Laboratório

Aplicação das técnicas moleculares na monitorização de cultivos de
microalgas e gestão das zonas costeras
Patricia A. Clemente J. Assunção
Departamento de Biotecnología
Instituto Tecnológico de Canarias (ITC)
Porque é que se cultivan Microalgas?
 Actividade
económico.
escassamente
desenvolvida
mas
com
um
grande
potencial
 Actividade de baixo impacto ambiental (não compete por terra fértil).
As actividades podem ser associados com o ambiente (águas residuais,
hidroponia, gás de combustão, etc.)
Legislação
Sistemas
SistemasAbiertos
Abertos
Sistemas Fechados
Cómo se cultivam las Microalgas?
Laboratório
Centrifugação
Escalado
Atomização
Raceways (250L, 10.000L,…)
Biomasa (seca, fresca)
Aplicação da Biología Molecular
ANTES
DURANTE
DEPOIS
Laboratório
Cultivos
Producto final
Laboratório
A detecção de espécies de interesse em amostras de campo
3xs
Amostras
estirpes puras
3xs
Semanas, Meses
C- C+
PCR especifica
Sequenciação
Sequenciação
Laboratório
Identificação e/ou confirmação de estirpes adquiridas
Espécies mal identificadas: Colecções, publicações, base de dados
Identificação só até “sp.”: Muitas espécies do mesmo género
Só 1 espécie produz a sustancia de interese
(ej. Dunaliella sp., Nannochloropsis sp.)
Taxonomía tradicional: Características fisiológicas y morfológicas.
?
Taxonomia tradicional
Engenharía genética
Microalgas: Fábricas unicelulares
Fontes naturales esgotadas (ex. Taxol)
Knowhow en bacterias, hongos, levaduras
Tipo de proteína
Função
Aplicação
Anticorpo
Actividade contra a
glicoproteína D do vírus
herpes simple
Anticorpos
monoclonais
Anticorpo derivado
da IgG1
Actividade contra o
antigénio PA83 do ántrax
Anticorpos
monoclonais
Toxina B da cólera
Vacina oral contra
Staphylococcus aureus
Vacina oral
Factor necrose
tumoral
Tratamento do cáncer
Terapêutica
Soro bovino amiloide
asociado a las
glándulas mamarias
Estimulação da
produção de mucina no
intestino para a
imunização de recémnascidos
Terapêutica
Descarboxilasa de
ácido glutámico
humana 65
Diagnóstico precoz da
diabetes tipo I
Terapêutica
Factor de
crescimento
endotelial vascular
humano
Tratamento do enfisema
pulmonar e da disfunção
eréctil; antidepressivo
Terapêutica
Proteína B1 do grupo
de alta mobilidad
Cicatrização de feridas
pela activação de células
endoteliais
Terapêutica
Chlamydomonas reinhardtii:
gama completa de ferramentas moleculares para a manipulação genética
Grande capacidade para acumular biomasa (64.000L/4 semanas) (XXX-12h)
Manipulação genética (6-8 semanas)
Proteínas, biodiesel, pigmentos, …
Organismo
Bactérias
Levaduras
Células de insectos
Células de mamíferos
Animais
Células de plantas
Plantas
Microalgas
Costo de
producción
Baixo
Medio
Alto
Alto
Alto
Baixo
Muito baixo
Tiempo de
producción
Corto
Medio
Medio
Longo
Muy largo
Corto
Longo
Capacidad de
escalamiento
Alto
Alto
Medio
Muito bajo
Bajo
Alto
Muito alto
Calidad del
producto
Baixo
Medio
Alto
Muito alto
Muito alto
Alto
Alto
Riesgo de
Contaminación
Endotoxinas
Baixo
Alto
Virus-Priões
Virus-Priões
Baixo
Baixo
Muito bajo
Corto
Muito alto
Alto
Baixo
Rivera Solís et al. 2011. La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii: nueva alternativa para la producción de proteínas recombinantes de interés médico. Ciencia, (oct-nov):1-9
Cultivos de microalgas
Identificação (Bacterias, Diatomeas, Dinoflagelados, Cianobacterias)
PCR especificas (gênero, espécie…), Sequenciação (SSU, ITS, rbcL, …)
Contaminação (sistemas abertos)
Mais frequentes no verão
Identificar a espécie: Toxicidade?. Tomar medidas para evitar novas contaminações.
Sequenciação
Espécie a identificar
Extracção ADN
PCR
Sequenciação
Identificação
Identificação de toxinas nos cultivos de microalgas
PCR (vs HPLC, ELISA, etc….)
Identificar os genes que produzen toxinas:
Microcistinas (mcyA, mcyB, mcyC, mcyD, mcyE, mcyG)
Cilindrospermopsina
Extracção ADN
PCR
Gene a identificar
GTGATTGAATTTCTTGGTCG
GGAAATTTCTATGTCTGACTCAG
ATCCAGCAGTTGAGCAAGC
GCCGATGTTTGGCTGTAAAT
ATCACTTCAATCTAACGACT
AGTTGCTGCTGTAAGAAA
GCAACATCCCAAGAGCAAAG
CCGACAACATCACAAAGGC
GACGCTCAAATGATGAAAC
GCAACCGATAAAAACTCCC
CGCAAACCCGATTTACAG
CCCCTACCATCTTCATCTTC
ACTCTCAAGTTATCCTCCCTC
AATCGCTAAAACGCCACC
GGCATTCCTAGTTATATTGCCATACTA
GCCCGTTTTTGTCCCTTTCGTGC
CCTCGCACATAGCCATTTGC
GAAGCTCTGGAATCCGGTAA
GGCAAATTGTGATAGCCACGAGC
GATGGAACATCGCTCACTGGTG
ndaF
mcyA
mcyB
mcyC
mcyD
mcyE
mcyG
rpoC1
polyk etide
synthase
peptide
synthase
PCR convencional
PCR a tempo real
Furukawa K. J. of Bioscience and Bioengineering, (2006) 102 (2): 90-96; Ouahid Y. Environ Toxicol , (2005) 20:235-243; Fergursson KM, Saint CP. Environ Toxicol, (2003) 18(2):120-5.
Legislação)
Estudos de impacto ambiental (ex: A espécie a cultivar existe localmente?)
Lista de especies Marinas de Canarias (Algas, Hongos, Plantas y Animales).
Gobierno de Canarias. 2003
(Estudos antes 2002). (micro-organismos: Bacterias, Dinoflagelados y Cianobacterias)
Reino Plantae: sólo División Magnoliophyta
No está contemplado División Chlorophyta: Tetraselmis, Dunaliella
Taxonomia muda constantemente. Não detectar não significa que não exista.
PCR especifica para detectar a espécie de cultivo no ambiente marinho próximo.
PCR/sequenciação das espécies presentes nos cultivo de microalgas.
Producto Final (Chlorella)
Productos comerciais (comprimidos e cápsulas)
Amostras de biomasa comercial
Sequenciação do 18S rDNA
Outras especies (Scenedesmus, Parachlorella,…)
Diferentes espécies de Chlorella (C. vulgaris, C. sorokiniana,…)
Görs et al. (2010). Quality analysis of commercial Chlorella products used as dietary supplement in human nutrition. J Appl Phycol, 22:265–276
Casos Prácticos (Planta Piloto ITC)
1
2
?
?
Casos Practicos (Planta Piloto ITC)
Sequenciação do 18S rDNA, ITS
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): http://www.ncbi.nlm.nih.gov
árvore filogenética
Chlamydomonas oligothermica
Nannochloropsis salina isolate D12
Nannochloropsis salina strain MBIC10063
Nannochloropsis gaditana
Cepa problema
Nannochloropsis limnetica strain SAG 18.99
Nannochloropsis granulata strain MBIC10054
Nannochloropsis oceanica strain MBIC10090
Nannochloropsis maritima
Nannochloropsis oceanica strain LAMB0001
Casos Practicos (Planta Piloto ITC)
Isochrysis galbana
Nannochloropsis gaditana
OBRIGADA