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Scanalyzer e software para uso com Daphnia em testes ecotoxicológicos
O sistema
O LemnaTec HTS com software Daphnia detecta e quantifica a mobilidade de pequenos organismos em microplacas. As placas
são colocadas no sistema de posicionamento do Scanalyzer HTS. Quando iniciando a operação do sistema o usuário escolha um
programa de ensaio de acordo com o organismo sendo avaliado e o programa ativa os métodos adequados para aquisição e
análise das imagens. Durante o processo de aquisição as placas são identificadas por seu código de barra seguido pelo
posicionamento da câmera na posição de escaneamento. Aí a câmera CCD tira as imagens necessárias em intervalos
escolhidos. Depois a câmera é posicionada na próxima posição para leitura de código de bar
barras
ras ou aquisição de imagem. Desta
forma imagens de todas as placas são digitalizadas sucessivamente. Analises já são iniciadas enquanto o sistema está
adquirindo imagens. Como primeiro produto uma imagem representativa dos movimentos é calculada de imagens singelas.
Esta nova imagem pode opcionalmente ser armazenada junto com a imagem original. Num próximo passo da análise, todas as
movimentações nos poços são quantificadas e classificadas em categorias de mobilidade previamente definidas. O resultado é
uma distribuição de mobilidade para cada poço, armazenada no banco de dados junto com as imagens originais e os dados
primários. Nas imagens e nas tabelas montadas usando os dados, certos valores predefinidos podem ser realçados. Todos os
controles nos ensaioss sofrem o mesmo procedimento, de forma que um controle contínuo de qualidade dos ensaios seja
possível.
Armazenagem de imagens e dados
A imagem representando os movimentos inclui toda informação sobre a mobilidade para avaliação quantitativa e eventual
nova
va análise posterior. A partir da imagem original é possível reconstruir dados marcantes nos resultados. Isto garante máxima
validade dos dados. Todos os dados são armazenados de acordo com GLP e disponíveis para transferência em bancos de
dados: imagens, métodos de análise usados (quantidade de imagens, tempos entre imagens, classes de mobilidade),
parâmetros da mobilidade (distribuição das classes de mobilidade, classificação como vivo, influenciado, imóvel), a
identificação de cada poço (ID por código de
e barra, nome do poço) e os dados do teste relevantes para GLP (data, tempo,
local, usuário).
Resolução e escolha dos quadros das imagens
O usuário especifica qual área da placa será adquirida como uma imagem. No caso de Daphnia para uma placa de 96 poços
poços,
4x6 ou 2x3 poços em cada imagem é uma escolha adequada. Com quadros menores (2x3 poços), a resolução aumenta
aumenta, mas o
tempo para aquisição da imagem é multiplicado. Para alterar a resolução deve se trocar a lente da câmera e modificar o
arquivo de configuração
ação do software de analise.
Duração do escaneamento
Caso os organismos em teste se movem rapidamente ou uns organismos causam movimentos em outros pela quantidade grande
de organismos em poços pequenos, pode-se
se reduzir o tempo entre a tomada de imagens. Desta forma se reduz o tempo total
de escaneamento sem redução na qualidade da classificação. Um tempo de 5 segundos entre cada aquisição de imagens ainda
fornece dados livres de outliers estatísticos. No caso de Daphnia o tempo pode ser reduzido até somen
somente 1 segundo.
Resultados da análise de imagens
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As larvas nas placas foram escaneadas pelo sistema Scanalyzer HTS com tempos entre 1 e 5 segundos. Simultaneamente os
códigos de barra foram escaneados também. A Figura 1 mostra imagens de seqüências de 5 seg
segundos
undos tomadas de controles e
uma outra serie depois um teste de 2 horas com substancias ativas. As imagens mostram diferenças evidentes no tamanho dos
organismos por falta de sincronização na cultura. Olhando as imagens em seqüência, mais diferenças são no
notadas nos
movimentos dos organismos em termos de velocidade e regularidade. Formação de nuvens e coloração causadas pelas
substancias de teste iriam complicar observação visual por um avaliador humano, especialmente no poço 2a (substancia =
surfactante).
1b
2a
2b
1d
2c
2d
2e
2f
1a
1c
1e
1f
Figura 1: Imagens originais dos poços. Esquerda: controles 1
1-6
6 , Direita: amostras com substancias ativas (2h). Substancias ativas: 2a: surfactante, 2b: controle 7, 2c:
controle 8 , 2d: etanol 5% , 2e: etanol 50%, 2f: nicotina
Um índice de mobilidade é introduzido
troduzido para quantificar os movimentos dos organismos de teste. O índice é expresso em escala
para ser desconectada de fatores difíceis de estabilizar como numero de indivíduos e seus tamanhos. A escala é baseada num
modelo matemático de movimento. O limiar
iar para detecção de organismos influenciados deve ser fixado através de um
conjunto de controles uma vez para cada tipo de teste e pode ser aplicado de forma estática numa quantidade arbitraria de
testes. Os indexes de mobilidade determinados pelo sistema LemnaTec são mostrados na tabela 1. Todos os controles estão
bem acima de 3000 unidades de mobilidade. No caso de organismos incubados o valor mais alto de mobilidade é 650,
indicando um grande decréscimo na sua atividade. Esta atenuação de mobilidade pod
pode
e também ser reconhecida por um
observador olhando as imagens em seqüência (tipo filme). Se adotarmos um tempo longo de escaneamento nos organismos
tratados com nicotina, o observador pode reconhecer movimentos fracos e freqüentes. Esta mobilidade fraca é detectada pelo
sistema Daphnia e é quantificado por observador de 62 unidades.
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Controles
Teste com substâncias ativas
Mobilidade:
Controle 1: 5639
Controle 3: 3978
Controle 5: 9315
Controle 2: 7178
Controle 4: 8467
Controle 6: 9427
Surfactante: 0
Controle 8: 6069
Etanol 50%: 1
Controle 7: 5372
Etanol 5%: 683
Nicotina: 62
Tabela 1: Mobilidades integradas
A mobilidade de pequenos organismos pode ser detectada usando o software Daphnia. A operação é praticamente
independente das espécies de organismos, sua quantidade, tamanho ou padrões de mobilidade. Uma ilustração da mobilidade
com pseudo cores obtida usando o software Daphnia é mostrada na Figura 2. As atividades dos organismos de teste foram
classificadas em 6 classes de mobilidade.
obilidade. As classes ‘ muito devagar’ até ‘muito rápido’ foram detectadas em todos os poços
no inicio do ensaio. Sem análise adicional pode ser estimado que as classificações dos poços mostrem algumas diferenças
individuais por dois motivos. Primeiro que as quantidades e tamanhos dos organismos analisados variam muito. Em segundo
lugar, que movimentos na direção perpendicular ao plano de observação não são detectados.
Como pode ser verificado olhando as imagens em seqüência de filme, após duas horas de inc
incubação
ubação não há mais mobilidade
detectada nos poços (a) e (e) (substâncias
ncias ativas surfactante
surfactantes e etanol 50%). Ao contrário os objetos de teste nos poços de
controles ainda demonstram mobilidade em todas as classes. Nos poços (d) e (f), respectivamente etanol 5% e nicotina, a
mobilidade diminui significativamente. Alguns movimentos normais isolados for
foram detectados nos poços (b) e (c).
Muito rápido
Rápido
Normal
Retardado
Devagar
Muito devagar
Figura 2: Ilustração com pseudo cores das diferentes mobilidades dos organismos de teste (Poços idênticos aos da figura 1).
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Desta forma, o Scanalyzer com software Daphnia diferencia numa microplaca de forma confiável organismos com e sem
mobilidade em questão de segundos. A observação da mobilidade não é atrapalhada por amostras coloridas ou por grandes
diferenças individuais nas populações de teste.
Avaliação estatística da análise de imagem
Os índices de mobilidade dos controles e das amostras de teste com substâncias ativas após 30 minutos são mostrados na
Figura 3. Pode ser definido um limiar em 3000 unidades baseado nos índices de mobilidade dos controles. Qualquer valor
acima deste limite deve ser considerado mobilidade que não esteja sendo influenciada. A flutuação das mobilidades dos
controles é devida a diferenças individuais dos organismos.
Figura 3: Escaneamento durante cinco segundos de uma serie de controles (esquerdo) e um a serie de organismos de teste com substancias ativas (direito) após 30
minutos. O limiar para efeito detectável na mobilidade é definido num valor de 3000 unidades.
A mobilidade dos organismos de teste tratados com 5% de etanol durante 30 minutos é bem abaixo do limiar, e a nicotina
também reduziu a mobilidade mais ainda. Os organismos intoxicados com surfactante e etanol em 50% perderam a mobilidade
totalmente.
Os resultados da análise de imagem de forma eletrônica podem ser verificados olhando a serie de imagens numa seqüência do
tipo filme. Mesmo uma mobilidade levemente alterada como no caso de 5% de etanol após 30 minutos ainda pode ser avaliada
desta forma. Entretanto uma quantificação precisa e resultados reproduzíveis não podem ser obtidos por um observador
humano.
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Figura 4: Efeitos ao longo do tempo sobre a mobilidade de organismos de teste.
Na Figura 4 mostramos os efeitos de substancias ativas na mobilidade de organismos de teste em função do tempo. É obvio
que os efeitos de álcool e nicotina não são fatais, embora as curvas estejam bem abaixo das curvas dos controles. Pela
execução de medições feitas em função de tempos, é possível estabelecer perfis de substancias ativas.
Resumo
O software Daphnia permite determinar de forma eficiente e confiável a influencia de substâncias ativas em microrganismos.
O método de detecção é extremamente significativo e possibilita uma rígida classificação de mobilidades como desejado em
testes HTS. Fatores normalmente complicadores tais como, coloração e formação de nuvens, não influenciam negativamente a
qualidade dos resultados de teste. Um tempo de escaneamento de menos de 5 segundos fornece já dados validos, livres de
outliers estatísticos devido a pequenos movimentos randômicos de pequenos organismos sem qualquer padrão claro de
movimento. Desta forma o ensaio é extremamente independente da espécie usada. Através de montagem de uma escala o
índice de mobilidade se torna até independente da quantidade e tamanho dos organismos no teste. Os resultados contem
muito mais informação do que uma simples separação entre organismos com e sem mobilidade. É possível reconhecer
organismos com mobilidade sendo reduzida ou organismos excitados. Quantificando as mobilidades permite até detector
alterações nos padrões de mobilidade. Testando a mobilidade em função do tempo permite estabelecer perfis de substancias
ativas e executar otimizações de testes. Em combinação com o Scanalyzer é possível avaliar até 100 microplacas de 96 poços
num só lote de operação. A ampla documentação de imagens e dados abre perspectivas para datamining, análises posteriores,
gerenciamento da qualidade e conformidade GLP.
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