UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES
INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis DE CÃES
DE BELÉM, PARÁ
CLAUDIA PINHEIRO RUFINO RABÊLO
Belém- Pará
2013
CLAUDIA PINHEIRO RUFINO RABÊLO
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis DE CÃES
DE BELÉM, PARÁ
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários da Universidade Federal do Pará como
requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre
em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador:
Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves
Co-orientador:
Prof. Dr. Andre Marcelo Conceição Meneses
Belém- Pará
2013
CLAUDIA PINHEIRO RUFINO RABÊLO
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis DE CÃES DE
BELÉM, PARÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau
de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador:
Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
Co-orientador:
Prof. Dr. Andre Marcelo Conceição Meneses
Universidade Federal do Pará
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Eduardo José Melo dos Santos
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
Profa. Dra. Elane Guerreiro Giese
Instituto de Saúde e Produção Animal, UFRA
Prof. Dr. Gustavo Góes Cavalcante
Instituto de Medicina Veterinária, UFPA
Prof. Dr. Raimundo Nonato Moraes Benigno (Suplente)
Instituto de Saúde e Produção Animal, UFRA
Belém, 01 de abril de 2013
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para
que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas
Graças a Deus, não sou o que era antes”.
(Martin Luther King)
Ao meu marido Ival e “filhos” Ivy, Smir Neto, Apollo e Príon,
por todo amor e companheirismo ao longo da minha jornada
em busca do aperfeiçoamento profissional.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus, por sempre ter guiado meus passos no caminho
certo, me amparando nos momentos mais difíceis.
Aos meus avós e anjos da guarda, Maria Clara e Alfredo Pinheiro, os verdadeiros
responsáveis por todas as minhas vitórias.
Ao meu marido Ival, por todo o amor, por realizar todos os meus sonhos e,
principalmente, por ser o meu maior incentivador.
Aos meus pais Claudio e Sílvia, pelo amor e dedicação, aos meus irmãos Meg,
Gabriela, Ivy e Beto, pelo companheirismo de sempre e a toda a minha família, por todo o
apoio, incentivo e compreensão.
Ao meu orientador Evonnildo Gonçalves, por ter acreditado em mim quando ninguém
mais acreditou e ter me acolhido como uma filha. Agradeço pelos ensinamentos de biologia
molecular e genética, mas também pelos ensinamentos de ética, profissionalismo e,
principalmente, de como fazer tudo ao mesmo tempo com excelência. Obrigada por ser um
pai amoroso na maioria das vezes e por ser um pai brigão quando precisou ser. Todos os
puxões de orelha vão servir pra que eu me torne uma pessoa melhor e uma profissional
exemplar, assim, que nem o senhor.
Ao meu co-orientador Andre Meneses, por disponibilizar o material para o
desenvolvimento da minha pesquisa (“perfeito!”).
Ao Dr. Manuel Ayres, pela hospitalidade, gentileza, conhecimentos repassados e por
uma análise estatística para ninguém colocar defeito.
Às amigas biólogas Soraya Andrade e Silvanira Barbosa, pela amizade, por toda ajuda
no processamento das amostras e ensinamentos de técnicas moleculares.
Aos professores e amigos do Laboratório de Tecnologia Biomolecular Délia, Pablo,
Thaís, Ruan, Elton, Fábio, Rafaela, Laíse, Marcela, Sanclayver, Bruno, Andrei, Jonathan,
Michele, Cássia, Tássia e Leopoldo, por toda ajuda e companheirismo ao longo desses dois
anos. Em especial ao professor John, pelos constantes ensinamentos e pelo abstract
impecável.
Aos médicos veterinários e funcionários do HOVET – UFRA pela ajuda nas coletas
das amostras.
À Universidade Federal do Pará, ao Programa de Pós Graduação em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários (PPGBAIP) e à coordenação deste, pela oportunidade de
ingresso em um dos cursos de pós graduação mais conceituados no Brasil.
Aos professores do PPGBAIP pelas aulas ministradas e pelos valiosos conhecimentos
compartilhados.
A CAPES pelo suporte financeiro ao longo desses 24 meses de pesquisa.
Ao Dr. Márcio Nunes do Instituto Evandro chagas pelo apoio nas análises de
sequenciamento de DNA.
Aos membros da banca de qualificação Dr. Cláudio Mafra e Dra. Cláudia Portes e aos
da banca de defesa Dr. Eduardo José Melo dos Santos, Dra. Elane Guerreiro Giese e Dr.
Gustavo Góes Cavalcante pelas valorosas contribuições.
Ao meu grupo de estudo Fabrício, Guto, Marcos, Kleber e Poliana. Sem vocês nada
disso estaria acontecendo agora.
Aos meus “filhos” de quatro patas Ivy, Smir Neto, Apollo e Príon, pelo amor
incondicional que só um animal sabe dar.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 11
1.1
HEMOPARASITOSES ANIMAIS................................................................................. 11
1.2
ERLIQUIOSE CANINA ................................................................................................. 11
1.2.1 Taxonomia e histórico ................................................................................................... 11
1.2.2 Vetores ............................................................................................................................ 13
1.2.3 Ciclo biológico ............................................................................................................... 13
1.2.4 Sinais clínicos e laboratoriais ....................................................................................... 14
1.2.5 Prevalência ..................................................................................................................... 15
1.2.6 Diagnóstico, prevenção e tratamento .......................................................................... 19
2
OBJETIVOS .................................................................................................................. 22
2.1
OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 22
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 22
3
MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 23
3.1
AMOSTRAGEM ............................................................................................................ 23
3.2
ANÁLISES MOLECULARES ....................................................................................... 23
3.3
ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 25
4
RESULTADOS.............................................................................................................. 26
4.1
DETECÇÃO E DIVERSIDADE NUCLEOTÍDICA ...................................................... 26
4.2
CORRELAÇÃO COM IDADE, SEXO E PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS ........ 29
5
DISCUSSÃO .................................................................................................................. 31
5.1
DETECÇÃO E FREQUÊNCIA DE PREVALÊNCIA DO DNA DE EHRLICHIA
CANIS EM BELÉM, PARÁ ........................................................................................................ 31
5.2
IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE DE EHRLICHIA EM BELÉM, PARÁ ......................... 32
5.3
CORRELAÇÃO DE INFECÇÃO POR EHRLICHIA
CANIS
COM VARIÁVEIS
HEMATOLÓGICAS E EPIDEMIOLÓGICAS ....................................................................... 33
6
CONCLUSÕES ............................................................................................................. 34
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 35
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 - Mórula de Ehrlichia spp. em neutrófilo canino ...................................... 12
Figura 2 - Carrapato Rhipicephalus sanguineus ...................................................... 14
Figura 3 - Ocorrência de infecção por E. canis em cães no Brasil .......................... 19
Figura 4 - Detecção de E. canis através de nested PCR, em amostras de sangue
total de cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na rotina do
Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia
(UFRA). Linhas 2 a 8 correspondem à primeira reação da PCR, enquanto as
linhas 10 a 16 à segunda reação da PCR; Linhas: 1 e 9 correspondem ao Ladder
100 pb (O’GeneRuler); 2 e 10: controles positivos (Amostra de DNA obtida de
cão parasitado por E. canis); Linhas 8 e 16: controles negativos (sem amostra de
DNA). As setas correspondem ao fragmento de 500 pb do ladder .........................
Tabela 1 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas
por esfregaço sanguíneo no Brasil. Os números entre parênteses correspondem
ao tamanho amostral ................................................................................................
Tabela 2 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas
por testes de ELISA no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao
tamanho amostral .....................................................................................................
Tabela 3 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas
por Reação de Imunofluorescência Indireta no Brasil. Números entre parênteses
correspondem ao tamanho amostral ........................................................................
Tabela 4 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas
por testes moleculares no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao
tamanho amostral .....................................................................................................
Tabela 5 - Identidade nucleotídica par a par do rDNA 16S de Ehrlichia canis de
Belém, Pará e 14 outras cepas de E. canis distribuídas mundialmente ...................
Tabela 6 – Polimorfismo do rDNA 16S de Ehrlichia canis de Belém, Pará em
comparação a 14 outras cepas de E. canis distribuídas mundialmente ...................
Tabela 7 - Associação entre achados hematológicos e resultados da reação em
cadeia da polimerase (PCR), em cães atendidos no período de julho a agosto de
2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural
da Amazônia (UFRA) ..............................................................................................
Tabela 8 - Frequência de cães positivos pela reação em cadeia da polimerase
(PCR) para Ehrlichia canis, segundo faixa etária e sexo, em cães atendidos no
período de julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da
Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA) ..................................................
26
16
17
18
18
27
28
29
30
RESUMO
As hemoparasitoses são doenças causadas por patógenos transmitidos por
vetores hematófagos. Estas se caracterizam por serem enfermidades de grande
importância na Medicina Veterinária, uma vez que acometem várias espécies animais
como cães e gatos. Dentre os hemoparasitos, a Ehrlichia canis é a espécie mais
patogênica e o principal bioagente causador da Erliquiose Monocítica Canina – EMC.
Assim, objetivando detectar e caracterizar molecularmente as cepas do hemoparasito
Ehrlichia spp. circulantes na região metropolitana de Belém, Pará, foram analisadas,
neste trabalho, 200 amostras de sangue total de cães atendidos no Hospital Veterinário
da Universidade Federal Rural da Amazônia (HOVET/UFRA) durante o período de
julho a outubro de 2011. Estas amostras foram escolhidas aleatoriamente, não
necessariamente envolvendo animais com sintomatologia para Erliquiose Monocítica
Canina - EMC. O diagnóstico de EMC foi feito através de um protocolo de nested PCR,
o qual resultou em uma frequência de 24% (48/200) de positividade para os animais
analisados, corroborando a frequência de EMC em estudos realizados em Belo
Horizonte, Nanuque e Londrina. O sequenciamento do rDNA 16S destas amostras
positivas sugere a exclusividade de Ehrlichia canis como o agente causador de EMC em
Belém, Pará. Adicionalmente, a comparação destas sequências com outras sequências
do rDNA 16S de E. canis disponíveis no GenBank, apresentaram de 99,5 a 100% de
identidade, reforçando dados da literatura que sugerem a baixa variabilidade genética
deste biogente. A despeito das análises epidemiológicas e hematológicas, assim como
para a idade e sexo dos animais, não foram observadas correlações estatisticamente
significativas entre a presença de E. canis e parâmetros como anemia, trombocitopenia,
leucopenia e leucocitose, sugerindo que estes não são adequados para o diagnóstico
diferencial de EMC.
Palavras chave: Erliquiose Monocítica Canina, Ehrlichia canis, diagnóstico molecular,
Belém, Amazônia.
ABSTRACT
Haemoparasitoses are diseases that are caused by pathogens transmitted by
haematophagous vectors. These diseases are of great importance in veterinary medicine
because they affect several animal species, such as dogs and cats.
Amongst
haemoparasites, Ehrlichia canis is the most virulent and principal etiologic agent of
Canine Monocytic Ehrlichiosis – CME. In view of this, in the present study, we set out
to characterise Ehrlichia spp. strains circulating in the metropolitan region of Belém –
PA by performing molecular biology analyses in 200 total blood samples obtained from
dogs attending the Veterinary Hospital of the Federal Rural University of Amazonia
(UFRA) during the period from July to October 2011. These samples were chosen
randomly, and were not restricted to animals presenting symptoms of EMC. Conclusive
diagnosis of EMC was achieved by nested PCR specific for the amplification of
Ehrlichia spp. DNA. We found a prevalence of 24% (48/200) among the animals tested,
which corroborates the prevalence of EMC obtained in other studies, carried out in
populations in other Brazilian cities (Belo Horizonte, Nanuque and Londrina).
Sequencing of 16S rRNA DNA coding regions (rDNA) of PCR-positive samples
suggests exclusivity of Ehrlichia canis as the sole etiologic agent of EMC in Belém.
Additionally, comparison of the 16S rDNA obtained in this study to those available in
GenBank yielded nucleotide sequence identities to E. canis 16S rDNA ranging from
99.5% to 100%, which confirms the reports of low variability of this pathogen in the
literature. The diagnosis of CME by nested PCR did not correlate to animal
characteristics such as age or sex, nor to clinical parameters such as presence of
anaemia, thrombocytopenia, leukopenia or leucocytosis, suggesting that these signs are
not adequate semiological markers of CME.
Key words: Canine Monocytic Ehrlichiosis, Ehrlichia canis, molecular diagnosis,
Belém, Amazonia.
11
1
INTRODUÇÃO
1.1
HEMOPARASITOSES ANIMAIS
As hemoparasitoses são doenças causadas por patógenos transmitidos por
vetores hematófagos. Estas se caracterizam por serem enfermidades de grande
importância na Medicina Veterinária, uma vez que acometem várias espécies animais
como cães, gatos, eqüinos, bovinos, etc. As manifestações clínicas destas doenças
podem variar desde imperceptíveis até quadros clínicos graves, sendo letais em alguns
casos (Dawson et al., 1991; Magnarelli & Anderson, 1993; Matthewman et al., 1996).
Embora a ocorrência de hemoparasitoses em equinos, ovinos e bovinos possa ser
responsável por grandes perdas econômicas, há grande interesse da comunidade
científica nas hemoparasitoses dos animais de estimação como cães e gatos, em especial
por que muitas destas doenças têm caráter zoonótico. Dentre os hemoparasitos mais
estudados nestes animais estão aqueles dos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Babesia,
Hepatozoon e Mycoplasma (Magnarelli & Anderson, 1993).
As hemoparasitoses têm sido identificadas como causas crescentes de morbidade
e mortalidade de caninos e, em alguns países, do homem, em virtude da maior
exposição a locais onde é comum a presença de carrapatos (Labruna & Pereira, 2001).
1.2
ERLIQUIOSE CANINA
1.2.1 Taxonomia e histórico
Taxonomicamente, as espécies do gênero Ehrlichia, que são pertencentes à
família Anaplasmataceae e ordem Rickettsiales, são pleomórficas, de crescimento
intracelular obrigatório e consideradas bactérias gram-negativas por não apresentarem
lipopolissacarídeos - LPS e peptidoglicanos. Comparado às espécies do gênero
Rickettsia essas espécies se replicam em vacúolos derivados da membrana celular das
células infectadas, que são principalmente monócitos e neutrófilos. Estes vacúolos
propiciam a formação de mórulas que são visíveis ao microscópio (Oteo & Brouqui,
2005) (Figura 1).
As espécies de Ehrlichia podem infectar cães (Magnarelli & Anderson, 1993),
gatos (Matthewman et al., 1996) e humanos (Dawson et al., 1991; Magnarelli &
Anderson, 1993), embora possam ainda infectar outros hospedeiros como ruminantes e
equinos (Magnarelli & Anderson, 1993).
Ehrlichia canis, causadora da Erliquiose Monocítica Canina – EMC é a espécie
mais patogênica e mais frequente em cães (Jojima et al., 2002; Oteo & Brouqui, 2005).
12
O primeiro relato de EMC foi feito em 1935 na Argélia, tendo como agente etiológico a
Rickettsia canis que foi posteriormente reclassificada como Ehrlichia canis por
Mashkovsky em1945 (Huxsoll et al., 1970).
Figura 1 – Mórula de Ehrlichia spp. em neutrófilo canino (seta). Foto: Raimundo
Nonato Moraes Benigno.
Bool & Sutmöller (1957) relataram a doença em cães da Antilhas e em 1962,
esta foi diagnosticada também na África, Índia, Antilhas holandesas, Sri Lanka e nos
Estados Unidos. Depois disto, novos relatos mostraram a disseminação da doença por
todo o continente americano (Beer, 1988; Corrêa & Corrêa, 1992). Porém, foi somente
depois da guerra do Vietnã que a doença recebeu maior atenção e reconhecimento, isto
depois da morte de 200 a 300 cães militares dos Estados Unidos, diagnosticados como
infectados por E. canis.
No Brasil, o primeiro relato de EMC ocorreu em Belo Horizonte, Minas Gerais
(Costa et al., 1973). Em 1978 houve um surto na cidade de Jaboticabal, São Paulo
(Maregati, 1978 apud Kavinski et al., 1988). Atualmente a EMC têm assumido grande
importância tanto na saúde pública, quanto animal e está disseminada em vários Estados
brasileiros (Macedo & Leal, 2005).
Até o ano de 2009, E. canis era o único táxon do gênero Ehrlichia reconhecido
como agente causador de doenças em cães no Brasil. Porém, com base na amplificação
do 16S rDNA, Oliveira et al. (2009) relataram a ocorrência de Ehrlichia ewingii no
Estado de Minas Gerais, e embora, não havendo a confirmação da espécie por
13
sequenciamento de DNA, este foi o primeiro estudo a fornecer evidências de infecção
por E. ewingii em cães do Brasil.
Tradicionalmente, tanto a E. canis quanto a E. ewingii estão envolvidas em
infecções caninas, porém apenas a primeira possui uma distribuição mundial, um
reflexo do vetor primário Rhipicephalus sanguineus, o carrapato marrom [vermelho] do
cão (Rikihisa, 1991; Breitschwerdt et al., 1998; Dumler et al., 2001).
1.2.2 Vetores
Os vetores classificados de maior importância na transmissão da EMC são os
carrapatos da ordem Ixodides, mais especificamente Rhipicephalus sanguineus, também
conhecido como carrapato marrom [vermelho] do cão, que pertence à família Ixodidae,
subfamília Rhipicephalinae (Figura 2). O papel do R. sanguineus como vetor da doença
foi documentado primeiramente por Donatien & Lestoquard (1935). Mais tarde, este
papel como vetor foi comprovado por estudos experimentais, onde através de nested
PCR (nPCR) foi confirmada a transmissão do parasito para cães livres de E. canis, por
larvas e ninfas adquiridas de cães infectados com este bioagente na sua fase aguda
(Mathew et al., 1996).
Pelo fato desta espécie de carrapato ser de ampla distribuição geográfica e ter
como hospedeiro principal o cão, do qual depende para a sua fonte de nutrição, a mesma
ganha grande importância na disseminação da enfermidade no Brasil e no mundo
(Fortes, 1997; Rosez et al., 2001).
1.2.3 Ciclo biológico
O ciclo da E. canis se dá inicialmente com a infecção dos carrapatos por essa
rickettsia quando estes realizam o repasto sanguíneo em cães que estejam infectados
elas, mais frequentemente durante as primeiras 2-3 semanas de infecção, no momento
em que os leucócitos parasitados são mais abundantes no sangue. Os microorganismos
multiplicam-se nos hemócitos, células do intestino médio e células das glândulas
salivares dos carrapatos infectados, com a transmissão acontecendo no momento que o
carrapato infectado ingere sangue e a infecção ocorrendo através das secreções salivares
que contém o microorganismo (Swango et al, 1992).
No cão, o ciclo da E. canis é dividido em três fases. Inicialmente, ocorre a
penetração de corpos elementares nos monócitos por fagocitose, onde se desenvolvem
14
por dois dias até começarem a multiplicação. Essa etapa tem duração de três a cinco
dias e culmina com a formação do corpo inicial, o qual pode ser visualizado como
inclusões pleomórficas (1,0 a 2,5 μm). Por fim, as mórulas se completam ao longo de 7
a 12 dias, sendo constituídas de corpos elementares envoltos por uma membrana e
permanecendo nas células hospedeiras por até quatro dias, quando ocorre a liberação
das mórulas através da lise celular ou por exocitose. A partir deste momento, tornam-se
livres na circulação passando a infectar novas células do hospedeiro acometido (Rosez
et al, 2001).
Figura 2 - Carrapato Rhipicephalus sanguineus.
1.2.4 Sinais clínicos e laboratoriais
A doença pode incluir três fases: aguda, crônica e subclínica. Na sua fase aguda,
os sinais da EMC incluem depressão, letargia, anorexia, pirexia, linfoadenomegalia,
esplenomegalia e perda de peso. Na fase crônica os sinais mais comuns são tendências a
sangramento, principalmente petéquias e equimoses na pele e nas membranas mucosas,
e epistaxe ocasional. Os sinais oculares não são incomuns e incluem uveíte anterior e
opacidade corneana (Waner et al., 1997). A infecção subclinica é freqüentemente
encontrada e é associada com a persistência do organismo e aumento dos anticorpos
séricos (Huxsoll et al., 1970; Buhles et al., 1974; Stephenson et al., 1975; Kuehn et al.,
1985; Greene & Harvey, 1990; Hoskins, 1991 a, b).
As anormalidades hematológicas mais frequentemente observadas em
infecções naturais são anemia não regenerativa, trombocitopenia e leucopenia (Almosny
et al., 2000). O número de leucócitos comumente varia durante a fase aguda, podendo
diminuir em decorrência da indução ao sequestro destes por mecanismos imunológicos
15
(Moreira et al., 2003) e, nesse caso, a linfocitopenia e eosinopenia são consequências
diretas (Waddle & Littman, 1987).
1.2.5 Prevalência
De acordo com Keefe et al. (1982) a prevalência de Ehrlichia canis varia de
acordo com as condições climáticas. Outros fatores também podem influenciar nesta
prevalência, como a distribuição dos vetores, sobrevivência do animal, média de idade
da população estudada, práticas de manejo e habitat dos animais (Sainz et al., 1996;
Rodriguez-Vivas et al., 2005).
As prevalências mundiais quando a Reação de Imunofluorescência Indireta
(RIFI) foi utilizada como método diagnóstico variam de 36,2% na Turquia (Tuna &
Ulutas, 2009) a 41% na África (Ndip et al, 2007) e nos E.U.A. (Wen et al., 1997).
Baseado em nPCR, foram observados valores de prevalência de 24,7% no Caribe
(Yabsley et al., 2008) e 44% nos E.U.A. (Wen et al., 1997). Lakshmanan et al. (2007),
em uma mesma amostra de 98 cães da Índia encontraram valores de 19,38% de infecção
com base em esfregaço sanguíneo e 50%, com base na nPCR. Isto mostra a maior
sensibilidade do diagnóstico molecular na detecção deste bioagente.
No Brasil, dependendo da população estudada e da técnica utilizada (esfregaço
sanguíneo, ELISA, RIFI e técnicas moleculares), a prevalência de E. canis, varia de 0,7
a 92% (Tabelas 1 a 4). Vale ressaltar que independente da região, as menores
prevalências da infecção por E. canis são sempre aquelas determinadas com base em
testes de esfregaço sanguíneo. A região norte do Brasil possui clima tropical propício à
ocorrência dos vetores, favorecendo o desenvolvimento da doença e infecção de cães
sadios. Porém, segundo Vieira et al. (2011) não existem relatos científicos da ocorrência
de E. canis nesta região do País (Figura 3).
16
Tabela 1 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por
esfregaço sanguíneo no Brasil. Os números entre parênteses correspondem ao tamanho
amostral.
Local
Prevalência (%)
Referência
Jaboticabal – SP (48)
2,00
Oliveira et al. (2000)
Jaboticabal – SP (35)
5,70
Faria et al. (2010)
Botucatu – SP (70)
7,00
Ueno et al. (2009)
Anápolis – GO (53)
5,56
Mundim et al. (2008)
Minas Gerais (101)
16,0
Soares et al. (2006)
Minas Gerais (4407)
5,70
Borin et al. (2009)
Brasília (2952)
0,81
Vasconcelos et al. (2008)
Recife – PE (100)
9,00
Ramos et al. (2009)
Cuiabá – MT (195)
37,9
Sousa (2006)
Campos dos Goytacazes – RJ (1.576)
13,89
Albernaz et al. (2007)
17
Tabela 2 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por
testes de ELISA no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao tamanho
amostral.
Local
Prevalência (%)
Referência
Jaboticabal – SP (52)
92,3
Oliveira et al. (2000)
Jaboticabal – SP (51)
86,2
Oriá et al. (2008)
Jaboticabal – SP (30)
70,0
Nakaghi et al. (2008)
São Paulo (671)
15,5
Labarthe et al. (2003)
Rio de Janeiro (422)
29,6
Labarthe et al. (2003)
Minas Gerais (446)
20,9
Labarthe et al. (2003)
Rio Grande do Sul (356)
1,70
Labarthe et al. (2003)
Paraná (43)
4,70
Labarthe et al. (2003)
Santa Catarina (142)
0,70
Labarthe et al. (2003)
Bahia (117)
35,9
Labarthe et al. (2003)
Ceará (11)
45,5
Labarthe et al. (2003)
Pernambuco (105)
49,5
Labarthe et al. (2003)
Alagoas (11)
54,5
Labarthe et al. (2003)
Mato Grosso do Sul (126)
35,7
Labarthe et al. (2003)
Distrito Federal (101)
23,8
Labarthe et al. (2003)
Londrina – PR (381)
22,8
Trapp et al. (2006)
Ilhéus, Itabuna – BA (200)
36,0
Carlos et al. (2007)
Cajazeiras – BA (203)
41,4
Souza et al. (2010)
Itapuã – BA (269)
31,2
Souza et al. (2010)
18
Tabela 3 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por
Reação de Imunofluorescência Indireta no Brasil. Números entre parênteses
correspondem ao tamanho amostral.
Local
Prevalência (%)
Referência
Jaboticabal – SP (51)
66,6
Oriá et al. (2008)
Jaboticabal – SP (30)
63,3
Nakaghi et al. (2008)
Botucatu – SP (198)
73,2
Diniz et al. (2007)
Minas Gerais (226)
44,7
Costa Jr et al. (2007)
Rio Grande do Sul (389)
4,80
Saito et al. (2008)
Montenegro – RO (314)
31,0
Aguiar et al. (2007)
Salvador - BA (472)
35,6
Souza et al. (2010)
Cuiabá – MT (254)
42,5
Silva et al. (2010)
Tabela 4. Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por
testes moleculares no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao tamanho
amostral.
Local
1
Prevalência (%)
Referência
Botucatu – SP (198)
77,7
Diniz et al. (2007)1
Botucatu – SP (70)
40,0
Ueno et al. (2009)1
Rio de Janeiro – RJ (226)
15,0
Macieira et al. (2005)1
Londrina – PR (129)
22,0
Dagnone et al. (2003)1
Jaboticabal – SP (25)
88,0
Dagnone et al. (2009) 2
Jaboticabal – SP (30)
53,3
Nakaghi et al. (2008) 2
Jaboticabal – SP (40)
72,5
Faria et al. (2010) 2
Botucatu – SP (217)
30,9
Bulla et al. (2004) 2
Ribeirão Preto – SP (221)
38,9
Santos et al. (2009) 2
Ilhéus-Itabuna – BA (153)
7,80
Carvalho et al. (2008) 2
Campo Grande – MS (26)
38,4
Dagnone et al. (2009) 2
Recife - PE (100)
57,0
Ramos et al. (2009) 2
Lavras – MG (97)
1,03
Costa Jr (2007) 3
Belo Horizonte – MG (49)
24,49
Costa Jr (2007) 3
Nanuque – MG (102)
26,47
Costa Jr (2007) 3
Cuiabá – MT (60)
20,0
Sousa (2006)2
PCR, 2nested PCR, 3PCR em tempo real
19
Figura 3: Ocorrência de infecção por E. canis em cães no Brasil. Fonte: adaptado de
Vieira et al. (2011).
1.2.6 Diagnóstico, prevenção e tratamento
O diagnóstico da erliquiose canina geralmente se dá através da observação dos
sinais clínicos, por métodos sorológicos e por meio da detecção do patógeno em
esfregaços sanguíneos (Waner et al., 2001). O diagnóstico pode ser feito também
através da história de exposição a carrapatos, anormalidades hematológicas, aspirados
de tecidos ou através de cultura de células (Rikihisa, 2000).
Em função da gama de enfermidades que podem apresentar os mesmos sinais
clínicos (Rikihisa, 2000), a baixa bacteremia (Harrus et al., 1997), e reações sorológicas
cruzadas entre espécies relacionadas (Rikihisa et al., 1994), os métodos rotineiros de
diagnóstico
supracitados
apresentam
suas
sensibilidades
e/ou
especificidades
comprometidas. Desta forma, diagnósticos mais precisos e rápidos, como os
diagnósticos moleculares, têm sido otimizados (Wen et al., 1997; Martin et al., 2005). A
20
otimização desses diagnósticos ganha grande importância em função do crescente
interesse no estudo dessas rickettsias como agentes causais de infecções em humanos
(Unver et al., 2001; Tami & Tami-Maury, 2004). Com isso, a precisa identificação do
estado de infecção dos cães é um dado cada vez mais significativo.
A PCR convencional ainda possui suas limitações, apresentando sensibilidade
semelhante à cultura de células, RIFI, e Western Blotting, porém, em função da sua
rapidez, comodidade e por ser um diagnóstico direto, este método é utilizado como teste
de acompanhamento ao tratamento (Iqbal et al., 1994; Wen et al., 1997).
Em função dessas limitações da técnica convencional de PCR, outras
ferramentas moleculares derivadas da mesma têm sido desenvolvidas com o objetivo de
aumentar a sensibilidade desta metodologia, como por exemplo, a nPCR, RFLP-PCR e
PCR em tempo real (Murphy et al., 1998; Wen et al., 1997; Dagnone et al., 2003;
Campagner et al., 2004; Labruna et al., 2007).
A vantagem do diagnóstico molecular em relação aos outros, é que neste há a
detecção do DNA do parasito, diferente dos demais diagnósticos que se baseiam na
visualização do próprio organismo ou na detecção da presença de anticorpos contra o
mesmo, causando muitas vezes reações cruzadas com outros organismos, gerando um
resultado falso positivo.
No Brasil, a detecção de E. canis, ainda tem se baseado predominantemente no
diagnóstico direto por meio de esfregaços sanguíneos e indireto através de métodos
sorológicos (Soares et al., 2006; Carlos et al., 2007), dificultando a determinação da
prevalência desses patógenos devido à baixa sensibilidade (Mylonakis et al., 2003) e
especificidade destes métodos, respectivamente (Rikihisa et al., 1994).
Vários são os medicamentos que podem ser utilizados para o tratamento dos
animais acometidos, como as tetraciclinas e seus derivados (doxiclina) que estão entre
os que têm maiores probabilidades de eliminar o agente (Woody & Hoskins, 1991;
Dawson et al., 1991; Dagnone, 2002). Outros medicamentos como o cloranfenicol e o
dipropionato de imidocarb são bastante eficazes no tratamento, principalmente quando
há co-infecção com Babesia spp. (Dagnone et al., 2002; Dagnone et al., 2004), sendo
que a recuperação depende da severidade do caso clínico e do período em que se inicia a
medicação (Troy & Forrester, 1990).
Estudos recentes demonstraram que uma cepa atenuada de E. canis pode
proteger potencialmente cães da EMC e ser utilizada como vacina para esta doença.
Nestes experimentos, cães que recebiam esta cepa atenuada, possuíam sinais clínicos e
21
cargas bacterianas reduzidas após o desafio com uma cepa selvagem de E. canis
(Rudoler et al., 2012).
Estes achados dão suporte a estudos anteriores que sugeriam que esta mesma
cepa poderia ser utilizada na confecção de vacinas para a EMC (Or et al., 2009).
22
2
OBJETIVOS
2.1
OBJETIVO GERAL
Detectar e caracterizar molecularmente as cepas de Ehrlichia spp. circulantes na
região metropolitana de Belém, Pará.
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar a(s) espécie(s) de Ehrlichia circulante(s) em Belém, Pará;

Analisar a associação entre a infecção por Ehrlichia com a idade e sexo dos
cães;

Analisar a associação entre a infecção por Ehrlichia versus alterações
quantitativas de plaquetas, hemácias e leucócitos em cães;

Caracterizar molecularmente a(s) cepas de Ehrlichia spp. de Belém, Pará.
23
3
MATERIAL E MÉTODOS
3.1
AMOSTRAGEM
Um total de 200 amostras de sangue total foi obtido de animais atendidos no
Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural da Amazônia (HOVET/UFRA)
durante o período de julho a outubro de 2011. Estas amostras foram selecionadas
aleatoriamente, não necessariamente envolvendo animais com sintomatologia para
EMC.
Após a coleta de sangue para a realização de hemograma completo, realizado
como rotina do hospital, no Laboratório de Análises Clínicas do HOVET/UFRA, uma
alíquota de sangue total foi enviada ao Laboratório de Tecnologia Biomolecular da
Universidade Federal do Pará (LTB/UFPA). Todas as amostras foram armazenadas a
4ºC até o seu processamento, isto é extração do DNA.
3.2
ANÁLISES MOLECULARES
O DNA total de cada amostra foi extraído através do método fenol-clorofórmio
seguindo procedimentos padrões de Sambrook et al. (1989).
A detecção de Ehrlichia spp. foi realizada com base na amplificação de um
fragmento de aproximadamente 500 pares de bases (pb) do gene ribossomal 16S, cujos
iniciadores foram desenhados para a amplificação de bactérias da família
Anaplasmataceae, enquanto que a identificação de E. canis foi realizada através da
amplificação de um fragmento de aproximadamente 400 pares de bases, também do
gene ribossomal 16S, como um protocolo de nested PCR, cujos iniciadores são
específicos apenas para E. canis.
Assim, foi realizada uma primeira reação de volume total de 25 µL contendo 1020 ng de DNA molde, 2,0 mM de MgCl2, 2,5 mM de cada dNTP, 10 mM de Tris-HCl,
50 mM de KCl, 5 µM de cada iniciador (ECC e ECB [Dawson et al., 1994, 1996]) e 1 U
de Taq DNA polymerase (Invitrogen). A segunda reação, também realizada em um
volume de 25 µL, continha 1 µL do produto da primeira reação, 2,0 mM de MgCl2, 2,5
mM de cada dNTP, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 5 µM de cada iniciador (Ecan
[Murphy et al., 1998] e HE3 [Anderson et al., 1992]). O perfil de amplificação da
primeira reação consistiu de 35 ciclos de 1 min a 94oC, 1 min a 65oC, e 1 min a 72°C,
precedidos por 3 min a 94oC seguidos por 5 min a 72oC. A segunda reação consistiu de
uma etapa de desnaturação de 94oC por 5 min, seguidos de 35 ciclos de 94oC por 1 min,
62ºC por um min e 72oC por um min, com uma extensão final de 72oC por 5 min.
24
O DNA de uma amostra de sangue de cão sabidamente infectada por E. canis foi
utilizada como controle positivo de reação, enquanto que água bidestilada estéril, como
controle negativo. A positividade desta amostra foi confirmada com base no
sequenciamento nucleotídico do fragmento amplificado com os iniciadores Ecan/HE3 e
sua comparação com a sequência EF195134 obtida do GenBank (NCBI –
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Todos os produtos de PCR foram visualizados após eletroforese em gel de
agarose 1,5% em tampão TAE, coloração com o
GelRed™ Nucleic Acid Stain
(Biotium) e visualização através do fotodocumentador E-BOX VX2 (Vilber Lourmat).
Um marcador de peso molecular de 100 pb (O’GeneRuler) e/ou de 1 kb (DNA ladder
Invitrogen®) foi utilizado para estimar o tamanho de cada fragmento amplificado.
Para a confirmação das espécies e cepas circulantes em Belém, todas as amostras
positivas pela PCR foram submetidas à análise segundo o protocolo de Pinyoowong et
al. (2008), o qual permite a amplificação da sequência completa do 16S rDNA. Os
amplicons resultantes deste protocolo foram purificados com auxílio do kit GFX DNA
PCR and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences), então, ligados ao vetor
pGem-T Vector System (Promega) e inseridos em E. coli JM109 (Promega)
quimiocompetente. Em seguida, as amostras foram sequenciadas no Centro de
Inovações Tecnológicas - CIT do Instituto Evandro Chagas - IEC, em analisador
automático de DNA modelo ABI 3500XL (Life Technologies), em conjunção com o Big
Dye Terminator V3.1 kit, seguindo especificações do fabricante. Para a validação das
sequências nucleotídicas cada amostra foi sequenciada com ambos os iniciadores, direto
e reverso. Finalmente, estas foram editadas e alinhadas no programa BioEdit Hall
(1999), o qual foi também utilizado para o cálculo de identidade nucleotídica em
comparação com as sequências nucleotídicas das seguintes cepas obtidas do GenBank
do
NCBI
-
National
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/):
Center
Brazil-CO1
for
Biotechnoloy
(EF195134),
TWN1
Information
(EU106856),
Bangkok (EF139458), VHE (AF373612), VDE (AF373613), GR21 (EF011110), Jake
(CP000107), Brazil-CO2 (EF195135), Oklahoma (M73221), Florida (M73226),
Gzh982 (AF162860), Germishuys (U54805), PDE (DQ915970), 611 (U26740) e
Kagoshima 1 (AF536827).
25
3.3
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os hemogramas obtidos foram analisados para as variáveis hemácias, plaquetas
e leucócitos totais. As mesmas foram analisadas de acordo com Bush (2004) onde
foram considerados anêmicos, leucopênicos e trombocitopênicos os animais que
apresentaram, respectivamente, valores inferiores a 5,5 × 106/mm3 hemácias,
6.000/mm3 leucócitos e 200.000/mm plaquetas. Os animais foram considerados com
leucocitose quando apresentavam valores de leucócitos totais superiores a 17.000/ mm3.
Para a análise estatística dos resultados obtidos, foi utilizado o teste do QuiQuadrado (χ2) e o teste G, com intervalo de confiança de 95%, tendo sido considerados
significativos os resultados com significância P < 0,05.
A avaliação estatística foi feita através da associação do resultado da PCR com
os valores hematológicos obtidos e as variáveis epidemiológicas sexo e idade. Para a
realização dos cálculos estatísticos, os animais foram divididos entre os valores
hematológicos de hemácias maior ou igual a 5,5 × 106/mm3e abaixo de 5,5 × 106/mm3.
Para os Leucócitos foram divididos em menor que 6.000/mm3, de 6.000/mm3 a
17.000/mm3 e maior que 17.000/mm3. Para as plaquetas foram divididos em maior ou
igual a 200.000/mm e menor que 200.000/mm. Já para a variável idade, foram divididos
em 1 a 12 meses, de 12 a 48 meses, acima de 48 meses e idade não determinada.
26
4
RESULTADOS
4.1
DETECÇÃO E DIVERSIDADE NUCLEOTÍDICA
A amplificação de um fragmento de 458 pares de bases na primeira reação
sugeriu a presença do DNA de Ehrlichia em 48 (24%) das 200 amostras de sangue total
analisadas. Nestas 48 amostras foram posteriormente identificadas como positivas para
a presença de E. canis com base na amplificação de um fragmento 398 pares de bases
na segunda reação do protocolo de nested PCR.
A amplificação da sequência completa do 16S rDNA das 48 amostras positivas
para Ehrlichia resultou em amplicons de 1481 nucleotídeos e um único haplótipo, cuja
identidade nucleotídica, em comparação par a par com cepas de E. canis, de várias
regiões do globo terrestre, variou de 99,7 a 100% (Tabelas 5 e 6).
Figura 4 - Detecção de E. canis através de nested PCR, em amostras de sangue total de
cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário
(HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA). Linhas 2 a 8
correspondem à primeira reação da PCR, enquanto as linhas 10 a 16 à segunda reação
da PCR; Linhas: 1 e 9 correspondem ao Ladder 100 pb (O’GeneRuler); 2 e 10:
controles positivos (Amostra de DNA obtida de cão parasitado por E. canis); Linhas 8 e
16: controles negativos (sem amostra de DNA). As setas correspondem ao fragmento de
500 pb do ladder.
27
Tabela 5 - Identidade nucleotídica par a par do rDNA 16S de Ehrlichia canis de Belém, Pará e 14 outras cepas de E. canis distribuídas
mundialmente.
Cepa
Jake
Belém
CO1
TW1
Bangkok
CO2
Oklahoma
Florida
Gzh982
VHE
Germishuys
VDE
PDE
611
Belém
0.999
CO1
0.999
1,000
TW1
0.999
1,000
1,000
Bangkok
0.999
1,000
1,000
1,000
CO2
0.998
0.999
0.999
0.999
0.999
Oklahoma
0.997
0.998
0.998
0.998
0.998
0.997
Florida
0.996
0.997
0.997
0.997
0.997
0.996
0.999
Gzh982
0.997
0.998
0.998
0.998
0.998
0.997
0.996
0.996
VHE
0.999
1,000
1,000
1,000
1,000
0.999
0.998
0.997
0.998
Germishuys
0.998
0.999
0.999
0.999
0.999
0.998
0.997
0.996
0.997
0.999
VDE
0.999
1,000
1,000
1,000
1,000
0.999
0.998
0.997
0.998
1,000
0.999
PDE
0.996
0.997
0.997
0.997
0.997
0.998
0.996
0.995
0.996
0.997
0.996
0.997
611
0.996
0.997
0.997
0.997
0.997
0.996
0.996
0.995
0.996
0.997
0.996
0.997
0.995
Kagoshima
0.998
0.999
0.999
0.999
0.999
0.998
0.997
0.996
0.997
0.999
0.998
0.999
0.996
0.998
GR21
0.999
1,000
1,000
1,000
1,000
0.999
0.998
0.997
0.998
1,000
0.999
1,000
0.997
0.997
Kagoshima
0.999
Código de acesso do GenBanK: Jake (CP000107), CO1 (EF195134), TW1 (EU106856), Bangkok (EF139458), CO2 (EF195135), Oklahoma (M73221), Florida
(M73226), Gzh982 (AF162860), VHE (AF373612), Germishuys (U54805), VDE (AF373613), PDE (DQ915970), 611 (U26740), Kagoshima (AF536827), GR21
(EF011110).
28
Tabela 6 - Polimorfismo do rDNA 16S de Ehrlichia canis de Belém, Pará em comparação 14 outras cepas de E. canis distribuídas
mundialmente.
Cepa de E. canis
País
Número de
acesso no
GenBank
Tamanho
Sítios nucleotídeosa
199 355 386 660 849 876 882 954 981 1014 1240
Belémc
Brasil
1481 pb
G
C
G
A
A
G
C
A
T
C
b
Jake
E.U.A
CP000107
1485 pb
●
●
●
●
●
A
●
●
●
●
●
Brazil-CO1b
Brasil
EF195134
1434 pb
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
TWN1b
Taiwan
EU106856 1623 pb
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
Bangkokc
Tailândia
EF139458
1481 pb
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
b
Brazil-CO2
Brasil
EF195135
1434 pb
●
●
●
●
●
●
T
●
●
●
Oklahomab
E.U.A
M73221
1433 pb
A
●
●
●
●
●
●
●
●
b
Florida
E.U.A
M73226
1433 pb
A
●
●
●
●
●
●
●
●
Gzh982b
China
AF162860
1483 pb
●
●
●
●
●
●
●
●
T
VHEc
Venezuela
AF373612
1408 pb
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
d
Germishuys
África do Sul U54805
1447 pb
●
●
●
●
●
●
●
●
●
VDEb
Venezuela
AF373613
1408 pb
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
PDEb
Peru
DQ915970 1318 pb
●
●
●
G
●
●
T
●
C
●
611b
Israel
U26740
1308 pb
●
●
S
●
●
●
●
C
●
●
b
Kagoshima 1
Japão
AF536827
1387 pb
●
●
●
●
●
●
●
C
●
●
GR21b
Grécia
EF011110
1379 pb
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
a
Os números representam a posição da cepa de E. canis “Belém”; ● mesma base da cepa de E. canis “Belém”; - deleção; S = G ou C;
b
Isolados obtido de humanos;
c
Isolados obtido de cães;
d
Isolado obtido de ovelha.
1266
C
●
●
●
●
●
●
T
●
●
●
●
●
●
●
●
1309
G
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
A
●
●
29
4.2
CORRELAÇÃO COM IDADE, SEXO E PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS
Dentre os 48 animais positivos para E. canis, 9 apresentavam anemia, 7
trombocitopenia, 2 leucocitose, 9 anemia e trombocitopenia, 3 anemia e leucocitose, 1
anemia e leucopenia, 6 anemia, trombocitopenia e leucopenia, 2 anemia,
trombocitopenia e leucocitose e 9 animais apresentaram parâmetros hematológicos
normais (Tabela 7).
Não foram observadas correlações estatisticamente significativas entre esses
parâmetros hematológicos e a infecção por Ehrlichia canis (Tabela 7). Contudo, sem
correção de Yates, a variável trombocitopenia apresentou valor de P igual a 0,04.
Nenhuma correlação foi observada entre a presença de Ehrlichia canis e a idade ou sexo
dos animais (Tabela 8).
Tabela 7 - Associação entre achados hematológicos e resultados da reação em cadeia
da polimerase (PCR), em cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na
rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia
(UFRA).
Exames
Hematológicos
Cães
n
PCR positivos
χ2
P
3,776
0,07
1,797
0,40
4,306
0,05
%
Hemácias
≥ 5.500
102
17
16,7
< 5.500
98
31
31,6
< 6.000
18
7
38,9
6.000 – 17.000
142
34
23,9
> 17.000
40
7
17,5
≥ 200.000
136
25
18,4
< 200.000
64
23
35,9
Leucócitos
Plaquetas
30
Tabela 8 - Frequência de cães positivos pela reação em cadeia da polimerase (PCR)
para Ehrlichia canis, segundo faixa etária e sexo, em cães atendidos no período de
julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade
Federal Rural da Amazônia (UFRA).
Idade
(meses)
Número de cães positivos/ número de cães testados (% positivos)
Machos
Fêmeas
Total
1 a 12
5/17 (29,4)
0/11 (0,0)
5/28 (17,8)*
>12 a 48
1/5 (20,0)
1/7 (14,3)
2/12 (16,7)*
>48
9/38 (23,7)
23/69 (33,3)
32/107 (29,9)*
Não determinada
3/21 (14,3)
6/32 (18,7)
9/53 (17,0)*
Total
18/81 (22,2)**
30/119 (25,2)**
48/200 (24,0)
* P > 0,05; ** P > 0,05
31
5
DISCUSSÃO
5.1
DETECÇÃO E FREQUÊNCIA DE PREVALÊNCIA DO DNA DE Ehrlichia
canis EM BELÉM, PARÁ
Este estudo demonstrou a presença de DNA de E. canis em cães de uma
população hospitalar de Belém, Pará. Embora não haja nenhum relato científico da
ocorrência e prevalência de Ehrlichia spp. na região norte brasileira a frequência de
animais positivos em Belém, com base em testes moleculares, parece ser semelhante
àquela descrita para algumas outras regiões do Brasil. Costa Jr (2007) observou uma
frequência de positividade igual a 24,49 e 26,47% em Belo Horizonte e Nanuque Minas Gerais, respectivamente. Dagnone et al. (2003) observaram uma frequência do
DNA de E. canis em 21% de uma amostra de 129 cães de Londrina, Paraná.
Por outro lado, a prevalência do DNA de E. canis detectada por diagnósticos
moleculares no Brasil pode variar de 1,03% a 88% (Dagnone et al., 2003; Bulla et al.,
2004; Macieira et al., 2005; Sousa, 2006; Costa Jr, 2007; Diniz et al., 2007; Carvalho et
al., 2008; Nakaghi et al., 2008; Dagnone et al., 2009; Ramos et al., 2009; Santos et al.,
2009; Ueno et al., 2009; Faria et al., 2010).
Embora não existam informações para outras partes da região norte brasileira, os
dados do presente estudo refutam a hipótese de que devido suas condições climáticas
esta região devesse apresentar prevalência de infecção superior àquelas observadas para
as regiões Sul e Sudeste por exemplo. Devido sua localização, a qual é situada às
margens da Baía do Guajará (01°26’06”S; 48°26’16”W) e a uma distância de
aproximadamente 100 Km do Oceano Atlântico, de acordo com a classificação de
Köppen, Belém pertence ao grupo Af, possuindo clima quente e úmido, com
temperatura média de 26ºC e umidade relativa do ar variando entre 80 a 90% (Abreu et
al., 2004), o que deve favorecer o ciclo biológico do carrapato em todos os meses do
ano, e consequentemente o aumento da prevalência de E. canis.
Adicionalmente, com base nos índices pluviométricos, a cidade de Belém é
caracterizada por dois períodos distintos, o chuvoso que se estende de dezembro a maio
e o menos chuvoso que vai de junho a novembro. Assim, considerando que estudo se
baseou apenas em amostras coletadas de julho a outubro, é interessante notar a
necessidade de estudos que avaliem diferenças sazonais quanto à prevalência de E.
canis em Belém.
32
5.2
IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE DE Ehrlichia EM BELÉM, PARÁ
A nested PCR constitui um método de diagnóstico altamente sensível e
específico além de ser uma forma rápida de detecção do parasito para diagnósticos
clínicos e estudos epidemiológicos. Considerando que os iniciadores utilizados na
primeira reação do protocolo de nested PCR utilizado no presente estudo amplifica um
fragmento de tamanho semelhante para vários táxons da família Anaplasmataceae, este
pode ser útil para a detecção de todas as espécies de Ehrlichia, dentre outros
microrganismos. Contudo, neste estudo, as 48 amostras positivas para a primeira reação
foram também positivas para a segunda reação, a qual utiliza iniciadores específicos
para E. canis, sugerindo a ocorrência exclusiva de E. canis em Belém, Pará.
Oliveira et al. (2009) sugere a ocorrência de Ehrlichia ewingii no Estado de
Minas Gerais, mas até o presente momento nenhum estudo, baseado no sequenciamento
de DNA, confirmou a ocorrência desta espécie no Brasil. O presente estudo favorece a
hipótese de que a EMC no Brasil seja causada exclusivamente por E. canis, e que a
observação de Oliveira et al. (2009) seja resultante de amplificação inespecífica. Isso
reforça a necessidade do sequenciamento de DNA para a confirmação da espécie nos
estudos de EMC. Adicionalmente, estes estudos devem ser baseados em grandes
tamanhos amostrais e envolver amostragem em ampla distribuição geográfica.
A exclusividade de E. canis, nas amostras testadas, em Belém, Pará foi
confirmada através do sequenciamento do rDNA 16S, que mesmo tendo sido
amplificado com iniciadores genéricos para cinco espécies de Ehrlichia e cinco de
Anaplasma, somente um haplótipo foi identificado nas 48 amostras positivas deste
estudo. Adicionalmente, este haplótipo apresentou de 99,7 a 100% de identidade com
diferentes cepas de E. canis, inclusive duas oriundas da região sudeste brasileira. É
interessante notar que apesar de um baixo nível de polimorfismo (Aguirre et al., 2006;
de la Fuente et al., 2006; Yu et al., 2007), o rDNA 16S é, atualmente, considerado o
melhor alvo para distinguir as diferentes cepas de E. canis (Unver et al., 2001).
Diniz et al. (2007) e Ueno et al. (2009) utilizaram o método da PCR
convencional para posterior confirmação da espécie E. canis por sequenciamento. Este
método, apesar de seguro, não se mostra interessante para a realização de diagnósticos
de rotina, uma vez que necessitam de um grande intervalo de tempo para a sua
realização. O mesmo se aplica para os estudos realizados por Dagnone et al. (2003),
uma vez que a mesma também utilizou a PCR convencional com posterior confirmação
33
da espécie através da utilização de enzimas de restrição. Este método além de mais
demorado pode gerar resultados inespecíficos.
5.3
CORRELAÇÃO DE INFECÇÃO POR Ehrlichia canis COM VARIÁVEIS
HEMATOLÓGICAS E EPIDEMIOLÓGICAS
Os principais achados hematológicos nos animais do presente estudo foram
anemia e trombocitopenia. Apesar de a trombocitopenia ser o principal achado
hematológico observado em todas as fases da erliquiose canina (Almosny et al., 2000;
Pagani et al., 2000; Moreira et al., 2003), não foi observada associação estatística
significativa para a variável hemácia e leucócitos, e a variável plaqueta, o que corrobora
os estudos de Scorpio et al. (2008) e Avizeh et al. (2010), respectivamente. Isto sugere a
importância do diagnóstico laboratorial específico, visto que a falta de associação de
parâmetros hematológicos e o desenvolvimento da infecção por E. canis não é
condizente com um diagnóstico preciso.
A falta de correlação entre a infecção por E. canis e a idade dos animais, aqui
observada, corrobora os estudos de Matthewman et al. (1993), Inokuma et al. (1999) e
Waner et al. (2000), enquanto a falta de correlação com o sexo dos animais está de
acordo com Waner et al. (2000), Watanabe et al. (2004), Rodriguez-Vivas et al. (2005),
Solano- Gallego et al. (2006) e Avizeh et al. (2010).
34
6
CONCLUSÕES
De acordo com as análises aqui realizadas pôde-se concluir que:

A espécie Ehrlichia canis é a única espécie de Ehrlichia circulante em Belém,
Pará;

As cepas de Ehrlichia canis circulantes em Belém, Pará apresentam baixa
variabilidade genética quando comparadas com cepas de E. canis de outras
regiões do globo terrestre;

Não houve correlação estatística significativa entre a infecção por E. canis e a
idade e o sexo dos cães analisados;

Não houve correlação estatística significativa entre a infecção por E. canis e os
valores hematológicos dos cães analisados.
35
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