(X) PIBIC/AF-CNPq
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0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: 03/2015 a 08/2015 ( ) PARCIAL ( X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Análise do desenvolvimento maturativo em caranguejo na Ilha de Marajó/Soure. Nome do Orientador: Prof. Dr. Adriano Biancalana Titulação do Orientador: Doutor Faculdade: Ciências Biológicas Unidade: Campus Universitário do Marajó/Soure Laboratório: Biologia Celular e Molecular Título do Plano de Trabalho: Alterações morfológicas do hepatopâncreas, nos períodos de maior demanda energética (muda e reprodução). Na ilha de Marajó, Soure - Pará – Brasil. Nome do Bolsista: Roberta Maués de Almeida. Tipo de Bolsa: ( ( ( ( ( ( ( ) PIBIC/CNPq ) PIBIC/UFPA ) PIBIC/INTERIOR ) PIBIC/FAPESPA ) PRODOUTOR ) PARD - renovação ) PIBIC/PIAD (X) PIBIC/AF-CNPq ( ) PIBIC/AF-UFPA ( ) PIBITI ( ) PADRC 1 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 2 1 - INTRODUÇÃO O hepatopâncreas apresenta diferentes níveis de complexidade, porém é similar na maioria dos decápodes (GIBSON E BARKER, 1979), é um órgão que exerce importante papel no metabolismo dos crustáceos, desempenhando além da digestão, outras funções, tais como absorção, estoque de lipídios, glicogênio e minerais, relacionados com os processos metabólicos cíclicos, a exemplo da muda e reprodução (KAMESWARAMMA et al., 1990; RAMADEVI et al., 1990; HAEFNER & SPAARGAREN, 1993, SOUZA & PETRIELLA, 2000; 2001). Também têm sido atribuídas a este órgão, outras atividades fisiológicas como osmorregulação (STORCH & LEHNERT-MORITZ, 1980; HRYNIEWIECKSZYFTER & BABULA, 1997; CUARTAS, 2003), excreção (AL-MOHANNA & NOTT, 1989) e detoxificação de poluentes (GIBSON & BAKER, 1979; Vogt, 1994). O órgão é revestido por epitélio colunar simples e é constituído por vários túbulos em fundo cego interligados por fibras de colágeno e tecido conjuntivo (CORRÊA JR. et al., 2002). Quatro tipos celulares têm sido identificados no epitélio de revestimento dos túbulos do hepatopâncreas em decápodes. Os tipos celulares são classificados como células E (embrionária), R (reabsortiva), F (fibrilar) e B (vesicular), de acordo com o esquema proposto por JACOBS (1928) e HIRSCH E JACOBS (1928). A localização dos tipos celulares citados varia ao longo do comprimento do túbulo hepatopancreático (ICELY E NOTT, 1992; CORRÊA JR. et al., 2002). Em Ucides cordatus como na maioria dos crustáceos decápodes, a salinidade pode afetar o crescimento, a sobrevivência e o desenvolvimento (COSTLOW et al., 1960; ANGER et al., 1990; ANGER, 1996; LÁREZ et al., 2000; ANGER et al., 2000; ANGER, 2003; LUPPI et al., 2003), dentre todos os fatores abióticos, a salinidade é considerada um parâmetro ambiental “chave” em regiões estuarinas e outros ambientes costeiros, por apresentar altas e constantes variações, as quais afetam a fisiologia e a ecologia dos organismos (ANGER, 2001; 2003). Como o hepatopâncreas dos crustáceos é o maior centro de reservas orgânicas e inorgânicas em decápodos (GIBSON & BARKER, 1979), é esperado que ocorra uma mobilização dessas reservas energéticas para a maturação das gônadas, mostrando assim valores dos índices gonadossomáticos e hepatossomáticos antagônicos, como vem sendo observado em crustáceos decápodos (PILLAY & NAIR, 1973; KYOMO, 1988; HAEFNER & SPAARGAREN, 1993; CHU, 1995; LÓPEZ-GRECO & RODRÍGUEZ, 1999). A mobilização dessa reserva também é observada por muitos autores no processo de muda, que é quando há uma grande absorção e liberação de cálcio para a formação de uma nova carapaça (TRAVIS, 1955; 1957; SZYFTER,1966; ADIYODI & ADIYODI, 1972; AL-MOHANNA & NOTT,1989; KAMESWARAMMA et al.,1990; SOUZA & PETRIELLA, 2001). 2 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 3 A histologia é uma ferramenta comumente utilizada para avaliar as modificações teciduais decorrentes de demandas fisiológicas, a exemplo da muda e reprodução nos crustáceos (ESTEVE & HERRERA, 2000). 2 - JUSTIFICATIVA O caranguejo Uçá colabora para a conservação do ecossistema dos manguezais, pois ajuda na oxigenação do solo e reciclagem da matéria orgânica do manguezal. O hepatopâncreas é um órgão ligado a reserva energética, que faz parte essencial do ciclo de vida e sobrevivência do animal. No entanto, poucos trabalhos descrevem a estrutura e morfologia do hepatopâncreas de Ucides cordatus. Especificamente na região de Soure, no arquipélago do Marajó, não existem trabalhos publicados. O estudo do hepatopâncreas é de grande importância, pois permite ampliar o conhecimento a respeito desse órgão vital à vida dos caranguejos. Que são animais que possuem não só importância ambiental, mas também socioeconômica. 3 - OBJETIVOS Este trabalho objetiva analisar as alterações macroscópica e microscópica do hepatopâncreas em Ucides cordatus frente às variações fisiológicas, principalmente nos momentos de maior demanda energética, como a muda e a reprodução, que são essenciais para o seu ciclo de vida. 4 - MATERIAIS E MÉTODOS Os caranguejos usados nesse estudo foram coletados nas áreas de manguezal da Reserva Extrativista Marinha (RESEX), localizada do Município de Soure Arquipélago do Marajó. A coleta aconteceu no período de (outubro/2014 a julho/2015), foram coletadas 32 fêmeas e 40 Machos adultos, semanalmente por um caranguejeiro cadastrado pelo Instituto Chico Mendes da Biodiversidade (ICMBio). Todos os animais foram capturados manualmente, pela técnica do braceamento, no período de maré baixa. Os animais foram levados ao laboratório, passaram por anestesia mediante resfriamento em congelador por 30 min. Logo em seguida foi realizada a identificação dos animais pelos sexos, fotografados por uma câmera semiprofissional, medidos com a utilização de paquímetro de precisão (0,05cm) e devidamente pesados com balança (0,05g). O hepatopâncreas foi dissecado, pesado com uma balança de precisão (0,01) e fotografado. O material biológico foi fixado em solução contendo formaldeído 4%, em tampão fosfato de sódio 2M, pH 7,4. E transferido para álcool 70% até o processamento histológico. O tecido foi desidratado em série crescente de etanol 70% até o absoluto (P.A.) e logo em seguida os fragmentos foram diafanizados em xilol 100% e incluídos em parafina histológica. Secções 3 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 4 histológicas de 7μm de espessura foram obtidas em micrótomo manual (Marca Leica Model SN1681) e os cortes foram corados com hematoxilixa-eosina(HE), o azul de toluidina (AT) e XP (Xylidine Ponceau). E posteriormente as lâminas foram fotografados em câmera (Marca Eyepice Modelo Mem 1300) acoplada ao microscópio óptico (Marca Nikon Eclipse Modelo E200). Para os parâmetros hidrológicos a salinidade, o Potencial de Hidrogênio (pH) e a temperatura foram aferidos nos períodos de Lua Cheia e Lua Nova, a amostra foi retirada sempre na coluna d’água, nas áreas de praia e mangue. Para aferir os parâmetros foi utilizado um refratômetro óptico para medir a salinidade, um peagâmetro para o pH e a temperatura com um termômetro. A análise estatística dos dados foi realizada pela análise de variância (ANOVA) One-Way, seguido pelo teste t. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão. Todos os testes foram feitos com 5% de nível de significância com a utilização de software (Bio-estatc 5.0). 5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 – Índices da Morfometria e peso de macho em relação às fêmeas Nos meses analisados observou-se diferença significativa da largura da carapaça(LC) e peso do animal(PA) dos machos em relação as fêmeas. Porém o Comprimento da carapaça(CC) e o peso do hepatopâncreas(PP) não foi significativo. Apesar de não estar expressivo na tabela1, o valor de p foi < 0,005 para os valores significativos. No delta do rio Parnaíba IVO et al, 1999 confirmou que machos são maiores e mais pesados que as fêmeas, apesar de estudos feitos em Alagoas no Complexo do Estuário Lagunar Mundáu feitos por Araújo e Calado, 2008 que sugerem que não há diferenças significativas em relação a LC, CC e PA, entretanto os autores acreditam que há uma tendência de machos serem maiores que as fêmeas. 4 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 5 Tabela 1: Morfometria da carapaça, peso total e do hepatopâncreas de machos e fêmeas do caranguejo Ucides cordatus. Variáveis Sexo Mínimo Máximo Média Desvio P LC (cm) * Macho 5,9 8,7 ±7,33 0,64 Fêmea 5,3 7,8 ±6,69 0,64 Macho 3,9 6,1 ±5,13 0,40 Fêmea 3,9 6 ±4,92 0,56 Macho 80 305 ±176,19 46,45 Fêmea 6,5 190 ±125,70 38,35 Macho 3,56 12,21 ±7,39 2,02 Fêmea 2,05 8,78 ±5,99 1,76 CC (cm) Ns PA (g) * PP (g) Ns LC: Largura da Carapaça; CC: Comprimento da Carapaça; PA: Peso do Animal; PP: Peso do Hepatopâncreas; Desvio P: Desvio Padrão; * - diferença significativa p≤0,005; Ns: Não significativo. 5.2 - Parâmetros hidrológicos A Ilha do Marajó segundo kõppen é denominado por clima do tipo AM1 (quente e úmido), e nos meses de agosto a dezembro é caracterizado pelo período seco (ou menos chuvoso) e para o período chuvoso de janeiro a julho (Moraes et al, 2005). Nossas análises confirmaram o clima segundo Kõpper utilizando os parâmetros hidrológicos: salinidade, PH e temperatura. Ao comparar as regiões de praia e mangue não se obteve diferenças estatisticamente significativas. Esses dados dos parâmetros hidrológicos podem contribuir com futuros estudos na região com animais bentônicos tendo em vista que não há trabalhos publicados nessas duas áreas de praia e de mangue estudadas. 5 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 6 Figura 1: Variação de salinidade, temperatura e PH, no periodo seco e chuvoso de agosto (2014) a junho(2015), na região de mangue em Soure/Pará. Figura 2: Variação de salinidade, temperatura e PH, no periodo seco e chuvoso de agosto (2014) a junho(2015), na região de praia em Soure/Pará. 6 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 7 5.3 - Análise Macroscópica do hepatopâncreas de Macho e Fêmea no Período de Muda e Reprodução Nos meses analisados foi possível identificar quatro colorações do hepatopâncreas: Amarela, verde, marrom e preto. Porem foi considerado uma quinta cor denominada mista, correspondente a junção de duas cores dentre as quatro observadas (figura1). Todos os meses apresentaram as diferentes colorações, não se obteve nem um padrão em relação ao período de muda e reprodução. Marques (2006) observou a coloração amarelo-castanhada em Macrobrachium amazonicum, porem até o presente trabalho não se teve registros na literatura sobre essas diferentes colorações em Ucides cordatus. Figura 3: Diferentes cores observadas no hepatopâncreas de machos e fêmeas do caranguejo Ucides cordatus. 5.4 - Análise Microscópica do hepatopâncreas de Ucides cordatus Tipos Celulares: O trabalho possibilitou identificar quatro tipos celulares presentes no epitélio de revestimento dos túbulos do órgão dos dois gêneros. As células R (reabsortiva), F (fibrilar), E (embrionária) e B (vesicular) (figura 4). Como foi descrito por Jacobs (1928); e esquematizado por Corrêa, Farina e Allodi (2002). Na figura 4.A podemos observar a Célula R que é a mais frequentemente visualizada no epitélio, isso foi observado também em outros decápodes como o Penaeus vannamei (Al-Monhanna e Nott, 1989). Seu formato é colunar e o núcleo está localizado na região basal e central. Esse tipo celular frequentemente apresenta vacúolos. 7 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 8 A célula F (figura 4.B) apresenta em geral forma alongada e coloração intensa (HE). Seu núcleo foi observado na região central da célula diferentemente do que foi descrito por Icely e Nott (1992), que descrevem o núcleo próximo a região basal da célula. Na célula E (figura 4.C) o núcleo ocupa quase todo volume citoplasmático da célula que possui formato esférico. Observa-se também intensa atividade mitótica (Vogt et al; 1985). Na figura 4.D encontrasse a célula B que é facilmente visualizada por apresentar um grande vacúolo e núcleo posicionado na região basal da célula. Figura 4: Fotomicrografia das células do órgão hepatopancreatico do caranguejo Ucides cordatus observado em microscópio de luz, A) R: Célula Reabsortiva; B) F: Célula Fibrilar; C) E: Células Embrionárias; D) B: Célula Vesicular. Corados em HE, corte transversal. Aumento: 100x. Hepatopâncreas de Fêmea e Macho no período reprodutivo: As análises realizadas identificaram importantes alterações microscópicas no epitélio de revestimento dos túbulos do hepatopâncreas de macho e fêmea do caranguejo Ucides cordatus. Com isso pode-se determinar dois importantes períodos, Pré-Reprodução (R1) o que antecede a reprodução e o período reprodutivo (R2): - Pré-Reprodução (R1) Caracterizou-se inicialmente por apresentarem um epitélio organizado, com muitas células R e B com forma colunar baixa (Fig. 5A). O epitélio durante esse período se alterou, apresentando bordas em escova (BE) e aumento celular que 8 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 9 promoveu um espessamento do tubo (Fig. 5B). Na Fig. 5C, observa-se um aumento de vacúolos nas células R e a célula F apresenta uma forma mais alongada. 5A 5B 5C Figura 5: Fotomicrografia demonstrando o Período R1, 5A: B: Células Vesicular e R: Célula Reabsortiva; 5B: BE: Borda em Escova; 5C: F: Célula Fibrilar. Corado em HE, corte transversal. Aumento: 10x. A célula F apresentou intensa coloração para ambos os gêneros, caracterizando uma intensa síntese protéica e/ou acúmulo de açúcares ácidos (Fig. 6. A e B). Já na coloração de HE o citoplasma e o núcleo das células apresentaram intensamente corados nos dois gêneros (Fig.6 C e D), diferente da coloração XP que ficou pouco corada (Fig. 6. E e F). A célula E é visualizada geralmente no espaço entre os túbulos, indicando a reconstrução de um novo túbulo (Fig. 6 B e D). A C E B D F Figura 6: Fotomicrografia em cortes transversal do túbulo do hepatopâncreas de Ucides cordatus, ilustrando o Período R1. A e B) túbulo hepatopâncreatico corado com coloração AT, evidenciando na seta a célula F e no círculo a célula E. C e D) Coloração HE e no círculo célula E. E e F) Coloração XP no túbulo do órgão. Aumento: 40X. 9 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO - Período Reprodutivo (R2) Observou-se frequência elevada da célula B e diminuição da célula F, como foi citado no trabalho de Al-Mohanna et al (1989) que sugere que a célula F se diferencia em célula B. Visualizou-se também a presença de grandes vacúolos com material digestivo no interior da Célula B, evidenciando sua atividade secretora assim ocorrendo também um aumento nas bordas em escova (BE) da célula R (Fig.7A). A célula E encontrasse novamente no espaço entre os túbulos. Perda de material secretor pode ser observada na figura 7B e nesse período encontra-se túbulos se desestruturando e reestruturando, podendo sugerir uma alta função metabólica no túbulo. B A * * Figura 7. Fotomicrografia em cortes transversal do túbulo do hepatopâncreas de Ucides cordatus em aumento de 10x com coloração HE, demonstrando o Período R2. A) Bordas em Escova da célula R na seta, a célula B com material dentro do seu vacúolo pinocítico (*) e no círculo a célula E. B) Célula B no círculo e rompimento celular (*). O período reprodutivo apresentou um aumento no acúmulo de proteína nos quatro tipos celulares (E, R, F e B), evidenciado pela coloração XP, especifica para corar proteínas totais. A coloração foi mais intensa nos machos que nas fêmeas (Fig.8. A e B), aparentemente observamos que nesse período ocorre o armazenamento de proteínas no órgão. A coloração HE (Fig.8. C e D) e AT (Fig.8. E e F) permaneceram com a mesma intensidade de coloração do período anterior para os dois gêneros. No entanto para o hepatopâncreas do macho (Fig. 8.C e E) pode-se observar bordas em escova (BE) presentes na célula R, mostrando a especialização para absorção de nutrientes presentes no lúmen do túbulo. 10 10 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO A C E B D F Figura 8: Fotomicrografia em cortes transversal do túbulo do hepatopâncreas de Ucides cordatus, demonstrando o Período R2. A) Túbulo hepatopâncreatico corado com XP do caranguejo macho. B) Túbulo do hepatopâncreas do caranguejo fêmea corado com XP. C) Túbulo do órgão do caranguejo Macho corado com HE, na ponta da seta bordas em escova (BE) da célula R. D) Hepatopâncreas do caranguejo fêmea orado com AT. E) Coloração AT do tubo do caranguejo Macho evidenciando as bordas em escova (BE) da célula R na seta. F) Tubo hepatopâncreatico de fêmea com coloração AT. Aumento: 40X. Hepatopâncreas de Fêmea e Macho no período de muda (ecdise) Nesse período o hepatopâncreas do macho apresenta a célula R com muitos vacúolos no seu citoplasma (Fig. 9.A) e acúmulo de proteína nas suas bordas em escova (Fig. 9. B). O túbulo da fêmea também apresenta o aparecimento de vacúolos na célula R, a célula F apresenta intensamente corada com HE (Fig.9.C) e em XP (Fig.9.D) e na figura 9.E e F é mais evidente a presença dessas reservas. 11 11 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO A C E B D F Figura 9: Fotomicrografia em cortes transversal do túbulo do hepatopâncreas de Ucides cordatus, demonstrando o Período de muda. A) Túbulo hepatopâncreatico corado com HE do caranguejo macho, vacúolos da célula R na seta. B) Túbulo do hepatopâncreas do caranguejo macho corado com XP, bordas em escova na ponta da seta. C) Túbulo do órgão do caranguejo fêmea corado com HE, na ponta da seta célula F. D) Hepatopâncreas do caranguejo fêmea corado com XP, célula F na ponta da seta. E) Coloração HE do tubo do caranguejo fêmea evidenciando as bordas em escova da célula R na seta. F) Tubo hepatopâncreatico de fêmea com coloração XP, bordas em escova bem proeminente (seta). Aumento de 40X. 6 - PUBLICAÇÕES A aluna apresentou seu trabalho em forma de pôster como primeira autora o trabalho intitulado “Presença de Polissacarídeos no Hepatopâncreas do caranguejo-Uçá durante o período reprodutivo na região Leste da Ilha do MarajóPA”. No XII CAEB, Congresso Aberto aos Estudantes de Biologia. Realizado na Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), que ocorreu no período de 20 a 24 de julho de 2015. 12 12 0BIDENTIFICAÇÃO DO PROJETO 7 - CONCLUSÃO Durante os meses analisados foram observadas diferentes colorações macroscopicas no hepatopâncreas do caranguejo Ucides cordatus que não permitiram determinar um padrão de coloração para o período reprodutivo e o período de muda (ecdise) do animal; Levando em consideração a análise microscópica da fêmea e do macho, foi observado que aparentemente o epitélio do túbulo do órgão somente dentro do período reprodutivo e no de muda passa por uma maior e mais intensa síntese proteica, comparando com os outros meses analisados; Os parâmetros hidrológicos e morfometricos analisados não obtiveram correlações com as análises macroscópicas e microscópicas, porem pode servir para estudos futuros na região. 8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADIYODI, R.G & ADIYODI, K.G. 1972. 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