TRANSCRIÇÃO DO DNA: Síntese do mRNA

TRANSCRIÇÃO DO DNA:
Síntese do mRNA
•Gene (Unidades transcricionais)
•Tipos de RNA
•Tipos de RNA polimerase
•Tipos de RNA polimerase DNA‐dependente
•Transcrição em Procariotos
•Transcrição em Eucariotos
•Mecanismos de controle da Exp. Gênica
1959/60‐ Jacob,
Jacob Monod e Gross
Isolaram o ácido ribonucleico responsável pelo direcionamento da
síntese de proteínas nos ribossomos e propuseram o nome RNA
mensageiro (mRNA) para esta molécula.
O mRNA representa apenas cerca de 2% do RNA total em relação aos
outros tipos de RNA (rRNA e tRNA).
1
DEFINIÇÕES DE GENE
Genética – Mendeliana
Porção do cromossoma que determina ou afeta um único caráter (fenótipo), como por exemplo a cor dos olhos.
Molec lar Beadle e Tatum, 1940
Molecular –
Beadle e Tat m 1940
Segmento de material genético que determina ou codifica uma enzima (conceito obtido a partir de seus estudos sobre o metabolismo de fungo N.crassa)
A
E1
x
B
E2
C
E3
D
E4
E
Segundo a proposta de Beadle e Tatum, 1gene codifica uma enzima (proteína).
Segundo a proposta de Beadle e Tatum, 1gene codifica uma enzima (proteína).
Este conceito vem sendo atualizado e a definição atual é a seguinte:
‐ Um gene codifica pelo menos uma cadeia polipeptídica (“Splicing alternativo”), um tRNA, ou um rRNA, como produto final em Eucariotos.
‐No entanto, uma cadeia polipeptídica pode ser codificada por dois genes separados, gerada a partir de “Protein splicing” ou “mRNA trans‐splicing”
ESTRUTURA GERAL DE UM GENE
5´...
PROMOTOR
CODIFICA RNA
...3´
...5´
3´...
Downstream Upstream
‐10
+1
10
2
UNIDADES TRANSCRICIONAIS DE:
PROCARIOTO (policistrônica) EUCARIOTO (monocistrônica)
Figure 9‐1
PROCARIOTOS x EUCARIOTOS:
ORGANIZAÇÃO GÊNICA, TRANSCRIÇAO E TRADUÇAO
3
Estrutura do Ácido Ribonucleico ‐ RNA
Ligação fosfodiester entre os nucleotídeos.
5’
Ligação entre P ligado ao C 5 do nucleotídeo que chega com a OH ligada ao g
g
C 3 do nucleotídeo da cadeia.
5’
3 ‘
3’
4
Small nuclear RNA (snRNA)
Núcleo
Processamento de mRNA TIPOS DE RNA POLIMERASES
RNA polimerase DNA dependente:
•
Envolvida na transcrição do DNA.
•
Utiliza nucleotídeos tri‐fosfatados (NTP) como substrato e depende de uma fita molde antiparalela. Catalisa o ataque nucleofílico
p
q
da hidroxila do carbono 3 da ribose sobre o fosfato alfa do nucleotídeo a ser incorporado na cadeia de polinucleotídeo.
RNA polimerase RNA dependente:
•
Envolvida na replicação do genoma de alguns vírus RNA. •
Catalisa o ataque nucleofílico da hidroxila do carbono 3 da ribose sobre o fosfato alfa do nucleotídeo a ser incorporado na cadeia de polinucleotídeo.
•
Utiliza NTP como substrato e depende de uma fita molde antiparalela.
Polinucleotídeo fosforilase (a primeira nucleotídeo polimerase isolada e caracterizada ‐
descrita por Manago e Ochoa)
•
Catalisa a seguinte reação reversível:
•
(NMP)n + NDP (NMP)n+1 + Pi
•
Não depende de molde e a composição do polinucleotídeo depende da composição de NDP do meio.
5
Tipos de RNAs polimerases – DNA dependente
Compostas de subunidades (multiméricas)
PROCARIOTOS
RNA Polimerase (sintetiza todos os RNAs)
(
)
EUCARIOTOS
RNA Polimerase I (Nucléolo) : Pré rRNAs ‐
rRNAs 18S, 5,8S e 28S
RNA Polimerase II (Nucloplasma): hnRNAs ‐
mRNA
RNA Polimerase III (Nucleoplasma): tRNA e snRNAs
Experimento de Volkin e Astrachan, 1957
Experimento de “Pulse‐chase” para marcação das moléculas de RNA: células incubadas com uracila radioativa, seguida de incubação com uracila não‐radioativa
Molécula de RNA se move do núcleo para o citoplasma.
6
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
INÍCIO, ALONGAMENTO E
TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO
- RESUMO -
7
ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA
EM PROCARIOTOS:
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ TÉRMINO
TRANSCRIÇAO EM PROCARIOTOS
PROMOTORESPRO
CARIOTOS
8
Procariotos ‐ Iniciação
5’
5
3’ (DNA +)
3
(DNA +)
5’
3’
3’
5’
9
ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA
EM PROCARIOTOS:
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ TÉRMINO
RNA POLIMERASE
ENZIMA RESPONSÁVEL PELA SÍNTESE DE RNA
Direção polimerização 5’ → 3’
Substratos: DNA molde antiparalela e NTP
Holoenzima
Composta de subunidades
10
Procariotos – Alongamento (Parte 1)
Procariotos – Alongamento (Parte 2)
DNA Toposimerase II
DNA Toposimerase I
11
ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA
EM PROCARIOTOS:
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ TÉRMINO
Términação dependente de proteína rô (helicase)
t í
ô (h li
)
Proteína rô reconhece sítio rut no RNA e promove o desligamento da RNA Pol
desligamento da RNA Pol
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Procariotos – Terminação independente da proteína Rô
Procarioto: ausência de MN (acoplamento Transcrição/Tradução)
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TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
Eucariotos ‐Transcrição
Genes interrompidos (introns e exons)
Presença de MN (proteção de mRNA)
14
TRANSCRIÇÃO DO DNA PELA RNA‐Pol II
‐ RESUMO ‐
ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA
EM EUOCARIOTOS:
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾PROCESSAMENTO DO RNA
15
Eucariotos ‐ Iniciação
Promotores E
Eucarióticos
ió i
Necessidade de Fatores Necessidade
de Fatores
gerais de início da trasncrição
TFI
TFII
TFIII
TATA Binding Protein
Montagem do complexo g
p
de início da transcrição com a RNA‐Pol II
Atividade Helicase e Proteína Quinase
16
Modelo de cooperatividade para o complexo de início da transcrição no promotor TTR em hepatócitos
ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA
EM EUCARIOTOS:
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ PROCESSAMENTO DO RNA
17
Eucariotos – Alongamento (Parte 1)
Eucariotos – Alongamento (Parte 2)
DNA Toposimerases I e II
DNA Toposimerase I e II
18
INIBIDORES DA TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS E EUCARIOTOS
Agentes intercalantes
INIBIDORES DA TRANSCRIÇÃO
Amanita phalloides
Rifampicina
Inibidor seletivo da RNA Pol
procariótica.
Composto semi-sintético derivado da
Amycolatopsis rifamycinica (também
conhecida como Amycolatopsis mediterranei
and Streptomyces mediterranei).[
Alfa-Amanitina
Inibidor seletivo da RNA pol II
eucariótica
19
ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO DO DNA
EM EUCARIOTOS:
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ PROCESSAMENTO DO RNA
Processamento do hnRNA ‐ Resumo
20
ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO
RNA
¾CAPEAMENTO DO TERMINAL 5`
¾“SPLICING”
¾( remoção de íntrons e ligação covalente de éxons)
¾POLI-ADENILAÇÃO DO TERMINAL 3`
¾
Eucariotos – Processamento da extremidade 5’ do hnRNA
“Heterogenous Nuclear RNA”: Capeamento
21
ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO
RNA
¾CAPEAMENTO DO TERMINAL 5`
¾“SPLICING”
¾( remoção de íntrons e ligação covalente de éxons)
¾POLI-ADENILAÇÃO DO TERMINAL 3`
¾
Eucariotos – “Splicing” do hnRNA
Remoção dos Íntrons e ligação covalente dos Éxons
Spliceossomo (U1,U2,U3,U4,U5)
22
ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO
RNA
¾CAPEAMENTO DO TERMINAL 5`
¾“SPLICING”
¾( remoção de íntrons e ligação covalente de éxons)
¾POLI-ADENILAÇÃO DO TERMINAL 3`
23
Eucariotos – Processamento da extremidade 3’ do hnRNA
“Heterogenous Nuclear RNA”: Poliadenilação
COMPARAÇÃO ENTRE mRNAs PROCARIÓTICOS E EUCARIÓTICOS
24