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ARTIGOS CIENTÍFICOS
Associação de tetraciclina à membrana de osso cortical bovino
desmineralizado aumenta atividade de enzimas lisossomais
Association of tetracycline and membrane of demineralized bovine cortical bone
increase lysosomal enzyme activity
Rodrigo Cardoso de OLIVEIRA1, Willian Fernando ZAMBUZZI2, Thelma Lopes da SILVA3, José Mauro GRANJEIRO4
RESUMO
A regeneração tecidual e óssea guiadas utilizando
membranas (M) à base de colágeno é usual. A tetraciclina é
utilizada algumas vezes para auxiliar a regeneração tecidual
na forma tópica ou associada às barreiras absorvíveis,
contudo acelerando a degradação da membrana.
Enzimas lisossomais estão envolvidas na resposta celular
a biomateriais. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito
da associação da tetraciclina à membrana derivada do
osso cortical bovino desmineralizado (MT) na atividade
de enzimas lisossomais. As membranas (M e MT) foram
implantadas no tecido subcutâneo de ratos (n = 120) e 1,
3, 7, 14, 28 e 60 dias após a cirurgia os animais foram
mortos e os respectivos tecidos reacionais coletados para
análise bioquímica. O lisado do tecido foi obtido em tampão
acetato 0,1 M, pH 5, contendo EDTA e β-mercaptoetanol
1 mM para a determinação da atividade das isoformas da
fosfatase ácida, fosfatase alcalina de membrana e arilsultase
e β-hexosamidase. No grupo MT observou-se maior atividade
das enzimas lisossomais nos períodos de 1, 3 e 7 dias (p
< 0,05). Os resultados obtidos permitem concluir que a
associação de tetraciclina à membrana aumenta a atividade
específica das enzimas analisadas, concorrendo para a
aceleração da degradação da membrana + tetraciclina.
ABSTRACT
Guided bone and tissue regeneration using collagen-derived
membranes (M) is a common practice. Topical application
of tetracycline or its association to membranes intends
to complement guided tissue regeneration, however,
accelerated degradation was observed. Lysosomal enzymes
are involved in the cell response to biomaterials. The aim
of this work was to evaluate the effect of tetracycline
association to the membrane (MT) obtained from
demineralized bovine cortical bone to lysosomal enzymes.
Membranes (M and MT) were implanted in the subcutaneous
tissue of rats (n=120) 1, 3, 7, 14, 28 and 60 days after
implantation the animals were killed and the granuloma
removed for enzymatic analysis. Tissue lyses was obtained
using 0.1M acetate buffer, pH 5.0, plus 1 mM of EDTA and
β-mercaptoethanol for determination of acid phosphatase
isoforms, cell membrane alkaline phosphatase, arilsulfatase
and β-hexosaminadase activities. MT group showed
higher lysosomal activity at 1, 3 and 7 days (p<0.05) than
M group. Based on the results it could be concluded that
the treatment of membranes with tetracycline significantly
altered the specific activity of the enzymes, increasing MT
degradation in the tissue.
Key words: Membranes. Alkaline phosphatase. Enzymes.
Palavras-chave: Membranas. Fosfatase alcalina. Enzimas.
Endereço para correspondência:
José Mauro Granjeiro
Universidade Federal Fluminense - Instituto de Biologia
Departamento de Biologia Celular e Molecular
Outeiro de São João Baptista, s/n - Campus do Valonguinho - Centro
24020-150 - Niterói - Rio de Janeiro - Brasil
E-mail: [email protected]
Recebido: 11/02/2009
Aceito: 05/04/2009
1. Professor Doutor do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
2. Pós-Doutorando em Enzimologia do Departamento de Bioquímica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil.
3. Doutoranda em Biologia Funcional e Molecular do Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil.
4. Professor Adjunto do Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil. Professor Visitante da
Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
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Associação de tetraciclina à membrana de osso cortical bovino desmineralizado aumenta atividade de enzimas lisossomais
INTRODUÇÃO
A regeneração tecidual e óssea guiadas utilizando membranas
à base de colágeno têm sido largamente utilizadas na clínica
odontológica8,18,20, algumas vezes associadas à antibióticos como
a tetraciclina. Um estudo recente demonstrou que a associação
de tetraciclina à membrana derivada do osso cortical bovino
desmineralizado promovia aceleração de sua degradação21.
Contudo, não se conhece até o momento o mecanismo pelo qual
se dá essa maior degradação da membrana.
Determinados eventos fisiológicos e patológicos podem ser
detectados, ou mesmo monitorados por marcadores biológicos.
Especificamente, os processos de degradação e remodelação
tecidual são orquestrados pela atividade de enzimas lisossomais
como fosfatase ácida, arilsulfatase, ß-hexosaminidase e proteases5.
Alguns relatos na literatura têm avaliado a possibilidade das
fosfatases e enzimas lisossomais servirem como marcadores
biológicos na tentativa de conhecer em maior detalhe os mecanismos
celulares e moleculares frente a diferentes contextos1,10.
As fosfatases são hidrolases que utilizam como substratos
fosfomonoésteres, as quais estão amplamente distribuídas
na natureza, tendo sido encontradas em animais27, vegetais9
e em microorganismos13. Estas enzimas são divididas em 3
grupos principais: fosfatases alcalinas, fosfatases ácidas e
proteínas fosfatases16.
Na natureza, o balanço entre a fosforilação e a desfosforilação
de proteínas é a base para o controle de diversos eventos
biológicos disparados por efetores extracelulares, como hormônios,
mitógenos, carcinógenos, citocinas, neurotransmissores, substâncias
ou metabólitos tóxicos17. Em consequência à ação destes efetores
ocorre regulação, principalmente, da divisão, diferenciação,
desenvolvimento e morte celular3,12,27,29.
Nos últimos anos, tem sido investigado o potencial destas
enzimas como biomarcadores teciduais em resposta a diferentes
biomateriais xenogênicos e importantes resultados tem sido
alcançados2,22-24,28. Assim, o objetivo geral deste trabalho foi
analisar o efeito da associação da tetraciclina à membrana de
osso cortical bovino desmineralizado na atividade específica de
enzimas lisossomais envolvidas na resposta tecidual ao implante
da membrana.
MATERIAL E MÉTODOS
Um total de 120 ratos albinos da linhagem Wistar (Rattus
norvegicus), machos adultos (70 dias e 250 g), provenientes
do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Bauru,
Universidade de São Paulo, foram divididos aleatoriamente em
dois grupos de 60 ratos, os quais foram sacrificados em subgrupos
de 10 animais cada após 1, 3, 7, 14, 28 e 60 dias da implantação
da membrana. A pesquisa foi realizada segundo as normas
20
recomendadas pela Comissão de Ética no Ensino e Pesquisa em
Animais da Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade
de São Paulo, seguindo o Colégio Brasileiro de Experimentação
Animal (COBEA).
PREPARO DO MATERIAL
As membranas derivadas do osso cortical bovino
desmineralizado (M) foram obtidas no mercado nacional e utilizadas
conforme indicação do fabricante ou associadas à tetraciclina após
imersão da membrana em solução de tetraciclina (5%) durante 10
minutos (MT). Todas as membranas utilizadas foram esterilizadas
previamente por radiação gama (25 KGy).
PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
Em todos os animais foi seguida a mesma sequência
operatória21. Primeiramente os animais foram anestesiados via
intramuscular com associação de 0,5 mL/Kg de peso de Dopalen
(Agribrands do Brasil Ltda., Paulínia,SP, Brasil) e Anasedan
(Agribrands do Brasil Ltda., Paulínia,SP, Brasil) na proporção 1:1
(v:v). Seguiu-se a tricotomia e assepsia (com álcool iodado) da
pele na região dorsal do animal. A incisão (1,5 cm) reta na pele
dos animais foi realizada no centro da região dorsal, no sentido
crânio-caudal. Utilizando uma tesoura de ponta romba, o tecido
conjuntivo foi divulsionado para a colocação da membrana (1cm2).
Foi realizada a sutura descontínua (fio de seda 4.0) e assepsia
com álcool iodado. Por todo o período experimental os animais
receberam dieta normal ad libitum composta de ração granulada e
água, sendo mantidos em gaiolas com forragem de maravalha.
Decorridos os períodos experimentais particulares a cada grupo
de animal, o tecido reacional foi localizado visualmente e pela
palpação, sendo removido da região original seguindo os mesmos
procedimentos acima descritos. Em seguida os animais foram
submetidos à eutanásia pelo deslocamento cervical, seguindo as
normas éticas nacionais. Imediatamente após a coleta, as biópsias
foram congeladas a -80°C e armazenadas até o momento da
manipulação para a dosagem enzimática.
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS: EXTRATOS TECIDUAIS
A amostra, depois de descongelada, foi homogeneizada em
tampão acetato 0,1 M, pH 5, contendo EDTA e β-mercaptoetanol
1 mM e centrifugada a 10.000 rpm durante 30 minutos.
O sobrenadante constituiu o extrato a ser utilizado para a
quantificação de proteína e da atividade enzimática das diferentes
isoformas da fosfatase ácida (através da inibição diferencial por
tartarato, fluoreto, e pHMB), da arilsulfatase e β-hexosamidase
(enzimas lisossomais). O precipitado foi ressuspendido em tampão
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5 (contendo Triton X-100 0,2%, MgCl2 2
mM e NaCl 150 Mm). Após 30 minutos à temperatura ambiente,
a solução ressuspendida foi centrifugada a 12.000 rpm durante
20 minutos e o sobrenadante foi utilizado para a quantificação da
fosfatase alcalina de membrana.
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA
A proteína foi quantificada pelo método de Bradford como
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descrito anteriormente4 utilizando a albumina do soro bovino
como padrão.
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE FOSFATÁSICA
- Fosfatase Ácida Solúvel: Fosfatase Ácida Total (FAT): Para um
volume final de 1,0 mL, a reação foi iniciada pela adição de 50 µL
do extrato a um meio contendo 100 mM de tampão acetato de
sódio, pH 5,0, e 5 mM do p-nitrofenilfosfato (pNPP). A paralisação
ocorreu pela adição de 1,0 mL de NaOH 1,0 M, após incubação por
10 min a 37 °C14-15.
A formação do p-Nitrofenol foi determinada
espectrofotometricamente pela leitura da absorção a 405 nm
(espectrofotômetro Ultrospec 2000), tomando-se o valor de
18.000 M-1 cm-1 como coeficiente de extinção molar da forma
do p-nitrofenóxido6.
A FAT é constituída pela atividade de três isoformas
distintas: fosfatase ácida resistente ao tartarato (FART),
fosfatase ácida lisossomal (FAL) e fosfatase ácida de baixo
peso molecular, com atividade fosfotirosina proteína fosfatase
(PTP-BMr). Em resumo, FAT = FART + FAL + PTP-BMr. Na
Tabela 1 temos um resumo do modo como a atividade de cada
uma das isoformas pode ser determinada.
Tabela 1 - Determinação da atividade enzimática da fosfatase
ácida por meio de inibidores seletivos.
Atividade
Inibidores
FAT
sem inibidor
FART
Tartarato e pHMB
FAL
pHMB (inibe PTP-BMr); FAL = FAT – FART
PTP-BMr
Fluoreto e Tartarato (inibem FAL e FART)
Fosfatase Ácida Resistente ao Tartarato (FART): o
ensaio foi realizado como descrito acima, exceto pela adição de
p-hidroximercuribenzoato (pHMB,1 mM) e Tartarato (10 mM).
O pHMB inibe toda atividade da fosfatase ácida de baixo peso
molecular (FABMr) e a atividade residual na presença do tartarato
foi correspondente à FART.
Fosfatase Ácida Lisossomal (FAL): o ensaio foi realizado
como descrito acima,exceto pela adição de p-hidroximercuribenzoato
(pHMB), um potente inibidor da FABMr14. A atividade obtida foi
subtraída da Atividade FART uma vez que esta enzima não é inibida
pelo pHMB.
Fosfatase Ácida de Baixa Massa Molecular Relativa: o
ensaio foi realizado como descrito acima, exceto pela adição de
Tartarato e Fluoreto-inibidores das fosfatases de alto e médio
peso molecular.
Determinação da Fosfatase Alcalina de Membrana
(Falc): a atividade enzimática foi determinada a 37ºC, através da
formação do p-nitrofenol (coeficiente de extinção molar de 18.000
M-1 cm-1, em pH alcalino), utilizando-se o tampão glicina 25 mM,
pH 9,4, contendo 2 mM de MgCl2 e 1 mM de p-nitrofenilfosfato
em um volume final de 1,0 mL7. A reação foi iniciada pela adição
de 0,05 mL da amostra obtida como indicado na Figura 3. Em todos
os ensaios, uma unidade de atividade enzimática (UE) foi definida
como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de
p-Nitrofenol por minuto. A atividade enzimática específica (AE) é
expressa como unidade de atividade enzimática por miligrama de
proteína (AE = UE/mg).
Determinação da Arilsulfatase: a atividade da arilsulfatase
foi determinada pelo método descrito por Waheed & Van Etten26.
O extrato foi incubado em meio de reação contendo 1,0mL de
p-nitrocatecol-sulfato 5 mM em tampão acetato 0,05 M, pH 5,0.
Após 30 minutos a reação foi paralisada pela adição de 1,0 mL
de NaOH 1,0 M. A absorbância foi determinada pela leitura da
cor do comprimento de onda de 515 nm. A unidade de atividade
enzimática é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa
um µmol de substrato por minuto, sendo o coeficiente de extinção
molar do p-nitrocatecol de 1,24 x 104 M-1cm-1.
Determinação da β-hexosaminidase: a determinação da
ß-hexosaminidase foi realizada pelo método descrito por Taga25.
O extrato foi incubado em meio de reação contendo 1,0mL de
p-nitrofenil-N-acetil-ß-D-glucosaminida 3 mM em tampão acetato
0,05 M, pH 4,5 a 37 0C. Após incubação por 20 minutos a reação
foi paralisada pela adição de 1,0 mL de NaOH 1,0 M.
Uma unidade de atividade enzimática é definida como 1 µmol
de p-nitrofenol liberado por minuto, sendo o coeficiente de extinção
molar 1,8 x 104 M-1cm-1, no comprimento de onda de 405 nm.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada utilizando o programa InStat®
(GraphPad Software, Inc.), utilizando um teste não paramétrico
(Teste de Múltiplas Comparações de Dunn com análise estatística
por Kruskal Wallis).
RESULTADOS
A atividade específica da FAT foi diferente para os dois grupos
experimentais (M e MT) em todos os períodos (p < 0,05), exceto
com 60 dias (Figura 1). De modo geral, a atividade da FAT nos
dois grupos teve um aumento com o decorrer do tempo, ocorrendo
atividade máxima no período de 7 dias no grupo M (28 nmol/min.
mg) e 14 dias para o grupo MT (24 nmol/min.mg). A atividade
da FAT nos períodos de 1, 3 e 14 dias foi maior no grupo MT,
enquanto nos períodos de 7 e 28 dias a atividade registrada foi
maior para o grupo M.
A atividade da fosfatase ácida lisossomal (Figura 2A)
correspondeu, em média, a cerca de 30-40% da FAT, apresentando
uma evolução temporal similar à da FAT. Picos de atividade aos
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7 (M, 7,5 nmol/min.mg) e 14 dias (MT, 8,5 nmol/min.mg),
decrescendo em seguida e não apresentando diferença entre os
grupos experimentais (Figura 1).
Pode-se observar que a atividade específica da FART foi
extremamente baixa, sendo menor que 10% em relação à
FAT. A atividade máxima observada ocorreu aos 7 dias pósimplantação para os grupos M e MT, com uma AE de 1,1 e
1,4 nmol/min.mg, respectivamente (Figura 2B). Em ambos
os grupos a atividade enzimática após 60 dias foi similar ao
observado no período inicial.
Figura 1 - Representação dos valores da atividade específica
(AE) da enzima fosfatase ácida total (FAT) para os dois grupos
nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre os
grupos tratados e não tratados em cada período (* p < 0,05).
Figura 2 - (A) Representação dos valores da atividade específica
(AE) da enzima fosfatase ácida lisossomal (FAL) para os dois
grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre
os grupos tratados e não tratados em cada período (* p < 0,05).
(B) Gráfico representando os valores da atividade específica
(AE) da enzima fosfatase ácida tartarato resistente (FART)
para os dois grupos nos diferentes períodos experimentais.
Diferença entre os grupos tratados e não tratados em cada
período (* p < 0,05).
22
Dentre as diferentes isoenzimas da fosfatase ácida analisada,
o perfil PTP de BMr foi muito semelhante ao da FAT, inclusive
apresentando os maiores valores de atividade específica. A
diferença entre as AE dos grupos experimentais M e MT perdurou
até o período de 28 dias. A AE máxima para o grupo M ocorreu aos
7 dias (20 nmol/min.mg) e para o MT aos 14 dias (16,5 nmol/min.
mg) (Figura 3A).
Bastante interessante foi o perfil exibido pela fosfatase alcalina,
cujo pico de atividade máxima ocorreu com 3 dias (M, 19 nmol/min.
mg) e 1 dia (MT, 8 nmol/min.mg), diminuindo progressivamente e
sem diferença significativa após 14 dias, atingindo uma atividade
residual por volta de 1,5 nmol/min.mg (Figura 3B). A atividade
relativamente baixa da Falc após 28 dias, quando praticamente
não se encontra mais a membrana no tecido, indica uma forte
modulação desta enzima.
Figura 3 - (A) Gráfico representando os valores da atividade
específica (AE) da enzima fosfatase ácida de baixa massa
molecular relativa (PTPs) para os dois grupos nos diferentes
períodos experimentais. Diferença entre os grupos tratados
e não tratados em cada período (* p<0,05). (B) Gráfico
representando os valores da atividade específica (AE) da
enzima fosfatase alcalina (Falc) para os dois grupos nos
diferentes períodos experimentais. Diferença entre os grupos
tratados e não tratados em cada período (* p < 0.01).
Um perfil semelhante foi observado para a atividade de
arilsulfatase cujos picos de atividade ocorreram nos períodos
iniciais, entre 1 e 3 dias para M e MT. Após 28 dias a atividade
não apresentou diferença em função do período ou tratamento da
membrana (Figura 4A).
Os grupos experimentais apresentaram diferenças nos valores
referentes à atividade específica da β-hexosaminidase nos períodos
de 1, 3 e 14 dias, sendo maiores no grupo MT, com pico em 3 dias
(Figura 4B). Esta enzima lisossomal mostrou um comportamento
muito semelhante à arilsulfatase após 28 dias de implantação,
onde diferenças não foram observadas entre os grupos e períodos
experimentais.
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Figura 4 - (A) Gráfico representando os valores da atividade
específica (AE) da enzima arilsulfatase (ARIL) para os dois
grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença
entre os grupos tratados e não tratados em cada período (*
p < 0,05). (B) Gráfico representando os valores da atividade
específica (AE) da enzima β-hexosaminidase (β-hexo) para os
dois grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença
entre os grupos tratados e não tratados em cada período (* p
< 0,05).
DISCUSSÃO
Biomateriais à base de colágeno tiveram sua qualidade de
aplicação clínica comprovada tanto na regeneração tecidual
guiada como na regeneração óssea guiada8,18,20. Contudo, as bases
teciduais, celulares e moleculares da sua degradação ainda não
foram completamente desvendadas11. Sabe-se que o processo de
degradação envolveu o recrutamento de células polimorfonucleares
na fase inicial de inflamação aguda (dados não apresentados)2122
. Essa fase também está relacionada ao trauma cirúrgico e os
achados histológicos correlacionaram-se positivamente com a
maior atividade das enzimas lisossomais, FAL, arilsulfatase e
ß-hexosaminidase. À medida que o processo inflamatório passa
a ter um predomínio de macrófagos e células gigantes, com
a respectiva diminuição no número de polimorfonucleares, a
degradação das membranas acentua-se, em particular a partir do
período de 14 dias, quando, ainda, a atividade lisossomal mantémse em níveis similares aos períodos iniciais.
A quantificação da atividade específica das várias enzimas
nos mostrou dados interessantes. Um dos pontos em comum que
percebemos foi a diferença entre a atividade específica, de todas
as enzimas analisadas, entre a membrana sem tratamento para
a membrana com tetraciclina, nos períodos iniciais (1 e 3 dias).
Na maioria das enzimas analisadas essa diferença entre os grupos
experimentais se estendeu até o período de 7 dias (FAT, FAL, FART,
PTPs e Falc).
A análise enzimática mostra claramente que a adsorção de
tetraciclina à membrana induziu a uma atividade significativamente
maior da FAL, arilsulfatase e ß-hexosaminidase. Associando esta
informação ao fato de que a membrana tratada com tetraciclina
desapareceu mais rapidamente do tecido, podemos inferir que a
ação destas enzimas possa ter sido preponderante para a absorção
mais rápida da MT.
Tetraciclina é um antibiótico comumente usado que também
parece desempenhar um papel importante na modulação da
resposta imuno-inflamatória, verificada em várias doenças ósseas.
A associação de um agente terapêutico (que impede a infecção
bacteriana) a um biomaterial, com o objetivo de reparação e/
ou regeneração de defeitos ósseos, poderia contribuir para uma
melhor previsibilidade de resultados clínicos.
A fosfatase ácida resistente ao tartarato (FART) é classicamente
um marcador de osteoclastos19. Foi possível observar neste estudo
que, para ambos os grupos, a atividade FART foi extremamente
baixa e discreta em relação às outras fosfatase. O aspecto
microscópico das células gigantes em contato com as membranas
implantadas (dados não apresentados) e a tênue atividade FART
indicam que as células gigantes multinucleadas encontradas não
possuem características de osteoclastos.
Quanto à fosfatase alcalina (Falc), utilizada como biomarcador
para síntese de tecido ósseo, sua atividade foi discreta, o
que já era esperado sabendo-se que sua atividade é maior
em osteoblastos27,29 e os materiais testados não apresentam
capacidade osteoindutora.
O resultado obtido confirma estudos anteriores que
demonstraram que a atividade das isoformas da fosfatase ácida
são moduladas ao longo dos períodos experimentais, atuando na
reabsorção de xenoenxerto bovino28.
Em conjunto, verifica-se que a atividade destas enzimas pode
ser uma ferramenta interessante no estudo e desenvolvimento de
biomateriais, a fim de se determinar a intensidade da resposta
tecidual ao material.
CONCLUSÃO
Concluímos que o processamento da membrana de osso
bovino com a tetraciclina modifica significativamente a resposta
biológica, interferindo na atividade específica das enzimas
analisadas, em particular das enzimas lisossomais, contribuindo
para sua degradação acelerada.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Fundação de Amparo a Pesquisa do
Estado de São Paulo pelas bolsas concedidas (WFZ, 08/53003-9).
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