expressar o quanto
sou grata a cada um que cruzou o meu caminho e que de alguma forma
contribuiu para o meu crescimento pessoal e profissional.
Ao meu orientador Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima ao qual
tenho respeito e admiração pelo seu caráter e honestidade, eu agradeço por
todo o acolhimento e todas as oportunidades geradas.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva
Almeida pelo qual tenho imenso carinho e afeição, agradeço de todo coração
por ter-me “adotado” e acreditado nos meus sonhos. Obrigada por ser esse
“grande homem” que acolhe, se esforça e se dedica tanto aos seus alunos,
merecendo todo o nosso respeito e admiração.
Ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do
Semiárido, e a todos os professores inseridos no programa, por todo
conhecimento que foi compartilhado, contribuindo significativamente na minha
formação.
A todos os integrantes da equipe do Núcleo de Estudos e Pesquisas
de Plantas Medicinais – NEPLAME.
Aos meus anjos enviados por Deus para me ajudar a realizar meus
experimentos: Viviane Barreto, Thayne Andrade, Sarah Raquel, Tâmara
Diniz, Juliane Cabral, Fernanda Granja, Suzana Rabêlo, Jamile Maiara e
Noádya Rebeca, Igor Menezes, Rafael Libório, Alessandra Marques.
A professora Dra Maria Helena Tavares de Matos e a aluna Jamile
Maiara pela confecção e coloração das lâminas, e por todo apoio e motivação
durante esse período.
A professora Dra Rosemairy L. Mendes e a sua fantástica equipe
de alunos: Érica M. Lavor, Mariana Gama, Osmar Galvão e Tales.
A grande família UNIVASF os meus agradecimentos a essa
instituição que foi a minha segunda casa durante seis anos (quatro de
graduação e dois de mestrado) influenciando significativamente na formação
do meu caráter ético e profissional.
A toda equipe do Biotério por toda ajuda nas horas de aflição, por
toda paciência e por todos os bons momentos vividos: Leonardo Neves, Euda
Freire, Helenildo Senna e Jean Gomes.
A todos os vigilantes da universidade, por toda a ajuda,
compromisso e segurança transmitidos.
A todos os funcionários terceirizados da UNIVASF pela paciência e
disposição para ajudar, em especial, Geralda Coelho, Francisca e Neide.
Aos Técnicos dos laboratórios da UNIVASF: Ana Paula, Amanda,
Sílvio Alan, Fernando, Amanda Leal, Geisa Lopes e Alberto.
A minha querida turma de mestrando 2012.1, em especial aos
colegas: Igor Menezes, Martapoliana, Anne, Suzana Rabêlo, Larissa
Macêdo, Rafael Libório e Eliatânia, por todo o companheirismo.
Aos funcionários da EMBRAPA Dr. Viseldo Ribeiro de Oliveira
pela coleta e identificação da espécie e ao Sr. João Macedo pela pulverização
das cascas da espécie do presente estudo.
À Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado.
Ao grande criador da vida Deus, sem a presença dele em minha
vida eu nada seria. Obrigada Senhor por me permitir viver cada momento que
vivi durante o mestrado, obrigada por seu amor infinito por mim, por me guiar e
me conduzir para o melhor caminho, por tudo sou grata a ti!
Aos meus pais amados Orlandino Macedo Gomes e Marinalva
Macedo de Araújo por todo o amor, carinho e dignidade a mim ofertados.
Tenho muito orgulho de ser filha de pais humildes e que não tiveram
oportunidades de estudar na vida, mas que fizeram e fazem todos os sacríficos
possíveis para que eu possa estudar. E ao meu irmão José Gustavo Macedo
de A. Gomes por todo o apoio e força que me foi dada durante esse percurso.
À minha doce e amada Aline Braga pela sua amizade!
E todos os meus familiares e amigos, não irei citar nomes para não
correr o risco de esquecer alguém. Sou uma pessoa abençoada e de muita
sorte, pois tenho os melhores amigos e a melhor família.
Á todos vocês muito obrigada!!
Consagre ao Senhor tudo o que você faz, e
os seus planos serão bem-sucedidos.
Provérbios 16:3
RESUMO
A espécie Cnidoscolus quercifolius (faveleira) é uma planta pertencente ao
bioma Caatinga, sendo utilizada popularmente no combate a inflamações em
geral. O presente trabalho avaliou o efeito antinociceptivo e anti-inflamatório do
extrato etanólico bruto das cascas (Cqc-EtOH) e das folhas (Cqf-EtOH) de
C. quercifolius, bem como realizou o estudo toxicológico dos extratos. A
atividade antinociceptiva foi investigada através dos testes de contorções
abdominais induzidas por ácido acético, teste da formalina e o teste da placa
quente. A avaliação da atividade anti-inflamatória foi realizada utilizando-se
dois modelos experimentais: peritonite e edema de pata, ambos induzidos por
carragenina. O estudo toxicológico dos extratos foi realizado através do estudo
de
toxicidade
aguda.
Os
resultados
obtidos
através
da
avaliação
antinociceptiva demonstram que os extratos possuem efeito antinociceptivo
marcante. Cqc-EtOH e Cqc-EtOH reduziram significativamente a nocicepção
dos animais no teste das contorções abdominais e o tempo da lambida da pata
no teste da formalina, bem como aumentaram o tempo em que os animais
permaneceram na placa quente. Os extratos Cqc-EtOH e Cqf-EtOH
apresentaram também marcante atividade anti-inflamatória. Nos resultados da
toxicidade aguda nenhuma alteração significativa foi observada nos animais
que receberam os extratos nas doses de 2,0 e 5,0 g/kg pelas vias
intraperitoneal e oral, respectivamente. Conclui-se que Cnidoscolus quercifolius
possui atividades antinociceptiva e anti-inflamatória, corroborando com o uso
na medicina popular. Além disso, os estudos de toxicidade demostram
nenhuma toxicidade, demonstrando que há segurança no uso dos extratos,
contribuindo assim, para o desenvolvimento de pesquisas farmacológicas e
toxicológicas futuras com a espécie.
Palavras-chave:
Atividade
anti-inflamatória;
Atividade
Cnidoscolus quercifolius; Euphorbiaceae; Toxicidade aguda.
antinociceptiva;
ABSTRACT
The species Cnidoscolus quercifolius (faveleira) is a plant from the Caatinga
biome, commonly used to combat inflammation. This study evaluated the
antinociceptive and anti-inflammatory effect of the crude ethanol extract from
barks (Cqb - EtOH) and leaves (Cql - EtOH) of C. quercifolius and performed
the toxicological study of the extracts. The antinociceptive activity was
investigated through the induced writhing acetic acid, formalin test and hot plate
test. The evaluation of the anti-inflammatory activity was performed using two
experimental models: peritonitis and paw edema, both induced by carageenan.
The toxicological study for the extracts was performed using the acute toxicity
study. The results obtained by the evaluation of antinociceptive activity
demonstrate that the extracts have a marked antinociceptive effect. Cqb-EtOH
and Cql-EtOH extracts significantly reduced nociceptive activity on the animals
tested for the writhing and the time of paw licking in the formalin test and
increased the time that the animals remained on the hot plate. The Cqb-EtOH
and Cql-EtOH extracts also showed marked anti-inflammatory activity. The
results of the acute toxicity showed no significant changes in the animals that
received the extracts at doses of 2.0 and 5.0 g/kg by intraperitoneal and oral
routes respectively. It’s possible to conclude that Cnidoscolus quercifolius has
antinociceptive and anti-inflammatory activities, corroborating the use in folk
medicine. In addition, toxicity studies demonstrate no toxicity, indicating security
in the use of the extracts, contributing to the development of pharmacological
and toxicological studies to further species.
Palavras-chave: Anti-inflamatory activity; Antinociceptive activity; Cnidoscolus
quercifolius; Euphorbiaceae; Acute toxicity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotografia de Cnidoscolus quercifolius..................................................34
Figura 2 - Distribuição fitogeográfica de Cnidoscolus quercifolius.........................35
Figura 3 - Desenho esquemático de um nociceptor..............................................38
Figura 4 - Representação das terminações nervosas livres, Fibras Aβ, Aδ e C...39
Figura 5 – Fotografia da exsicata de Cnidoscolus quercifolius..............................56
Figura 6 - Camundongo observado no teste de contorções abdominais...............61
Figura 7 - Camundongo observado no teste da formalina.....................................62
Figura 8 - Camundongo observado no teste da placa quente...............................63
Figura 9 - Camundongos observados no teste do Rota-Rod.................................64
Figura 10 - Volume da pata mensurado utilizando o aparelho pletismômetro no
modelo do edema de pata induzido por carragenina............................................66
Figura 11 - Efeito antinociceptivo do Cqc-EtOH, da indometacina e da morfina, no
teste
das
contorções
abdominais
induzidas
por
ácido
acético
em
camundongos.........................................................................................................72
Figura 12 - Efeito antinociceptivo do Cqc-EtOH, da indometacina e da morfina na
primeira
e
segunda
fase
do
teste
da
formalina
em
camundongos.........................................................................................................74
Figura 13 - Efeito antinociceptivo do Cqc-EtOH no teste da placa quente em
camundongos.........................................................................................................75
Figura 14 - Efeito sobre a coordenação motora do Cqc-EtOH e do diazepam no
teste de Rota-Rod em camundongos....................................................................76
Figura 15 - Efeito do Cqc-EtOH e da dexametasona sobre a migração leucitária
na
cavidade
peritoneal
após
a
administração
de
carragenina
em
camundongos.........................................................................................................77
Figura 16 - Efeito anti-inflamatório do Cqc-EtOH e da indometacina, no edema de
pata induzida por carragenina em camundongos..................................................78
Figura 17 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Cqc-EtOH.........80
Figura 18 - Consumo de água pelos animais tratados com Cqc-EtOH.................80
Figura 19 - Variação de peso dos animais tratados com Cqc-EtOH.....................81
Figura 20 - Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais tratados
com Cqc-EtOH.......................................................................................................87
Figura 21 - Fotomicrografias de cortes histológicos do pâncreas de animais
tratados com Cqc-EtOH.........................................................................................88
Figura 22 - Fotomicrografias de cortes histológicos dos rins de animais tratados
com Cqc-EtOH.......................................................................................................89
Figura 23 - Efeito antinociceptivo do Cqf-EtOH, da indometacina e da morfina, no
teste
das
contorções
abdominais
induzidas
por
ácido
acético
em
camundongos.........................................................................................................90
Figura 24 - Efeito antinociceptivo do Cqf-EtOH, da indometacina e da morfina na
primeira
e
segunda
fase
do
teste
da
formalina
em
camundongos.........................................................................................................92
Figura 25 - Efeito antinociceptivo do Cqf-EtOH no teste da placa quente em
camundongos.........................................................................................................93
Figura 26 - Efeito sobre a coordenação motora do Cqf-EtOH e do diazepam no
teste de Rota-Rod em camundongos....................................................................94
Figura 27 - Efeito do Cqf-EtOH e da dexametasona sobre a migração leucitária na
cavidade
peritoneal
após
a
administração
de
carragenina
em
camundongos.........................................................................................................95
Figura 28 - Efeito anti-inflamatório do Cqf-EtOH e da indometacina, no edema de
pata induzida por carragenina em camundongos..................................................96
Figura 29 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Cqf-EtOH...........98
Figura 30 - Consumo de água pelos animais tratados com Cqf-EtOH..................98
Figura 31 - Variação de peso dos animais tratados com Cqf-EtOH......................99
Figura 32 - Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais tratados
com Cqf-EtOH.....................................................................................................105
Figura 33 - Fotomicrografias de cortes histológicos do pâncreas de animais
tratados com Cqf-EtOH.......................................................................................106
Figura 34 - Fotomicrografias de cortes histológicos dos rins de animais tratados
com Cqf-EtOH.....................................................................................................107
LISTA DE QUADRO E TABELAS
Quadro 1 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os
principais
metabólitos
secundários
da
espécie
Cnidoscolus
quercifolius
(Euphorbiaceae).....................................................................................................59
Tabela 1 - Identificação das principais classes de constituintes químicos presentes
no extrato etanólico bruto das cascas e folhas de Cnidoscolus quercifolius
................................................................................................................................71
Tabela 2 - Parâmetros hematológicos de camundongos tratados com extrato
etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius........................................82
Tabela 3 - Parâmetros bioquímicos de camundongos tratados com extrato
etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius........................................84
Tabela 4 - Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto
das cascas de Cnidoscolus quercifolius.................................................................85
Tabela 5 - Parâmetros hematológicos de camundongos tratados com extrato
etanólico bruto das folhas de Cnidoscolus quercifolius........................................100
Tabela 6 - Parâmetros bioquímicos de camundongos tratados com extrato
etanólico bruto das folhas de Cnidoscolus quercifolius........................................102
Tabela 7 - Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto
das folhas de Cnidoscolus quercifolius ................................................................103
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aα
Fibras nervosas mielinizadas do tipo A-alfa
Aβ
Fibras nervosas mielinizadas do tipo A-beta
Aδ
Fibras nervosas mielinizadas do tipo A-delta
AA
Ácido araquidônico
AAS
Ácido acetilsalicílico
ACTH
Corticotropina
AINES
Anti-inflamatórios não esteroides
ALT
Alanina aminotrasnferase
AMPc
Monofosfato de 3,5 - adenosina cíclico
ANOVA
Análise de variância
AST
Aspartato aminotransferase
ATP
1,4,5- Trifosfato de Adenosina
CD31
Cluster of Differentiation 31
CEUA
Comissão de Ética no Uso de Animais
CHCM
Concentração de hemoglobina corpuscular média
CGRP
Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
Cqc-EtOH
Extrato etanólico das cascas de Cnidoscolus quercifolius
Cqf-EtOH
Extrato etanólico das folhas de Cnidoscolus quercifolius
COX
Cicloxigenase
CT
Corticosteróides
EDTA
Ácido etileno diamino tetra-acético
FDA
Food and Drug Administration
GC
Glicocorticoides
HCM
Hemoglobina corpuscular média
HVASF
Herbário Vale do São Francisco
IASP
International Association for the Study of Pain
ICAM
Intercellular Adhesion Molecules
IFNʏ
Interferon Gama
IL
Interleucina
IL-1β
Interleucina-1 beta
IL-6
Interleucina-6
IKK
Proteína quinase do IkB
IkB
Proteína inibidora do NFkB
iNOS
Sintase de Óxido Nítrico Induzível
JAM-3
Molécula de adesão juncional-3
LOX
Lipoxigenase
OMS
Organização Mundial da Saúde
NFkB
Fator nuclear kappa B
NMDA
N-metil-D-aspartato
NO
Óxido nítrico
PAF
Fator de agregação plaquetária
PG
Prostaglandina
PGE2
Prostaglandina E2
PGF2α
Prostaglandina F2 alfa
PGI2
Prostaciclina
PKA
Proteína cinase A
PKC
Proteína cinase C
PLA2
Fosfolipase A2
PNPIC
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
QPN
Química de Produtos Naturais
RGC
Receptor Guanylate Cyclase
SG
Substância Gelatinosa
SNC
Sistema Nervoso Central
SUS
Sistema Único de Saúde
TGO
Transaminase glutâmico oxalacética
TGP
Transaminase glutâmico pirúvica
TGFβ
Fator transformador do crescimento beta
TNF
Fator de necrose tumoral
TNF-α
Fator de necrose tumoral-α
TRVP-1
Transient Receptor Potential cation channel, subfamily V, member
1
TXA2
Tromboxano
UNIVASF
Universidade Federal do Vale do São Francisco
VCAM-1
Moléculas de Adesão Vascular
VCM
Volume corpuscular médio
VR
Vanilloid Receptor
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO.................................................................................
23
2.
OBJETIVOS....................................................................................
26
2.1.
Objetivo geral...................................................................................
27
2.2.
Objetivos específicos.......................................................................
27
3.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................
28
3.1.
Produtos naturais.............................................................................
29
3.2.
O bioma Caatinga............................................................................
31
3.3.
Considerações sobre a família Euphorbiaceae...............................
32
3.4.
Considerações sobre o gênero Cnidoscolus...................................
33
3.5.
Considerações sobre a espécie Cnidoscolus quercifolius Pohl.......
34
3.6.
Considerações sobre a dor .............................................................
36
3.6.1.
Dor e nocicepção.............................................................................
36
3.6.2.
Nociceptores....................................................................................
37
3.6.3.
Fibras e vias nociceptivas................................................................
38
3.6.4.
Mecanismo da dor central................................................................
40
3.6.5.
Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória.................................
41
3.6.6.
Drogas analgésicas.........................................................................
41
3. 7.
Modelos
experimentais
para
avaliação
da
atividade
antinociceptiva.................................................................................
43
3.7.1.
Contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................
43
3.7.2.
Teste da formalina...........................................................................
44
3.7.3.
Teste da placa quente.....................................................................
44
3. 8.
Considerações sobre inflamação.................................................
45
3.8.1
Eventos vasculares..........................................................................
46
3.8.2
Eventos celulares............................................. ……………….…….
47
3.8.3
Mediadores químicos ………………………………………………….
48
3.9.
Drogas anti-inflamatórias.................................................................
49
3.9.1.
Anti-inflamatórios não esteroides....................................................
49
3.9.2.
Anti-inflamatórios esteroides...........................................................
50
3.10.
Modelos experimentais....................................................................
52
3.10.1.
Edema de pata induzido por carragenina........................................
52
3.10.2.
Edema de orelha induzido por óleo de cróton.................................
53
3.10.3.
Peritonite induzida por carragenina.................................................
54
4.
PARTE EXPERIMENTAL ...............................................................
55
4.1.
Material vegetal................................................................................
56
4.1.1.
Coleta de Cnidoscolus quercifolius Pohl..........................................
56
4.2.
Obtenção do extrato etanólico bruto das cascas e folhas de
Cnidoscolus quercifolius Pohl..........................................................
4.3.
57
Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos das
cascas e folhas de Cnidoscolus quercifolius Pohl...........................
57
4.4.
Animais............................................................................................
60
4.5.
Testes de atividade antinociceptiva.................................................
60
4.5.1.
Teste
das
contorções
abdominais
induzidas
por
ácido
acético..............................................................................................
60
4.5.2.
Teste da formalina........................................................................
61
4.5.3.
63
4.6.
Teste de coordenação motora.........................................................
64
4.6.1.
Teste do rota-rod...........................................................................
64
4.7.
Testes de atividade anti-inflamatória...............................................
65
4.7.1.
Migração de leucócitos na cavidade peritoneal...............................
65
4.7.2.
Edema de pata induzido por carragenina........................................
65
4.8.
Toxicidade aguda.............................................................................
67
4.8.1.
Análise comportamental..................................................................
67
4.8.2.
Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos....................
67
4.8.3.
Análise histopatológica dos órgãos..................................................
68
4.9.
Análise estatística............................................................................
69
5.
RESULTADOS................................................................................
70
5.1.
Triagem fitoquímica.........................................................................
71
5.2.
Resultados da atividade farmacológica do extrato das cascas de
Cnidoscolus quercifolius..................................................................
5.2.1
72
Atividade antinociceptiva do extrato das cascas de Cnidoscolus
quercifolius.......................................................................................
72
5.2.1.1
Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético.......
72
5.2.1.2
73
5.2.1.3
75
5.2.2.
Avaliação da coordenação motora do extrato das cascas de
76
5.2.2.1
Teste do rota-rod...........................................................................
76
5.2.3.
Atividade
anti-inflamatória
do
extrato
das
cascas
de Cnidoscolus quercifolius.............................................................
77
5.2.3.1
77
5.2.3.2
Teste do edema de pata induzido por carragenina.........................
78
5.2.4.
Toxicidade
aguda
do
extrato
das
cascas
de Cnidoscolus quercifolius.............................................................
78
5.2.4.1.
Avaliação comportamental dos camundongos................................
79
5.2.4.2.
Consumo de alimento e água..........................................................
79
5.2.4.3.
Variação do peso corporal...............................................................
80
5.2.4.4
Parâmetros hematológicos..............................................................
81
5.2.4.5.
Parâmetros bioquímicos..................................................................
83
5.2.4.6.
Peso dos órgãos..............................................................................
85
5.2.4.7.
Análise macroscópica e histológica................................................
86
5.3.
Resultados da atividade farmacológica do extrato das folhas de
5.3.1.
90
Atividade antinociceptiva do extrato das folhas de Cnidoscolus
quercifolius.......................................................................................
90
5.3.1.1
Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético.......
90
5.3.1.2
91
5.3.1.3
93
5.3.2.
Avaliação da coordenação motora do extrato das folhas de
94
5.3.2.1
Teste do rota-rod...........................................................................
94
5.3.3.
Atividade
anti-inflamatória
do
extrato
das
folhas
de
95
5.3.3.1
95
5.3.3.2
Teste do edema de pata induzido por carragenina.........................
96
5.3.4.
Toxicidade
aguda
do
extrato
das
folhas
de
96
5.3.4.1.
Avaliação comportamental dos camundongos................................
97
5.3.4.2
Consumo de alimento e água..........................................................
97
5.3.4.3.
Variação do peso corporal...............................................................
98
5.3.4.4.
Parâmetros hematológicos..............................................................
99
5.3.4.5.
Parâmetros bioquímicos..................................................................
101
5.3.4.6.
Peso dos órgãos..............................................................................
103
5.3.4.7.
Análise macroscópica e histológica.................................................
104
6.
DISCUSSÃO....................................................................................
108
7.
CONCLUSÕES................................................................................
116
REFERÊNCIAS...............................................................................
118
APÊNDICES....................................................................................
133
ANEXOS..........................................................................................
182
1. INTRODUÇÃO
GOMES, L.M.A. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus
quercifolius Pohl (Euphorbiaceae) em roedores.
1. INTRODUÇÃO
A ingestão de plantas para o alívio e a cura das doenças foi uma das
primeiras formas de utilização dos produtos naturais pela humanidade
(VIEGAS-JÚNIOR et al., 2006). Assim, as plantas medicinais têm sido
utilizadas ao longo do tempo, sendo vários os procedimentos clínicos
registrados com as mesmas. Embora a medicina alopática tenha obtido um
grande avanço a partir da segunda metade do século XX, ainda existem alguns
entraves
na
sua
utilização
pelas
populações
menos
favorecidas
economicamente. Dessa maneira, o uso de plantas medicinais se destacou
entre as populações carentes dos países em desenvolvimento, devido a sua
fácil obtenção e a grande tradição do uso de plantas medicinais (VEIGAJÚNIOR et al., 2005).
O
Brasil
se
destaca
abrigando
aproximadamente
14%
da
diversidade de plantas do mundo, sendo considerado o país com a maior
diversidade biológica do planeta (PEIXOTO; AMORIM, 2003). Nesse sentido, a
biodiversidade brasileira é considerada uma importante fonte para a descoberta
de novos fármacos e/ou fitofármacos, contribuindo assim, para o avanço das
pesquisas multidisciplinares e para o desenvolvimento tecnológico nacional,
ressaltando que a diversidade dos biomas brasileiros é ainda muito pouco
explorada como uma fonte de substâncias de interesse farmacológico
(BARREIRO; BOLZANI, 2009).
Dentre os biomas brasileiros, destaca-se a Caatinga, por se
encontrar na lista dos biomas que mais sofreram com a interferência humana e
é um dos menos estudados no Brasil (CASTELLETTI et al., 2003). A espécie
selecionada para este estudo foi Cnidoscolus quercifolius, conhecida
popularmente como “faveleira”, uma das plantas pertencentes ao bioma
Caatinga, que se destaca pela sua extraordinária resistência à seca. Esta
espécie apresenta grande importância para o desenvolvimento da região
semiárida em virtude de sua alta disseminação e completa adaptação às
condições adversas dessa região. É popularmente utilizada para recuperar
áreas degradadas, para a alimentação animal e humana, para a medicina
24
popular, para serrarias como fonte de energia e para diversos outros usos
(NETO et al., 2009).
Em relação ao uso na medicina popular, Cnidoscolus quercifolius é
usada para combater a inflamação (LORENZI; MATOS, 1998). O processo
inflamatório consiste na resposta orgânica mais precoce diante de lesão
tissular ou infecção. Perante um trauma tissular, ocorre o acúmulo local de
prostaglandinas, tromboxanos e outros mediadores químicos que ocasionam
uma alteração no limiar de nociceptores, com consequente hiperalgia. A dor é
uma modalidade sensorial que em muitos casos representa o único sintoma
para o diagnóstico de várias doenças. Ela tem muitas vezes uma função
protetora (ALMEIDA et al., 2001; KUMMER; COELHO, 2002).
Em levantamento bibliográfico realizado nos principais bancos de
dados sobre estudos com plantas medicinais, não foram encontrados registros
de estudos com essa espécie e sua ação antinociceptiva e anti-inflamatória.
Nesse sentindo, é de suma importância a realização do presente estudo no
intuito de avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatórios da espécie.
Assim, a presente pesquisa buscou realizar a avaliação da atividade
antinociceptiva e anti-inflamatória do extrato etanólico bruto da espécie
Cnidoscolus quercifolius, bem como o estudo de sua toxicidade, no intuito de
assegurar sua utilização e servir de parâmetros para o desenvolvimento de
futuros medicamentos fitoterápicos.
25
2. OBJETIVOS
26
2. OBJETIVOS
2.1. Geral

Contribuir para o estudo farmacológico de espécies de família
Euphorbiaceae nativas da Caatinga, através da avaliação da atividade
antinociceptiva e anti-inflamatória de Cnidoscolus quercifolius Pohl em
camundongos.
2.2. Específicos

Realizar a triagem fitoquímica para a identificação das principais classes
de constituintes químicos presentes nos extratos;

Avaliar o potencial antinociceptivo do extrato etanólico bruto das cascas
e folhas da espécie Cnidoscolus quercifolius Pohl;

Avaliar o potencial anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das cascas
e folhas da espécie Cnidoscolus quercifolius Pohl;

Investigar os possíveis mecanismos de ação envolvidos nos extratos e a
participação dos sistemas de neurotransmissão;

Avaliar o perfil de segurança, através do estudo da toxicidade aguda, do
extrato etanólico bruto das cascas e folhas da espécie.
27
3. FUNDAMENTAÇÃO
TEÓRICA
28
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Produtos naturais
O uso dos produtos naturais pela humanidade transcorre desde
tempos imemoriais. Assim, uma das primeiras formas de utilização dos
produtos naturais para o alívio e a cura de doenças, foi pela ingestão de ervas
e folhas. Nas civilizações Oriental e Ocidental, no desenvolvimento de suas
histórias, utilizaram os recursos naturais na medicina e no controle de pragas.
Já na medicina tradicional chinesa, até hoje muitas espécies e preparados
vegetais medicinais são estudados na busca pelo entendimento de seu
mecanismo de ação e no isolamento dos princípios ativos (VIEGAS-JUNIOR
et al., 2006).
O termo "produtos naturais" usualmente está associado com a
produção de metabólitos secundários produzidos por um organismo, que na
maioria dos casos funciona como mecanismo de defesa contra herbívoros,
microorganismos, insetos e plantas competidoras. Uma variedade de produtos
naturais, originados principalmente a partir das plantas, contêm vários
componentes ativos e são usados por milhares de anos pela população em
diversos países e regiões do mundo (MAJEED et al., 2012).
Estima-se que 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica
atual foram desenvolvidos de fontes naturais, desses, 25% são provenientes de
plantas, 13% de microrganismos e 3% de animais. Somente no período entre
1983-1994, aproximadamente 39% dos fármacos aprovados pela agência
americana
de
controle
de
medicamentos
e
alimentos
(FDA),
foram
desenvolvidos a partir de produtos naturais. Além disso, um terço dos
medicamentos mais prescritos e vendidos no mundo foi desenvolvido a partir
de produtos naturais (CRAGG et al., 1997).
Nesse sentindo, os produtos naturais têm servido como importante
fonte de medicamentos durantes séculos, e cerca de metade dos produtos
farmacêuticos, como os fármacos, em uso hoje são derivados dos produtos
naturais (ZHANG et al., 2013). Assim, a terapêutica moderna, baseada no uso
29
de medicamentos com ações específicas sobre receptores, enzimas e canais
iônicos, não teria sido possível sem a contribuição dos produtos naturais
(CALIXTO, 2003).
Em meio aos diversos reinos da natureza, o reino vegetal é o que
tem contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos
secundários, a grande maioria destes de grande valor agregado, devido às
suas aplicações em medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos
(PHILLIPSON; ANDERSON, 1989).
Assim, as plantas além do seu uso na medicina popular, têm
contribuído ao longo dos anos para a obtenção de vários fármacos, até hoje
amplamente utilizados na clínica (FARNSWORTH, 1980). Um exemplo
relevante a ser considerado é a morfina (analgésico de ação no sistema
nervoso central) e a codeína (antitussígeno), ambas são produtos obtidos a
partir do ópio da Papaver somniferum (SIMÕES; PETROVICK, 2010).
Os metabólitos secundários produzidos pelas plantas têm a função
de modular seus próprios metabolismos, possuindo uma constituição complexa
e, consequentemente, também podem alcançar alvos terapêuticos de doenças
humanas. Assim, a grande maioria dos princípios ativos de relevância
farmacológica encontradas nos extratos vegetais é proveniente dos metabólitos
secundários (FERREIRA; PINTO, 2010).
Nesse sentindo, os produtos naturais são usados como matériaprima na síntese de moléculas complexas de interesse farmacológico. Através
deles os pesquisadores puderam compreender fenômenos complexos
relacionados à biologia celular e molecular e à eletrofisiologia, permitindo que
enzimas, receptores, canais iônicos e outras estruturas biológicas fossem
identificados (SHU, 1998).
Assim, o Brasil por possuir uma riqueza na sua biodiversidade e,
sendo o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não
pode abdicar de sua vocação para os produtos naturais. Assim, a Química de
Produtos Naturais (QPN) é, dentro da Química brasileira, a área mais antiga,
agregando um número elevado de pesquisadores (PINTO et al., 2002).
É importante que o Brasil progrida no uso das plantas medicinais, a
partir de uma campanha de esclarecimento público, incluindo a classe médica,
para mostrar a segurança e eficácia das plantas medicinais de uso tradicional,
30
como uma alternativa terapêutica. É também relevante, que os químicos de
produtos naturais se envolvam com o estudo de plantas medicinais, desde o
trabalho de identificação do princípio ativo ao controle de qualidade dos
produtos oferecidos ao consumidor (FERREIRA; PINTO, 2010).
3.2 O bioma Caatinga
A Caatinga brasileira compreende aproximadamente 750.000 km 2 de
área geográfica e possui uma população de 20 milhões de habitantes, sendo
considerada uma das regiões semiáridas de maior densidade populacional do
mundo. O Bioma tem grande potencial para o desenvolvimento de novas
pesquisas científicas em vários aspectos, tais como fauna, flora, recursos
hídricos e minerais, além dos aspectos ecológicos e climáticos. Isso é
justificado pelo fato de ser uma região altamente habitada e por possuir
inúmeras características próprias e particulares (FREIRE, 2009).
A vegetação da Caatinga ocupa uma área de aproximadamente 7%
do território brasileiro e está presente nos estados da Bahia, Piauí, Ceará, Rio
Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e a porção norte de
Minas Gerais. É importante ressaltar, que a preservação da biodiversidade da
Caatinga é de relevante importância, tanto para o ecossistema como para o
sustento das famílias da região, estas que sofrem com o longo período de
estiagem (BARBOSA et al., 2009).
Nesse sentido, por estarem inseridas em uma região com baixas
precipitações pluviométricas, temperaturas elevadas, solos cristalinos, baixa
umidade e alta incidência solar suas espécies são notavelmente adaptadas
(FREIRE, 2009). A Caatinga pode ser caracterizada por uma vegetação baixa,
composta principalmente por árvores e arbustos adaptados às condições
xerofíticas por meio da microfilia, da caducidade e de espinhos, entre outras
modificações morfológicas típicas desses ambientes (PRADO, 2003).
31
32
3.3 Considerações sobre a família Euphorbiaceae
Dentre as diversas famílias de espécies vegetais da Caatinga
podemos destaca a família Euphorbiaceae. Essa família é constituída por 62
gêneros e 765 espécies, entre os quais 500 são endêmicas (FORZZA et al.,
2010). As plantas desta família possuem folhas simples ou compostas, em
geral possuem laticíferos, em maior ou menor quantidade e na maioria das
vezes, glândulas no pecíolo ou no limbo (SILVA et al., 2012).
No Brasil, a família possui cerca de 70 gêneros e 100 espécies,
sendo mais frequentemente encontrados os seguintes vegetais: Croton
(“sangue-de-dragão”), Manihot ("mandioca"), Joannesia (“ánda-açu” ou “purgade-cavalo”); Jathropha ("pinhão-do-paraguai"); Euphorbia ("coroa-de-cristo”),
Poinsettia (“flor-de-papagaio”) Acalypha (PANTOJA, 2010).
Assim, a família é considerada de grande importância econômica
entre as Angiospermas (SÁTIRO; ROQUE, 2008), reunindo algumas espécies
de interesse econômico, destacando-se a espécie Hevea brasiliensis Müll. Arg.
(seringueira), Manihot esculenta Crantz (mandioca ou cassava), Ricinus
comunis L. (mamona) e Croton cajucara L. (sacaca) (GIULIETTI, 2009). É
relevante destacar ainda, que a família Euphorbiaceae é a segunda família
mais representativa em número de espécies na Caatinga, distribuída em
trópicos e subtrópicos (SANTOS et al., 2005).
É característica desta família, a ocorrência de vários metabólitos
secundários (RANDAU et al., 2002). Uma classe de metabólitos secundários
presentes na família são os diterpernos, os mesmos são considerados o grupo
de substâncias mais característico e complexo da família (SALATINO et al.,
2007).
Dessa forma, as plantas da família Euphorbiaceae são detentoras de
várias atividades biológicas. A espécie Croton urucurana, cujos óleos voláteis
possuem em torno de 83 compostos distintos, apresenta atividades
anticâncerígena,
anti-inflamatória,
antioxidante,
antirreumática
e
antiulcerogênica (SIMIONATTO et al., 2007). Pera glabrata possui atividade
antifúgica, devido às altas taxas de cafeína, além de ser também utilizada no
tratamento para a perda da memória decorrente da doença de Alzheimer
(CARDOSO-LOPES et al., 2009). Dentre os diversos gêneros pertecencentes a
essa família, podemos destacar o Cnidoscolus, relatado no tópico a seguir.
3.4 Considerações sobre o gênero Cnidoscolus
O gênero Cnidoscolus Pohl compreende cerca de 50-75 espécies,
distribuídas
excepcionalmente
na
América
tropical
e
concentradas,
principalmente, no México e Nordeste do Brasil (WEBSTER, 1994). É um
gênero bem representado no Brasil (aproximadamente 18 espécies),
especialmente na região Nordeste (com cerca de 10 espécies), sendo esta
região um dos prováveis centros de diversidade de Cnidoscolus (MACBRIDE,
1951).
Uma das características das espécies pertencentes ao gênero
Cnidoscolus é a presença de tricomas urticantes (Cnidoscolus, do grego:
knide = urtiga, skolos = ponta), que se concentram em quase todas as suas
partes vegetativas e florais. A característica distinta deste gênero é a presença
de tricomas urticantes que, quando estimulada pelo contato com a pele, pode
causar dor intensa e localizada (MELO; SALES, 2008).
Na Caatinga, o gênero Cnidoscolus se faz presente, através de
quatro espécies utilizadas na medicina popular: C. infestus Pax & K.,
Hoffm.; C. pubescens Pohl, C. quercifolius Pohl e C. urens L. Arthur. Essas
espécies possuem diversas propriedades medicinais, dentre elas, atividade
antitumoral, anti-inflamatória para o sistema genito-urinário, antisséptica e no
tratamento de infecções renais, dermatológicas e lesões oftalmológicas,
contusões, fraturas, feridas, verrugas, disenteria, hemorragia, apendicite e
reumatismo (AGRA et al., 2008). Outro fato relevante, é que várias espécies do
gênero Cnidoscolus possuem atividade antioxidante, dentre elas, as raízes de
C. infestus e as folhas de C. pubescens (SOBRINHO et al., 2011).
Existem relatos na literatura da presença de alcaloides no gênero
Cnidoscolus (AWOYINKA et al., 2007; YAKUBU et al., 2008). Outros
metabólitos também foram encontrados no gênero, tais como: as cumarinas, os
terpenoides, as xantinas e as antocianinas (TAVARES; AMORIM, 2010). Foram
33
identificados e isolados três novos terpenoides das cascas da espécie
C. quercifolius, que foram denominados: um bis-nor-diterpeno, filacantona e
dois triterpenos 3β-O-cinamoil-lupeol e 3β-O-dihidrocinamoil-lupeol (LEMOS et
al., 1991).
3.5 Considerações sobre a espécie Cnidoscolus quercifolius Pohl
Pertencente à família Euphorbiaceae, Cnidoscolus quercifolius Pohl
(Figura 1) está presente nos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte,
Paraíba, Pernambuco, Bahia e dentre outros (DUQUE, 2004). A espécie é
conhecida popularmente como faveleira, sendo uma árvore de porte pequeno e
muito conhecida por possuir tricomas urticantes distribuídos por toda a planta
(MAIA-SILVA et al., 2012).
Figura 1. Fotografia de Cnidoscolus quercifolius Pohl.
Esta espécie é uma planta oleaginosa, xerófila, decídua, heliófila e
pioneira, que atinge de 4 a 8 m de altura, dotada de copa alongada ou
arrendondada e rala, possuindo um tronco curto e ramificado desde a base,
mais ou menos cilíndrico, com casca fina, lenticelada e quase lisa, de 20 a
35 cm de diâmetro. Na medicina popular do Nordeste, a decocção, a infusão e
34
maceração das cascas e entrecascas do caule são empregadas contra
inflamações ovarianas e inflamações gerais (LORENZI; MATOS, 1998).
A faveleira destaca-se por sua grande capacidade de tolerância à
seca. Suas raízes são tuberosas e armazenam nutrientes, utilizados durante a
estação seca, período em que ocorre a floração e a frutificação dessa espécie.
Suas inflorescências são compostas por flores pequenas e brancas (MAIASILVA et al., 2012). Essa espécie é utilizada na medicina popular para
combater a inflamação (LORENZI; MATOS, 1998).
RR
AP
MA
PI
AM
CE
PA
RN
PB
PE
AL
TO
SE
MT
AC
BA
RO
MS
ES
PR
RS
RJ
MG
SC
Figura 2. Distribuição fitogeográfica de Cnidoscolus quercifolius Pohl
(Disponível em: http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2013).
35
36
3.6 Considerações sobre a dor
3.6.1 Dor e nocicepção
A palavra “dor” na língua portuguesa é derivada do latim “dolore” e
significa sofrimento; na língua inglesa “pain”, do grego: poiné, pena. Há uma
distinção entre os termos dor e nocicepção feita pelos fisiologistas, onde a
nocicepção se refere aos sinais que chegam ao sistema nervoso central
resultante da ativação dos receptores sensoriais especializados, denominados
nociceptores, que fornecem informações sobre a lesão tecidual ocasionada por
estímulos nocivos, daí a origem da nomenclatura. Diferentemente, “a dor é uma
experiência
emocional
desagradável,
que
geralmente
acompanha
a
nocicepção” (FEIN, 2011).
A definição de dor descrita pela Associação Internacional para o
Estudo da Dor (IASP) como uma “experiência emocional, com sensação
desagradável, associada à lesão tecidual presente, potencial ou descrita como
tal” (LAPA et al., 2003). No Brasil, estima-se que cerca de 50 milhões de
pessoas padeçam de algum tipo de dor (FORNI et al., 2012).
Quando o sujeito experimental não pode definir verbalmente a
resposta de dor, como no caso dos animais, torna-se preferível a utilização do
termo “Resposta Nociceptiva” por englobar as respostas comportamentais e
neurofisiológicas da dor, dissociando-as do caráter cognitivo-afetivo da
resposta. Dessa forma, apesar dos animais não apresentarem a capacidade de
comunicar verbalmente a ocorrência da dor, quando são submetidos a um
estímulo nociceptivo, eles exibem respostas comportamentais, motoras e
fisiológicas semelhantes às observadas em humanos (LAPA et al., 2003).
O sistema sensorial, que engloba visão, olfato, tato, audição e
gustação, tem a função de informar o cérebro sobre os ambientes externo e
interno do corpo. A dor, por ser considerada uma percepção sensorial, constitui
um sistema de alarme, para proteção do organismo de uma eventual lesão
tecidual, por meio da ativação de mecanismos que envolvem vias reflexas
periféricas, espinhais e supraespinhais (CARLINI; MENDES, 2011).
3.6.2 Nociceptores
Os nociceptores são terminações neuronais livres dos neurônios de
primeira ordem, cuja função é preservar a homeostasia tecidual, assinalando
uma injúria potencial ou real (KLAUMANN et al., 2008). A função básica dos
nociceptores é de transmitir informações aos neurônios de ordem superior
sobre a lesão tecidual ocasionada por estímulos térmicos, mecânicos ou
químicos que provocam lesão tecidual, resultando em sensação de dor.
Existem várias possibilidades para explicar como estes diferentes estímulos
resultariam na sensação de dor, dentre elas, a de que os nociceptores
individuais são sensíveis a todos esses estímulos diferentes e a outra é que
existem vários tipos de nociceptores, e cada um é sensível a um estímulo
específico (FEIN, 2011).
Os nociceptores estão descritos em quatro classes: os mecânicos,
térmicos, polimodais e silenciosos. Os nociceptores mecânicos respondem a
pressão intensa; os nociceptores térmicos respondem a temperaturas
extremas, quentes (> 45 °C) ou frias (< 5 °C) e possuem fibras A mielinizadas,
em
conjunto
esses
nociceptores
de
fibra
A
δ-β
são
denominados
mecanotérmicos. Os nociceptores polimodais respondem aos estímulos
nocivos mecânicos, térmicos ou químicos. Os nociceptores silenciosos são
ativados por estímulos químicos, mediadores inflamatórios, e respondem a
estímulos mecânicos e térmicos somente depois de serem ativados (FEIN,
2011).
37
Figura 3. Desenho esquemático do nociceptor (FEIN, 2011, Disponível em:
http://www.dol.inf.br/nociceptores).
3.6.3 Fibras e vias nociceptivas
Os nociceptores (Figura 4) são responsáveis por transmitir o sinal
nociceptivo da periferia para os neurônios secundários que estão localizados
no corno dorsal da medula, estes que transmitem as informações para os
centros integrativos do Sistema Nervoso Central (SNC) através de vias
ascendentes da medula espinhal. As fibras são divididas em três categorias: a
primeira são as fibras sensoriais primárias Aα e Aβ mielinizadas e de condução
rápida, responsáveis pela informação proprioceptiva (toque leve e pressão); na
segunda estão os neurônios de corpos celulares de pequeno e médio diâmetro,
formados pelas fibras C amielinizadas de condução lenta, e por fim, as fibras
Aδ mielinizadas de condução rápida. Em condições normais apenas as fibras C
e Aδ transmitem informações nociceptivas (CARLINI; MENDES, 2011).
38
Figura 4. Representação das terminações nervosas livres, Fibras Aβ, Aδ e C
(RANG et al., 2007).
Os corpos celulares das fibras aferentes nociceptivas situam-se nos
gânglios da raiz dorsal: as fibras entram na medula espinal através das raízes
dorsais, terminando na substância cinzenta do corno posterior. A maioria das
fibras aferentes nociceptivas termina na região superficial do corno posterior,
com as fibras C e algumas fibras Aδ inervando os corpos celulares nas lâminas
I e II, enquanto outras fibras A penetram mais profundamente no corno
posterior (lâmina V). As células nas lâminas I e V dão origem às principais vias
de projeção do corno posterior ao tálamo (RANG et al., 2007).
A informação nociceptiva é transmitida da medula espinhal para o
tálamo e para o córtex por cinco vias ascendentes: os tratos espinotalâmico,
espinoreticular,
espinomesencefálico,
cervicotalâmico,
espinohipotalâmico
(PINTO, 2000). O tálamo e o córtex são regiões finais da projeção das vias de
nocicepção. O tálamo é um dos responsáveis por informar que existe sensação
nociceptiva, e o córtex é responsável pela discriminação do tipo de sensação
nociceptiva e por identificar, de forma pouco fiel, de onde provém
(SOUZA, 2005).
Os neurônios cruzam a linha média da medula espinhal e ascendem
em direção ao tálamo, através do fascículo anterolateral que contém os feixes
39
espinotalâmico e espinorreticular para penetrar na substância cinzenta, após o
impulso ser integrado no sistema medular, o impulso nociceptivo caminha por
feixes ascendentes. O feixe espinotalámico dirige-se ao tálamo para o
complexo
ventrobasal,
núcleo
posterior
e
núcleos
intralaminares,
as
informações processadas nessas áreas são transmitidas ao córtex e o feixe
espinorreticular vai à formação reticular. Há também um sistema descendente
que tem origem no córtex e na formação reticular, que desce anatomicamente
pelo funículo dorso lateral e faz sinapse com os neurônios da lâmina II na
medula espinhal, com função inibitória (CAVALCANTI; MADALENA, 2003).
Já o feixe espinomesencefálico é formado por axônios de neurônios
de projeção das lâminas I e IV que se projetam até os núcleos parabraquiais da
formação reticular. O feixe espinocervical tem origem nas Lâminas III e IV e
projeta-se para o tálamo através do trato cervicotalâmico. O Trato
espinohipotalâmico compreende axônios das lâminas I, V e VIII. Estas se
projetam diretamente no hipotálamo (KLAUMANN et al., 2008).
3.6.4 Mecanismo central da dor
As
lesões
teciduais
periféricas
induzem
a
liberação
de
neurotransmissores, como substância P, somatotastina, peptídeo relacionado
ao gene da calcitonina, neurocinina-A, glutamato e aspartato. Essas
substâncias estão relacionadas com a ativação de potenciais pós-sinápticos
excitatórios
e
dos
receptores
N-metil-D-aspartato
(NMDA) (ROCHA
et al., 2007).
A sensibilização central é induzida por impulsos sensoriais
conduzidos pelas fibras C, estas quando são estimuladas podem liberar os
neurotransmissores, aminoácidos excitatórios e os neuropeptídios (substância
P, glutamato, etc). O glutamato por sua vez, após sua liberação, ativa os
receptores NMDA, provocando a despolarização da célula pós-sináptica e a
liberação
de
um
segundo
mensageiro,
além
de
ativar
receptores
metabotrópicos que ativam enzimas intracelulares através da fosfolipase C
(CAVALCANTI; MADALENA, 2003).
40
3.6.5 Mecanismo da dor periférica (dor inflamatória)
A dor inflamatória tem como função indicar a ocorrência de uma
lesão tissular, assim reduz a propagação do agente etiológico e previne lesões
tissulares futuras (LAPA et al., 2003). Logo após uma lesão tecidual ou
inflamação,
nociceptores
sensibilização
periférica
são
ativados
com
e
eventos
inicia-se
uma
celulares
e
cascata
de
subcelulares
(KLAUMANN et al., 2008). Os mediadores liberados ativam cascatas de
segundos mensageiros, influenciando canais iônicos, enzimas e proteínas de
sinalização intracelular nos nociceptores, levando ao aumento da excitabilidade
do neurônio, diminuindo o limiar de disparo e aumentando a frequência de
potenciais
de
ação
produzidos
durante
uma
estimulação
supralimiar
(BASBAUM; WOOLF, 1999).
As células lesadas e fibras aferentes primárias liberam uma série de
mediadores químicos, incluindo substância P e neurocinina A que têm efeitos
diretos sobre a excitabilidade de fibras sensoriais e simpáticas, além de
promover a vasodilatação com extravasamento de proteínas plasmáticas e o
recrutamento de células inflamatórias: mastócitos, macrófagos, linfócitos e
plaquetas contribuem para a formação de um ambiente complexo, composto
por mediadores inflamatórios, como íons hidrogênio, bradicinina, histamina,
íons potássio, citocinas, serotonina, fator de crescimento neural, óxido nítrico e
produtos das vias da ciclo-oxigenase e lipo-oxigenase do metabolismo do ácido
araquidônico (KLAUMANN et al., 2008).
3.6.6 Drogas analgésicas
As drogas utilizadas para o tratamento da dor tanto de classificação
aguda como crônica, são na grande maioria as drogas adjuvantes, que
possuem ações farmacológicas diversas, entre elas estão os antidepressivos,
anticonvulsivantes, anestésicos locais, agonistas dos receptores adrenérgicos
e moduladores gabaérgicos, entre outros, os fármacos anti-inflamatórios não
41
42
esteroides (AINES) e os opioides. Nesse sentindo, vale ressaltar que as drogas
clinicamente utilizadas para combater a dor, possuem ação limitada
dependendo do tipo de dor e produzem efeitos colaterais relevantes, que
restringem sua utilização (CARLINI; MENDES, 2011).
Os fármacos opioides são amplamente utilizados para promover o
alívio da dor, sendo considerados importantes por atuarem no sistema nervoso
central, exercendo os seus efeitos através de três receptores opioides (µ, ƙ, ᵹ).
Essa classe de fármacos é importante para o tratamento da dor crônica.
Existem algumas consequências devido ao uso dos opiáceos, dentre elas, a
depressão respiratória, sonolência, diminuição da motilidade gastrointestinal,
náuseas e diversas alterações do sistema endócrino e do sistema nervoso
autônomo (ALMEIDA et al., 2001). O sistema opioide endógeno tem várias
funções fisiológicas, incluindo a regulação da dor, através da inibição da
resposta dolorosa, modulação das funções gastrointestinal, endócrinas,
autonômicas e de aprendizado e da memória (ÁLVAREZ; FARRÉ, 2005).
Os medicamentos anti-inflamatórios não-esteroides (AINEs) são
utilizados no combate a dor e são amplamente utilizados no mundo, seus
efeitos farmacológicos são devido à inibição de uma enzima chamada ciclooxigenase (COX), que existe em três isoformas, a COX-1, COX-2 e a COX-3
(ABDEL-AZIZ et al., 2011). A administração de AINES em longo prazo pode
causar úlceras gastrointestinais, sangramentos e desordens renais, devido à
inibição não seletiva das isoformas constitutiva (COX-1) e induzível (COX-2).
Os
fármacos
cardiovasculares
inibidores
e
seletivos
adversos
da
COX-2
importantes,
podem
causar
dentre
efeitos
eles,
o
aumento do risco de infarto agudo do miocárdio, acidente vascular encefálico,
insuficiência cardíaca, insuficiência renal e hipertensão arterial (BATLOUNI,
2010).
Os opioides atuam excitando os neurônios na substância cinzenta
periaquedutal e no núcleo reticular paragigantocelular, que, por sua vez, se
projetam ao bulbo rostroventral, que inclui o núcleo magno da rafe e a partir
dele os neurônios contendo 5-hidroxitriptamina e encefalina vão à substância
gelatinosa do corno posterior e exercem influência inibitória sobre a
transmissão, além disso, eles atuam também no corno posterior e nas
terminações periféricas de neurônios aferentes nociceptivos. Já os AINES
atuam perifericamente diminuindo a produção de prostaglandinas, além dos
efeitos periféricos, eles também atuam na região central, possivelmente na
medula espinal, tendo em vista que, as lesões inflamatórias aumentam a
liberação de prostaglandinas na medula, causando facilitação da transmissão
das fibras de dor aferentes para os neurônios de retransmissão no corno
posterior (RANG et al., 2007).
3. 7. Modelos experimentais para avaliação da atividade antinociceptiva
3.7.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
O teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos é descrito como um modelo típico de estudo da dor inflamatória,
a ser utilizado como uma triagem para avaliação de analgésicos ou antiinflamatórios. Assim, a irritação local que é produzida pela injeção
intraperitoneal do ácido acético provoca a liberação de vários mediadores, tais
como a substância P, bradicininas, prostaglandinas, bem como das citocinas
pró-inflamatórias tais como IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α (PINHEIRO et al., 2011).
O modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético é
um modelo geral, não seletivo, para estudos de drogas antinociceptivas
(COUTO et al., 2011). O ácido acético induz o aumento do nível de PGE2 e
PGF2α no fluido peritoneal, que é responsável pela produção de dor. Por isso,
pode concluir-se que qualquer agente que reduz o número de contorções irá
demonstrar efeito analgésico, por inibição da síntese de prostaglandina, um
mecanismo periférico de inibição da dor (ALI et al., 2012).
43
3.7.2. Teste da formalina
A injeção subcutânea de formalina, em camundongos, determina o
aparecimento
de
várias
respostas motoras
bem
caracterizadas,
cuja
quantificação permite que se avalie a intensidade da resposta nociceptiva
(LAPA et al., 2003).
Assim,
o
teste
da
formalina
é
um
método
de
avaliação
comportamental utilizado para medir a efetividade de agentes antinociceptivos,
sendo composto por duas fases. A primeira inicia-se logo após a injeção de
formalina e se estende pelos primeiros 5 minutos (dor neurogênica ou aguda),
estando relacionada com a estimulação química direta dos nociceptores das
fibras aferentes do tipo C e, em parte, das fibras do tipo Aδ, está associada à
liberação de aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e substância P. A segunda
ocorre entre 15 e 30 min após a injeção de formalina e está relacionada com a
liberação
de
vários
mediadores
pró-inflamatórios,
como
bradicinina,
prostaglandinas e serotonina, entre outros. O intervalo entre a primeira e a
segunda fase (período de quiescência) é resultado de uma inibição da
transmissão nociceptiva através de circuitos supra-espinhais e espinhais
(HUNSKAAR; HOLE, 1987).
3.7.3. Teste da placa quente
O teste da placa quente (hot plate) é utilizado para avaliar a latência
dos animais a estímulos térmicos. Foi inicialmente descrito por Woolfe;
Macdonald (1944) como modelo específico para a detecção de substâncias
analgésicas de efeito central. Neste teste, os animais são colocados
individualmente numa placa quente de temperatura constante (55 ± 0,5 0C) e
após a obtenção dos valores basais os animais são tratados, posteriormente
decorridos 30, 60 e 120 da administração da droga a resposta é novamente
avaliada (CARLINI; MENDES, 2011; LAPA et al., 2003).
44
O modelo da placa quente avalia a participação de mecanismos
centrais na antinocicepção, sendo seletivo para componentes analgésicos tipo
opióide (PIRES et al., 2004). Este modelo utiliza a temperatura como estímulo
nociceptivo, assim, os nociceptores (fibras C e Aδ, principalmente) são
estimulados após a ativação dos receptores vaniloides, em especial, os
receptores do tipo VR-1, que possuem limiar de ativação em 43 ºC, e os
receptores do tipo VRL-1, que possuem limiar de ativação em 52 ºC. Os
recepetores VR-1 e VRL-1 são importantes na avaliação da resposta a
estímulos térmicos nocivos, permitindo uma resposta quando a temperatura
aumenta (SILVA et al., 2013).
3. 8. Considerações sobre inflamação
A palavra inflamação, ou flogose, tem origem do latim inflamare, ou
do grego phlogos, que significa pegar fogo. A inflamação é considerada um
mecanismo defensivo de relevante importância contra inúmeras agressões,
sendo então, uma reação dos tecidos vascularizados a um agente agressor,
caracterizada morfologicamente pela saída de líquidos e de células do sangue
para o interstício (BRASILEIRO - FILHO, 2009).
A inflamação faz parte de um mecanismo de defesa do hospedeiro
contra os estímulos que causam lesões, mas quando esse processo não é
controlado, pode causar danos ao organismo do indivíduo (DIA et al., 2014). Os
sinais cardinais que identificam a inflamação são: o calor, rubor (vermelhidão),
tumor (edema), dor e a perda da função, dentre os quais os quatro primeiros
foram descritos por Cornelius Celsus (ALESSANDRI et al., 2013). Esses sinais
são aparentes no local em que a reação inflamatória foi induzida o processo
inflamatório pode ser desencadeado por agentes infecciosos, agentes físicos
(radiação, queimadura, trauma), químicos (substâncias cáusticas), isquemia e
interações antígeno-anticorpo. A resposta inflamatória pode ser dividida em
aguda
(caracterizada
por
vasodilatação
localizada
e
aumento
da
permeabilidade vascular), subaguda (ocorre a infiltração de leucócitos e células
45
fagocitárias) e crônica (ocorre degeneração tecidual e fibrose) (CARVALHO,
2004).
A resposta inflamatória ocorre através de uma reação inata,
englobando os eventos ocorridos no local do tecido, e a resposta imune que
tornando a resposta de defesa mais específica. Assim, a reação inata envolve
os eventos que ocorrem localmente no interior dos tecidos e podem ser
divididos em vasculares e celulares (SILVA, 2007).
3.8.1. Eventos vasculares
Os eventos vasculares são de relevante importância, devido à sua
capacidade para promover no local da lesão um aumento na concentração de
mediadores de origem plasmática, dentre eles os componentes do sistema
complemento, da coagulação, do sistema fibrinolítico e das cininas. Esses
eventos compreendem a vasodilatação, com consequente aumento do fluxo
sanguíneo no local, o aumento da permeabilidade vascular e a exsudação
plasmática (SILVA, 2007).
Os
fenômenos
vasculares
são
representados
por
algumas
modificações hemodinâmicas que ocorrem na microcirculação, essas são
conduzidas pelos mediadores liberados durante os fenômenos irritativos
(BRASILEIRO - FILHO, 2009). Inicialmente, após a ocorrência de uma lesão,
ocorre a vasodilatação, que é caracterizada por vermelhidão e ardor no local da
lesão. Essa vasodilatação ocorre com o propósito de facilitar a migração de
mediadores e células inflamatórias para o local da lesão tissular (SHERWOOD;
TOLIVER-KINSKY, 2004).
A vasodilatação arteriolar é produzida por ação da histamina e
mantida por prostaglandinas, leucotrienos e PAF, aumentando assim, o fluxo
de sangue para a área agredida. Em seguida, as vênulas menores dilatam-se e
as maiores sofrem pequena constrição, aumentando a pressão hidrostática na
microcirculação. Concomitantemente com o aumento da permeabilidade
vascular, ocorre a exsudação de plasma para o interstício, promovendo a
46
hemoconcentração local e o aglomeramento das hemácias, tornando o sangue
mais viscoso e a circulação mais lenta (BRASILEIRO - FILHO, 2009).
As alterações vasculares na inflamação dependem do equilíbrio de
forças para direcionar o líquido para o interior do espaço vascular ou para fora
dele, tais como: pressão hidrostática, pressão oncótica, pressão osmótica e
fluxo linfático (HANSEL; RENEE, 2007). Assim a resposta inflamatória
desempenha um papel importante na regulação do sistema vascular,
integrando diversas respostas mecânica e bioquímica, liberando substâncias
vasoativas, citocinas, fatores de crescimento e hormônios (ALLER et al., 2007).
3.8.2. Eventos celulares
Os eventos celulares são desencadeados com o propósito de
promover a saída de leucócitos do leito vascular para o local em que ocorreu a
inflamação. Esse fenômeno ocorre simultaneamente com os eventos
vasculares e segue algumas fases como captura, rolamento dos leucócitos
pelo endotélio, adesão firme e transmigração (SILVA, 2007).
Nesse sentindo, a partir de respostas da imunidade inata e
adaptativa ocorre à migração de leucócitos para o sítio de inflamação. A
migração de neutrófilos, monócitos e células “natural killer” é iniciada através
de respostas inatas e pela origem de mediadores inflamatórios no local, tais
como, quimiocinase, citocinas específicas e a partir da imunidade adaptativa
através
da
migração
de
Linfócitos
T
para
o
local
da
inflamação
(NOURSHARGH; MARELLI-BERG, 2005).
O processo de migração se inicia quando os leucócitos ocupam a
periferia do vaso, sendo em seguida capturados, aderindo frouxamente ao
endotélio e deslocando-se sobre a superfície endotelial (fenômeno de captura e
rolamento), posteriormente são ativados e aderem firmemente ao endotélio
(fenômeno da adesão), e finalmente, migram através da parede das vênulas,
passando entre as células endoteliais (migração). A captura, o rolamento e a
adesão dos leucócitos são mediados por moléculas de adesão na superfície do
endotélio e dos leucócitos, naturalmente expressas na membrana ou com
47
expressão aumentada após ativação do endotélio ou leucócito. Assim, as
moléculas de adesão existentes no endotélio são ICAM-1 e 2, VCAM-1, CD31,
selectinas e as JAM-3 (BRASILEIRO – FILHO, 2009).
A migração de leucócitos a partir do sistema vascular ocorre através
de um processo de múltiplos passos, ditada pela ativação sequencial de
proteínas adesivas e os seus ligantes nos leucócitos e no endotélio das células.
Os monócitos, os linfócitos e os leucócitos polimorfonucleares migram por
mecanismos semelhantes, diferindo apenas em suas respostas (WAGNER;
ROTH, 2000).
3.8.3. Mediadores químicos
A reação inflamatória é resultado da produção no local de origem do
processo inflamatório de inúmeros mediadores, a partir de fontes humorais ou
celulares. Esses mediadores químicos são os responsáveis pela uniformidade
quase estereotipada da reação inflamatória, independente da natureza do
agente agressor (CARVALHO, 2004).
Vários mediadores são liberados no tecido lesionado, incluindo o
citocinas, quimiocinas, eicosanoides, aminas biogênicas, neuropeptídeos, entre
outros. No local da inflamação, esses mediadores exercem efeitos vasculares,
tais como, a vasodilatação, estase vascular e aumento da permeabilidade
vascular, promove a migração de leucócitos da circulação para o tecido
inflamado e coordena as respostas de defesa (ROTH et al., 2009).
Nesse sentindo, os mediadores devem ser liberados nos momentos
certos para que os fenômenos subsequentes atinjam o objetivo de defesa
(eliminação ou contenção da agressão) e de reparo (regeneração ou
cicatrização), havendo uma cronologia adequada para que os mecanismos próinflamatórios antecedam os anti-inflamatórios, possibilitando que a inflamação
aconteça e seja resolvida ou terminada (BRASILEIRO - FILHO, 2009).
Assim, os principais mediadores pró-inflamatórios são: histamina
(receptores H1), PAF, bradicinina, prostaglandinas, Leucotrienos, taquicininas,
IL-1, TNFα, IL-17, IFNϒ, anafilatoxinas e as proteases plasmina e tripsina. Os
48
principais mediadores anti-inflamatórios são: histamina (receptores H2),
prostaglandinas e tromboxanos A2, lipoxinas, resolvinas D e E, neuroproteínas,
acetilcolina, IL-10, TGFβ, antiproteases: α1-antitripsina e α2-macroglobulina,
glicocorticoides e endorfinas (BRASILEIRO - FILHO, 2009).
Após o reconhecimento dos estímulos inflamatórios os mediadores
liberam uma cascata de citocinas, as quais desempenham um papel essencial
no
desenvolvimento
da
dor
inflamatória,
bem
como
outros
eventos
inflamatórios. As citocinas participantes no processo inflamatório após uma
lesão são: o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), responsável por promover a
liberação de outras citocinas, destacando-se a interleucina 1-beta (IL-1β), que
promove a produção de prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e a
interleucina 8 (IL-8) (BASBAUM; JULIUS, 2006; VERRI et al., 2006).
3.9. Drogas anti-inflamatórias
3.9.1. Anti-inflamatórios não esteroides
As terapias anti-inflamatórias têm focado em estratégias para reduzir
ou neutralizar a ação dos mediadores pró-inflamatórios, bem como inibir o
recrutamento e ativação de leucócitos (ALESSANDRI et al., 2013). Dentre eles,
destacam-se os AINEs, esses estão entre os mais usados de todos os
fármacos.
Seus
principais
efeitos
terapêuticos
são:
anti-inflamatório
(modificação da reação inflamatória), analgésico (redução da dor inflamatória)
e antipirético (redução da temperatura corporal patologicamente elevada)
(RANG et al., 2007).
Os anti-inflamatórios não-esteroides interferem na síntese de
prostaglandinas e leucotrienos, e são excelentes bloqueadores da dor e do
edema inflamatório, mas com menor ação na exsudação celular. São
conhecidos dois grupos: os inibidores da COX-1 e inibidores da COX-2. Os
inibidores da síntese de leucotrienos têm seus receptores utilizados como anti-
49
inflamatórios nos casos de inflamações alérgicas, principalmente asma
(BRASILEIRO - FILHO, 2009).
O principal mecanismo de ação dos AINEs é a inibição da COX, e
consequentemente das prostaglandinas. Estas provocam vasodilatação,
eritema e hiperalgia quando liberadas em resposta ao trauma. O eritrema e o
edema resultam da propriedade vasodilatadora da PGE2 e da PGI2, principais
produtos da COX-2 do macrófago e do endotélio vascular, os efeitos antiinflamatórios decorrem da inibição da COX-2 e da síntese de PGE2 e PGI2
pelos macrófagos e pelo endotélio vascular (SAKATA, 2008).
A COX é responsável pela conversão de ácido araquidônico a
prostaglandinas, tromboxanos e outros mediadores lipídicos envolvidos na
inflamação. Os efeitos anti-inflamatórios dos AINEs são decorrentes da sua
capacidade de inibir a forma indutível da COX (isto é, a COX-2). A forma
constitutiva da enzima, a COX-1, é responsável pela produção de
prostaglandinas envolvidas na citoproteção gástrica, na agregação plaquetária
e na auto-regulação do fluxo sanguíneo renal. Por conseguinte, os AINEs, que
inibem tanto a COX-1 e COX-2 (por exemplo, o ASS) podem resultar tanto em
uma diminuição de inflamação e os efeitos colaterais de comprometimento de
plaquetas, renais e as funções gastrointestinais (WAGNER; ROTH, 2000).
No intuito de diminuir os efeitos colaterais dos anti-inflamatórios
convencionais, manter suas propriedades analgésicas e anti-inflamatórias, os
inibidores seletivos da COX-2 foram formulados. Esses, em sua dose
terapêutica, inibem apenas a isoforma COX-2, sem interferência na atividade
COX-1, os coxibes, como por exemplo, o rofecoxibe®, etoricoxibe®,
lumiracoxibe® e firocoxibe® (LEES et al., 2004; SAKATA, 2008).
3.9.2. Anti-inflamatórios esteroides
Os corticosteroides são hormônios esteroides sintetizados pela
cortex da adrenal, exercendo efeito sobre muitos sistemas orgânicos, bem
como possuindo ação anti-inflamatória (SAKATA, 2008). De forma primária, a
produção de glicocorticoides é regulada pelo hormônio adrenocorticotrófico
50
(ACTH). Os corticoides podem ser divididos em duas classes principais, os
mineralocorticoides, assim denominados por estarem envolvidos com a
regulação do equilíbrio de íons, e os glicorticoides, que participam da regulação
do metabolismo de carboidratos e de outras vias metabólicas (POIAN;
CARVALHO-ALVES, 2006).
Os corticosteroides possuem efeito analgésico intrínseco, tornandoos úteis no combate à dor aguda ou crônica. A prescrição dessa classe de
medicamentos torna-se especial em situações nas quais o processo
inflamatório se manifesta como importante agente patogênico da dor em
questão, ou seja, nas dores reumáticas, naquelas associadas aos traumas, em
algumas dores neuropáticas, em dores causadas por tumores e em especial
nas de acometimento ósseo, entre outras situações (SAKATA, 2008).
Os glicocorticoides atuam por vários mecanismos no processo
inflamatório, dentre eles: estabilizam membranas, diminuindo a fagocitose e a
exocitose dos fagócitos; reduzem a permeabilidade vascular e a ativação de
células endoteliais, bloqueando parcialmente a expressão de moléculas de
adesão e têm ação antifibrogênica (BRASILEIRO - FILHO, 2009).
Os glicocorticoides inibem as citocinas pró-inflamatórias, como as
interleucinas IL2 e IL12, o interferon gama (INFg) e o fator de necrose tumoral,
bem como moléculas de adesão, como a lipocortina-1, moléculas de adesão
vascular (VCAM-1) e moléculas de adesão intercelular (ICAM) e enzimas,
como a sintase induzida pelo óxido nítrico (INOS), a ciclooxigenase (COX 2) e a
fosfolipase (A2). No processo inflamatório, os glicocorticoides produzem ação
moduladora sobre a taxa de expressão de fatores de transcrição, como o fator
nuclear kappa B (NFkB), proteína inibidora do NFkB (IkB) e a proteína quinase
do IkB (IKK), além dos efeitos genômicos dos glicocorticoides, os quais
determinam redução da ação histamínica, diminuição da síntese de
prostaglandinas e da ativação do plasminogênio (LONGUI, 2007).
Os glicocorticoides suprimem a expressão da COX 2, promovem a
inibição da fosfolipase A2, bloqueiam a liberação de ácido araquidônico e
consequentemente da síntese de prostaglandinas mediada pela COX 2. Esses
efeitos contribuem para as ações anti-inflamatórias dos glicocorticoides
(GILMAN et al., 2006; HANSEL; DINTZIS, 2007).
51
Os glicocorticoides possuem um amplo espectro de indicações
terapêuticas e dignósticas, podendo ser utilizados de forma substitutiva em
casos de insuficiência adrenocortical ou no diagnóstico de doenças como a
síndrome de Cushing, além de serem empregados no tratamento agudo da
hipoglicemia e da hipercalcemia. Esses também induzem a maturação celular
(pneumócito tipo II), a diferenciação celular (linhagens da crista neural) e a
morte celular por apoptose, o que permite seu uso no tratamento de tumores,
especialmente os de linhagem hematopoiética. Os glicocorticoides têm papel
central no tratamento de doenças, nas quais estejam envolvidos mecanismos
imunes e inflamatórios (LONGUI, 2007).
É importante ressaltar, que o uso prolongado dos glicocorticoides
constitui num fator de risco elevado. Os efeitos adversos são geralmente mais
graves quando o uso é sistêmico, quando comparado com o uso tópico. Os
principais efeitos adversos são: a cicatrização retardada, o aparecimento de
petéquias e eritemas na pele, acne, glaucoma, osteoporose e outros
(SCHACKE et al., 2002).
3.10. Modelos experimentais para avaliação da atividade anti-inflamatória
3.10.1. Edema de pata induzido por carragenina
O edema é ocasionado pela injeção subcutânea de carragenina na
pata de ratos ou camundongos, que promove o aumento agudo e progressivo
do volume da pata injetada. Esse edema é proporcional à intensidade da
resposta inflamatória, constituindo um parâmetro útil na avaliação da atividade
anti-inflamatória de novos compostos (LAPA et al., 2003).
Na atividade anti-inflamatória avaliada pelo modelo, o edema é
induzido pela administração de 0,1 mL/animal de carragenina 1% na região
subplantar do camundongo. O volume é mensurado pelo aparelho de
hidroplestismômetro no tempo de 0 e intervalos de 1, 2, 3, 4 e 5 horas após a
injeção.
O
modelo
experimental
demonstra
um
elevado
grau
de
52
reprodutibilidade. A resposta inflamatória induzida pela carragenina é
caracterizada por uma resposta bifásica com formação de edema acentuado
resultante da produção rápida de vários mediadores inflamatórios, tais como
histamina, serotonina e bradicinina (primeira fase), e subsequentemente
liberação de prostaglandinas e óxido nítrico (segunda fase), com pico em 3 h,
produzido pela COX 2 e óxido nítrico sintase (iNOS), respectivamente
(THOMAZZI et al., 2010).
3.10.2. Edema de orelha induzido por óleo de cróton
O modelo de edema induzido na orelha de camundongos, através da
administração do óleo de cróton, é utilizado para avaliar a atividade de agentes
anti-inflamatórios de uso tópico, bem como anti-inflamatórios esteroides de uso
sistêmico. Primeiramente o anti-inflamatório é aplicado topicamente nas
orelhas dos camundongos e, após um período de absorção (geralmente 1 h)
aplica-se na orelha direita o agente irritante diluído em acetona, enquanto a
orelha esquerda é tratada apenas com o veículo. O edema é medido através
da diferença de peso entre as orelhas (LAPA et, al., 2003).
O edema de orelha induzido por óleo de cróton representa um
modelo usado para estudar atividade anti-inflamatória de drogas esteroides e
não esteroides. No teste são aplicados topicamente 10 µL de óleo de cróton
(2,5% em acetona), tendo como controle a orelha contralateral administrado
com o mesmo volume de acetona. Após 4 h os animais devem ser sacrificados
e removidos discos de 5 mm de diâmetro das orelhas e pesados. A diferença
entre o peso das orelhas é tomada como o edema induzido por óleo de cróton
(BRAGGIO et al., 2002).
53
3.10.3. Peritonite induzida por carragenina
O modelo de peritonite induzida pela injeção intraperitoneal (i.p.) de
carragenina permite avaliar drogas anti-inflamatórias. A injeção i.p. de
carragenina induz a migração de leucócitos para o local, cuja quantificação
permite avaliar a influência de drogas no desenvolvimento deste parâmetro da
resposta inflamatória, sendo sensível a anti-inflamatórios esteroides, além da
presença de vários mediadores inflamatórios pode ser avaliada e dosada no
exsudato inflamatório assim obtido (LAPA et al., 2003).
O recrutamento de células durante a inflamação depende da
liberação de mediadores locais, que são responsáveis pelas alterações
vasculares no local do processo inflamatório, bem como pelo recrutamento das
células de defesa. A inflamação induzida pela carragenina envolve a migração
celular, a exsudação e a produção de mediadores plasmáticos, tais como NO,
prostaglandina E2, a IL-1β, IL-6 e TNF-α. Esses mediadores são responsáveis
por recrutar neutrófilos (THOMAZZI et al., 2010).
54
4. PARTE EXPERIMENTAL
55
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. Material vegetal
4.1.1 Coleta de Cnidoscolus quercifolius Pohl
As folhas e cascas de Cnidoscolus quercifolius Pohl foram coletadas
no município Petrolina, na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Semiárido, em fevereiro de 2012, em uma área de Caatinga dentro
da instituição, cujas coordenadas geográficas são: latitude 09 003’55,30’’’
longitude 040020’06,90’’’ e altitude 374 m. O material foi identificado pelo
engenheiro florestal Dr. Viseldo Ribeiro de Oliveira da EMBRAPA. Uma
exsicata da espécie foi depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF)
da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) sob a
identificação de número 19202 (Figura 5).
Figura 5. Exsicata de Cnidoscolus quercifolius Pohl coletada em Petrolina-PE.
56
4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de Cnidoscolus
quercifolius Pohl
O material vegetal (folhas e cascas) foi dessecado em estufa com ar
circulante à temperatura média de 40 °C por um período de 72 horas. Após a
secagem e completa estabilização (eliminação de água, inativação de enzimas,
etc.) o material foi pulverizado em moinho, obtendo-se um material vegetal
seco e pulverizado (folhas – 0,482 kg; cascas – 1,481 kg).
O material seco e pulverizado foi submetido à maceração exaustiva
com etanol 95% em um percolador. Foram realizadas várias extrações com
intervalos de 72 hs entre cada extração até completo esgotamento da droga. A
solução extrativa obtida passou por um processo de destilação do solvente em
evaporador rotativo à pressão reduzida a uma temperatura média de 50 °C.
Após este processo de evaporação do solvente, obteve-se o extrato
etanólico bruto de Cnidoscolus quercifolius (Cq-EtOH). A partir de 0,482 kg do
pó seco das folhas foi obtido 0,063 kg do extrato etanólico bruto das folhas de
Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH) (13,07% de rendimento em relação ao
peso seco da planta), enquanto a partir de 1,481 kg do pó seco das cascas foi
obtido 0,392 kg do extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus
quercifolius (Cqc-EtOH) (26,46% de rendimento em relação ao peso seco da
planta).
4.3.
Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de
Cq-EtOH
A presente avaliação fitoquímica é uma triagem, cujo objetivo é
sistematizar e/ou rastrear, os principais grupos de constituintes químicos que
compõem um extrato vegetal. Trata-se de um exame rápido e superficial
através de reagente de coloração ou precipitação que revela a presença de
metabólitos secundários em um extrato. Essa triagem fitoquímica preliminar,
com o intuito de estabelecer a possível natureza química dos compostos
57
existentes foi realizada com o extrato etanólico bruto das cascas e folhas da
espécie Cnidoscolus quercifolius. Foram realizados testes para as classes
específicas de constituintes químicos, tais como saponinas, esteroides,
alcaloides, flavonoides e taninos.
A análise qualitativa dos grupos fitoquímicos presentes no extrato
etanólico bruto das cascas e folhas de C. quercifolius, foram avaliados em
placas de cromatografia em camada delgada de gel de sílica 60 F 254 com
suportes de alumínio, aplicada com uma micropipeta, e eluiu-se em diferentes
sistemas de solventes, conforme descritos em Wagner; Bladt (1996), buscando
destacar os principais grupos de metabólitos secundários (Quadro 1).
58
Quadro 1. Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os
principais metabólitos secundários da espécie Cnidoscolus quercifolius
(Euphorbiaceae).
Classe química
Sistema eluente
Revelador
Alcaloides
Tolueno: acetato de etila:
Dragendorff
dietilamina (70:20:10)
Antocianinas
Acetato de etila: ácido
anisaldeído
fórmico: ácido acético glacial:
sulfúrico
água (100:11:11: 26)
Cumarinas
Tolueno: éter etílico (1:1
KOH etanólico
saturado com ácido acético a
10%
10%)
Derivados
Acetato de etila: metanol:
KOH etanólico
Antracênicos
água (100:13,5:10)
10%
Flavonoides
Acetato de etila: ácido
NEU
fórmico: ácido acético glacial:
água
(100: 11: 11: 26)
Lignanas
Clorofórmio: metanol: água
Vanilina fosfórica
(70:30:4)
Mono e diterpenos
Tolueno: acetato de etila
Vanilina sulfúrica
(93:7)
Naftoquinonas
Tolueno: ácido fórmico (99:1)
KOH etanólico
10%
Saponinas
Clorofórmio: ácido acético:
Anisaldeído
metanol: água (64:32:12:8)
sulfúrico
Triterpenos e
Tolueno: clorofórmio: etanol
Lieberman-
esteroides
(40:40:10)
Burchard
Adaptado de Wagner; Bladt, 1996.
59
4.4. Animais
Para os testes farmacológicos foram utilizados camundongos albinos
Swiss (Mus musculus) machos e de ambos os sexos para o teste de toxicidade
aguda, pesando entre 30–40 g, todos provenientes do Biotério Setorial da
UNIVASF, Campus Petrolina. Antes dos experimentos, todos os animais foram
mantidos em gaiolas de polipropileno com ventilação e temperatura (22 ± 2 °C)
controladas, em um ciclo claro-escuro de 12/12 h, com a fase de luz iniciando
às 6:00 e terminando às 18:00 hs, com livre acesso à ração tipo “pellets”
(Labina®) e água (disponível em frascos de plástico com bicos apropriados).
Antes dos experimentos os animais foram privados de alimento por 12 hs e
transferidos do Biotério para o laboratório de fisiologia 48 horas antes do
experimento.
No período de adaptação os animais apenas foram manipulados
durante a limpeza das caixas. Todos os procedimentos foram conduzidos de
acordo com os princípios éticos na experimentação animal, sendo aprovados
pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal
do Vale do São Francisco - UNIVASF sob o número 0030/82012.
4.5. Testes de atividade antinociceptiva
4.5.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Baseado no método descrito Collier et al. (1968) com algumas
adaptações o teste das contorções abdominais foi realizado, com o objetivo de
avaliar o Cqc-EtOH e o Cqf-EtOH. Assim, foram utilizados seis grupos com seis
camundongos para cada extrato (Cqc-EtOH e Cqf-EtOH).
A resposta nociceptiva foi induzida através da administração de
ácido acético via intraperitoneal (i.p.) em volume de 0,1 mL/10 g. Os
camundongos foram tratados com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.) ou
60
Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.) e os animais do grupo controle negativo
receberam solução fisiológica 0,9% administrados por via intraperitoneal (i.p.)
30 minutos antes da administração do ácido acético. A Indometacina (20mg/kg)
e a morfina (10 mg/kg) foram usados como drogas padrões, sendo
administradas por i.p. 30 minutos antes do agente indutor da nocicepção.
O movimento de contorção abdominal é uma resposta caracterizada
pela contração e rotação do abdomem, seguida pela extensão de uma ou
ambas as patas traseiras. As contorções foram registradas entre 5 - 15 min
após a administração do ácido acético por via intraperitoneal (i.p.) (LAPA et al.,
2003).
Figura 6. Camundongo observado no teste de contorções abdominais após a
injeção do ácido acético.
4.5.2. Teste da formalina
Foi utilizado o método descrito por Hunskaar; Hole (1987), com
algumas adaptações. A nocicepção foi induzida através da administração da
61
solução de formalina (2,5% em salina 0,9%) por via subplantar (s.p.) na pata
posterior direita, em um volume de 20 μL/pata. Foram utilizados seis
camundongos em seis grupos para cada extrato. Os animais foram tratados
com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg),
veículo (salina), indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) todos por i.p. 60
minutos antes da injeção da formalina.
Os camundongos foram observados em uma câmara com um
espelho montado em três lados para permitir a visão das patas, e o tempo (em
segundos) gasto lambendo e mordendo a pata injetada foi medido como um
indicador de dor (Figura 7) (ALMEIDA et al., 2011). As respostas nociceptivas
causadas pela formalina são bifásicas, sendo divididas em uma primeira fase,
que ocorre durante os 5 min iniciais e, uma segunda fase, que acontece entre
15 e 30 min após a injeção de formalina. A primeira fase é descrita como
neurogênica, é ativada pelas fibras do tipo C. A segunda fase possui caráter
mais prolongado, sendo atribuída à liberação de mediadores inflamatórios
(CARLINI; MENDES, 2011).
Figura 7. Camundongo observado no teste da formalina.
62
4.5.3. Teste da placa quente
No teste da placa quente os camundongos foram divididos em cinco
grupos com seis animais cada para cada extrato. Os mesmos foram
previamente selecionados 24 horas antes do teste, no aparelho de placa
quente (Insight, Brasil), na temperatura de 55 ± 0,5 °C. Assim, aqueles animais
que apresentaram um tempo de reação (definido como latência para levantar
ou lamber as patas) maior que vinte segundos foram automaticamente
excluídos.
Os animais que foram selecionados receberam o pré-tratamento
com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg
i.p.), veículo (salina i.p.) e morfina (10 mg/kg i.p.). No teste os animais são
colocados individualmente numa placa quente de temperatura constante
(55± 0,5 °C) (Figura 8) e o tempo de latência foi medido em 30, 60, 90 e 120
min após os pré-tratamentos (LAPA, et al., 2003; KURIAN, R. et al., 2006). No
intuito de proteger o animal de possíveis lesões teciduais, foi escolhido um
tempo de corte de 20 s.
Figura 8. Camundongo observado no teste da placa quente.
63
4.6. Teste de coordenação motora
4.6.1. Teste do rota-rod
Os animais utilizados foram previamente selecionados 24 hs antes
da realização do teste. Aqueles que permaneceram por um período igual a
180 s estavam aptos para participar do teste (ALMEIDA, 2006). Os
camundongos que foram selecionados receberam o tratamento com Cqc-EtOH
(100, 200 e 400 mg/kg i.p.), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.), veículo
(salina i.p.) e diazepam (2,5 mg/kg i.p.). Assim, os camundongos foram
divididos em cinco grupos com seis animais para cada extrato.
Os animais foram colocados na barra giratória de 2,5 cm de
diâmetro girando a 7 rotações por minuto – R.P.M. (Figura 9), em seguida foi
registrado o tempo de permanência do animal na barra giratória (em
segundos), com três reconduções, no máximo, à barra (LAPA et al., 2003).
Figura 9. Camundongos observados no teste do rota-rod.
64
4.7. Testes de atividade anti-inflamatória
4.7.1. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal
Para a realização do teste foram utilizados cinco grupos com seis
animais para cada extrato. Os animais receberam Cqc-EtOH (100, 200 e
400 mg/kg i.p.), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.), veículo (salina i.p.) e
dexametasona (2 mg/kg, i.p.) e após 30 min receberam a solução de
carragenina (i.p.) (LAPA et al., 2003).
Os animais foram eutanasiados 4 hs após o estímulo e a migração
de leucócitos foi avaliada, sendo colhidas as células da cavidade peritoneal
com 3 mL de solução salina contendo 1 mM de EDTA. Imediatamente, uma
breve massagem foi realizada, e em seguida foi coletado o fluido peritoneal,
que foi centrifugado (3000 R.P.M. por 6 min) em temperatura ambiente. O
sobrenadante foi descartado e 300 μL de EDTA foi adicionado ao precipitado,
do qual foi retirado uma alíquota de 10 μL. Foi adicionado 200 μL de solução
de Turk à alíquota e o total de células foi contado em uma câmara de
Neubauer, em um microscópio óptico. Os resultados foram expressos como
número de leucócitos/mL (MELO et al., 2011).
4.7.2. Edema de pata induzido por carragenina
O teste do edema de pata induzido por carragenina 2% consiste em
injetar um volume de 20 μL/animal na região subplantar (s.p.), da pata direita
do camundongo (WINTER; RISLEY; NUSS, 1962). Posteriormente, para avaliar
a medida do volume das patas é necessário imergir a pata direita até o maléolo
lateral em um hidropletismômetro elétrico (PanLab LE 7500, Espanha)
(Figura 10) (LAPA et, al., 2003).
Os camundongos foram divididos em cinco grupos de seis animais
para cada extrato. Os animais foram tratados com Cqc-EtOH (100, 200 e
65
400 mg/kg i.p.), Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg i.p.), veículo (salina) e
indometacina (20 mg/kg) todos por i.p. 30 minutos antes da injeção da
carragenina. Antes da administração da carragenina (s.p.), foi avaliado o
volume basal da pata, posteriormente as medidas foram realizadas em 1, 2, 3,
4 e 5 horas (HUANG et al., 2012). Finalmente, para calcular a inibição do
edema, o volume da pata direita após a injeção da carragenina (VB) foi
subtraído pelo volume da pata direita anterior à injeção da carragenina (VA) e
dividido pelo (VA), pela seguinte fórmula: (VB-VA)/VA.
Figura 10. Volume da pata mensurado utilizando o aparelho pletismômetro no
modelo do edema de pata induzido por carragenina.
66
4.8. Toxicidade aguda
No intuito de investigar a toxicidade aguda, os camundongos foram
divididos em seis grupos de 6 machos e 6 fêmeas (n = 12). Assim, o grupo
controle recebeu o veículo (salina), os demais grupos receberam prétratamento com Cqc-EtOH e Cqf-EtOH, na dose de 2,0 g/kg e 5,0 g/kg por via
intraperitoneal e via oral, respectivamente. Posteriormente, os animais foram
observados durante 14 dias para avaliar a presença de mortes e sinais de
toxicidade. Outros parâmetros tais como: peso corporal, consumo de alimento
e água foram avaliados diariamente, durante todo o estudo.
4.8.1. Análise comportamental
A análise comportamental foi realizada seguindo metodologia
descrita por Almeida et al. (1999), baseado na observação de alguns
parâmetros específicos (piloereção, ptose palpebral, contorções abdominais,
convulsões, catatonia, tremores, paralisia das patas dianteiras, sedação,
ambulação aumentada, resposta ao toque diminuída, movimentação intensa
das vibrissas,
agressividade,
estereotipia
e analgesia), logo
após a
administração de Cq-EtOH. No primeiro dia, tais parâmetros foram avaliados
nos tempos de 0,5, 1, 2, 3 e 4 h após administração do extrato. Nos demais
dias, a avaliação comportamental foi feita diariamente até o último dia da
toxicidade aguda.
4.8.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos
Os parâmetros hematológicos e bioquímicos sanguíneos foram
avaliados seguindo a metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2007) e
Araújo et al. (2008) com modificações. O sangue foi retirado através do plexo
braquial para análise laboratorial dos parâmetros hematológicos: contagem de
67
eritrócitos (106/mm3), hemoglobina (g/dL), hematócrito (%), volume corpuscular
médio (VCM, μ3), hemoglobina corpuscular média (HCM, g), concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM,%), leucócitos (103/mm3), linfócitos
(%), monócitos (%) e plaquetas (103/mm3). Os parâmetros bioquímicos
analisados em amostras de soro foram glicose (mg/dL), colesterol (mg/dL),
triglicérides (mg/dL), AST/TGO (U/L), ALT/TGP (U/L), uréia (mg/dL) e creatinina
(mg/dL). As amostras foram levadas para laboratórios privados do município de
Petrolina-PE.
4.8.3. Análise histopatológica dos órgãos
Foram retirados fragmentos (medindo aproximadamente: 1,0 cm
x 1,0 cm) dos seguintes órgãos: rim, fígado, pâncreas, pulmão, baço, coração
e estômago, lavados imediatamente em solução salina (soro fisiológico) e a
seguir para se proceder à fixação os mesmos foram imersos em solução de
formol tamponado a 10% (tampão fosfato 0,1 M pH 7,2) por 12 h. A seguir, os
fragmentos foram imersos em álcool a 70% e transportados ao Laboratório de
Biologia Celular, Histologia e Citologia, no Campus de Ciências Agrárias da
UNIVASF. Os tecidos (rim, fígado e pâncreas) foram escolhidos para realizar a
análise histopatológica, devido apresentarem
alterações macroscópicas
importantes. Esses foram desidratados em concentrações crescentes de etanol
(Dinâmica, São Paulo, Brasil), clarificados em xileno (Dinâmica, São Paulo,
Brasil) e inclusos em parafina (Dinâmica, São Paulo, Brasil). Em seguida,
secções de 5 µm de cada bloco foram cortados em micrótomo (EasyPath, São
Paulo, Brasil) montadas em lâminas de vidro e coradas pelo método HE
(Hematoxilina-Eosina). A análise histopatológica foi realizada pela docente do
Colegiado de Ciências Farmacêuticas Dra Rosemairy L. Mendes.
68
4.9. Análise estatística
Os dados obtidos foram analisados através do programa GraphPad
Prism, versão 4.0, e expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m.).
Diferenças estatisticamente significativas entre os grupos foram calculadas
pela aplicação de uma análise de variância (ANOVA) one-way seguido do teste
de Dunnett, ou pelo teste t de Student não pareado, conforme exigido pelo
protocolo experimental. Foram considerados significativos valores de p < 0,05.
69
5. RESULTADOS
70
5. RESULTADOS
5.1. Triagem fitoquímica
A análise fitoquímica preliminar (Tabela 1) indicou reação positiva
para
presença
de
cumarinas,
flavonoides,
monoterpenos/diterpenos e
naftoquinonas no Cqc-EtOH, enquanto, o Cqf-EtOH demonstrou reação
positiva para cumarinas, derivados antracênicos, flavonoides, lignanas e
triterpenos/esteroides. Não foram detectados no Cqc-EtOH os seguintes
constituintes: alcaloides, antocianinas, derivados antracânicos, lignanas,
saponinas e triterpenos/esteroides. O Cqf-EtOH evidenciou reação negativa
para alcaloides, antocianinas, monoterpenos/diterpenos, naftoquinonas e
saponinas.
Tabela 1. Identificação das principais classes de constituintes químicos
presentes no extrato etanólico bruto das cascas e folhas de Cnidoscolus
quercifolius (Euphorbiaceae).
Classe Química
Cqc-EtOH
Cqf-EtOH
Alcaloide
-
-
Antocianinas
-
-
Cumarinas
++
+
Derivados Antracênicos
-
+
Flavonoides
++
+
Lignanas
-
+
Monoterpenos/diterpenos
+
-
Naftoquinonas
+
-
Saponinas
-
-
Triterpenos/esteroides
-
+++
(-): ausência do constituinte, (+): leve presença do constituinte, (++): moderada
presença do constituinte, (+++): intensa presença do constituinte.
71
5.2. Resultados da atividade farmacológica do extrato das cascas de
Cnidoscolus quercifolius
5.2.1
Atividade
antinociceptiva
do
extrato
das
cascas
de
5.2.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Os resultados mostrados na Figura 11 demonstram que a
administração do Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) proporcionou a
inibição das contorções induzidas pelo ácido acético quando comparados com
grupo controle (p<0,01). As porcentagens de inibição foram de 83,7%, 81,4% e
88,1%, respectivamente. Os fármacos indometacina e morfina apresentaram
89,6% e 100%, respectivamente, de redução de contorções quando
comparados com o controle. Não houve diferença estatística entre as doses de
Cqc-EtOH, quando comparadas entre si (p<0,01).
Número de contorções
30
20
10
**
**
100
200
**
**
400
INDO
**
0
Controle
MORF
Cqc-EtOH (mg/kg)
Figura 11: Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto das cascas de
Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina
(20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no teste das contorções abdominais em
camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n=6.
**p < 0,01 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo
teste de Dunnet).
72
5.2.1.2 Teste da formalina
O tempo de lambida da pata diminui significativamente com o prétratamento com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.), quando comparado ao
grupo controle em ambas as fases (p<0,01) no teste da formalina (Figura 12).
As porcentagens de inibição para Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) na
primeira fase foram de 31,62%, 51,10% e 68,33%, respectivamente. Já na
segunda fase as porcentagens foram de 66,08%, 78,26% e 73,97%,
respectivamente. O fármaco padrão morfina reduziu em ambas as fases o
estímulo da dor (p<0,01), enquanto a indometacina inibiu apenas na segunda
fase o estímulo da dor. Assim, houve diferença significativa entre as doses de
Cqc-EtOH na primeira e na segunda fase (p< 0,01).
73
Primeira Fase
a)
Tempo de lambida (s)
60
50
40
*
30
**
20
**
10
**
0
Controle 100
200
400
INDO
MORF
Cqc-EtOH (mg/kg)
b)
Segunda fase
200
150
100
**
50
**
**
**
**
0
Controle
100
200
400
Cqc-EtOH (mg/kg)
INDO
MORF
Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina
(20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), na primeira e segunda fase do teste da
formalina em camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão da
média, n=6. *p<0,05, **p<0,01, significativamente diferente do grupo controle
(ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
74
5.2.1.3 Teste da placa quente
Os resultados demonstrados na Figura 13 apontam que no teste da
placa quente, os animais tratados com Cqc-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.)
não mostraram aumento no tempo de latência, assim não houve diferença
significante, com exceção da dose de 400 mg/kg no tempo de 30 min que
aumentou o tempo de latência (p<0,05). Os animais tratados com a morfina
(10 mg/kg) demonstraram um aumento significativo no tempo de latência em
30, 60, 90 e 120 min (p<0,05).
Tempo de Latência (s)
20
*
**
*
15
*
*
10
Controle
Cqc-EtOH 100 mg/kg
Cqc-EtOH 200 mg/kg
Cqc-EtOH 400 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
5
0
30
60
90
120
Tempo (min)
Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), morfina
(10
mg/kg), no teste da placa quente em camundongos. Valores são
expressos em média ± erro padrão da média, n=6. *p<0,05, **p<0,01,
significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de
Dunnet).
75
5.2.2. Avaliação da coordenação motora do extrato das cascas de
5.2.2.1 Teste do rota-rod
Não houve alteração no tempo de permanência na barra giratória
para os animais que receberam o pré-tratamento com Cqc-EtOH (100, 200 e
400 mg/kg, i.p.) em relação ao grupo controle (Figura 14). Já o fármaco padrão
utilizada, diazepam (2,5 mg/kg) reduziu o tempo de permanência dos animais
na barra giratória significativamente (p<0,01). Não houve diferença significativa
entre as doses de Cqc-EtOH quando comparadas entre si (p<0,05).
Tempo no rota-rod (s)
200
150
**
**
**
100
Controle
Cqc-EtOH 100 mg/kg
Cqc-EtOH 200 mg/kg
Cqc-EtOH 400 mg/kg
Diazepam 2,5 mg/kg
50
0
0,5 h
1h
2h
Figura 14: Avaliação da coordenação motora do extrato etanólico bruto das
cascas de Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg),
diazepam (2,5 mg/kg), no teste de rota-rod em camundongos. Valores são
expressos em média ± erro padrão da média, n=6. **p<0,01 significativamente
diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
76
5.2.3.
Atividade
anti-inflamatória
do
extrato
das
cascas
de
5.2.3.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal
A administração do extrato etanólico bruto das cascas (Cqc-EtOH
100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) 1 h antes da injeção de carragenina (1%, i.p.,
0.25 mL) inibiu a migração de leucócitos (p<0,01) quando comparado ao grupo
controle (Figura 15). As doses de Cqc-EtOH quando comparadas entre si
apresentaram
diferença
estatística
(p<0,01).
A
droga
de
referência
dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu redução significante na
migração de leucócitos (p<0,01).
Leucócitos x 102/mm3
250
200
150
100
50
**
**
100
200
**
**
400
DEXA
0
Controle
Cqc-EtOH (mg/ml)
Figura 15: Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das cascas de
Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg) e dexametasona
(2 mg/kg), no teste da migração de leucócitos na cavidade peritoneal em
**p<0,01 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo
teste de Dunnet).
77
5.2.3.2 Teste edema de pata induzido por carragenina
No pré-tratamento com o Cqc-EtOH (i.p.) apenas a dose de
200 mg/kg inibiu durante todo o período do experimento (p<0,01), enquanto a
dose de 100 mg/kg inibiu apenas a partir da 3 h até 5 h (p<0,01), após o uso da
carragenina para induzir o edema (Figura 16). A droga padrão utilizada foi a
indometacina (20 mg/kg, i.p.) que inibiu o volume do edema de pata (p<0,01)
Volume do edema de pata (mL)
durante as 5 h de realização do experimento.
1.25
1.00
0.75
**
0.50
*
0.25
0.00
0
**
**
**
**
Controle
Cqc-EtOH 100 mg/kg
Cqc-EtOH 200 mg/kg
Cqc-EtOH 400 mg/kg
Indometacina 20 mg/kg
**
**
**
**
**
**
**
1
2
3
4
5
Tempo (horas)
Figura 16: Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das cascas de
Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina
(20
mg/kg), no teste do edema de pata induzido por carragenina em
teste de Dunnet).
5.2.4. Toxicidade aguda do extrato das cascas de Cnidoscolus quercifolius
Na avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico bruto das
cascas de Cnidoscolus quercifolius, não foram observadas mortes dos animais,
78
que receceberam a dose 2,0 g/kg administrada pela via intraperitoneal, como
também dos animais que receberam a dose 5,0 g/kg administrada pela via oral.
5.2.4.1. Avaliação comportamental dos camundongos
Na avaliação comportamental foi observado que os animais que
receberam a dose de 2,0 g/kg i.p. (fêmeas e machos) apresentaram contorções
abdominais, ptose palpebral, resposta ao toque diminuída e ambulação
diminuída. Na dose de 5 g/kg v.o os animais (fêmeas e machos) apresentaram
as seguintes alterações comportamentais: ambulação diminuída, ptose
palpebral e diarreia.
5.2.4.2. Consumo de água e alimento
Durante a análise o consumo de água pelos camundongos tratados
com Cqc-EtOH em todos os grupos não mostrou alterações significativas,
exceto o grupo de fêmeas que receberam a dose de 2,0 g/Kg por via
intraperitoneal. A quantidade de água consumida no final do experimento foi de
33,00 ± 1,71 mL para o grupo controle fêmeas, enquanto o grupo tratado com a
dose de 2,0 g/kg i.p. foi de 24,71 ± 1,08 mL (p<0,05) (Figura 17).
Em relação ao consumo de alimentos pelos animais não houve
alterações relevantes, apenas as fêmeas que receberam o Cqc-EtOH na dose
de 2,0 g/Kg i.p. e os machos que receberam a dose de 5,0 g/kg v.o,
respectivamente, apresentaram resultados significativos. O consumo de ração
no final do experimento foi de 30,07 ± 0,73 g para o grupo controle machos e
de 25,43 ± 1,00 g para o grupo controle fêmeas, enquanto o grupo tratado com
a dose de 2,0 g/kg (fêmeas) e 5,0 g/kg (machos) foi de 16,93 ± 1,33 g e 24,07
± 0,92 g respectivamente (p<0,05) (Figura 18).
79
Consumo de Ração (g)
40
Controle machos
Cqc-EtOH machos 2 g/kg
Controle fêmeas
Cqc-EtOH fêmeas 2 g/kg
35
30
25
20
15
10
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (dias)
Figura 17: Consumo de alimentos pelos animais tratados com extrato etanólico
bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).
Consumo de líquido (mL)
80
55
Controle machos
Controle fêmeas
45
35
25
15
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (dias)
Figura 18: Consumo de líquidos pelos animais tratados com extrato etanólico
bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).
5.2.4.3. Variação do peso corporal
O peso corporal dos camundongos do dia 1 ao dia 14 (Figura 19)
apresentou diferença estatística apenas nos grupos fêmeas nas doses de
2,0 g/kg por i.p. e 5,0 g/kg v.o. A média do peso corporal dos camundongos do
grupo controle fêmeas ao término do experimento foi de 30,87 ± 0,24 g,
enquanto as dos grupos fêmeas tratados com 2,0 g/kg por i.p. e 5,0 g/kg v.o.
foram de 28,82 ± 0,18 g e 29,46 ± 0,09.
50
Controle machos
Cqc-EtOH machos 2g/kg
Cqc-EtOH machos 5g/kg
Controle fêmeas
Cqc-EtOH fêmeas 2g/kg
Cqc-EtOH fêmeas 5g/kg
Peso (g)
45
40
35
30
25
20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Tempo (dias)
Figura 19: Variação de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto
das cascas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).
5.2.4.4. Parâmetros hematológicos
Nos valores avaliados para os parâmetros hematológicos (eritrócitos,
hemoglobina, hematócritos, concentração de hemoglobina corpuscular média
(CHCM), basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos, monócitos e neutrófilos)
apenas os parâmetros de volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina
corpuscular média (HCM) e neutrófilos apresentaram diferença estatística
(p<0,05), os demais grupos não apresentaram diferença significativa. Os
resultados estão expressos na Tabela 2.
81
82
GOMES, L.M.A. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus quercifolius Pohl (Euphorbiaceae) em roedores.
Tabela
2.
Parâmetros
hematológicos
de
camundongos
tratados
com
extrato
etanólico
bruto
das
cascas
de
Cnidoscolus quercifolius (Cqc-EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias
(n=6 por grupo).
Grupos
Parâmetros
Controle
Machos
2 g/kg Machos
5 g/kg Machos
Controle
Fêmeas
2 g/kg Fêmeas
5 g/kg Fêmeas
Eritrócitos (106/mm3)
8,04 ± 0,33
8,25 ± 0,09
8,10 ± 0,35
10,00 ± 1,33
6,94 ± 1,03
7,91 ± 0,17
Hemoglobina (g/dL)
12,74 ± 0,53
13,40 ± 0,21
12,94 ± 0,59
17,18 ± 2,63
10,76 ± 1,57
13,02 ± 0,30
Hematócrito (%)
36,28 ± 1,90
38,58 ± 0,61
37,10 ± 1,79
49,30 ± 7,45
30,84 ± 4,50
36,48 ± 1,21
VCM (μ3)
45,80 ± 0,73
47,20 ± 0,80
45,80 ± 0,66
49,20 ± 1,02
44,40 ± 0,74*
47,00 ± 0,70
HCM (μg)
16,14 ± 0,12
16,32 ± 0,13
16,04 ± 0,25
17,00 ± 0,38
15,52 ± 0,14*
16,44 ± 0,08
CHCM (%)
34,90 ± 0,33
34,30 ± 0,47
34,96 ± 0,29
34,78 ± 0,66
35,00 ± 0,61
35,74 ± 0,61
Basófilos (%)
0,52 ± 0,09
0,36 ± 0,05
0,34 ± 0,09
0,70 ± 0,21
0,42 ± 0,15
0,54 ± 0,10
Eosinófilos (%)
Leucócitos
(103/mm3)
Linfócitos (%)
0,08 ± 0,02
0,02 ± 0,02
0,06 ± 0,02
0,04 ± 0,02
0,08 ± 0,04
0,10 ± 0,05
8,94 ± 1,71
7,30 ± 1,33
6,14 ± 1,48
10,30 ± 2,27
4,92 ± 1,24
6,92 ± 0,88
93,00 ± 0,50
93,96 ± 0,24
90,42 ± 1,21
93,24 ± 0,62
89,62 ± 2,25
90,48 ± 1,20
Monócitos (%)
0,74 ± 0,11
0,46 ± 0,09
0,70 ± 0,09
0,52 ± 0,09
0,38 ± 0,10
0,56 ± 0,10
Neutrófilos (%)
6,00 ± 0,61
5,18 ± 0,20
8,12 ± 1,01
5,00 ± 0,73
8,66 ± 1,68*
Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student p<0,05, comparado ao controle.
8,32 ± 1,06*
quercifolius pohl (Euphorbiaceae) em roedores.
5.2.4.5. Parâmetros bioquímicos
Os parâmetros bioquímicos demonstrados na Tabela 3 apontam que
houve um decréscimo nos valores de triglicerídeos no grupo machos nas doses
de 2 g/kg i.p., 5 g/kg v.o. e fêmeas 2 g/kg i.p., de glicose no grupo machos na
dose 5 g/kg v.o e 2 g/kg fêmeas, bem como nos níveis de AST/TGO no grupo 2
g/kg machos e 5 g/kg fêmeas. Os demais resultados não mostraram diferenças
significativas.
83
84
GOMES, L.M.A. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cnidoscolus quercifolius pohl (Euphorbiaceae) em roedores.
Tabela 3. Parâmetros bioquímicos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius
(Cqc-EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n=6 por grupo).
Grupos
Parâmetros
Glicose (mg/dL)
Controle
Machos
153,7 ± 13,87
2 g/kg Machos
5 g/kg Machos
Controle
Fêmeas
2 g/kg Fêmeas
5 g/kg Fêmeas
157,2 ± 22,86
83,8 ± 20,53*
142,0 ± 5,94
88 ± 12,51*
107,6 ± 27,27
Colesterol
(mg/dL)
324,8 ± 45,70
243,6 ± 33,52
295,6 ± 16,55
292 ± 41,21
271,2 ± 17,55
380 ± 38,22
Triglicerídeos
(mg/dL)
454,8 ± 35,05
234,8 ± 31,01*
355,6 ± 39,89*
406,4 ± 22,33
340 ±17,85*
443,2 ± 55,58
AST/TGO (U/L)
200,7 ± 19,83
105,1 ± 24,83*
274,2 ± 68,59
329,6 ± 34,32
392 ± 64,46
182,1 ± 39,34*
ALT/TGP (U/L)
63,44 ± 4,96
77,8 ± 15,56
70,16 ± 18,10
94,08 ± 23,00
101,7 ± 25,60
95,16 ± 27,99
Creatinina
0,54 ± 0,04
0,48 ± 0,03
0,54 ± 0,02
0,61 ± 0,04
0,7 ± 0,08
(mg/dL)
0,62 ± 0,12
85
5.2.4.6. Peso dos órgãos
No resultado da análise dos pesos dos órgãos dos animais, não houve diferença significativa quando comparados com
o controle (Tabela 4).
Tabela 4. Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius (CqcEtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n=6 por grupo).
Grupos
Parâmetros
Controle
Machos
2 g/kg Machos
5 g/Kg Machos
Controle Fêmeas
2 g/kg
Fêmeas
5 g/Kg
Fêmeas
Baço (g)
0,14 ± 0,02
0,13 ± 0,00
0,14 ± 0,01
0,10 ± 0,01
0,14 ± 0,02
0,09 ± 0,01
Coração (g)
0,17 ± 0,01
0,17 ± 0,00
0,15 ± 0,03
0,13 ± 0,00
0,12 ± 0,02
0,13 ± 0,00
Estômago (g)
0,48 ± 0,06
0,51 ± 0,04
0,40 ± 0,08
0,41 ± 0,01
0,31 ± 0,06
0,42 ± 0,05
Fígado (g)
1,53 ± 0,08
1,64 ± 0,02
1,59 ± 0,06
1,26 ± 0,04
1,32 ± 0,06
1,20 ± 0,04
Rim (g)
0,22 ± 0,01
0,23 ± 0,00
0,21 ± 0,01
0,16 ± 0,01
0,17 ± 0,01
0,14 ± 0,01
Pâncreas (g)
0,28 ± 0,03
0,28 ± 0,03
0,23 ± 0,04
0,22 ± 0,00
0,21 ± 0,04
0,20 ± 0,01
Pulmão (g)
0,22 ± 0,00
0,23 ± 0,00
0,23 ± 0,00
0,22 ± 0,00
0,23 ± 0,01
Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student p< 0,05, comparado ao controle.
0,20 ± 0,00
5.2.4.7. Análise Macroscópica e Histológica
Na análise macroscópica dos órgãos os animais tratados com 2 g/kg
Cqc-EtOH por via i.p. apresentaram fígado com consistência endurecida,
aderido ao diafragma e apenas um animal macho tratado na dose 5 g/kg v.o.
apresentou esplenomegalia, porém a análise histológica dos órgãos (fígado,
pâncreas e rins) não apresentaram sinais de toxicidade e lesões.
Na análise histológica do fígado dos animais tratados com Cqc-EtOH
não foi identificada alteração (Figura 20). O parênquima do órgão mostrou-se
ausente de lesões (Figura 20 - B, C, E e F) com estruturas conservadas,
semelhante aquelas encontradas no grupo controle (Figura 20A e 20D).
O pâncreas do animal tratado apresenta o parênquima muito bem
preservado (Figura 21). Observa-se a presença de Ilhotas pancreáticas (Figura
21A e 21C) e ácinos pancreáticos em bom estado de conservação em todos os
grupos.
A análise histológica dos rins mostrou estruturas preservadas e
ausência de sinais de nefrotoxicidade (Figura 22).
86
Figura 20. Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais tratados com extrato etanólico bruto das cascas de
Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqc-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqc-EtOH (5 g/kg v.o.). VC= ramo da veia
centrolobular; H= Hepatócito (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100 X).
87
Figura 21. Fotomicrografias de cortes histológicos do pâncreas de animais tratados com extrato etanólico bruto das cascas de
Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqc-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqc-EtOH (5 g/kg v.o.). AP= Ácinos pancreático;
IP= Ilhotas pancreáticas (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100 X).
88
Figura 22. Fotomicrografias de cortes histológicos dos rins de animais tratados com extrato etanólico bruto das cascas de
Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqc-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqc-EtOH (5 g/kg v.o.) TR=Túbulos Renais;
CR= Corpúsculo Renal (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100X).
89
5.3. Resultados da atividade farmacológica do extrato das folhas de
5.3.1
Atividade
antinociceptiva
do
extrato
das
folhas
de
5.3.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
A administração do Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.), 30 min
antes da administração do ácido acético, promoveu a inibição as contorções
induzidas pelo ácido acético quando comparados com o grupo controle
(p<0,01) (Figura 23). Os resultados mostrados demonstram que as
porcentagens de inibição foram de 71,3%, 79,4% e 98,7%, respectivamente. As
drogas padrão indometacina e morfina apresentaram 94% e 100%,
respectivamente, de redução de contorções quando comparados com o
controle.
40
30
20
**
10
**
**
0
Controle
100
200
400
**
INDO
**
MORF
Cqf-EtOH (mg/kg)
Figura 23: Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto das folhas de
Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina
(20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no teste das contorções abdominais em
teste de Dunnet).
90
5.3.1.2 Teste da formalina
No teste da lambida da pata induzida pela formalina, o prétratamento com Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.), reduziu o tempo de
lambida da pata significativamente, quando comparado ao grupo controle em
ambas as fases (p<0,01) (Figura 24). As porcentagens de inibição para Cqf EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) na primeira fase foram de 44,28%, 29,05% e
36,27%, respectivamente. Já na segunda fase as porcentagens foram de
60,11%, 75,58% e 79,46%, respectivamente. O fármaco padrão morfina
reduziu em ambas as fases o estímulo da dor (p<0,01), enquanto a
indometacina inibiu apenas na segunda fase o estímulo da dor. Houve
diferença significativa entre as doses de Cqf-EtOH na primeira e na segunda
fase.
91
Primeira fase
a)
60
50
40
*
**
30
**
20
10
**
0
Controle
100
200
400
INDO
MORF
Cqf-EtOH (mg/kg)
b)
Segunda fase
200
150
100
**
**
50
**
**
**
0
Controle
100
200
400
INDO
MORF
Cqf-EtOH (mg/kg)
Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina
(20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), na primeira e segunda fase do teste da
formalina em camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão da
média, n=6. *p<0,05, *p<0,01, significativamente diferente do grupo controle
(ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
92
5.3.1.3 Teste da placa quente
Os resultados demonstrados na Figura 25 revelam que no teste da
placa quente, os animais tratados com Cqf-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.)
não mostraram aumento no tempo de latência, com exceção da dose de
400 mg/kg no tempo de 90 e 120 minutos (p<0,05). Os animais tratados com a
morfina (10 mg/kg) demonstraram um aumento evidente no tempo de latência
em 30, 60, 90 e 120 min (p<0,01).
20
**
**
** **
15
****
10
Controle
Folhas -EtOH 100 mg/kg
Folhas-EtOH 200 mg/kg
Folhas - EtOH 400 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
5
0
30
60
90
120
Tempo (min)
Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), morfina (10 mg/kg),
no teste da placa quente em camundongos. Valores são expressos em média
± erro padrão da média, n=6. **p<0,01 significativamente diferente do grupo
controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
93
5.3.2.
Avaliação
da coordenação motora
do
extrato
das folhas de
5.3.2.1 Teste do rota-rod
No teste do rota-rod não houve alteração no tempo de permanência
na barra giratória para os animais que receberam o pré-tratamento com CqfEtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) em relação ao grupo controle (Figura 26),
não havendo valores significantes (p>0,05). Já o fármaco padrão utilizada
diazepam (2,5 mg/kg) reduziu o tempo de permanência dos animais na barra
giratória significativamente (p<0,01). Não houve diferença significativa entre as
doses de Cqf-EtOH quando comparadas entre si.
Tempo no rota-rod (s)
200
150
**
**
**
100
Controle
Cqf-EtOH 100 mg/kg
Cqf-EtOH 200 mg/kg
Cqf-EtOH 400 mg/kg
Diazepam 2,5 mg/kg
50
0
0,5 h
1h
2h
Figura 26: Efeito na coordenação motora do extrato etanólico bruto das folhas
de Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg), diazepam
(2,5 mg/kg), no teste do rota-rod em camundongos. Valores são expressos em
média ± erro padrão da média, n=6. **p<0,01 significativamente diferente do
grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
94
5.3.3.
Atividade
anti-inflamatória
do
extrato
das
folhas
de
5.3.3.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal
O pré-tratamento com o extrato etanólico bruto das folhas (Cqf-EtOH
100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) 1 h antes da injeção de carragenina (1%, i.p.,
0.25 mL) inibiu a migração de leucócitos (p<0,01) quando comparado ao grupo
controle (Figura 27). As doses de Cqf-EtOH quando compradas entre si
apresentou
diferença
estatística
(p<0,01).
O
fármaco
de
referência
dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu redução significante na
migração de leucócitos (p<0,01).
Leucócitos x 102/mm3
250
200
150
*
100
**
**
**
400
DEXA
50
0
Controle
100
200
Cqf-EtOH (mg/kg)
Figura 27: Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das folhas de
Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg) e dexametasona
(2 mg/kg), no teste da migração de leucócitos na cavidade peritoneal em
*p<0,05, **p<0,01, significativamente diferente do grupo controle (ANOVA
seguido pelo teste de Dunnet).
95
5.3.3.2 Teste edema de pata
No teste de edema de pata induzido por carragenina em
camundongos foi possível observar que no pré-tratamento com o (Cqf-EtOH
100, 200 e 400 mg/kg, i.p.), apenas a dose de 100 mg/kg proporcionou a
inibição do edema de pata a partir da 4 h (p<0,05) e 5 h (p<0,01) (Figura 28). A
droga padrão utilizada foi a indometacina (20 mg/kg, i.p.) inibiu o edema de
Volume do edema de pata (mL)
pata (p<0,01) durante as 5 h de realização do experimento.
1.25
Controle
Cqf-EtOH 100 mg/kg
Cqf-EtOH 200 mg/kg
Cqf-EtOH 400 mg/kg
Indometacina 20 mg/kg
1.00
0.75
*
0.50
*
0.25
0.00
0
**
*
**
**
**
1
2
3
4
5
Tempo (horas)
Figura 28: Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das folhas de
Cnidoscolus quercifolius (Cqf-EtOH 100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina
(20
mg/kg), no teste do edema de pata induzido por carragenina em
*p<0,05, **p<0,01, significativamente diferente do grupo controle (ANOVA
seguido pelo teste de Dunnet).
5.3.4. Toxicidade aguda do extrato das folhas de Cnidoscolus quercifolius
Durante o período de observação no estudo da toxicidade aguda das
folhas do dia 1 ao dia 14, o extrato não ocasionou a morte de nenhum animal
96
após os mesmos receberem as doses de 2,0 g/kg por via intraperitoneal e 5,0
g/kg por via oral, indicando baixa toxicidade do extrato.
5.3.4.1. Avaliação comportamental dos camundongos
Durante a triagem comportamental os animais que receberam a
dose de 2,0 g/kg i.p. de Cqf-EtOH (fêmeas e machos) apresentaram as
seguintes alterações comportamentais: contorções abdominais, ambulação
diminuída e ptose palpebral. Na dose de 5 g/kg os animais não demostraram
alterações no comportamento.
5.3.4.2. Consumo de alimento e água
Durante a análise do consumo de água pelos camundongos tratados
com Cqf-EtOH, houve diferença estatística apenas nos grupos de 2,0 g/kg por
via intraperitoneal (machos e fêmeas), os demais grupos não demonstraram
diferença significativa. As quantidades de água consumidas no final do
experimento pelos grupos controles machos e fêmeas foram respectivamente
de: 30,21 ± 1,40 mL e 30,93 ± 1,12 mL. Já o grupo tratado com a dose de
2,0 g/kg por via intraperitoneal machos consumiu uma média de 38,86
± 2,04 mL e o consumo feito pelo grupo de fêmeas que recebeu a mesma
dose foi de 25,93 ± 1,32 mL (p<0,05) (Figura 30).
Em relação ao consumo de alimentos, apenas o grupo de fêmeas
que receberam o Cqf-EtOH na dose de 2,0 g/Kg i.p. mostrou diferença
significativa, o consumo de ração no final do experimento foi para esse grupo
foi de 16,21 ± 1,44 g e o consumo para o grupo controle fêmeas foi de 25,43
± 1,16 g (p<0,05) (Figura 29).
97
Consumo de Ração (g)
40
Controle machos
Cqf-EtOH machos 2 g/kg
Controle fêmeas
Cqf-EtOH fêmeas 2 g/kg
35
30
25
20
15
10
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (dias)
Figura 29: Consumo de alimentos pelos animais tratados com extrato etanólico
Consumo de líquido (mL)
bruto das folhas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).
50
Controle machos
Controle fêmeas
45
40
35
30
25
20
15
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (dias)
Figura 30: Consumo de líquidos pelos animais tratados com extrato etanólico
bruto das folhas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).
5.3.4.3. Variação do peso corporal
O peso corporal dos camundongos apresentou diferença estatística
apenas nos seguintes grupos: 2 g/kg i.p. (machos e fêmeas) e 5 g/kg v.o
(machos). Os demais grupos não apresentaram diferenças significativas. Ao
término do experimento a média do peso corporal dos camundongos do grupo
98
controle machos foi de 33,27 ± 0,20 g, do grupo controle fêmeas foi de 38,98
± 0,13 g, enquanto as dos grupos machos e fêmeas ambos tratados com
2,0 g/kg foram de 38,26 ± 0,41 g e 35,22 ± 0,23 g respectivamente, e por fim, o
grupo de machos que receberam a dose de 5 g/kg por via oral foi de 38,26
± 0,41 g (p<0,05). A variação de peso ao longo do experimento pode ser vista
na Figura 31.
50
Controle machos
Cqf-EtOH machos 2g/kg
Cqf-EtOH machos 5g/kg
Controle fêmeas
Cqf-EtOH fêmeas 2g/kg
Cqf-EtOH fêmeas 5g/kg
Peso (g)
45
40
35
30
25
20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Tempo (dias)
Figura 31: Variação de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto
das folhas de Cnidoscolus quercifolius durante 14 dias (n= 6 por grupo).
5.3.4.4. Parâmetros hematológicos
(CHCM), basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos, monócitos e neutrófilos,
apenas os seguintes parâmetros mostraram diferença significativa: os valores
de eosinófilos mostraram uma diminuição nos grupos 2 g/kg machos e um
aumento no grupo 5 g/kg fêmeas, os valores de leucócitos mostraram um
aumento na dose de 2 g/kg machos, bem como, os valores de neutrófilos
apresentaram um decréscimo nos animais que receberam a dose de 2 g/kg i.p.
(machos), apresentando assim diferença estatística (p<0,05). Os demais
grupos não apresentaram diferença significativa. Os resultados estão
expressos na Tabela 5.
99
100
Tabela 5. Parâmetros hematológicos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus
quercifolius (Cqf-EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n= 6 por grupo).
Grupos
Parâmetros
Controle
Machos
2 g/kg Machos
5 g/kg Machos
Controle Fêmeas
2 g/kg Fêmeas
5 g/kg Fêmeas
Eritrócitos
5,74 ± 1,21
8,08 ± 0,20
7,91 ± 0,31
7,93 ± 0,22
7,64 ± 0,17
8,14 ± 0,08
Hemoglobina
9,14 ± 1,92
13,12 ± 0,52
12,88 ± 0,45
12,78 ± 0,29
12,20 ± 0,32
13,28 ± 0,12
Hematócrito
25,32 ± 5,29
37,30 ± 1,24
37,06 ± 1,19
35,26 ± 0,93
32,62 ± 1,10
37,20 ± 0,65
VCM
45,20 ± 0,73
46,20 ± 0,86
45,60 ± 0,81
44,60 ± 0,24
44,00 ± 0,44
46,20 ± 0,73
HCM
15,90 ± 0,11
16,16 ± 0,25
16,26 ± 0,12
16,02 ± 0,073
15,98 ± 0,18
16,22 ± 0,18
CHCM
35,94 ± 0,29
35,16 ± 0,74
34,70 ± 0,48
35,82 ± 0,31
35,96 ± 0,16
35,26 ± 0,42
Basófilos
1,20 ± 0,29
0,58 ± 0,08
0,94 ± 0,34
0,56 ± 0,14
0,38 ± 0,08
0,56 ± 0,04
Eosinófilos
0,30 ± 0,07
0,12 ± 0,02*
0,48 ± 0,27
0,08 ± 0,02
0,02 ± 0,02
0,18 ± 0,03*
Leucócitos
3,68 ± 0,55
6,20 ± 0,45*
5,76 ± 1,32
4,46 ± 1,24
7,14 ± 0,68
4,84 ± 0,71
Linfócitos
91,36 ± 1,38
95,24 ± 1,07
89,80 ± 1,71
93,66 ± 1,14
94,10 ± 0,77
94,14 ± 0,35
Monócitos
0,40 ± 0,07
0,24 ± 0,05
0,36 ± 0,09
0,38 ± 0,06
0,40 ± 0,044
0,54 ± 0,16
Neutrófilos
6,66 ± 1,11
3,14 ± 0,66*
6,34 ± 0,91
4,44 ± 0,51
5,08 ± 0,67
Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Testet de Student p<0,05, comparado ao controle.
4,14 ± 0,24
5.3.4.5. Parâmetros bioquímicos
Os parâmetros bioquímicos revelaram um decréscimo no valor de
AST/TGO no grupo 2 g/kg i.p. (machos), de triglicerídeos nos animais que
receberam a dose de 5 g/kg v.o. (fêmeas) e de glicose nas doses 2 g/kg
(machos e fêmeas) i.p. e 5 g/kg fêmeas. Os demais parâmetros não
demonstraram diferenças significativas. Os resultados estão expressos na
Tabela 6.
101
102
Tabela 6. Parâmetros bioquímicos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius
(Cqf-EtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n=6 por grupo).
Grupos
Parâmetros
Controle
Machos
2 g/kg Machos
5 g/kg Machos
Controle
Fêmeas
2 g/kg Fêmeas
5 g/kg Fêmeas
Glicose (mg/dL)
250,5 ± 16,68
108,0 ± 21,49*
213,0 ± 24,80
253,5 ± 12,58
177,0 ± 21,42*
115,5 ± 40,35*
Colesterol (mg/dL)
115,8 ± 7,66
101,2 ± 9,88
126,0 ± 3,88
94,40 ± 11,18
98,00 ± 3,30
106,8 ± 10,06
Triglicerídeos
(mg/dL)
327,6 ± 147,4
256,8 ± 191,6
198,0 ± 113,9
470,4 ± 154,7
159,6 ± 38,40
86,40 ± 35,63*
AST/TGO (U/L)
212,0 ± 26,99
133,4 ± 16,64*
200,5 ± 33,72
208,7 ± 31,25
222,6 ± 27,98
227,5 ± 61,26
ALT/TGP (U/L)
48,80 ± 16,20
78,20 ± 37,81
70,20 ± 23,40
60,80 ± 14,23
102,6 ± 32,21
57,10 ± 32,61
Creatinina
0,27 ± 0,025
0,21 ± 0,02
0,22 ± 0,01
0,23 ± 0,01
0,22 ± 0,01
(mg/dL)
0,29 ± 0,02
103
5.3.4.6. Peso dos órgãos
No resultado da análise dos pesos dos órgãos dos animais, houve diferença significativa nos valores do peso do baço e
do fígado na dose de 2 g/kg i.p. (machos e fêmeas), bem como no rim e pâncreas apenas grupo 2 g/kg i.p. machos de Cqf-EtOH
quando comparados com o controle (Tabela 7).
Tabela 7. Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius (CqfEtOH 2 g/kg, i.p. e 5 g/kg, v.o.) e solução salina 0,9% em dose única e avaliados durante 14 dias (n=6 por grupo).
Parâmetros
Grupos
Controle Machos 2 g/kg Machos 5 g/kg Machos Controle Fêmeas 2 g/kg Fêmeas
5 g/kg Fêmeas
Baço (g)
0,10 ± 0,00
0,20 ± 0,01*
0,12 ± 0,01
0,12 ± 0,00
0,22 ± 0,00*
0,12 ± 0,01
Coração (g)
0,15 ± 0,01
0,18 ± 0,00
0,14 ± 0,00
0,16 ± 0,00
0,14 ± 0,00
0,15 ± 0,00
Estômago (g)
0,35 ± 0,03
0,42 ± 0,05
0,40 ± 0,02
0,49 ± 0,03
0,46 ± 0,02
0,45 ± 0,03
Fígado (g)
1,37 ± 0,05
1,90 ± 0,07*
1,45 ± 0,10
1,36 ± 0,02
1,64 ± 0,04*
1,34 ± 0,06
Rim (g)
0,19 ± 0,00
0,23 ± 0,01*
0,19 ± 0,01
0,19 ± 0,00
0,18 ± 0,01
0,18 ± 0,00
Pâncreas (g)
0,23 ± 0,01
0,33 ± 0,01*
0,20 ± 0,01
0,25 ± 0,00
0,31 ± 0,02
0,24 ± 0,00
Pulmão (g)
0,22 ± 0,00
0,25 ± 0,01
0,31 ± 0,08
0,24 ± 0,01
0,24 ± 0,01
Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Testet de Student p<0,05, comparado ao controle.
0,25 ± 0,01
5.3.4.7. Análise Macroscópica e Histológica
Na análise macroscópica dos órgãos, cinco fêmeas tratadas com
Cqf-EtOH na dose de 2 g/kg apresentaram fígado e baço com alterações de
consistência e duas com alteração na consistência e coloração do pâncreas,
enquanto o grupo de machos que receberam a mesma dose cinco
apresentaram alterações de consistência no fígado e no pâncreas e um no
baço. Nos grupos 5 g/kg v.o. fêmeas e machos não apresentaram nenhum
órgão com alteração macroscópica.
O fígado dos animais tratados com Cqf-EtOH não apresentaram
alterações na análise histológica (Figura 32). Ausência de lesões nos
hepatócitos, porém ocorreu apenas uma discreta hiperemia.
Na análise histológica os pâncreas dos animais que receberam o
Cqf-EtOH não
apresentaram
alterações, estando
o
parênquima
bem
preservado (Figura 33). Observa-se a presença de ilhotas pancreáticas e
ácinos pancreáticos em bom estado de conservação em todos os grupos.
Na análise histológica dos rins observam-se túbulos renais e
corpúsculo renal (Figura 34) com estruturas preservadas e ausência de sinais
de toxicidade.
104
Figura 32. Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de
Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqf-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqf-EtOH (5 g/kg v.o.). VC= ramo da veia
centrolobular; H= Hepatócito (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100 X).
105
Figura 33. Fotomicrografias de cortes histológicos do pâncreas de animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de
Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqf-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqf-EtOH (5 g/kg v.o.). AP= Ácinos pancreático;
IP= Ilhotas pancreáticas (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100 X).
106
Figura 34. Fotomicrografias de cortes histológicos dos rins de animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de
Cnidoscolus quercifolius: (A e D) controle, (B e E) Cqf-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C e F) Cqf-EtOH (5 g/kg v.o.) TR=Túbulos Renais; CR=
Corpúsculo Renal (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 100X).
107
6. DISCUSSÃO
108
6. DISCUSSÃO
No presente estudo, foi possível demonstrar pela primeira vez, o
efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Cqc-EtOH e Cqf-EtOH de
Cnidoscolus quercifolius, através de diversos testes farmacológicos para
avaliar as respostas nociceptivas e inflamatórias, geradas por diferentes
estímulos
nocivos.
Essa
atividade
antinociceptiva
e
anti-inflamatória
apresentadas por Cqc-EtOH e Cqf-EtOH, provavelmente estão associadas com
a diversidade de constituintes químicos que foram identificados na análise
fitoquímica preliminar dos extratos (Tabela 2).
Em relação aos constituintes presentes em Cqc-EtOH e Cqf-EtOH,
destaca-se a presença de flavonoides em ambos os extratos. Assim, as
atividades farmacológicas provavelmente estão relacionadas à presença desta
classe de substâncias, visto que esses possuem atividade anti-inflamatória,
devido à inibição da COX, da formação de granulação e do aumento da
permeabilidade capilar observado no início do processo inflamatório, além de
diminuir os riscos para úlceras gástricas (CARVALHO, 2004; SIMÕES et al.,
2010). No Cqf-EtOH há presença de triterpenos/esteroides que atuam na
reação imunológica e revelam efeitos bastante promissores quando utilizados
como anti-inflamatórios (CARVALHO, 2004; HUANG et al., 2012).
O primeiro teste realizado para avaliar a atividade antinociceptiva foi
o teste das contorções abdominais. Este modelo é empregado para o
screening inicial de novas moléculas com potencial analgésico, devido à sua
baixa especificidade, pois o teste é sensível à substâncias analgésicas de ação
central e/ou periférica (CARLINI; MENDES, 2011). O ácido acético, ao penetrar
na cavidade peritoneal dos camundongos, provoca dor inflamatória através da
indução da permeabilidade capilar e da liberação de substâncias endógenas
que excitam as terminações nervosas (KURIAN et al., 2006). A dor é gerada
através da liberação de mediadores endógenos como a bradicinina, serotonina,
capsaicina, além do envolvimento da liberação das ciclo-oxigenase através do
ácido araquidônico e da biossíntese de prostaglandinas (MELO et al., 2008).
Os nociceptores são sensíveis à ação de drogas anti-inflamatórias não
esteroides, como o ácido acetilsalicílico, e a analgésicos opioides, como a
109
morfina, daí ser considerado como um método inespecífico de nocicepção
(ROCHA et al., 2007).
A administração dos extratos Cqc-EtOH e Cqf-EtOH propiciou a
redução das contorções abdominais, após a aplicação do ácido acético de
maneira significativa.
Os resultados apresentados na Figura 11 (pág. 71)
apontam que quando os animais foram previamente tratados com Cqc-EtOH
(100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) as porcentagens de inibição foram de 83,7%,
81,4% e 88,1%, respectivamente, enquanto o pré-tratamento com Cqf-EtOH
(100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) demonstrados na figura 23 (pág. 90), promoveu as
porcentagens de inibição de: 71,3%, 79,4% e 98,7%, respectivamente. O grupo
controle para Cqc-EtOH e Cqf-EtOH apresentou 22,50 ± 2,90 e 39,00 ± 0,81 de
contorções respectivamente, indicando que Cqc-EtOH e Cqf-EtOH apresentem
agentes antinociceptivos.
No intuito de distinguir se o efeito do Cq-EtOH é de ação central ou
periférica, foi realizado o teste da lambida da pata induzida pela formalina.
Esse modelo atua promovendo um estímulo químico que induz a uma resposta
espontânea de dor, sendo o teste dividido em duas fases distintas, que refletem
diferentes tipos de dor (HUNSKAAR; HOLE, 1987). A primeira fase começa
imediatamente após a injeção da formalina e perdura por cerca de cinco
minutos. Essa fase é seguida por um período de quiescência, de cerca 510 min, após o qual se desenvolve a segunda fase da resposta, que se inicia
20-25 min após a injeção (PERAZA et al., 2007).
Cqc-EtOH e Cqf-EtOH diminuíram o tempo de lambida nas duas
fases, porém, o efeito foi mais significativo para ambos os extratos na segunda
fase, conforme demonstrado nas Figuras 12 (pág. 73) e 24 (pág. 91),
respectivamente. A diminuição do tempo das lambidas nas duas fases é
característica de drogas que atuam em nível central e a possibilidade de
interação com os receptores opioides. A primeira fase é mais sensível aos
analgésicos opiodes, porém a indometacina e o ácido acetilsalicílico
respondem melhor na segunda fase (SÁ et al., 2012). Assim, os extratos
apresentaram efeitos na segunda fase, apontando um possível efeito antiinflamatório.
O teste da placa quente realizado com Cqc-EtOH e Cqf-EtOH
demonstrou que os extratos apresentaram efeitos em algumas doses,
110
aumentando o tempo de permanência dos animais na placa aquecida. CqcEtOH aumentou o tempo de latência na dose de 400 mg/kg em 30 minutos,
conforme a Figura 13 (pág. 74) e Cqf-EtOH aumentou a latência na dose de
400 mg/kg no tempo de 90 e 120 minutos, como demonstrado na Figura 25
(pág. 92). Os extratos, especialmente Cqf-EtOH, nessas doses específicas
possivelmente exercem efeito antinociceptivo central, visto que esse teste
revela resposta de reflexo particularmente espinhal, com ação de drogas
analgésicas que atuam em nível central (LE BARS, 2001). A resposta eficaz
nessas doses dos extratos indica que há participação na estimulação térmica,
associada com a neurotransmissão central, em que o calor ativa nociceptores
(fibras Aδ e C) pela condução do impulso ao longo do corno dorsal da medula
espinhal até os centros corticais (PINHEIRO et al., 2011).
Analisando os resultados, percebe-se que os dois extratos
apresentam atividade antinociceptiva, com mecanismos de ação semelhantes,
com excesão para a dose de 400 mg/kg de ambos os extratos, principalmente
para o Cqf-EtOH, pois essas doses apresentaram mecanismo de ação central,
não descartando também a participação no mecanismo de ação periférica
dessas doses. As demais doses dos extratos apresentaram ação periférica. A
provável causa para que os extratos apresentem mecanismos de ação
diferentes, é devido ao fato de que foram utilizados extratos brutos com vários
constituintes químicos, ao passo que utilizar apenas substâncias isoladas
proporcionaria um aprimoramento maior do estudo.
Nardi et al. (2006) estudando a atividade antinociceptiva do extrato
etanólico das cascas de Croton celtidifolius (Euphorbiaceae), encontrou como
resultado, 75,9% de inibição ao administrar a dose 300 mg/kg v.o. no teste de
contorções abdominais. Já no teste da formalina, ao administrar a mesma
dose, a percentagem de inibição do extrato na primeira e segunda fase foram
de 11,6% e 76,2%, respectivamente.
Os testes para avaliar a atividade antinociceptiva envolvem uma
resposta motora, assim, drogas que promovam relaxamento muscular ou
sedação, levando à incoordenação motora, podem interferir com a resposta
sem serem necessariamente analgésicas, e o teste permite uma interpretação
mais
acurada
dos
resultados
obtidos
nos
testes
de
antinocicepção
(LAPA et al., 2003). Nesse sentindo, a coordenação motora dos animais após
111
receberem Cqc-EtOH e o Cqf-EtOH foi avaliada através do teste do rota-rod.
Os resultados revelaram que os extratos não alteraram a coordenação dos
camundongos na barra giratória, conforme demonstrado nas Figuras 14 (pág.
75) e 26 (pág. 93). O teste consiste em colocar os animais sobre uma barra
giratória a uma velocidade constante e mede o efeito de relaxamento muscular
ou de incoordenação motora produzido por efeito de drogas (ALMEIDA, 2006).
Outro fato relevante, é que ao receber o extrato bruto de uma planta, o animal
está recebendo muitas substâncias diferentes, que podem induzir efeitos
inespecíficos, como por exemplo, diminuir a atividade motora do animal
(CARLINI; MENDES, 2011).
A atividade antinociceptiva evidenciada nos testes das contorções
abdominais e da formalina, envolvem mecanismos anti-inflamatórios (COSTASOUZA, 2010). Nesse sentindo, buscando avaliar a possibilidade dos extratos
possuírem atividade anti-inflamatória, foram realizados dois testes: o primeiro
foi o da peritonite induzida por carragenina e o segundo foi o teste de edema
de pata induzida por carragenina.
O teste da peritonite induzida pela carragenina tem por objetivo,
investigar a migração de leucócitos para a cavidade peritoneal. Após a
administração da carragenina na cavidade peritoneal, ocorrem vários eventos,
tais como a migração de neutrófilos e leucócitos para a cavidade peritoneal,
além de promover a vasodilatação, o aumento da permeabilidade vascular e a
liberação de mediadores inflamatórios como TNF-α, IL-1β, prostanoides e
componentes do sistema complemento (PINHEIRO et al., 2011).
Cq-EtOH e Cqf-EtOH inibiram a migração de leucócitos em todas as
doses conforme Figuras 15 (pág. 76) e 27 (pág. 94), respectivamente,
provavelmente os extratos contêm substâncias que atuam no bloqueio da
síntese dos mediadores responsáveis pela quimiotaxia dos leucócitos, não
sendo possível estabelecer o mecanismo envolvido. Alguns fármacos antiinflamatórios diminuem a migração leucocitária, dentre eles, os antiinflamatórios esteroides como a dexametasona e alguns anti-inflamatórios não
esteroides como a indometacina (SCHIMMER; PARKER, 2001; COSTA –
E - SOUSA et al., 2010).
O segundo teste realizado para avaliar a atividade anti-inflamatória,
foi o teste de edema de pata. Esse modelo é composto por duas fases, sendo a
112
primeira avaliada entre 1 ou 1,5 horas após a injeção de carragenina, é
caracterizada pela formação de um edema não fagocítico, enquanto que a
segunda fase 2-5 hs após a injeção, sendo caracterizada por um aumento da
formação do edema, que permanece por até 5 horas (KHAN et al., 2009).
Assim, Cqc-EtOH inibiu o edema de pata significativamente em todas as horas
apenas na dose de 200 mg/kg, enquanto a dose de 100 mg/kg inibiu apenas a
partir da 3 h até 5 h. Enquanto, Cqf-EtOH inibiu o edema de pata apenas na
dose de 100 mg a partir da 4 h e 5 h. A primeira fase é resultante da ação
sequencial e integrada de vários mediadores inflamatórios, como a histamina,
serotonina, bradicinia, PAF, substância P nas primeiras 1 -1,5 horas, logo após
a segunda fase é mantida pela liberação de prostaglandinas, atingindo o pico
entre 4-6horas (LAPA et al., 2003). Os extratos atuaram no combate à
inflamação provavelmente através da inibição da atuação das prostaglandinas.
García-Rodríguez et al. (2014) estudando a atividade antiinflamatória de Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh (Euphorbiaceae), ao
administrar a dose de 500 mg/kg i.p. do extrato etanólico bruto das folhas no
teste do edema de pata, observaram que o mesmo não apresentou atividade
anti-inflamatória, enquanto que na administração do extrato da fase acetato de
etila, os resultados observados foram de 28,78% (p<0,05) de inibição do
edema após 3 horas da administração da carragenina.
As plantas medicinais podem produzir várias atividades biológicas
em seres humanos, porém, pouco se conhece sobre a toxicidade de algumas
espécies de uso na medicina tradicional. Nesse sentido, o principal critério
para uso de plantas medicinais deve ser a segurança (MUKINDA;
SYCE, 2007).
Foi observado no presente estudo que a administração do extrato
bruto das cascas de Cnidoscolus quercifolius não demonstrou toxicidade,
quando avaliados aspectos macroscópicos e microscópicos de alguns órgãos
(fígado, pâncreas e rim), somente algumas alterações nos parâmetros
hematológicos (neutrófilos) na dose de 2 g/kg i.p. e 5 g/kg v.o. O extrato bruto
das folhas também não demonstrou toxicidade, apresentando alterações
discretas nos parâmetros hematológicos (leucócitos) 2 g/kg i.p. machos. Os
extratos não ocasionaram a morte dos animais em até 24 horas após
receberem as doses de 2 g/kg i.p e 5 g/kg v.o.
113
A perda de peso corporal é um sinal característico observado na
maioria dos animais expostos a substâncias tóxicas, essa diminuição do peso
geralmente se manifesta dentro de alguns dias após a exposição, e resulta
numa redução substancial do tecido adiposo e do tecido muscular
(SANGEETHA et al., 2013). Durante 14 dias o peso corporal foi avaliado,
registrando um decréscimo no peso corporal dos animais apenas nos grupos
de fêmeas que receberam do Cqc-EtOH as doses de 2,0 g/kg i.p. e 5,0 g/kg
v.o., bem como nos animais que receberam o Cqf-EtOH nas doses de
2,0 g/kg i.p (fêmeas) e 5,0 g/kg v.o (machos).
No presente estudo, durante a avaliação comportamental dos
animais que receberam Cqc-EtOH na dose de 2 g/kg i.p, foram observadas
contorções abdominais, ptose palpebral, resposta ao toque diminuída e
ambulação diminuída, enquanto na dose de 5 g/kg os animais apresentaram
ambulação diminuída, ptose palpebral e diarreia. Na avaliação comportamental
de Cqf-EtOH foram observadas alterações apenas na dose de 2 g/kg i.p, tais
como contorções abdominais, ambulação diminuída e ptose palpebral. Os
comportamentos descritos na triagem comportamental servem para facilitar a
investigação da possível atividade do extrato no sistema nervoso central, bem
como indicar os efeitos do mesmo no comportamento dos animais
(ALMEIDA, 2006).
Na avaliação da toxicidade de plantas medicinais é de fundamental
importância avaliar as alterações hematológicas, visto que essas permitem a
detecção de alterações fisiopatológicas de animais em diferentes condições de
estresse e são capazes de indicar a toxicidade induzida por hemólise
(NUSSEY et al., 1995; GAYATHRI et al., 2010).
(CHCM), basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos, monócitos e neutrófilos),
após a administração de Cqc-EtOH os valores não mostraram variação
significativa, apenas o volume corpuscular médio (VCM) e hemoglobina
corpuscular média (HCM) na dose de 2 g/kg i.p. fêmeas e os neutrófilos na
dose de 5 g/kg v.o fêmeas que houve diferença estatística. Já na administração
de Cqf-EtOH provocou nos animais a diminuição dos valores de eosinófilos e
neutrófilos, bem como um aumento de leucócitos no grupo 2 g/kg i.p. machos.
114
Nos resultados dos parâmetros bioquímicos houve uma diminuição
nos valores de triglicerídeos dos animais machos que receberam o Cqc-EtOH
nas doses de 2 g/kg i.p. e 5 g/kg v.o., de glicose, no grupo machos na dose
5 g/kg v.o. e 2 g/kg i.p. fêmeas e nos níveis de ALT/TGP na dose 2 g/kg i.p. e
5 g/kg v.o. (fêmeas), enquanto a administração de Cqf-EtOH na dose de
2 g/kg i.p. machos provocou uma diminuição de AST/TGO.
A administração de Cqc-EtOH mostrou alteração macroscópica
apenas no fígado de animais tratados com 2 g/kg i.p e no baço de animais
tratados com 5 g/kg v.o. A análise macroscópica dos órgãos revelou que as
fêmeas tratadas com Cqf-EtOH na dose de 2 g/kg i.p apresentaram alterações
no fígado, baço e pâncreas, enquanto os machos que receberam a mesma
dose apresentaram alterações no fígado, pâncreas e baço. Os animais que
receberam a dose de 5 g/kg v.o não apresentaram nenhum órgão com
alteração macroscópica. Os órgãos que mostraram diferença significativa foram
o baço, o fígado, rim e pâncreas na dose 2 g/kg i.p.
Em relação ao estudo histopatológico do tecido hepático, não foram
observadas alterações nos animais tratados com os extratos de C. quercifolius.
O parênquima do órgão mostrou-se ausente de lesões em todos os grupos,
tanto para os animais que receberam Cqc-EtOH, quanto para os que
receberam Cqf-EtOH, conforme figuras 20 (pág. 86) e 29 (pág. 106),
confirmando que os extratos não ocasionaram toxicidade às células hepáticas.
O estudo histopatológico do órgão pâncreas dos animais tratados
com Cqc-EtOH e Cqf-EtOH demonstrou que os extratos não ocasionaram
lesões pancreáticas, pois todos os grupos apresentaram o parênquima muito
bem preservado, Ilhotas pancreáticas e ácinos pancreáticos em bom estado de
conservação em todos os grupos, conforme figuras 21 (pág. 87) e 30
(pág. 107). A análise histológica dos rins também não demonstrou sinais de
toxicidade, pois podem ser observados túbulos renais e corpúsculo renal com
estruturas preservadas e sem ausência de sinais de nefrotoxicidade nas figuras
22 (pág. 88) e 31 (pág. 108). Dessa forma, o estudo da toxicidade aguda indica
que o extrato etanólico bruto das cascas e folhas de Cnidoscolus quercifolius
não apresentou toxicidade, porém, outros estudos com diferentes metodologias
devem ser realizados, com o intuito de determinar uma melhor segurança dos
extratos.
115
7. CONCLUSÕES
116
7. CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir
que os extratos brutos das cascas e folhas da espécie Cnidoscolus quercifolius
apresentaram atividades antinociceptiva e anti-inflamatória relevantes nas
doses testadas. Cqc-EtOH e Cqf-EtOH demonstraram efeito antinociceptivo
envolvendo mecanismos centrais e periféricos, que podem está relacionados
aos receptores opioides, além de possuírem atividade anti-inflamatória,
comprovadas pela diminuição da migração leucocitária e provavelmente
envolve a inibição da síntese de mediadores pró-inflamatórios.
Em relação à segurança de C. quercifolius, pode-se afirmar que os
extratos são de baixa toxicidade, pois não houve mortes dos animais que
receberam os extratos nas doses de 2,0 e 5,0 g/kg por via intraperitoneal e
oral, respectivamente. Cqc-EtOH e o Cqf-EtOH não ocasionou toxicidade aos
animais durante a toxicidade aguda. Foram encontradas algumas alterações
hematológicas e bioquímicas no estudo, que ainda estão sendo investigadas
para melhor esclarecer a sua importância clínica, bem como, faz-se necessário
a realização de outros ensaios de toxicidade sub-crônica e crônica no intuito de
determinar o perfil de segurança dos extratos para que os mesmos possam se
tornar agentes seguros para uso terapêutico.
Dessa forma, todos os resultados apresentados nesse trabalho são
considerados inéditos para a espécie em estudo, contribuindo assim, para os
estudos farmacológicos e toxicológicos de plantas pertencentes ao Bioma
Caatinga, em especial para às espécies da família Euphorbiaceae. Outro fato
relevante é a contribuição do presente trabalho para o surgimento de novas
pesquisas científicas com a espécie C. quercifolius, bem como com outras
espécies da Caatinga utilizada na medicina popular.
117
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Avaliação
preliminar
da
atividade
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(antiespasmódica
e
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Medicinal
132
APÊNDICES
134
APÊNDICE A – Artigo I
Artigo I:
ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY OF THE ETHANOLIC EXTRACT
FROM BARKS AND LEAVES OF Cnidoscolus quercifolius
(EUPHORBIACEAE) IN MICE
135
ARTIGO I
Artigo submetido à:
Revista: Indian Journal of Pharmacology
Título: Antinociceptive activity of the ethanolic extract from barks and leaves of
Cnidoscolus quercifolius (Euphorbiaceae) in mice
Autores: Leandra Macedo de Araújo Gomes, Sarah Raquel Gomes de LimaSaraiva, Thayne Mayra Dantas de Andrade, Juliane Cabral Silva, Tâmara
Coimbra Diniz, Viviane Nunes Sousa Barreto, Lucindo José Quintans-Júnior,
Jullyana Siqueira de Sousa Quintans, Julianeli Tolentino de Lima, Jackson
Roberto Guedes da Silva Almeida.
136
Antinociceptive activity of the ethanolic extract from barks and
leaves of Cnidoscolus quercifolius (Euphorbiaceae) in mice
Leandra Macedo de Araújo Gomes1; Sarah Raquel Gomes de Lima-Saraiva2;
Thayne Mayra Dantas de Andrade1; Juliane Cabral Silva1, Tâmara Coimbra
Diniz1; Viviane Nunes Sousa Barreto1; Lucindo José Quintans-Júnior3, Jullyana
Siqueira de Sousa Quintans2, Julianeli Tolentino de Lima1, Jackson Roberto
Guedes da Silva Almeida1,*
1
Federal University of San Francisco Valley, 56.304-205, Petrolina,
Pernambuco, Brazil
2
Federal University of Pernambuco, 50.670-901, Recife, Pernambuco, Brazil
3
Federal University of Sergipe, 49.100-000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil
Running title: Antinociceptive activity of Cnidoscolus quercifolius
*Correspondence to: Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, E-mail:
[email protected]
137
ABSTRACT
Objectives: To evaluate the antinociceptive effect of the ethanolic extract from
barks (Cqb-EtOH) and leaves (Cql-EtOH) of Cnidoscolus quercifolius in mice
using experimental models of nociception.
Material and Methods: The antinociceptive activity was evaluated by writhing,
hot-plate and formalin tests. Additionally, the rota-rod test was used to evaluate
motor coordination.
Results: In the acetic acid-induced writhing test, the Cqb-EtOH (100, 200 and
400 mg/kg, i.p.) reduced the number of writhing by 83.70, 81.40 and 88.10%,
respectively,
while
Cql-EtOH reduced by
71.30,
79.40
and
98.70%,
respectively. In the formalin test, the extracts reduced the paw licking time in the
first and second phases, but the best results were observed in the second
phase (inflammatory pain), reducing by 66.08, 78.26 and 73.97%, as well as
60.11, 75.58 and 79.46% for Cqb-EtOH and Cql-EtOH, respectively. In the hot
plate test, the extracts increased the reaction time when compared to control
only at dose of 400 mg/kg. Using the rota-rod test, mice treated did not
demonstrate any significant motor performance changes.
Conclusions: It can be concluded that extracts from the barks and leaves of C.
quercifolius have antinociceptive activity which supports the popular use of this
plant to treat pain.
KEY WORDS: Cnidoscolus quercifolius; Euphorbiaceae; pain; inflammation.
Running title: Antinociceptive activity of Cnidoscolus quercifolius
138
Introduction
Medicinal plants are used over the years by humanity in order to promote
healing for diseases and pain relief, with several clinical procedures registered
with them. So, while allopathic medicine has obtained a breakthrough from the
second half of the XX century, there are still some barriers in their use by
disadvantaged populations. Thus, the use of medicinal plants stood out among
the poorest people in developing countries due to its easy to obtain and great
tradition of using medicinal plants.[1]
Many ethnopharmacological studies in Brazil have shown that a large
number of plant species are used by the local population to treat their diseases
particularly the family Euphorbiaceae, which has great medicinal use, as well as
the highly cited genus Cnidoscolus, popularly known as “urtiga” or “favela”. This
genus has 50 to 75 representatives, which are predominantly concentrated in
tropical America, almost exclusively in Mexico and northeastern Brazil.[2,3] The
distinct feature of this genus is the presence of stinging trichomes that, when
stimulated by contact with skin, can cause severe and localized pain.[4]
In the Caatinga biome, this genus is represented by four Cnidoscolus
medicinal species (C. infestus, C. pubescens, C. quercifolius and C. urens),
which are utilized for a variety of indications, including as an anti-inflammatory,
an antitumor agent for the genito-urinary system, an antiseptic and to treat
kidney infections, dermatological and ophthalmic lesions, bruises, fractures,
wounds, warts, dysentery, hemorrhage, appendicitis and rheumatism.[3, 5-7]
Cnidoscolus quercifolius is a species known as “faveleira” and “faveleira”,
and is a deciduous species, heliophytic, which occurs in xerophytic woods and
exhibits irregular dispersion. The species has been used in reforestation of
139
eroded areas of different soil habitats in the Caatinga. C. quercifolius also has
high economic value to be used as a food source for local populations and
livestock.[8] Several species of the genus Cnidoscolus are used in folk medicine
for treatment of diseases, including pain and inflammation.[7]
In our continuing search of the pharmacological properties of species
from the Caatinga biome, in the present paper we demonstrate the
antinociceptive effects of crude ethanol extracts from barks and leaves of C.
quercifolius in experimental models in mice.
Materials and methods
Drugs and chemicals
Acetic acid, formaldehyde, indomethacin and polyoxyethylenesorbitan
monolated (Tween 80) were purchased from Sigma (USA) and morphine was
obtained from União Química (Brazil). All drugs and extracts were administered
intraperitoneally (i.p.) in volumes of 0.1 mL/10 g (mice).
Plant material
The barks and leaves of C. quercifolius Pohl. were collected in the city of
Petrolina (Coordinates: S 09º03’55”; W 40º20’06”), State of Pernambuco, Brazil,
in February of 2012. The sample was identified by a biologist from EMBRAPA
Semiárido. A voucher specimen (19202) was deposited at the Herbarium Vale
do São Francisco (HVASF) of the Federal University of San Francisco Valley.
Extraction
140
The barks and leaves were dried and pulverized (1481 g and 482 g,
respectively), and macerated with ethanol 95% at room temperature for 72 h.
The solution was filtered and concentrated under reduced pressure in a rotatory
evaporator at 50 °C, producing 0.392 g of crude ethanol extract of barks (CqbEtOH, 13.07% yield on dry weight of the plant) and 0.063 g of crude ethanol
extract of leaves (Cql-EtOH, 26.46% of yield on dry weight of the plant).
Animals
Adult male albino Swiss mice (30-40 g) were used throughout this study.
The animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h
light/dark cycle with free access to food and water. Mice were used in groups of
six animals each, according to the requirements of individual experiments. All
tests were carried out by the same visual observer. Experimental protocols and
procedures were approved by Federal University of San Francisco Valley
Animal Care and Use Committee by number 0030/82012.
Pharmacological experiments
Acetic acid-induced writhing in mice
This test was performed as described by Collier et al.[9] with
modifications. Male mice (n= 6) were intraperitoneally pre-treated 30 min before
the nociceptive agent, acetic acid 0.9% (v/v, 0.1 ml/ 10 kg). Vehicle (saline +
drops of tween 80), Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.),
indomethacin (20 mg/kg, i.p.) and morphine (10 mg/kg, i.p.) were administered
before acetic acid injection. Following the injection of acetic acid, the intensity of
141
nociceptive behavior was quantified by counting the total number of writhes
occurring between 5 and 15 min after injection of the acetic acid.
Formalin test
The method used was described by Hunskaar and Hole[10] with some
modifications. Twenty microliters of 2.5% formalin was injected subcutaneously
into the right hind paw of male mice. The time (in seconds) spent in licking and
biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain response.
Responses were measured for 0-5 min (first phase, neurogenic phase) and 1530 min after formalin injection (second phase, inflammatory phase). Cqb-EtOH
and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.), indomethacin (20 mg/kg, i.p.) and
morphine (10 mg/kg, i.p.) were administered 60 min before the formalin
injection. Control animals received the same volume of saline with drops of
tween 80. Mice were observed in the chambers with a mirror mounted on three
sides to allow view of the paws.
Hot plate test
Mice were divided into five groups of six mice each. Mice were preselected on the hot plate at 55 ± 0.5 oC. Licks on the rear paws were the
parameters of observation. Animals showing a reaction time (latency for licking
the hind feet or jumping) greater than 20 s were discarded. The mice were then
treated with Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.), vehicle
(saline + drops of tween 80 i.p.) and morphine (10 mg/kg i.p.). The animals
were placed individually on a hot plate with constant temperature (55 ± 0.5 °C)
and the latency was measured at 30, 60, 90 and 120 min after administration of
142
extracts and morphine.[11] In order to protect the animal from potential tissue
damage, was chosen a cutoff time of 20 s.
Motor coordination test (rota-rod test)
A rota-rod treadmill device (Insight, Brazil) was used for the evaluation of
motor coordination.[12] Initially, 24 h before the test, mice capable of remaining
on the rota-rod apparatus longer than 180 s (7 rpm) were selected. Thirty
minutes after administration of Cqb- EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400
mg/kg, i.p.), vehicle (saline + drops of tween 80) or diazepam (DZP, 2.5 mg/kg,
i.p.), each animal was tested in the rota-rod apparatus for 0.5, 1 and 2 h posttreatment, and time (s) the rats were able to remain on top of the bar was
recorded for 180 s.
Statistical analysis
The data are expressed as the means ± S.E.M., and statistical
significance was determined using an analysis of variance (ANOVA) followed by
Dunnett’s test. All analysis was performed with the GraphPad Prism 4.0
program. Values were considered significant at p < 0.05.
Results
Acetic acid-induced writhing in mice
The intraperitoneal administration of Cqb-EtOH (100, 200 and 400
mg/kg) decreased significantly (p < 0.01) the number of writhing movements
induced by the administration of the acetic acid when compared with the control
143
group (Figure 1). The inhibitions of writhes in percentage were 83.70, 81.40 and
88.10%, respectively.
INSERT FIGURE 1
The administration of Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) also
decreased significantly (p < 0.01) the number of writhing movements (Figure 2).
The inhibitions of writhes in percentage were 71.30, 79.40 and 98.70%,
respectively.
INSERT FIGURE 2
Formalin test
The results of the formalin test are shown in Figures 3 and 4. Cqb-EtOH
caused a significant inhibition of both neurogenic and inflammatory phases in
the licking induced by formalin. The result was most significative in the
inflammatory phase. Cqb-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.) decreased by
31.62, 51.10 and 68.33%, respectively, the paw licking time in the first phase,
as well as 66.08, 78.26 and 73.97%, respectively, the second phase of the
formalin test.
INSERT FIGURE 3
The Cql-EtOH extract also caused a significant inhibition of both
neurogenic and inflammatory phases in the formalin test. The result was most
144
significative in the inflammatory phase. Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.)
decreased by 44.28, 29.05 and 36.27%, respectively, the paw licking time in the
first phase, as well as 60.11, 75.58 and 79.46%, respectively, in the second
phase of the formalin test.
INSERT FIGURE 4
Hot plate test
In the hot plate test, significant effect was observed only at dose of 400 mg/kg
of Cqb-EtOH in the time of 30 min (p < 0.05), while the administration of CqlEtOH showed an increase in latency time for the dose of 400 mg/kg at 90 and
120 minutes after administration (Figures 5 and 6).
INSERT FIGURE 5
INSERT FIGURE 6
Motor coordination test (rota-rod test)
In this test, Cqb-EtOH and Cql-EtOH did not impair motor coordination at
0.5, 1 and 2 h post-administration. Diazepam (2.5 mg/kg) caused a significant
decrease in time that the animals remained on the rota-rod apparatus,
compared to the control group (Figures 7 and 8).
INSERT FIGURE 7
INSERT FIGURE 8
145
Discussion
This study showed for the first time the antinociceptive effect of crude
extracts obtained from bark and leaves of Cnidoscolus quercifolius in different
nociceptive
responses
generated
by
different
noxious
stimuli.
Three
experimental models were used to assess the antinociceptive activity and a
model was used to assess motor coordination.
In folk medicine in the Northeast of Brazil, the decoction, infusion and
maceration of the stem bark and inner bark of C. quercifolius are used against
ovarian inflammation and general inflammation.[13]
The first test conducted to evaluate the antinociceptive activity was the
abdominal writhing test. This model is employed for the initial screening of new
molecules with potential analgesic. Due to its low selectivity, most agents cause
a change in the number of writhes, as other models should be tested. Pain is
generated through the release of endogenous mediators such as bradykinin
and serotonin, besides the involvement of cyclooxygenase release of
arachidonic acid through the biosynthesis of prostaglandins.[14] Thus, the
administration of Cq-EtOH from barks and leaves can cover hypothesized to act
by inhibiting prostaglandin synthesis.
To distinguish between the central and peripheral antinociceptive action
of the extracts, the formalin test was performed. This model acts to promote a
chemical stimulus that induces a spontaneous response to pain, being divided
into two distinct phases, which reflect different types of pain.[10] The first phase
(neurogenic pain) starts immediately after injection and lasts for approximately
five minutes, this stage is followed by a quiescent period of about 5-10 minutes,
after which develops a second phase (inflammatory pain) response, which
146
starts 15-30 minutes after injection.[10] In this experiment, the Cqb-EtOH and
Cql-EtOH decreased the licking time in both phases, but the effect was more
significant for both extracts in the second phase. The decrease of licking time in
both phases is characteristic of drugs acting at the central level and the
possibility of interaction with opioid receptors. The first stage is more sensitive
to opioid analgesics, but indomethacin and acetylsalicylic acid respond better in
the second phase.[15] The extracts showed effects in the second phase,
indicating a possible anti-inflammatory effect.
The evaluation of Cqb-EtOH and Cql-EtOH administration with the hot
plate showed that the extracts presented effect in the hot plate test. The CqbEtOH extract increased the latency time at dose of 400 mg/kg after 30 minutes.
The Cql-EtOH extract increased the latency time at dose of 400 mg/kg after 90
and 120 minutes. As the hot plate test is a specific central antinociceptive test, it
is possible that Cqb-EtOH and Cql-EtOH exerts an antinociceptive effect at
least in part through central mechanisms. This result is similar to what was
observed in the formalin test with Cqb-EtOH and Cql-EtOH inhibiting of both
phases of nociception.
Finally, to assess whether Cqb-EtOH and Cql-EtOH produces a loss of
motor coordination in animals, a rota-rod test was performed. The results
revealed that the extracts did not produce changes in motor coordination of
treated animals.
It can be concluded that the
Cqb-EtOH and Cql-EtOH have
antinociceptive activity, its effect is probably mediated by inhibition of peripheral
and central mediators, however, the extracts did not affect motor coordination of
animals. Thus, our results confirm that Cnidoscolus quercifolius has therapeutic
147
potential to act in combating of pain, corroborating its popular use. Other
studies are underway to enable us to understand the precise mechanisms of
action of Cqb-EtOH and Cql-EtOH.
Acknowledgements
The authors are grateful to the Brazilian agencies CNPq, CAPES and
FACEPE for financial support.
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Figure 1: Effect of ethanolic extract of barks of Cnidoscolus quercifolius (CqbEtOH 100, 200 and 400 mg/kg), indomethacin (INDO 20 mg/kg) and morphine
(MORPH 10 mg/kg), on acetic acid induced writhing test in mice. Values are
mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from control, ANOVA followed
Dunnett’s test (n = 6, by group).
Number of writhings
30
20
10
**
**
100
200
**
**
400
INDO
**
0
Control
Cqb-EtOH (mg/kg)
MORPH
150
Figure 2: Effect of ethanolic extract of leaves of Cnidoscolus quercifolius (CqlEtOH 100, 200 and 400 mg/kg), indomethacin (INDO 20 mg/kg) and morphine
(MORPH 10 mg/kg), on acetic acid induced writhing test in mice. Values are
mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from control, ANOVA followed
Dunnett’s test (n = 6, by group).
Number of writhings
40
30
20
**
10
**
**
0
Control
100
200
400
Cql-EtOH (mg/kg)
**
INDO
**
MORPH
151
Figure 3: Effect of ethanolic extract of barks of Cnidoscolus quercifolius (CqbEtOH 100, 200 and 400 mg/kg), indomethacin (INDO 20 mg/kg) and morphine
(MORPH 10 mg/kg), on formalin test (first and second phase) in mice. Values
are mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from control; ANOVA
followed Dunnett’s test (n = 6, by group).
First phase
Licking time (s)
60
50
40
*
30
**
20
**
10
**
0
Control
100
200
400
INDO MORPH
Cqb-EtOH (mg/kg)
Second phase
Licking time (s)
200
150
100
**
50
**
**
**
**
0
Control
100
200
400
Cqb-EtOH (mg/kg)
INDO
MORPH
152
Figure 4: Effect of ethanolic extract of leaves of Cnidoscolus quercifolius (CqlEtOH 100, 200 and 400 mg/kg), indomethacin (INDO 20 mg/kg) and morphine
(MORPH 10 mg/kg), on formalin test (first and second phase) in mice. Values
are mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from control; ANOVA
followed Dunnett’s test (n = 6, by group).
First phase
Licking time (s)
60
50
40
*
**
30
**
20
10
**
0
Control
100
200
400
INDO
MORPH
Cql-EtOH (mg/kg)
Second phase
Licking time (s)
200
150
100
**
**
50
**
**
**
0
Control
100
200
400
Cql-EtOH (mg/kg)
INDO
MORPH
153
Figure 5: Effect of ethanolic extract of barks of Cnidoscolus quercifolius (CqbEtOH 100, 200 and 400 mg/kg) and morphine (MORPH 10 mg/kg), on hot plate
test in mice. Values are mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from
control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, by group).
20
*
Latency time (s)
**
*
15
*
*
10
Control
Cqb-EtOH 100 mg/kg
Cqb-EtOH 200 mg/kg
Cqb-EtOH 400 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
5
0
30
60
90
120
Time (min)
Figure 6: Effect of ethanolic extract of leaves of Cnidoscolus quercifolius (CqlEtOH 100, 200 and 400 mg/kg) and morphine (MORPH 10 mg/kg), on hot plate
test in mice. Values are mean ± S.E.M. *p < 0.05, significantly different from
control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, by group).
20
**
Latency time (s)
**
****
15
****
10
5
0
30
60
90
Time (min)
120
Control
Cql-EtOH 100 mg/kg
Cql-EtOH 200 mg/kg
Cql-EtOH 400 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
154
Figure 7: Effect of ethanolic extract of barks of Cnidoscolus quercifolius (CqbEtOH 100, 200 and 400 mg/kg) and diazepam (2.5 mg/kg), on motor
coordination test in mice (rota-rod test). Values are mean ± S.E.M. *p < 0.05,
significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, by
group).
Time (s) on Rota-rod
200
150
**
**
**
100
Control
Cqb-EtOH 100 mg/kg
Cqb-EtOH 200 mg/kg
Cqb-EtOH 400 mg/kg
Diazepam 2.5 mg/kg
50
0
2h
1h
0.5 h
Figure 8: Effect of ethanolic extract of leaves of Cnidoscolus quercifolius (CqlEtOH 100, 200 and 400 mg/kg) and diazepam (2.5 mg/kg), on motor
coordination test in mice (rota-rod test). Values are mean ± S.E.M. *p < 0.05,
significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, by
Time (s) on Rota-rod (s)
group).
200
150
**
**
**
100
50
0
0.5 h
1h
2h
Control
Cql-EtOH 100 mg/kg
Cql-EtOH 200 mg/kg
Cql-EtOH 400 mg/kg
Diazepam 2.5 mg/kg
155
APÊNDICE B – Carta de submissão
156
APÊNDICE C – Artigo II
Artigo II:
PHYTOCHEMICAL SCREENING AND ANTI-INFLAMMATORY
ACTIVITY OF Cnidoscolus quercifolius (EUPHORBIACEAE) IN
MICE
157
ARTIGO II
Artigo submetido à:
Revista: Pharmacognosy Research
Título: Phytochemical screening and anti-inflammatory activity of Cnidoscolus
quercifolius (Euphorbiaceae) in mice
Autores: Leandra Macedo de Araújo Gomes, Thayne Mayra Dantas de
Andrade, Juliane Cabral Silva, Julianeli Tolentino de Lima, Lucindo José
Quintans-Júnior, Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.
158
Phytochemical Screening and Anti-inflammatory Activity of
Cnidoscolus quercifolius (Euphorbiaceae) in Mice
LMA Gomes1; TMD Andrade1; JC Silva1, JT Lima1, LJ Quintans-Júnior2,
JRGS Almeida1,*
1
Center of Studies and Research of Medicinal Plants (NEPLAME), Federal
University of San Francisco Valley, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil
2
Department of Physiology, Federal University of Sergipe, 49.100-000, São
Cristóvão, Sergipe, Brazil
Correspondence Address:
J R G S Almeida
Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal
do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil
E-mail: [email protected]; Phone/Fax: +55-87-21016862
159
ABSTRACT
Background: Cnidoscolus quercifolius is a species popularly known as
“faveleira”, and belonging to the Caatinga biome (semi-arid vegetation, Brazil),
where is used in folk medicine as an anti-inflammatory. Objective: To evaluate
the anti-inflammatory effect of the ethanolic extract from barks (Cqb-EtOH) and
leaves (Cql-EtOH) of Cnidoscolus quercifolius in mice using experimental
models of inflammation. Material and Methods: The preliminary phytochemical
analysis of the ethanolic extract was performed. The anti-inflammatory activity
was evaluated by paw edema induced by carrageenan and leukocytes
migration to the peritoneal cavity induced by carrageenan methods. Results: A
preliminary analysis of Cqb-EtOH revealed that it contained coumarins,
flavonoids, monoterpenes/diterpenes and naphthoquinones, while the Cql-EtOH
showed positive reaction to coumarins, anthracene derivatives, flavonoids,
lignans and triterpenes/steroids. Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400
mg/kg) inhibited significantly (p < 0.01) the increase in the edema volume after
administration of carrageenan. In the peritonitis test, acute pre-treatment with
Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) inhibited the leukocyte
migration. Conclusions: It can be concluded that extracts from the barks and
leaves of C. quercifolius have anti- inflammatory activity which supports the
popular use of this plant to treat inflammation. Thus, extracts has significant
anti-inflammatory properties, which are related probably to inhibition of release
of mediators of the inflammatory process.
Key words: Cnidoscolus quercifolius; Euphorbiaceae; inflammation, medicinal
plants.
160
Introduction
The Euphorbiaceae family is considered of big economic importance among the
Angiosperms.[1] It is characteristic of this family the occurrence of various
secondary metabolites, among which stand out alkaloids, flavonoids, tannins
and coumarins.[2] Another important class of secondary metabolites present in
species of this family are the diterpenes, as they are considered the most
characteristic group of substances in this complex family.[3]
Inside the family Euphorbiaceae is the genus Cnidoscolus, which is well
represented in Brazil (about 18 species), especially in the northeastern (about
10 species), and this region is one of the probable centers of diversity of
Cnidoscolus.[4] In relation to the phytochemistry, there are reports of the
presence of alkaloids and terpenoids in the genus Cnidoscolus.[5]
[6]
Chemical
investigation of C. phyllacanthus had led to isolation of three new terpenoids
from the barks: a bis-nor-diterpene, phyllacantone and two triterpenes, 3β-Ocinnamoyl-lupeol and 3β-O-dihidrocinnamoyl-lupeol.[7]
Cnidoscolus quercifolius Pohl. is a species popularly known as “faveleira” and
“faveleira”, the tree is known to possess stinging trichomes distributed
throughout the plant. This species produces latex, which is widely used for
medicinal purposes. It´s roots are tuberous and store nutrients used during the
dry season, a period when flowering and fruiting of this species occurs. [8]
Regarding use in folk medicine, C. quercifolius is used to fight inflammation.[9]
161
The inflammation is the earliest organic response before tissue damage or
infection. Before a tissue injury, the local accumulation of prostaglandins,
thromboxanes and other chemical mediators cause a change in the threshold
nociceptors, resulting in hyperalgesia.[10] [11] The inflammatory process is part of
a mechanism of host defense against stimuli that cause injuries, but when this
process is not controlled, can damage the health of the individual. [12] The
cardinal signs that identify the inflammation are heat, flushing (redness), tumor
(swelling), pain and loss of function, of which the first four were described by
Cornelius Celsus.[13]
Considering the large consumption in our region and scarcity of chemical and
pharmacological studies about this species, in our continuing search of the
pharmacological properties of species from the Caatinga biome, in this paper
we demonstrate the anti-inflammatory effects of crude ethanol extracts from
barks and leaves of C. quercifolius in experimental models in mice.
Materials and methods
Plant material
The barks and leaves of C. quercifolius Pohl. were collected in the city of
Petrolina (Coordinates: S 09º03’55”; W 40º20’06”), State of Pernambuco, Brazil,
in February of 2012. The sample was identified by a biologist from EMBRAPA
Semiárido. A voucher specimen (19202) was deposited at the Herbarium Vale
do São Francisco (HVASF) of the Federal University of San Francisco Valley.
162
Preparation of the extracts
The barks and leaves were dried and pulverized (1481 g and 482 g,
respectively), and macerated with ethanol 95% at room temperature for 72 h.
The solution was filtered and concentrated under reduced pressure in a rotatory
evaporator at 50 °C, producing 0.392 g of crude ethanol extract of barks (CqbEtOH, 13.07% yield on dry weight of the plant) and 0.063 g of crude ethanol
extract of leaves (Cql-EtOH, 26.46% of yield on dry weight of the plant).
Animals
Adult male albino Swiss mice (30-40 g) were used throughout this study. The
animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h
light/dark cycle with free access to food and water. Mice were used in groups of
six animals each, according to the requirements of individual experiments. All
tests were carried out by the same visual observer. Experimental protocols and
procedures were approved by Federal University of San Francisco Valley
Animal Care and Use Committee by number 0030/82012.
Preliminary phytochemical screening
Preliminary phytochemical analyses of the extracts were performed as
described by Wagner and Bladt,[14] seeking to highlight the major groups of
secondary
metabolites.
It
was
evaluated
the
presence
of
alkaloids,
anthocyanins, coumarins, anthracene derivatives, flavonoids, lignans, mono
and diterpenes, naphthoquinones, saponins, steroids and terpenoids.
163
Pharmacological experiments
Carrageenan-induced hind paw edema
The test of paw edema induced by carrageenan 2% consists of injecting a
volume of 20 µl/animal in the subplantar region (s.pl.), the right paw of the
mouse.[15] Subsequently, to assess the extent of the volume of the paws
immersed itself right paw to the lateral malleolus in an electric plethysmometer.
The mice were divided into five groups of six animals each. The animals were
treated with Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.), vehicle
(saline) and indomethacin (20 mg/kg, i.p.) 30 minutes before the injection of
carrageenan. The mice pedal volume up to the ankle joint was measured using
plethysmometer (PanLab LE 7500, Spain) before (VA, baseline) the intraplantar
administration of carrageenan and 1, 2, 3, 4 and 5 h after (VB), as described
previously.[16] The inhibition of the edema paw was calculated by (VB-VA)/VA,
where VA is the volume of the right hind paw before carrageenan injection, and
VB is the volume of the right hind paw after carrageenan injection.
Leukocyte migration to the peritoneal cavity
The animals were divided into five groups of six animals each. Leukocyte
migration was induced by injection of carrageenan (1%, i.p., 0.25 mL) into the
peritoneal cavity 1 h after administration of Cqb-EtOH and Cql-EtOH (100, 200
and 400 mg/kg i.p.), vehicle (saline, i.p.) and dexamethasone (2 mg/kg, i.p.), the
solution of carrageenan was administered 30 minutes later of pre-treatments.
The migration of leukocytes was measured 4 hours after stimulation, and the
animals euthanized and cells were harvested from the peritoneal cavity with 3
164
ml of saline containing 1 mM EDTA. Immediately, a short massage was
performed and then the peritoneal fluid was collected, it was centrifuged (3000
rpm for 6 min) at room temperature. The supernatant was discarded and 300 μl
of EDTA was added to the precipitate, which was removed at a rate of 10 μl.
200 μl solution Turk at the rate and total cells were counted in a Neubauer
chamber, in an optical microscope was added. The results were expressed as
the number of leukocytes/ml.[17]
Statistical analysis
The data are expressed as the means ± S.E.M., and statistical significance was
determined using an analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test.
All analysis was performed with the GraphPad Prism 4.0 program. Values were
considered significant at p < 0.05.
Results
Preliminary phytochemical screening
The preliminary phytochemical analysis indicated a positive reaction for the
presence
of
coumarins,
flavonoids,
monoterpenes/diterpenes
and
naphthoquinones in Cqb-EtOH, while the Cql-EtOH showed positive reaction to
coumarins, anthracene derivatives, flavonoids, lignans and triterpenes/steroids.
However, Cqb-EtOH showed negative for the presence of alkaloids,
anthocyanins,
anthracene
derivatives,
lignans,
saponins
and
triterpenes/steroids and Cql-EtOH negative for alkaloids, anthocyanins,
165
monoterpenes/diterpene quinones, saponins and triterpenes/steroids. The
results are presented in the Table 1.
INSERT TABLE 1
Carrageenan-induced hind paw edema
The paw edema induced by carrageenan test revealed an anti-inflammatory
effect of the extracts. Pre-treatment with Cqb-EtOH (i.p.) significantly inhibited
at all times only at the dose of 200 mg/kg (p < 0.01), whereas a dose of 100
mg/kg inhibited only from 3 h to 5 h (p < 0.01) after using the carrageenan
induced edema (Figure 1).
INSERT FIGURE 1
The paw edema induced by carrageenan in mice was reduced after pretreatment with the Cql-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.). The edema was
significantly inhibited only at a dose of 100 mg from 4 h (p < 0.01) and 5 h (p <
0.01) (Figure 2).
INSERT FIGURE 2
Leukocyte migration to the peritoneal cavity
The i.p. administration of Cqb-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg), 1 h before
injection of carrageenan (1%, i.p., 0.25 ml) inhibited leukocyte migration (p <
0.01) when compared to the control group (Figure 3).
166
INSERT FIGURE 3
Pre-treatment with crude ethanolic extract of leaves (Cql-EtOH 100, 200 and
400 mg/kg, i.p.) 1 h before carrageenan injection also inhibited leukocyte
migration (p < 0.01) when compared to the control group (Figure 4).
INSERT FIGURE 4
Discussion
In the present study, we demonstrate for the first time, the anti-inflammatory
effects of crude ethanol extract of the barks and leaves of C. quercifolius
through various inflammatory responses. This anti-inflammatory effects
presented by Cqc-EtOH and Cqf-EtOH, are probably associated with a variety
of chemical constituents that were identified in the preliminary phytochemical
analysis of the extracts (Table 1).
In the evaluation of anti-inflammatory activity, the paw edema test was
performed. This model consists of two stages, the first being evaluated between
1 to 1.5 hours after carrageenan injection is characterized by the formation of a
non-phagocytic edema, whereas the second stage 2-5 hours after injection, is
characterized by increased formation of edema, which remains to 5 hours.[18]
Inflammation induced by carrageenan involves three distinct phases of release
of the mediators. In the first phase occurs liberation of serotonin and histamine
(0–2 h), in the second phase kinins are liberated (3 h), and prostaglandin in the
167
third phase (after 4 h).[19] Thus, the Cqb-EtOH inhibited paw edema significantly
at all times only at the dose of 200 mg/kg, while the dose of 100 mg/kg inhibited
only from 3 h to 5 h, while the Cql-EtOH inhibited paw edema at a dose of only
100 mg from 4 h to 5 h.
The inflammation produced by injection of carrageenan into the peritoneal
cavity is slow and prolonged, making it possible to evaluate the leakage of
liquid, as well as cell migration, besides the participation of cytokines, enzymes,
and chemical mediators, such as nitric oxide, prostaglandin E 2, IL-1β, IL-6 and
TNF-α, by utilizing different phlogistic agents.[20] In the test of carrageenaninduced peritonitis, Cqb-EtOH and Cql-EtOH inhibited the leukocyte migration at
all tested doses. Probably the extracts contain substances that act in blocking
the synthesis of mediators responsible for leukocyte chemotaxis, and it is not
possible to establish the mechanism involved.
The present study has demonstrated that crude ethanol extracts of the barks
and leaves of C. quercifolius has significant anti-inflammatory properties, which
are related probably with inhibition of release of mediators of the inflammatory
process, such as prostaglandins, histamine and neutrophils.
Conclusion
It can be concluded that extracts from the barks and leaves of C. quercifolius
have anti-inflammatory activity, which supports the popular use of this plant to
treat inflammation.
168
Acknowledgements
The authors are grateful to the Brazilian agencies CNPq, CAPES and FACEPE
for financial support.
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20.
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profiles during carrageenan-induced inflammatory hyperalgesia in rat
muscle and hind paw. J Pain 2007;8:127-36.
171
APÊNDICE D – Carta de submissão
172
APÊNDICE E – Certificado
173
APÊNDICE F – Resumo
VIII JIC/
II JOINT/
II Mostra de Pós-graduação
VIII Jornada de Iniciação Científica
II Jornada de Iniciação em Desenvolvimento
Tecnológico e Inovação
II Mostra de pós-Graduação
21 a 23 de novembro de 2013
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO
MOTORA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS CASCAS DE
Cnidoscolus quercifolius (EUPHORBIACEAE)
Leandra Macedo de Araújo Gomes1,2, Thayne Mayra Dantas de Andrade2, Sarah
Raquel Gomes de Lima Saraiva3, Viviane Nunes Sousa Barreto2, Tâmara Santos
Diniz2, Juliane Cabral Silva2, Jackson R. G. S. Almeida1,2, Julianeli T. de Lima1,2
1
Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido, Campus Petrolina, Av.
José de Sá Maniçoba, S/N, centro - Petrolina – PE CEP: 56304-205.
2
Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Laboratório de Bioquímica e Fisiologia,
Universidade Federal de Vale do São Francisco.
3
Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal de Pernambuco.
Introdução
A planta conhecida popularmente como faveleira, de nome científico
Cnidoscolus quercifolius (Euphorbiaceae), é uma das espécies pertencentes ao bioma
caatinga, que se destaca pela sua extraordinária resistência à seca. Seu emprego
popular consiste em recuperar áreas degradadas, na alimentação animal e humano,
na medicina popular, serrarias e como fonte de energia, dentre outros usos (NETO et
al., 2009).
Em relação à dor, esta é uma modalidade sensorial que em muitos casos
representão o único sintoma para o diagnóstico de várias doenças. Ela tem muitas
vezes uma função protetora. Já o processo inflamatório consiste na resposta orgânica
mais precoce diante de lesão tissular ou infecção. Perante um trauma tissular, o
acúmulo local de prostaglandinas, tromboxanos e outros mediadores químicos
ocasionam uma alteração no limiar de nociceptores, com consequente hiperalgia
(ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001; KUMMER & COELHO, 2002).
Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade
antinociceptiva e motora do extrato etanólico bruto das cascas de Cnidoscolus
quercifolius. Em levantamento bibliográfico realizado nos principais bancos de dados
sobre estudos com plantas medicinais, não foram encontrados registros de estudos
com essa espécie e sua ação antinociceptiva.
Materiais e Métodos
O material vegetal foi coletado no município de Petrolina, na Empresa
Brasileira de Pesquisas Agropecuárias - Embrapa Semiárido. A coleta e identificação
174
foram realizadas por um botânico, e a exsicata da espécie foi depositada no Herbário
Vale do São Francisco (HVASF), no Centro de Referência para Recuperação de Áreas
Degradadas (CRAD) na UNIVASF sob a identificação de número 19202.
O material vegetal (cascas) foi levado à estufa à temperatura média de 40 °C
por um período de 72 horas. Após a secagem e completa estabilização o material foi
pesado e pulverizado. O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à
maceração exaustiva com etanol 95% em um recipiente de aço inoxidável. Foram
feitas várias extrações num intervalo de 72 horas entre cada extração até completo
esgotamento da droga. A solução extrativa obtida passou por um processo de
destilação do solvente em evaporador rotativo a uma temperatura média de 50 °C.
Após este processo de evaporação do solvente, obteve-se o EEB.
Foram utilizados grupos de camundongos (n=6) (Mus musculus) Swiss,
machos, albinos, pesando entre 30–40 gramas, todos provenientes do Biotério da
UNIVASF e foram mantidos em gaiolas coletivas com alimentação e água ad libitum. A
atividade antinociceptiva do EEB cascas (100; 200 e 400 mg/kg i.p) foi avaliada
através do teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, teste da
lambida da pata induzida pela formalina e pelo teste da placa quente, enquanto a
avaliação da coordenação motora foi feita pelo teste de Rota-Rod. Indometacina (20
mg/kg i.p.), morfina (10 mg/kg i.p.) e Diazepam (2,5 mg/kg i.p.) foram utilizadas como
drogas padrão. Os grupos controle receberam solução salina. A análise dos dados foi
feita no programa GraphPadPrism
NÚMERO DE CONTORÇÕES
Resultados e Discussão
Durante a realização do teste das contorções abdominais, os números de
contorções diminuíram significativamente (p<0,01) em relação ao grupo controle, após
a administração por via i.p. dos EBB das cascas de C. quercifolius. No EBB das
cascas, os efeitos foram similares nas doses 100 mg/kg (83,7% de inibição), 200
mg/kg (81,4% de inibição) e 400 mg/kg (88,1% de inibição).
30
20
10
**
**
**
**
400
INDO
**
0
CONTROLE 100
200
MORF
Cq-EtOH (mg/kg)
Figura 01: Efeito antinociceptivo do Cq-EtOH de Cnidoscolus quercifolius no teste das
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos. Foram
utilizadas indometacina e morfina como controle positivo. Os valores são significantes
quando *P<0,05; **P<0,01 e ***P<0,001; ANOVA + Dunnet.
175
No teste da formalina o tempo de lambida da pata diminuiu na primeira e na
segunda fase após a administração do EEB das cascas, sendo as melhores respostas
obtidas na segunda fase na dose de 200 mg/kg (78,26% de inibição). Em relação ao
teste da placa quente o EEB das cascas não proporcionou o aumento do tempo de
latência. E por fim, o EEB das cascas não provocou alteração na coordenação motora
dos camundongos no teste do Rota-Rod.
Conclusões
Os resultados obtidos demonstram que as cascas da espécie Cnidoscolus
quercifolius possui atividade antinociceptiva, atuado possivelmente na dor inflamatória,
sendo seu mecanismo de atuação provavelmente a nível periférico. Outros estudos
ainda são necessários para caracterizar o mecanismo de ação preciso dos extratos. A
coordenação motora dos animais não foi alterada pela administração do extrato.
Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Referências
ALMEIDA, R. N.; NAVARRO, D. S.; BARBOSA-FILHO, J. M. Plants with central
analgesic activity. Revista Phytomedicine, Stuttgart, v. 8, n. 4, p. 310-322, jul. 2001.
Disponível em: http://artigocientifico.uol.com.br/uploads/artc_1146349999_70.pdf.
Acesso em: 16 jan. 2012.
KUMMER, C. L.; COELHO, T. C. R. B. Antiinflamatórios Não Esteróides Inibidores da
Ciclooxigenase-2 (COX-2): Aspectos Atuais. Revista Brasileira Anestesiologia,
Botafogo-RJ, v. 52, n. 4, p.498-512, jul./ago. 2002. Disponível em:
http://www.scielo.br/pdf/rba/v52n4/v52n4a14.pdf. Acesso em: 16 jan. 2012.
NETO, J. P. et al. AVALIAÇÃO DA AÇÃO CLASTOGÊNICA DO ÓLEO DE
Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm EM CÉLULAS MEDULARES.
Revista de Biologia e Farmácia, Campina Grande, v. 3, n. 1, p. 6-22, mar. 2009.
176
APÊNDICE G – Certificado
177
APÊNDICE H – Resumo
ENCONTRO BRASILEIRO
II
para
3º Encontro Brasileiro para Inovação Terapêutica
cvfcvcv
INOVAÇÃO TERAPÊUTIC
I Jornada para o Desenvolvimento da Economia da Saúde
AVALIAÇÃO
21 a 25 de novembro
de 2011DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E DA COORDENAÇÃO
MOTORA
UFPE Recife & Mar
Hotel DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE
Cnidoscolusquercifolius(EUPHORBIACEAE)
Realização
Patrocínio
Inscrições e Contatos
Site: http://www.wix.com/segundoebit/ufpe
E-mail: [email protected]
L.M. DE A. GOMES,1S.R.G.
Min
Programa de Pós-Graduação
1
em Inovação
Terapêutica
DE L. SARAIVA, T.M.D. DE ANDRADE,
J.C.SILVA, 1T.S. DINIZ, 1V.N.S. BARRETO, 1J.R.G. DA S. ALMEIDA; 1J.T.
DE LIMA.
1
1
Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Laboratório de
Bioquímica e Fisiologia, Universidade Federal de Vale do São Francisco.
[email protected]
RESUMO
A espécie Cnidoscolusquercifolius(Euphorbiaceae) é conhecida
popularmente como faveleira e pertence ao bioma Caatinga. O presente
trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antinociceptiva e motora doEEB
(Extrato Etanólico Bruto) das folhas de C. quercifolius. Foram utilizados grupos
de camundongos (n=6) (Mus musculus). A atividade antinociceptiva do EEB
das folhas foi avaliada através do teste das contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético, teste da lambida da pata induzida pela formalina e pelo
teste da placa quente. A coordenação motora foi avaliada pelo Teste de RotaRod.Os resultados obtidos demonstraram que a espécie C.quercifoliuspossui
atividade antinociceptiva e a coordenação motora dos animais não foi alterada
pela administração do extrato.
INTRODUÇÃO
A espécie Cnidoscolusquercifolius(faveleira) é uma das plantas
pertencentes ao bioma caatinga, que se destaca pela sua extraordinária
resistência à seca. Seu emprego popular consiste em recuperar áreas
degradadas, na alimentação animal e humano, na medicina popular, serrarias e
como fonte de energia, dentre outros usos (NETO et al., 2009).
Segundo Lorenzi (1998) a faveleira é uma espécie pertencente à
família Euphorbiaceae, trata-se de uma planta oleaginosa, xerófila, decídua,
heliófila e pioneira. Atinge 4 a 8 metros de altura, dotada de copa alongada ou
178
arrendondada e rala. Tronco curto e ramificado desde a base, mais ou menos
cilíndrico, com casca fina, lenticelada e quase lisa, de 20 a 35 cm de diâmetro.
Em relação à dor, esta é uma modalidade sensorial que em muitos
casos representão o único sintoma para o diagnóstico de várias doenças. Ela
tem muitas vezes uma função protetora. Já o processo inflamatório consiste na
resposta orgânica mais precoce diante de lesão tissular ou infecção. Perante
um trauma tissular, o acúmulo local de prostaglandinas, tromboxanos e outros
mediadores químicos ocasionam uma alteração no limiar de nociceptores, com
consequente hiperalgia(ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001;
KUMMER & COELHO, 2002).
Nesse sentido, o presente trabalho realizou a avaliação da atividade
farmacológica do extrato da espécie Cnidoscolusquercifolius, abordando
aspectos deatividadeantinociceptiva e da coordenação motora. Em
levantamento bibliográfico realizado nos principais bancos de dados sobre
estudos com plantas medicinais, não foram encontrados registros de estudos
com essa espécie e sua ação antinociceptiva.
OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade
antinociceptiva e motora do extrato etanólico bruto das folhas de
Cnidoscolusquercifolius.
MATERIAIS E MÉTODOS
O material vegetal foi coletado no município de Petrolina, na Empresa
Brasileira de Pesquisas Agropecuárias - Embrapa Semiárido. A coleta e
identificação foram realizadas por um botânico, e a exsicata da espécie foi
depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF), no Centro de
Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD) na UNIVASF sob
a identificação de número 19202.
O material vegetal (folhas) foi levado à estufa à temperatura média de 40
°C por um período de 72 horas. Após a secagem e completa estabilização o
material foi pesado e pulverizado. O material vegetal seco e pulverizado foi
submetido à maceração exaustiva com etanol 95% em um recipiente de aço
inoxidável. Foram feitas várias extrações num intervalo de 72 horas entre cada
extração até completo esgotamento da droga. A solução extrativa obtida
passou por um processo de destilação do solvente em evaporador rotativo a
uma temperatura média de 50 °C. Após este processo de evaporação do
solvente, obteve-se o EEB.
Foram utilizados grupos de camundongos (n=6) (Mus musculus) Swiss,
machos, albinos, pesando entre 30–40 gramas, todos provenientes do Biotério
da UNIVASF e foram mantidos em gaiolas coletivas com alimentação e água
ad libitum.Aatividadeantinociceptiva do EEB folhas (100; 200 e 400 mg/kg i.p)
foi avaliada através do teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético, teste da lambida da pata induzida pela formalina e pelo teste da placa
quente, enquanto a avaliação da coordenação motora foi feita pelo teste de
Rota-Rod. Indometacina (20 mg/kg i.p.), morfina (10 mg/kg i.p.) e Diazepam
(2,5 mg/kg i.p.) foram utilizadas como drogas padrão. Os grupos controle
179
receberam solução salina. A análise dos dados foi feita no programa
GraphPadPrism
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante a realização do teste das contorções abdominais, os números
de contorções diminuíram significativamente (p<0,01) em relação ao grupo
controle, após a administração por via i.p. do EBB das folhas de C.quercifolius.
Os efeitos foram maiores nas doses de 400 mg/kg (98,7% de inibição), 200
mg/kg (79,4% de inibição) e 100 mg/kg (71,3% de inibição), conforme ilustrado
na figura 01.
40
**
30
20
**
10
**
**
0
Control 100
200
400
**
**
INDO MORPH
Cq-EtOH (mg/kg)
FIGURA 01: Efeito antinociceptivo do EEB das folhas da espécie
C.quercifolius(Euphorbiaceae) no teste das contorções abdominais induzida
pelo ácido acético. Os valores são significantes quando *P<0,05; **P<0,01 e
***P<0,001; ANOVA + Dunnet.
No teste da formalina o tempo de lambida da pata diminuiu na primeira e
na segunda fase após a administração do EEB das folhas, sendo as melhores
respostasobtidas na segunda fase na dose de 400 mg/kg (79,46% de inibição).
Em relação ao teste da placa quente o EEB das folhas na dose de 400
mg/kg proporcionou o aumento do tempo de latência significativamente (p<
0,05), dados apresentados na figura 2. E por fim, o EEB das folhas não
provocou alteração na coordenação motora dos animais no teste do Rota-Rod.
180
20
**
**
*
15
**
10
Controle
Folhas -EtOH 100 mg/kg
Folhas-EtOH 200 mg/kg
Folhas - EtOH 400 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
5
0
30
60
90
120
Tempo (min)
FIGURA 02: Efeito antinociceptivo do EEB das folhas da espécie
C.quercifolius(Euphorbiaceae) no teste da placa quente. Os valores são
significantes quando *P<0,05; **P<0,01 e ***P<0,001; ANOVA + Dunnet.
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos demonstram que as folhas da espécie
Cnidoscolusquercifoliuspossui atividade antinociceptiva, atuado possivelmente
na dor inflamatória, sendo seu mecanismo de atuação provavelmente a nível
periférico, com exceção da dose de 400 mg/kg que apresentou resposta tanto a
nível periférico como a nível central. Outros estudos ainda são necessários
para caracterizar o mecanismo de ação preciso dos extratos. A coordenação
motora dos animais não foi alterada pela administração do extrato.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALMEIDA, R. N.; NAVARRO, D. S.; BARBOSA-FILHO, J. M. Plantswith central
analgesicactivity. Revista Phytomedicine, Stuttgart,v. 8, n. 4, p. 310-322, jul.
2001. Disponível em:
http://artigocientifico.uol.com.br/uploads/artc_1146349999_70.pdf. Acesso em:
16 jan. 2012.
KUMMER, C. L.; COELHO, T. C. R. B.Antiinflamatórios Não Esteróides
Inibidores da Ciclooxigenase-2 (COX-2): Aspectos Atuais. Revista Brasileira
Anestesiologia, Botafogo-RJ, v. 52, n. 4, p.498-512, jul./ago. 2002. Disponível
em: http://www.scielo.br/pdf/rba/v52n4/v52n4a14.pdf. Acesso em: 16 jan. 2012.
181
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas
arbóreas nativas do Brasil. 2. ed. Nova Odessa: Editora Plantarum, 1998.
NETO, J. P. et al.AVALIAÇÃO DA AÇÃO CLASTOGÊNICA DO ÓLEO DE
Cnidoscolusphyllacanthus (Mart.) Pax. et K. HoffmEM CÉLULAS
MEDULARES. Revista de Biologia e Farmácia, Campina Grande, v. 3, n. 1,
p. 6-22, mar. 2009.
182
ANEXOS
183
ANEXO A - Protocolo de aprovação do Comitê de Ética
184
ANEXO B - Protocolo para avaliação da triagem farmacológica

Euphorbiaceae - Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido

Transcrição

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