Comparação de Metodologias para a Purificação de Betanina

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Comparação de Metodologias para a Purificação de Betanina
Nathana B. Lopes1, Letícia C. P. Gonçalves1, Vani X. de Oliveira, Jr.1, Wilhelm J. Baader2, e Erick L. Bastos1,*
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Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André, SP, Brasil
Departamento de Química Fundamental, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Betalaínas semi-sintéticas são obtidas através do acoplamento entre o ácido betalâmico e aminoácidos/aminas ou ciclo-DOPA. Para
a obtenção deste precursor betalaínico é necessária a purificação da betanina, principal pigmento da beterraba, que em meio alcalino é
hidrolisado formando o ácido betalâmico. Este trabalho compara metodologias para a pré-purificação da betanina a partir do extrato
de beterraba (Beta vulgaris, subsp. vulgaris), através da avaliação da eficiência de purificação e do rendimento de cada método.
Palavras-chave — betalaínas, betanina, cromatografia, pigmentos naturais
I. INTRODUÇÃO
interesse do consumidor por produtos naturais
tem crescido consideravelmente nos últimos
anos por estes serem associados a efeitos
terapêuticos e à preservação do meio ambiente.
Neste contexto, a descoberta e a semi-síntese
(síntese utilizando reagentes obtidos a partir de
produtos naturais) de novos pigmentos naturais
apresentam grande perspectiva econômica [1,8].
As quatro principais classes de pigmentos
naturais
são
as
antocianinas,
betalaínas,
carotenóides e clorofilas. As betalaínas receberam
menor atenção científica do que as outras classes
devido à sua ocorrência restrita à maioria das
famílias da ordem Caryophyllales e a alguns
gêneros de fungos Basidiomicetos. Entretanto,
devido à recém-descoberta de sua atividade
antioxidante e fluorescência, as betalaínas vêm
recebendo maior interesse [2].
Do ponto de vista químico, betalaínas são
compostos
nitrogenados,
resultantes
do
acoplamento de um cromóforo, o ácido betalâmico,
com aminoácidos/aminas (betaxantinas amarelas)
ou derivados de ciclo-Dopa (betacianinas
vermelho-violáceas) (Esquema 1) [2].
O
Esquema 1. Estruturas básicas de betacianinas, betaxantinas e seu precursor
comum, o ácido betalâmico.
*
Autor
de
correspondência:
[email protected]).
E.
L.
Bastos
(e-mail:
A semi-síntese de novas betalaínas depende da
obtenção de ácido betalâmico, que pode ser
preparado pela hidrólise alcalina de betalaínas
naturais como a betanina (Esquema 2). A betanina é
o principal pigmento da beterraba, sendo composta
por um núcleo betalâmico e uma porção cicloDOPA glicosilada [3-5].
Esquema 2. Procedimento para a hidrólise alcalina de betanina, preparação de
indicaxantina pelo acoplamento aldimínico entre ácido betalâmico e L-prolina
e preparação de betanidina a partir de betanina e β-glicosidase.
Tentativas de hidrólise de extrato de beterraba
não purificado foram mal sucedidas devido à rápida
oxidação do ácido betalâmico e/ou formação de
outros produtos [6,7]. Assim, no presente trabalho,
aprimoramos as condições de purificação da
betanina a partir de extrato bruto de beterraba para
que esta pudesse ser hidrolisada gerando o ácido
betalâmico. O ácido obtido é fundamental para a
semi-síntese de novos pigmentos betalâmicos
biocompatíveis com propriedades antioxidantes
e/ou fluorescentes [8].
II. PARTE EXPERIMENTAL
A betanina foi obtida a partir de extrato de
beterraba orgânica fresca, beterraba liofilizada
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comercial e betanina em dextrina comercial, sendo
comparada a eficiência de quatro metodologias de
purificação: 1) cromatografia em coluna de gel de
Sephadex G-25, eluente água deionizada; 2)
cromatografia em coluna de Silicagel 60, eluente:
metanol/água (8:2, v/v); 3) extração líquido-líquido
PEG/(NH4)2SO4 e 4) centrifugação seguida de
purificação por HPLC semi-preparativo (Fase
reversa, coluna C18, 250 cm x 21,20 cm, 15 µm;
gradiente 5-20%B em 60 min, sendo A: 1% ácido
acético/água e B: 1% ácido acético/60%
MeCN/água; 10 mL/min; λmax = 254 nm).
Nos processos cromatográficos 1 e 2, as amostras
foram previamente diluídas na fase móvel e
acidificadas até pH 3,0, sendo as frações de
coloração magenta, que contem a betanina
(λmax=536 nm, ε536=6.5×104 M-1s-1), recolhidas e
após precipitação em meio ácido de etanol/água
(9:1, v/v) foram submetidas à analise
cromatográfica em HPLC analítico (Fase reversa,
coluna C18, 15 cm x 4,6 cm, 5 µm, gradiente 595%B em 20 min, sendo solvente A: 0,1%
TFA/água
e
solvente
B:
0,1%TFA/60%
MeCN/água; 1mL/min; λmax=536 nm) juntamente
com as frações resultantes dos métodos 3 e 4
(Figura 1).
Figura 2. Cromatogramas das amostras de betanina obtidas pelos métodos
de separação 1 a 4 na região de interesse (5,5 – 8,5 min). Coluna de fase
reversa C18, 15 cm x 4,6 cm, 5 µm, gradiente 5-95%B em 20 min, sendo A:
0,1% TFA, água e B: 0,1%TFA, 60% MeCN/água, 1mL/min, λmax=536 nm.
As propriedades óticas das amostras brutas e
purificadas (Figura 3) foram obtidas e analisadas.
As amostras brutas apresentam uma banda principal
de absorção em 536 nm (betanina) com um ombro
em 487 nm referente à betaxantinas também
presentes na beterraba.
Figura 1. Extração e purificação das amostras de beterraba liofilizada,
betanina liofilizada em dextrina e extrato de beterraba orgânica.
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As amostras purificadas foram analisadas no
HPLC analítico, mostrando a eficiência de
purificação de cada método (Figura 2).
Figura 3. Espectros de absorção (linha cheia) e fluorescência (linha
pontilhada) de extrato de beterraba bruto aquoso e das frações de betanina
resultante dos processos de separação estudados para as amostras de beterraba
em dextrina, beterraba liofilizada e extrato de beterraba.
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A concentração da betanina/isobetanina foi
calculada a partir do valor de absortividade molar
da espécie (ε536=6.5×104 M-1s-1), sendo possível
calcular o rendimento para cada método e amostra
(Figura 4).
IV. CONCLUSÕES
A
extração
aquosa
na
presença
de
PEG/(NH4)2SO4 é o método que permite uma boa
pré-purificação da betanina a partir do extrato de
beterraba, porém a purificação através do HPLC
semi-preparativo permite a melhor e, em termos de
rendimento, a mais eficiente purificação.
AGRADECIMENTOS
FAPESP
(JP07/00684-6,
DD07/59407-1),
CAPES (PE/2007) e UFABC pelo apoio financeiro;
Profs. Drs. Antonio de Miranda (UNIFESP) e
Etelvino J. H. Bechara (IQ-USP/UNIFESP) pelo
apoio na realização das separações cromatográficas.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Figura 4. Rendimento calculado para as quantidades em massa de
betanina/isobetanina obtidas a partir dos métodos de separação estudados.
A partir de betanina purificada em HPLC
preparativo coluna fase reversa C18, gradiente
MeCN/água:ácido fórmico (0,5%)/água, resultou no
isolamento de uma mistura de betanina e seu
enantiômero isobetanina com >97% pureza, como
aferido por espectroscopia de massas (Central
analítica, IQ-USP) (Figura 5).
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[6]
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[8]
Figura 5. (A) Cromatograma de amostra de betanina purificada. (Coluna em
fase reversa C-18, 5-95% de B em 20 min, sendo A: 0,1% TFA/água e B:
0,1% TFA/60% ACN/ água, 1mL/min). (B) Espectro de massas do pico
majoritário. (C) Espectro de UV-vis em 535 nm e [betanina] = 1,45 x 105
mol.L-1 em pH 5.
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Comparação de metodologias para a pré-purificação de betalaínas a
partir do extrato de beterraba (Beta vulgaris, subsp. vulgaris), In 32a.
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