novo complexo mononuclear de relevncia

NOVO COMPLEXO MONONUCLEAR DE RELEVÂNCIA
BIOINORGÂNICA COMO MODELO BIOMIMÉTICO PARA A
ENZIMA GALACTOSE OXIDASE
Lis Regiane Vizolli Favarin1, Ademir dos Anjos2, Natália Aparecida Cabeza3,
Geziel Rodrigues de Andrade3
1
Estudante do Curso de Química da UEMS, Unidade de Naviraí; *E-mail:
[email protected]
2
Professor do Curso de Química da UEMS, Unidade de Naviraí; E-mail:
[email protected]
3
Estudantes do Curso de Química da UEMS, Unidade de Naviraí; *E-mail:
[email protected], [email protected]
Área Temática: Pesquisa (Química Bioinorgânica)
Resumo
A galactose oxidase (GAO) é uma enzima na qual o sítio ativo possui um íon CuII coordenado
por dois átomos de Otirosinato, dois átomos de Nhistidínico e um ligante exógeno (água ou acetato)
em uma geometria piramidal quadrada. A ligação axial do grupo tirosina (protonado)
constitui, juntamente com a formação de um radical fenoxil/tirosil (na posição equatorial),
fatores cruciais no mecanismo catalítico da enzima (oxidação de álcoois). Neste trabalho, foi
sintetizado e caracterizado um novo complexo mononuclear de cobre(II) empregando-se um
novo ligante hexadentado N,O-doador com o objetivo de biomimetizar o sítio ativo da GAO.
O complexo foi devidamente caracterizado através de análise elementar de CHN e
espectroscopias de IV e UV-VIS. Os resultados obtidos sugerem uma estrutura que pode ser
comparada com a da GAO. Os grupos terc-butil nas posições –orto e –para aos fenóis
permitem a formação e estabilização de radicais fenoxil, o que foi comprovado através de
oxidação eletroquímica. Dessa forma, têm-se a perspectiva que o complexo possa ser
convenientemente utilizado como modelo funcional/estrutural para a enzima.
Palavras-chave: metaloenzima, complexo cobre(II), UV-VIS, eletroquímica, metalo-fenoxil.
Introdução
Grande ênfase vem sendo atribuída ao estudo e modelagem do sítio ativo de
metaloenzimas de cobre. Essas enzimas estão envolvidas cataliticamente em uma variedade
de processos biológicos, tais como a transferência de elétrons, transporte de oxigênio
molecular e oxidação de vários bio-substratos. Um dos exemplos mais interessantes é o da
Galactose Oxidase (GAO), uma enzima mononuclear que atua promovendo a oxidação de um
grande número de álcoois primários aos correspondentes aldeídos, e que apresenta no seu
ciclo catalítico a admirável participação de espécies radicalares (conversão de um fenol,
ArOH, a um radical fenoxil, ArO•) [dos Anjos, 2005]. Sua estrutura foi determinada via
difratometria de raio X, possuindo um sítio mononuclear de CuII em um ambiente de
coordenação piramidal quadrado, com dois átomos de nitrogênio histidínicos (Hist496,
Hist581, equatoriais), dois oxigênios tirosinatos (Tir272, equatorial, Tir495, axial) e um ânion
acetato ou aquo exógeno (equatorial) [Thomas, 2007]. Uma vez que a GAO é uma das
enzimas que apresentam radicais livres mais bem caracterizadas, a compreensão das suas
propriedades e reatividade pode contribuir para um melhor entendimento das espécies metaloradicalares e dos mecanismos nos quais elas participam em outras enzimas e em uma
variedade de outros processos biológicos e tecnológicos.
Uma estratégia comum para síntese de complexos modelos é a utilização de ligantes
multidentados contendo átomos N-O-S doadores com um ou mais grupos fenólicos presentes.
Alguns desses ligantes apresentam vários grupos substituintes nas posições –orto e –para dos
grupos fenólicos, como terc-butil, entre outros. Estes substituintes permitem a formação de
radicais fenoxil, além de promoverem uma maior estabilização dos mesmos [dos Anjos,
2005].
Com o objetivo de obter um modelo sintético (estrutural e funcional) ao sitio ativo da
GAO, o presente trabalho descreve nossos esforços empregados na síntese e caracterização de
um novo complexo mononuclear de cobre(II) obtido a partir do novo ligante N,N’,N,N’bis[2-hidróxi-3,5-di-terc-butilbenzil)(2-piridilmetil)]-1,3-diaminopropano (L).
Materiais e Métodos
Todos os reagentes e solventes utilizados nas análises e nos procedimentos de síntese,
foram adquiridos de fonte comercial sem purificação prévia. A determinação dos percentuais
de carbono, hidrogênio e nitrogênio foram realizadas na Central de Análises do Departamento
de Química da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), em um analisador elementar
de CHNS Carlo Erba modelo E-1110. Os espectros no infravermelho foram obtidos em
espectrofotômetro Perkin Elmer FTIR-2000, na região de 4000 a 450 cm-1 (pastilhas de KBr
grau espectroscópico) no Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia, Departamento de
Química – UFSC. Os espectros eletrônicos nas regiões do ultravioleta e visível foram obtidos
em um espectrofotômetro Varian modelo Cary50, no Laboratório de Pesquisa da Unidade de
Naviraí/UEMS. As análises foram realizadas utilizando-se acetonitrila (grau espectroscópico)
e celas de quartzo com capacidade para 4 mL com 1 cm de caminho óptico. O comportamento
redox do complexo foi investigado por voltametria cíclica em um potenciostato MQPG-01 da
Microquímica, no Laboratório de Pesquisa da Unidade de Naviraí. Os experimentos foram
realizados em soluções de diclorometano, sob atmosfera de argônio (hexafluorfosfato de
tetrabutilamônio: eletrólito suporte; eletrodo de trabalho: platina; eletrodo auxiliar: platina;
eletrodo de referência: Ag/Ag+; padrão interno: ferrocínio/ferroceno).
O ligante mononucleante L foi obtido e caracterizado na forma de um pó branco,
conforme procedimentos descritos na literatura [Cabeza, 2010]. Análise elementar de CHN
calculada para C45H64N4O2, MM = 693 g mol-1, C = 77,99; H = 9,31; N = 8,08 %.
Encontrada: C = 77,51; H = 9,42; N = 8,20 %. IV (KBr), em cm-1: 3400-3300 (νOH); 2956
(νC-H, t-butil); 1596, 1477 (νC=N,C=C, aromáticos); 1394 (δO-H, fenol); 1362 (δC-H, terc-butil);
1237 (νC-O, fenol); 879 (δC-H, aromáticos); 756 (δC-H piridina).
A uma solução de Cu(CH3COO)2.H2O (0,10 g; 0,5 mmol) em 20 mL de metanol, sob
agitação e leve aquecimento, adicionou-se uma solução metanólica do ligante (0,35 g; 0,5
mmol; 10 mL de metanol). A solução púrpura resultante permaneceu sob agitação e
aquecimento por aproximadamente 15 minutos. Em seguida adicionou-se KClO4 (0,07 g; 0,5
mmol). Deixou-se reagir, sob agitação e aquecimento, até a redução do volume à metade,
então filtrou-se e deixou-se em repouso. Após dois dias à temperatura ambiente, houve a
formação de um precipitado púrpura microcristalino o qual foi filtrado e lavado com metanol
e éter etílico gelados. Análise elementar de CHN calculada para CuC45H63N4O2.ClO4.CH3OH,
MM = 887,03 g mol-1, C = 62,29; H = 7,61; N = 6,32 %. Encontrada: C = 62,63; H = 7,52;
N = 6,46 %. IV (KBr), em cm-1: 3400-3300 (νO-H); 2956 (νC-H, terc-butil); 1610-1445
(νC=N,C=C, aromáticos); 1390 (δO-H, fenol); 1362 (δC-H, terc-butil); 1234 (νC-O, fenol); 1096
(νCl-O, ClO4); 880 (δC-H, aromáticos); 763 (δC-H, piridina).
Resultados e Discussão
O ligante foi obtido com bons rendimentos e grau de pureza adequado para a
utilização na síntese do complexo o que é demonstrado pela análise elementar de CHN e
pelos resultados por espectroscopia IV.
O espectro no infravermelho obtido para o complexo apresenta basicamente as
mesmas bandas exibidas pelo ligante. Na região próxima a 1100 cm-1, aparece uma banda
intensa referente ao estiramento das ligações Cl-O do contra-íon ClO4-. Isto indica que pelo
menos um dos oxigênios fenólicos esteja desprotonado.
O espectro eletrônico do complexo é apresentado na Figura 1a. Este espectro mostra
uma banda larga e intensa (λmáx. = 479 nm) com elevado coeficiente de extinção molar
(ε > 1000 mol-1 L cm-1). Esta absorção pode ser atribuída a um processo de transferência de
carga do tipo ligante-metal (TCLM), no caso Ofenolato equatorial → Cu(II) [dos Anjos, 2005].
Isto está em concordância com os resultados da análise elementar de CHN e espectroscopia de
infravermelho, que indicam a presença de pelo menos um contra-íon perclorato, sugerindo
que pelo menos um dos oxigênios fenólicos esteja coordenado de forma desprotonada. O
complexo também apresenta uma banda larga com baixo coeficiente de extinção, observada
na região entre 650-800 nm, a qual pode ser atribuída a uma transição d-d. Os resultados
mostrados anteriormente sugerem uma geometria ao redor do centro de cobre(II) (Figura 1b)
com a presença tanto de um fenolato (equatorial) quanto um fenol (axial), o que é
extremamente relevante no contexto de biomimetizar estruturalmente o sítio ativo da enzima
GAO, uma vez que a mesma apresenta um ambiente de coordenação similar.
1,0
N
0,8
Absorvância
N
N
0,6
Cu
N
0,4
O
0,2
O
H
0,0
300
400
500
600
700
800
λ (nm)
(a)
(b)
Figura 1 – (a) Espectro eletrônico do complexo em CH3CN. (b) Estrutura proposta
para o complexo de cobre(II).
Nos estudos eletroquímicos, o processo reversível anódico encontrado no
voltamograma (Figura 2a, a esquerda), com um potencial (E1/2) de 381 mV vs. Fc+/Fc, pode
ser atribuído a formação da espécie radicalar ([CuII(HL)]+/[CuII(HL•)]2+. Já o processo
reversível catódico (Figura 2a, a direita) que apresenta um potencial de -1107 mV vs. Fc+/Fc
pode ser relacionado ao par redox Cu2+/Cu+. Os valores dos potenciais foram referenciados
vs. Fc+/Fc, onde E1/2(Fc+/Fc) = 385 mV vs. Ag/Ag+ (Figura 2b). O aparecimento deste radical
fenoxil possivelmente está condicionado a coordenação do átomo de oxigênio como fenolato,
conforme sugerido pelos outros resultados. Um potencial de 10 mV vs. Fc+/Fc é reportado
para o par redox fenolato/fenoxil na GAO [Thomas, 2007]. É importante salientar que a
ocorrência tanto de processos centrados no metal quanto no ligante é essencial no ciclo
catalítico da GAO.
10
40
8
6
20
4
I (μA)
I (μA)
2
0
-2
0
-20
-4
-40
-6
-8
-60
-10
1000
500
0
-500
-1000
600
400
200
0
-200
+
+
E vs. Ag/Ag (mV)
(a)
E vs. Ag/Ag (mV)
(b)
Figura 2 – (a) Voltamograma do complexo de cobre(II). (b) Voltamograma do padrão Fc+/Fc.
Agradecimentos
Ao PIBIC/UEMS pela bolsa concedida, a FUNDECT pelos recursos financeiros para
realização da pesquisa e ao LABINC/UFSC (Prof. Dr. Ademir Neves).
Referências Bibliográficas
Cabeza, N. A.; dos Anjos, A.; Favarin, L. R. V.; Andrade, G. R.; Andrade, L. H. C. Novo
Complexo de Relevância Bioinorgânica e Ambiental. Resumo Expandido – 8º ENIC/1º
EPEX. Submetido, 2010.
dos Anjos, A. 2005. Novos Complexos Metalo-Radicalares de Relevância Bioinorgânica:
1) Modelos Biomiméticos para a Enzima Galactose Oxidase, 2) Modelos Complexos
Metalo-Fenoxil. Tese (Doutorado em Química) – Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, 241p. e referências citadas.
Thomas, F. Ten years of a biomimetic approach to the copper(II) radical site of galactose
oxidase. European Journal of Inorganic Chemistry, v. 17, p. 2379-2404, 2007, e
referências citadas.