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Positionsspezifischer Nachweis
und relative Quantifizierung von
Modifikationen des as1-Caseins
in Milch mittels MALDI-TOF-MS
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Gregor Vollmer
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
20. 12. 2012
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Johannes Barth
Erstberichterstatterin:
Prof. Dr. Monika Pischetsrieder
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Drewello
Danksagung
Allen voran danke ich meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. M. Pischetsrieder für die
Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe, die Überlassung des Themas, ihre engagierte und
freundliche Unterstützung in den Jahren der Promotion und das mir entgegen gebrachte
Vertrauen sehr herzlich. Mein Dank gilt außerdem Frau Dr. Jasmin Meltretter für ihre
wertvollen Anregungen zu meiner Arbeit.
Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. T. Drewello für die Erstellung
des Zweitgutachtens und bei Herrn Prof. Dr. G. Lee für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes bedanken. Herrn PD Dr. T. Göen danke ich für die freundliche Bereitschaft,
sich als Zweitprüfer zur Verfügung zu stellen. Mein Dank gilt weiterhin Herrn Prof.
Dr. C.-M. Becker dafür, dass ich das MALDI-TOF-MS seiner Arbeitsgruppe nutzen
durfte; Herrn Prof. Dr. M. Karas danke ich für die Erlaubnis, die ClCCA-Matrix für
wissenschaftliche Zwecke einzusetzen.
Sehr herzlich danke ich Frau C. Meißner für die stets freundliche Hilfe, nicht nur in
bürokratischen Angelegenheiten. Ebenso danke ich Herrn W. Utz für seine engagierte
Unterstützung bei Computerfragen. Für ihre Hilfsbereitschaft und Unterstützung in
technischen Fragen danke ich den Herren K. Thomas, R. Köppl, A. Zillich-Balthasar,
C. Fischer und A. Balla.
Außerdem geht mein Dank an die gesamte Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Becker
für die freundliche Aufnahme und Unterstützung. Besonders bedanken möchte ich mich
bei Nico Vogel, Martin Eberhardt, Angela Seebahn und Wei Xiang für die vielen mir
gewährten Hilfestellungen beim Messen am MALDI-TOF-MS.
Für die schöne Zeit, die gemeinsamen Unternehmungen und die entstandenen
Freundschaften möchte ich mich bei allen Kolleginnen und Kollegen im Arbeitskreis
herzlich bedanken. Auch für den regen fachlichen Austausch einen großen Dank an
Andrea, Artur, Barbara, Bianca, Dima, Flo, Ingrid, Julia, Kerstin, Leonie, Martin,
Melanie, Nadine, Nina, Rainer, Sabrina, Stefan, Tanja, Tobias, Ulla und Viola; ebenso
an die Kollegen der AKs Eichler und Heinrich.
Mein abschließender Dank gilt meinen Eltern und meinem Bruder, ohne deren große
Unterstützung mein Studium und diese Arbeit nicht möglich gewesen wären.
i
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
ix
Abbildungsverzeichnis
xi
Tabellenverzeichnis
xiii
1 Einleitung
1.1 Milchprodukte als Teil der täglichen Ernährung . . . . . . . . . .
1.2 Hitzebehandlung von Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3 Inhaltsstoffe von Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1 Begriffsklärung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.2 Milchproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4 Während der Hitzebehandlung von Milch ablaufende Vorgänge . .
1.4.1 Die Maillard-Reaktion, ihre Produkte und deren Relevanz
1.4.2 Oxidation einzelner Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . .
1.4.3 Konsequenzen der Hitzebehandlung von Milch . . . . . . .
1.5 Analytik modifizierter Aminosäuren in Proteinen . . . . . . . . .
1.5.1 Nachweisverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5.2 Vermessung intakter und totalhydrolysierter Proteine . . .
1.5.3 Vermessung partiell hydrolysierter Proteine . . . . . . . . .
1.6 MALDI-TOF-Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6.1 Entwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6.2 Überblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6.3 Ionisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6.4 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6.5 Massenanalysator und Detektor . . . . . . . . . . . . . . .
1.7 Interpretation von Massenspektren . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7.1 Dimensionslosigkeit von m/z . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7.2 Isotopenmuster und monoisotopische Masse . . . . . . . .
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1
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2
3
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6
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iii
Inhaltsverzeichnis
1.8
1.9
LC-MS/MS . . . . . . . . . . .
1.8.1 Überblick . . . . . . . .
1.8.2 Ionisierung . . . . . . . .
1.8.3 Massenanalysator . . . .
1.8.4 Fragmentbezeichnungen
Zielsetzungen dieser Arbeit . . .
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2 Methodenentwicklung - Nachweis von Modifikationen in Milchproteinen
2.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2 MALDI-TOF-MS-Messung intakten s1 -Caseins . . . . . . . . . . . . .
2.2.1 Phosphorylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.2 Lactosylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3 Optimierung des Casein-Verdaus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1 In-silico-Verdau und Identifikation des optimalen Verdauenzyms
2.3.2 Verdau von Caseinen mit Chymotrypsin . . . . . . . . . . . . .
2.3.3 Bestimmung der Verdaudauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.4 Kombination zweier Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4 Vermessungen im Milchmodellsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.1 Modifikationen des s1 -Caseins nach Inkubation im Milchmodellsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.2 Untersuchung von im Milchmodellsystem inkubiertem -Casein .
2.5 Isolierung von Caseinen aus Milchproben mittels SDS-PAGE . . . . . .
2.5.1 Untersuchung von s1 -Casein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5.2 Untersuchung von -Casein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.6 Nachweis von Proteinmodifikationen nach Vortrennung mittels HPLC .
2.6.1 Etablierung einer Trennung für das Hydrolysat von -Casein . .
2.6.2 Untersuchung von im Milchmodellsystem erhitztem -Casein . .
2.6.3 Etablierung einer Trennung für das Hydrolysat von -Lactalbumin
2.6.4 Untersuchung von im Milchmodellsystem erhitztem -Lactalbumin
2.6.5 Etablierung einer Trennung für das Hydrolysat von s1 -Casein .
2.6.6 Untersuchung von im Milchmodellsystem erhitztem -Casein . .
2.6.7 Vermessung aus UHT-Milch gelelektrophoretisch isolierten
s1 -Caseins mit HPLC-MALDI-TOF-MS . . . . . . . . . . . . .
2.6.8 Etablierung einer HPLC-Trennung der Milchproteine . . . . . .
a
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b
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b
b
b
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a
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iv
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40
40
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44
45
47
50
52
53
Inhaltsverzeichnis
2.7
2.8
2.9
Optimierung der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.7.1 Beseitigung der Störung mit Massenunterschied 56 Da
2.7.2 Optimierung der eingesetzten MALDI-Matrix . . . .
2.7.3 Versuch zur Unterdrückung der Metalladdukte . . . .
Evaluation der Peptidfraktionierung . . . . . . . . . . . . . .
Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3 Positionsspezifischer Nachweis und relative Quantifizierung der
Hauptmodifikationen des as1 -Caseins
3.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Bedeutung der Laserenergie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Veränderung der HPLC-Chromatogramme bei stark hitzebehandelten
Milchproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Probenaufarbeitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Untersuchte Standardproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.2 Vermessung der bei 60 °C inkubierten Rohmilch . . . . . . . . .
3.4.3 Vermessung der bei 99 °C inkubierten Rohmilch . . . . . . . . .
3.4.4 Aufarbeitung von Rohmilch, UHT-Milch und Sterilmilch . . . .
3.4.5 Untersuchung von Kindermilchnahrungen . . . . . . . . . . . . .
3.5 Positionsspezifischer Nachweis von Modifikationen des s1 -Caseins . . .
3.6 Relative Quantifizierung der Hauptmodifikationen des s1 -Caseins . . .
3.6.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.2 Definition der Modifikationsrate . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.3 Abhängigkeit der Modifikationsrate von der Laserenergie . . . .
3.6.4 Modifikationsraten von erhitztem -Casein-Standard . . . . . .
3.6.5 Modifikationsraten nach Erhitzung von Rohmilch bei 60 °C . . .
3.6.6 Modifikationsraten nach Erhitzung von Rohmilch bei 99 °C in
unabhängiger Dreifachbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.7 Quantifizierung von Modifikationen in Roh-, UHT- und Sterilmilch
3.6.8 Quantifizierung von Modifikationen in Kindermilchnahrungen .
3.6.9 Gegenüberstellung der bei 99 °C erhitzten Rohmilch und aller
Handelsproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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83
83
87
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94
99
v
Inhaltsverzeichnis
4 Identifikation modifizierter Aminosäuren mittels LC-MS/MS
4.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 EMS-Scan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 EPI-Scan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.1 Durchführung der Messungen . . . . . . . . . . . .
4.3.2 Ergebnisse aus den EPI-Scan-Messungen . . . . . .
4.4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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5 Material und Methoden
5.1 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.4 Herstellen von Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5 Probenaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5.1 Entfettung aller Milchproben . . . . . . . . . . . . . . .
5.5.2 ZipTip-Aufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5.3 Dialyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6 Vermessung der Proben mittels MALDI-TOF-MS . . . . . . . .
5.6.1 Herstellung der Matrices und Spotten . . . . . . . . . . .
5.6.2 Proteindatenbanksuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6.3 Parameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6.4 Spektrenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7 Bestimmung des Phosphorylierungsgrades von Caseinen . . . . .
5.8 Bestimmung der Verdaudauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.9 Hitzebehandlung von Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.9.1
-Casein im Milchmodellsystem . . . . . . . . . . . . . .
5.9.2
-Casein im Milchmodellsystem . . . . . . . . . . . . . .
5.9.3
-Lactalbumin im Milchmodellsystem . . . . . . . . . . .
5.9.4 Erhitzung von Rohmilch bei 60 °C . . . . . . . . . . . . .
5.9.5 Erhitzung von Rohmilch bei 99 °C . . . . . . . . . . . . .
5.10 Aufarbeitung der im Milchmodellsystem erhitzten Proteine . . .
5.11 Trennung von Proteinen mittels Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
5.11.1 Herstellung der Gele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.11.2 Durchführung der Gelelektrophorese . . . . . . . . . . .
5.11.3 Ausschneiden einzelner Banden und In-Gel-Verdau . . .
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130
130
130
131
Inhaltsverzeichnis
5.12 Probenvorbereitung für HPLC-Peptidtrennungen . . . . . . . . . . . . 132
5.12.1 Etablierung einer Trennung für das Hydrolysat von -Casein . . 132
5.12.2 Untersuchung von im Milchmodellsystem erhitztem -Casein . . 132
5.12.3 Etablierung einer Trennung für das Hydrolysat von -Lactalbumin 132
5.12.4 Untersuchung von im Milchmodellsystem erhitztem -Lactalbumin133
5.12.5 Etablierung einer Trennung für das Hydrolysat von s1 -Casein . 133
5.12.6 Untersuchung von im Milchmodellsystem erhitztem -Casein . . 133
5.13 HPLC-Peptidtrennung für -Lactalbumin . . . . . . . . . . . . . . . . 134
5.14 Auftrennung der Protein- und Peptidmischungen mittels HPLC . . . . 134
5.14.1 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
5.14.2 HPLC-Proteintrennung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
5.14.3 GluC-Verdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
5.14.4 HPLC-Peptidtrennung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
5.14.5 Aufarbeitung der Fraktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
5.15 Relative Quantifizierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
5.16 Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
5.17 Vermessung von Proben mittels UHPLC-MS/MS . . . . . . . . . . . . 140
5.17.1 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
5.17.2 Parameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
5.17.3 Spektrenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
b
b
a
a
a
a
a
6 Zusammenfassung
143
7 Summary
149
8 Anhang
8.1 Die 20 proteinogenen Aminosäuren . . . . . . . . . . . .
8.2 Enzymatischer Proteinverdau . . . . . . . . . . . . . . .
8.2.1 Enzymatischer In-Silico-Verdau von s1 -Casein . .
8.2.2 Enzymatischer In-Silico-Verdau weiterer Proteine
155
155
156
156
159
a
Literaturverzeichnis
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161
vii
AGE
AP
BSG
CCA
CE
CES
ClCCA
CML
d
DHAP
DP
DTT
EDTA
EHEC
ELISA
EMS
EPI
ESI
FE
h
HMWF
HPLC
LC-MS/MS
LIT
MALDI-TOF-MS
MC
min
MRM
Advanced Glycation Endproduct
Amadoriprodukt
Bestimmungsgrenze
4-Hydroxy- -cyanozimtsäure
Collision Energy
Collision Energy Spread
4-Chloro- -cyanozimtsäure
Carboxymethyllysin
Tag(e)
2,5-Dihydroxyacetophenon
Declustering Potential
Dithiothreitol
Ethylendiamintetraessigsäure
Enterohämorrhagische Escherichia coli
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Enhanced MS
Enhanced Product Ion
Electro-Spray Ionisation
Flächeneinheiten
Stunde(n)
High Molecular Weight Fraction
High Performance Liquid Chromatography
Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
Linear Ion Trap
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation - Time Of Flight - Mass Spectrometry
Missed Cleavage(s)
Minute(n)
Multiple Reaction Monitoring
a
a
ix
NWG
OPA
Rt
SDS-PAGE
TFA
TIC
UHPLC
UHT
x
Nachweisgrenze
o-Phthaldialdehyd
Retentionszeit
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Trifluoressigsäure
Total Ion Current
Ultra High Performance Liquid Chromatography
Ultra-High-Temperature
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
1.10
Maillard-Reaktion zwischen Lactose und Protein . . . . . . . . . . . . .
Strukturen einiger AGEs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mechanismus zur Bildung von CML . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Oxidationsmodifikationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Prinzip des positionsspezifischen Nachweises von Modifikationen mit MS
Spektrum eines Peptids und Identifikation zugehöriger Modifikationen .
Schematische Darstellung eines MALDI-Massenspektrometers . . . . .
Chemische Strukturen der MALDI-Matrices CCA, ClCCA und DHAP
Schematische Darstellung eines Tripelquadrupols . . . . . . . . . . . . .
Bezeichnung der Fragmente nach MS/MS . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
2.13
2.14
2.15
MS-Spektren von nativem und dephosphoryliertem s1 -Casein . . . . .
MALDI-TOF-MS-Spektren von intaktem s1 -Casein in DHAP . . . . .
Sequenzabdeckung beim Verdau von s1 -Casein mit GluC und Trypsin
Massenspektren von hitzeinkubiertem -Casein-Standard . . . . . . . .
Massenspektren von hitzeinkubiertem -Casein-Standard - Zeitserie . .
SDS-PAGE von UHT-Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Peptid 2120 mit Amadoriprodukt nach Gelelektrophorese . . . . . . . .
Peptid 1778 mit Oxidation nach Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . .
Peptid 1581 aus -Casein mit Amadoriprodukt nach Gelelektrophorese
Fraktionierung des -Casein-GluC-Hydrolysates nach HPLC-Auftrennung
Chromatogramme von im Modellsystem inkubiertem -Casein-Standard
Fraktionierung des -Lactalbumin-Hydrolysates nach HPLC-Auftrennung
Modifikationen von -Lactalbumin nach Inkubation mit Lactose . . . .
Fraktionierung des s1 -Casein-Hydrolysates nach HPLC-Auftrennung .
Modifikationen von s1 -Casein nach Inkubation; Proteinsequenz . . . .
a
b
b
a
a
a
a
a
a
a
a
b
7
7
8
10
13
16
17
18
21
23
26
27
31
32
34
36
38
39
39
41
43
44
46
48
51
xi
xii
2.16
2.17
2.18
2.19
HPLC-Trennung der Milchproteine aus UHT-Milch; Peakidentifizierung
Vergleich von „massive steel target“ und „ground steel target“ . . . . .
Matrixvergleich ClCCA, CCA und DHAP . . . . . . . . . . . . . . . .
Vergleich von MS-Spektren nach und ohne HPLC-Peptidfraktionierung
54
57
60
63
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
Änderung von Retentionszeit und Peakhöhe durch Erhitzung . . . . . . 73
Nachweis von Modifikationen mittels MALDI-TOF-MS-Spektren . . . . 77
Modifikationen von s1 -Casein in Milchproben; Proteinsequenz . . . . . 79
Abhängigkeit der Modifikationsrate von der Laserenergie . . . . . . . . 83
Modifikationsraten nach Inkubation von Rohmilch bei 60 °C - I . . . . 85
Modifikationsraten nach Inkubation von Rohmilch bei 60 °C - II . . . . 86
Modifikationsraten bei Peptid 2120 aus inkubierter Rohmilch . . . . . . 87
Modifikationsraten nach Inkubation von Rohmilch bei 99 °C - I . . . . 88
Modifikationsraten nach Inkubation von Rohmilch bei 99 °C - II . . . . 89
Vergleich der Modifikationsraten von Rohmilch, UHT- und Sterilmilch . 91
Modifikationsraten in Kindermilchproben . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Modifikationsraten in Kindermilchprobe 6 . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Vergleich Rohmilchinkubation mit Handelsproben - I . . . . . . . . . . 96
Vergleich Rohmilchinkubation mit Handelsproben - II . . . . . . . . . . 97
Vergleich Rohmilchinkubation mit Handelsproben - III . . . . . . . . . 98
Zyklisierung Glutamin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
EMS-Scan: Peptid 1049 Amadoriprodukt . . .
Peptid 876 mit zugehörigen Fragmenten . . .
Spektrum des zweifach oxidierten Peptids 876
LC-MS/MS-Spektrum von Peptid 1049 . . . .
5.1
Berechnung von Modifikationsraten mit Excel . . . . . . . . . . . . . . 139
a
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
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.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
109
112
112
113
113
114
114
115
Tabellenverzeichnis
1.1
1.2
1.3
1.4
Zusammensetzung von Kuhmilch . . . . . . . . . . . .
Milchproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Schnittstellen einiger Endoproteinasen . . . . . . . . .
Massenunterschiede durch Modifikationen und Addukte
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
2
3
14
15
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
Identifikation von Peptiden aus -Casein in HPLC-Fraktionen . . .
Ergebnisse und Methodenvergleich -Casein . . . . . . . . . . . . .
Identifikation von Peptiden aus -Lactalbumin in HPLC-Fraktionen
Identifikation von Peptiden aus s1 -Casein in HPLC-Fraktionen . .
CML-Modifikationen und AP von s1 -Casein nach Inkubation . . .
Methodenvergleich für s1 -Casein . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zuordnung Fraktionen-Peptide-Matrix . . . . . . . . . . . . . . . .
Nachgewiesene Modifikationen von -Lactalbumin . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
42
43
45
49
50
53
59
65
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
Charakteristika der untersuchten Kindermilchproben . . . . . . . . . . 76
In Milchproben nachgewiesene Modifikationen des s1 -Caseins . . . . . 78
In inkubierten Milchproben nachgewiesene Modifikationen in s1 -Casein 80
Modifikationsraten des bei 60 °C inkubierten -Casein-Standards . . . . 84
Zusammenstellung qualitativ und quantitativ in Milchproben nachgewiesener Modifikationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
4.1
4.2
Zuordnung von Peptiden und Retentionszeiten; Nachweis von APs . . . 108
Prekursoren für EPI-Scan und Zuordnung zu modifizierten Peptiden . . 111
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
Parameter der Peptidtrennung bei -Lactalbumin mittels HPLC
Verdünnung der einzelnen Kindermilchproben . . . . . . . . . .
Parameter der Proteintrennung mittels HPLC . . . . . . . . . .
Parameter der Peptidtrennung mittels HPLC . . . . . . . . . . .
Zuordnung Fraktionen-Peptide-Matrix . . . . . . . . . . . . . .
Parameter der UHPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
b
a
a
a
.
.
.
.
.
.
.
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b
a
a
a
a
a
a
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.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
134
135
136
137
138
141
xiii
Tabellenverzeichnis
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
xiv
Die 20 proteinogenen Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Peptide aus dem Verdau von s1 -Casein mit AspN . . . . . . . . . . . .
Peptide aus dem Verdau von s1 -Casein mit Trypsin . . . . . . . . . . .
Peptide aus dem Verdau von s1 -Casein mit GluC im Bicarbonatpuffer
Peptide aus dem Verdau von s1 -Casein mit GluC im Phosphatpuffer .
Peptide aus dem Verdau von -Casein mit GluC im Phosphatpuffer . .
Peptide aus dem Verdau von -Lactalbumin mit AspN . . . . . . . . .
a
a
a
a
b
a
155
156
156
157
158
159
160
1 Einleitung
1.1 Milchprodukte als Teil der täglichen Ernährung
Milchprodukte stellen einen wichtigen Bestandteil unserer täglichen Ernährung dar.
Die Produktpalette reicht von der Milch selbst über Kondensmilch, Kindermilchnahrung, Sahne, Butter, Magermilchgetränke, Joghurt, Kefir und Quark bis hin zu unterschiedlichsten Käsesorten. Eine Einteilung der Produkte kann nach dem Fettgehalt
erfolgen, der beispielsweise bei entrahmter Milch unter 0,3 % und bei Butter über 81 %
liegt [1]. Alternativ werden die Milchprodukte in fermentierte (Kefir, Joghurt) und
nicht-fermentierte Produkte eingeteilt (Milch, Sahne) oder nach der Art der bei der
Herstellung angewandten Hitzebehandlung unterschieden.
Kindernährmittel sind speziell für Säuglinge und Kleinkinder geeignete Nahrungsmittel. Viele dieser Produkte basieren auf Kuhmilch und werden als Kindermilchnahrungen
bezeichnet. Oft wird ihre Zusammensetzung durch Zusatz von Lactose und Molkenproteinen der von Muttermilch angenähert. Außerdem können ungesättigte Fettsäuren,
Eisen und Vitamine zugesetzt werden [2], um eine optimale Versorgung des Kleinkindes mit Nährstoffen zu gewährleisten. Kindermilchnahrungen werden unterteilt in
Anfangs- und Folgemilch; dabei ist Anfangsmilch optimiert für Säuglinge bis zu etwa
sechs Monaten, Folgemilch ist je nach Produkt ab dem sechsten oder zwölften Monat
zur Ernährung geeignet.
1.2 Hitzebehandlung von Milch
Speziell bei Milch gibt es verschiedene Produkte, die sich in der Art der Erhitzung
unterscheiden. Rohmilch ist nicht wärmebehandelt und wird am Hof des Erzeugers
oder unter der Verkehrsbezeichnung Vorzugsmilch über den Einzelhandel verkauft [3].
Frischmilch wird pasteurisiert, also für 15-30 Sekunden auf 72-75 °C erhitzt. Länger haltbare, sogenannte ESL-Milch („Extended Shelf Life“) wird bei 125-127 °C für
2-4 Sekunden hitzebehandelt (oder es wird der Rahm bei 72-75 °C erhitzt und die
1
1. Einleitung
Tab. 1.1: Zusammensetzung von Kuhmilch
mittlerer Anteil Schwankungsbreite
(Massenprozent)
(Massenprozent)
Wasser
87,3
85,5 - 88,7
Fett
3,9
2,4 - 5,5
Proteine
3,3
2,3 - 4,4
Lactose
4,6
3,8 - 5,3
Mineralstoffe
0,7
0,5 - 0,8
Enzyme, Vitamine, etc.
0,2
0,1 - 0,3
Komponente
Magermilch mikrofiltriert). H-Milch oder UHT-Milch („Ultra-High-Temperature“)
wird für 2-8 Sekunden auf 136-145 °C erhitzt, Sterilmilch wird durch Erhitzung von
Milch auf 107-115 °C für 20-40 Minuten (alternativ 120-130 °C für 8-12 Minuten in der
Verpackung) hergestellt [1], [4].
Milch wird hitzebehandelt, um ihre Haltbarkeit zu verlängern. Trotz diverser Vorsichtsmaßnahmen kann Milch mit Bakterien belastet sein. Häufig kommen Milchsäurebakterien (u.a. Lactokokken, Lactobazillen) vor, allerdings konnten auch pathogene
Keime (z.B. Salmonellen, Listerien, EHEC) in Milch nachgewiesen werden. Durch die
Hitzebehandlung werden vorhandene Keime, bei intensiverer Hitzebehandlung auch
die Sporen abgetötet, sodass das Produkt länger genießbar bleibt. Während Sterilmilch
monatelang bei Raumtemperatur gelagert werden kann, muss auf der Verpackung von
Vorzugsmilch ein Verbrauchsdatum angegeben sein, das nicht später als 96 Stunden
nach der Gewinnung liegen darf [3]. Schwangeren und Kindern wird vorsichtshalber
vom Verzehr von Rohmilch abgeraten. Die speziell für Babys geeignete Säuglingsmilchnahrung wird verhältnismäßig stark hitzebehandelt, da die körpereigenen Abwehrkräfte von Kleinkindern noch nicht so stark ausgeprägt sind wie bei Erwachsenen; daher
müssen gerade diese Produkte frei von pathogenen Keimen sein.
1.3 Inhaltsstoffe von Milch
1.3.1 Begriffsklärung
Im Rahmen dieser Arbeit ist mit Milch immer Kuhmilch gemeint, analog zur rechtlichen
Definition. Abgesehen von Kuhmilch werden weltweit vor allem Büffel-, Ziegen- und
Schafmilch produziert; sie alle unterscheiden sich in ihrer genauen Zusammensetzung
[1]. Über die Zusammensetzung von Kuhmilch informiert Tab. 1.1 (nach [5] in [6]).
2
1.3. Inhaltsstoffe von Milch
Tab. 1.2: Milchproteine
Anteil in
Gruppe
39,8 %
s1 -Casein
-Casein
10,9 %
s2
Caseine
-Casein
32,6 %
-Casein
10,9 %
-Lactalbumin
20,7 %
Molken-Lactoglobulin
54,6 %
proteine
BSA
6,9 %
Immunoglobuline
7,5 %
Gruppe
Protein
a
b
1
a
a
b
k
Anteil am
Konz.
Milchprotein
in g/l
32,5 %
12 - 15
8,9 %
3-4
26,6 %
9 - 11
8,9 %
2-4
3,6 %
0,6 - 1,7
9,5 %
2-4
1,2 %
0,4
1,3 %
0,4 - 0,8
Masse
in Da
22.975
24.349
23.583
18.974
14.186
18.281
66.433
Code 1
P02662
P02663
P02666
P02668
P00711
P02754
P02769
Zugangsnummer des Proteins in der Datenbank „UniProtKB“ (erreichbar unter www.expasy.org)
1.3.2 Milchproteine
Überblick
Die Proteine in Milch werden in Molkenproteine und Caseine unterteilt. Definitionsgemäß fallen Caseine aus, wenn Milch bei 20 °C auf pH 4,6 angesäuert wird; sie machen
etwa 80 % aller Milchproteine aus, die unter diesen Bedingungen löslichen Molkenproteine 20 % (s. Tab. 1.3.2) [6], [7].
Die in Tab. 1.3.2 genannten Proteine stellen die wichtigsten Vertreter der beiden
Gruppen dar. In der Caseinfraktion finden sich des Weiteren beispielsweise Abbauprodukte der anderen Caseine, gebildet durch milcheigene Proteinasen, wie Chymosin oder
Plasmin. Solche Fragmente können auch in Molke auftreten. Zu den Molkenproteinen
zählen außer den genannten auch Proteine aus der Membran der Fettkügelchen oder
Lactoferrin [6].
Die hier angegebenen Massen berücksichtigen keine posttranslationalen Veränderungen der Proteine, also insbesondere keine Phosphorylierungen oder Disulfidbrücken. In
der letzten Spalte sind die Zugangsnummern für die Datenbank „UniProtKB“ (Protein Knowledgebase), erreichbar unter www.expasy.org, genannt. Nähere Informationen
hierzu finden sich in Kap. 2.3.1 und Kap. 5.6.2. Die angegebenen Massen sind dieser Datenbank entnommen und wurden teilweise durch eigene Messungen bestätigt
(s. Kap. 2.2.1).
3
1. Einleitung
Genetische Varianten
a-Lactalbumin, b-Lactoglobulin sowie die Caseine liegen in unterschiedlichen sogenannten genetischen Varianten vor. Weltweit wird Milch von Kühen verschiedener Rassen
gewonnen, die nicht den gleichen Genotyp aufweisen. Auf Grund dieser genetischen
Unterschiede werden auch verschiedene Varianten der einzelnen Caseine exprimiert.
Eine ungefähre regionale Zuordnung einzelner genetischer Varianten ist auf Grund der
jeweils bevorzugt eingesetzten Tierrasse möglich. Die Varianten unterscheiden sich untereinander in der Aminosäuresequenz, wobei im Wesentlichen bestimmte Aminosäuren
durch andere ausgetauscht sind oder an definierten Positionen einzelne Aminosäuren
fehlen [1].
Im Falle des s1 -Caseins sind bisher die Varianten A, B, C, D, E, F, G und H bekannt
[7]. In dieser Arbeit wurde die in der westlichen Welt vorherrschende Variante B (Bos
taurus) untersucht [1]. Die Unterschiede zwischen einzelnen Varianten können bei der
Lebensmittelherstellung von großer Bedeutung sein. Beispielsweise weist Quark, der
aus s1 -Casein B hergestellt wird, eine deutlich höhere Schnittfestigkeit auf als einer
aus Variante A (die 13 Aminosäuren kürzer ist als Variante B) [8].
a
a
Disulfidbrücken
In vielen Proteinen kommt es zur Bildung von Disulfidbindungen zwischen zwei Cysteinresten. Die hier untersuchten Proteine s1 -Casein und -Casein enthalten jedoch
beide kein Cystein in der Aminosäuresequenz; daher bilden sie auch keine Disulfidbindungen aus. -Lactalbumin hingegen enthält acht Cysteinreste und vier Disulfidbrücken; -Lactoglobulin bildet zwei, BSA siebzehn sowie s2 -Casein und -Casein
je eine Disulfidbrücke aus [7].
a
b
b
a
a
k
Phosphorylierung
Zu den posttranslationalen Modifikationen eines Proteins gehört neben der Bildung
von Disulfidbrücken auch seine Phosphorylierung. Während die in Tab. 1.3.2 genannten
Molkenproteine nicht phosphoryliert vorliegen, trägt in allen dort genannten Caseinen
mindestens ein Serinrest eine Phosphatgruppe. In s2 -Casein sind 11 Serinreste, in
-Casein ist nur Ser149 phosphoryliert [7].
Bei -Casein sind laut Literatur fünf Serinreste phosphoryliert (Ser15, 17, 18, 19, 35)
[7], die Datenbank „UniProtKB“ unter www.expasy.org listet aber nur die ersten vier
Modifikationsstellen auf. Diese Angabe wurde bei den selbst durchgeführten Messungen
k
4
a
b
1.3. Inhaltsstoffe von Milch
a
bestätigt (s. Kap. 2.2.1). Bei s1 -Casein sind acht Serinreste phosphoryliert (Ser46, 48,
64, 66, 67, 68, 75, 115) [7]. Diese achtfache Phosphorylierung konnte im o.g. Experiment
bestätigt werden; es wurde für s1 -Casein B-8P eine Masse von 23.615 Da bestimmt, in
Übereinstimmung mit Tab. 1.3.2 und Angaben in der Literatur [7].
a
Struktur und Funktion einzelner Milchproteine
as1-Casein ist eine Peptidkette aus 199 Aminosäuren (s. Tab. 8.1), darunter 14 Lysin-,
5 Methionin- und 2 Tryptophanreste (C1035 H1587 N265 O317 S5 ). Seine Vorstufe enthält
zusätzlich eine Signalsequenz mit 15 Aminosäuren, die abgespalten wird. Eine 3DStruktur konnte bisher nicht ermittelt werden, da s1 -Casein keine Kristalle bildet;
NMR-Studien wurden durch Bildung von Aggregaten erschwert. Vermutlich verhindert
das gleichmäßig über das Protein verteilte Prolin, dass sich größere reguläre Strukturen
bilden. Dennoch gibt es polar-saure und apolare Abschnitte in s1 -Casein. Letztere führen zu einer großen Assoziationsneigung, andererseits stoßen sich die Phosphatgruppen
gegenseitig ab. Dennoch ist das in Milch vorliegende Calciumsalz des Proteins an sich
nicht löslich.
-Casein enthält 209 Aminosäuren (darunter 11 Lysin- und 6 Methioninreste sowie
einen Tryptophanrest) und liegt wie s1 -Casein in mehreren genetischen Varianten vor;
die wichtigste ist -Casein A2 . -Casein ist das Casein mit der größten Hydrophobizität;
auch -Casein würde als Calciumsalz in Milch ausfallen. -Casein besteht zu etwa 9 %
aus -Helices und zu ca. 25 % weist es -Faltblatt-Strukturen auf.
-Casein besitzt 169 Aminosäuren und kommt in elf verschiedenen genetischen Varianten vor. -Casein ist ein Glycoprotein, das in diversen Glycosylierungs- und Phosphorylierungsgraden als Oligomer vorliegt; dennoch ist der größte Teil nicht glykiert.
Trotzdem ist -Casein löslich, auch bei milchtypischen Calciumkonzentrationen.
-Casein verhindert durch Komplexbildung, dass die übrigen Caseine präzipitieren;
nur so können sich stabile Caseinmizellen bilden. Diese Proteinaggregate sind ungefähr 150 nm groß und enthalten etwa 25.000 Monomere. Die Bindung erfolgt über
Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und über Calciumphosphatbrücken. Labenzym spaltet von -Casein spezifisch nach Aminosäure 105 ein Glycopeptid ab. Das verbleibende para- -Casein ist unlöslich und die Caseine fallen aus,
was die Grundlage der Käseherstellung darstellt.
Von -Lactalbumin sind bisher drei genetische Varianten bekannt; ebenso konnte hier
eine biologische Funktion aufgeklärt werden: Im Golgi-Apparat der Epithelzellen von
Milchdrüsen bildet -Lactalbumin mit der -1,4-Galactosyltransferase einen Komplex.
a
a
b
k
a
b
b
b
a
b
b
k
k
k
k
k
a
a
b
5
1. Einleitung
Die Transferase selbst ist wenig spezifisch und zeigt eine geringe Affinität gegenüber
Glucose. Die Affinität des Komplexes, der Lactosesynthase, ist deutlich höher, sodass
die Bildung von Lactose aus Glucose und UDP-Galactose auch bei geringen Glucosekonzentrationen abläuft.
Lactoferrin enthält 689 Aminosäuren sowie 17 Disulfidbindungen und kommt in verschiedenen Glycosylierungsgraden vor. Es ist anti-mikrobiell wirksam, indem es beispielsweise Mikroorganismen das benötigte Eisen entzieht [9]. [1], [7]
1.4 Während der Hitzebehandlung von Milch
ablaufende Vorgänge
Durch die Hitzebehandlung von Milch kommt es zu verschiedenen Reaktionen ihrer
Inhaltsstoffe. Die zwei grundlegenden Prozesse sind einerseits die Maillard-Reaktion,
andererseits die Oxidation. Beide Reaktionen sollen in den folgenden Kapiteln kurz
erläutert werden.
1.4.1 Die Maillard-Reaktion, ihre Produkte und deren Relevanz
Maillard-Reaktion und AGE-Bildung
Louis Camille Maillard (1878 - 1936) hat die Reaktion von Aminosäuren mit reduzierenden Zuckern untersucht. Die nach ihm benannte Maillard-Reaktion fasst unterschiedliche Reaktionen, die zu einer komplexen Vielzahl unterschiedlicher Produkte führen,
zusammen. Diese Reaktionen laufen insbesondere bei der Erhitzung von Lebensmitteln ab, oft verbunden mit deren Braunfärbung. Grund hierfür ist, dass während der
Erhitzung braune Verbindungen gebildet werden können. Beim Backen von Brot beispielsweise ist die Maillard-Reaktion erwünscht, sie führt zu wichtigen Aroma- und Geschmacksstoffen vor allem in der Brotkruste. In anderen Fällen können unerwünschte
Stoffe wie Acrylamid entstehen. Bei sterilisierter Milch ist eine Gelb- oder Braunfärbung zu erkennen, die in diesem Fall nicht erwünscht ist; ebenso kann es zur Bildung
von Fehlaromen kommen.
Da die Maillard-Reaktion keine enzymatischen Prozesse beschreibt wird sie auch als
nicht-enzymatische Bräunung bezeichnet; sie kann auch während der Lagerung von
Lebensmitteln und in vivo ablaufen [10]. Die Maillard-Reaktion lässt sich in eine frühe
und eine späte Phase einteilen. In der frühen Phase bildet sich das erste stabile Reak-
6
1.4. Während der Hitzebehandlung von Milch ablaufende Vorgänge
Abb. 1.1: Maillard-Reaktion zwischen Lactose und Protein
Abb. 1.2: Strukturen einiger AGEs. CEL: Carboxyethyllysin;
GOLD: Glyoxal-Lysin-Dimer; MOLD: Methylglyoxal-Lysin-Dimer
tionsprodukt, das Amadoriprodukt (AP). In Milch kommt es vorrangig zur Reaktion
des Milchzuckers, also der Lactose, mit Aminogruppen im Protein. Typischerweise wird
Lysin modifiziert, da dessen -NH2 -Gruppe bevorzugt angegriffen wird. Es kann aber
auch der N-Terminus die Reaktion eingehen, die in Abb. 1.1 gezeigt ist.
Bei fortgesetzter Erhitzung bilden sich sogenannte AGEs („Advanced Glycation Endproducts“). Zu dieser Gruppe gehört eine Vielzahl stark unterschiedlicher Strukturen,
die nur teilweise bekannt sind. Vertreter sind CML (s. Abb. 1.1 rechts), die in Abb. 1.2
(nach [10]) gezeigten Strukturen sowie Melanoidine. Letztere sind hochmolekulare, teilweise stickstoffhaltige Verbindungen, die intensiv braun gefärbt sind. Im unteren Teil
der Abbildung sind AGEs dargestellt, die zwei Peptidketten miteinander verbinden,
e
7
1. Einleitung
Abb. 1.3: Ein Mechanismus zur Bildung von CML (nach [13])
also über Heterozyklen sogenannte Proteinquervernetzungen ausbilden. Durch solche
Veränderungen der Proteine können diese ihre Fähigkeit, bestimmte Funktionen zu
erfüllen, verlieren.
Im Verlauf dieser Reaktionen entstehen auch Dicarbonylverbindungen wie Glyoxal,
Methylglyoxal und 3-Desoxyglucoson, die als reaktive Vorläufermoleküle zur Bildung
von AGEs beitragen [11]. Die Komplexität dieser Reaktionen zeigt sich daran, dass
aus den gleichen Vorstufen verschiedene Produkte gebildet werden, andererseits unterschiedliche Mechanismen zu einem bestimmten AGE führen. So kann Glyoxal beispielsweise zu CML oder GOLD weiter reagieren [11], während CML gebildet werden kann
durch eine Retroaldol-Reaktion aus dem Amadoriprodukt (s. Abb. 1.3), durch Reaktion
von Lysin mit Glyoxal oder durch oxidative Spaltung des Amadoriprodukts (s. Abb.
1.1) (metallkatalysiert oder durch reaktive Sauerstoffspezies wie Wasserstoffperoxid,
Hydroxyl- oder Superoxidradikale) [12].
Bedeutung der AGEs in Lebensmitteln
Da die meisten Lebensmittel sowohl Kohlenhydrate als auch Proteine enthalten, sind
auch die Produkte der Maillard-Reaktion in unserer täglichen Ernährung vorhanden.
Von den aufgenommenen niedermolekularen Verbindungen werden bis zu 30 % resorbiert [14]. Ein Teil davon wird nach einigen Stunden renal ausgeschieden; dennoch
konnte gezeigt werden, dass bei AGE-reicher Ernährung der AGE-Spiegel im Blut um
etwa 30 % steigt [15]. Außerdem war bei Individuen mit AGE-reicher Nahrung eine
8
1.4. Während der Hitzebehandlung von Milch ablaufende Vorgänge
höhere Gewichtszunahme als bei Kontrollgruppen zu beobachten. Diese Ergebnisse
wurden in mehreren Tier- und Humanstudien bestätigt (zusammengestellt in [16]).
AGEs können an verschiedene Rezeptoren von Zellen binden, darunter an RAGE
(„Receptor for AGEs“). Es konnte gezeigt werden, dass durch Bindung von AGEs
an RAGE der oxidative Stress zunimmt und der Transkriptionsfaktor NF- B hochreguliert wird, was eine veränderte Genexpression zur Folge hat. Beispielsweise wurde
eine verstärkte Expression der Hämoxygenase beobachtet. Diese Effekte konnten durch
Gabe von RAGE-Antikörpern oder Antioxidantien unterbunden werden [17]. Oxidativer Stress kann zur Schädigung von Lipiden, Proteinen und DNA führen. Außerdem
können reaktive Sauerstoffspezies in Signalwege eingreifen, die Zellproliferation und
Apoptose regulieren. Oxidativer Stress und damit AGEs werden in Zusammenhang
mit Krankheiten wie Krebs, Alzheimer, Diabetes und Arteriosklerose gebracht [18].
k
1.4.2 Oxidation einzelner Aminosäuren
Neben der Maillard-Reaktion kommt es bei der Erhitzung von Lebensmitteln zur Oxidation bestimmter Aminosäuren. Betroffen von oxidativer Schädigung sind vor allem
die schwefelhaltigen Aminosäuren sowie Tryptophan und Lysin. Die Oxidation von Methionin, Cystein, Tryptophan und Lysin kann aber auch bei Raumtemperatur und in
vivo ablaufen. Abb. 1.4 (nach [19]) zeigt Abbauprodukte der Aminosäuren.
1.4.3 Konsequenzen der Hitzebehandlung von Milch
Die Erhitzung von Milch erhöht ihre mikrobielle Stabilität und damit die Haltbarkeit. Allerdings ergeben sich durch die Hitzebehandlung auch einige Nachteile. Bereits
genannt wurden eine möglicherweise unerwünschte Verfärbung der Lebensmittel, die
Entstehung von Fehlaromen sowie die Bildung von AGEs und die sich daraus ergebenden Konsequenzen (s. Kap. 1.4.1). Ein weiterer negativer Effekt ist der Abbau von
in Milch enthaltenen Vitaminen. Vor allem die Vitamine B1 , B6 , B12 und Vitamin C
sind hiervon betroffen; bei der UHT-Erhitzung kommt es zu etwa 10-30 % Verlust, bei
Sterilmilch sogar zu 50-100 %, abhängig vom betrachteten Vitamin [1].
Ein weiteres Problem der Erhitzung stellt der Verlust an bestimmten, sogenannten
essentiellen Aminosäuren dar. Das sind die Aminosäuren, die der menschliche Körper
nicht selbst synthetisieren kann und daher über die Nahrung aufnehmen muss; hierzu
gehören unter anderen Lysin, Methionin und Tryptophan. Durch die oben gezeigten
Reaktionen können die modifizierten Aminosäuren nicht mehr vom Körper verstoff-
9
1. Einleitung
Abb. 1.4: Strukturen oxidativ modifizierter Aminosäuren
wechselt werden [20]. Modifikationen können also die biologische Wertigkeit eines Proteins absenken. Ist ein großer Anteil einer Aminosäure wie z.B. Lysin modifiziert, kann
es zu einer Unterversorgung kommen. Bei Erwachsenen können die Verluste an einzelnen Aminosäuren in Milchprodukten über eine ausgewogene Ernährung kompensiert
werden; Babys jedoch verzehren ausschließlich Milch. Daher sind vor allem bei Kindernährmitteln für Säuglinge die ernährungsphysiologischen Eigenschaften besonders
entscheidend [20]. Aus diesem Grund ist der Verlust an essentiellen Aminosäuren ein
wichtiger Gegenstand von Untersuchungen.
1.5 Analytik modifizierter Aminosäuren in Proteinen
1.5.1 Nachweisverfahren
Es wurden bisher mehrere Verfahren in der Literatur beschrieben, die geeignet sind,
Maillard-Produkte nachzuweisen. Ein mögliches Verfahren zur Bestimmung des Ausmaßes einer Lysinschädigung ist die Furosinmessung. Furosin ist ein Lysinderivat
(Ne -(2-Furoylmethyl)-lysin), das bei der Säurehydrolyse von Proteinen aus proteingebundenem Lactulosyllysin entsteht, jedoch nicht bei der Maillard-Reaktion selbst [21].
Durch Bestimmung des Furosingehaltes kann somit auf den Amadoriprodukt-Gehalt
10
1.5. Analytik modifizierter Aminosäuren in Proteinen
rückgeschlossen werden [22]. Als analytische Methoden können hier Ionenaustauschchromatografie [23]/[24], HPLC-UV [25], Gaschromatografie [26], Kapillarelektrophorese [27] und LC-MS/MS [28] eingesetzt werden. Eine alternative Methode wurde von
Henle et al. vorgestellt, mit der Lactulosyllysin direkt, nach enzymatischer Proteinhydrolyse, am Aminosäurenanalysator mittels Ionenaustauschchromatografie vermessen
werden kann [29].
Eine andere Möglichkeit zum Nachweis der Maillard-Reaktion ist die Untersuchung
von Enzymen. Werden Aminosäuren in deren aktivem Zentrum modifiziert, so sinkt
häufig die enzymatische Aktivität ab [30]. Durch enzymatische Hydrolyse, massenspektrometrische Untersuchung und anschließenden Edman-Abbau kann die Art der
Modifikation und ihre Position im aktiven Zentrum nachgewiesen werden. Dies gelang bereits bei dem Enzym Glutathion-Peroxidase, dessen Aktivität nach Inkubation
mit Methylglyoxal abnahm. Gleichzeitig wurden zwei modifizierte Argininreste in der
Bindetasche nachweisbar [31]. Bei dem Enzym Aldehydreductase wurde ebenfalls eine
geringere Aktivität der glykierten gegenüber der nativen Form nachgewiesen, ebenso
fünf modifizierte Lysinreste [32].
Auch zur Bestimmung von CML als Vertreter der AGEs sind diverse Methoden
publiziert. Ein auch quantitativer Nachweis von CML kann mittels ELISA erfolgen
[33]/[34]. Alternativ kann Western Blotting eingesetzt werden. In diesem Fall wird
die Probe zunächst über ein- oder zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt.
Anschließend werden die Proteine vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran übertragen
und diese mit anti-CML-Antikörpern inkubiert [35].
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Untersuchung verschiedener Lebensmittel
nach Proteintotalhydrolyse mit RP-HPLC und Fluoreszenzdetektion nach Derivatisierung von CML mit OPA [36]/[37]. Außerdem kann nach entsprechender Derivatisierung
eine GC-Analytik [38]/[39] bzw. GC-MS-Analytik eingesetzt werden [40]/[41]. Die in
einigen Studien ermittelten CML-Gehalte in bestimmten Lebensmitteln waren bei GCMS- und HPLC-Analytik allerdings wesentlich geringer als bei Untersuchungen mittels
ELISA. Bei Verfahren, die auf Antikörperreaktionen basieren, besteht die Gefahr, dass
Antikörper unspezifisch an Matrixbestandteile binden; das könnte die ermittelten Abweichungen erklären [41]. Außerdem kann mittels ELISA nicht genau bestimmt werden,
welche Aminosäure im Protein modifiziert ist.
Weitere häufig eingesetzte Methoden zur Analytik von Proteinmodifikationen sind
LC-MS/MS [42]/[43]/[35] und MALDI-TOF-MS [44]/[45]/[19]/[46]. Auch bei diesen
massenspektrometrischen Methoden wird auf den Einsatz von Antikörpern verzich-
11
1. Einleitung
tet; die Ionisierung erfolgt in beiden Fällen durch spezielle, möglichst schonende Verfahren. Massenspektrometrisch können einerseits unterschiedlichste Maillard-Produkte
mit sehr hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden, andererseits können in einem
ungerichteten Ansatz Proben auch nach unbekannten Reaktionsprodukten durchsucht
werden. Ein großer Vorteil von MALDI-TOF-MS- gegenüber LC-MS/MS-Messungen
ist, dass bei der Vermessung von Peptiden in der Regel einfach geladene Ionen gebildet
werden, was die Interpretation der Spektren wesentlich erleichtert.
1.5.2 Vermessung intakter und totalhydrolysierter Proteine
Mittels massenspektrometrischer Verfahren können einerseits intakte Proteine vermessen werden [46]; ebenso können auch die einzelnen Aminosäuren eines Proteins frei
vorliegend untersucht werden, wenn das Protein vor der Messung komplett hydrolysiert wird [42]/[43]/[35]. Diese Spaltung aller Peptidbindungen eines Proteins kann
durch den Einsatz geeigneter Enzyme oder durch Säureeinwirkung erreicht werden [43]
und wird als Totalhydrolyse bezeichnet. Die beiden genannten Vorgehensweisen liefern
jedoch keine positionsspezifischen Ergebnisse.
1.5.3 Vermessung partiell hydrolysierter Proteine
Neben der vollständigen Hydrolyse eines Proteins ist auch dessen partielle Hydrolyse
möglich. Der Vorteil dieser Spaltung eines Proteins in Peptide liegt darin, dass die
Position einer nachgewiesenen Modifikation in einem Peptid lokalisiert und damit auf
einen kleinen Abschnitt des gesamten Proteins festgelegt werden kann.
Prinzip des positionsspezifischen massenspektrometrischen Nachweises von
Modifikationen
In Abb. 1.5 ist schematisch ein (sehr kurzes Modell-) Protein gezeigt. Ein Teil der Moleküle ist modifiziert: die zweite Aminosäure ist zweifach modifiziert, die letzte Aminosäure trägt eine andere Modifikation. Beim Verdau entstehen beispielhaft drei Peptide,
die drei Peaks im Massenspektrum ergeben. Da ein Teil der Peptide modifiziert ist,
ergeben sich zusätzlich zwei weitere Peaks. Die Massendifferenz zum jeweiligen nichtmodifizierten Peptid entspricht genau der Masse der Modifikation. Daher erlaubt dieser
Massenunterschied Rückschlüsse auf die Art der Modifikation. Da die Peptide über ihre
Massen identifiziert werden können, kann auch bestimmt werden, in welchem Abschnitt
12
Abb. 1.5: Prinzip des positionsspezifischen massenspektrometrischen
Nachweises von Modifikationen. AA: Aminosäure
des ursprünglichen Proteins eine gemessene Modifikation lokalisiert ist. Handelt es sich
beispielsweise um eine Lysinmodifikation und der betreffende Abschnitt beinhaltet nur
einen Lysinrest, so kann die Position des modifizierten Lysinrests im Protein genau
angegeben werden; die Analytik ist positionsspezifisch.
Spaltung von Proteinen in Peptide
Es existieren verschiedene Möglichkeiten, Proteine in Peptide zu spalten. Ein Beispiel
für eine chemische Peptidbindungsspaltung ist die Bromcyanspaltung; bei diesem nichtenzymatischen Prozess wird die Peptidbindung C-terminal von einem Methioninrest
gespalten [47].
Häufiger kommt jedoch eine enzymatische Spaltung von Peptidbindungen zum Einsatz. Auch diese Spaltungen laufen spezifisch nur an bestimmten Aminosäuren (s. Tab.
8.1) ab, die vom eingesetzten Enzym abhängen. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Verdauenzyme sind GluC, AspN, Trypsin und Chymotrypsin. Sie alle sind
Endoproteinasen, die spezifische Schnittstellen erkennen und Proteine nicht von einem
13
1. Einleitung
Tab. 1.3: Schnittstellen einiger Endoproteinasen
Enzym
Schnittstelle(n)
Position
GluC
E, (D)
C-terminal
AspN
D
N-terminal
Trypsin
K, R
C-terminal
Chymotrypsin Y, F, W, (L), (M), (A), (D), (E) C-terminal
Ende her abbauen. Die Spezifität dieser Enzyme kann Tab. 1.3 entnommen werden
(Quellen: Angaben des Herstellers). Die eingeklammerten Schnittstellen werden langsamer gespalten. Die entsprechenden Bindungen sind also nach dem Verdau nur zum
Teil hydrolysiert. Bei GluC läuft die Spaltung nach Asparaginsäure etwa 3.000-mal
langsamer ab als die nach Glutaminsäure. Dieser Unterschied hängt jedoch stark vom
eingesetzten Puffersystem ab. Daher werden bei einem GluC-Verdau in Bicarbonatpuffer und in Phosphatpuffer unterschiedliche Peptide erhalten (vgl. Kap. 2.3).
Eine enzymatische Proteinhydrolyse muss nicht vollständig ablaufen. Bestimmte
Schnittstellen werden nur nach längerer Zeit gespalten, andere gar nicht. So wird im
Protein beispielsweise vor und nach Prolin aus sterischen Gründen üblicherweise nicht
gespalten. Auch ist von Trypsin bekannt, dass es nach einem lactosylierten Lysinrest in
vielen Fällen nicht spaltet [48]/[49], weil das Enzym die Schnittstelle nicht erkennt. Aus
diesen Gründen treten im Hydrolysat Peptide auf, die eine (oder mehrere) übergangene
Schnittstelle(n), sogenannte „Missed Cleavage(s)“ (MC) enthalten.
Je länger die Verdaudauer ist, umso mehr Bindungen werden hydrolysiert. Ist diese Zeitspanne jedoch zu lang, können unerwünschte Nebenreaktionen wie Proteinmodifikationen oder das Wachstum von Mikroorganismen ablaufen. Daher und um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, wird die Verdaudauer auf eine bestimmte Zeit
standardisiert, die durch Optimierung ermittelt werden muss (s. Kap. 2.3.3).
Identifikation von Modifikationen
Ist eine Aminosäure modifiziert, so ist die Masse des Moleküls größer als die der nativen Aminosäure. Diese Massenänderung durch die Modifikation ist abhängig von der
Art der Modifikation und kann berechnet werden. Diese Werte gelten auch dann, wenn
die Aminosäure nicht frei sondern gebunden im Protein vorliegt. Der Nachweis einer
Modifikation mittels MALDI-TOF-MS erfolgt über die spezifischen Massenzunahmen,
die in Tab. 1.4 aufgeführt sind. Bei der Lactosylierung kommt es beispielsweise zur
Bindung von C12 H22 O11 unter Abspaltung eines Wassermoleküls. Gerechnet mit ge-
14
Tab. 1.4: Massenunterschiede durch Modifikationen und Addukte
Modifikationen
Addukte
Einfache Oxidation
16 Da
Zweifache Oxidation
32 Da
CML
58 Da
Amadoriprodukt
324 Da
zweifaches Amadoriprodukt 648 Da
Natriumaddukt
22 Da
Kaliumaddukt
38 Da
zweifaches Natriumaddukt
44 Da
nauen monoisotopischen Massen (s. Kap. 1.7.2) ergibt sich eine Massenzunahme von
324,1056 Da.
Neben der bereits erwähnten Lactosylierung konnten im Rahmen dieser Arbeit weitere Modifikationen nachgewiesen werden, darunter auch Mehrfach-Modifikationen einzelner Peptide. Im Falle des zweifachen Amadoriprodukts bedeutet das, dass das Peptid
mehrere Lysinreste enthält und zwei von ihnen mit je einem Lactosemolekül reagiert
haben (alternativ können auch der N-Terminus und ein Lysinrest glykiert sein).
Bei einem zweifach oxidierten Peptid können eine oder zwei Aminosäuren an der
Oxidation beteiligt sein. Es können Methionin oder Tryptophan entweder je doppelt
oxidiert vorliegen oder auch beide einfach oxidiert (vgl. Abb. 1.4). Welcher der beiden
Fälle vorliegt, konnte teilweise über die Peptidsequenz bestimmt werden: Enthält ein
Peptid nur eine der beiden Aminosäuren einmal, so muss diese doppelt oxidiert vorliegen. Bei den Peptiden, die Methionin und Tryptophan enthalten erfolgte die Abklärung
mittels UHPLC-MS/MS (in Kap. 4.3.2).
Bei Modifikationen werden die betroffenen Peptide verändert, was bestimmte Konsequenzen nach sich zieht (s. Kap. 1.4.3). Abzugrenzen von diesen Modifikationen ist die
Anlagerung von Metallionen an Peptide. Messungen haben gezeigt, dass an einige Peptide Metallionen angelagert sind, was ebenfalls die Masse der Moleküle erhöht (s. Tab.
1.4). Relevant waren hier Natrium- und Kaliumaddukte. Eine genauere Untersuchung
dieser Addukte findet sich in Kap. 2.7.3.
In Abb. 1.5 wurde schematisch der massenspektrometrische Nachweis von Proteinmodifikationen vorgestellt; Abb. 1.6 zeigt die Anwendung dieses Prinzips in der Praxis.
Es ist der Peak eines unmodifizierten Peptids zu sehen, ebenso dessen Natriumaddukt.
Über die mittels MALDI-TOF-MS ermittelten Massendifferenzen von 58 Da und 324 Da
wurden je eine CML-Modifikation und das Amadoriprodukt des Peptids nachgewiesen.
15
1. Einleitung
Abb. 1.6: MALDI-TOF-MS-Spektrum eines Peptids und Identifikation zugehöriger
Modifikationen
1.6 MALDI-TOF-Massenspektrometrie
1.6.1 Entwicklung
In den 1970er Jahren wurden bereits Proben in einer dünnen Schicht auf Metalloberflächen aufgebracht und mit Laserpulsen angeregt. Die Desorption von Analytmolekülen
gelang, jedoch zeigten die resultierenden Massenspektren geringe Intensitäten und eine starke Fragmentierung (LD-MS). 1987 beschrieben Karas und Hillenkamp erstmals
die Verwendung von kleinen organischen Molekülen als Matrix. Diese zeigen bei der
Wellenlänge des Lasers eine starke Absorption und geben die Energie an die Analyten
weiter [50]. Dadurch konnte eine schonende Ionisation erreicht werden, die die Fragmentierung minimierte und auch die Untersuchung großer Biomoleküle ermöglichte.
[51]
16
1.6. MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Abb. 1.7: Schematische Darstellung eines MALDI-Massenspektrometers (nach [51])
1.6.2 Überblick
Die Abkürzung MALDI-TOF-MS steht also für „Matrix Assisted Laser-Desorption/Ionisation - Time of Flight - Mass Spectrometry“. Damit werden die einzelnen Komponenten dieser Technik zusammengefasst: Die durch die spezielle Ionisierungstechnik
erzeugten Ionen werden beschleunigt und ihre Flugzeit wird gemessen. Daraus kann
die Masse einfach geladener Ionen errechnet werden.
1.6.3 Ionisierung
Die Ionisierung der Analyten erfolgt bei MALDI mit Hilfe eines Lasers, der auf einen
bestimmten Punkt auf dem Stahlträger gerichtet ist. Am Monitor zeigt das Bild der
CCD-Kamera, welche Stelle genau vom Laser getroffen wird. Der Probenteller, an dem
der Stahlträger fixiert ist, kann bewegt werden, wodurch verschiedene nebeneinander
aufgebrachte Proben nacheinander vermessen werden können und ebenfalls genau bestimmt werden kann, welcher Kristall vermessen werden soll.
Da die Proben mit einem Überschuss an Matrix cokristallisiert sind, trifft der Laserpuls höchstwahrscheinlich auf Matrixmoleküle, die dadurch angeregt werden. Sie geben
die Energie an die Probenmoleküle weiter, die desorbiert und gleichzeitig ionisiert werden. So wird eine schonende Ionisation erreicht, die eine Fragmentierung auch großer
Moleküle verhindert. [51]
17
1. Einleitung
Abb. 1.8: Chemische Strukturen der MALDI-Matrices CCA, ClCCA und DHAP
1.6.4 Probenvorbereitung
Als MALDI-Matrices stehen verschiedene Verbindungen zur Verfügung. Im Rahmen
dieser Arbeit wurde mit CCA (4-Hydroxy- -cyanozimtsäure), ClCCA (4-Chloro- cyanozimtsäure) und DHAP (2,5-Dihydroxyacetophenon) experimentiert; deren Strukturen sind in Abb. 1.8 dargestellt [52].
Für die Vermessung wird die Probenlösung zunächst mit einer gelösten MALDIMatrix vermischt. Etwa 1 µl dieser Mischung wird auf einen Stahlträger pipettiert.
Durch Verdampfen des Lösungsmittels bilden sich die Kristalle, die anschließend vermessen werden können.
a
a
1.6.5 Massenanalysator und Detektor
Die desorbierten Ionen werden durch ein an der Beschleunigungselektrode anliegendes
Potential beschleunigt. Nach der Beschleunigungsphase durchfliegen die Ionen eine feldfreie Driftstrecke und gelangen schließlich zum Detektor (vgl. Abb. 1.7). Als Detektor
wird meist ein Sekundärelektronenvervielfacher eingesetzt. Für die kinetische Energie der Ionen bei Eintritt in die feldfreie Driftstrecke gilt: z · e · U = ½ · m · v2 = Ekin .
Hierbei sind z der Betrag der Ladungszahl, e die Elementarladung, U die Beschleunigungsspannung, m die Masse eines Ions und v seine Geschwindigkeit. Da alle Ionen bei
der Beschleunigung (theoretisch) die gleiche Energie aufnehmen, haben sie unabhängig von ihrer Masse die gleiche kinetische Energie. Hieraus ergibt sich, dass schwerere
Ionen eine geringere Geschwindigkeit, leichtere Ionen höhere Geschwindigkeiten aufweisen. Im Flugzeit-Massenanalysator wird die Flugzeit der Ionen gemessen; daraus
kann bei bekannter Länge der Flugstrecke ihre Geschwindigkeit errechnet werden. Damit kann das Masse/Ladung-Verhältnis bestimmt werden: m/z = 2 · e · U/v2 . Typische
Werte sind Flugzeiten von etwa 1 µs bis 30 µs und Flugstrecken von einem Meter [53].
18
1.7. Interpretation von Massenspektren
Die Messung von Proteinen erfolgt meist mit linearer Driftstrecke. Peptide jedoch
werden im Reflektor durch ein elektrisches Gegenfeld umgelenkt und auf einen weiteren
Detektor gerichtet. Durch die längere Flugstrecke kann die Zeit genauer erfasst werden.
Ein weiterer Vorteil ist, dass im Reflektor Unterschiede in der aufgenommenen Energie bei der Beschleunigung ausgeglichen werden. Durch verschiedene Effekte kommt
es zu einer unerwünschten Geschwindigkeitsverteilung von Ionen gleicher Masse. Beispielsweise werden nicht alle Ionen exakt gleichzeitig desorbiert und auch nicht an der
gleichen Stelle. Außerdem führen abstoßende elektrische Kräfte und Abschirmeffekte
bei der Beschleunigung zu unterschiedlichen Anfangsenergien. Da jedoch Ionen mit höherer Energie tiefer in den Reflektor eindringen als Ionen gleicher Masse mit geringerer
Energie, werden diese Unterschiede nivelliert. [51]
1.7 Interpretation von Massenspektren
1.7.1 Dimensionslosigkeit von m/z
Die Einheit der Größe m/z stellt ein Problem dar. Massen werden in Dalton angegeben, wobei 1 Da etwa 1,66054 · 10-27 kg entspricht. z bezeichnet jedoch die Anzahl der
Elementarladungen (e ≈ 1,602177 · 10-19 C), die ein Molekül trägt. [54] Damit hätte das
Masse/Ladung-Verhältnis die Dimension einer Masse, was zu Verwirrung führt, sobald
z 6= 1 ist. Auch die Benutzung von SI-Einheiten ist keine Lösung, da sich hier wenig
aussagekräftige Zahlenwerte in kg/C ergeben würden.
Eine mögliche Lösung besteht darin, m/q statt m/z zu schreiben und die Elementarladung e als Einheit für die Ladung q zu verwenden. m/q hätte dann die Einheit
1 Da/e, was als 1 Th (für Thomson) abgekürzt wird [55]. Allerdings ist e keine offizielle
Einheit zur Angabe von Ladungen. Außerdem ist eine solche Beschriftung von Massenspektren eher unüblich. Für diese Arbeit wird daher bei m/z das m als Masse eines
Moleküls in Dalton definiert. Wie z ist dann auch m dimensionslos, sodass m/z keine
Einheit besitzt.
1.7.2 Isotopenmuster und monoisotopische Masse
Etwa 1,1 % des natürlichen Kohlenstoffs liegt als 13 C-Isotop vor, ebenso ca. 0,2 % des
natürlichen Sauerstoffs als 18 O und 0,37 % des Stickstoffs als 15 N. Auch Schwefel kommt
in verschiedenen Isotopen in organischen Molekülen vor, in sehr geringem Umfang auch
weitere Kohlenstoff- und Sauerstoffisotope sowie Deuterium und Tritium [56]. Sind
19
1. Einleitung
solche schwereren Isotope in Molekülen vorhanden, erhöht sich deren Masse. Diese
Tatsache wird bei der Massenspektrometrie beobachtet.
Aus diesem Grund ergibt die Vermessung eines Peptids genau genommen nicht nur
ein Signal, sondern mehrere. Dieser Mehrfachpeak ist trotz der eigentlich geringen prozentualen Anteile der schwereren Isotope immer deutlich erkennbar. Die Gründe dafür
sind die große Anzahl von Atomen pro Molekül und die hohe Zahl der gleichzeitig
vermessenen Moleküle; beides erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass bei der Vermessung
auch schwere Isotope erfasst werden. Dieser Mehrfachpeak (s. z.B. Abb. 1.6) wird Isotopenmuster genannt, aber dennoch als Ganzes als „Peak“ bezeichnet. Der Abstand
der Einzelpeaks voneinander beträgt 1, was der Masse des zusätzlichen Neutrons entspricht. Das gilt nur, wenn das Molekül einfach geladen ist; höhere Ladungszustände
(z = 2; z = 3; z = 4) können an abweichenden Abständen der Einzelpeaks erkannt werden
( m/z = 0,5; m/z = 0,33; m/z = 0,25). Mehrfach geladene Ionen werden normalerweise nur nach Elektrospray-Ionisierung detektiert (s. Kap. 1.8 und Kap. 4); bei der
MALDI-TOF-MS-Messung sind die Peptide meist einfach geladen.
Der erste dieser Einzelpeaks entspricht der sogenannten monoisotopischen Masse.
Das ist die theoretische Masse eines Peptids; diese monoisotopische Masse würde es
aufweisen, wenn jeweils nur das Hauptisotop vorliegen würde. Bei der Vermessung
von intakten Proteinen mittels MALDI-TOF-MS zeigt sich kein Isotopenmuster, da
die Auflösung des hier eingesetzten Gerätes bei diesen wesentlich größeren Molekülen
dafür nicht ausreicht.
D
D
D
1.8 LC-MS/MS
1.8.1 Überblick
Bei den hier durchgeführten Messungen (s. Kap. 4) kam eine UHPLC-ESI-MS/MSAnlage zum Einsatz. Zuerst wurden die Proben chromatografisch aufgetrennt. Die dafür eingesetzte Trennsäule beinhaltet Partikel mit einem sehr geringen Durchmesser
von etwa 1,7 µm und weist daher eine besonders hohe Trennleistung auf. Die UHPLCKomponenten („Ultra High Performance Liquid Chromatography“) sind auf die resultierenden sehr hohen Drücke ausgelegt. Nach der Elution wurden die Probenmoleküle
ionisiert und in einem Tripelquadrupol analysiert (s. Abb. 1.9).
20
1.8. LC-MS/MS
Abb. 1.9: Schematische Darstellung eines Tripelquadrupol-Massenspektrometers
(nach [51])
1.8.2 Ionisierung
Die Ionisierung erfolgte hier durch Elektrospray-Ionisation (ESI). Das Fließmittel mit
den Analyten aus der UHPLC wird aus einer Kapillare versprüht. An dieser Kapillare liegt gegenüber dem Eingang in den Massenanalysator ein hohes Potential an,
wodurch die Tröpfchen geladen werden. Durch Verdunstung des Lösungsmittels nimmt
der Tröpfchenradius immer weiter ab, bis es wegen der hohen Ladungsdichte zu sogenannten Coulomb-Explosionen auf Grund der Abstoßung gleichnamiger Ladungen
kommt. Dieser Prozess wiederholt sich solange, bis freie, geladene Analytionen vorliegen, die durch geeignete elektrische Felder in den Massenanalysator beschleunigt
werden. Ein Stickstoffstrom unterstützt zusätzlich die Verdampfung des Lösungsmittels bei der Ionisation. Wie MALDI ist auch die Elektrospray-Ionisation ein relativ
schonendes Verfahren.
Das Orifice befindet sich zwischen der Ionenquelle, in der Atmosphärendruck
herrscht, und dem Massenanalysator mit Hochvakuum. Durch eine kleine Öffnung
können die Ionen das Orifice passieren und in den Analysator gelangen. [51]
1.8.3 Massenanalysator
Als Massenanalysator kam hier ein Tripelquadrupol zum Einsatz. Q 0 dient der Fokussierung der Ionen, die Quadrupole Q 1 - Q 3 können je nach Anwendung verschieden
eingesetzt werden. Insbesondere kann Q 3 bei dem hier eingesetzten Gerätetyp als lineare Ionenfalle betrieben werden. Ionenfallen können Ionen durch elektrische Felder
21
1. Einleitung
einfangen und auf stabilen Bahnen halten. Zur Detektion werden die Ionen abhängig
von ihrem Masse/Ladung-Verhältnis durch Veränderung der Felder aus der Ionenfalle
ejiziert und von einem Detektor nachgewiesen.
Jeder Quadrupol besteht aus vier parallelen Metallstäben, an die überlagerte Gleichund Wechselspannungen angelegt werden. Die resultierenden komplexen elektrischen
Felder können so eingestellt werden, dass nur Ionen mit bestimmten Masse/LadungVerhältnissen den Quadrupol passieren können. Die übrigen Ionen werden abgelenkt
und erreichen den Detektor nicht. [51]
Im ersten Experiment (beschrieben in Kap. 4) wurde ein Scan mit der linearen Ionenfalle durchgeführt (EMS-Scan), im zweiten Experiment ein EPI-Scan. Dabei wird
Q 1 so eingestellt, dass nur ein bestimmtes Vorläuferion passieren kann. Dieses wird in
Q 2 durch Stöße mit Gasmolekülen fragmentiert und mit dem als Ionenfalle geschalteten Q 3 werden die erhaltenen Fragmente selektiert und anschließend nachgewiesen
(„Enhanced Product Ion Scan“).
1.8.4 Fragmentbezeichnungen
In Q 2 können beispielsweise Peptide aus einem Proteinverdau fragmentiert werden.
Bei einer solchen Fragmentierung von Peptiden entstehen charakteristische Fragmente, deren Benennung nach einem Vorschlag von Roepstorff und Fohlman erfolgt [57].
Kommt es zur Spaltung der Peptidbindung, so bezeichnet man das N-terminale Fragment als b-Fragment, das den C-Terminus enthaltende Fragment als y-Fragment (vgl.
Abb. 1.10). Als Index wird die Position der Spaltung angegeben, bei b-Fragmenten
vom N-Terminus aus, bei y-Fragmenten vom C-Terminus her. Wird eine der beiden
anderen Bindungen des Peptidrückgrades gespalten, spricht man von a- und x- bzw.
von c- und z-Fragmenten (s. Abb. 1.10).
Diese Fragmente können zur Peptidsequenzierung herangezogen werden: Der Massenunterschied zweier aufeinander folgender Fragmente der gleichen Serie entspricht
der Masse des im längeren Fragment zusätzlich vorhandenen Aminosäurerests. Dieser
Massenunterschied kann auch einer modifizierten Aminosäure entsprechen. Wird also
beispielsweise eine komplette b-Serie oder y-Serie für ein Peptid detektiert, können über
die einzelnen Massendifferenzen Art und Reihenfolge der im Peptid enthaltenen Aminosäuren ermittelt werden. Damit kann auch festgestellt werden, ob ein Aminosäurerest
modifiziert ist und wo genau im Peptid er lokalisiert ist (s. Kap. 4.3.2).
22
1.9. Zielsetzungen dieser Arbeit
Abb. 1.10: Bezeichnung der bei der Tandem-Massenspektrometrie gebildeten Peptidfragmente (nach [57])
1.9 Zielsetzungen dieser Arbeit
Bei der Erhitzung von Milch laufen vielfältige Reaktionen ab, speziell zwischen Milchproteinen und dem Milchzucker Lactose. Resultat ist unter anderem die Modifikation
der essentiellen Aminosäure Lysin, was die biologische Wertigkeit vor allem von intensiv hitzebehandelter Säuglingsnahrung beeinträchtigt. Daher ist die Untersuchung
modifizierter Milchproteine von großer Bedeutung.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Proteinmodifikationen des s1 -Caseins
untersucht, die bei der Erhitzung von Milch entstehen. s1 -Casein macht etwa ein Drittel aller Milchproteine aus. Zuerst sollte eine Methode entwickelt werden, die die Identifikation der Hauptmodifikationen dieses Proteins in einem ungerichteten Ansatz ebenso erlaubt wie die Bestimmung der Positionen dieser Modifikationen im Protein. Als
Nachweisverfahren wurde die instrumentelle Analytik gewählt, speziell kamen MALDITOF-MS und UHPLC-ESI-MS/MS zum Einsatz. Ein weiteres Ziel war die Erstellung
produkt- und positionsspezifischer Reaktionskinetiken: Das Ausmaß der einzelnen Modifikationen sollte mit der Intensität einer vorangegangenen Hitzebehandlung in Beziehung gesetzt werden. Hierbei sollte auch untersucht werden, ob die Reaktivität einzelner
Aminosäuren von ihrer Position im Protein abhängt. Ebenso wurde die Anwendbarkeit
der Methode auf andere Milchproteine untersucht. Abschließend sollten einige Handelsproben vermessen und miteinander verglichen werden.
a
a
23
2 Entwicklung einer Methode zum
positionsspezifischen Nachweis von
Modifikationen in Milchproteinen
2.1 Einleitung
a
b
In vorangegangenen Studien wurden bereits -Lactalbumin und -Lactoglobulin auf
Modifikationen untersucht, sowohl als intakte Proteine als auch nach enzymatischer Hydrolyse. Meltretter et al. konnten bei der Vermessung der intakten Proteine Lactoseaddukte nachweisen, nachdem die Proteine in einem der Milch nachempfundenen Puffersystem für mehrere Tage mit Lactose bei 60 °C inkubiert worden waren. Nach enzymatischem Verdau der modifizierten Proteine konnten in bestimmten Peptiden oxidierte
Aminosäurereste nachgewiesen werden, ebenso wie Lysinaldehyd, CML-Modifikationen
und Amadoriprodukte [19]. In hitzebehandelten Handelsproben konnten mehrfache
Lactosylierungen der intakten Proteine nachgewiesen werden. Nach Erhitzung von
Rohmilch nahm der Anteil lactosylierten -Lactalbumins mit steigender Erhitzungsdauer bzw. steigenden Temperaturen zu [46]. In hitzeinkubierter Rohmilch sowie in
Handelsproben konnten nach gelelektrophoretischer Isolierung von -Lactoglobulin und
anschließendem In-Gel-Verdau relative Gehalte des Amadoriprodukts von bis zu 7,2 %
bestimmt werden, ebenso Methioninoxidationen von bis zu 41 % (jeweils abhängig von
der Probe und dem betrachteten Peptid) [58].
Des Weiteren wurde auch s1 -Casein bereits auf Lactosylierungen untersucht, daher
waren mögliche Bindungsstellen bereits bekannt [59]/[45]. Jedoch wurden bei diesen
Untersuchungen keine weiteren Modifikationen nachgewiesen, ebenso erfolgte keine relative Quantifizierung dieser Modifikationen in Abhängigkeit von der Dauer der Milcherhitzung.
a
b
a
25
2. Methodenentwicklung - Nachweis von Modifikationen in Milchproteinen
Abb. 2.1: MALDI-TOF-MS-Spektren von intaktem
nach enzymatischer Dephosphorylierung
as1-Casein in
DHAP, nativ und
Die folgenden Kapitel befassen sich mit der Entwicklung einer Methode, die zum
positionsspezifischen Nachweis verschiedener Modifikationen in Milchproteinen und für
deren relative Quantifizierung geeignet ist, ausgehend von der massenspektrometrischen
Vermessung intakter Caseine.
2.2 MALDI-TOF-MS-Messung intakten
as1-Caseins
2.2.1 Phosphorylierung
Wie in Kap. 1.5.1 dargestellt existieren zahlreiche verschiedene Verfahrensweisen,
um Modifikationen von Proteinen nachzuweisen. Bei Anwendung der MALDI-TOFMassenspektrometrie besteht die Möglichkeit, auch intakte Proteine zu vermessen.
Besonders auf Grund der schonenden Ionisation ist diese Technik hierfür gut geeignet.
s1 -Casein liegt als phosphoryliertes Protein vor; mit Hilfe von Phosphatasen kann
bestimmt werden, wie hoch der Phosphorylierungsgrad eines Proteins ist. Diese Bestimmung wurde für s1 -Casein durchgeführt, um die Masse des intakten Proteins
zu ermitteln. s1 -Casein wurde enzymatisch dephosphoryliert und anschließend mittels MALDI-TOF-MS vermessen (s. Kap. 5.7). Das in Abb. 2.1 dargestellte Massenspektrum zeigt einen Massenunterschied von 640 Da zwischen dem dephosphorylierten
und nativem s1 -Casein. Dies lässt auf eine 8-fache Phosphorylierung schließen. Analog
aufgearbeitetes -Casein zeigte vierfache Phosphorylierung.
a
a
a
a
26
b
2.3. Optimierung des Casein-Verdaus
Abb. 2.2: MALDI-TOF-MS-Spektren von intaktem
as1-Casein in DHAP
2.2.2 Lactosylierung
a
Auch auf Lactosylierungen wurde s1 -Casein im Rahmen dieser Arbeit ohne vorhergehenden Verdau untersucht. Es ergaben sich Massenspektren wie sie Abb. 2.2 zeigt.
Dargestellt sind drei Proben: -Casein-Standard, der nicht hitzebehandelt wurde, sowie s1 -Casein, das aus zwei verschieden stark erhitzten Milchproben isoliert wurde. Der größte Peak repräsentiert s1 -Casein mit einer Molekülmasse von 23.615 Da
(8-fach phosphoryliert). Im Standard war keine Modifikation nachweisbar, bei der
UHT-Milchprobe hingegen ist die Lactosylierung mit einer Massenzunahme von 324 Da
bereits zu erkennen. Bei noch stärkerer Hitzebehandlung konnten sogar zwei Lactosylierungen des Proteins im Spektrum beobachtet werden. Es konnten auch doppelt
geladene Ionen detektiert werden; die Lactosylierung erscheint hier im Abstand von
m/z = 324/2 = 162.
Galvani et al. haben entfettetes Milchpulver mit 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt
und einzelne Spots mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Hierbei wurde 7- bis 9-fach
phosphoryliertes s1 -Casein mit bis zu zwei Lactosylierungen nachgewiesen [60]. Solche
Messungen sind jedoch nicht positionsspezifisch: An welche Aminosäurenseitenkette im
Protein die Lactose gebunden ist, kann so nicht bestimmt werden. Auf Grund dieser
Einschränkung wird im Folgenden ausschließlich mit verdautem Protein gearbeitet.
a
a
a
D
a
2.3 Optimierung des Casein-Verdaus
Beim enzymatischen Verdau eines Proteins werden Peptide gebildet. Deren Art und
vor allem Größe hängt nicht nur vom verdauten Protein ab, sondern auch von dem
27
eingesetzten Verdauenzym. Als Enzyme wurden im Rahmen dieses Projektes GluC,
AspN, Trypsin und Chymotrypsin untersucht. Jedes dieser Enzyme schneidet nach
unterschiedlichen Aminosäuren (die genaue Zuordnung findet sich in Tab. 1.3). Die
Häufigkeit und Verteilung bestimmter Aminosäuren in einem gegebenen Protein entscheiden also über die Anzahl und Länge der bei einem Verdau gebildeten Peptide.
2.3.1 In-silico-Verdau und Identifikation des optimalen
Verdauenzyms
Neben dem praktischen Verdau ist auch ein „In-silico-Verdau“ möglich, also die Vorhersage der gebildeten Peptide am Computer. Dieser theoretische Verdau kann mit Hilfe
geeigneter Softwares durchgeführt werden. Die gewonnenen Ergebnisse können anschließend interpretiert werden, bevor praktische Versuche durchgeführt werden. Eine Übersicht über die Eigenschaften der erwarteten Peptide geben die Tabellen 8.2 - 8.7; sie
wurden von PeptideMass (www.expasy.org) übernommen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind 1 MC-Peptide hier nur aufgeführt, wenn sie praktisch beobachtet wurden.
Zur Benennung einzelner Peptide in dieser Arbeit wird ihre Masse ohne Dezimalstellen herangezogen. Da die Aminosäuren innerhalb eines Proteins nummeriert werden,
kann ein Peptid auch über seine Position im Protein identifiziert werden. Dazu werden die Nummer der ersten und letzten Aminosäure des Peptids im Protein angegeben.
Diese positionsbezogene Angabe kann für jedes Peptid seiner Masse zugeordnet werden
(s. Tab. 8.2 - 8.7).
Relevant für die Entscheidung für ein bestimmtes Enzym ist hauptsächlich die Länge der von ihm gebildeten Peptide. Peptide über etwa 3.300 Da können zwar mittels
MALDI-TOF-MS vermessen werden, jedoch geht das Isotopenmuster auf Grund einer
geringeren Auflösung bei so großen Massen verloren. Außerdem nimmt mit der Größe
eines Peptids auch die Wahrscheinlichkeit zu, dass mehrere mögliche Modifikationsstellen im gleichen Peptid enthalten sind und mittels MALDI-TOF-MS nicht unterschieden werden können. Zudem hat sich in der Praxis gezeigt, dass die beobachtete
Signalintensität für Peptide dieser Größe relativ gering ist. Werden aber große Peptide
nicht gefunden, sinkt die Sequenzabdeckung schnell ab, da solche Peptide einen großen
Anteil am Protein ausmachen. Die Sequenzabdeckung bezeichnet das Verhältnis von
„abgedeckten“ Aminosäuren zu allen in einem Protein vorhandenen Aminosäuren. Je
höher dieser Wert ist, über umso mehr mögliche Modifikationsstellen kann eine Aussage getroffen werden. Das Enzym sollte also idealerweise nur Peptide unter 2.500 Da
28
2.3. Optimierung des Casein-Verdaus
liefern. Vor diesem Hintergrund ergibt sich aus den Tabellen 8.2 - 8.5, dass GluC in
Phosphatpuffer das am besten geeignete Enzym für den Verdau von s1 -Casein ist.
Andererseits sind Peptide unter 500 Da schlecht zu erfassen, da in diesem Bereich ein
starkes Grundrauschen (vor allem bedingt durch die Matrix) auftritt, von dem sich die
Signale der Peptide nicht deutlich abheben. Aus diesem Grund sind auch keine Peptide unter 500 Da in den Tabellen 8.2 - 8.7 aufgeführt. Auch eine Spaltung in zu viele
Peptide kleiner 500 Da sollte daher vermieden werden.
a
2.3.2 Verdau von Caseinen mit Chymotrypsin
a
Während für den Verdau von s1 -Casein GluC am besten geeignet ist, hydrolysiert das
Enzym Chymotrypsin -Casein theoretisch zu Peptiden mit gut geeigneter Länge. Leider konnten nach Verdau von -Casein (und ebenso nach einem Verdau von s1 -Casein)
mit Chymotrypsin keine oder nur wenige einzelne der erwarteten 0 MC- und 1 MCPeptide nachgewiesen werden. Dabei wurde von verschiedenen Spezifitäten des Enzyms
ausgegangen, insbesondere einer Hydrolyse der Peptidbindung nach Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan sowie von einer solchen nach zusätzlich einer oder mehreren der
übrigen Spaltstellen (vgl. Tab. 1.3). Darüber hinaus wurde versucht, anhand der erhaltenen Peptide eine Spezifität abzuleiten; dies gelang aber leider nicht. Auch verschiedene Puffersysteme (Tris-HCl-Puffer mit CaCl2 -Zusatz, Bicarbonatpuffer), Verdauzeiten
(1 h - 15 h) und MALDI-Matrices (CCA, DHAP) wurden eingesetzt, zusätzlich wurde im negativen Modus vermessen. Auch Chymotrypsin von einem anderen Hersteller
brachte keine Verbesserung der Ergebnisse. Abschließend wurden die Caseine vor und
nach dem Verdau enzymatisch dephosphoryliert, was leider ebenfalls zu keiner Verbesserung führte. Der als „Positivkontrolle“ mitgeführte Verdau von -Casein mit GluC
lieferte hingegen die erwarteten Peptide. Daher musste von der Verwendung von Chymotrypsin abgesehen werden. Der Vergleich der übrigen Verdauenzyme analog zu Kap.
2.3.1 im theoretischen Verdau ergab für den Verdau von -Casein mit GluC im Phosphatpuffer die besten Resultate.
b
b
a
b
b
2.3.3 Bestimmung der Verdaudauer
Ein weiterer wichtiger Parameter ist die Verdaudauer. Zur Optimierung der Verdauzeit
wurde eine -Casein-Standard-Lösung für drei sowie fünf Stunden mit GluC verdaut
(s. Kap. 5.8). Die MALDI-TOF-MS-Messung zeigte, dass nach nur drei Stunden einige
0 MC-Peptide noch nicht detektiert werden konnten; nach fünf Stunden ließen sich mehr
a
29
0 MC-Peptide nachweisen. In weiteren Versuchen ergab sich, dass bei einem Verdau
über Nacht, also für etwa 15 Stunden, noch mehr Peptide detektiert werden konnten
und dass ihre Signalintensität bei dieser Vorgehensweise am größten war. Daher wurde
als Verdaudauer 15 Stunden festgelegt. Das Verhältnis Enzymmasse zu Proteinmasse
wurde dabei auf etwa 1:40 eingestellt.
2.3.4 Kombination zweier Enzyme
a
GluC ist, wie oben dargestellt, das am besten geeignete Enzym für den s1 -CaseinVerdau. Dennoch wurde versucht, zusätzliche Aminosäuren zu erfassen, indem die gleiche Probe mit GluC und unabhängig davon mit Trypsin verdaut wurde. AspN kam
hier nicht in Betracht, da sich in praktischen Versuchen gezeigt hatte, dass sich nur
wenige der theoretisch erwarteten Peptide auch tatsächlich detektieren ließen; ebenso
verhielt es sich mit Chymotrypsin. Ein möglicher Grund dafür könnte sein, dass diese Enzyme ihre Schnittstellen im Protein auf Grund der Proteinkonformation nicht
optimal angreifen können.
Ein Vergleich der von GluC und Trypsin gebildeten Peptide lässt die Bestimmung einer „Gesamtsequenzabdeckung“ zu. Um die Proben nach dem Verdau ohne weitere Aufreinigung, eine mögliche Quelle für Verluste, direkt massenspektrometrisch vermessen
zu können, wurde hier Ammoniumbicarbonatpuffer eingesetzt. Für diesen Versuch wurde eine -Casein-Standard-Lösung (2 mg in 500 µl Ammoniumbicarbonatpuffer, 10 µl)
mit je 2 µl GluC bzw. Trypsin vermischt und über Nacht verdaut. Anschließend wurden die Proben in drei unterschiedlichen Matrices mit MALDI-TOF-MS vermessen:
2 µl Probe wurden mit 2 µl CCA-Matrix, 2 µl Probe mit 14 µl CCA-Matrix und 3 µl
Probe mit DHAP-Matrix vermischt (Herstellung der Matrices siehe Kap. 5.6). Hierbei
ergab sich, dass der Einsatz von 2 µl CCA die besten Resultate lieferte. In der TrypsinProbe wurden die Peptide 2316, 1759, 1384, 1267 und 910 gefunden; bei GluC 1778,
1756, 1664, 1449, 913, 910, 902 und 900. Zusätzlich wurde das Peptid 1229 gefunden,
das bei einem Verdau im Phosphatpuffer zu erwarten gewesen wäre, hier aber offensichtlich auch gebildet wurde. Die jeweilige Sequenzabdeckung ist in Abb. 2.3 grafisch
dargestellt.
Durch diese Vorgehensweise konnte allerdings nur eine minimale Erhöhung der Sequenzabdeckung erreicht werden, was den zusätzlichen Messaufwand nicht gerechtfertigt hat. Eine deutliche Verbesserung ergab sich erst mit der HPLC-Vortrennung (s.
Kap. 2.6.5). Daher wurde im Folgenden ausschließlich mit GluC verdaut.
a
30
2.4. Vermessungen im Milchmodellsystem
Abb. 2.3: Vergleich der Sequenzabdeckung beim Verdau von
Trypsin
as1-Casein mit GluC und
2.4 Vermessungen im Milchmodellsystem
Wie bereits erwähnt enthält Milch eine Vielzahl an verschiedenen Proteinen. Bevor eine
Trennung der Milchproteine etabliert wird, bietet sich als Vorversuch die Vermessung
eines isolierten Proteins an. Hierfür wurden -Casein und -Casein als Standardsubstanzen eingesetzt; diese Proteine sind kommerziell erhältlich. Um die Erhitzung der
Milch nachzuahmen, wurden diese Standardsubstanzen getrennt in einem Milch simulierenden Puffer mit Lactose erhitzt. Zusätzlich wurde als Kontrolle ein weiterer Ansatz
ohne Lactose inkubiert, um einen möglichen zuckerunabhängigen Proteinabbau durch
die Hitzebehandlung erkennen zu können. Die genaue Vorgehensweise ist im Abschnitt
5.9f dargestellt.
a
2.4.1 Modifikationen des
b
as1-Caseins nach Inkubation im
Milchmodellsystem
a-Casein wurde mit Lactose für 7 Tage und 14 Tage bei 60 °C im Milchmodellsystem erhitzt, mit GluC in Ammoniumbicarbonatpuffer verdaut und mittels MALDI-TOF-MS
vermessen (s. Kap. 5.10). Dabei konnten die meisten 0 MC-Peptide nachgewiesen werden, ebenso einige 1 MC-Peptide, was zu einer Sequenzabdeckung von etwa 47 % führte.
Die Hauptursache für diesen eher geringen Wert ist, dass unter diesen Bedingungen ein
Peptid der Masse 4.674 Da gebildet wird (siehe Tab. 8.4), das nicht nachgewiesen werden konnte. Der Ammoniumbicarbonatpuffer wurde dennoch hier eingesetzt, damit die
31
a
Abb. 2.4: MALDI-TOF-MS-Spektren von bei 60 °C hitzeinkubiertem -Casein-Standard nach Verdau mit GluC
Proben direkt mit MALDI-TOF-MS vermessen werden konnten. Eine zusätzliche Aufreinigung beispielsweise über ZipTips hätte möglicherweise zu Verlusten geführt. Vor
allem kleinere Peptide waren bei mehreren vorangegangenen Experimenten nach einer solchen Aufreinigung nicht mehr oder in deutlich geringerer Intensität nachweisbar
(vgl. Kap. 2.7.3).
An Modifikationen konnte hier an Peptid 1756 eine Lactosylierung und eine CMLModifikation nachgewiesen werden (s. Abb. 2.4), des Weiteren eine Oxidation an Peptid 900. Der Peak bei m/z = 2.080 in Abb. 2.4 zeigt die Modifikation des Peptids 1756
durch Lactosylierung; bei Vermessung der lactosefreien Inkubation konnte dieses Signal
erwartungsgemäß nicht detektiert werden. Nach sieben Tagen Inkubation bei 60 °C ist
nur ein minimaler Peak an dieser Position zu erkennen, nach weiteren sieben Tagen
Inkubation hat die Signalintensität stark zugenommen, sodass das Signal des Amadoriprodukts deutlich erkennbar ist. Des Weiteren wird der Peak der CML-Modifikation
bei m/z = 1.814 ersichtlich. Auch dieser ist erst nach zweiwöchiger Inkubation eindeutig
nachweisbar.
Diese Ergebnisse konnten in einem zweiten Versuch bestätigt werden; hierbei wurden
zwei unabhängig für 14 Tage wie oben beschrieben erhitzte Proben dialysiert und
lyophyllisiert, dann jedoch in Phosphatpuffer wieder aufgenommen. Nach GluC-Verdau
und ZipTip-Aufreinigung wurden die Proben in CCA mit MALDI-TOF-MS vermessen.
Es zeigte sich erneut die Lactosylierung und CML-Modifikation des Peptids 1756 in
32
2.4. Vermessungen im Milchmodellsystem
der mit Lactose erhitzten Probe, analog zu Abb. 2.4. Die Peptide 900 und 2120 waren
hier nicht bzw. kaum zu detektieren, was möglicherweise mit Verlusten bei der ZipTipAufreinigung erklärt werden kann.
Nach Abschluss dieser Vorversuche war es möglich, die Entwicklung der Lactosylierung und der CML-Bildung mit zunehmender Erhitzungszeit zu beobachten. Für diesen
Versuch wurde erneut -Casein bei 60 °C jeweils mit und ohne Lactose für einen Tag,
drei, fünf, sieben und vierzehn Tage erhitzt. Die Lösungen wurden wie oben erwähnt
dialysiert, lyophyllisiert und in 500 µl Ammoniumbicarbonatpuffer wieder aufgenommen. Je 10 µl dieser Lösung wurden mit 2 µl GluC-Lösung versetzt und über Nacht
verdaut. Eine Aufreinigung der Proben war nicht erforderlich, sie wurden direkt im
Verhältnis 2:14 mit CCA-Matrix verdünnt und auf den Stahlträger pipettiert. Das
Ergebnis der MALDI-TOF-MS-Messung ist in Abb. 2.5 dargestellt.
Man erkennt deutlich die Zunahme des Ausmaßes der Modifikationen: Mit längerer Inkubationszeit erhöhen sich auch die Intensitäten des Amadoriprodukts und der
CML-Modifikation. Für Peptid 2120 (Daten hier nicht gezeigt) schien die Intensität
der Lactosylierung erst zuzunehmen, mit zunehmender Erhitzungsdauer aber wieder
abzunehmen. CML konnte bei Peptid 2120 nicht nachgewiesen werden. In der ohne
Lactose erhitzten Kontrolle zeigten sich keine Modifikationen.
Um weitere Modifikationen detektieren zu können, wurde die Modellmischung für
1, 4, 9 und 24 Stunden je auf 72 °C und 99 °C erhitzt. Allerdings wurde das Ziel so
nicht erreicht, das Auffinden zusätzlicher Modifikationen gelang hier nicht. Der Grund
ist vermutlich, dass bei solch starker Erhitzung -Casein ausfällt; in den beiden am
stärksten hitzebehandelten Proben war das präzipitierte Protein als bräunlich verfärbter Niederschlag deutlich zu sehen.
a
a
2.4.2 Untersuchung von b-Casein nach Inkubation im
Milchmodellsystem
b
b
Bereits bei den ersten Experimenten mit -Casein fiel auf, dass -Casein in wässriger
Lösung (10 mg/ml) schon nach geringer Hitzebehandlung zur Präzipitation neigt. Bei
Erhitzung auf 72 °C oder sogar nur 60 °C zeigte sich schon nach fünf Minuten eine Trübung des Ansatzes; diese Trübung wurde bei einer -Casein-Vergleichslösung gleicher
Konzentration nicht beobachtet. Nach Erhitzung für eine Stunde zeigte sich nur bei
-Casein ein deutliches Präzipitat. Eine Untersuchung des Überstandes auf Modifikationen wurde nicht durchgeführt, da unbekannt ist, wie viel Protein sich nach welcher
a
b
33
a
Abb. 2.5: MALDI-TOF-MS-Spektren von hitzeinkubiertem -Casein-Standard nach
Verdau mit GluC. Vergleich verschiedener Inkubationszeiten
34
2.5. Isolierung von Caseinen aus Milchproben mittels SDS-PAGE
Erhitzungsdauer noch in Lösung befindet und ob eventuelle Modifikationen im gleichen
Verhältnis präzipitieren wie das unmodifizierte -Casein selbst.
Dennoch wurde versuchsweise der in Kap. 5.9 beschriebene Ansatz mit leicht verringerter -Casein-Konzentration vermessen. Die Aufarbeitung erfolgte wie in Kap. 5.10
beschrieben. In der unerhitzten Kontrolle wurden die meisten 0 MC-Peptide gefunden.
Jedoch konnten diese ab der 1-Tages-Inkubation nicht mehr detektiert werden. Dies
führte zu dem Schluss, dass auch in diesen Proben ein Großteil des -Caseins präzipitiert war. Aus diesen Gründen wurde auf eine ausführliche Vermessung von im
Milchmodellsystem erhitztem -Casein verzichtet. Bei der Erhitzung von Milch fällt
-Casein auf Grund von Interaktionen mit anderen Proteinen nicht aus.
b
b
b
b
b
2.5 Analyse der Modifikationen von Caseinen
nach deren Isolierung aus Milchproben
mittels SDS-PAGE
Bisher wurden Proteine vermessen, die einzeln mit Lactose erhitzt worden waren. Als
nächster Schritt sollten aus erhitzten Milchproben zunächst Proteine isoliert und diese
anschließend vermessen werden. Das Isolieren einzelner Proteine aus Milch setzt eine
Auftrennung der Milchproteine voraus; danach können an einem bestimmten Protein
aus der Milch auftretende Modifikationen erfasst werden. Ziel war hierbei immer, ein
bestimmtes Casein möglichst ohne Verunreinigungen durch andere Milchproteine zu
isolieren. Andererseits musste verhindert werden, dass modifizierte Proteine abgetrennt
werden. Als mögliche Lösung dafür hat sich eine gelelektrophoretische Proteintrennung
angeboten.
Ein Polyacrylamid-Gel (s. Kap. 5.11.1) wurde mit entfetteter (s. Kap. 5.5.1) HMilch beladen (1:10 verdünnt mit Lämmli-Probenpuffer, 10 µl je Tasche). Als Vergleiche
dienten -Casein, -Casein und -Casein (wässrige Lösungen der Proteinstandards in
milchtypischen Konzentrationen). Die Durchführung der Gelelektrophorese ist in Kap.
5.11.2 beschrieben. Die Identifikation der jeweiligen Bande in Milch erfolgte durch
Vergleich ihrer Laufstrecke mit der des entsprechenden Standards (s. Abb. 2.6). Die
relevanten Banden wurden wie in Kap. 5.11.3 beschrieben ausgeschnitten und im Gel
verdaut; nach dem Verdau wurden die Proben über ZipTips aufgereinigt (s. Kap. 5.5.2)
und mit MALDI-TOF-MS in CCA vermessen.
a
b
k
35
Abb. 2.6: Entfettete UHT-Milch nach gelelektrophoretischer Auftrennung mit
-Casein- und -Casein-Standard
a
b
2.5.1 Untersuchung von
as1-Casein
In getrennten Experimenten wurden sowohl AspN als auch GluC als Verdauenzym
eingesetzt. Beim theoretischen Verdau von s1 -Casein mit AspN ergeben sich sehr große
Peptide (s. Tab. 8.2); diese konnten in der Praxis leider nicht nachgewiesen werden.
Ein möglicher Grund dafür ist, dass Peptide mit solch großen Massen schlecht aus dem
Gel eluiert werden. Zudem enthalten viele dieser großen Peptide sehr viele Lysine, was
die Aussage über Bindungsstellen erschwert. Daher wurde im Folgenden GluC anstelle
von AspN eingesetzt.
Beim Verdau von s1 -Casein mit GluC in Phosphatpuffer (vgl. Tab. 8.5) ergeben sich
wesentlich kleinere Peptide als bei AspN, die daher gut detektierbar sind: In diesem Versuch konnten die meisten 0 MC-Peptide und einige 1 MC-Peptide nachgewiesen werden;
damit lag die Sequenzabdeckung bei etwa 55 %. Darüber hinaus konnte in UHT-Milch
bereits eine Lactosylierung von Peptid 2120 nachgewiesen werden (s. Abb. 2.7), analog
auch die Lactosylierung von Peptid 1756. Abb. 2.7 lässt außerdem erkennen, dass die
Modifikation auch im Proteinstandard bereits vorliegt, wenn auch in geringerer Intensität. Durch die Hitzebehandlung, der die H-Milch unterzogen wurde, hat das Ausmaß
der Modifikation stark zugenommen.
a
a
36
In einem weiteren Experiment, bei dem noch stärker hitzebehandelte Kondensmilch
gelelektrophoretisch aufgetrennt wurde, konnten die Lactosylierungen der Peptide 1756
und 2120 bestätigt werden, wie das unterste Spektrum in Abb. 2.7 für Peptid 2120 zeigt.
Die Intensität der Modifikation hat nochmals deutlich gegenüber der bei H-Milch zugenommen. Die übrigen Peaks konnten keinen bekannten Modifikationen zugeordnet
werden; sie könnten weitere Abbauprodukte repräsentieren, die sich während der intensiven Hitzebehandlung gebildet haben.
Ebenfalls konnte der Einfluss der Hitzebehandlung auf die oxidative Schädigung
von Milch experimentell gezeigt werden. Abb. 2.8 zeigt die deutliche Oxidation des
Peptids 1778. Auch hier zeigt bereits der Standard eine Oxidation, die jedoch durch
die Erhitzung intensiviert wurde. Ausgehend von der Aminosäuresequenz des Peptids
liegt hier vermutlich eine Methioninoxidation vor. Der Peak bei m/z = 1.800 zeigt das
Natriumaddukt des Peptids.
Auch bei wiederholter Durchführung dieses Experimentes gelang es nicht, an weiteren
Positionen in s1 -Casein aus der Literatur [45] bekannte Modifikationen nachzuweisen.
Aus diesem Grund wurde eine Auftrennung der Peptide und Proteine mittels HPLC
entwickelt, beschrieben in Kap. 2.6.
a
2.5.2 Untersuchung von b-Casein
b-Casein wurde wie am Anfang von Kap. 2.5 beschrieben aus UHT-Milch gelelektrophoretisch isoliert, im Gel mit GluC in Phosphatpuffer verdaut und mittels MALDI-TOFMS in CCA und DHAP vermessen. Der theoretische Verdau ist in Tab. 8.6 aufgeführt.
Alle 0 MC-Peptide im Bereich von 950 Da bis 3.300 Da konnten detektiert werden, ebenso wie die Lactosylierung von Peptid 1581 und dessen Methionin-Oxidation (s. Abb.
2.9) sowie die Methionin-Oxidation von Peptid 976. Bei -Casein hat die DHAP-Matrix
zu deutlich besseren Spektren geführt als die CCA-Matrix. Weitere Modifikationen
konnten hier nicht nachgewiesen werden.
Um weitere Modifikationen nachweisen zu können, wurde entfettete UHT-Milch erhitzt auf 70 °C, 80 °C und 99 °C, je für 30 Minuten, 2 und 4 Stunden. Alle Proben
wurden wie oben beschrieben behandelt. Die Lactosylierung und Oxidation von Peptid
1581 und die Oxidation von Peptid 976 konnten bestätigt werden, allerdings wurden
trotz zusätzlicher Erhitzung keine weiteren Modifikationen nachgewiesen. Ebenso wie
für s1 -Casein wurde daher im Folgenden eine HPLC-Proteintrennung durchgeführt,
um mögliche Verluste bei der Extraktion der Peptide aus dem Gel zu vermeiden.
b
a
37
a
Abb. 2.7: Massenspektren von Peptid 2120 mit Amadoriprodukt. s1 -Casein isoliert aus
H-Milch bzw. Kondensmilch mittels Gelelektrophorese, verdaut mit GluC in
Phosphatpuffer und vermessen mit MALDI-TOF-MS in CCA, im Vergleich
mit -Casein-Standard, der genauso aufgearbeitet wurde
a
38
a
Abb. 2.8: Massenspektren von Peptid 1778 mit Oxidation. s1 -Casein isoliert aus
H-Milch mittels Gelelektrophorese, verdaut mit GluC in Phosphatpuffer und
vermessen mit MALDI-TOF-MS in CCA, im Vergleich mit genauso aufgearbeitetem -Casein-Standard
a
b
Abb. 2.9: Massenspektrum von Peptid 1581 aus -Casein mit Oxidation und Amadoriprodukt. -Casein isoliert aus H-Milch mittels Gelelektrophorese, verdaut
mit GluC in Phosphatpuffer und vermessen mit MALDI-TOF-MS in DHAP
b
39
2.6 Nachweis von Modifikationen in Milchproteinen
nach Vortrennung mittels HPLC
Bisher wurden Spektren nach gelelektrophoretischer Auftrennung und In-Gel-Verdau
ausgewertet. Dabei fiel auf, dass jedes Spektrum sehr viele Peaks enthielt: Diverse Peptide (v.a. 0 MC und 1 MC) sowie unterschiedliche Addukte und Reaktionsprodukte als
Folge der vorangegangenen Erhitzung der Proben. In diesem Fall besteht die Möglichkeit, dass vorhandene Modifikationen nicht erkannt werden können, weil deren Signale
von anderen Peaks überlagert werden. Außerdem kann eine zu große Anzahl von Molekülen die Ionisation von Minorkomponenten beeinträchtigen. Aus diesem Grund wurde
das Proteinhydrolysat per RP-HPLC aufgetrennt und in Fraktionen aufgefangen, die
anschließend einzeln mittels MALDI-TOF-MS vermessen wurden.
Die hierzu eingesetzte HPLC-Anlage ist in Kap. 5.14.4 beschrieben, ebenso sind dort
die wichtigsten Parameter zusammengestellt. Als Detektor wurde ein Diodenarraydetektor gewählt, besonders die Wellenlängen 220 nm und 275 nm wurden beobachtet.
220 nm entspricht dem Absorptionsmaximum der Peptidbindung, bei 275 nm absorbieren aromatische Aminosäuren [1]. Mittels Detektion bei 275 nm können also Peptide
ohne aromatische Aminosäuren nicht detektiert werden; außerdem war die Signalintensität selbst bei Peptiden mit aromatischen Aminosäuren bei 220 nm wesentlich größer
als die bei 275 nm. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit bei 220 nm detektiert.
2.6.1 Etablierung einer HPLC-Trennung der Peptide aus dem
Hydrolysat von b-Casein
b-Casein wurde mit GluC verdaut (s. Kap. 5.12.1) und das Hydrolysat mittels HPLC
aufgetrennt. Eine der hierbei verwendeten Fließmittelkomponenten war reines Acetonitril; das führte, wie sich später zeigte, zu der leicht abfallenden Grundlinie. Um das zu
vermeiden, wurde im Folgenden der Acetonitril-Fließmittelkomponente TFA zugesetzt.
Fraktioniert wurde so wie es Abb. 2.10 zu entnehmen ist.
Anschließend wurden die einzelnen Fraktionen lyophyllisiert und in DHAP mittels
MALDI-TOF-MS vermessen (die ersten drei Fraktionen wiesen erhöhte Salzkonzentrationen und noch keine Peptide auf, weshalb erst ab Fraktion 4 vermessen wurde).
Hierbei konnten die in Tab. 2.1 genannten Peptide und Fraktionen einander zugeordnet
werden.
40
2.6. Nachweis von Proteinmodifikationen nach Vortrennung mittels HPLC
b
Abb. 2.10: Chromatogramm zur Fraktionierung des Hydrolysates von -Casein nach
GluC-Verdau und HPLC-Auftrennung. Die gekennzeichneten Peaks konnten 0 MC- oder 1 MC-Peptiden zugeordnet werden.
Alle 0 MC-Peptide im Bereich von 900 Da bis 3.300 Da wurden nachgewiesen; zusammen mit den detektierten 1 MC-Peptiden errechnet sich eine Sequenzabdeckung von ca.
65 % (bzw. 8 von 11 Lysinresten).
2.6.2 Untersuchung von im Milchmodellsystem erhitztem b-Casein
b
Ebenso wurden im Milchmodell erhitzte -Casein-Proben untersucht; hierfür wurde mit
bzw. ohne Lactose inkubiertes Protein mit GluC verdaut und mittels HPLC vermessen
(s. Kap. 5.12.2). Der in Kap. 2.4.2 erwähnte Effekt wurde bestätigt, -Casein fällt bei
der Erhitzung im Milchmodellsystem aus (s. Abb. 2.11). Je länger erhitzt wurde, umso
kleiner wurden die Peaks an der HPLC. Auffällig war, dass sich unabhängig davon,
ob -Casein mit oder ohne Lactose inkubiert worden war, das gleiche Peakmuster an
b
b
41
Tab. 2.1: Identifikation von Peptiden in den einzelnen HPLC-Fraktionen (vgl. Abb.
2.10). -Casein wurde mit GluC verdaut, die resultierende Peptidmischung
mittels HPLC fraktioniert und mit MALDI-TOF-MS in DHAP vermessen.
b
Peptid
5199
2794
1581
1201
1092
976
969
911
675
MC
1
0
0
0
1
0
1
0
1
HPLC-Fraktion
19
22
17
11
15
10
15
6
7
der HPLC ergeben hat. Bei den mit Lactose inkubierten Proben wurden zusätzliche
Peaks erwartet; deren Auftreten hätte durch entstandene Modifikationen erklärt werden können. Mögliche Gründe für das Fehlen zusätzlicher Peaks sind einerseits ein zu
geringes Ausmaß der Modifikationen oder andererseits, dass modifizierte Peptide von
unmodifizierten chromatografisch nicht abgetrennt wurden.
Das Hydrolysat des für drei Tage mit Lactose inkubierten -Caseins wurde analog
zu Abb. 2.10 fraktioniert. Auffällig war, dass in den Fraktionen 2 bis 22 kein 0 MCPeptid von -Casein detektiert wurde. Die einzige Ausnahme bildet Peptid 1581, das in
Fraktion 17 nachgewiesen werden konnte; zusätzlich wurden das Oxidations- und das
Amadoriprodukt dieses Peptids detektiert. Diese Modifikationen konnten auch nach
gelelektrophoretischer Aufreinigung bereits nachgewiesen werden (vgl. Abb. 2.9 und
Tab. 2.2). Für den Nachweis weiterer Modifikationen war die Proteinkonzentration
offensichtlich zu gering; ein größerer Teil des Proteins war bereits ausgefallen, wie
durch die geringe Signalintensität der Peaks in Abb. 2.11 deutlich wird.
Der nächste Schritt wäre hier eine Vermessung von -Casein, das aus hitzebehandelter Milch isoliert wurde. Aus Zeitgründen waren diese Messungen im Rahmen der
vorliegenden Arbeit allerdings nicht möglich. Tab. 2.2 fasst die zur Untersuchung von
-Casein eingesetzten Methoden und die jeweils erzielten Ergebnisse zusammen; anstelle des 0MC-Peptids 4843 wurde das 1MC-Peptid 5199 nachgewiesen, das drei Aminosäurereste zusätzlich enthält.
b
b
b
b
42
b
Abb. 2.11: Chromatogramme des -Casein-Standards, im Milchmodellsystem ohne und
mit Lactose inkubiert, anschließend mit GluC verdaut und mittels HPLCDAD vermessen
Tab. 2.2: Unter Einsatz verschiedener Methoden nachweisbare Peptide (0MC-Peptide
größer 900 Da und Peptid 5199) und Modifikationen von -Casein.
-Casein-Standard wurde im Milchmodellsystem inkubiert und hydrolysiert
(A); -Casein wurde mittels Gelelektrophorese aus UHT-Milch isoliert und
hydrolysiert (B); inkubierter -Casein-Standard wurde hydrolysiert und mittels HPLC fraktioniert (C). Die Vermessung erfolgte jeweils mittels MALDITOF-MS.
-: nicht detektiert, AP: Amadoriprodukt, Ox: Oxidation
b
b
b
b
Peptid
6011
5199
4843
2794
Anzahl
Met+Trp
3
0
0
1
Anzahl
N-Term.+Lys
2
1
1
0
1581
1
1
1201
0
2
976
1
2
911
1
2
A
B
StandardSDS-PAGE
Inkubation
nativ
nativ
nativ
nativ
nativ
nativ
AP
Ox
nativ
nativ
nativ
nativ
Ox
nativ
-
C
HPLC
nativ
nativ
nativ
AP
Ox
nativ
nativ
nativ
43
a
Abb. 2.12: Chromatogramm zur Fraktionierung des Hydrolysates von -Lactalbumin
nach AspN-Verdau und HPLC-Auftrennung. Die gekennzeichneten Peaks
konnten 0 MC- oder 1 MC-Peptiden zugeordnet werden.
Hydrolysat von
a-Lactalbumin
Im Weiteren Verlauf wurden analoge Peptid-Fraktionierungen für weitere partiell hydrolysierte Milchproteine etabliert; zunächst wurde eine Trennung für hydrolysiertes
-Lactalbumin erstellt. Dafür wurde ein -Lactalbumin-Standard mit AspN verdaut
und mittels HPLC fraktioniert (s. Kap. 5.12.3). Aus den in Kap. 2.3.1 genannten Kriterien folgt, dass für den Verdau von -Lactalbumin AspN das am besten geeignete
Enzym ist. Zunächst wurde ein neuer Gradient erstellt und optimiert. Die endgültigen
Parameter sind in Kap. 5.13 aufgelistet. Abb. 2.12 zeigt ein typisches Chromatogramm
und das hier angewandte Fraktionierungsschema.
Anschließend wurden die einzelnen Fraktionen lyophyllisiert und in DHAP mittels
MALDI-TOF-MS vermessen (die erste Fraktion wies erhöhte Salzkonzentrationen und
noch keine Peptide auf, weshalb erst ab Fraktion 2 vermessen wurde). Analog zu
-Casein konnten auch hier in den einzelnen Fraktionen die Peptide aus dem theoretischen Verdau (s. Tab. 8.7) identifiziert werden. Die entsprechenden Signale sind
durch Sternchen in Abb. 2.12 gekennzeichnet; Tab. 2.3 gibt Auskunft über die ge-
a
a
a
b
44
2.12). -Lactalbumin wurde mit AspN verdaut, die resultierende Peptidmischung mittels HPLC fraktioniert und mit MALDI-TOF-MS in DHAP
vermessen.
a
Peptid
2517
2188
2174
2059
1646
1622
1531
1252
1177
1062
1034
1002
637
522
MC
0
0
1
0
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
HPLC-Fraktion
11
10
9
9
5
6
5
5
7
7
8
2
5
5 und 6
naue Zuordnung. Die übrigen Peaks konnten weder 2 MC- oder 3 MC-Peptiden, noch
Peptiden aus anderen Milchproteinen zugeordnet werden.
Hier ergab sich eine Sequenzabdeckung von 97 %, wobei alle 12 Lysinreste erfasst
wurden, ebenso alle 13 Cystein-, Tryptophan- und Methioninreste.
2.6.4 Untersuchung von im Milchmodellsystem erhitztem
a-Lactalbumin
a
Nachdem eine Fraktionierung für die Peptide aus dem Verdau von -Lactalbumin etabliert war, wurden Proben vermessen, die im Milch simulierenden System erhitzt worden waren. Dazu wurde ein -Lactalbumin-Proteinstandard sieben Tage lang mit und
ohne Lactose erhitzt, dialysiert und mit AspN verdaut (s. Kap. 5.12.4). Die resultierenden Peptidmischungen wurden mittels HPLC fraktioniert (s. Kap. 2.6.3) und die
erhaltenen Fraktionen wurden mittels MALDI-TOF-MS in DHAP vermessen; ein identischer Ansatz wurde zusätzlich in CCA untersucht.
a
45
a
Abb. 2.13: MALDI-TOF-MS-Spektren von Peptiden aus modifiziertem -Lactalbumin.
-Lactalbumin wurde 7 Tage bei 60 °C mit Lactose inkubiert, mit AspN
verdaut und mittels HPLC fraktioniert. Die dargestellten Spektren zeigen
beispielhaft die Modifikationen der Peptide 522, 1034, 1177 und 2188 (in
DHAP) und 1622 (in CCA).
a
46
Die Chromatogramme der inkubierten Proben stimmten gut mit denen des hydrolysierten Proteinstandards (s. Abb. 2.12) überein; daher konnte hier auf die gleiche
Weise fraktioniert werden wie es Abb. 2.12 zeigt. Die MALDI-TOF-MS-Spektren einiger Fraktionen zeigt Abb. 2.13; insgesamt konnten Oxidationen an den vier Peptiden
2188, 2059, 1177 und 1034 nachgewiesen werden, ebenso Amadoriprodukte der sechs
Peptide 2188, 2059, 1622, 1252, 1177 und 522. Darüber hinaus wurden an den fünf
Peptiden 2188, 2059, 1622, 1252 und 522 Massenzunahmen von 58 Da beobachtet, was
durch die Bildung von CML-Modifikationen erklärt werden könnte (vgl. Kap. 2.9). Die
Positionen und Sequenzen der Peptide sowie die beteiligten Aminosäuren sind in Tab.
2.8 zusammengestellt.
Hydrolysat von
as1-Casein
Auch hier wurde zunächst ein Protein-Standard verdaut (mit GluC) und an der HPLC
vermessen (s. Kap. 5.12.5). Es ergaben sich gut reproduzierbare Chromatogramme;
fraktioniert wurde, wie es Abb. 2.14 veranschaulicht, nach den in Kap. 5.14.4 genannten Zeitpunkten. Diese Fraktionierung wurde für die gesamte vorliegende Arbeit beibehalten.
In den ersten Experimenten zeigte sich, dass Fraktion 5 anhand der Chromatogramme von den Fraktionen 4 und 6 schwer abzugrenzen war, da sich kein deutlicher Peak
ergab. Daher und um die Probenanzahl so gering wie möglich zu halten, wurde Fraktion
5 auf die Fraktionen 4 und 6 aufgeteilt. Nichtsdestotrotz wurde lückenlos fraktioniert,
also nichts verworfen bis auf den Einspritzpeak und die ersten beiden Fraktionen, die
keine Peptide enthielten. Um einen übersichtlichen Vergleich aller Fraktionierungsexperimente zu ermöglichen, wurde von einer Umbenennung aller nachfolgenden Fraktionen
abgesehen.
Nach der Fraktionierung wurden die einzelnen Fraktionen lyophyllisiert und in DHAP
mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Hierbei konnten die in Tab. 2.4 genannten Peptide
und Fraktionen einander zugeordnet werden. Die folgenden Auswertungen beschäftigen
sich jedoch ausschließlich mit den Peptiden, die Lysin oder Methionin bzw. Tryptophan
enthalten, da an den übrigen Peptiden keine Modifikationen erwartet und auch nicht
nachgewiesen wurden. Die beiden sehr großen Peptide in Fraktion Nummer 14, Peptid
3793 (3 MC, Position 158-192) und Peptid 3463 (2 MC, Position 158-189) haben die Sequenz AYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSE(NSE) und werden gebildet,
47
a
Abb. 2.14: Chromatogramm zur Fraktionierung des Hydrolysates von s1 -Casein nach
GluC-Verdau und HPLC-Auftrennung. Die mit Sternchen gekennzeichneten
Peaks konnten s1 -Casein-Peptiden zugeordnet werden.
a
48
2.14). s1 -Casein wurde mit GluC verdaut, die resultierende Peptidmischung
mittels HPLC fraktioniert und mit MALDI-TOF-MS in DHAP vermessen.
a
Peptid
3793
3463
2120
1778
1756
1664
1449
1440
1229
1049
913
910
902
900
876
858
763
MC
3
2
1
0
0
0
0
2
0
1
0
0
0
0
0
0
1
HPLC-Fraktion
14
14
9
8
10
7
16
11
12
7
10
3 und 4
11
7
12
6
6
wenn GluC die Bindungen nach den beiden Asparaginsäureresten nicht hydrolysiert.
Beide Peptide enthalten weder Lysin noch Methionin, jedoch je einmal Tryptophan.
Da sie jedoch nicht oxidiert vorlagen, wird im Folgenden auf diese beiden Peptide nicht
weiter eingegangen. Peptid 763 enthält zwar Lysin, jedoch konnte dieses Amadoriprodukt nicht ausgewertet werden: 763 Da + 324 Da = 1087 Da; dieser Peak war von dem
Kaliumaddukt des Peptids 1049 überlagert. Der Nachweis dieser Modifikation erfolgte
mittels UHPLC-MS/MS (s. Kap. 4.3).
Die Sequenzabdeckung bei s1 -Casein betrug mit dieser Methode 84 %, 32 der 199
Aminosäuren konnten nicht erfasst werden. In Abb. 2.15 sind die nachgewiesenen Peptide über der Proteinsequenz dargestellt. Es wurden 13 der 14 vorhandenen Lysinreste
abgedeckt (etwa 93 %), ebenso beide Tryptophanreste und vier der fünf Methioninreste.
a
49
Tab. 2.5: Nachgewiesene CML-Modifikationen und Amadoriprodukte nach Inkubation von s1 -Casein im Milchmodellsystem, Verdau, HPLC-Auftrennung und
MALDI-TOF-MS-Messung in DHAP (X) bzw. in CCA (O)
a
Peptid
2120
1778
1756
1664
1049
910
900
876
Lysinposition
N-Term./Lys3/Lys7
Lys132
Lys102/Lys103/Lys105
N-Term./Lys3/Lys7
Lys34/Lys36
Lys79/Lys83
Lys124
Lys193
1d
CML
5d 7d
O
14 d
O
O
XO XO
O
X
X
O
Amadoriprodukt
1 d 5 d 7 d 14 d
X X XO O
X
X
O
X X XO XO
O
O
X X
X
X
X
O
O
X X XO O
a
a-Casein
Anschließend wurden im Milchmodell erhitzte -Casein-Proben vermessen; hierfür wurde wiederum mit bzw. ohne Lactose inkubiertes Protein mit GluC verdaut und mittels
HPLC vermessen; die Aufarbeitung erfolgte analog zu Kap. 5.12.2. Auch hier waren
zwischen den Chromatogrammen der mit und ohne Lactose erhitzten Proben keine
deutlichen Unterschiede zu erkennen. Die für einen, fünf, sieben und vierzehn Tage
inkubierten Proben wurden wie oben beschrieben fraktioniert und mittels MALDITOF-MS in DHAP vermessen. Jeweils als Kontrolle diente die ohne Lactose für die
gleiche Zeit inkubierte Probe. Die unmodifizierten Peptide wurden in allen Proben gefunden, die Modifikationen wurden wie erwartet nur in den mit Lactose inkubierten
Proben detektiert. Bei der Auswertung dieser Experimente zeigte sich, dass es hier erstmals gelang, an mehreren Peptiden Modifikationen nachzuweisen. Tab. 2.5 stellt die in
s1 -Casein nachgewiesenen Modifikationen zusammen und lässt erkennen, dass vor allem CML-Modifikationen erst bei stärkerer Hitzeeinwirkung gebildet wurden. Darüber
hinaus war in allen Proben die Oxidation der Peptide 1778, 900 und 876 nachweisbar,
unabhängig vom Lactosezusatz.
Die eingesetzte MALDI-Matrix kann einen großen Einfluss darauf haben, ob bestimmte modifizierte Peptide messbar sind oder nicht. Daher wurde in einem zweiten,
unabhängigen Versuch CCA-Matrix eingesetzt. Hierzu wurde -Casein mit und ohne
Lactose im Milchmodellsystem für 7 und 14 Tage bei 60 °C inkubiert und mit GluC verdaut. Die resultierende Peptidmischung wurde mittels HPLC fraktioniert und in CCA
mittels MALDI-TOF-MS vermessen (s. Kap. 5.12.6). Die ohne Lactose inkubierten
a
a
50
a
Abb. 2.15: Darstellung der nachgewiesenen Modifikationen des s1 -Caseins in der Proteinsequenz. s1 -Casein wurde im Milchmodellsystem inkubiert und mit
GluC verdaut; die resultierenden Peptide wurden mittels HPLC aufgetrennt
und in DHAP und CCA mittels MALDI-TOF-MS vermessen
a
51
Proben dienten auch hier als Kontrolle; CML-Modifikationen und Amadoriprodukte
waren nur in den mit Lactose inkubierten Proben nachweisbar. Es zeigte sich, dass
einige Ergebnisse des vorhergehenden Versuches bestätigt werden konnten, darunter
auch die Oxidation der Peptide 1778, 900 und 876; darüber hinaus wurden zusätzliche
Modifikationen nachgewiesen, wie Tab. 2.5 zeigt. Die Abb. 2.15 zeigt die mit mindestens einer der beiden Matrices nachgewiesenen Proteinmodifikationen in der Sequenz
von s1 -Casein.
a
2.6.7 Vermessung aus UHT-Milch gelelektrophoretisch isolierten
as1-Caseins mit HPLC-MALDI-TOF-MS
Bisher wurde a -Casein untersucht, das im Milchmodellsystem mit Lactose erhitzt
worden war. Als nächster Schritt sollte modifiziertes a -Casein aus hitzebehandelter
s1
s1
Milch isoliert werden; dies wurde zunächst durch eine Gelelektrophorese realisiert.
Es wurde wie unter 2.5 beschrieben aus entfetteter UHT-Milch gelelektrophoretisch
s1 -Casein isoliert und dieses anschließend im Gel mit GluC verdaut. Die Peptide wurden aus dem Gel eluiert, lyophyllisiert, in Wasser aufgenommen und in die HPLC injiziert. Die erhaltenen Fraktionen wurden wiederum lyophyllisiert und in DHAP mittels
MALDI-TOF-MS vermessen.
Das Experiment wurde mehrfach durchgeführt, auch mit erhöhter Proteinmenge im
Gel und Vermischung identischer Banden aus mehreren mit Milch beladenen Bahnen, um die Proteinmenge weiter zu erhöhen. Erst dadurch war es möglich, neben der
Oxidation der Peptide 1778, 900 und 876, bei zwei Peptiden (2120 und 1756) Lactosylierungen nachzuweisen. Allerdings konnten im Milchmodellsystem deutlich mehr
modifizierte Peptide nachgewiesen werden (vgl. Tab. 2.5 und 2.6). Es besteht die Möglichkeit, dass der In-Gel-Verdau selbst oder die anschließende Extraktion der Peptide
aus der Gelmatrix mit hohen Verlusten behaftet war. Um diese Fehlerquelle auszuschließen, wurde im Folgenden eine andere Trenntechnik für die Proteine eingesetzt.
Die Auftrennung der Milchproteine aus Milchproben heraus sollte mit HPLC erfolgen.
Zuerst musste jedoch eine Trennung für die Proteine in Milch etabliert werden. Die
unter Anwendung dieses Verfahrens nachgewiesenen Modifikationen sind in Kap. 3.5
aufgeführt; die Ergebnisse der bisherigen Experimente fasst Tab. 2.6 zusammen.
a
52
Tab. 2.6: Unter Einsatz verschiedener Methoden erreichte Sequenzabdeckung und detektierte modifizierte Peptide des s1 -Caseins. -Casein-Standard wurde im
Milchmodellsystem mit Lactose inkubiert bzw. wurde s1 -Casein mittels
Gelelektrophorese aus UHT-Milch isoliert. Nach partieller Hydrolyse und
ggf. Peptidfraktionierung per HPLC erfolgte jeweils die Vermessung mittels
MALDI-TOF-MS.
CML: Carboxymethyllysin, AP: Amadoriprodukt, Ox: Oxidation
a
Probe
Proteinisolierung
Peptidfraktionierung
Sequenzabdeckung
Peptid 2120
Peptid 1778
Peptid 1756
Peptid 1664
Peptid 1049
Peptid 910
Peptid 900
Peptid 876
StandardUHT-Milch
inkubation
SDS-PAGE
47 %
55 %
AP
AP
Ox
CML, AP
AP
Ox
a
a
StandardUHT-Milch
inkubation
SDS-PAGE
HPLC
84 %
CML, AP
AP
Ox, CML, AP
Ox
CML, AP
AP
CML, AP
AP
CML, AP
Ox, CML, AP
Ox
Ox
Ox
2.6.8 Etablierung einer HPLC-Trennung der Milchproteine
Zur Trennung der Milchproteine wurden vier verschiedene Säulen getestet: eine PLRPS-Säule (Polystyroldivinylbenzol, PS/DVB) und drei unterschiedliche C8-Säulen (s.
Kap. 5.1). Für alle Säulen wurde versucht, einen optimalen Fließmittel-Gradienten
zu entwickeln, indem aufgereinigte Caseine und Molkenproteine getrennt und in Mischungen injiziert wurden. Eine dieser C8-Säulen (Zorbax 300SB-C8) ist auf Grund
der größeren Poren speziell für Proteintrennungen geeignet und führte daher auch zu
den besten Ergebnissen. Eine komplette Auftrennung aller Milchproteine gelang jedoch
auch mit Zusatz von DTT nicht; dies konnte nur erreicht werden, wenn die Milchproteine vor der Trennung mit Guanidin denaturiert wurden. Hierfür wurde ein Protokoll
nach Bobe et al. [61] eingesetzt, das in Kap. 5.14.1 beschrieben ist. Ausgehend von einer
Publikation von Bonfatti et al. [62] wurden alle relevanten Parameter optimiert; dies
führte zu den in Kap. 5.14.2 dargestellten Werten. Im weiteren Verlauf der vorliegenden
Arbeit wurden diese optimierten Parameter verwendet.
53
Abb. 2.16: Chromatogramm mittels HPLC getrennter Milchproteine aus entfetteter
UHT-Milch; Vergleich mit Chromatogrammen von Standardsubstanzen und
Identifizierung der Peaks
54
2.7. Optimierung der Methode
Abb. 2.16 zeigt beispielhaft eines der Chromatogramme, die sich bei Anwendung
dieses Protokolls auf eine UHT-Milchprobe ergeben haben. Die Identifizierung der einzelnen Peaks erfolgte durch Vergleich der Retentionszeiten mit denen von Standardproteinen; hier wurden drei Caseine und die zwei wichtigsten Molkenproteine als Standards eingesetzt (wässrige Lösungen in milchtypischen Konzentrationen). Abb. 2.16
zeigt die gute Übereinstimmung der Retentionszeiten von den Proteinstandards und
den Signalen aus der Milchprobe. Zusätzlich wurden die Peaks einzeln aufgefangen,
lyophyllisiert und in DHAP mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Über die gemessenen
Massen konnte die Zuordnung nochmals abgesichert werden.
2.7 Optimierung der Methode
2.7.1 Untersuchung und Beseitigung der Störung mit
Massenunterschied 56 Da
Ein Ziel dieser Arbeit war der Nachweis CML-modifizierter Peptide. In vielen Spektren trat jedoch eine „Modifikation“ mit einer Massenzunahme von 56 Da auf, die die
Detektion von CML (Massenunterschied zum nativen Peptid 58 Da) verhindert oder
zumindest erschwert hat. Es wurden daher einige Versuche unternommen, um gegen
diese Störung vorzugehen.
Eine mögliche Interpretation dieser Massendifferenz sind an die Probe angelagerte
Eisenionen. Zur Abklärung wurde s1 -Casein aus Milchproben gelelektrophoretisch isoliert und im Gel verdaut. Die Peptide wurden eluiert und mittels HPLC fraktioniert.
Jede einzelne Fraktion wurde mit EDTA-haltigem (1 mM) Tris-HCl-Puffer (20 mM;
pH 8,5) inkubiert, um eventuell aus HPLC oder HPLC-Fließmittel stammende Eisenionen zu komplexieren. Anschließend wurden die Proben über ZipTips gereinigt und in
DHAP mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Dieser Versuch wurde zweimal unabhängig
durchgeführt.
Leider führte der EDTA-Zusatz zu einer Verschlechterung der Spektrenqualität; die
Signalintensitäten der Lactosylierungen haben deutlich abgenommen, sodass nicht in
jedem Fall die Amadoriprodukte der Peptide 2120 und 1756 detektiert wurden. Zudem
konnte die Störung bei +56 Da auf diesem Wege nicht beseitigt, ja nicht einmal deutlich abgeschwächt werden. Es wurde auch versucht, die Fraktionen ohne Inkubation
mit EDTA direkt mit ZipTips aufzureinigen. Jedoch waren auch hier die erhaltenen
Signalintensitäten sehr gering und die Störung bei +56 Da immer noch nachweisbar.
a
55
Des Weiteren wurde mit verschiedenen Puffern und EDTA-Konzentrationen experimentiert: s1 -Casein wurde aus Sterilmilch mittels HPLC isoliert und mit GluC verdaut. Die Peptidmischung wurde fraktioniert, jede Fraktion mit EDTA in verschiedenen Konzentrationen inkubiert und in DHAP vermessen (Details s. Kap. 5.14). Hierbei
zeigte sich, dass eine Inkubation mit 0,01 mM EDTA die Detektion von vier Amadoriprodukten erlaubte, jedoch die Störung mit +56 Da nicht wirksam unterdrückte.
Höhere EDTA-Konzentrationen ab 0,05 mM senkten die Signalintensitäten der Peaks
bei der MALDI-TOF-MS-Messung soweit ab, dass die meisten lactosylierten Peptide
nicht mehr nachweisbar waren, ebenso wenig wie CML-Modifikationen. Als Ursache
für die geringen Signalintensitäten wurde die HPLC-Peptidtrennung ausgeschlossen;
hier waren die Intensitäten noch auf gutem Niveau. Offensichtlich stören also bereits
die hier eingesetzten kleinen EDTA-Mengen die massenspektrometrische Messung; allerdings wurde hier auf ZipTips verzichtet, um dadurch möglicherweise auftretende
Verluste zu vermeiden.
Da eine Komplexierung eventuell vorhandener Eisenionen nicht zum erhofften Ergebnis führte, wurde versucht, diese durch Zusatz von Lithiumsalzen von den Peptiden zu verdrängen. Zu diesem Zweck wurden neue Serien von HPLC-Fraktionen mit
500 mM Lithiumchlorid und in weiteren Experimenten mit Lithiumcarbonat oder Lithiumacetat umgesetzt. Es zeigte sich, dass pro Peptid mehrere Lithiumaddukte durch
MALDI-TOF-MS-Messung in DHAP nachweisbar waren. Allerdings waren durch die
Vielzahl dieser Addukte auch die Signalintensitäten der Peaks wesentlich verringert.
Daher konnte auch so keine Lösung des Problems herbeigeführt werden.
Anschließend sollte bestimmt werden, nach welchem Schritt der Aufarbeitung die
Verunreinigung zum ersten Mal auftritt. Dazu wurde -Casein in Ammoniumbicarbonatpuffer mit GluC über Nacht verdaut. Das Hydrolysat wurde mittels HPLC fraktioniert und exemplarisch die Fraktion, die Peptid 1756 enthält, mittels MALDI-TOFMS vermessen. Ebenso wurde das Hydrolysat direkt vermessen und es wurde HPLCFließmittel der gleichen Zusammensetzung wie bei der HPLC-Trennung mit Verdaulösung versetzt und vermessen. Der Zusatz von Verdaulösung war erforderlich, damit
Peptide vorhanden sind, an die sich möglicherweise vorhandene Ionen anlagern können;
die Vermessung des Fließmittels erfolgte, um einen Einfluss der HPLC-Anlage selbst erkennen zu können. Der Verdau wurde im Ammoniumbicarbonatpuffer durchgeführt, da
Phosphat in vorangegangenen Experimenten in den hier eingesetzten Konzentrationen
die Messergebnisse stark beeinträchtigt hatte. Alle Proben wurden vor der Vermessung
lyophyllisiert und in DHAP wieder aufgenommen. Es zeigte sich, dass die Störung
a
a
56
Abb. 2.17: MALDI-TOF-MS-Spektren zum Vergleich von „massive steel target“ und
„ground steel target“
in allen drei Proben vorhanden war, jedes Mal mit vergleichbarer Intensität. Da die
Störung bereits im Hydrolysat messbar war, lässt sich schlussfolgern, dass HPLC und
Fließmittel nicht verantwortlich sind. Außerdem ergaben sich in der Verdauprobe Signale bei einer Massenzunahme von 56 Da bei diversen Peptiden, auch bei solchen, die
kein Lysin enthalten; somit ist ausgeschlossen, dass es sich um eine Lysinmodifikation
handelt.
Auffällig war, dass die Signalintensität der Störung stark von der eingesetzten Matrix
abhängig war: mit CCA war die Störung kaum oder gar nicht sichtbar, andererseits
war ein Nachweis von CML in DHAP und ClCCA nicht möglich, weil die Störung hier
deutlich höhere Intensitäten aufwies. Diese starke Abhängigkeit von der Matrix führte
zu dem Verdacht, dass die Störung mit dem Stahlträger zu tun haben könnte. Vom Hersteller des MALDI-Massenspektrometers (Bruker Daltonics) wurden zwei verschiedene
Stahlträger angeboten: „massive steel target“ und „ground steel target“; die bisherigen
Messungen erfolgten auf einem „massive steel target“. Um den Einfluss des verwendeten
Stahlträgers zu bestimmen wurde zweimal die gleiche Probenlösung - Fraktion 10 aus
zwei Milch-Fraktionierungen, je einmal in DHAP und ClCCA - auf beide Trägertypen
pipettiert. Die Vermessung ergab, dass die +56 Da-Störung nur bei dem „massive steel
target“ auftrat (s. Abb. 2.17). Dieser Effekt zeigte sich ebenso bei weiteren, unabhän-
57
gigen Versuchen. Daher wurde im Folgenden ausschließlich mit einem „ground steel
target“ gearbeitet, wodurch die Störung vollständig eliminiert werden konnte. Zusätzlich wurde dadurch die Signalintensität der Metalladdukte von Peptid 1756 deutlich
abgesenkt.
Laut Hersteller besitzt das „massive steel target“ eine Korrosionsschutz-Beschichtung.
Eine mögliche Erklärung für die Beobachtungen ist, dass sich Eisenionen aus dieser
Beschichtung lösen und unspezifisch an die Peptide binden. Das würde erklären,
warum mit ZipTip-Aufreinigung und EDTA-Zusatz keine Verbesserung erzielt wurde.
Die Massendifferenz liefert einen weiteren Anhaltspunkt, da 91,7 % der natürlichen
Eisenvorkommen das Isotop 56 Fe ausmacht [56].
2.7.2 Optimierung der eingesetzten MALDI-Matrix
Wie bereits erwähnt wurde, hat die Auswahl der MALDI-Matrix großen Einfluss auf
die Ergebnisse der Messung. Daher wurde die Matrix bestimmt, die zu den besten
Signal/Rausch-Verhältnissen führte. Hierbei zeigte sich, dass nicht alle Fraktionen in
der gleichen Matrix vermessen werden sollten. Aus diesem Grund wurde für jede Fraktion getrennt die optimale Matrix festgelegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die
Matrices CCA, ClCCA und DHAP untersucht. ClCCA wurde im Arbeitskreis in Anlehnung an eine Publikation von Jaskolla et al. [52] synthetisiert. Im Anschluss wurde
das Produkt zusätzlich in Acetonitril/Wasser umkristallisiert sowie Identität und Reinheit mittels 1 H-NMR überprüft.
Um in den drei Matrices aufgenommene Peptidspektren vergleichen zu können, wurde Sterilmilch wie es in den Kapiteln 5.14.1 - 5.14.4 beschrieben ist aufgearbeitet und
untersucht: Die Proteine wurden denaturiert, mittels HPLC s1 -Casein isoliert, dieses
mit GluC verdaut und die Peptidmischung an der HPLC fraktioniert. Nach zweimaliger
Wiederholung standen drei Serien von Fraktionen zur Verfügung; alle Fraktionen einer
Serie wurden in einer der zu testenden Matrices aufgenommen und mittels MALDITOF-MS vermessen.
Ziel war, dass die Signalintensität von CML und dem Amadoriprodukt möglichst
groß ist, die der Natrium- und Kaliumaddukte hingegen möglichst klein. Wie also
Abb. 2.18 entnommen werden kann, ist beispielsweise für Peptid 900 die CCA-Matrix,
für Peptid 910 hingegen die ClCCA-Matrix am besten geeignet. Insgesamt ergab sich
für alle Peptide die in Tab. 2.7 dargestellte Zuordnung. Die Fraktionen 3 und 4 sowie
6 und 7 mussten jeweils vereinigt werden; für die im folgenden Kapitel beschriebene
a
58
Tab. 2.7: Zuordnung der HPLC-Fraktionen zu den enthaltenen Peptiden und der optimalen Matrix
HPLC-Fraktion
3+4
6+7
6+7
6+7
8
9
10
11
12
Peptid Matrix
910 ClCCA
1664 CCA
1049 CCA
900 CCA
1778 ClCCA
2120 CCA
1756 CCA
902 ClCCA
876 ClCCA
relative Quantifizierung ist es von entscheidender Bedeutung, dass sich das native und
zugehörige modifizierte Peptide in der selben MALDI-Probe befinden (genaue Erläuterung siehe Kap. 3.7). Zudem darf das Peptid aus dem gleichen Grund nicht auf zwei
getrennte Fraktionen aufgeteilt sein. Um beides sicherzustellen, wurden die genannten
Fraktionen nach dem Lyophyllisieren bei der Matrixzugabe vereinigt. Außerdem sank
dadurch die Probenanzahl, was die Analytik beschleunigte. Zur Überlagerung mehrerer
Peaks in den vereinigten Fraktionen kam es nicht, weshalb die Auswertung trotz der
Vereinigung gut möglich war.
Bei diesem Versuch war es nicht möglich, die selbe Probe in drei Matrices aufzunehmen und dann zu vermessen. Die lyophyllisierten Fraktionen des Hydrolysates enthielten so geringe Mengen der Peptide, dass die komplette Probe direkt in Matrix
gelöst und vermessen wurde. Aus diesem Grund wurden für die verschiedenen Matrices verschiedene Serien von Fraktionen herangezogen. Daher könnten Unterschiede der
Signalintensitäten auch auf mögliche Schwankungen der Intensitäten bei der HPLCFraktionierung zurückzuführen sein. Abweichungen zwischen den Läufen konnten anhand der Chromatogramme jedoch nicht beobachtet werden. Um dies abzusichern,
wurde der oben beschriebene Versuch wiederholt, indem erneut Sterilmilch wie dort
dargestellt aufgearbeitet und vermessen wurde. Hierbei ergab sich genau die gleiche
Zuordnung wie im ersten Versuch. Im Folgenden wurde also jede Fraktion in der für
sie optimal geeigneten Matrix vermessen, so wie es Tab. 2.7 zeigt.
59
Abb. 2.18: MALDI-TOF-MS-Spektren zum Vergleich der Matrices ClCCA, CCA und
DHAP am Beispiel der Peptide 900 und 910, erhalten durch Aufarbeitung einer Sterilmilchprobe. Die Intensität der Peptidpeaks wurde normalisiert, die Skalierung der Amadoriproduktpeaks entspricht der des jeweiligen
Peptidpeaks.
60
2.8. Evaluation der Peptidfraktionierung
2.7.3 Versuch zur Unterdrückung der Metalladdukte
In den Massenspektren zeigte sich, dass an die meisten Peptide Natrium- und Kaliumionen angelagert waren (s. z.B. Abb. 2.18oder 2.19 ganz oben). Im folgenden Experiment
wurde untersucht, ob eine Aufreinigung mit ZipTips vor der Vermessung diese Addukte
unterdrücken kann.
s1 -Casein wurde mittels HPLC aus Sterilmilch isoliert und mit GluC verdaut, die
resultierende Peptidmischung wurde fraktioniert. Alle Fraktionen wurden lyophyllisiert
und mittels ZipTips aufgereinigt (s. Kap. 5.5.2). Die Proben wurden getrocknet, in der
optimalen Matrix wieder aufgenommen und mittels MALDI-TOF-MS vermessen.
Beim Vergleich mit einer Sterilmilchprobe, die nicht mit ZipTips aufgereinigt worden
war, zeigte sich, dass die ZipTip-Aufreinigung die Signalintensitäten der Peaks verringert hat. Bei einigen Peptiden nahm die Intensität der Modifikationspeaks ab, was im
Sinne einer möglichst guten Nachweis- und Bestimmungsgrenze nicht akzeptabel ist.
Bei den meisten Peptiden war kein Unterschied durch die ZipTip-Aufreinigung feststellbar; andererseits waren die Peaks der Natrium- und Kaliumaddukte bei einigen
Peptiden nach der Aufreinigung etwas weniger intensiv. Ziel war jedoch deren vollständiges Verschwinden, um sie in der relativen Quantifizierung nicht berücksichtigen zu
müssen und die Spektrenqualität wesentlich zu erhöhen. Da diese Ziele nicht erreicht
wurden, wurde im weiteren Verlauf keine ZipTip-Aufreinigung durchgeführt.
Die Höhe der Metalladdukt-Peaks war von Peptid zu Peptid stark unterschiedlich,
aber für jedes Peptid bei verschiedenen Ansätzen vergleichbar. Daher wurde untersucht,
ob ein Zusammenhang zwischen Peptidsequenz und der Bindung von Metallionen besteht. Leider konnte ein solcher nicht gefunden werden; weder die Länge eines Peptids
noch die Anzahl an sauren Aminosäuren ließ sich mit der Intensität der Signale seiner
Metalladdukte korrelieren.
a
2.8 Evaluation der Peptidfraktionierung
Da die im Rahmen der hier etablierten Methode durchgeführte Peptidfraktionierung
relativ zeitaufwändig ist, wurde ein Vergleich mit und ohne diese Auftrennung durchgeführt. Hierzu wurde für 20 Minuten und für 2 Stunden erhitzte Rohmilch aufgearbeitet wie ab Kap. 5.14.1 beschrieben. Die Probenlösung für die Peptid-HPLC wurde
jedoch nicht injiziert, sondern mittels ZipTips nach dem in Kap. 2.7.3 genannten Verfahren aufgereinigt. Das war erforderlich, da, wie bereits erwähnt, auf Grund des ho-
61
hen Phosphatgehaltes im Verdaupuffer eine MALDI-TOF-MS-Vermessung anderenfalls
nicht möglich gewesen wäre; normalerweise erfolgt die Abtrennung der Phosphationen
an der Peptid-HPLC. Ein Verdau im Ammoniumbicarbonatpuffer hätte zu anderen
Schnittstellen von GluC im Protein geführt und dadurch einen Vergleich mit früheren
HPLC-Proben unmöglich gemacht. Die Proben wurden anschließend getrocknet und
in ClCCA mittels MALDI-TOF-MS vermessen.
Die Auftrennung der Peptidmischung brachte wesentliche Vorteile. Die meisten nativen Peptide und beispielsweise auch die Lactosylierung von Peptid 2120 ergaben stets
sehr intensive Signale; diese konnten auch ohne Fraktionierung detektiert werden. Viele Modifikationen lagen jedoch in geringer Konzentration vor; in diesen Fällen zeigte
sich, dass die Signale nur nach Auftrennung vom Grundrauschen unterschieden werden konnten. Ohne Fraktionierung waren die Nachweisgrenzen also deutlich schlechter, sodass einige Modifikationen nicht mehr nachgewiesen werden konnten (vgl. Abb.
2.19). Problematisch war auch, dass schon die Signalintensität einiger unmodifizierter
Peptide (vor allem 910 und 1664) ohne Vortrennung wesentlich geringer war als mit;
ein möglicher Grund dafür ist, dass die Ionisierung dieser Peptide durch die Vielzahl
der vorhandenen Moleküle zurückgedrängt wurde. Damit konnten auch Modifikationen dieser Peptide nicht mehr nachgewiesen oder weniger genau quantifiziert werden
(s. Abb. 2.19). Abschließend ergaben sich durch die Fraktionierung Spektren deutlich
besserer Qualität, da viele Überlagerungen und Störungen vermieden wurden. Modifikationspeaks in direkter Nähe zu anderen Signalen mit hoher Signalintensität, beispielsweise anderen Peptidpeaks, waren nach Vortrennung besser zu erkennen und zu
quantifizieren. In anderen Fällen verhinderte die Überlagerung von Peaks die Auswertung; so war das Signal von Peptid 1778 (1778,9 Da) überlagert vom Isotopenmuster
des Peaks des Natriumaddukts von Peptid 1756 (1756,1 Da + 22 Da = 1778,1 Da),
was eine präzise Quantifizierung beider Peptide und ihrer Modifikationen verhinderte
(s. Abb. 2.19 unten). Kleine Peaks der Oxidation des Peptids 1778 (1794,9 Da) konnten vom Isotopenmuster des Signals des Kaliumaddukts von Peptid 1756 (1756,1 Da
+ 38 Da = 1794,1 Da) komplett verdeckt sein. Durch die Fraktionierung konnten die
Peptide 1756 und 1778 mit ihren jeweiligen Addukten in unterschiedlichen Fraktionen
vermessen werden, wodurch eine Überlagerung von Signalen verhindert wurde.
Anhand dieser Ergebnisse wurden die großen Vorteile der Auftrennung des Peptidgemisches deutlich; daher wurde die Fraktionierung bei allen folgenden Proben eingesetzt.
62
2.8. Evaluation der Peptidfraktionierung
Abb. 2.19: Vergleich von MALDI-TOF-MS-Spektren mit und ohne vorhergehende
HPLC-Trennung der Peptide. Entfettete Rohmilch wurde für zwei Stunden
bei 99 °C inkubiert, s1 -Casein isoliert und verdaut mit GluC. Nach HPLCFraktionierung bzw. ZipTip-Aufreinigung wurden die Proben getrocknet
und mittels MADLI-TOF-MS vermessen.
a
63
2.9 Diskussion
Ein Ziel dieser Arbeit war die Erstellung einer Methode, die den positionsspezifischen
Nachweis von Modifikationen des s1 -Caseins erlaubt. Dieses Ziel wurde mit der in
diesem Kapitel vorgestellten Vorgehensweise erreicht. Die partielle enzymatische Hydrolyse des Proteins und die anschließende massenspektrometrische Vermessung der
Peptide erlauben den Nachweis von Modifikationen, wobei zusätzlich die Modifikationsstelle angegeben oder zumindest eingegrenzt werden kann. Wie sich im Rahmen
der Methodenentwicklung zeigte, führt eine Auftrennung der Peptidmischung mittels
HPLC zu deutlich besseren Ergebnissen; durch eine Verbesserung der Spektrenqualität konnte die Zahl der nachweisbaren Modifikationen wesentlich erhöht werden. Eine
Trennung der Milchproteine an der HPLC wurde ebenfalls etabliert. Unter Einsatz dieser Methode wurde zunächst ergebnisoffen nach allen vorkommenden Modifikationen
gesucht.
Als Hauptmodifikationen von s1 -Casein wurden dabei das Amadoriprodukt, CML
und die Oxidation von Methionin identifiziert, eine Tryptophanoxidation ist zusätzlich
möglich (sie wurde nachgewiesen mittels LC-MS/MS, s. Kap. 4.3.2). Außerdem konnten einzelne Peptide nachgewiesen werden, die mehrfach modifiziert waren. Im Gegensatz dazu waren Argininmodifikationen, CEL und der Lysinaldehyd trotz ausführlicher
Suche hier nicht nachweisbar; vermutlich lagen deren Konzentrationen unterhalb der
Nachweisgrenze. Ebenso wäre auch eine zweifache CML-Modifikation eines Peptids
denkbar, die aber ebenfalls nicht nachgewiesen werden konnte. Modifiziertes Cystein
kann hier nicht auftreten, da s1 -Casein und -Casein keinen Cysteinrest enthalten.
Neben der ausführlichen Anwendung auf s1 -Casein (s. Kap. 3) wurde die Methode auch für die Analytik von -Casein und -Lactalbumin herangezogen. Besonders
bei -Casein ergab sich allerdings als Problem, dass eine Erhitzung des Proteins in
Modellmischungen zur Präzipitation führt, bevor Modifikationen in größerem Umfang
gebildet werden. Daher kam hier nur eine Untersuchung von erhitzten Milchproben in
Betracht. Die in diesem Fall erforderliche Proteintrennung wurde mittels Gelelektrophorese erreicht und führte zum Nachweis des Amadoriprodukts von Peptid 1581 sowie
der Oxidationen der Peptide 1581 und 976. Aus den Aminosäuresequenzen der beiden
Peptide ergibt sich, dass hier Lys113 sowie Met109 und Met93 modifiziert vorliegen.
Die Lactosylierung von Lys113 wurde in der Literatur bereits beschrieben [45], ebenso
konnten Meyer et al. eine oxidative Schädigung von -Casein nachweisen, sowohl in erhitzter Rohmilch als auch in verschiedenen Handelsproben [63]. Darüber hinaus wurde
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b
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a
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64
2.9. Diskussion
a
Tab. 2.8: Nachgewiesene Modifikationen von -Lactalbumin.
Ox: Oxidation, CML: Carboxymethyllysin, AP: Amadoriprodukt
Mod.
Ox
CML
AP
Peptid
2188
2059
1177
1034
2188
2059
1622
1252
522
2188
2059
1622
1252
1177
522
Position
97-115
46-62
87-96
116-123
97-115
46-62
01-13
01-10
78-81
97-115
46-62
01-13
01-10
87-96
78-81
Sequenz
DKVGINYWLAHKALCSEKL
DSTEYGLFQINNKIWCK
DDIMCVKKIL
DQWLCEKL
DKVGINYWLAHKALCSEKL
DSTEYGLFQINNKIWCK
EQLTKCEVFRELK
EQLTKCEVFR
DKFL
DKVGINYWLAHKALCSEKL
DSTEYGLFQINNKIWCK
EQLTKCEVFRELK
EQLTKCEVFR
DDIMCVKKIL
DKFL
modifizierte Aminosäure
Trp104 / Cys111
Trp60 / Cys61
Met90 / Cys91
Trp118 / Cys120
Lys98 / Lys108 / Lys114
Lys58 / Lys62
N-Term. / Lys5 / Lys13
N-Term. / Lys5
Lys79
Lys98 / Lys108 / Lys114
Lys58 / Lys62
N-Term. / Lys5
Lys93 / Lys94
Lys79
b
bereits CML in -Casein nachgewiesen [35]. Alternativ zu der gelelektrophoretischen
Trennung der Milchproteine kann diese Proteintrennung auch mittels HPLC erfolgen.
Wie die Untersuchung von s1 -Casein gezeigt hat, könnte so der Nachweis weiterer Modifikationen mit der vorliegenden Methode ermöglicht werden; hier sind noch weiter
gehende Untersuchungen erforderlich. Der Vorteil der HPLC-Methode ist, dass der bei
der gelelektrophoretischen Trennung eingesetzte In-Gel-Verdau und die anschließende
Extraktion der Peptide aus dem Gel zu Verlusten führen; beide Schritte werden bei
einer HPLC-Proteintrennung nicht durchgeführt.
Auch die Untersuchung von -Lactalbumin aus hitzebehandelten Milchproben ist mit
der etablierten Methode möglich, konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit aus Zeitgründen nicht durchgeführt werden. Allerdings gelang bei -Lactalbumin die Vermessung
von im Milchmodellsystem erhitzten Proben. Dabei wurden die in Tab. 2.8 genannten
Modifikationen nachgewiesen. Da -Lactalbumin acht Cysteinreste enthält und vier Disulfidbrücken ausbildet, wurden die entsprechenden Proben vor der Untersuchung mit
DTT reduziert. Durch diese Spaltung der Disulfidbindungen wurde verhindert, dass
einzelne Peptide über Disulfidbrücken miteinander verbunden bleiben und somit möglicherweise analytisch nicht erfasst werden. Bei den Peptiden 1252 und 1622 besteht
die Möglichkeit, dass der hier enthaltene N-Terminus von -Lactalbumin statt eines
Lysinrests modifiziert ist. Marvin et al. haben bei -Lactalbumin Lactosylierungen der
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65
Lysinreste 5, 13, 94, 108 und 122 nachgewiesen, nachdem ein Kindernährmittel mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und der entsprechende Spot mit Trypsin verdaut und mittels nano-ESI-MS/MS vermessen wurde [49]. Auch Carulli et al. haben
Amadoriprodukte an Lys5/Lys13, Lys58/Lys62, Lys98/Lys108 und Lys122 detektiert.
Des Weiteren konnten eine Oxidation des Peptids 1034 und eine CML-Modifikation
von Peptid 1622 nachgewiesen werden [64]. Als Probe wurde dabei im Milchmodellsystem mit Lactose erhitztes -Lactalbumin nach Verdau mit AspN mittels MALDITOF-MS in ClCCA vermessen. Als zusätzliche Modifikationen führen Arena et al.
Lactosylierungen von Lys16, Lys58, Lys62, Lys79, Lys93, Lys98 und Lys114 auf, wobei hier die Proteine eines Kindernährmittels tryptisch verdaut wurden, anschließend
an Aminophenylboronsäure-Säulen aufgereinigt und mittels LC-ESI-LIT-MS/MS vermessen wurden [59]. Zusätzlich konnte hier die Oxidation von Met90 gemessen werden. Meltretter et al. schließlich konnten neben der Oxidation des Peptids 1034 auch
die der Peptide 2188 (entspricht Trp104/Cys111) und 2517 (Trp26/Cys28) feststellen,
ebenso die CML-Modifikation und das Amadoriprodukt der Peptide 1252 (entspricht
Lys5) und 1622 (Lys5/Lys13). Hier wurde ebenfalls im Milchmodellsystem mit Lactose
erhitztes -Lactalbumin vermessen [19]. Damit stehen die in Tab. 2.8 genannten Lactosylierungsstellen in guter Übereinstimmung mit der Literatur; CML könnte durch
den Abbau dieser Amadoriprodukte gebildet werden. Ebenso sind die meisten der hier
detektierten Oxidationen in der Literatur beschrieben; die dort erwähnte LysinaldehydBildung konnte jedoch nicht beobachtet werden. Unterschiede zwischen den Literaturdaten und den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit können beispielsweise durch unterschiedliche Proben (Milchproben und Erhitzungen im Modellsystem), abweichende
Probenaufarbeitungen und unterschiedliche Ionisierungstechniken erklärt werden.
Bei der gelelektrophoretischen Trennung der Caseine zeigte sich eine Anomalie. Das
schwerere -Casein (23.903 Da) legte eine längere Strecke im Gel zurück als s1 -Casein,
das mit 23.615 Da das leichtere der beiden Proteine ist. Der Grund für die ungewöhnlich
geringe Wanderungsgeschwindigkeit von s1 -Casein scheint zu sein, dass der s1 -CaseinSDS-Komplex größer ist als erwartet, denn die Anzahl der pro Proteinmolekül gebundenen SDS-Moleküle und damit auch die Nettoladung liegen im üblichen Rahmen. Eine
mögliche Erklärung ist, dass in bestimmten Abschnitten des Proteins viele negative
Ladungen lokalisiert sind, die sich in Gegenwart von SDS gegenseitig abstoßen und so
den Raumbedarf erhöhen. [65]
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b
a
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66
a
2.9. Diskussion
Zentrales Element dieser Methode ist der Verdau der untersuchten Proteine. Im
theoretischen Verdau wurden alle in PeptideMass (s. Kap. 5.6.2) und mMass (s. Kap.
5.6.4) hinterlegten Enzyme auf ihre Eignung überprüft. Dabei ergaben sich die besten Resultate bei GluC, Chymotrypsin, Trypsin und AspN. Der praktische Verdau
von -Casein mit Chymotrypsin lieferte zwar Peptide, jedoch konnte keine sichere Zuordnung von Aminosäuresequenzen erfolgen, da keine spezifischen Schnittstellen des
Enzyms abgeleitet werden konnten (vgl. Kap. 2.3.2). Für Trypsin ist bekannt, dass
es in vielen Fällen Peptidbindungen nach modifizierten Lysinresten nicht hydrolysiert.
Ein Einsatz von Trypsin hätte also die Untersuchung von 1 MC-Peptiden erfordert, die
aber größer sind als die korrespondierenden 0 MC-Peptide. Große Peptide führten jedoch zu einem schlechteren Signal/Rausch-Verhältnis als kleine Peptide; zudem nimmt
die Wahrscheinlichkeit zu, dass mehrere Lysine im gleichen Peptid enthalten sind. Die
hier etablierte Methode ist positionsspezifisch; allerdings können nur Modifikationsstellen differenziert werden, die sich in unterschiedlichen Peptiden befinden. Enthält ein
Peptid mehrere mögliche Modifikationsstellen, kann mittels MALDI-TOF-MS nicht
bestimmt werden, welcher Aminosäurerest im Peptid modifiziert ist.
Die Endoproteinase GluC hingegen weist einen großen Vorteil auf: Beim Verdau von
Phosphoproteinen wie s1 -Casein und -Casein werden phosphorylierte Peptide gebildet. Neben der Veränderung der Peptidmasse durch Phosphatreste können diese auch
die Ionisation verschlechtern. Dem könnte beispielsweise durch enzymatische Dephosphorylierung begegnet werden. Beim Verdau dieser beiden Proteine mit GluC sind aber
alle phosphorylierten Seitenketten in wenigen Peptiden konzentriert, die hier nicht relevant sind. Grund dafür ist, dass diese Peptide weder Lysin oder Arginin noch Tryptophan oder Methionin enthalten und daher vermutlich nicht modifiziert vorliegen;
nur das Phosphopeptid 462 aus s1 -Casein enthält zwar Lysin, konnte jedoch nicht
erfasst werden, da seine Masse mit unter 500 Da im Bereich des durch die Matrix
hervorgerufenen Grundrauschens liegt. Die geringe Sequenzabdeckung beim Trypsinverdau (vgl. Abb. 2.3) erklärt sich neben der Bildung eines Peptids mit einer Masse
von über 4.700 Da (vgl. Kap. 2.3.1) damit, dass drei Peptide mit Massen von 1.580 Da
bis 2.321 Da phosphoryliert sind und nicht detektiert werden konnten.
Beim theoretischen Verdau von -Casein mit GluC zeigt sich unabhängig vom eingesetzten Puffer, dass ein sehr großes Peptid gebildet wird, das alle Lysinreste enthält.
Eine Identifikation von Modifikationsstellen könnte somit nicht erfolgen. Bei Verdau
mit AspN liegt ein Lysinrest, mit Trypsin liegen vier Lysinreste in Peptiden mit Massen
unter 3.300 Da vor (vgl. Kap. 2.3.1). -Casein enthält jedoch insgesamt 9 Lysinreste,
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67
sodass ihre Mehrheit mit 0 MC-Peptiden nicht erfasst werden würde. Somit ist bei
-Casein eine andere Herangehensweise erforderlich, beispielsweise über LC-MS/MS.
Wurde das Hydrolysat der Caseine direkt mittels MALDI-TOF-MS vermessen, so
ergaben sich sehr komplexe Spektren. Es traten diverse Peptidpeaks auf, zusätzlich
Signale von Natrium- und Kaliumaddukten sowie gegebenenfalls von mehreren Modifikationen pro Peptid. Die Bildung von Natrium- und Kaliumaddukten ist auch in
der Literatur beschrieben [66]. Diese hohe Komplexität der Spektren erschwerte deren
Auswertung und verhinderte die genaue Bestimmung einiger Modifikationen. Um dies
zu vermeiden, wurde in einem ersten Schritt eine HPLC-Trennung des Peptidgemisches etabliert; Fraktionen wurden getrennt aufgefangen und mittels MALDI-TOF-MS
vermessen.
Ausgangspunkt für die Peptidtrennung an der HPLC war eine Publikation von Scaloni et al. Dort wurde eine C18-Trennsäule eingesetzt, Fließmittelkomponenten waren
Acetonitril und 0,1 % TFA. Bei einem Fluss von 0,2 ml/min wurde ein linearer Gradient von 5 % bis 60 % Acetonitril in 60 min programmiert [45]. Durch Einsatz von
Acetonitril mit 0,1 % TFA konnte das Absinken der Grundlinie verhindert werden. Als
Säule wurde eine Zorbax Eclipse XDB-C8 (Agilent) eingesetzt. XDB steht für „eXtra Densely Bonded and Doubled Endcapped“; das ist eine robuste Säule, die auch
laut Herstellerangaben bei pH 2 (dem pH-Wert der wässrigen Fließmittelkomponente)
noch gute Resultate liefert. Nach Optimierung des Gradienten konnte hier eine gute
Trennung der beim Verdau der Caseine gebildeten Peptide erreicht werden; zu einer
deutlichen Abtrennung der modifizierten Peptide vom jeweiligen nativen Peptid kam es
interessanterweise nicht. Basierend auf diesem Gradienten wurde auch ein Gradient für
die Peptide aus dem Verdau von -Lactalbumin erstellt, wobei Säule und Fließmittel
beibehalten wurden.
Weiterhin wurde eine Trennung der Milchproteine etabliert. Dafür wurde eine Zorbax 300SB-C8-Säule (Agilent) eingesetzt, die durch die hohe Porengröße von 300 Å
besonders für Proteintrennungen geeignet ist. Vorlage für diese Trennung war eine
Veröffentlichung von Bonfatti et al. [62], aus der Fließmittel, Säulentyp und Probenvorbereitung (nach [61]) übernommen wurden; der Gradient wurde durch minimale
Veränderungen angepasst. Bonfatti et al. haben die Methode zur Trennung und Quantifizierung der genetischen Varianten der Milchproteine eingesetzt. Die Retentionszeiten
von s1 -Casein, -Casein, -Lactalbumin und -Lactoglobulin aus der vorliegenden Arbeit stimmen sehr gut mit denen von Bonfatti et al. überein, was die Identifikation der
Peaks zusätzlich absichert. Der kleine Peak bei etwa 10 Minuten im -Casein-Standard-
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68
2.9. Diskussion
k
Lauf (vgl. Abb. 2.16) kann als -Casein bestätigt werden, da auch in der genannten
Publikation eine ähnliche Retentionszeit gemessen wurde. s2 -Casein ist dort nach etwa 12 Minuten eluiert, entspricht also hier vermutlich dem Peak nach -Casein in
der UHT-Milch-Probe. Der Doppelpeak von -Casein könnte möglicherweise auf zwei
unterschiedliche genetische Varianten zurückzuführen sein, ebenso entsprechen die beiden -Lactoglobulinpeaks den genetischen Varianten A und B (wie MALDI-TOF-MSMessungen zeigten). Ebenfalls zu erkennen sind Verunreinigungen in den kommerziell
erhältlichen Standards. Der -Casein-Standard weist neben s1 -Casein eine zusätzliche
Komponente auf, vermutlich s2 -Casein. Im -Lactalbumin-Standard sind Verunreinigungen zu sehen, die -Casein sein könnten, ebenso scheint im -Casein-Standard eine
-Lactoglobulinfraktion enthalten zu sein.
Die Proteintrennung hat die nachfolgende Peptidtrennung des s1 -Casein-Hydrolysates nicht beeinflusst; insbesondere gelten das in Abb. 2.14 gezeigte Chromatogramm
und die für die Sequenzabdeckung angegebenen Werte auch für Messungen nach beiden
HPLC-Aufreinigungsschritten.
Die Identifikation des Modifikationstyps erfolgte hier über den Massenunterschied
zwischen dem nativen und dem modifizierten Peptid. Hierbei handelt es sich jedoch
um keinen absolut sicheren Beweis, dass eine angenommene Modifikation auch tatsächlich vorliegt. Eine solche Absicherung kann über LC-MS/MS-Experimente erfolgen, was
teilweise, wie in Kap. 4 beschrieben, durchgeführt wurde. Allerdings ist auch bei den
MALDI-TOF-MS-Experimenten die Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit dieser Zuordnung sehr hoch. Indizien dafür sind zum einen, dass diese Massendifferenzen nur bei
lysinhaltigen beziehungsweise methionin- oder tryptophanhaltigen Peptiden beobachtet wurden. Zum anderen nahm die Signalintensität dieser Modifikationen mit zunehmender Erhitzung zu. Auch dieser Effekt ist nur durch die Bildung von Modifikationen
zu erklären; die Intensität eventueller Störpeaks wäre von der Erhitzung unabhängig. Analoges gilt ebenso für die Peptidpeaks. Ein Peak bei einer bestimmten Masse
muss nicht unbedingt eines der erwarteten Peptide abbilden. Für einige Peptide konnte
dies im Rahmen der LC-MS/MS-Experimente jedoch nachgewiesen werden. Darüber
hinaus sind die am häufigsten in Milch auftretenden Proteine bekannt, ebenso deren
Primärstruktur und die eingesetzte Endoproteinase inklusive ihrer Spezifität. Wenn
also genau an den aus diesen Daten theoretisch berechneten Massen Ionen nachgewiesen werden, so ist die Wahrscheinlichkeit, dass es sich tatsächlich um die vermuteten
Peptide handelt, extrem groß. Das Auftreten erwarteter Modifikationen dieser Peptide
sichert deren Identität zusätzlich ab.
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69
In den MALDI-TOF-Spektren wiesen manche Signale, die eine Modifikation repräsentieren, nur geringe Signalintensitäten auf. Das war besonders bei CML-Modifikationen in nur geringfügig erhitzten Proben zu beobachten. Daher musste festgelegt werden,
ab welchem Signal-Rausch-Verhältnis ein Peak im Spektrum als Signal gewertet wird.
Das Grundrauschen in den Massenspektren lag auf einem sehr einheitlichen Niveau.
Um Modifikationen möglichst empfindlich nachweisen zu können, wurde jeder Peak, der
inklusive seines Isotopenmusters oberhalb des Grundrauschens lag, als Signal gewertet.
70
3 Positionsspezifischer Nachweis
und relative Quantifizierung
der Hauptmodifikationen
des as1-Caseins
3.1 Einleitung
a
Im folgenden Kapitel wird s1 -Casein genauer untersucht. Zunächst werden verschiedene Modifikationen dieses Proteins positionsspezifisch nachgewiesen, wobei inkubiertes
Standardprotein, hitzeinkubierte Rohmilch und einige Handelsproben vermessen werden. Den zweiten Teil bilden die relative Quantifizierung der wichtigsten Modifikationen
und die Erstellung von Reaktionskinetiken.
3.2 Bedeutung der Laserenergie
Bei der MALDI-TOF-MS-Messung stellt die Energie des Lasers eine wichtige Variable
dar. Die Peaks gering konzentrierter Analyten werden nur mit relativ hoher Energie detektierbar. Allerdings ist dann das Isotopenmuster von Analyten, die in großer
Konzentration vorliegen, nicht mehr aufgelöst; es kann sogar dazu kommen, dass es gar
nicht mehr erkennbar ist. Bei geringerer Laserenergie ist das Isotopenmuster der Hauptbestandteile einer Probe gut aufgelöst, jedoch können Minorkomponenten nicht mehr
nachgewiesen werden, weil sich ihre Peaks nicht mehr vom Grundrauschen abheben.
Im vorliegenden Fall wiesen die Peaks der unmodifizierten Peptide eine hohe Intensität auf, sodass eine geringe Laserenergie notwendig war. Jedoch lagen gerade CMLModifikationen häufig in geringer Konzentration vor und erforderten höhere Laserenergien. Daraus ergab sich die Notwendigkeit, eine Probe mehrfach mit verschiedenen
71
3. Positionsspezifischer Nachweis und relative Quantifizierung
Laserenergien zu vermessen; einmal optimiert auf das native, anschließend auf das modifizierte Peptid.
Bei der relativen Quantifizierung zeigte sich, dass das Isotopenmuster des nativen
Peptids komplett aufgelöst sein musste, damit reproduzierbare Ergebnisse erhalten
wurden. Grund dafür ist, dass hier die Intensität des monoisotopischen Peaks ausgewertet wurde. Mit zunehmender Laserenergie nahm die Signalintensität des Peaks
des modifizierten Peptids zu; daher musste auch die des Peaks des nativen Peptids
im gleichen Maße steigen. Wie die Messwerte zeigten, war das auch der Fall (s. Kap.
3.6.3); allerdings nur, solange das Isotopenmuster des nativen Peptids komplett aufgelöst war. Anderenfalls kommt es zur Peakverbreiterung, wodurch sich die Intensität
nicht mehr ändert und die Modifikationsrate überschätzt würde. Daher wurde hier darauf geachtet, dass bei der relativen Quantifizierung das Isotopenmuster aller Peaks der
unmodifizierten Peptide komplett aufgelöst war.
Einige Modifikationen konnten dann jedoch nicht mehr nachgewiesen werden. Ihr
Gehalt war damit zu klein für eine relative Quantifizierung nach der hier beschriebenen Methode. Sie waren dennoch nachweisbar (mit höherer Laserenergie), aber nicht
quantifizierbar; ihre Konzentration lag also oberhalb der Nachweisgrenze, aber unterhalb der Bestimmungsgrenze. Das Kap. 3.5 befasst sich mit dem positionsspezifischen
Nachweis aller detektierten Modifikationen, Kap. 3.6 mit der relativen Quantifizierung
der Hauptmodifikationen.
3.3 Veränderung der HPLC-Chromatogramme bei
stark hitzebehandelten Milchproben
Bei der Untersuchung von Milchproben, die verschieden stark thermisch behandelt
worden waren, ergaben sich einige Veränderungen der HPLC-Chromatogramme. Insbesondere die Chromatogramme der Protein-Trennung zeigten breiter werdende Peaks,
je länger die Probe hitzebehandelt wurde. Interessanterweise kam es hier im Wesentlichen zu Fronting, also zu leicht unsymmetrischen, relativ flach ansteigenden Peaks.
Durch die Peakverbreiterung kam es auch zur Abnahme der Peakhöhen. Wie eine
grafische Auswertung bestätigte, nahmen beide Effekte mit der Erhitzungsdauer zu.
In Abb. 3.1 sind die Retentionszeiten und Peakhöhen von s1 -Casein-Peaks nach Erhitzung von entfetteter Rohmilch bei 60 °C angegeben. Sehr ähnliche Kurvenverläufe
ergaben sich sowohl für -Casein als auch für beide Proteine nach Erhitzung bei 99 °C.
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b
72
3.3. Veränderung der HPLC-Chromatogramme bei stark hitzebehandelten Milchproben
Abb. 3.1: Abhängigkeit von Retentionszeit und Peakhöhe des
Erhitzungszeit
as1-Casein-Peaks von der
a
Zum Vergleich sind auch Retentionszeiten und Peakhöhen der Peaks von s1 -Casein aus
Sterilmilch und UHT-Milch eingetragen. Eine mögliche Erklärung für das Fronting sind
Abbauprodukte der Proteine. Diese könnten nach Reaktionen mit Zuckern hydrophiler
oder durch Bindungsspaltungen kleiner als das native Protein sein und daher früher
als dieses eluieren. Um sicher keine hier zu untersuchende Modifikation zu verwerfen, wurde bei den stark erhitzten Proben das Zeitfenster für die s1 -Casein-Isolierung
auf 17,0 - 24,3 Minuten ausgedehnt; eine Abtrennung von -Casein konnte trotzdem erreicht werden. Die Verbreiterung der Peaks sorgte dafür, dass trotz der stark sinkenden Peakhöhen die Flächen und damit die Proteinmengen nur geringfügig abnahmen:
Die Fläche des s1 -Casein-Peaks aus Rohmilch und mäßig erhitzten Proben hat etwa
51 Flächeneinheiten (FE), die der für 7 Tage inkubierten Proben noch ca. 47 FE, die
der 14 Tage bei 60 °C inkubierten Probe noch 38 FE betragen. Zum Vergleich ergaben
sich bei Sterilmilch Flächen von etwa 36 FE, bei UHT-Milch ca. 49 FE.
Bei der Trennung der Peptide des s1 -Casein-Hydrolysates zeigte sich erwartungsgemäß keine Veränderung der Retentionszeiten und keine Peakverbreiterung. Jedoch
sanken die Peakhöhen mit längerer Hitzebehandlung der Milchproben leicht ab. Unabhängig davon waren die in den einzelnen Fraktionen enthaltenen Peptidmengen für die
MALDI-TOF-MS-Messung mehr als ausreichend.
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73
3.4 Probenaufarbeitung
Mit der im Rahmen dieser Arbeit etablierten Methode, die ab Kap. 5.14.1 genau dargestellt ist, wurden diverse Milchproben vermessen: Inkubierter -Casein-Standard, bei
60 °C und bei 99 °C hitzeinkubierte Rohmilch sowie Rohmilch, UHT-Milch, Sterilmilch
und insbesondere Kindermilchnahrungen. Letztere stellen für kleine Kinder die Hauptnahrungsquelle dar; daher ist hier die Modifikation der essentiellen Aminosäure Lysin
von besonderer Bedeutung.
a
3.4.1 Untersuchte Standardproben
a
14 Tage mit und ohne Lactose bei 60 °C inkubierter -Casein-Standard sowie zur Kontrolle der nicht inkubierte Standard (s. Kap. 5.9) wurden wie unter Kap. 5.14.1ff beschrieben aufgearbeitet und vermessen.
3.4.2 Vermessung der bei 60 °C inkubierten Rohmilch
Zur Erstellung einer positionsspezifischen Kinetik der Modifizierungen während der Erhitzung wurde entfettete Rohmilch zunächst bei 60 °C inkubiert (s. Kap. 5.9.4). Es wurde pro Inkubationszeit (0, 1, 4, 7 und 14 Tage) in drei HPLC-Läufen s1 -Casein isoliert
und die Fraktionen jeweils vereinigt. Das Protein wurde verdaut und die Peptidmischung dreimal mittels HPLC fraktioniert; diese drei Serien von Fraktionen wurden
getrennt vermessen und qualitativ und quantitativ ausgewertet.
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3.4.3 Vermessung der bei 99 °C inkubierten Rohmilch
Entfettete Rohmilch wurde wie in Kap. 5.9.5 beschrieben bei 99 °C inkubiert. Die für 20
Minuten, 1, 2, 5 und 10 Stunden inkubierten Proben wurden aufgearbeitet; es wurde
auch hier isoliertes s1 -Casein aus drei Protein-HPLC-Läufen vereinigt, verdaut und
dreimal mittels Peptid-HPLC fraktioniert. Die Fraktionen wurden getrennt vermessen,
um noch einmal die sich ergebenden Abweichungen bei der relativen Quantifizierung
analoger Ansätze zu untersuchen. Da die Inkubation bei 60 °C genauso aufgearbeitet
wurde, wurde ein Vergleich beider Messreihen ermöglicht.
Zusätzlich wurde eine unabhängige Dreifachbestimmung der Inkubation von Rohmilch bei 99 °C durchgeführt. Die Aufarbeitung erfolgte wie oben erwähnt, jedoch
wurden die das s1 -Casein enthaltenden Fraktionen aus den drei HPLC-Läufen zur
a
a
74
3.4. Probenaufarbeitung
Proteinisolierung (abweichend von Kap. 5.14.2) nicht vereinigt, sondern getrennt verdaut (je 75 µl Phosphatpuffer und 0,7 µl GluC) und je einmal an der Peptid-HPLC
fraktioniert. Durch die getrennte Messung und Auswertung der drei Fraktionen pro Inkubationszeit konnten inklusive der Erhitzung komplett unabhängige, jeweils dreifach
bestimmte Proben erhalten werden.
3.4.4 Aufarbeitung von Rohmilch, UHT-Milch und Sterilmilch
Es wurden insgesamt zwei Rohmilchproben, drei UHT- und drei Sterilmilchproben
untersucht. Die Rohmilchproben wurden an verschiedenen Tagen bei einem lokalen
Bauernhof direkt nach dem morgendlichen Melken abgeholt. Bei den UHT-Milchproben
handelte es sich zweimal um „haltbare Alpenmilch“ verschiedener Hersteller mit 3,5 %
bzw. 3,8 % Fett und um eine „H-Vollmilch“ mit 3,5 % Fett. Alle waren UHT-erhitzt
und homogenisiert. Die Sterilmilchproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten im
Internet bestellt; sie enthielten neben 1,5 % Fett mit nur 3,0 g Eiweiß pro 100 ml laut
Herstellerangabe etwas weniger Protein als die übrigen Proben.
Diese Proben wurden wie in Kap. 5.5.1 beschrieben entfettet und anschließend vermessen (s. Kap. 5.14.1ff). Allerdings war hier nicht die Analyse einzelner Proben das
Ziel, sondern die Erstellung einer Übersicht über die unterschiedlichen Produkttypen.
Daher wurde aus jeder Milchprobe einmal s1 -Casein isoliert, dieses nach dem Lyophyllisieren verdaut (gelöst in 75 µl Phosphatpuffer mit 0,7 µl GluC) und einmal mittels
Peptid-HPLC fraktioniert. Daher liegen die Daten für den Typ Rohmilchprobe im
Doppelansatz, für UHT- und Sterilmilchproben jeweils im Dreifachansatz vor.
a
3.4.5 Untersuchung von Kindermilchnahrungen
Es wurden sechs verschiedene Kindermilchnahrungen untersucht (s. Tab. 3.1). Sofern
diese pulverförmig waren, wurden sie zuerst nach den Angaben des Herstellers in Wasser
gelöst; anschließend wurden alle Proben entfettet (s. Kap. 5.5.1). Die weitere Aufarbeitung erfolgte nach der genannten Methode; isoliertes s1 -Casein aus drei ProteinHPLC-Läufen wurde vereinigt, verdaut und dreimal mittels Peptid-HPLC fraktioniert.
Die drei Serien von Fraktionen wurden getrennt mittels MALDI-TOF-MS vermessen.
Die Kindernährmittel enthielten laut Herstellerangabe auf der Verpackung deutlich weniger Protein als die bisherigen Milchproben. Um dies auszugleichen, wurde
der Proteingehalt der Kindermilchproben vor der Isolierung von s1 -Casein dem Niveau der anderen Proben angeglichen. Dazu wurde ein Verdünnungsschritt während
a
a
75
Tab. 3.1: Charakteristika der untersuchten Kindermilchproben.
AM: Anfangsmilch, FM: Folgemilch
Nährmilchprobe
1
Produktart
AM
Form
Pulver
Eiweißgehalt
1,3
in g/100 ml
2
FM
flüssig
3
AM
Pulver
4
FM
Pulver
5
AM
flüssig
6
FM
flüssig
1,5
1,5
1,5
1,4
1,9
der Probenaufarbeitung dem angegebenen Proteingehalt angepasst (vgl. Kap. 5.14.1).
Es erfolgte hier keine Standardisierung auf s1 -Casein, sondern auf den Gesamtproteingehalt. Der s1 -Casein-Gehalt der Kindermilchproben war den Verpackungen nicht
zu entnehmen und hätte daher erst quantifiziert werden müssen; wie sich zeigte, ergab
aber auch die Standardisierung auf den Proteingehalt Chromatogramme, die mit denen
von Rohmilch vergleichbar waren, die 7 Tage bei 60 °C bzw. 2 Stunden bei 99 °C erhitzt
worden war. Der Fettgehalt der Kindernährmittel lag mit 2,7 g bis 3,5 g Fett/100 ml im
milchtypischen Bereich, der Kohlenhydratanteil (mind. 7,3 g Kohlenhydrate in 100 ml)
war höher als der in Kuhmilch, da er, ebenso wie der Proteingehalt, vom Hersteller an
den Gehalt von Muttermilch angepasst worden war [2].
a
a
3.5 Positionsspezifischer Nachweis von
Modifikationen des
as1-Caseins
a
Der Vorteil an der Vermessung von verdautem s1 -Casein liegt darin, dass so die Position der Modifikation im Protein bestimmt werden kann. Anhand von modifizierten
Peptiden, die nur einen Lysinrest bzw. nur eine oxidationsanfällige Aminosäure enthalten, kann genau bestimmt werden, welcher Aminosäurerest des Proteins modifiziert
ist. Enthält ein Peptid mehre mögliche Modifikationsstellen, so kann zwischen diesen
nicht unterschieden werden; allerdings kann die Position der Modifikation auf den entsprechenden Proteinabschnitt eingegrenzt werden. Abb. 3.2 zeigt beispielhaft einige
MALDI-TOF-MS-Spektren, die die positionsspezifischen Nachweise der verschiedenen
Modifikationen erbrachten. Tab. 3.2 gibt einen Überblick über alle nachgewiesenen
Modifikationen, Abb. 3.3 zeigt, in welcher Milchprobe welche Modifikation an welchem
Peptid nachweisbar war. Zusätzlich konnte die einfache Oxidation der Peptide 876, 900
und 1778 sowie die zweifache Oxidation der Peptide 876 und 900 sowohl in Rohmilch,
UHT- und Sterilmilch, als auch in den Kindernährmitteln nachgewiesen werden.
76
3.5. Positionsspezifischer Nachweis von Modifikationen des as1 -Caseins
Abb. 3.2: MALDI-TOF-MS-Spektren zum Nachweis von Modifikationen der
Peptide 2120, 1778, 1756, 1664, 1049, 910, 900 und 876
77
Tab. 3.2: In Milchproben nachgewiesene Modifikationen des
Massen in Da
Peptid Sequenz / Modifikation
Masse
2120 RPKHPIKHQGLPQEVLNE
- CML
2178
- Amadoriprodukt
2444
- zweifaches Amadoriprodukt
2768
1778
Position
GIHAQQKEPMIGVNQE
- Oxidation
- Amadoriprodukt
1794
2102
QLLRLKKYKVPQLE
- CML
- Amadoriprodukt
1814 Lys102 / Lys103 / Lys105
2080 Lys102 / Lys103 / Lys105
2404 Lys102 / Lys103 / Lys105
RPKHPIKHQGLPQE
- CML
- Amadoriprodukt
1722
1988
2312
VFGKEKVNE
- Amadoriprodukt
1373
Lys34 / Lys36
QKHIQKE
- CML
- Amadoriprodukt
968
1234
1558
Lys79 / Lys83
Lys79 / Lys83
Lys79+Lys83
RLHSMKE
- Oxidation
- zweifache Oxidation
- Amadoriprodukt
916
932
1224
Met123
Met123
Lys124
876 KTTMPLW
- Oxidation
- zweifache Oxidation
- Amadoriprodukt
892
908
1200
Met196 / Trp199
Met196 / Trp199
Lys193
1756
1664
1049
910
900
78
as1-Caseins.
Met135
Lys132
3.5. Positionsspezifischer Nachweis von Modifikationen des as1 -Caseins
Abb. 3.3: Darstellung der in verschiedenen Milchproben nachgewiesenen
Modifikationen des s1 -Caseins in der Proteinsequenz
und Vergleich mit Publikationen von Scaloni et al. [45],
Arena et al. [59] und Marvin et al. [49] (vgl. Kap. 3.7)
a
79
a
Tab. 3.3: In inkubierten Milchproben nachgewiesene Modifikationen von s1 -Casein.
-Casein-Standard wurde mit Lactose versetzt, anschließend gar nicht bzw.
14 Tage bei 60 °C inkubiert. Aufarbeitung siehe Text
a
In Tab. 3.3 ist dargestellt, welche Modifikationen durch die Inkubation von Rohmilch und des -Casein-Standards nachweisbar wurden. In den Rohmilchproben konnte jeweils die Oxidation der Peptide 876, 900 und 1778 gezeigt werden, ebenso die
zweifache Oxidation der beiden erstgenannten Peptide und das Amadoriprodukt von
drei weiteren Peptiden. Weitere einfache und zweifache Lactosylierungen sowie CMLModifikationen wurden nach bestimmten Erhitzungszeiten nachweisbar. Die gleiche
Tendenz gilt für die inkubierten Standard-Proben. Auch in der ohne Lactose für 14 Tage erhitzten Standard-Kontrolle wurden Modifikationen detektiert; Grund hierfür sind
bereits im Standard vorliegende modifizierte Peptide. Im Einzelnen waren in dieser
Probe die drei oben genannten Oxidationen und beide zweifache Oxidationen nachweisbar, darüber hinaus Lactosylierungen der Peptide 1664, 1756 und 2120 sowie sogar
die CML-Modifikation des Peptids 1756 als vermutliches Abbauprodukt des lactosylierten Peptids.
a
80
3.6. Relative Quantifizierung der Hauptmodifikationen des as1 -Caseins
3.6 Relative Quantifizierung der Hauptmodifikationen
des
as1-Caseins
3.6.1 Einleitung
a
Im letzten Kapitel wurden Modifikationen des s1 -Caseins qualitativ nachgewiesen. Ziel
des folgenden Abschnittes ist die struktur- und positionsspezifische relative Quantifizierung des Ausmaßes dieser Modifikationen, in Abhängigkeit einer Hitzebehandlung
der Milchproben. Wie in Kap. 3.4 erwähnt, wurden verschiedene Milchproben nach der
hier etablierten Methode aufgearbeitet. Anhand dieser Messungen wurde neben dem
qualitativen Nachweis von Modifikationen auch deren relative Quantifizierung durchgeführt. Dies erfolgte bei jeder Probe jeweils für die Modifikationen Oxidation, zweifache
Oxidation, CML sowie einfaches und zweifaches Amadoriprodukt an allen modifizierten
Positionen im Protein. Zuerst wurde die jeweilige Modifikationsrate ermittelt, anschließend wurden aus den Mehrfachbestimmungen Mittelwert und Standardabweichung berechnet.
3.6.2 Definition der Modifikationsrate
Die Modifikationsrate wurde definiert als der Anteil, den eine bestimmte Modifikation
an der Gesamtmenge eines Peptids inklusive aller seiner Modifikationen hat:
Modifikationsrate n =
Modifikation n
Peptid + alle seine Modifikationen
Hierbei handelt es sich um eine relative Quantifizierung, da die einzelnen Messwerte
nicht auf einen externen Standard bezogen werden. Die Modifikationsrate einer bestimmten Modifikation eines Peptids wurde anhand der gemessenen Signalintensitäten
(SI) der monoisotopischen Peaks aus den MALDI-TOF-Massenspektren errechnet:
Modifikationsrate n =
SI (Modifikation n )
SI (Peptid) + SI (Modifikation 1 ) + SI (Modifikation 2 ) + ...
Details zur Berechnung der Modifikationsrate finden sich in Kap. 5.15.
81
3.6.3 Abhängigkeit der Modifikationsrate von der Laserenergie
Eine wichtige Voraussetzung dafür, dass mit der hier angewandten Methode eine relative Quantifizierung durchgeführt werden kann, ist die Reproduzierbarkeit der ermittelten Modifikationsraten bei Mehrfachbestimmungen. Ob die Bestimmung der Modifikationsraten reproduzierbar ist, wurde durch die Vermessung von parallelen Serien von
Peptidfraktionen (s. bspw. Kap. 3.4.2) mittels MALDI-TOF-MS überprüft. Insbesondere müssen die Modifikationsraten von der jeweils eingestellten Laserenergie unabhängig
sein. Mit der Laserenergie nimmt zwar die Intensität der Peaks zu, allerdings muss das
im gleichen Maße bei allen Peaks geschehen.
Bei der Vermessung von Mehrfachansätzen waren stets verschiedene Laserenergien erforderlich; die Energie wurde bei jeder einzelnen Vermessung auf das jeweilige
Peptid optimiert, damit das Isotopenmuster vollständig aufgelöst war. Daher wurde
kontrolliert, ob ein Zusammenhang zwischen den verschiedenen Laserenergien und den
ermittelten Modifikationsraten existiert. Die Energie wurde während jeder Messung
mehrfach angepasst, sodass die Angabe der Laserenergie hier nicht möglich ist. Als
Maß dafür dient stattdessen die Summe der Intensitäten aller Peaks in einem Spektrum (soweit sie zu einem Peptid und dessen Modifikationen gehören). Dieser Wert
wurde bereits bei der Berechnung der Modifikationsraten ermittelt.
Abb. 3.4 zeigt den Zusammenhang zwischen Laserenergie und Modifikationsraten.
Aus den sechs untersuchten Kindermilchproben wurde getrennt s1 -Casein isoliert und
jeweils mit GluC verdaut. Jede der resultierenden Peptidmischungen wurde dreimal
mittels HPLC fraktioniert (vgl. Kap. 3.4.5). Diese drei analogen Fraktionenserien je
Milchprobe wurden mittels MALDI-TOF-MS vermessen, wobei, wie oben dargestellt,
verschiedene Laserenergien zum Einsatz kamen. Das Ergebnis dieser Vermessungen
zeigt beispielhaft für zwei lactosylierte Peptide Abb. 3.4. Die jeweilige Laserenergie ist
als prozentualer Anteil des Maximalwertes angegeben; die sechs Graphen entsprechen
den einzelnen Kindermilchproben. Es ist zu erkennen, dass mit zunehmender Energie
kein Anstieg der Modifikationsraten gemessen wurde. Es liegen in der Messung begründete Schwankungen vor, aber kein Trend. Damit besteht zwischen der Laserenergie und
der Modifikationsrate kein Zusammenhang. Es konnte gezeigt werden, dass zwar unterschiedliche Peakhöhen in den MALDI-TOF-MS-Spektren auftreten, das Verhältnis der
Signalintensität des Modifikationspeaks zur Signalintensität des Peptidpeaks jedoch
annähernd konstant ist.
a
82
Abb. 3.4: Abhängigkeit der Modifikationsrate von der Laserenergie; die sechs Graphen
je Peptid entsprechen den sechs untersuchten Kindermilchnahrungen, die je
dreimal mit unterschiedlicher Energie vermessen wurden. Erläuterungen siehe Text
a-Casein-Standard
Tab. 3.4 gibt Auskunft über die Modifikationsraten von erhitztem a-Casein-Standard.
3.6.4 Modifikationsraten von erhitztem
Eine zweifache Lactosylierung konnte in keiner der drei Proben an keinem Peptid quantitativ erfasst werden, CML nur in drei Peptiden nach vierzehntägiger Inkubation mit
Lactose, dann allerdings mit bis zu knapp 10 % Modifikationsrate. Geringe Lactosylierungsraten von unter 1 % waren bereits im nicht inkubierten Proteinstandard festzustellen; nach 14 Tagen stiegen sie auf bis zu 12,2 % an. Die Modifikationsraten der
Oxidation waren nach der Inkubation mit Lactose wesentlich größer als nach der Inkubation ohne Lactose; das könnte darauf hindeuten, dass die Inkubation selbst einen
eher geringen, die Anwesenheit von Lactose hingegen einen größeren Einfluss auf die
Oxidation einzelner Peptide hat. Die zweifache Oxidation zeigte deutlich kleinere Werte
als die einfache Oxidation und konnte hier nur an zwei Peptiden nachgewiesen werden.
3.6.5 Modifikationsraten nach Erhitzung von Rohmilch bei 60 °C
Für die relative Quantifizierung wurde die Präzision der Fraktionierung und der Messung untersucht. Mögliche Quellen für Abweichungen sind die Peptidtrennung mittels
RP-HPLC und die MALDI-TOF-MS-Messung mit Auswertung. Es zeigte sich, dass die
drei analogen Peptid-Trennungen (vgl. Kap. 3.4.2) quasi identische Chromatogramme
lieferten, also sehr gut reproduzierbar waren. Jedoch bestand die Möglichkeit, dass bei
der MALDI-TOF-MS-Messung mit nachfolgender Auswertung so große Fehler entstehen, dass eine quantitative Auswertung nicht möglich ist. Aus diesem Grund wurden
die drei analogen Serien von Peptidfraktionen getrennt vermessen und ausgewertet;
83
a
Tab. 3.4: Modifikationsraten des bei 60 °C inkubierten -Casein-Standards
d: Tage, Lac: Lactose, -: unterhalb der Bestimmungsgrenze
Modifikation
Amadoriprodukt
CML
Oxidation
zweifache
Oxidation
Peptid
Probe
0 d mit Lac
14 d ohne Lac
14 d mit Lac
0 d mit Lac
14 d ohne Lac
14 d mit Lac
0 d mit Lac
14 d ohne Lac
14 d mit Lac
0 d mit Lac
14 d ohne Lac
14 d mit Lac
876
900
910
1049
1664
1756
1778
2120
7,5 %
5,6 %
5,3 %
7,2 %
3,7 %
2,5 %
1,0 %
6,2 %
21,5 %
32,3 %
37,0 %
1,4 %
2,0 %
1,9 %
13,4 %
1,1 %
1,7 %
-
0,5 %
4,6 %
-
12,2 %
7,4 %
3,0 %
3,6 %
2,9 %
15,0 %
-
0,3 %
11,8 %
9,2 %
die resultierenden Standardabweichungen sollten zeigen, ob die relative Quantifizierung reproduzierbar ist. Deswegen wurde auf eine dreifach unabhängige Erhitzung und
Proteinisolierung verzichtet.
Es zeigte sich, dass die Standardabweichungen bei diesem Experiment eine relative
Quantifizierung zuließen, wie den Abbildungen 3.5f zu entnehmen ist. Größere Standardabweichungen ergaben sich vor allem bei relativ kleinen Modifikationsraten, da bei
kleinen Peaks in den Massenspektren geringe Schwankungen der Peakintensitäten zu
großen Standardabweichungen führen.
Die Abb. 3.5f zeigen, getrennt nach Modifikationstyp, den Verlauf der Modifikationsrate mit zunehmender Erhitzung an einem bestimmten Peptid. Mit längerer Erhitzungsdauer nahm die Lactosylierung wesentlich zu, bis auf Werte von ca. 2 % bis
ca. 40 %, abhängig vom jeweiligen Peptid. Bei einigen Peptiden ergab sich ein Plateau, das auch bei fortgesetzter Erhitzung nicht überschritten wurde. Andere Peptide
hingegen zeigten einen anderen Verlauf: Hier nahm die Modifikationsrate des Amadoriprodukts trotz weiterer Erhitzung wieder ab. Grund hierfür ist vermutlich die Bildung
von späteren Reaktionsprodukten wie der zweifachen Lactosylierung und CML. Die
Modifikationsraten für CML stiegen daher auch kontinuierlich an, auf Werte zwischen
rund 0,5 % und 7 % an den Peptiden 910, 1664, 1756 und 2120. Die zweifache Lactosylierung erreichte Maximalwerte um 2 %, konnte hier aber nur an den Peptiden 1664
und 2120 relativ quantifiziert werden. Für die Oxidationen ließ sich kein sicherer Trend
beobachten; während bei der einfachen Oxidation noch ein leichter Anstieg der Modifikationsrate vermutet werden konnte, war bei der zweifachen Oxidation keine Zunahme
84
Abb. 3.5: Relative Quantifizierung der Amadoriprodukte der einzelnen Peptide aus
s1 -Casein. Dargestellt ist die jeweilige Modifikationsrate nach Inkubation
von Rohmilch bei 60 °C für 0, 1, 4, 7 und 14 Tage. ∗ p < 0,05; ∗∗ p < 0,01
a
85
Abb. 3.6: Relative Quantifizierung von CML-Modifikationen und Oxidationen der einzelnen Peptide aus s1 -Casein. Dargestellt ist die jeweilige Modifikationsrate
nach Inkubation von Rohmilch bei 60 °C für 0, 1, 4, 7 und 14 Tage. ∗ p < 0,05;
∗∗ p < 0,01
a
86
Abb. 3.7: Modifikationsraten bei Peptid 2120 nach Inkubation von Rohmilch bei 60 °C
für 0, 1, 4, 7 und 14 Tage.
zu beobachten; bei Peptid 900 sogar eine deutliche Abnahme der Modifikationsrate.
Die Zuordnung der modifizierten Peptide zu den beteiligten Aminosäureresten kann
Tab. 3.2 entnommen werden.
Die Darstellung der Modifikationsraten bezogen auf ein Peptid zeigt beispielhaft für
Peptid 2120 Abb. 3.7. Die Abnahme des Anteils des unmodifizierten Peptids ist zu
sehen, zugunsten steigender Amadoriprodukt- und CML-Gehalte.
3.6.6 Modifikationsraten nach Erhitzung von Rohmilch bei 99 °C
in unabhängiger Dreifachbestimmung
Die bei der industriellen Hitzebehandlung eingesetzten Temperaturen liegen meist deutlich über 60 °C. Um dem Rechnung zu tragen, wurde auch Milch untersucht, die bei
höherer Temperatur hitzebehandelt wurde. Die Abb. 3.8f zeigen die Ergebnisse der Inkubation von Rohmilch bei 99 °C in unabhängiger Dreifachbestimmung. Beim Amadoriprodukt ergaben sich auch hier anfangs steigende Modifikationsraten, die bei einigen
Peptiden ein Plateau erreichten; die Modifikationsraten lagen je nach Peptid zwischen
etwa 4 % und 9 %. Bei den Peptiden 1049, 1664, 1756 und 2120 ergab sich nach 2 h bzw.
5 h Hitzebehandlung ein Maximum mit Werten von 1 % bei Peptid 1049 bis zu ca. 36 %
bei Peptid 2120. Die anschließende Abnahme der Modifikationsrate kann mit der Bildung des zweifachen Amadoriprodukts und von CML erklärt werden. Ersteres konnte
hier an den Peptiden 1664 und 2120 relativ quantifiziert werden, mit Maximalwerten
von etwa 2 % nach 2 h bzw. 5 h Erhitzung. Die relative Quantifizierung von CML bei
den Peptiden 910, 1756 und 2120 ergab kein Maximum, sondern eine kontinuierliche
87
Abb. 3.8: Relative Quantifizierung der Amadoriprodukte der einzelnen Peptide aus
s1 -Casein. Dargestellt ist die jeweilige Modifikationsrate nach Inkubation
von Rohmilch bei 99 °C für 0 und 20 Minuten sowie 1, 2, 5 und 10 Stunden.
∗ p < 0,05; ∗∗ p < 0,01
a
88
Abb. 3.9: Relative Quantifizierung von CML-Modifikationen und Oxidationen der einzelnen Peptide aus s1 -Casein. Dargestellt ist die jeweilige Modifikationsrate
nach Inkubation von Rohmilch bei 99 °C für 0 und 20 Minuten sowie 1, 2, 5
und 10 Stunden. ∗ p < 0,05; ∗∗ p < 0,01
a
89
Zunahme; bei der hier angewandten Erhitzung auf 0,5 % bis etwa 13 %, abhängig vom
jeweiligen Peptid.
Die Peptide 876, 900 und 1778 zeigten oxidative Veränderungen; da die Peptide 900
und 1778 kein Tryptophan enthalten, liegt bei beiden eine Methioninoxidation vor.
Peptid 876 enthält sowohl Methionin als auch Tryptophan; die Positionen dieser Modifikationen wurden mittels UHPLC-MS/MS bestimmt (s. Kap. 4.3.2). Bei der einfachen
Oxidation war eine mit andauernder Inkubation zunehmende Modifikationsrate erkennbar. Die Peptide lagen auch in Rohmilch teilweise oxidiert vor, die Modifikationsraten
betrugen je nach Peptid etwa 4 % bzw. 11 %. Die Maximalwerte nach Erhitzung erreichten je nach Peptid rund 14 %, 61 % und 37 %. Zweifache Oxidation zeigten nur die
Peptide 876 und 900, allerdings in erheblich geringerem Ausmaß. Die Maximalwerte
erreichten 6 % bzw. 2 %, wobei auch in Rohmilch bereits geringe relative Gehalte von
etwa 1,5 % quantifiziert wurden.
Wie in Kap. 3.4.3 erwähnt, wurde auch eine Untersuchung von bei 99 °C erhitzter Rohmilch durchgeführt, wobei die Probe einmal erhitzt und anschließend einmal
s1 -Casein isoliert und verdaut wurde, die Peptide jedoch dreimal fraktioniert und getrennt vermessen wurden. Die Standardabweichungen dieser Bestimmung lagen in demselben Bereich wie die der unabhängigen Dreifachbestimmung und der Bestimmung von
bei 60 °C inkubierter Rohmilch. Das bedeutet, dass die Hitzebehandlung selbst und die
Proteinisolierung keinen großen Einfluss auf die Messungenauigkeiten hatten; sie sind
hier wohl vor allem auf die MALDI-TOF-MS-Messung zurückzuführen. Die hier quantifizierten Reaktionen während der Erhitzung sind also immer in vergleichbarem Umfang
abgelaufen.
Bei diesem Vergleich wurde auch deutlich, dass sowohl das einfache und zweifache
Amadoriprodukt als auch CML bei allen Peptiden vergleichbare Kurvenverläufe und
Maximalwerte aufwiesen. Dadurch konnten die Ergebnisse der Dreifachbestimmung
nochmals abgesichert werden.
a
3.6.7 Quantifizierung von Modifikationen in Roh-, UHT- und
Sterilmilch
In Rohmilch, UHT- und Sterilmilch konnten Lactosylierungen und Oxidationsmodifikationen relativ quantifiziert werden; die Ergebnisse zeigt Abb. 3.10. Auf der Abszisse
sind jeweils die Peptide dargestellt, wobei für jedes Peptid die drei verschiedenen Handelsprodukte nebeneinander aufgetragen sind. Beim Amadoriprodukt sind für jedes
90
Abb. 3.10: Vergleich der Modifikationsraten der s1 -Casein-Modifikationen in Rohmilch, UHT- und Sterilmilch, dargestellt in Boxplots.
Romi: Rohmilch (n = 2), UHT:
UHT-Milch (n = 3), Stm: Sterilmilch (n = 3).
a
91
Peptid die zunehmenden Gehalte von Rohmilch über UHT-Milch bis zur Sterilmilch
deutlich zu erkennen. Die Modifikationsraten bei Sterilmilch lagen je nach Peptid und
Probe zwischen 0,5 % und 24 %; bei UHT-Milch ergaben sich Werte bis zu 13 %, wobei
andererseits beispielsweise das Amadoriprodukt der Peptide 900 oder 1049 in manchen
Proben unterhalb der Bestimmungsgrenze lag. In Rohmilch konnte nur in einer Probe
ein Amadoriprodukt relativ quantifiziert werden und zwar mit 0,2 % an Peptid 2120.
Zweifache Lactosylierung konnte ausschließlich in zwei Sterilmilchproben und auch
hier nur an Peptid 1664 relativ quantifiziert werden, die Modifikationsraten lagen unter 1 %. CML wurde nur an Peptid 1756 in zwei Sterilmilchproben und an Peptid
1664 in nur einer Probe quantitativ erfasst; die Werte lagen hier unterhalb von 1,5 %.
In allen Rohmilch- und UHT-Milchproben lagen beide Modifikationen unterhalb der
Bestimmungsgrenze. Bei der einfachen und zweifachen Oxidation konnte kein klarer
Zusammenhang mit der Intensität der Hitzebehandlung gezeigt werden. Die Mediane
der einfachen Oxidation der Peptide 876 und 1778 lagen zwischen 2 % und 5 %, bei
Peptid 900 bei bis zu ca. 30 %. Für die zweifache Oxidation ergaben sich wiederum
kleinere Mediane, bei Peptid 876 bis zu 12 %, bei Peptid 900 unter 1 %.
3.6.8 Quantifizierung von Modifikationen in Kindermilchnahrungen
Um auch die relative Belastung von Kindermilchnahrungen abschätzen zu können,
wurden sechs verschiedene Produkte auf Modifikationen untersucht. In Abb. 3.11 sind
die zugehörigen Ergebnisse dargestellt. Das Amadoriprodukt wies Modifikationsraten
bis zu ca. 26 % auf; hier konnte in jeder Probe an jedem vermessenen Peptid diese
Modifikation nachgewiesen werden. Der Median der Modifikationsraten lag bei etwa
4 % - 18 %. CML konnte nur an Peptid 1756 relativ quantifiziert werden, jedoch nicht
in allen Proben. Gleiches gilt für das zweifache Amadoriprodukt, das Modifikationsraten von bis zu 1,3 % an den Peptiden 1664, 1756 und 2120 aufwies. Die Oxidation
zeigte im Median aller Proben Werte zwischen 10 % und 33 %, die zweifache Oxidation
wesentlich geringere Werte, auch hier nur an den Peptiden 876 und 900. Diese Werte liegen innerhalb des Bereichs, in dem auch die Ergebnisse der Rohmilch-Erhitzungsserien
liegen. Das bedeutet, dass beide Erhitzungsmodelle die tatsächlichen Abläufe bei der
industriellen Hitzebehandlung gut repräsentieren. Die Boxen in den Abb. 3.10 und
3.11 repräsentieren verschiedene Proben, keine durch die Aufarbeitung begründeten
Schwankungen.
92
Abb. 3.11: Modifikationsraten bei
proben
as1-Casein aus den sechs untersuchten Kindermilch-
93
Die Ergebnisse der einzelnen Kindermilchproben zeigten Unterschiede im Ausmaß
der Hitzeschädigung. Manche Proben wiesen sowohl beim einfachen und zweifachen
Amadoriprodukt wie auch bei CML höhere Werte auf, andere Proben zeigten geringere Werte. Proben mit höherer Belastung ergaben bei allen Peptiden die höchsten
Werte, die gering belasteten Proben zeigten auch bei allen Peptiden die geringsten
Werte. Eine Zuordnung der Hitzeschädigung zu einerseits Anfangs- oder Folgemilch
und andererseits zu flüssigen oder pulverförmigen Produkten konnte im Rahmen dieser Bestimmungen hingegen nicht getroffen werden. Letzteres deutet darauf hin, dass
für die Erzeugung der Pulver sehr schonende Trocknungsverfahren eingesetzt wurden.
Anfangs- und Folgemilchprodukte sind für Säuglinge verschiedenen Alters optimiert;
allerdings wurden die hier untersuchten Nährmittel für Säuglinge direkt nach der Geburt nicht (oder nur geringfügig) stärker hitzebehandelt als die Nährmittel für etwas
ältere Kleinkinder.
Im nächsten Versuch sollte die Reproduzierbarkeit der Probenaufarbeitung überprüft
werden. Dazu wurde Kindermilchnahrung Nummer 6 dreimal unabhängig vermessen.
Die Aufarbeitung erfolgte wie im vorherigen Versuch (s. Kap. 3.4.5), jedoch wurden die
drei Läufe der Proteintrennung nicht vereinigt, sondern wie bei der unabhängigen Rohmilcherhitzung beschrieben getrennt verdaut und je einmal mittels HPLC fraktioniert.
Wie Abb. 3.12 zeigt, ergab die getrennte Auswertung dieser drei Messungen gut mit
den Standardabweichungen bisheriger Messungen vergleichbare Werte; daher spielt der
Einfluss der Proteintrennung an der HPLC eine untergeordnete Rolle hinsichtlich der
Messfehler. Zweifache Lactosylierung konnte bei dieser Vermessung nicht quantitativ
erfasst werden, CML lag bei Peptid 1756 in etwa an der Bestimmungsgrenze. Die
Ergebnisse für das Amadoriprodukt stimmten mit der obigen Bestimmung gut überein.
3.6.9 Gegenüberstellung der bei 99 °C erhitzten Rohmilch und
aller Handelsproben
Abschließend sollen die letztgenannten Ergebnisse miteinander verglichen werden. In
Abb 3.13ff sind die Daten der unabhängigen Dreifachbestimmung der bei 99 °C inkubierten Rohmilchproben denen der Handelsproben (Rohmilch, UHT- und Sterilmilch,
Kindernährmittel) gegenüber gestellt. Die Erhitzungsserie wird hier durch Balken dargestellt. Beim Amadoriprodukt sind sind die Trends aus Abb. 3.8 zu erkennen, also der
anfängliche Anstieg der Modifikationsrate sowie die Abnahme der Modifikationsrate
bei fortgesetzter Erhitzung vor allem bei den Peptiden 1664 und 2120. Bei den Han-
94
a
Abb. 3.12: Modifikationsraten bei s1 -Casein aus Kindermilchprobe Nummer 6 nach
unabhängiger Dreifachbestimmung
delsproben ist ein Anstieg zu beobachten, wobei es vom Peptid abhängt, ob Sterilmilch
oder die Kindermilchproben die höchsten Werte aufweisen; darunter liegen UHT-Milch
und Rohmilch. Diese Werte liegen im Bereich der Rohmilcherhitzung, was zeigt, dass
das Erhitzungsmodell - trotz der deutlich längeren Inkubationszeiten als bei industrieller Erhitzung - ein sehr gutes Modell für die industrielle Hitzebehandlung verschiedener
Milchprodukte darstellt. Die Daten von UHT-Milch entsprechen in etwa denen einer
für 20 Minuten bei 99 °C erhitzten Rohmilch; die Steril- und Kindermilchproben entsprechen ungefähr einer für etwas mehr als eine Stunde bei 99 °C erhitzten Rohmilch.
Diese Einordnung trifft auch für CML und das zweifache Amadoriprodukt zu; bezüglich der Oxidation liegen die Steril- und Kindermilchproben eher im Bereich der für
zwei Stunden erhitzten Rohmilch. Die in den Abbildungen erkennbaren Abweichungen
der Handelsproben von der Rohmilchinkubation bei 99 °C sind vermutlich auf unterschiedliche Erhitzungsbedingungen zwischen Labor und Industrie zurückzuführen.
95
a
Abb. 3.13: Vergleich der Modifikationsraten der Hauptmodifikationen des s1 -Caseins
aus der Rohmilchinkubation bei 99 °C (Balken) mit Handelsproben (Rohmilch, UHT- und Sterilmilch, Kindernährmittel) - Teil I
96
a
aus der Rohmilchinkubation bei 99 °C (Balken) mit Handelsproben (Rohmilch, UHT- und Sterilmilch, Kindernährmittel) - Teil II
97
a
aus der Rohmilchinkubation bei 99 °C (Balken) mit Handelsproben (Rohmilch, UHT- und Sterilmilch, Kindernährmittel) - Teil III
98
3.7. Diskussion
3.7 Diskussion
a
Die in diesem Kapitel beschriebenen Untersuchungen von s1 -Casein konnten modifizierte Aminosäurereste im Protein identifizieren und zeigten, welche Modifikationen
an diesen Stellen vorlagen. Zusätzlich konnten die Modifikationsraten während einer
Hitzebehandlung qualitativ und quantitativ verfolgt werden. Die Erhitzungsdauer beeinflusste das Ausmaß vorhandener Modifikationen; des Weiteren wurde während der
Erhitzung beispielsweise das Amadoriprodukt teilweise zu CML umgesetzt.
An Peptid 2120 konnten CML, einfaches und zweifaches Amadoriprodukt nachgewiesen werden. Lys3 und/oder Lys7 können modifiziert sein, allerdings kann auch der
in diesem Peptid enthaltene N-Terminus von s1 -Casein modifiziert vorliegen. Tab. 3.5
zeigt alle erfassten Lysin-, Methionin- und Tryptophanreste von s1 -Casein und fasst
die bisherigen Ergebnisse zusammen (die Einträge zu Peptid 763 sind ein Vorgriff aus
Kap. 4.3.2).
Scaloni et al. konnten in s1 -Casein aus Sterilmilch Lactosylierungen von Lys7, Lys34,
Lys83, Lys103, Lys105, Lys132 und Lys193 nachweisen, ebenso das zweifache Amadoriprodukt des Peptids, das Lys103 und Lys105 enthielt. Die einfachen Lactosylierungen der gleichen Lysinreste wurden ebenfalls nach Untersuchung von UHT-Milch
detektiert. Pasteurisierte Milch zeigte genau ein Amadoriprodukt, an Lys34; in Rohmilch wurde keines gefunden. Hier wurde aus entfetteter Milch mittels HPLC isoliertes s1 -Casein mit Trypsin und AspN verdaut. Die resultierenden Peptidmischungen
wurden chromatografisch aufgetrennt und mittels ESI-MS und MALDI-TOF-MS analysiert. Zur Identifikation der genauen Bindungsstelle wurde ein Edman-Abbau durchgeführt [45].
In Tab. 3.5 sind einige Modifikationsstellen nicht einzeln angegeben, da manche Peptide mehr als einen Lysinrest enthalten. Dies erschwert einen Vergleich mit den Literaturdaten. Jedoch sind alle von Scaloni et al. genannten Modifikationen des s1 -Caseins
mit den hier ermittelten Ergebnissen vereinbar. Scaloni et al. konnten in pasteurisierter
Milch nur die Lactosylierung von Lys34 detektieren und haben daraus gefolgert, dass
dieser Rest besonders anfällig für die Lactosylierung ist. Diese Feststellung konnte hier
nicht bestätigt werden. Die selbst in Rohmilch modifiziert vorliegenden Peptide waren
2120 und 1756, die Lys34 nicht enthalten. Deren Modifikationen zeigten auch in allen
übrigen Proben die höchsten Signalintensitäten.
a
a
a
a
a
99
Tab. 3.5: Zusammenstellung qualitativ und quantitativ in Milchproben nachgewiesener
Modifikationen.
-: Modifikation konnte nicht detektiert werden;
•: Modifikation qualitativ nachgewiesen;
Zahlenwerte: Maximale Modifikationsraten nach intensiver Hitzebehandlung
Position
Peptid
Amadoriprodukt
CML
zweifaches AP
Lys3/Lys7
2120
36 %
13 %
2,3 %
Position
Peptid
Amadoriprodukt
CML
zweifaches AP
Lys102/Lys103/Lys105
1756
13 %
9,5 %
0,3 %
Position
Peptid
Oxidation
zweifache Oxidation
Met60
763
-
Lys34/Lys36
1049
3,9 %
-
Met123
900
61 %
21 %
Lys58
763
•
Lys124
900
7,6 %
-
Met135
1778
37 %
-
Lys79/Lys83
910
15 %
0,5 %
•
Lys132
1778
5,5 %
-
Trp164
3463
-
Lys193
876
8,9 %
-
Met196/Trp199
876
16 %
22 %
Zusätzlich zu den von Scaloni et al. für Sterilmilch genannten Amadoriprodukten
konnten mindestens zwei weitere nachgewiesen werden, an Lys58 und Lys124. Arena et al. konnten insgesamt elf lactosylierte Lysinreste in s1 -Casein nachweisen und
zwar Lys3, Lys7, Lys34, Lys36, Lys83, Lys102, Lys103, Lys105, Lys124, Lys132 und
Lys193. Die Proteine verschiedener Milchproben wurden in deren Studie über Nacht
mit Trypsin verdaut. Die erhaltenen lactosylierten Peptide wurden anschließend über
m-Aminophenylboronsäure-Agarosesäulen aufgereinigt und angereichert. Nach einer
weiteren Aufreinigung mittels ZipTips erfolgte eine Vermessung mittels nano-LC-ESILIT-MS/MS oder MALDI-TOF-MS in CCA [59]. Alle in Tab. 3.5 genannten Positionen
von Lactosylierungen stimmen mit den Ergebnissen von Arena et al. überein, abgesehen
von der in Tab. 3.5 zusätzlich erwähnten Lactosylierung von Lys58. Diese Modifikation
konnte nur qualitativ nachgewiesen werden; das lässt darauf schließen, dass diese Position nur in sehr geringem Umfang modifiziert wurde. Die genannten Modifikationen
wurden in pulverförmigen Kindernährmitteln detektiert; in UHT-Milch konnten Arena
et al. Lactosylierungen von Lys36, Lys102 und Lys124 nicht nachweisen. Ein Vergleich
a
100
3.7. Diskussion
der beiden erstgenannten Lysinreste mit obiger Tabelle ist nicht möglich, da im jeweils gleichen Peptid ein weiterer Lysinrest vorliegt, der modifiziert sein kann. Mit der
im Rahmen dieser Arbeit angewandten Methode ist jedoch ein Nachweis von lactosyliertem Lys124 auch in UHT-Milch gelungen. Ausschlaggebend hierfür könnten jedoch
auch Unterschiede zwischen den untersuchten UHT-Milchproben sein. Allerdings ist
nach einer Anreicherung modifizierter Peptide eine relative Quantifizierung nicht mehr
möglich. Marvin et al. haben die Lactosylierungsstellen Lys34, Lys36, Lys83, Lys105
und Lys124 in s1 -Casein aus pulverförmiger Kindermilchnahrung mittels nano-ESIMS/MS-Messung nach tryptischem In-Gel-Verdau bestätigt [49]. Abb. 3.3 veranschaulicht die in den drei genannten Literaturstellen nachgewiesenen Lactosylierungen und
ermöglicht einen Vergleich mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Die Bildung
von CML-Modifikationen [35] und ebenso das Auftreten oxidativer Schädigungen ist
für intaktes s1 -Casein bereits gezeigt worden. Dabei wurde zusätzlich s1 -Casein aus
unerhitzter und bei 120 °C für 30 Minuten erhitzter Rohmilch mittels Gelelektrophorese isoliert, im Gel mit GluC verdaut und mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Es
wurde Methioninsulfoxid an Met60, Met123, Met135 und Met196 detektiert [63]. Diese
Daten stimmen mit denen in Tab. 3.5 überein, wobei vermutlich auf Grund der höheren
Inkubationstemperatur in der genannten Studie auch Met60 oxidiert vorlag.
In der vorliegenden Arbeit konnte zusätzlich erstmalig der zeitliche Verlauf der Reaktion für jede Aminosäure und für jede Modifikation quantitativ erfasst werden. Auch
nach der Erhitzung wiesen die Modifikationsraten verschiedener Aminosäurereste große
Unterschiede untereinander auf. Ein möglicher Grund dafür ist, dass bestimmte Aminosäurereste bevorzugt modifiziert werden, andere hingegen langsamer reagieren. Eine
solche Beobachtung könnte mit sterischen Aspekten erklärt werden und ist für andere
Proteine bereits beschrieben worden [58]. Größere, oder auch geladene, Seitenketten benachbarter Aminosäuren könnten auch hier die Reaktion eines Lysinrests mit Lactose
verzögern.
Wie die Abb. 3.8 zeigt, nahm die Modifikationsrate der einfachen Lactosylierung
bei einigen Peptiden (z.B. 2120, 1049) trotz fortgesetzter Erhitzung nach anfänglichem
Anstieg wieder ab; gleiches gilt für die zweifache Lactosylierung, beispielsweise von
Peptid 1664. Dieser Trend wurde auch bei den qualitativen Nachweisen (vgl. Tab. 3.3)
bereits beobachtet. Auch hier war das Amadoriprodukt von Peptid 1049 nach längerer
Erhitzung nicht mehr nachweisbar, ebenso die zweifachen Amadoriprodukte der Peptide 1756, 1664 und 910. Gleiches gilt für die zweifache Oxidation von Peptid 900; für
CML hingegen konnte auch bei den qualitativen Nachweisen kein Rückgang beobach-
a
a
a
101
tet werden. Zweifaches CML lag selbst bei stark erhitzten Proben knapp unterhalb der
Nachweisgrenze; ebenso wenig wurden CML und Amadoriprodukt gleichzeitig in einem
Molekül detektiert.
Es wurde aus allen Handelsproben mittels HPLC s1 -Casein isoliert. Um die einzelnen Experimente besser vergleichen zu können, wurde auch der -Casein-Standard
entsprechend behandelt. Außerdem konnten so die in Kap. 2.9 beschriebenen, zusätzlich
im Standard vorhandenen Caseinsubtypen (wie s2 -Casein) abgetrennt werden.
Bei den Oxidationsprodukten besteht die Möglichkeit, dass ihre Bildung während der
Probenaufarbeitung stattfindet; das gilt vor allem für die in Rohmilch nachgewiesenen
Produkte. Allerdings bleibt festzustellen, dass auch in den in Kap. 2.8 erwähnten, nicht
mittels HPLC fraktionierten Proben sowohl die Oxidation der Peptide 876, 900 und
1778, wie auch die zweifache Oxidation der Peptide 876 und 900 nachgewiesen wurden. Somit kann ausgeschlossen werden, dass sämtliche oxidative Schädigungen während dieses letzten Aufarbeitungsschrittes entstehen. Auch die Zunahme der oxidativen
Schädigung in erhitzter Milch (s. Abb. 3.9) spricht gegen die ausschließliche Bildung
während der Aufarbeitung; in diesem Fall würden sich konstante Werte ergeben, da
die Aufarbeitung immer in der gleichen Weise durchgeführt wurde. Die Zunahme der
Werte mit längerer Inkubationszeit dagegen ist ein Anzeichen für die Entstehung von
Oxidationsmodifikationen während der Hitzebehandlung. Zudem ist bekannt, dass im
Verlauf der Maillard-Reaktion reaktive Sauerstoffspezies gebildet werden [67].
Die Kurvenverläufe der 99 °C-Messreihe sind sehr gut vergleichbar mit denen der
Rohmilcherhitzung bei 60 °C. Die Hitzebehandlung bei 99 °C für bis zu 10 Stunden
ergibt ähnliche Resultate wie die Erhitzung bei 60 °C für bis zu zwei Wochen. Auch die
Werte der Modifikationsraten je Peptid und Modifikation liegen im gleichen Bereich,
wobei das Ausmaß der Modifikationen bei 99 °C nach 10 Stunden in einigen Fällen (z.B.
bei CML) etwas größer war als nach 14 Tagen bei 60 °C. Ein größerer Unterschied zeigt
sich beim zweifachen Amadoriprodukt: Bei 99 °C wird es nach längerer Erhitzung so gut
wie vollständig abgebaut; eine Reaktion, die bei 60 °C in der beobachteten Zeitspanne
nicht in diesem Maße abläuft, obwohl auch hier der einsetzende Abbau erkennbar ist.
Auch die oxidative Schädigung zeigt die gleiche Tendenz, jedoch ist auch hier das
Ausmaß bei der 99 °C-Inkubation höher als bei der 60 °C-Inkubation.
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass diese Methode die Möglichkeit bietet, während
des Erhitzungsprozesses produkt- und positionsspezifisch Reaktionskinetiken aufzunehmen.
a
a
102
a
3.7. Diskussion
a
Die Peptide 1664 und 2120 stammen beide aus dem N-Terminus von s1 -Casein und
enthalten die gleichen Lysinreste; Peptid 2120 ist auf Grund einer übergangenen
Schnittstelle um vier Aminosäuren länger. Daher wären eigentlich gleiche Resultate
zu erwarten gewesen. Allerdings zeigte Peptid 1664 geringere Signalintensitäten, als
sie bei Peptid 2120 beobachtet wurden. Grund dafür könnte sein, dass beim Verdau
die erwähnte Schnittstelle zwischen Glu14 und Val15 nur selten hydrolysiert wurde.
Kleinere Peaks führen zu schlechteren Nachweis- und Bestimmungsgrenzen. Das könnte
der Grund dafür sein, dass bei Peptid 1664, im Unterschied zu Peptid 2120, manche
Modifikationen nicht mehr nachweisbar waren. An Peptid 1664 konnte bei der 60 °CInkubation CML relativ quantifiziert werden, bei 99 °C jedoch nicht. Ein möglicher
Grund dafür könnte sein, dass das Protein durch die höhere Inkubationstemperatur
teilweise denaturiert wurde und sich der Verdau deshalb in Richtung der Bildung von
Peptid 2120 verschoben hat, auf Kosten von Peptid 1664. Die geringere Peptidmenge
führt zu schlechteren Nachweisgrenzen und daher könnten keine CML-Gehalte mehr
messbar gewesen sein.
Wird Milch sehr stark erhitzt, so kann sich eine hochmolekulare Fraktion (HMWF)
bilden, die im Wesentlichen aus aggregierten Milchproteinen besteht. Beispielsweise führte die Lagerung von UHT-Milch für zwei Monate bei 28 °C oder 40 °C zur
Bildung einer deutlichen HMWF, wie Holland et al. mittels 2D-Gelelektrophorese
zeigen konnten. Die neu gebildeten Spots wurden mit Trypsin im Gel verdaut und
mit MALDI-TOF-MS vermessen. So konnte gezeigt werden, dass sich einerseits
s1 -Casein-Oligomere, andererseits Komplexe aus
s1 -Casein,
s2 -Casein und/oder
-Casein gebildet hatten. Die Proteine können beispielsweise über AGEs oder Lysinoalanin quervernetzt sein. Letzteres kann durch einen Angriff von Lysin an Dehydroalanin entstehen, das wiederum durch -Eliminierung eines Phosphorsäuremoleküls
aus phosphoryliertem Serin gebildet werden kann. [68]
Auch bei der Erhitzung von Rohmilch kann sich eine HMWF bilden. Nach einer
Erhitzung für 60 Minuten bei 120 °C konnten Meyer et al. eine HMWF mittels Gelelektrophorese detektieren; nach 180 Minuten bei 72 °C war sie jedoch noch kaum erkennbar
[35]. Die Bildung einer HMWF scheint also bei intensiver Hitzebehandlung verstärkt
abzulaufen. Bei den im Rahmen dieses Projektes durchgeführten Proteintrennungen
der bei 60 °C erhitzten Rohmilch zeigte sich am Ende der HPLC-Chromatogramme
ein kleiner Peak, dessen Intensität mit der Erhitzung in geringem Umfang zunahm.
Auch bei den bei 99 °C erhitzten Proben zeigte sich dieser Peak, ab den für 5 Stunden inkubierten Proben mit deutlicherer Intensität. Dieser Peak könnte auch hier auf
a
b
a
a
b
103
die Bildung einer HMWF hindeuten; diese wurde jedoch im Rahmen der vorliegenden
Arbeit nicht näher charakterisiert. Bei einer gelelektrophoretischen Auftrennung einer
für 60 Minuten bei 99 °C erhitzten Rohmilchprobe zeigte sich ebenfalls eine HMWF
in Form einer diffusen, schwachen Bande. Ein Zusatz von Guanidin verbesserte die
Löslichkeit der erhitzen Proteine in der Probenlösung zwar erheblich, führte allerdings
nicht zur Rückbildung der HMWF. Die Bildung dieser HMWF könnte teilweise die in
Kap. 3.3 beschriebene Abnahme der s1 -Casein-Fläche in den Chromatogrammen erklären. Ein Teil dieser hochmolekularen Komplexe könnte quervernetztes s1 -Casein sein,
das möglicherweise auch modifiziert ist. Dieser Anteil des modifizierten Proteins wurde
hier nicht erfasst; daher könnten noch größere Anteile von s1 -Casein geschädigt sein,
als es die Modifikationsraten vermuten lassen. Andererseits könnten sich durch die Abnahme der Menge an isoliertem s1 -Casein bei intensiv hitzebehandelten Proben die
Nachweisgrenzen für Modifikationen eventuell etwas verschlechtert haben.
Unerwünschte Vorgänge während der Ionisierung können ebenfalls einen Einfluss auf
die hier bestimmten Modifikationsraten haben. Es kann nicht ausgeschlossen werden,
dass sich die Ionisierbarkeit eines Peptids auf Grund eingeführter Modifikationen ändert. Beispielsweise könnte ein Lactulosylrest die Ionisation eines Moleküls im Vergleich
zum nativen Peptid zurückdrängen; in diesem Fall würde eine geringere Modifikationsrate beobachtet werden, als es dem Anteil der umgesetzten Moleküle entspricht. Die
hier ermittelten Modifikationsraten geben daher nicht unbedingt die genauen Verhältnisse der entstandenen Reaktionsprodukte zueinander wieder.
Auch Aussagen zum Vergleich der Reaktivitäten einzelner Peptide können nicht mit
Sicherheit getroffen werden, da der Einfluss der Modifikation auf die Ionisationsfähigkeit eines Peptids möglicherweise von der Aminosäuresequenz abhängt: Bei Messungen
im positiven Modus kommt es zur Protonierung des Moleküls vorzugsweise an basischen Gruppen. Daher hätte die Blockierung des einzigen basischen Aminosäurerests
eines kleinen Peptids möglicherweise größere Auswirkungen auf die Ionisierung als eine
einfache Lactosylierung großer Peptide mit mehreren basischen Seitengruppen. Die Modifikationsraten dienen vielmehr dazu, quantitative Aussagen über Modifikationen an
einzelnen Positionen des Proteins machen zu können. Die festgestellten Zusammenhänge zwischen Erhitzung und relativer Veränderung einer bestimmten Modifikationsrate
werden von diesen Ionisationseffekten nicht beeinflusst.
Aus diesem Zusammenhang ergibt sich auch, dass ein unmodifiziertes Peptid gleichzeitig mit allen zugehörigen modifizierten Peptiden zusammen mittels MALDI-TOFMS vermessen werden muss. Matrixeffekte in verschiedenen Proben können die Ioni-
a
a
a
a
104
3.7. Diskussion
sierung von Peptiden unterschiedlich stark beeinflussen. Die Intensität des Modifikationspeaks wird aber auf die Intensität des Peaks des unmodifizierten Peptids bezogen.
Sind beide in verschiedenen Proben, könnte es selbst bei Vermessung mit der gleichen
Laserenergie durch diese Unterschiede in der Ionisation zu verzerrten Peakintensitäten kommen - die Folge wären falsche Modifikationsraten. Um diesen möglichen Effekt
auszuschließen, müssen das native Peptid und alle zugehörigen modifizierten Peptide
simultan vermessen werden; daher wurden die Peptid-HPLC-Fraktionen 3 und 4 sowie
6 und 7 vereinigt.
Aussagen zu den absoluten Umsatzraten und somit auch zu einem Vergleich der Peptide untereinander könnten durch die parallele Vermessung von Proben und modifizierten Standardpeptiden erhalten werden. Die Quantifizierung könnte mittels LC-MS/MS
im MRM-Modus erfolgen. Allerdings müsste dazu von jedem Peptid und für jede Modifikation davon ein Standard vorliegen. Da diese Standards nicht kommerziell erhältlich
sind, müssten diese modifizierten Peptide selbst hergestellt und aufgereinigt werden.
Auf dieses experimentell sehr aufwändige Verfahren wurde verzichtet und stattdessen
relativ quantifiziert. Daher können hier auch keine absoluten Nachweis- oder Bestimmungsgrenzen angegeben werden; beide wären wegen der genannten Ionisationseffekte
sowohl vom vermessenen Peptid als auch von der jeweiligen Modifikation abhängig.
Die hier etablierte Methode liefert ebenso keine quantitativen Gehalte der Modifikationen in Milchproben. Allerdings wurden durch den Einsatz anderer Methoden bereits
absolute Gehalte beispielsweise für CML nach Totalverdau bestimmt. Sie liegen bei
Kindermilchnahrungen je nach untersuchtem Produkt in der Größenordnung von etwa
5 - 200 µg CML/g Protein [41]/[36] bzw. etwa 1,5 mmol CML/mol Lysin [69].
In den Spektren, die das Signal des Peptids 910 zeigten, trat ein zusätzlicher Peak
auf, der eine Massendifferenz von -17,0 Da zum Peptid aufwies (s. z.B. Abb. 2.19). Eine
mögliche Erklärung ist eine Zyklisierung von Glutamin unter Ammoniakabspaltung.
Glutamin ist in diesem Peptid die erste Aminosäure; am N-Terminus kann die in Abb.
3.16 gezeigte Reaktion stattfinden. Diese Reaktion ist in der Literatur bereits von
Baldwin et al. nachgewiesen worden [70]. Eine Abhängigkeit der Signalintensität von
der Dauer der Inkubation von Rohmilch bei 60 °C konnte nicht beobachtet werden,
was im Einklang mit der vorgestellten Reaktion steht: Erst durch den Verdau wird das
entsprechende Glutamin im Protein zur N-terminalen Aminosäure des sich bildenden
Peptids. Daher kann die Zyklisierung erst nach dem Verdau und nicht während der
Inkubation ablaufen.
105
Abb. 3.16: Mögliche Zyklisierung des N-terminalen Glutamins in Peptid 910 unter
Ammoniakabspaltung
Des Weiteren trat in den Massenspektren von Peptidfraktion Nummer 9 ein Peak
bei m/z = 1867,0 auf; der Massenunterschied zum Peptidpeak bei m/z = 2120,2 betrug 253,2 Da. Dieser Massenunterschied könnte durch eine Abspaltung der beiden
N-terminalen Aminosäuren dieses Peptids (und damit auch von s1 -Casein), Arginin
und Prolin, erklärt werden. Diese Annahme wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt, allerdings nahm die Signalintensität dieses Peaks mit zunehmender
Dauer der Inkubation von Rohmilch bei 60 °C zu.
a
106
4 Identifikation modifizierter
Aminosäuren mittels LC-MS/MS
4.1 Einleitung
In den letzten beiden Kapiteln wurden Untersuchungen beschrieben, in deren Verlauf Art und Position von Proteinmodifikationen mittels MALDI-TOF-MS identifiziert
wurden. Bei den Peptiden, die nur einen reaktiven Aminosäurerest enthielten, konnte
bereits bestimmt werden, welcher Aminosäurerest modifiziert vorliegt. Ziel der folgenden Versuche war, auch die übrigen Modifikationen den betroffenen Aminosäureresten
innerhalb eines Peptids zuordnen zu können. Mit der bisher beschriebenen Technik,
MALDI-TOF-MS nach enzymatischem Verdau, kann dieses Ziel nicht erreicht werden;
vor allem die Sequenz KKYK in Peptid 1756 kann so nicht genauer aufgelöst werden.
Zur Lösung dieses Problems wurde ein Tandem-Massenspektrometer eingesetzt. Damit können Peptide sequenziert und so die genaue Modifikationsstelle bestimmt werden
(zum Prinzip der Sequenzierung siehe Kap. 1.8.4). Im Rahmen dieses Projektes wurden
zwei unterschiedliche MS-Experimente durchgeführt: Zuerst ein EMS-Scan (Enhanced
MS Scan), um die Retentionszeiten der Peptide und ihre Ladung zu bestimmen; anschließend ein EPI-Scan (Enhanced Product Ion Scan), um die genaue Struktur der
modifizierten Peptide zu ermitteln (s. Kap. 4.3). Nach Optimierung von DP (Declustering Potential) und CE (Kollisionsenergie) konnten die in Kap. 4.3 genannten Ergebnisse
erzielt werden. Vermessen wurden hier für 2 Stunden bei 99 °C erhitzte Rohmilch sowie unbehandelte Rohmilch als Kontrolle; die Probenvorbereitung ist in Kap. 5.17.1
beschrieben.
4.2 EMS-Scan
Im Totalionenstrom (TIC) konnten Peaks beobachtet werden (s. Abb. 4.1). Die zugehörigen Massenspektren zeigten die erwarteten Peptide aus dem Hydrolysat; die
107
4. Identifikation modifizierter Aminosäuren mittels LC-MS/MS
Tab. 4.1: Zuordnung der Peptide zu ihren Retentionszeiten und Ladungszuständen;
Nachweis von Amadoriprodukten (AP) in für 2 Stunden bei 99 °C erhitzter
Rohmilch im EMS-Scan. Massen in Dalton, Rt in Minuten
Peptid
2120
1778
1756
Modifikation Masse
2120,2
Rt
16,5
AP
2444,2
16,5
-
1778,9
16,9
AP
2102,9
16,9
AP
1756,1 21,5
2080,1 21,5
-
1049,6
10,1
1049
876
763
AP
-
1373,6 10,1
876,5 25,0
AP
1200,5
24,3
AP
763,4
1087,4
9,4
9,4
z
2
3
3
4
2
3
2
3
2
2
3
1
2
2
1
2
1
2
1
1
2
m/z
1060,6
707,4
815,4
611,8
890,0
593,6
1051,9
701,6
878,5
1040,6
694,0
1049,6
525,3
687,3
876,5
438,7
1200,5
600,8
763,4
1087,4
544,2
Reihenfolge ihrer Elution von der Säule war quasi die gleiche wie in Kap. 2.6.5 beschrieben. Allerdings konnten die Peptide 1664, 910 und 900 hier nicht nachgewiesen
werden. Möglicher Grund hierfür könnte die andere Art der Ionisierung im Vergleich zu
MALDI sein. Teilweise wurden auch im EMS-Scan bereits Modifikationen detektiert,
wie erwartet jedoch ausschließlich bei Vermessung der erhitzten Rohmilch. Interessanterweise wurden die Amadoriprodukte auch bei dieser Trennung nicht oder nur in
geringem Umfang vom unmodifizierten Peptid abgetrennt (vgl. Kap. 2.9).
Tab. 4.1 stellt die nachgewiesenen, teilweise modifizierten Peptide und ihre Retentionszeiten, sofern beobachtet auch unter Berücksichtigung mehrfach geladener Ionen,
zusammen. Weitere Informationen zu den Peptiden können den Tab. 3.2 und 8.5 entnommen werden.
108
4.2. EMS-Scan
Abb. 4.1: EMS-Scan: Totalionenstrom, Extracted Ion Chromatograms und Massenspektren für das native Peptid 1049 und dessen Amadoriprodukt (AP).
Gal: Galactose, z: Ladungszahl
109
4.3 EPI-Scan
Ziel war hier, die exakte Position von Lactosylierungen innerhalb der Peptide zu bestimmen, die mehrere Lysinreste (Peptid 2120 zusätzlich den N-Terminus) enthalten. Daher
wurden Peptide mit genau einem Lysinrest hier nicht vermessen, da davon ausgegangen
werden kann, dass sich das mittels MALDI-TOF-MS nachgewiesene Amadoriprodukt
am einzigen Lysinrest befindet. Aus dem gleichen Grund wurde nur die Oxidation von
Peptid 876 vermessen, da nur dieses Methionin und Tryptophan enthält. Zusätzlich
wurde Peptid 763 auf Lactosylierung und Oxidation untersucht, da eine Auswertung
nach den MALDI-TOF-MS-Messungen nicht möglich war (vgl. Kap. 2.6.5).
4.3.1 Durchführung der Messungen
Für die Durchführung eines EPI-Scans wird ein Mutterion ausgewählt, das in Q1 selektiert und in Q2 fragmentiert wird. Q3 ist als lineare Ionenfalle geschaltet, wodurch
sich Spektren mit sehr gutem Signal-Rausch-Verhältnis ergeben (daher die Bezeichnung „Enhanced Product Ion Scan“). Als Prekursoren wurden die in Tab. 4.2 genannten Masse/Ladung-Verhältnisse angegeben, die bekannte modifizierte Peptide, teilweise
mehrfach geladen, repräsentieren. Die resultierenden Fragmentspektren wurden nach
b- und y-Fragmenten durchsucht. Für die einzelnen Vorläuferionen wurden zunächst
die Parameter DP und CE optimiert. Die dabei ermittelten Einstellungen sind ebenfalls
in Tab. 4.2 aufgeführt. Auffällig war, dass bei den hier vermessenen Proben das DP nur
einen sehr geringen Einfluss auf die Spektren hatte. Auch bei großen Veränderungen
des DP war an den Signalintensitäten kein deutlicher Unterschied zu erkennen. Das DP
wurde daher hier auf 50 V festgelegt. Dafür war der Einfluss der Kollisionsenergie umso größer; schon eine Veränderung um 5 eV ergab deutliche Unterschiede der relativen
Signalintensitäten der Peaks in den Massenspektren.
Die Amadoriprodukte der Peptide 910 und 1664 konnten trotz mehrerer Versuche
auch im EPI-Scan nicht detektiert werden. Da schon beim EMS-Scan auch das native
Peptid 910 nicht detektiert werden konnte, besteht die Vermutung, dass dieses unter den hier gewählten Bedingungen praktisch nicht ionisiert wurde. Eine Vermessung
der Probenlösung mittels MALDI-TOF-MS in ClCCA zeigte klare Peaks, für das unmodifizierte Peptid 910 und ebenso für dessen Amadoriprodukt. Die gleiche Ursache
kann auch für Peptid 1664 angenommen werden, jedoch besteht hier auch die Möglichkeit, dass es beim Verdau nur in wesentlich geringerem Maße gebildet wurde: Da
bei den LC-MS/MS-Messungen vor dem Verdau keine Isolierung von s1 -Casein aus der
a
110
4.3. EPI-Scan
Tab. 4.2: Prekursoren für den EPI-Scan und Zuordnung zu modifizierten
Peptiden. Massen in Dalton, Rt in Minuten, CE in eV
Peptid
2120
1756
1049
876
763
Modifikation
AP
AP
AP
Oxidation
zweifache Oxidation
Oxidation
zweifache Oxidation
AP
Masse Rt
2120,2
2444,2 16,5
z
m/z
CE
3 815,4
4 611,8
42
33
1756,1
2080,1 21,5 3
1049,6
1373,6 10,1 2
876,5
892,5 20,3 2
908,5 21,8 2
763,4
779,4
2
795,4
2
1087,4 9,4 2
694,0
39
687,3
43
446,7
454,7
20
25
390,2 div.
398,2 div.
544,2 25
Milchprobe erfolgte, wurden die Verdaubedingungen leicht abgeändert (s. Kap. 5.17.1).
Anstelle des Peptids 1664 wurde Peptid 2120 vermessen, das die vollständige Sequenz
von Peptid 1664 enthält.
Die Zuordnung von Peaks mit bestimmten Retentionszeiten zu einzelnen modifizierten Peptiden erfolgte bisher an Hand der im EMS-Scan gemessenen Massenspektren. Diese Zuordnung sollte abgesichert werden. Dazu wurde s1 -Casein aus Sterilmilch isoliert, mit GluC verdaut und die resultierende Peptidmischung mittels HPLC
fraktioniert (vgl. Kap. 3.4.2). Die lyophyllisierten Fraktionen wurden in 60 µl Acetonitril/Wasser (80/20) aufgenommen; wie immer wurden die Fraktionen 3 und 4 sowie 6
und 7 vereinigt. Durch die getrennte Messung einzelner modifizierter Peptide aus dem
Hydrolysat konnte deren Retentionszeit ermittelt werden. So konnte die in Kap. 4.2
ermittelte Zuordnung bestätigt und teilweise erweitert werden.
a
111
Abb. 4.2: Peptid 876 mit zugehörigen Fragmenten
Abb. 4.3: LC-MS/MS-Spektrum des zweifach oxidierten
Peptids 876 (Sequenz KTTMPLW)
4.3.2 Ergebnisse aus den EPI-Scan-Messungen
Wie Abb. 4.3 zeigt, konnte für das zweifach oxidierte Peptid 876 (Sequenz KTTMPLW,
s. Abb. 4.2) die b-Serie b2 bis b6 nachgewiesen werden, jedoch kein zweifach oxidiertes
b-Fragment. Des Weiteren konnte die zweifach oxidierte y-Serie y1 bis y4 detektiert
werden, jedoch kein unmodifiziertes y-Fragment. Dies lässt den Schluss zu, dass hier
Trp199 zweifach oxidiert vorliegt und nicht (oder nur minimal) Met196; anderenfalls
müssten zweifach oxidierte b4- bis b6-Ionen nachweisbar sein. Es wurde kein einfach
oxidiertes Fragment gefunden, was ausschließt, dass Methionin und Tryptophan je einfach oxidiert sind.
Beim einfach oxidierten Peptid 876 konnte ein unmodifiziertes b2-Fragment, sowie
die oxidierte b4- bis b6-Serie nachgewiesen werden, andererseits die unmodifizierten
y1- bis y4-Fragmente und die oxidierten y4- bis y6-Fragmente. Dies zeigt, dass Met196
einfach oxidiert ist.
112
4.3. EPI-Scan
Von Peptid 763 (Sequenz DIKQME, s. Abb. 4.4) konnte bei mehreren verschiedenen
Versuchen weder eine einfache, noch eine zweifache Oxidation nachgewiesen werden.
Eine Lactosylierung von Lys58 konnte hingegen nachgewiesen werden, da b3-, b4- und
b5-Fragmente detektiert wurden, die dem lactosylierten Peptid (nach Wasser- und/oder
Galactosylrestabspaltung) entsprechen. Auch das lactosylierte y4-Fragment war nachweisbar; ebenso die unmodifizierte y1 bis y5-Serie, wobei offensichtlich bei einem Teil
der y4- und y5-Ionen die Modifikation abgespalten worden ist.
Bei Peptid 1049 (Sequenz VFGKEKVNE, s. Abb. 4.5) sollte bestimmt werden, ob
Lys34 oder Lys36 modifiziert ist. Es konnte hier die unmodifizierte y-Serie von y1
bis y8 detektiert werden (vgl. Abb. 4.6), ebenso y4 bis y8 mit Amadoriprodukt nach
Galactosylrest- und Wasserabspaltung. Aus den modifizierten y4- und y5-Fragmenten
kann gefolgert werden, dass Lys36 lactosyliert ist. Zusätzlich konnte die lactosylierte
b5- bis b8-Serie (ebenfalls nach Galactosylrest- und Wasserabspaltung) nachgewiesen
werden; das modifizierte b5-Fragment weist die Modifikation von Lys34 nach. Somit
konnte für Peptid 1049 gezeigt werden, dass beide Lysinreste modifiziert vorliegen.
113
Abb. 4.6: LC-MS/MS-Spektrum von Peptid 1049 (Sequenz VFGKEKVNE).
Quadrat: Lactosylierte b-Serie, Kreis: unmodifizierte y-Serie,
Vollkreis: modifizierte y-Serie
Nach demselben Verfahren wurde Peptid 1756 (s. Abb. 4.7) untersucht. Hierbei konnte die unmodifizierte y-Serie von y1 bis y9 detektiert werden, teilweise nach Wasserabspaltung. Ebenso konnte y7 mit Amadoriprodukt nach Abspaltung des Galactosylrestes
nachgewiesen werden (y6 bei höheren Kollisionsenergien auch), was eine Lactosylierung
von Lys105 zeigt. Ebenso wurde Fragment b6 mit Amadoriprodukt und Wasserabspaltung gefunden, zusätzlich auch nach Abspaltung des Galactosylrestes. Damit ist also
auch Lys102 modifiziert. Da beide Lysinreste hier modifiziert vorliegen, kann über
Lys103 keine Aussage getroffen werden.
114
4.4. Diskussion
a
Peptid 2120 (s. Abb. 4.8) enthält den N-Terminus von s1 -Casein. Eine Modifikation des N-Terminus’ konnte gezeigt werden, da zwei lactosylierte b2-Fragmente (nach
Galactosylrest- und Wasserabspaltungen) detektiert wurden, ebenso wie auch alle folgenden modifizierten b-Ionen bis b17. Daneben konnten die lactosylierten y14- bis y16Fragmente nachgewiesen werden. Damit liegen der N-Terminus und Lys7 modifiziert
vor; ob Lys3 modifiziert ist, konnte daher nicht bestimmt werden.
4.4 Diskussion
Als Probe wurde hier Rohmilch gewählt, die für 2 Stunden bei 99 °C inkubiert worden
war, da bei dieser Probe mit die höchsten Modifikationsraten aufgetreten sind (s. Abb.
3.8).
Die Sequenzierung von Peptiden ist ein gängiges Verfahren. Beispielsweise nutzten
Galliano et al. diese Vorgehensweise, um die erstmals beschriebene genetische Variante
-Casein D in Ziegenmilch zu charakterisieren. Nach tryptischem Verdau der isolierten -Casein-Fraktion und anschließender LC-MS/MS-Vermessung eines bestimmten
Peptids konnte über die resultierenden b- und y-Serien die Position eines Aminosäureaustausches gegenüber -Casein C identifiziert werden, ebenso die beteiligten Aminosäurereste [71].
Wichtig für die Interpretation der Ergebnisse ist hier, dass unmodifizierte Peptide
beim EPI-Scan Q1 nicht passieren konnten; dennoch ergaben sich bei den Messungen
Signale, die unmodifizierten Peptiden entsprechen. Diese entstehen durch Abspaltung
der Modifikation im Q2. Allerdings muss ein Lactulosylrest nicht vollständig abgespalten werden; des Öfteren waren Signale zu beobachten, die Fragmentierungsprodukte
eines Amadoriprodukts darstellten. Im Wesentlichen waren dies Abspaltungen von bis
zu drei Wassermolekülen, Abspaltung des Galactosylrestes aus dem Lactulosylrest, Ammoniakabspaltungen sowie Kombinationen aus diesen Reaktionen. Zusätzlich kommen
mehrere dieser Ionen in verschiedenen Ladungszuständen vor. Durch diese große Zahl
an Veränderungen war einerseits die Auswertung der Spektren sehr komplex, anderer-
b
b
b
115
seits sinkt die Signalintensität, da nicht nur ein Signal, sondern mehrere Signale pro
Modifikation auftreten; diese Tatsache verschlechtert die Nachweisgrenze wesentlich.
a-, c-, x- und z- Fragmente wurden hingegen nur selten beobachtet.
Durch die Fragmentierung konnten je nach Peptid teilweise sehr viele Peaks in den
Massenspektren detektiert werden. Da jede Modifikation wie oben geschildert in mehreren Variationen auftreten kann, ergeben sich schon zufällig einzelne Übereinstimmungen. Daher wurde hier Wert darauf gelegt, dass eine ganze Serie an beispielsweise
b- oder y- Fragmenten nachgewiesen werden konnte. Nur so kann eine Lactosylierung
an einer bestimmten Position sicher nachgewiesen werden.
Auch in der Literatur ist bereits beschrieben worden, dass das Amadoriprodukt bei
MS/MS-Messungen zur Fragmentierung neigt. Montgomery et al. konnten bei der Untersuchung eines lactosylierten Modellpeptids ebenfalls eine zweifache Wasserabspaltung, die Abspaltung eines Hexoserests (Massenunterschied 162 Da) sowie die Kombination aus beidem feststellen; zusätzlich auch die Abspaltung des gesamten Lactulosylrests (Massenunterschied 324 Da). Dennoch ist auch eine Sequenzierung glykierter
Peptide möglich, wodurch der modifizierte Aminosäurerest identifiziert werden kann
[72]. Die Abspaltung eines Hexoserests kann auch zur Identifizierung glykierter Peptide während einer MS/MS-Messung herangezogen werden; dazu wird nach Peptiden
gesucht, die ein Neutralteilchen der Masse 162 Da abspalten (Neutral Loss Scan). Innerhalb von auf diese Weise spezifizierten Peptiden kann dann über Sequenzierung
die genaue Modifikationsstelle bestimmt werden. Im Rahmen solcher Untersuchungen
mit humanem Serumalbumin stellten Gadgil et al. ebenfalls fest, dass die glykierten
Peptide des Hydrolysates teilweise mit den unmodifizierten koeluieren [48].
Als Ergänzung zu Tab. 3.5 ist festzuhalten, dass für s1 -Casein die zweifache Oxidation eines Tryptophanrests nachgewiesen werden konnte, und somit vermutlich die
Bildung des N-Formyl-Kynurenins. Interessanterweise findet die einfache Oxidation des
gleichen Peptids nicht an Trp199, sondern an Met196 statt, welches wiederum nicht
doppelt oxidiert vorzuliegen scheint.
Bezüglich der Peptide mit mehreren möglichen Lactosylierungsstellen konnte gezeigt
werden, dass bei Peptid 1049 beide mögliche Positionen, Lys34 und Lys36, modifiziert
sind. Für die Peptide 2120 und 1756 konnte die Lactosylierung aller jeweils drei möglichen Positionen nicht vollständig aufgeklärt werden; es konnte jedoch das Amadoriprodukt an den jeweils äußeren Positionen nachgewiesen werden: N-Terminus und Lys7,
Lys102 und Lys105. Über Lys79/Lys83 kann leider keine Aussage getroffen werden, da
das Peptid 910 nicht nachweisbar war, vermutlich auf Grund mangelnder Ionisierung.
a
116
4.4. Diskussion
Ebenso kann hier keine Aussage über das Ausmaß der Lactosylierungen an den genannten Positionen getroffen werden; auch das Verhältnis der Umsetzungsraten zweier
modifizierter Aminosäurereste im gleichen Peptid wurde hier nicht bestimmt. Auch
ohne Standards lässt sich ermitteln, welche Position innerhalb eines Peptids die reaktivste ist, indem bei Rohmilch nach geringer Hitzebehandlung untersucht wird, welche
Position zuerst lactosyliert vorliegt.
Der Einsatz der Tandem-Massenspektrometrie eröffnet noch deutlich weiter gehende Möglichkeiten. Zunächst ist eine Vergrößerung der Sequenzabdeckung möglich. Mit
der UHPLC-MS/MS sind auch kleinere Peptide erfassbar, die mittels MALDI-TOFMS nicht nachgewiesen werden konnten. Durch die Existenz mehrfach geladener Ionen
können unter Umständen auch sehr große Peptide vermessen werden. Durch Optimierung der MS/MS-Methode auf diese Peptide ließe sich die Sequenzabdeckung weiter
verbessern.
Darüber hinaus können weitere Modifikationen vermessen werden. Die zweifache
Lactosylierung könnte Aufschluss über die hier noch ungeklärten Lysinreste Lys3 und
Lys103 geben. Wenn diese Modifikation jedoch in deutlich geringerem Umfang als
das Amadoriprodukt auftritt, worauf die MALDI-TOF-MS-Ergebnisse hindeuten, wäre
hierfür wohl eine weitere Optimierung der Methode erforderlich. Im Anschluss könnte
mit dieser empfindlichen Technik nach weiteren Modifikationen wie CML und CEL
gesucht werden. Zudem kann mittels LC-MS/MS relativ, aber auch absolut quantifiziert werden, wenn geeignete Standards zur Verfügung stehen; diese Möglichkeit wurde
bereits in Kap. 3.7 diskutiert.
Alternativ könnte die Fragmentierung mit einer Ionenfalle durchgeführt werden. Die
hier durchgeführte Fragmentierung in Q2 erfolgt durch Stöße mit Gasmolekülen, was
zu Sekundärfragmentierungen und damit zu komplexen Spektren führen kann. In einer
Ionenfalle dagegen erfolgt eine Anregung der Ionen durch eine Resonanzfrequenz, die
vom Masse/Ladung-Verhältnis der Vorläuferionen abhängt. Auch hier erfolgen Stöße
mit Gasmolekülen, allerdings werden die Fragmente nicht weiter fragmentiert, da die
Produktionen wegen ihrer veränderten Masse nicht mehr angeregt werden. Somit ergeben sich Spektren mit weniger Peaks und höheren relativen Intensitäten [73]. Aus
diesem Grund erhielten Shipkova et al. bei der Fragmentierung eines Peptids mit einer linearen Ionenfalle deutlich weniger komplexe Spektren als bei Verwendung eines
Tripelquadrupols [73]. Damit wird die Nachweisgrenze gesenkt, wodurch weitere Modifikationen erfasst werden könnten.
117
5 Material und Methoden
5.1 Geräte
Analysenwaagen
Sartorius, BP 210 S
Mettler Toledo, AG285
Analytische HPLC
Jasco, DG-1580-53 3-Line Degasser
Jasco, LG-1580-02 Ternary Gradient Unit
Jasco, PU-1580 Intelligent HPLC Pump
Jasco, AS-1550 Intelligent Sampler
Jasco, MD-1510 Multiwavelength Detector
Jasco, FP-920 Intelligent Flourescence Detector
Advantec, CHF122SB Fraction Collector
Eppendorf, TC-45 Säulenofen
Jasco, Borwin PDA™ Version 1.50
Agilent, Zorbax 300SB-C8; 4,6 mm x 150 mm; 5 µm
Macherey-Nagel, CC 125/3 Nucleosil 100-5 C8 ec
Polymer Labs, PLRP-S (PS/DVB); 300 Å; 5 µm
Agilent, Zorbax Eclipse XDB-C8;
4,6 mm x 150 mm; 5 µm
HPLC-Säulen Proteintrennung
HPLC-Säule Peptidtrennung
Analytische UHPLC-MS/MS
UHPLC-Säule
Dionex, UltiMate 3000 RS Pump
Dionex, UltiMate 3000 RS Autosampler
Dionex, UltiMate 3000 RS Column Compartment
AB Sciex Instruments, 4000 Q TRAP
AB SCIEX, Analyst Version 1.5.1 © 2010
Waters, Acquity UPLC BEH 300 C18;
2,1 mm x 100 mm; 1,7 µm
119
5. Material und Methoden
Farbscanner
Gelelektrophorese
Kolbenhubpipetten
Kühlgeräte
Lyophylle
MALDI-TOF-MS
Magnetrührer
Oberschalenwaage
pH-Meter
Schüttelwasserbad
Schüttler
Stahlträger
Thermomixer
Ultraschallbad
Vortex-Schüttler
Wasseraufbereitung
Zentrifugen
Canon, CanoScan LiDE 50
BIO-RAD, Mini Protean III
BIO-RAD, PowerPac Basic™
BIO-RAD, VersaDoc Model 4000
BIO-RAD, Quantity One Version 4.6.9
Brand, diverse Größen
Liebherr, Comfort NoFrost (-20 °C, 4 °C)
New Brunswick Scientific, Ultra Low
Temperature Freezer (-80 °C)
Savant, Novalyphe-NL150
Varian, DS 602
Bruker Daltonics® , autoflex®
Bruker Daltonics® , flexControl © Version 2.4
IKAMAG, RCT
Mettler, PM400
Metrohm, 654 pH Meter
Julabo, SW 20
Stuart, gyro-rocker SSL3
Bruker Daltonics, MTP 384 target plate ground steel
Bruker Daltonics, MTP 384 massive target
Eppendorf, Thermomixer comfort
Bandelin Sonorex, Super RK 255 H
VWR
Millipore, Synergy 185
National Labnet Co., Mini Centrifuge C-1200
Hettich, Universal 32 R
Hettich, Universal 16 R
5.2 Chemikalien
Acetonitril (LC-MS Chromasolv® )
30 % Acrylamid / Bis Solution (37,5 / 1)
Alkaline Phosphatase from calf intestine
Ameisensäure (LC-MS grade)
Ammoniumbicarbonat
120
Sigma-Aldrich / Fluka
BIO-RAD
Roche
Sigma-Aldrich
5.2. Chemikalien
Ammoniumdihydrogenphosphat (≥ 99,9 %)
Ammoniumpersulfat (APS)
BioSafe Coomassie
4-Hydroxy- -cyanozimtsäure (CCA) (puriss., p.a.)
Diammoniumhydrogencitrat (≥ 99,0 %)
2,5-Dihydroxyacetophenon (DHAP)
Dinatriumhydrogenphosphat x 2 H2 O
1,4-Dithiothreitol (DTT) (≥ 99 %, p.a.)
EDTA Dinatriumsalz Dihydrat
Glycerin (99,6 %, p.a.)
Guanidin x HCl
Lactose (wasserfrei)
Magnesiumchlorid Hexahydrat
Natriumchlorid
Natriumdihydrogenphosphat x 2 H2 O
Natriumdodecylsulfat (SDS)
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Peptide Calibration Standard II (0,7 kDa - 3,2 kDa)
Trifluoressigsäure (TFA) (99+ %)
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Tris(hydroxymethyl)aminomethan x HCl
Acros
BIO-RAD
BIO-RAD
Bruker Daltonics
Roth
Roth
Acros
Sigma-Aldrich
Merck
VWR / Prolabo
Sigma-Aldrich
BIO-RAD
Bruker Daltonics
Sigma-Aldrich
Acros
Acros
as1-Casein (as-Casein min. 70 %)
b-Casein (min. 90 %)
k-Casein (min. 80 %)
a-Lactalbumin (min. 85 %)
b-Lactoglobulin (min. 85 %)
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Endoproteinase AspN (sequencing grade)
Chymotrypsin (sequencing grade)
-Chymotrypsin (for protein sequencing)
Endoproteinase GluC (Protease V8; sequencing grade)
Trypsin (sequencing grade, modified)
Roche
Roche
Sigma-Aldrich
Roche
Roche
a
a
121
5.3 Verbrauchsmaterialien
Dialyseschläuche
Einmalhandschuhe
Falcons
Filter
Parafilm
Pipettenspitzen
Reaktionsgefäße
Vials
ZentrifugenFiltereinheiten
ZipTips
Roth, Zellutrans; 6,0; MWCO 8.000 Da - 10.000 Da
Kimtech Science Brand, Sterling Nitrile
Sarstedt, Röhre 15 ml bzw. 50 ml
Roth, Rotilabo® -Spritzenfilter; PVDF; unsteril; 0,22 µm;
13 mm
Pechiney Plastic Packaging, Parafilm
Brand
Eppendorf, Safe-Lock Tubes
VWR, 1,5 ml Braunglasvials
Millipore, Amicon Ultra - 0.5 ml 3K
Millipore, ZipTip Pipette Tips C18
5.4 Herstellen von Lösungen
HPLC-Fließmittel
Wenn nicht anders angegeben, wurden folgende Fließmittel für die HPLC-Trennung der
Proteine und der Peptide verwendet: A: Wasser (Millipore) + 0,1 % TFA; B: Acetonitril
+ 0,1 % TFA. Nach dem Durchmischen wurden die Lösungen für etwa 15 Minuten im
Ultraschallbad entgast.
Ammoniumbicarbonatpuffer 25 mM, pH 8,0
Es wurden 0,0988 g Ammoniumbicarbonat in etwa 48 ml bidestilliertem Wasser gelöst.
Der pH-Wert dieser Lösung wurde mit 1%-iger Ammoniaklösung auf pH 8,0 eingestellt.
Anschließend wurde der Puffer mit Wasser im Messkolben auf 50,0 ml aufgefüllt.
Milchpuffer: 10 mM Natriumphosphat, pH 6,8 mit 8 mM NaCl
137,3 mg Natriumdihydrogenphosphat x 2 H2 O, 21,8 mg Dinatriumhydrogenphosphat
x 2 H2 O und 46,8 mg NaCl wurden in etwa 90 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Mit 1N
NaOH wurde der pH-Wert auf 6,8 eingestellt und die Lösung mit Wasser auf 100,0 ml
aufgefüllt.
122
5.4. Herstellen von Lösungen
Phosphatpuffer 25 mM, pH 7,8
440 mg Dinatriumhydrogenphosphat x 2 H2 O wurden in etwa 95 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Mit wenigen Kristallen Natriumdihydrogenphosphat x 2 H2 O wurde der pHWert auf 7,8 eingestellt und das Volumen im Messkolben mit Wasser auf 100,0 ml
ergänzt.
Protein-Denaturierungspuffer: 0,1 M BisTris, pH 6,8
mit 6 M Guanidin
2 g BisTris wurden in etwa 90 ml bidestilliertem Wasser gelöst, mit 2N HCl auf pH 6,8
eingestellt und im Messkolben auf 100,0 ml aufgefüllt. Es wurden 57,4 g Guanidin x HCl,
192,8 mg Natriumcitrat x 5,5 H2 O (entspricht 5,4 mM) und 300,9 mg DTT (entspricht
19,5 mM) eingewogen. Die Einwaagen wurden in etwa 30 ml des obigen BisTris-Puffers
gelöst und auf Raumtemperatur temperiert. Anschließend wurde die Lösung im Messkolben mit BisTris-Puffer auf 100,0 ml ergänzt.
4,5 M Guanidin-Lösung
43,2 g Guanidin x HCl wurden in 100,0 ml HPLC-Fließmittel gelöst (90 % A + 10 % B).
Trenngelpuffer: 1,5 M Tris, pH 8,8
18,171 g Tris wurden in etwa 90 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Mit konz. HCl wurde
der pH-Wert auf 8,8 eingestellt und die Lösung mit Wasser auf 100,0 ml aufgefüllt.
Sammelgelpuffer: 1 M Tris, pH 6,8
6,057 g Tris wurden in etwa 90 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Mit konz. HCl wurde
der pH-Wert auf 6,8 eingestellt und die Lösung mit Wasser auf 50,0 ml aufgefüllt.
10-facher Elektrophoresepuffer: 0,25 M Tris, pH 8,6
15,1 g Tris, 71 g Glycin und 5,0 g SDS wurden in etwa 450 ml bidestilliertem Wasser
gelöst. Der pH-Wert wurde auf 8,6 eingestellt und die Lösung auf 500 ml aufgefüllt.
123
Lämmlipuffer: 0,5 M Tris, pH 8,5
Für die Herstellung des Probenpuffers nach Lämmli [74] wurden 2,5 ml eines 0,5 M
Trispuffers (pH 8,5) mit 2,0 ml Glycerin, 0,31 g DTT, 0,4 g SDS und einer kleinen Spatelspitze Bromphenolblau versetzt. Anschließend wurde die Lösung mit Wasser auf
10,0 ml aufgefüllt.
Entfärbelösung
50 ml Methanol und 75 ml Eisessig wurden mit Wasser auf 1 l ergänzt.
Enzymlösungen
Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Enzymlösungen und Inkubationstemperaturen eingesetzt:
Enzym
Vial-Inhalt
Volumen
Lösungsmittel
AspN
GluC
Trypsin
2 µg
50 µg
25 µg
50 µl
100 µl
50 µl
Wasser
Wasser
HCl, 1mM
Enzymkonzentration
0,04 µg/µl
0,5 µg/µl
0,5 µg/µl
Inkubationstemperatur
37 °C
25 °C
37 °C
5.5 Probenaufreinigung
5.5.1 Entfettung aller Milchproben
Alle Milchproben (Rohmilch, UHT-Milch, Sterilmilch, Kindermilchnahrungen) wurden vor der Untersuchung entfettet. Dazu wurden zweimal ca. 45 ml Milch in zwei
50 ml-Falcons gefüllt und diese bei 4 °C für 1 Stunde mit 3.850 rpm zentrifugiert. Bei
einem Radius von etwa 15 cm ergibt sich: RCF ≈ 2485 · g. Anschließend wurde die oben
schwimmende Fettschicht mit einem Spatel entfernt und verworfen.
5.5.2 ZipTip-Aufreinigung
Trockene Proben wurden in 10 µl 0,1 % TFA gelöst, die Elutionslösung 10 µl 50 % Acetonitril / 0,1 % TFA wurde noch vor der Aufreinigung in Reaktionsgefäße vorgelegt.
Die ZipTips wurden durch zweimaliges Aufziehen von 10 µl Acetonitril befeuchtet
und anschließend zweimal mit 10 µl 0,1 % TFA äquilibriert. Danach wurde die Pro-
124
5.6. Vermessung der Proben mittels MALDI-TOF-MS
be mindestens zehnmal aufgezogen, um die Peptide ans C18-Material zu binden. Zur
Entfernung von Salzen und anderen Störsubstanzen wurden die ZipTips je fünfmal
mit 10 µl 0,1 % TFA und 10 µl 5 % Methanol / 0,1 % TFA gewaschen. Durch mindestens zehnmaliges Aufziehen der Elutionslösung wurden die Peptide vom C18-Material
abgelöst.
Um mögliche Verluste zu minimieren, wurde beim Versuch zur Unterdrückung der
Metalladdukte (s. Kap. 2.7.3) nicht mit 5 % Methanol gewaschen und andererseits mit
60 % Acetonitril eluiert.
5.5.3 Dialyse
Um nicht mittels HPLC vorgereinigte Proben mittels MALDI-TOF-MS vermessen zu
können, mussten diese vorher dialysiert werden. Dies dient dazu, überschüssige Lactose und den Milchpuffer zu entfernen. Beides hätte die Spektrenqualität wesentlich
verschlechtert und das Instrument belastet.
Die Dialyse wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die zu dialysierenden Proben
wurden in die unter 5.3 aufgeführten Dialyseschläuche pipettiert. Diese wurden daraufhin in etwa 2 l bidestilliertes Wasser gehängt. Etwa 5 Stunden wurde unter leichtem
Rühren dialysiert, wobei das Wasser während dieser Zeit mehrfach gewechselt wurde.
Anschließend wurden die Proben bei -80 °C eingefroren und lyophyllisiert.
5.6 Vermessung der Proben mittels MALDI-TOF-MS
5.6.1 Herstellung der Matrices und Spotten
CCA-Matrix
Die CCA-Matrix bestand aus einer 1:1-Mischung einer gesättigten Lösung von 4-Hydroxy- -cyanozimtsäure in 50 % Acetonitril / 0,1 % TFA und einer 10 mM Ammoniumdihydrogenphosphatlösung in 50 % Acetonitril / 0,1 % TFA.
Die Probenlösung wurde mit der Matrix vermischt (Verhältnis s. Kap. 2.3f) - bei
lyophyllisierten Proben wurden 3 µl Matrix in das entsprechende Reaktionsgefäß pipettiert und gut durchmischt - und etwa 0,5 µl der Mischung auf den Stahlträger pipettiert
und an der Luft getrocknet.
a
125
ClCCA-Matrix
a
Die ClCCA-Matrix wurde erhalten, indem 5 mg 4-Chloro- -cyanozimtsäure in 500 µl
60 % Acetonitril / 0,1 % TFA durch Vortexen gelöst wurden.
3 µl dieser Matrix wurden in das Reaktionsgefäß mit der lyophyllisierten Probe gegeben. Nach gründlichem Mischen wurden etwa 0,5 µl auf den Stahlträger pipettiert und
an der Luft getrocknet.
DHAP-Matrix
Zur Herstellung der DHAP-Matrix wurden 7,6 mg (50 µmol) 2,5-Dihydroxyacetophenon
in 375 µl Ethanol suspendiert. Der Matrix wurde Diammoniumhydrogencitrat zugesetzt, um Metallionen abzufangen. Daher wurde eine Stammlösung mit 27 mg Diammoniumhydrogencitrat in 1,5 ml Wasser hergestellt. Von dieser Lösung wurden 125 µl
(10 µmol) zu obiger Suspension hinzugefügt. Die Mischung wurde gevortext, im Ultraschallbad in ca. 10 Minuten gelöst und anschließend wieder gevortext.
Je Probe wurden 3 µl dieser Matrix mit 3 µl 2 %-iger TFA und 3 µl Probenlösung
gemischt, bis eine Trübung erkennbar war. Im Falle lyophyllisierter Proben wurden 2 µl
DHAP-Matrix und 2 µl 2 %-ige TFA in das entsprechende Reaktionsgefäß pipettiert
und gründlich vermischt. Anschließend wurden etwa 0,5 µl der Suspension auf den
Stahlträger pipettiert und an der Luft getrocknet.
5.6.2 Proteindatenbanksuche
Bereits vor der Vermessung wurde ein In-silico-Verdau durchgeführt, also die Vorhersage der erwarteten Peptide am Computer. Eingesetzt wurde hierfür die öffentlich zugängliche Software PeptideMass, zu finden unter www.expasy.org → proteomics → protein sequences (November 2011). Die UniProtKB-Proteinnummer für s1 -Casein lautet
P02662, für -Casein P02666 und für -Lactalbumin P00711. Als Parameter wurden
eingestellt: [M+H]+ als monoisotopische Masse, maximal 3 übergangene Schnittstellen
und die Anzeige von Peptiden größer als 500 Da. Die Cysteine wurden nicht modifiziert
( s1 -Casein und -Casein enthalten kein Cystein).
Als Ergebnis waren die Sequenz der erwarteten Peptide, die Position der Peptide
im Protein und ihre Masse bekannt. Mit diesen Daten wurden die Massenspektren
verglichen.
b
a
126
a
b
a
5.7. Bestimmung des Phosphorylierungsgrades von Caseinen
5.6.3 Parameter
Die Vermessung erfolgte an einem Bruker Daltonics autoflex MALDI-TOF-MS, ausgestattet mit einem Stickstofflaser (337 nm). Die Vermessung der intakten Proteine wurde
mit einer Beschleunigungsspannung von 20 kV und bei einer Verzögerung von 330 ns im
linearen Modus durchgeführt. Die Messung der Peptide erfolgte mit 19 kV Beschleunigungsspannung und 110 ns Verzögerung im Reflektormodus. Proteine wie Peptide
wurden im positiven Modus vermessen; durch Vermessung im negativen Modus hatte
sich bei den eingesetzten Proben keine Verbesserung der Spektren ergeben. Die hier
untersuchten Peptide aus s1 -Casein wiesen keine Phosphorylierungen auf. Kalibriert
wurde für die Peptidmessungen mit dem Bruker Peptide Calibration Standard II, der
einen Massenbereich von 0,7 kDa bis 3,2 kDa abdeckt. Für jedes Massenspektrum wurden 150 Laserpulse auf verschiedene Stellen in einem Spot addiert. Die Laserenergie
wurde bei jeder Vermessung so angepasst, dass das Isotopenmuster der Peaks bei maximaler Signalintensität noch komplett aufgelöst war.
a
5.6.4 Spektrenauswertung
Jedes Massenspektrum wurde mit der Software flexAnalysis © (Version 2.4) von Bruker
Daltonics nachbearbeitet: die Grundlinie wurde abgezogen (Algorithmus: Median; Abplattung 0,8) und die Spektren geglättet (Algorithmus: Savitzky Golay; Breite 0,2 m/z;
1 Zyklus).
Die Auswertung der Massenspektren erfolgte über die Open-Source-Software mMass,
deren jeweils neueste Version (bis 3.12) von www.mmass.org heruntergeladen wurde.
Diese Software, programmiert von Martin Strohalm et al. [75], erlaubt neben der Anzeige der Spektren auch ihre genaue Auswertung. Insbesondere wurden hier gegebenenfalls
die zur relativen Quantifizierung eingesetzten Daten erhoben (s. Kap. 5.15).
5.7 Bestimmung des Phosphorylierungsgrades von
Caseinen
In einem TrisHCl-Puffer (50 mM, pH 7,9 mit 100 mM NaCl und 10 mM MgCl2 ) wurde
-Casein gelöst (1 mg/ml); 60 µl der Lösung wurden mit alkalischer Phosphatase (30 U)
bei 37 °C für 70 min inkubiert. Zusätzlich wurde eine Blindprobe ohne Enzym angesetzt. Im Anschluss wurden die Proben über Zentrifugen-Filtereinheiten aufgereinigt,
a
127
die zunächst zweimal mit Wasser gereinigt wurden. Anschließend wurden die Proben
aufgegeben sowie einmal Wasser und zweimal Ammoniumbicarbonatpuffer; nach jedem
Schritt wurde zentrifugiert (10.700 rpm, 17 °C, 20 min). 3 µl des Überstandes wurden
mit DHAP-Matrix vermischt und mittels MALDI-TOF-MS vermessen (s. Kap. 5.6).
5.8 Bestimmung der Verdaudauer
a
Zur Optimierung der Verdauzeit wurden je 5 µl einer -Casein-Standard-Lösung (2 mg
in 500 µl Phosphatpuffer) mit je 0,5 µg GluC versetzt und für drei sowie fünf Stunden
verdaut. Anschließend wurden die Proben über ZipTips gereinigt (s. Kap. 5.5.2), in
CCA (2 µl Probe und 2 µl CCA-Lösung) auf den Stahlträger pipettiert und mittels
MALDI-TOF-MS vermessen (s. Kap. 5.6).
5.9 Hitzebehandlung von Proben
5.9.1
a-Casein im Milchmodellsystem
a
Als vereinfachtes Modellsystem für Milch wurde -Casein im Milchpuffer erhitzt; dies
erfolgte in zwei Ansätzen, einmal mit und einmal ohne Lactose, um Einflüsse durch
einen möglichen Proteinabbau erkennen zu können. Die Proteinkonzentration wurde
ähnlich der in Milch gewählt, etwa 13 g/l. Es wurden 200 mg -Casein in 15 ml Milchpuffer gelöst, im zweiten Ansatz zusätzlich mit 740 mg Lactose (entspricht etwa 4,6 %).
Diese Lösungen wurden bei 60 °C für 1 d, 5 d, 7 d und 14 d inkubiert. Nach jedem Zeitpunkt sowie als Kontrolle vor der Inkubation („0 d“) wurden je 4 Aliquote (je 150 µl,
entspricht etwa 2 mg -Casein) entnommen und bei -80 °C gelagert.
a
a
5.9.2
b-Casein im Milchmodellsystem
b
Als vereinfachtes Modellsystem für Milch wurde -Casein im Milchpuffer erhitzt; dies
erfolgte ebenfalls in zwei Ansätzen, einmal mit und einmal ohne Lactose. Als Proteinkonzentration wurde hier 8 g/l gewählt. Dieser Gehalt ist etwas geringer als der in Milch
(9 g/l - 11 g/l) (s. Tab. 1.3.2), da versucht wurde, eine Präzipitation von -Casein zu
verhindern. Es wurden 32 mg -Casein in 4 ml Milchpuffer gelöst, im zweiten Ansatz
zusätzlich mit 197 mg Lactose (entspricht etwa 4,7 %). Diese Lösungen wurden bei
60 °C für 1 d, 3 d, 7 d und 14 d inkubiert. Nach jedem Zeitpunkt sowie als Kontrolle vor
b
128
b
5.9. Hitzebehandlung von Proben
b
der Inkubation („0 d“) wurden je 3 Aliquote (je 125 µl, entspricht etwa 1 mg -Casein)
entnommen und bei -80 °C gelagert.
a-Lactalbumin im Milchmodellsystem
Als vereinfachtes Modellsystem für Milch wurde auch a-Lactalbumin im Milchpuffer
5.9.3
erhitzt; auch dies erfolgte in zwei Ansätzen, einmal mit und einmal ohne Lactose.
Die Proteinkonzentration wurde ähnlich der in Milch gewählt, etwa 1,3 g/l. Es wurden
12 mg -Lactalbumin in 9,25 ml Milchpuffer gelöst, im zweiten Ansatz zusätzlich mit
426 mg Lactose (entspricht etwa 4,4 %). Diese Lösungen wurden bei 60 °C für 3 d, 7 d
und 14 d inkubiert. Nach jedem Zeitpunkt sowie als Kontrolle vor der Inkubation („0 d“)
wurden je 3 Aliquote (je 1,54 ml, entspricht etwa 2 mg -Lactalbumin) entnommen und
bei -80 °C gelagert. Um die benötigten Mengen zu erhalten, wurde der beschriebene
Ansatz zweifach durchgeführt.
a
a
5.9.4 Erhitzung von Rohmilch bei 60 °C
Es wurden je 500 µl entfettete Rohmilch in zehn 1,5 ml-Reaktionsgefäße pipettiert. Die
0 d-Proben wurden sofort bei -20 °C eingefroren, die übrigen Reaktionsgefäße wurden
im Schüttelwasserbad bei 60 °C für 1 d, 4 d, 7 d und 14 d inkubiert. Nach der jeweiligen
Inkubationszeit wurden je 2 Reaktionsgefäße auf -20 °C abgekühlt. Alle Proben wurden
bis zur Untersuchung bei -20 °C gelagert.
5.9.5 Erhitzung von Rohmilch bei 99 °C
Es wurden je 500 µl entfettete Rohmilch in zwanzig 1,5 ml-Reaktionsgefäße pipettiert.
Die 0 min-Proben wurden sofort bei -20 °C eingefroren, die übrigen Reaktionsgefäße
wurden gleichzeitig in einem vorgeheizten Thermomixer bei 99 °C unter Schütteln
(400 rpm) inkubiert. Nach 5 min, 11 min, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 5 h, 10 h und 24 h
wurden je 2 Proben aus dem Thermomixer genommen und sofort auf -20 °C abgekühlt.
Alle Proben wurden bis zur Untersuchung bei -20 °C gelagert.
Bei der unabhängigen Dreifachbestimmung wurden je 500 µl entfettete Rohmilch in
fünfzehn 1,5 ml-Reaktionsgefäße pipettiert. Die Reaktionsgefäße wurden in drei verschiedenen Thermomixern für je 20 min, 1 h, 2 h, 5 h und 10 h inkubiert; anschließend
wurden die Proben auf -20 °C abgekühlt und bei -20 °C bis zur Untersuchung aufbewahrt.
129
5.10 Aufarbeitung der im Milchmodellsystem erhitzten
Proteine
Je ein Aliquot der für 7 Tage und 14 Tage bei 60 °C erhitzten Proben wurde dialysiert (s. Kap. 5.5.3), lyophyllisiert und in 500 µl Ammoniumbicarbonatpuffer aufgenommen. Je 5 µl davon (entspricht 20 µg Protein) wurden mit 5 µl GluC versetzt und
für 3 Stunden bei 25 °C verdaut. Anschließend wurden 2 µl des Verdaus mit 14 µl CCAMatrix vermischt und auf einen Stahlträger pipettiert. Die Vermessung erfolgte mittels
MALDI-TOF-MS (s. Kap. 5.6).
5.11 Trennung von Proteinen mittels Gelelektrophorese
(SDS-PAGE)
5.11.1 Herstellung der Gele
Die Gelelektrophorese wurde nach dem Protokoll von Lämmli durchgeführt [74]. Die
hier verwendeten 0,75 mm-Gele bestanden aus einem Sammelgel und einem Trenngel.
Zur Herstellung eines 15%-igen Trenngels wurden 1,15 ml Wasser, 2,45 ml 30 % Acrylamid-Mix, 1,3 ml Trispuffer pH 8,8, 50 µl 10 %-ige SDS-Lösung, 2 µl TEMED und 50 µl
10 %-ige APS-Lösung gemischt. Die Mischung wurde zwischen zwei Glasplatten pipettiert, mit Isopropanol überschichtet und etwa 20 min aushärten gelassen. Anschließend
wurde der Isopropanol abgegossen und die Sammelgelmischung auf das Trenngel pipettiert: 2,1 ml Wasser, 500 µl 30 % Acrylamid-Mix, 380 µl Trispuffer pH 6,8, 30 µl
10 %-ige SDS-Lösung, 3 µl TEMED und 20 µl 10 %-ige APS-Lösung. Ein Kamm zur
Bildung von Geltaschen wurde angebracht. Nach weiteren etwa 20 min war das Gel
polymerisiert; der Kamm wurde entfernt und das Gel über Nacht im Kühlschrank gelagert, um vollständige Polymerisation sicherzustellen und damit Acrylamidaddukte zu
vermeiden.
5.11.2 Durchführung der Gelelektrophorese
Ein bis zwei Gele wurden in eine „Mini Protean III“ - Apparatur (BIO-RAD) eingebaut und diese mit etwa 400 ml 1:10 verdünntem 10-fachem Elektrophoresepuffer
(s. Kap. 5.4) gefüllt. Je Probe wurden 2 µl bis 10 µl der 1:1 bis 1:10 mit Lämmli-Puffer
verdünnten Probenlösung in eine Geltasche pipettiert, ebenso ein Proteinmarker mit
130
5.11. Trennung von Proteinen mittels Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
bekannten Standardverbindungen. Die Entwicklung des Gels erfolgte für 20 min bei
80 V und anschließend für etwa 70 min bei 150 V. Die Elektrophorese wurde beendet,
wenn der Farbstoff aus dem Lämmli-Puffer das Gel verlassen hatte. Das Gel wurde mit
Wasser gewaschen und mit einer Coomassie-Lösung für etwa 20 min gefärbt. Daraufhin
wurde das Gel erneut mit Wasser gewaschen und mit Entfärbelösung (s. Kap. 5.4)
entfärbt, bis der Hintergrund klar wurde. Die Auswertung erfolgte entweder über einen
Farbscanner oder mittels VersaDoc mit zugehöriger Software (s. Kap. 5.1).
5.11.3 Ausschneiden einzelner Banden und In-Gel-Verdau
Der In-Gel-Verdau wurde nach Meltretter et al. [58] durchgeführt, in einigen Punkten
jedoch angepasst. Nach dem Einscannen des Gels wurde die interessierende Bande mit
einem Skalpell herausgeschnitten und zerkleinert (auf etwa 1 mm Kantenlänge). Die
Gelstückchen wurden in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß zweimal mit Wasser gewaschen
und zweimal mit je 100 µl Acetonitril versetzt, das nach kurzer Einwirkzeit mit einer
Pipette wieder entfernt wurde. Es folgte ein Äquilibrierungsschritt mit 100 µl Phosphatpuffer (Herstellung s. Kap. 5.4), der ebenfalls nach kurzer Zeit wieder abpipettiert
wurde. Zur Entfärbung wurden je 100 µl Acetonitril und des Puffers zugegeben und das
Gefäß für etwa 40 min bei Raumtemperatur geschüttelt, bis die Gelstückchen (fast) vollständig entfärbt waren; die Lösung wurde während dieser Zeit mehrfach erneuert. Die
entfärbten Gelstückchen wurden durch zweimalige Zugabe von je 100 µl Acetonitril von
Wasser befreit; nach Abpipettieren des Acetonitrils wurden die Gelstückchen im Abzug
getrocknet. Anschließend wurden 2 µl GluC-Lösung so auf die Gelstückchen pipettiert,
dass die gesamte Lösung von den Gelstückchen aufgenommen wurde. Nach 10 min Inkubation im Kühlschrank zur Quellung des Gels wurde in das Reaktionsgefäß soviel
Phosphatpuffer pipettiert, dass die Gelstückchen bedeckt waren. Inkubiert wurde über
Nacht bei 25 °C. Es wurden auch Versuche mit anderen Enzymen durchgeführt; dabei
wurden beispielsweise 2 µl AspN-Lösung zugegeben und bei 37 °C inkubiert.
Um die Peptide nach dem Verdau aus dem Gel zu eluieren, wurden 100 µl 60 % Acetonitril in das Reaktionsgefäß pipettiert. Die Probe wurde mit dem Vortex gemischt,
15 min stehen gelassen und erneut gemischt. Der Überstand wurde in ein neues
1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Zu den Gelstückchen wurden 100 µl 80 % Acetonitril / 0,1 % TFA pipettiert. Nach Vortexen, 15-minütigem Warten und erneutem
Vortexen wurde der Überstand mit dem ersten vereinigt. Der Prozess wurde mit 100 µl
Acetonitril wiederholt, die mit den bisherigen Elutionslösungen vereinigt wurden. Die
131
Lösungen wurden bei -80 °C eingefroren und an der Lyophylle getrocknet; danach
wurden die Proben mittels ZipTips aufgereinigt (s. Kap. 5.5.2). Die anschließende
Vermessung der Proben erfolgte am MALDI-TOF-MS wie unter 5.6 beschrieben.
5.12 Probenvorbereitung für HPLC-Peptidtrennungen
Hydrolysat von b-Casein
b
Es wurden 4 mg -Casein in 1,5 ml Phosphatpuffer mit GluC verdaut und anschließend
1:10 verdünnt, sodass eine Proteinkonzentration von etwa 270 µg/ml vorlag (rechnerisch
bezogen auf unverdautes Protein). Von dieser Lösung wurden 50 µl wie unter 5.14.4
beschrieben in die HPLC injiziert. Als Fließmittelkomponente B wurde hier reines
Acetonitril eingesetzt. Die Fraktionen wurden lyophyllisiert und wie unter Kap. 5.6
beschrieben mittels MALDI-TOF-MS in DHAP vermessen.
b-Casein
Etwa 240 µg des mit bzw. ohne Lactose inkubierten Proteins wurden in 50 µl Phosphatpuffer mit 10 µl GluC verdaut. Diese Lösungen wurden mit Wasser auf etwa 810 µl
verdünnt (ergibt etwa 300 µg (verdautes) Protein pro Milliliter) und wie oben beschrieben mittels HPLC vermessen.
Hydrolysat von
a
a-Lactalbumin
Es wurden 2 mg -Lactalbumin in 2 ml Ammoniumbicarbonatpuffer (s. Kap. 5.4) gelöst; 200 µl dieser Lösung wurden mit 50 µl AspN-Lösung vermischt und bei 37 °C über
Nacht verdaut. Zur Reduktion von Disulfidbrücken wurden 10 µl 100 mM DTT hinzu
pipettiert und nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur die Lösung so
verdünnt, dass sie etwa 200 µg (verdautes) Protein pro Milliliter enthielt. Je 50 µl der
Verdünnung wurden in die HPLC injiziert.
132
5.12. Probenvorbereitung für HPLC-Peptidtrennungen
a-Lactalbumin
Die Erhitzung der Proben erfolgte wie unter 5.9.3 beschrieben. Je ein Aliquot der sieben
Tage lang mit und ohne Lactose erhitzten Proben wurde dialysiert (s. Kap. 5.5.3), um
überschüssige Lactose und den Milchpuffer zu entfernen, und anschließend lyophyllisiert. Jede Probe enthielt 2 mg -Lactalbumin und wurde in 500 µl Ammoniumbicarbonatpuffer aufgenommen. 11 µl davon (entsprechend etwa 44 µg -Lactalbumin) wurden
nach Zusatz von 187 µl Ammoniumbicarbonatpuffer mit 12 µl AspN-Lösung über Nacht
bei 37 °C inkubiert. Damit ergibt sich eine Konzentration von etwa 210 µg (verdautes)
-Lactalbumin pro Milliliter. Jede Probe wurde mit 2 µl 100 mM DTT etwa 30 min bei
Raumtemperatur inkubiert; 50 µl der Lösung wurden mittels HPLC fraktioniert. Die
HPLC- und Fraktionierungsparameter sind in den Kap. 2.6.3 und 5.13 beschrieben.
Wie dort erwähnt, wurden die einzelnen Fraktionen anschließend lyophyllisiert und in
DHAP und in CCA mittels MALDI-TOF-MS vermessen.
a
a
a
Hydrolysat von
a
as1-Casein
3,5 mg -Casein wurden in Phosphatpuffer gelöst und mit GluC verdaut. Die Lösung
wurde so verdünnt, dass sie etwa 260 µg (verdautes) Protein pro Milliliter enthielt;
50 µl davon wurden in die HPLC injiziert. Die weiteren Parameter sind in Kap. 5.14.4
beschrieben. Die erhaltenen Fraktionen wurden lyophyllisiert und wie unter Kap. 5.6
beschrieben mittels MALDI-TOF-MS in DHAP vermessen.
a-Casein
Es wurden je 60 mg a-Casein ohne und mit 230 mg Lactose in 5 ml Milchpuffer (s. Kap.
5.4) für 7 und 14 Tage bei 60 °C inkubiert. Je ein Aliquot (ca. 2 mg Protein) wurde
dialysiert (s. Kap. 5.5.3) und lyophyllisiert. Die Proben wurden in 500 µl Phosphatpuffer
aufgenommen. Davon wurden 14 µl mit 1 µl GluC-Lösung über Nacht bei 25 °C verdaut.
Jede Probe wurde mit 260 µl Wasser verdünnt; 50 µl der resultierenden Lösung (ca.
200 µg verdautes Protein pro Milliliter) wurden in die HPLC injiziert (Parameter s.
Kap. 5.14.4), die erhaltenen Fraktionen wiederum lyophyllisiert und in CCA mittels
MALDI-TOF-MS vermessen.
133
5.13 HPLC-Peptidtrennung für
a-Lactalbumin
Zum Einsatz kam die in Kap. 5.1 beschriebene Jasco-HPLC-Anlage mit der Zorbax
Eclipse XDB-C8-Säule (Agilent). Die HPLC-Parameter sind in Tab. 5.1 zusammengestellt.
a
Tab. 5.1: Parameter der Peptidtrennung bei -Lactalbumin mittels HPLC
Fließmittel A
Fließmittel B
Fluss
Gradient
Injektionsvolumen
Säulentemperatur
Detektion
Wasser mit 0,1 % TFA
Acetonitril mit 0,1 % TFA
0,5 ml/min
0 min 10 % B; 3 min 10 % B; 8 min 23 % B;
20 min 33 % B; 30 min 44 % B; 43 min 80 % B;
53 min 80 % B; 65 min 10 % B; 75 min 10 % B
50 µl
22 °C
DAD, 220 nm
Alle Fraktionen (s. Kap. 2.6.3) wurden getrennt in 1,5 ml- oder 2 ml-Reaktionsgefäßen
gesammelt, je nach Volumen der Fraktion. Die Reaktionsgefäße wurden bei -80 °C eingefroren und über Nacht lyophyllisiert.
5.14 Auftrennung der Protein- und Peptidmischungen
mittels HPLC
Milchproben wurden aufgetrennt, um die Proteine in Milch voneinander zu trennen und
insbesondere, um s1 -Casein zu isolieren. Zusätzlich wurde nach dem Verdau mit GluC
die resultierende Peptidmischung aufgetrennt, da dies die MALDI-TOF-MS-Spektren
in mehreren Punkten deutlich verbesserte (s. Kap. 2.8). Jeder Lauf der eigentlich analytischen HPLC wurde „präparativ“ genutzt: Das in der Proteintrennung erhaltene
s1 -Casein wurde aufgefangen, lyophyllisiert und für den Verdau eingesetzt. Die bei
der Peptidtrennung erhaltenen Fraktionen wurden ebenfalls aufgefangen, lyophyllisiert
und wie im Folgenden beschrieben zur MALDI-TOF-MS-Messung aufgearbeitet.
a
a
Die Probenaufarbeitung von Milchproben erfolgte nach Bobe et al. [61], wurde jedoch
leicht angepasst. 500 µl einer nach Kap. 5.5.1 entfetteten bzw. 500 µl einer nach Kap.
134
5.14. Auftrennung der Protein- und Peptidmischungen mittels HPLC
Tab. 5.2: Verdünnung der einzelnen Kindermilchproben
Nährmilchprobe
1
Eiweißgehalt
1,3
in g/100 ml
Volumen
341
Guanidin-Lösung in µl
2
3
4
5
6
1,5
1,5
1,5
1,4
1,9
432
432
432
386
614
5.9 erhitzten Milchprobe wurden mit 500 µl Protein-Denaturierungspuffer (s. Kap. 5.4)
vermischt, gevortext und eine Stunde bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Vortexen inkubiert. Anschließend wurde zentrifugiert (5 min, 14.800 rpm, Raumtemperatur)
und aus der Mitte des Überstands wurden 250 µl herauspipettiert, die mit 1.250 µl
4,5 M Guanidin-Lösung (s. Kap. 5.4) verdünnt wurden. Die Lösung wurde gevortext
und durch einen 0,22 µm-Filter in ein Braunglasvial filtriert. Diese Lösung wurde für
die Proteintrennung mittels HPLC eingesetzt.
Die Aufarbeitung der 14 Tage mit und ohne Lactose inkubierten -Casein-StandardProben erfolgte analog. Die Aliquote mit je 2 mg Protein (s. Kap. 5.9) wurden zunächst
lyophyllisiert und anschließend in 166 µl Wasser und 166 µl Protein-Denaturierungspuffer gelöst; damit war die Konzentration der Lösungen ähnlich der bei der Milchaufarbeitung. Es wurde bei Raumtemperatur inkubiert und weiterhin wie oben beschrieben
verfahren.
Der Proteingehalt der untersuchten Kindermilchproben war deutlich geringer als
der der übrigen Milchproben. Um dies auszugleichen, wurden bei der Aufarbeitung der
Säuglingsnahrungen die 250 µl Zentrifugationsüberstand mit einem geringeren Volumen
an 4,5 M Guanidin-Lösung verdünnt. Das je Kindermilchprobe eingesetzte Volumen
hing von ihrem Proteingehalt ab und ist in Tab. 5.2 aufgeführt.
a
5.14.2 HPLC-Proteintrennung
Zum Einsatz kam die in Kap. 5.1 beschriebene Jasco-HPLC-Anlage mit (soweit nicht
anders vermerkt) der Proteinsäule Zorbax 300SB-C8 (Agilent) und dem Fraktionensammler. Die HPLC-Parameter sind in Tab. 5.3 zusammengestellt, angelehnt an die
Trennung von Milchproteinen nach Bonfatti [62]. Die Fraktionen wurden in 15 mlFalcons gesammelt, wobei drei Läufe im jeweils gleichen Falcon gesammelt wurden,
um die Proteinmenge zu erhöhen. Die vier Proben wurden bei -80 °C eingefroren und
über Nacht lyophyllisiert.
135
Tab. 5.3: Parameter der Proteintrennung mittels HPLC
Fließmittel A
Fließmittel B
Fluss
Gradient
0,5 ml/min
0 min 33 % B; 1 min 33 % B; 6 min 35 % B;
10 min 37 % B; 19 min 40 % B; 23 min 41 % B;
29 min 41 % B; 30 min 43 % B; 38 min 45 % B;
40 min 90 % B; 48 min 90 % B; 50 min 33 % B;
60 min 33 % B
Injektionsvolumen
50 µl
Säulenofentemperatur 42 °C
Detektion
DAD, 220 nm
Fraktionensammler
19:42 min - 24:18 min für s1 -Casein-Fraktion
24:19 min - 29:00 min für -Casein-Fraktion
29:01 min - 31:00 min für -Lactalbumin-Fraktion
31:01 min - 38:00 min für -Lactoglobulin-Fraktion
a
b
a
b
5.14.3 GluC-Verdau
a
Die getrocknete s1 -Casein-Probe wurde im Falcon in 230 µl Phosphat-Puffer (s. Kap.
5.4) gelöst (ermöglicht 3 Injektionen mit je 65 µl inklusive der zum Spülen der Injektionsnadel benötigten Probenlösung). Nach gründlichem Mischen wurde die Lösung in
ein 0,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Nach Zusatz von 2 µl GluC-Lösung (s. Kap. 5.4)
wurde über Nacht für 15 Stunden im Thermomixer bei 25 °C unter Schütteln (400 rpm)
inkubiert. Die resultierende Lösung wurde direkt für die Peptidtrennung an der HPLC
eingesetzt.
5.14.4 HPLC-Peptidtrennung
Zum Einsatz kam wiederum die in Kap. 5.1 beschriebene Jasco-HPLC-Anlage mit
der Zorbax Eclipse XDB-C8-Säule (Agilent) und dem Fraktionensammler. Die HPLCParameter sind in Tab. 5.4 zusammengestellt.
Alle Fraktionen wurden getrennt in 1,5 ml- oder 2 ml-Reaktionsgefäßen gesammelt,
je nach Volumen der Fraktion. Die Reaktionsgefäße wurden bei -80 °C eingefroren und
über Nacht lyophyllisiert.
Die Fraktionen 1 und 2 wurden nicht aufgefangen, da Messungen gezeigt hatten,
dass sie keine Peptide enthalten; im Gegenteil war davon auszugehen, dass in diesen
Fraktionen relativ hohe Salzkonzentrationen vorliegen, deren direkte Vermessung das
136
5.14. Auftrennung der Protein- und Peptidmischungen mittels HPLC
Tab. 5.4: Parameter der Peptidtrennung mittels HPLC
Fließmittel A
Fließmittel B
Fluss
Gradient
Injektionsvolumen
Säulentemperatur
Detektion
Fraktionensammler
0,5 ml/min
0 min 5 % B; 3 min 5 % B; 47 min 55 % B;
55 min 95 % B; 59 min 95 % B; 65 min 5 % B;
75 min 5 % B
50 µl
22 °C
DAD, 220 nm
12:30 min - 15:00 min für Fraktion 3
Massenspektrometer hätte belasten können. Fraktion 5 wurde nach den ersten Versuchen auf die Fraktionen 4 und 6 aufgeteilt (s. Kap. 2.6.5).
5.14.5 Aufarbeitung der Fraktionen
Jede Fraktion wurde in 3 µl einer bestimmten Matrix gelöst, die zu den besten Messergebnissen geführt hatte. Aus Kap. 2.7.2 ergibt sich die in Tab. 5.5 gezeigte Zuordnung.
Die Fraktionen 3 und 4 sowie 6 und 7 wurden zu den Proben 3+4 und 6+7 vereinigt
(s. Kap. 2.7.2). Hierzu wurden 3 µl Matrix in das jeweils erste Reaktionsgefäß pipettiert
und nach gründlichem Mischen in das zweite Reaktionsgefäß überführt. Die Vermessung
mittels MALDI-TOF-MS erfolgte wie in Kap. 5.6 beschrieben.
137
Tab. 5.5: Zuordnung der resultierenden Fraktionen zu den enthaltenen Peptiden und
der optimalen Matrix
HPLC-Fraktion
3+4
6+7
6+7
6+7
8
9
10
11
12
Peptid Matrix
910 ClCCA
1664 CCA
1049 CCA
900 CCA
1778 ClCCA
2120 CCA
1756 CCA
902 ClCCA
876 ClCCA
5.15 Relative Quantifizierung
Als Peptid-Modifikationen kommen in dieser Arbeit Oxidation, zweifache Oxidation,
CML sowie das einfache und zweifache Amadoriprodukt in Betracht. Nähere Erläuterungen zu diesen Modifikationen finden sich in Kap. 1.4. Möglich ist auch die Kombination von Oxidation und CML oder Amadoriprodukt. Außerdem lagen einige Peptide
zusätzlich als Natrium-, doppeltes Natrium- oder als Kaliumaddukt vor.
In der zweiten Formel in Kap. 3.6.2 steht also „SI(Modifikation n )“ für die Summe
der Signalintensitäten der Peaks, die zu dieser Modifikation gehören, das sind der
Modifikationspeak selbst, sowie die Signale der Natrium- und Kaliumaddukte und der
Oxidation (im Falle des Amadoriprodukts oder CML). Analoges gilt für das Peptid
und für alle Modifikationen dieses Peptids.
Ziel war, aus den Daten aus den Massenspektren Modifikationsraten zu errechnen.
Dazu wurde Microsoft© Excel 2003 eingesetzt und eine spezialisierte Excel-Vorlage
entwickelt (s. Abb. 5.1).
Das oberste Segment dieser Exceltabelle berechnet immer die Differenz aus der Peakintensität und dem Grundrauschen in Peakumgebung. Die Signalintensität jedes relevanten Peaks wurde in der Software mMass abgelesen, ebenso die obere Grenze des
Grundrauschens in der Umgebung des betreffenden Peaks. Das Ergebnis dieser Differenz wird als („effektive“ Peak-) Höhe ausgegeben. Zur Orientierung sind in der zweiten
Zeile die Massen des Peptids und aller Modifikationen in Dalton angegeben. Im zweiten senkrechten Block werden die Peakhöhe des Peptidpeaks selbst und seine Natriumund Kaliumaddukte sowie die Oxidation und zweifache Oxidation tabelliert. Im dritten
138
5.15. Relative Quantifizierung
Abb. 5.1: Zusammenfassung der Peakintensitäten in Microsoft© Excel und Berechnung
der Modifikationsraten. Erläuterungen siehe Text
Block werden die CML-Modifikation und die Oxidation davon, im vierten Block das
Amadoriprodukt mit allen Natrium- und Kaliumaddukten sowie seiner Oxidation erfasst. Schließlich wird noch die zweifache Lactosylierung eines Peptids gezeigt. Wegen
deren geringer Gehalte konnten hier keine Addukte oder Oxidationen detektiert werden, weshalb diese nicht in der Tabelle aufgeführt sind; Gleiches gilt für die Natriumund Kaliumaddukte von CML. In der letzten Spalte wird die Höhe aller Peaks aufsummiert; auf diesen Wert werden alle einzelnen Peakhöhen bezogen und in Prozent
angegeben. In der siebten Zeile werden die einzelnen Anteile in Gruppen aufsummiert,
die dem unmodifizierten Peptid und Modifikationen davon (Oxidation, zweifache Oxidation, CML, Lactosylierung und zweifache Lactosylierung) entsprechen.
Die beiden folgenden Segmente erlauben die gleichen Bestimmungen für zwei weitere Fraktionierungsexperimente. Die auffällige unterschiedliche Größe der Summen aller
Peakhöhen in der rechten Spalte spiegelt verschiedene durchschnittliche Laserenergien
wider, die bei der MALDI-TOF-MS-Messung eingesetzt wurden. Abschließend werden
139
die Werte zusammengefasst, sowie der Mittelwert, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient aus den drei Experimenten ermittelt und grafisch dargestellt. Diese
Mittelwerte und Standardabweichungen wurden in die in Kap. 3.6 gezeigten Diagramme übernommen.
5.16 Statistik
Es wurde untersucht, ob der Anstieg zwischen zwei Messpunkten signifikant ist. Dazu
wurde ein gepaarter, zweiseitiger Student-t-Test eingesetzt. Die errechneten Signifikanzniveaus sind durch Sternchen symbolisiert: ∗ p < 0,05; ∗∗ p < 0,01; ∗ ∗ ∗ p < 0,001.
5.17 Vermessung von Proben mittels UHPLC-MS/MS
500 µl entfettete Rohmilch wurden für zwei Stunden bei 99°C erhitzt. Für den Verdau
wurden 25 µl erhitzte Rohmilch (bzw. unbehandelte Rohmilch als Vergleich) mit 75 µl
GluC-Lösung (hier 50 µg Glu-C in 1,25ml Phosphatpuffer) versetzt und für 16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Lösung mit 10 µl 1M DTT-Lösung
versetzt und erneut für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden
die Proben mit 890 µl Wasser verdünnt, gevortext und durch einen 0,22 µm-Filter filtriert. Abschließend wurden die Lösungen für die EMS-Messungen 1:5 mit 10 mM DTT
verdünnt; von diesen Lösungen wurden 10 µl injiziert. Bei den EPI-Messungen wurde
nicht mehr verdünnt, jedoch nur 5 µl injiziert.
5.17.2 Parameter
Zum Einsatz kam hier eine UltiMate 3000 RS von Dionex, gekoppelt mit einem 4000
Q TRAP (Linear Ion Trap Quadrupole LC-MS/MS Mass Spectrometer) der Firma AB
Sciex Instruments, jeweils mit den unter 5.1 genannten Komponenten. Die UHPLCParameter sind in Tab. 5.6 zusammengestellt.
Es wurden zwei unterschiedliche Experimente durchgeführt; im EMS-Scan wurden
als Parameter 4 kDa/s und 250 ≤ m/z ≤ 1500 eingestellt. Die Parameter des EPI-Scans
im positiven Modus waren 1 kDa/s und 100 ≤ m/z ≤ 1500. Durch Optimierung von DP
und CE ergaben sich die in Kap. 4.3.1 genannten Werte. CES wurde auf 2 eingestellt.
140
5.17. Vermessung von Proben mittels UHPLC-MS/MS
Tab. 5.6: Parameter der UHPLC
Fließmittel A
Fließmittel B
Fluss
Gradient
Säulenofentemperatur
Wasser mit 0,1 % Ameisensäure
Acetonitril
0,3 ml/min
0 min 5 % B; 5 min 5 % B;
55 min 50 % B; 55,5 min 90 % B; 60 min 90 % B
30 °C
5.17.3 Spektrenauswertung
Die aufgenommenen Daten wurden mit Analyst (s. Kap. 5.1) ausgewertet. Für die
Zuordnung von b- und y-Fragmenten wurde das entsprechende Massenspektrum exportiert und mit mMass weiter bearbeitet. Die Open-Source-Software mMass (Version
3.12, s. Kap. 5.6.4) erlaubte einerseits die Berechnung der theoretischen Masse/LadungVerhältnisse der Fragmente, nachdem die Peptidsequenz, die Endoproteinase und die
auftretenden Modifikationen eingegeben worden waren. Andererseits konnten diese Daten direkt mit den Spektrendaten in Übereinstimmung gebracht werden; identifizierte Peaks wurden entsprechend beschriftet und von Hand nativen und modifizierten
b- bzw. y-Serien zusortiert.
141
6 Zusammenfassung
Milch und Milchprodukte spielen eine bedeutende Rolle in der menschlichen Ernährung. Vor der Abgabe an den Verbraucher wird Milch in den allermeisten Fällen hitzebehandelt, um mikrobielle Stabilität sicherzustellen und die Haltbarkeit zu verlängern.
Allerdings kann diese Hitzebehandlung die in Milch enthaltenen Nährstoffe, unter anderem Kohlenhydrate, Lipide, Proteine und Vitamine, erheblich schädigen. Vitamine
werden durch starke Erhitzung zerstört, bei den Lipiden kann es zu Abbaureaktionen kommen; Proteine können oxidiert werden, denaturieren oder Quervernetzungen
ausbilden. Aus dem Milchzucker Lactose können beispielsweise reaktive Dicarbonyle
entstehen.
Eine wichtige bei der Erhitzung von Milch auftretende Reaktion läuft zwischen der
Lactose und den Milchproteinen ab. Diese sogenannte Maillard-Reaktion führt zu einer
großen Vielfalt unterschiedlicher Produkte. Das erste stabile Zwischenprodukt, das im
Zuge dieser Reaktion gebildet wird, ist das Amadoriprodukt. Dieses entsteht, wenn ein
Lactosemolekül an eine -Aminogruppe eines Lysinrests oder an den N-Terminus eines
Proteins gebunden wird. Dauert die Erhitzung länger an, so bilden sich diverse weitere
Produkte, von Carboxymethyllysin (CML) bis hin zu komplexen, stickstoffhaltigen und
teilweise braun gefärbten Strukturen (Melanoidinen). Diese späten Reaktionsprodukte
werden AGEs genannt. Eine weitere Folge der Maillard-Reaktion ist die Abnahme
der biologischen Wertigkeit von Nahrungsproteinen, da der Anteil an bioverfügbarem
Lysin, einer essentiellen Aminosäure, gesenkt wird. Daher ist es von großer Bedeutung,
industrielle Erhitzungsprozesse zu optimieren, um die Bildung von Maillard-Produkten
und damit den Lysinverlust zu minimieren.
Ein besonderes Milchprodukt ist Kindermilchnahrung, die speziell für die Ernährung
von Säuglingen geeignet ist. Diese Produkte basieren auf Kuhmilch, werden jedoch
durch Zusatz von unter anderem Molkenproteinen und Lactose an Muttermilch angeglichen. Anschließend werden sie intensiv hitzebehandelt, um die Kleinkinder nicht
zu gefährden. Hier wiegt der Verlust an der essentiellen Aminosäure Lysin besonders
schwer, da Säuglinge einen möglichen Mangel im Unterschied zu Erwachsenen nicht
durch eine ausgewogene Ernährung kompensieren können.
e
143
6. Zusammenfassung
Der Fokus dieser Dissertation lag auf dem Nachweis von Maillard-Produkten und
oxidativen Veränderungen der Milchproteine. Ziel war, in Abhängigkeit der Intensität
einer Erhitzung das Ausmaß der Schädigungen eines Milchproteins zu verfolgen. Untersucht wurde hier s1 -Casein, das von allen Milchproteinen am häufigsten vorkommende Protein. Gleichzeitig wurde bestimmt, welche Aminosäurereste von s1 -Casein,
-Casein und -Lactalbumin reaktiv sind und es wurden die Modifikationen identifiziert, die am häufigsten auftreten.
Als Nachweistechnik wurde hier MALDI-TOF-Massenspektrometrie eingesetzt. Um
die genaue Modifikationsstelle bestimmen zu können, wurden die untersuchten Proteine
im Vorfeld enzymatisch durch Endoproteasen partiell verdaut. Für die Caseine hat sich
herausgestellt, dass die Endoprotease GluC das am besten geeignete Verdauenzym ist.
Die Identifikation des Modifikationstyps erfolgte über die Massendifferenz zwischen den
Signalen eines nativen Peptids und des gleichen Peptids mit Modifikation.
-Casein wurde gelelektrophoretisch aus UHT-Milch isoliert, im Gel mit GluC verdaut und mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Es konnten alle erwarteten nativen
Peptide detektiert werden, ebenso wie die Lactosylierung von Lys113 und zwei Oxidationen von Methionin zu Methioninsulfoxid (Met93 und Met109). Unter Anwendung
dieser Methode konnten keine weiteren Modifikationen nachgewiesen werden; auch eine zusätzliche Hitzebehandlung der UHT-Milch vor der Untersuchung führte nicht
zum Nachweis weiterer Modifikationen. Ebenso konnten bei der Untersuchung von
s1 -Casein nur einige wenige Modifikationen detektiert werden.
Deshalb wurde durch eine chromatografische Auftrennung und Fraktionierung der
beim Verdau erhaltenen Peptidmischung die Empfindlichkeit verbessert. Dazu wurde
eine HPLC-Methode etabliert, die die Trennung der Peptide aus dem Hydrolysat von
s1 -Casein ermöglicht; ebenso wurde je eine weitere Methode für die Auftrennung der
Peptide aus den Hydrolysaten von -Casein und -Lactalbumin entwickelt. Die Peptide wurden in mehreren Fraktionen aufgefangen, gefriergetrocknet und anschließend
mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Dabei zeigte sich ein relativ großer Einfluss der
verwendeten Matrix, weshalb für jede s1 -Casein-Fraktion individuell die optimal geeignete Matrix identifiziert und im Folgenden eingesetzt wurde.
Auf diese Weise wurde zunächst das Milchprotein -Lactalbumin untersucht, nachdem es in einem Milchmodellsystem mit Lactose inkubiert worden war. Nach Erhitzung des Proteins für 14 Tage bei 60 °C mit Lactose in milchtypischen Konzentrationen wurde es mit AspN verdaut, die Peptidmischung chromatografisch aufgetrennt,
fraktioniert und mittels MALDI-TOF-MS vermessen. So konnten Amadoriprodukte
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
144
an N-Terminus/Lys5, Lys58/Lys62, Lys79, Lys93/Lys94 und Lys98/Lys108/Lys114
nachgewiesen werden. Allerdings können mit dieser Methode einzelne Lysinreste, die
nach der enzymatischen Hydrolyse im gleichen Peptid lokalisiert sind, nicht unterschieden werden. Die Modifikationen stehen in guter Übereinstimmung mit Literaturdaten.
An den gleichen Positionen (außer Lys93/Lys94) konnten CML-Modifikationen nachgewiesen werden, des Weiteren wurden die Oxidationen von Trp60/Cys61, Met90/Cys91,
Trp104/Cys111 und Trp118/Cys120 detektiert.
Ebenso wurde im Milchmodellsystem mit Lactose für 14 Tage bei 60 °C erhitztes
s1 -Casein untersucht; es konnten an jeweils mehreren Peptiden das Amadoriprodukt
und CML nachgewiesen werden, zusätzlich drei oxidierte Peptide (Positionen siehe
unten). Im Anschluss sollte aus Milchproben isoliertes s1 -Casein vermessen werden.
Zuerst wurde die erforderliche Trennung der Milchproteine durch Gelelektrophorese
realisiert, gefolgt von einem In-Gel-Verdau. Wie sich allerdings zeigte, konnten auf diese Weise deutlich weniger Modifikationen des s1 -Caseins nachgewiesen werden als bei
der Erhitzung im Milchmodellsystem; im Einzelnen die drei oxidierten Peptide und
zwei Lactosylierungen. Daher wurde eine Trennung der Milchproteine mittels HPLC
etabliert. Durch diese Verbesserung konnte die Anzahl der erfassten modifizierten Peptide deutlich erhöht werden, was möglicherweise dadurch erklärt werden kann, dass die
Elution der Peptide aus dem Gel zu größeren Verlusten geführt hat.
Mit dieser hier etablierten Methode wurden anschließend diverse Milchproben vermessen: Bei 60 °C und bei 99 °C hitzeinkubierte Rohmilch, bei 60 °C inkubierter
-Casein-Standard sowie Handelsproben von Rohmilch, UHT-Milch, Sterilmilch und
Kindermilchnahrungen. Alle Proben wurden zuerst entfettet, dann wurde mittels
HPLC s1 -Casein isoliert und dieses mit GluC verdaut. Die resultierende Peptidmischung wurde an der HPLC fraktioniert und die einzelnen Fraktionen wurden mittels
MALDI-TOF-MS vermessen. Diese Methode ergab eine Sequenzabdeckung von 84 %
bei s1 -Casein; es wurden 13 der 14 vorhandenen Lysinreste abgedeckt, ebenso beide
Tryptophanreste und vier der fünf Methioninreste. An Modifikationen konnten einfach
und zweifach oxidierte Peptide, CML und das einfache und zweifache Amadoriprodukt
nachgewiesen werden; bei letzterem ist je ein Lactulosylrest an zwei Lysinreste eines
Peptids (oder an einen Lysinrest und den N-Terminus des Proteins) gebunden.
In s1 -Casein wurden Amadoriprodukte an den Positionen N-Terminus/Lys3/Lys7,
Lys34/Lys36, Lys79/Lys83, Lys102/Lys103/Lys105, Lys124, Lys132 und Lys193 nachgewiesen, das zweifache Amadoriprodukt und CML jeweils an N-Terminus/Lys3/Lys7,
Lys102/Lys103/Lys105 und Lys79/Lys83. Einfache Oxidation zeigten Met123, Met135
a
a
a
a
a
a
a
145
6. Zusammenfassung
und Met196/Trp199, zweifache Oxidation nur Met123 und Met196/Trp199. Während
die Oxidationsprodukte in fast allen Proben detektiert wurden, waren die Amadoriprodukte sowie die CML-Modifikationen abhängig vom Peptid erst nach einer bestimmten Erhitzungszeit nachweisbar. Beispielsweise wurde CML an Lys79/Lys83 erst
nach Inkubation von Rohmilch für sieben Tage bei 60 °C nachweisbar, das zweifache
Amadoriprodukt bereits nach Inkubation für vier Tage.
Die Messdaten ermöglichten neben dem qualitativen Nachweis von Modifikationen
auch die relative Quantifizierung der Hauptmodifikationen des s1 -Caseins. Die dabei
eingesetzte Modifikationsrate wurde folgendermaßen errechnet: Die Signalintensität des
Peaks einer Modifikation wurde geteilt durch die Summe der Signalintensitäten der
Peaks des nativen Peptids und aller zugehöriger Modifikationen.
Bei der relativen Quantifizierung der Modifikationen des s1 -Caseins aus bei 60 °C für
0, 1, 4, 7 und 14 Tage erhitzter Rohmilch ergaben sich je nach Peptid und Modifikation
sehr unterschiedliche Verläufe der einzelnen Modifikationsraten. Bei einigen Peptiden
nahm die Modifikationsrate des Amadoriprodukts während der gesamten Erhitzung zu,
bis auf Werte von etwa 2 % an Lys34/Lys36 und bis 13 % an Lys102/Lys103/Lys105.
Bei anderen Peptiden nahm sie erst zu, bis auf 40 % an N-Terminus/Lys3/Lys7, und
anschließend bei weiter andauernder Erhitzung wieder ab. Ein Grund dafür könnte
die Bildung von CML, einem Abbauprodukt des Amadoriprodukts, sein; hier ergab
sich bei allen modifizierten Peptiden ein Anstieg der Modifikationsrate, auf 0,5 % an
Lys79/Lys83 bis zu 7 % an N-Terminus/Lys3/Lys7. Das zweifache Amadoriprodukt
zeigte auf etwa 2 % ansteigende Modifikationsraten, konnte aber nur an zwei Peptiden
relativ quantifiziert werden. Die Modifikationsraten der einfachen Oxidation erreichten
peptidabhängig 7 % bis 33 %, die der zweifachen Oxidation bis zu 3 %.
Die Erhitzung von Rohmilch bei 99 °C für 0 und 20 Minuten sowie 1, 2, 5 und 10
Stunden wurde in unabhängiger Dreifachbestimmung durchgeführt. Es ergaben sich
Kurvenverläufe, die den oben genannten sehr ähnlich waren. Während auch hier die
Modifikationsrate des Amadoriprodukts mancher Peptide anstieg (auf Werte bis zu
9 %), zeigte sie bei anderen Peptiden ein Maximum von bis zu 36 % nach zwei bzw.
fünf Stunden Erhitzung, abhängig vom jeweiligen Peptid. Für CML wurden auf bis
zu 13 % (an N-Terminus/Lys3/Lys7) zunehmende Modifikationsraten bestimmt. Die
Werte des zweifachen Amadoriprodukts lagen wiederum bei maximal etwa 2 %, jedoch
war diese Modifikation nach 10 Stunden Erhitzung nicht mehr quantifizierbar. Die
einfache Oxidation ergab steigende Modifikationsraten auf bis zu etwa 61 % an Met123,
die Modifikationsrate der zweifachen Oxidation erreichte etwa 6 % an Met196/Trp199.
a
a
146
a
Anschließend wurde s1 -Casein aus Handelsproben untersucht. Die Modifikationsraten des Amadoriprodukts stiegen bei allen Peptiden von Rohmilch über UHT-Milch
bis zur Sterilmilch an. In Rohmilch betrug die maximale Modifikationsrate 0,2 % an
N-Terminus/Lys3/Lys7, bei UHT-Milch 13 %, in Sterilmilch 24 %. Das zweifache Amadoriprodukt und CML konnten nur in manchen Sterilmilchproben an einzelnen Peptiden relativ quantifiziert werden, die Gehalte lagen unter 1,5 %. Die Mediane der Modifikationsraten der einfachen Oxidation lagen proben- und peptidabhängig zwischen
2 % und 30 %, die der zweifachen Oxidation unter 12 %.
Bei den Kindermilchnahrungen wies das Amadoriprodukt Modifikationsraten bis zu
26 % auf. Auch hier ergaben das zweifache Amadoriprodukt und CML nur in manchen
Proben und an einzelnen Peptiden quantifizierbare Werte; diese lagen unterhalb von
1,3 %. Diese Ergebnisse liegen ebenso wie die der einfachen und zweifachen Oxidation
in dem Bereich, in dem die Werte der erhitzten Rohmilchproben liegen. Das zeigt, dass
die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Erhitzungsserien von Rohmilch ein gutes
Modell für die industrielle Erhitzung darstellen.
Einige der untersuchten Peptide enthalten mehrere mögliche Modifikationsstellen,
deren Unterscheidung durch Vermessung mittels MALDI-TOF-MS nicht möglich ist.
Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, welche dieser Positionen
tatsächlich modifiziert sind. Dazu wurde ein Tandem-Massenspektrometer eingesetzt,
das eine Sequenzierung von Peptiden erlaubt. Es wurde für 2 Stunden bei 99 °C hitzebehandelte Rohmilch mit GluC verdaut und die Peptidmischung mittels UHPLC-MS/MS
vermessen. Es wurde ein EPI-Scan (Enhanced Product Ion Scan) durchgeführt, wobei
als Vorläuferionen mehrfach geladene modifizierte Peptide ausgewählt wurden.
Anhand von b- und y-Serien in den resultierenden Fragmentspektren konnte gezeigt
werden, dass in dem Peptid, das Met196 und Trp199 enthält, nur der Tryptophanrest
zweifach oxidiert vorliegt, die einfache Oxidation jedoch am Methioninrest lokalisiert
ist. Bereits gezeigt wurden die Methioninoxidationen von Met123 und Met135 zum Methioninsulfoxid und von Met123 zum Methioninsulfon. Zusätzlich zu den oben genannten Aminosäuren konnte ein Amadoriprodukt an Lys58 nachgewiesen werden. Anhand
weiterer Untersuchungen konnte abschließend die Lactosylierung des N-Terminus und
von Lys7, Lys34, Lys36, Lys58, Lys79/Lys83, Lys102, Lys105, Lys124, Lys132 und
Lys193 in s1 -Casein nachgewiesen werden.
Als wichtigste Modifikationen des s1 -Caseins in thermisch behandelter Milch wurden
das Amadoriprodukt, CML sowie Oxidationsprodukte von Methionin und Tryptophan
identifiziert. Alle Modifikationen wurden positionsspezifisch relativ quantifiziert. Damit
a
a
147
6. Zusammenfassung
erlaubt die Methode, struktur- und positionsspezifische Reaktionskinetiken zu erstellen.
Solche Erkenntnisse können dazu beitragen, Parameter einer industriellen Erhitzung
weiter zu optimieren.
148
7 Summary
Milk and dairy products play an important role in human nutrition. Prior to marketing, milk is usually heat-treated in order to ensure microbial stability and to extend
shelf life. This thermal treatment, however, can degrade nutrients present in milk, such
as carbohydrates, lipids, proteins and vitamins. Severe heat treatment can destroy
vitamins and lipids may undergo degradative reactions. It can be expected that thermal treatment leads to protein denaturation, oxidation and crosslinking. Furthermore,
reactive dicarbonyls can be formed by degradation of lactose.
An important reaction occurring during the heat treatment of milk is the so-called
Maillard reaction. This is a reaction between lactose and milk proteins leading to a
broad variety of different products. First, the carbonyl group of lactose reacts with
either an -amino moiety of a lysine residue or with the N-terminus of a protein,
forming glycosylamine. The latter undergoes Amadori rearrangement leading to the
stable Amadori product. With prolonged heat treatment, a multiplicity of advanced
products is formed, including carboxymethyllysine (CML) as well as complex, nitrogencontaining, partially brown-coloured structures (melanoidins). These late products are
so-called advanced glycation end products (AGEs). The Maillard reaction has a negative impact on the nutrient content of milk and dairy products. This reaction leads
to a decrease of the biological value of dietary proteins due to the loss of biologically
available lysine, which is an essential amino acid. Hence, industrial heating processes
should be optimized in order to minimize the formation of Maillard products and,
consequently, the loss of biologically available lysine.
Infant formulas are particular dairy products, fulfilling as exactly as possible the
nutritional requirements of newborns. Infant formulas are based on cow’s milk, but
they are adapted to the composition of human milk by addition of whey proteins and
lactose. For safety reasons, infant formulas are severely heat treated. In this case, the
loss of the essential amino acid lysine is a serious problem, since newborns cannot
compensate a possible deprivation by a balanced diet.
The focus of this thesis was the analysis of Maillard- and oxidation products of milk
proteins. The aim was to survey the changes of milk proteins as a function of the extent
e
149
7. Summary
a
of a heat treatment. s1 -Casein is the most abundant protein among all milk proteins.
Reactive sites of s1 -casein, -casein, and -lactalbumin as well as the main types of
modifications were identified in a non-targeted approach.
In order to determine the modification sites, the proteins of interest were enzymatically partially digested by GluC or AspN. The resulting peptide mixture was analyzed
by MALDI-TOF-MS. The modification type was identified by the mass difference between the signals of a native peptide and the same peptide with modification.
-Casein was isolated from UHT-milk using gel electrophoresis, followed by in-geldigestion with GluC and analysis by MALDI-TOF-MS. All expected native peptides
were detected, as well as the lactosylation of lys113 and two oxidized methionine residues (met93 and met109). No further modifications were observed using this method;
even an additional heat treatment of UHT-milk did not lead to evidence of further
modifications. An assay of s1 -casein also allowed the detection of only a few modifications.
Therefore, a chromatographic separation and fractionation of the peptide mixture
obtained by protein digestion were established in order to improve sensitivity. For
that purpose, an HPLC-method allowing the separation of the peptides from digested
s1 -casein was developed; two more methods were established, for the separation of
the peptides of digested -casein and -lactalbumin, respectively. The peptides were
collected in several fractions, freeze-dried, and analyzed by MALDI-TOF-MS. The
applied matrix greatly influenced the results and thus, the optimal matrix was identified
for every single fraction of the digested s1 -casein.
-lactalbumin was analyzed as described above after an incubation with lactose at
60 °C for 14 days in a milk model mixture. After the incubation, the modified protein
was digested with AspN and the resulting peptide mixture was separated by HPLC,
fractionated, and analyzed by MALDI-TOF-MS. At N-terminus/lys5, lys58/lys62,
lys79, lys93/lys94, and lys98/lys108/lys114, Amadori products were detected. However, different lysine residues located in the same peptide after enzymatic hydrolysis
cannot be distinguished by this method. These modifications are in good accordance
with literature data. At the same positions, except of lys93/lys94, CML was detected;
besides, an oxidation of trp60/cys61, met90/cys91, trp104/cys111, and trp118/cys120
was found.
s1 -casein was incubated with lactose in the milk model system for 14 days at 60 °C.
The analysis of the incubated protein revealed several modificated peptides: Amadori
products, CML-modifications, and three oxidized side chains (see below for positi-
a
b
a
b
a
a
b
a
a
150
a
a
a
ons). Subsequently, s1 -casein isolated from milk samples was assayed. The required
separation of the milk proteins was achieved by gel electrophoresis, followed by an
in-gel-digestion. Less modifications of s1 -casein than in the milk model system were
detected; only three oxidized peptides and two Amadori products were found. It was
most likely that the elution of the peptides from the gel led to a loss of molecules of
interest. Thus, an HPLC-method was established to separate the milk proteins. This
procedure did clearly increase the number of detected peptides with modifications.
In the following, several milk samples were analyzed with the established method:
Raw milk, incubated at 60 °C and 99 °C, -casein standard protein incubated at 60 °C,
and commercially available samples of raw milk, UHT-milk, sterilized milk, and infant
formulas. All samples were defatted, s1 -casein was isolated by HPLC and digested
using GluC. The resulting peptide mixture was fractionated by HPLC and the fractions
were measured with MALDI-TOF-MS. The method showed a sequence coverage of
84 %, 13 of the 14 lysine residues were covered, as well as both tryptophan residues
and four out of five methionine residues. Identified modifications were singly and doubly
oxidized peptides, CML, the Amadori product, and the twofold Amadori product. The
latter contains two lactulosyl residues bound to either two lysine residues of one peptide,
or to one lysine residue and the N-terminus of the protein.
In s1 -casein, Amadori products were detected at the positions N-terminus/lys3/lys7,
lys34/lys36, lys79/lys83, lys102/lys103/lys105, lys124, lys132, and lys193; CML and
the twofold Amadori product at N-terminus/lys3/lys7, lys102/lys103/lys105, and
lys79/lys83, respectively. Met123, met135, and met196/trp199 were singly oxidized,
Met123 and met196/trp199 also twofold. The oxidative modifications were found in
nearly every sample, whereas the Amadori products and CML-modifications were only
detected after a specific heating time, depending on the analyzed peptide. For example,
CML at lys79/lys83 was not detected until the incubation period reached seven days’
time, the twofold Amadori product was found after an incubation of raw milk at 60 °C
for four days.
Besides the determination of modification sites and modification types, the collected
data allowed a relative quantification of the main modifications. For this purpose, a
modification rate was calculated as follows: the signal intensity of a peak induced by a
modification was divided by the sum of the signal intensities of the peaks of the native
peptide and all its modifications.
The modifications of s1 -casein isolated from heat treated raw milk (0, 1, 4, 7, and
14 days at 60 °C) were relatively quantified; the resulting modification rates showed
a
a
a
a
a
151
7. Summary
different trends, depending on the surveyed modification and peptide. The modification
rate of several Amadori products increased during the entire thermal treatment, up to
values from 2 % (lys34/lys36) to 13 % (lys102/lys103/lys105). For different peptides, the
modification rate increased, up to 40 % on N-terminus/lys3/lys7, and then decreased
with prolonged heat treatment. A reason could be the formation of CML, a degradation
product of the Amadori product. The corresponding modification rate rose up to values
from 0.5 % (lys79/lys83) to 7 % (N-terminus/lys3/lys7). The twofold Amadori product
showed modification rates increasing to 2 %, but it was detected at only two peptides.
The modification rates of the oxidation products reached 7 % to 33 %, depending on
the particular peptide; the ones of the twofold oxidation products up to 3 %.
The incubation of raw milk at 99 °C for 0 and 20 minutes, 1, 2, 5, and 10 hours,
carried out in triplicate, showed trends very similar to the ones mentioned above. The
modification rate of the Amadori products of several peptides increased, up to 9 %,
whereas the rate of other peptides showed a maximum at up to 36 % after two or
five hours of heat treatment, depending on the specific peptide. For CML, modification
rates rising to 13 % at N-terminus/lys3/lys7 were determined. The values of the twofold
Amadori product reached 2 %, whereas this modification could no longer be quantified
after ten hours of thermal treatment. The oxidation yielded increasing modification
rates up to 61 % at met123, the rates of the twofold oxidation reached about 6 % at
met196/trp199.
In the next step, s1 -casein from commercially available milk samples was analyzed.
The modification rates of the Amadori product increased for all peptides from raw
milk via UHT-milk to sterilized milk. The highest modification rate in raw milk was
0.2 % at N-terminus/lys3/lys7, in UHT-milk 13 %, and in sterilized milk 24 %. The
twofold Amadori product and CML could be quantified in some samples of sterilized
milk and only in certain peptides; the values were below 1.5 %. The medians of the
modification rates of the oxidation were between 2 % and 30 %, depending on sample
type and peptide, the ones of the twofold oxidation were below 12 %.
The highest modification rate of the Amadori product in s1 -casein from infant formulas was 26 %. The twofold Amadori product and CML could once again be quantified
only in some peptides deriving from a few products; both showed rates below 1.3 %.
These results, as well as the ones for the oxidations, are within the range containing
the values of the heated raw milk samples. Hence, the thermal treatment of raw milk
samples applied in this study is a valuable model for industrial heat treatment.
a
a
152
Some of the analyzed peptides contain more than one possible reaction site; these
amino acids cannot be distinguished by MALDI-TOF-MS. The aim of the last part of
this work was to determine the positions in a peptide that are actually modified. A
tandem mass spectrometer allowing sequencing of peptides was used for this purpose.
Heat treated raw milk (two hours at 99 °C) was digested with GluC and the resulting
peptide mixture was analyzed by UHPLC-MS/MS. An EPI-Scan (Enhanced Product
Ion Scan) was conducted, using multiply charged modified peptides as precursor ions.
b- and y-series in the resulting fragment spectra proved that trp199 was doubly oxidized, not the methionine residue in the same peptide. Interestingly, the single oxidation
of the same peptide was located at met196, not at trp199. The oxidation of met123
and met135 to methionine sulfoxide and met123 to methionine sulfone have already
been detected by MALDI-TOF-MS. In addition to the amino acids mentioned above,
an Amadori product at lys58 was detected. MALDI-TOF-MS- and further MS/MSexperiments proved the lactosylation of the N-terminus and lys7, lys34, lys36, lys58,
lys79/lys83, lys102, lys105, lys124, lys132, and lys193 in s1 -casein.
Amadori products, CML, and oxidation products of methionine and tryptophan were identified as the most abundant modifications in s1 -casein isolated from thermally
treated milk. All modifications were site-specifically relatively quantified. Consequently, the method established here allows to record structure- and site-specific reaction
kinetics. These findings can contribute to further optimization of the parameters of an
industrial heat treatment.
a
a
153
8 Anhang
8.1 Die 20 proteinogenen Aminosäuren
Tab. 8.1: Die 20 proteinogenen Aminosäuren
Aminosäure
Alanin
Arginin
Asparagin
Asparaginsäure
Cystein
Glutamin
Glutaminsäure
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionin
Phenylalanin
Prolin
Serin
Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin
Dreibuchstabencode
Einbuchstabencode
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
155
8. Anhang
8.2 Enzymatischer Proteinverdau
8.2.1 Enzymatischer In-Silico-Verdau von
Tab. 8.2: Peptide aus dem Verdau von
Masse
MC
Position
8637,49
0
85-156
4909,70
0
1-42
3312,63
2129,02
2051,94
837,35
623,27
593,22
0
0
0
0
0
0
56-84
181-199
157-174
43-50
175-180
51-55
as1-Casein mit AspN
Sequenz
DVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERL
HSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQL
RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEV
FGKEKVNELSK
DIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQKE
DIPNPIGSENSEKTTMPLW
DAYPSGAWYYVPLGTQYT
DIGSESTE
DAPSFS
DQAME
Masse
as1-Casein
as1-Casein mit Trypsin
MC
Position
Sequenz
4716,17
0
152-193
2321,08
2316,14
1767,76
1759,95
1580,83
1384,73
1267,70
910,47
831,38
0
0
0
0
0
0
0
0
0
59-79
133-151
43-58
08-22
106-119
23-34
91-100
125-132
84-90
QFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPN
PIGSENSEK
QMEAESISSSEEIVPNSVEQK
EPMIGVNQELAYFYPELFR
DIGSESTEDQAMEDIK
HQGLPQEVLNENLLR
VPQLEIVPNSAEER
FFVAPFPEVFGK
YLGYLEQLLR
EGIHAQQK
EDVPSER
156
8.2. Enzymatischer Proteinverdau
748,37
689,38
615,33
525,31
0
0
0
0
194-199
37-42
120-124
80-83
TTMPLW
VNELSK
LHSMK
HIQK
Masse
as1-Casein mit GluC im Bicarbonatpuffer
MC
Position
Sequenz
4674,21
0
149-189
2120,17
1778,89
1756,08
1739,87
1664,93
1449,79
1440,70
1049,56
913,48
910,51
902,43
900,47
876,46
858,42
848,44
763,37
757,41
738,32
593,22
579,31
546,24
1
0
0
1
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
01-18
126-141
97-110
111-125
01-14
19-30
85-96
31-39
90-96
78-84
142-148
119-125
193-199
111-118
40-47
56-61
71-77
64-70
51-55
31-35
85-89
LFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFS
DIPNPIGSE
RPKHPIKHQGLPQEVLNE
GIHAQQKEPMIGVNQE
QLLRLKKYKVPQLE
IVPNSAEERLHSMKE
RPKHPIKHQGLPQE
NLLRFFVAPFPE
DVPSERYLGYLE
VFGKEKVNE
RYLGYLE
QKHIQKE
LAYFYPE
RLHSMKE
KTTMPLW
IVPNSAEE
LSKDIGSE
DIKQME
IVPNSVE
SISSSEE
DQAME
VFGKE
DVPSE
157
8. Anhang
GluC im Phosphatpuffer
Masse
2120,17
2051,94
1778,89
1756,08
1739,87
1664,93
1449,79
1440,70
1229,63
1049,56
913,48
910,51
902,43
900,47
876,46
858,42
826,43
763,37
757,41
738,32
648,34
623,27
579,31
158
as1-Casein mit
MC
Position
Sequenz
1
0
0
0
1
0
0
2
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
01-18
158-175
126-141
97-110
111-125
01-14
19-30
85-96
149-157
31-39
90-96
78-84
142-148
119-125
193-199
111-118
182-189
56-61
71-77
64-70
57-61
176-181
31-35
RPKHPIKHQGLPQEVLNE
AYPSGAWYYVPLGTQYTD
GIHAQQKEPMIGVNQE
QLLRLKKYKVPQLE
IVPNSAEERLHSMKE
RPKHPIKHQGLPQE
NLLRFFVAPFPE
DVPSERYLGYLE
LFRQFYQLD
VFGKEKVNE
RYLGYLE
QKHIQKE
LAYFYPE
RLHSMKE
KTTMPLW
IVPNSAEE
IPNPIGSE
DIKQME
IVPNSVE
SISSSEE
IKQME
APSFSD
VFGKE
8.2. Enzymatischer Proteinverdau
8.2.2 Enzymatischer In-Silico-Verdau weiterer Proteine
b
Tab. 8.6: Peptide aus dem Verdau von -Casein mit GluC im Phosphatpuffer
Masse
MC
Position
Sequenz
6011,23
0
132-184
5199,79
1
45-91
4843,62
0
48-91
2794,57
1581,77
1201,73
1092,54
976,55
969,53
911,48
864,43
767,36
738,32
675,33
633,28
628,33
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
1
0
0
185-209
109-121
22-31
122-131
92-100
06-14
101-108
122-129
32-37
15-21
01-05
38-42
06-11
NLHLPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL
SLSQSKVLPVPQKAVPYPQRD
LQDKIHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLT
QTPVVVPPFLQPE
KIHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLT
QTPVVVPPFLQPE
MPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV
MPFPKYPVEPFTE
SITRINKKIE
SQSLTLTDVE
VMGVSKVKE
LNVPGEIVE
AMAPKHKE
SQSLTLTD
KFQSEE
SLSSSEE
RELEE
QQQTE
LNVPGE
159
8. Anhang
a
Tab. 8.7: Peptide aus dem Verdau von -Lactalbumin mit AspN
Masse
2517,18
2188,16
2174,02
2059,00
1646,65
1622,86
1531,63
1252,63
1177,63
1062,61
1034,50
1002,49
637,32
522,29
160
MC
Position
Sequenz
0
0
1
0
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
14-36
97-115
46-63
46-62
63-77
01-13
64-77
01-10
87-96
88-96
116-123
37-45
78-82
78-81
DLKGYGGVSLPEWVCTTFHTSGY
DKVGINYWLAHKALCSEKL
DSTEYGLFQINNKIWCKD
DSTEYGLFQINNKIWCK
DDQNPHSSNICNISC
EQLTKCEVFRELK
DQNPHSSNICNISC
EQLTKCEVFR
DDIMCVKKIL
DIMCVKKIL
DQWLCEKL
DTQAIVQNN
DKFLD
DKFL
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