Polimorfismo genético-bioquímico de enzimas em éguas da raça

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Polimorfismo genético-bioquímico de enzimas em éguas da raça
Polimorfismo genético-bioquímico de enzimas
em éguas da raça Mangalarga
R. de Lima e Silva, J. Bortolozzi1, P. R. R. Ramos, S. M. Dierckx2
Departamento de Fisica e Biofisica, Instituto de Biociencias, UNESP. Botucatu, Sao Paulo, Brasil
Genetic-biochemical polymorphism of enzymes
in Brazilian Mangalarga mares
ABSTRACT. A study was conducted with a group of mares of the Mangalarga breed in Brazil, with the aim of determining the electrophoretic pattern, in polyacrylmide gel, of the enzymes Acid Phosphatase, Alkaline Phosphatase and Peroxidase. Blood plasma samples of 45 mares in reproductive age were used. For Acid Phosphatase, we observed the existence of
two alleles, A and B, with allelic frequencies of 0.28 and 0.72, respectively: corresponding to three genotypes AA, AB and
BB. Allelic frequency demonstrated that the group was in Hardy-Weinberg-Castle balance. For Alkaline Phosphatase, three
genotypes were verified: Type I (HA ), presenting only one band of fast migration; Type II (HA -HA and HA -HA ), presenting two bands, with HA of intermediary position and HA of slower motility; and Type III, presenting all three bands
HA , HA and HA . Type I was most frequent, occurring in 21 animals. For Peroxidase, all animals presented a pattern of
two bands, designated as genotype I, suggesting that this is a monomorphic locus in the population under study.
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Key words: Mares, Mangalarga, allelic frequencies, acid phosphatase, alkaline phosphatase, peroxidase
©2002 ALPA. Todos los derechos reservados
Arch. Latinoam. Prod. Anim. 2002. 10(3): 149-152
RESUMO: Foi realizado um estudo com uma pequena população de éguas da raça Mangalarga, no Brasil para se determinar os padrões eletroforéticos em gel de poliacrilamida das enzimas fosfatase ácida, fosfatase alcalina e peroxidase.
Amostras de plasma sangüíneo foram utilizadas para o estudo de 45 éguas em idade reprodutiva. Para a fosfatase ácida observou-se a existência se 2 alelos A e B, com freqüências alélicas de 0.28 e 0.72 respectivamente; e 3 genótipos AA, AB e
BB. A freqüência alélica demonstra que a população se encontra em equilíbrio de Hardy-Weinberg-Castle. Para a fosfatase
alcalina constatou-se 3 genótipos: Tipo I (HA ), apresentando apenas uma banda de migração rápida, os genótipos Tipo II
(HA - HA e HA – HA ) apresentaram duas bandas, sendo que a banda lenta apresentava diferente razão de migração e um
genótipo Tipo III, apresentando as três bandas HA HA e HA . O genótipo mais freqüente foi o Tipo I com 21 animais. Para
o loco Peroxidase todos os animais apresentaram um padrão de duas bandas, designado de genótipo I, sugerindo que este
loco é monomórfico para a população em estudo.
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Palabras clave: Éguas, Mangalarga, freqüência alélica, fosfatasa acida, fosfatasa alcalina, peroxidase
trabalhos entretanto, existem descrevendo o polimorfismo
de enzimas em eqüinos.
A Fosfatase ácida foi descrita por Podliachouk et al.
(1972) que evidenciaram a variabilidade genética desta enzima em cavalos, regida por 2 alelos: AcPA e AcPB, originando 3 genótipos distintos denominados de AA, BB e AB.
Isso foi depois confirmado por Nozawa et al. (1988), que
utilizando também a técnica de eletroforese, observou para
Introdução
O polimorfismo bioquímico das proteínas representa um
imenso campo de investigação, nos animais. As variabilidades estruturais das proteínas e enzimas, que são determinadas geneticamente, e se encontram nas células, plasma sangüíneo e outros tipos de líquidos orgânicos, têm contribuído
para aumentar o número de marcadores genéticos. Poucos
Recibido Julio 02, 2001. Aceptado Junio 20, 2002
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Departamento de Ciências Biológicas, Faculdades de Ciências - UNESP - Campus de Bauru.
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Departamento de Produção e Exploração Animal, FMVZ, UNERSP - Campus de Botucatu.
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Lima e Silva et al.
os mesmos alelos: AcPA e AcPB três genótipos: AA e BB
com 2 bandas e o heterozigoto AB com 3 bandas.
No mesmo ano, Bengtsson & Sandberg, em gel de amido, obtiveram para a fosfatase ácida padrões de bandas que
não coincidiam exatamente com os descritos por Podliachouk et al. (1972), e foram chamados de F, FS e S.
Já a fosfatase alcalina foi descrita por Morizono et al.
(1976), trabalhando com soro de eqüinos e eletroforese de
disco em gel de poliacrilamida quando observaram três padrões de bandas denominados de tipo I, tipo II e tipo III.
Num trabalho mais minucioso, Dumas & Spano (1980)
analisaram o polimorfismo da fosfatase alcalina em amostras de tecidos, fluído abdominal e soro, utilizando a eletroforese em gel de poliacrilamida. Através da mobilidade
das bandas foi possível detectar a origem da fosfatase alcalina no soro de cavalos adultos, éguas gestantes e potros
sadios. Eles constataram que no soro de eqüinos adultos a
origem mais provável da atividade fosfatase alcalina seria
o fígado. Já as éguas gestantes, apresentaram uma segunda
banda que migrava com valor Rf próximo ao da variante
placentária, indicando que a placenta poderia contribuir
com a fosfatase alcalina no soro total, já que apresentavam
maior atividade desta enzima que animais não gestantes.
Nos potros, embora a fosfatase alcalina apresentasse
maior atividade que os animais adultos, sua atividade também teria origem no fígado, além da possível contribuição
da medula.
Yashiki et al. (1989), utilizando também gel de poliacrilamida separaram a fosfatase alcalina do soro eqüino em
duas bandas: tipo I e II, que foram associados com fosfatase
alcalina hepática e óssea, respectivamente. Outros trabalhos também tentaram justificar a origem das fosfatase alcalinas como Roger (1976) e Hoffman & Dorner, (1975), que
sugerem que a fosfatase alcalina sérica teria origem principalmente no fígado e na medula óssea, e Lee & Kenny
(1975), sugerem que a existência dessa segunda banda teria
origem medular e uma terceira banda, origem intestinal,
sendo que esta última teria seu nível determinado geneticamente, e de baixa freqüência. Essas três bandas também foram observadas em soro humano, por Smith et al (1968),
utilizando a técnica de gel de poliacrilamida, que concluiram que essas bandas seriam originárias do fígado, medula
óssea e intestino.
Este trabalho teve por objetivos analisar o polimorfismo
de três sistemas enzimáticos (Fosfatase Ácida, Fosfatase
Alcalina e Peroxidase), em éguas da raça Mangalarga.
Material e Método
Foram utilizadas amostras de 45 éguas da raça Mangalarga, em idade variando de 3 a 19 anos, provenientes de
fazendas situadas na região de Botucatu, estado de São Paulo. De cada animal foi coletada uma amostra de sangue
(15 mL) por meio de venopunção, em tubo estéril sem anticoagulante. Posteriormente os soros foram separados em
alíquotas de 2 mL e estocados em temperatura de –20°C.
Para a identificação de todas as enzimas empregou-se a
técnica de eletroforese vertical descontínua, em poliacrilamida 10% de concentração no gel separador, em pH alcalino, conforme técnica de Hames & Rickwood (1990). Foi
aplicado em cada ponto cerca de 20 L de soro. A corrida durou cerca de 7 horas. Os géis foram corados de maneira específica segundo Vallejos (1983).
Em todas as colorações o gel foi posteriormente fixado
em solução aquosa de glicerol a 10%.
Os padrões obtidos receberam a nomenclatura para a
fosfatase ácida empregada por Nozawa et al. (1988), e para
a fosfatase alcalina, segundo Morizono et al. (1976).
Como não foram encontrados trabalhos relatando polimorfismo genético-bioquímico da peroxidase em animais,
utilizou-se a seguinte nomenclatura: para as bandas de
maior migração a denominação de F (fast) e para as bandas
de migração mais lenta a denominação de S (slow), configurando o genótipo I.
Resultados e Discussão
1. Fosfatase Ácida. Três padrões distintos puderam ser
evidenciados através da separação eletroforética, com bandas de mesma intensidade de coloração. Esses padrões genotípicos foram designados por AA, AB e BB de acordo
com o número de bandas e mobilidade eletroforética apresentada. Dois deles estão ilustrados na Figura 1.
O padrão de bandas encontrados discorda dos observados por Podliachouh et al (1972) e Bengtoson & Sandberg
(1972). Em ambos os experimentos os pesquisadores empregaram gel de amido, o que pode explicar as diferenças
nas mobilidades das bandas. Além disso, as raças estudadas
eram diferentes.
As freqüências alélicas e os genótipos, encontradas na
população estão descritos nas Quadros 1 e 2.
As freqüências encontradas para os alelos AcPA e AcPB
foram de 0,28 e 0,72 respectivamente, estando a população
estudada em equilíbrio de Hardy-Weinberg-Castle
(c = 0,15; p = 0,92). Esses dados discordam dos obtidos por
NOZAWA et al. (1988), que constataram uma maior
freqüência do alelo AcPA (0,967) nos cavalos de Bangladesh. Esse fato provavelmente se deve à diferenças na origem da formação das raças, visto que o cavalo de Bangladesh se originou do cavalo primitivo da Mongólia e o cavalo Mangalarga, que é um animal de sela, tem como ancestral primitivo o cavalo Tarpan.
2. Fosfatase Alcalina. Quatro genótipos distintos foram
observados para a fosfatase alcalina. O genótipo Tipo I
(HA ), apresentando apenas uma banda de migração rápida,
os genótipos Tipo II (HA - HA e HA – HA ) apresentaram duas bandas, sendo que a banda lenta apresentava diferente razão de migração e um genótipo Tipo III, apresentando as três bandas HA HA e HA , como ilustra a Figura 2.
Na população de éguas Mangalarga observou-se a ocorrência de 21 animais apresentando o genótipo tipo I, que possui
apenas a banda HA1. Segundo Dumas e Spano (1980), Lee e
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Quadro 1. Freqüências alélicas dos locos Fosfatase Ácida
(AcP), para a população de éguas Mangalarga.
ORIGEM
-
Sistema
Alelo
Freqüência Alélica
AcP
A
0,28
B
0,72
Quadro 2. Teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg-Castle
e freqüências alélicas para fosfatase ácida para a
população de éguas Mangalarga
+
Figura 1. Eletroferograma de eletroforese alcalina (pH 8.3),
em gel de poliacrilamida, em sistema de tampões
descontínuos a 10% de concentração no gel de separação e 2.5% no gel de empilhamento, ilustrando s genótipos de fosfatase ácida.
Genótipos
Freqüências Alélicas
Obs.
ORIGEM
-
Esp.
AA
4,0
3,47
AB
17,0
18,06
23,47
BB
24,0
c2 calc.
0,15 (n.s.)
gl
2
p
0,69
Quadro 3. Freqüências de genótipo por grupo em
porcentagem (%), para Fosfatase Alcalina na
população de éguas Mangalarga (P).
+
Genótipos
Figura 2. Eletroferograma de eletroforese alcalina (pH 8.3),
em gel de poliacrilamida, em sistema de tampões
descontínuos a 10% de concentração no gel de separação e 2.5% no gel de empilhamento, ilustrando s genótipos de fosfatase alcalina.
ORIGEM
-
Nº Animais
(%)
Tipo I (HA1)
21
46,68
Tipo II (HA1 – HA2)
15
33,33
Tipo II (HA1 – HA3)
7
15,55
Tipo III
2
4,44
animais e no caso do genótipo HA – HA , 7 animais. Esses
dados concordam com Roger (1976) e Hoffman e Doner
(1975), sendo essa segunda banda provavelmente de origem medular.
Ao se analisar o genótipo tipo III constatou-se o aparecimento apenas em 2 animais. Esse mesmo padrão foi observado por Smith et al. (1968), Morizono et al. (1976) e Lee
& Kenny (1975), tendo provavelmente origem intestinal.
3. Peroxidase. Constatou-se a presença de padrões de 2
bandas, de iguais mobilidades e colorações, para todos os
animais em estudo.
Esse genótipo foi designado de genótipo I, e encontra-se
ilustrado na Figura 3. Como durante todo o processo de revisão bibliográfica, não foram encontrados trabalhos de eletroforese de peroxidase em animais, e como o loco em estudo
é monomórfico, não é possível aferir nada sobre essa enzima.
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FS FS FS FS FS FS FS FS FS FS FS FS FS
+
Figura 3. Eletroferograma de eletroforese alcalina (pH 8.3),
em gel de poliacrilamida, em sistema de tampões
descontínuos a 10% de concentração no gel de separação e 2.5% no gel de empilhamento, ilustrando s genótipos de peroxidase.
Kenny (1975) e Yashiki et al. (1989) essa banda seria de
origem hepática, e está sempre presente em todos os animais, concordando com os resultados aqui obtidos.
Quando analisado o genótipo Tipo II, que apresenta duas
bandas, foram encontrados para o genótipo HA - HA , 15
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Conclusões
Embora o número de amostras tenha sido pequeno pode-se concluir que:
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1.
2.
3.
Lima e Silva et al.
Através das técnicas utilizadas classificar os genótipos
dos animais através dos padrões eletroforéticos de Fosfatases Ácida e Alcalina.
Para o loco Peroxidase todos os animais apresentaram
um padrão de duas bandas, designado de genótipo I,
sugerindo que este loco é monomórfico para a população em estudo.
Foi constatada a ocorrência de polimorfismo genético-bioquímico das enzimas em éguas da raça Mangalarga com os genótipos: fosfatase ácida: AA, AB e BB,
e freqüências alélicas: AcP = 0,28 e AcPB =0,72; fosfatase alcalinas: Tipo I, Tipo II e Tipo III.
A
Literatura Citada
Bengtsson, S. B., K. Sandberg. 1972. Phosphoglucomutase polymorphism
in Swedish horses. Anim. Blood groups Biochem. Genet., 3:115119.
Dumas, M.B., Spano, J.S. 1980. Characterization of equine alkaline phosphatase isoenzymes based on their electrophoretic mobility by polyacrylamide gel disc electrophoresis. Am. J. Vet. Res., v.41, n. 12,
p.2076-81.
Hames, B.D., Rickwood, D. 1990. Gel electrophoresis of proteins. 2 ed.
New York: Oxford University Press. 383 p.
Hoffman, H. E., Dorner, J. L. 1997. J. Am. Anim. Hosp. Assoc., v.11,
p.283, 1975. Appud Kaneco, J.J., Harvey, J.W., Bruss, M.L. Clinical
Biochesmistry of Domestic Animals.5ª ed., Nova York, Academic
Press, 932p.
Lee, L.M.Y., Kenny, M.A. 1975. Electrophoretic method for assessing the
normal and pathological distribution of alkaline phosphatase isoenzymes in serum. Clin. Chem., v.28, p.1128-35.
Morizono, M., Kita, T., Nishiyama, S. 1976. Clinical studies on serum alkaline phosphatase in domestic animals. II. Detection of isoenzymes
of serum alkaline phosphatase in domestic animals. Bull. Fac. Agric.
Kagoshima Univ., v.26, p.95-112.
Nozawa, K. et al. 1988. Gene constitution of the native horses in Bangladesh. Rep. Soc. Res. Native Livestock, v.12, p.123-34.
Podliachouk, L. et al. 1972. Imunogenetic Study of the Mur-Insulan
Horses. In: Proc. XIIth Europ. Conf. Anim. Blood Grps. Biochem.
Polymorph., Budapest, p.533-6.
Rogers, W.A. 1997. J. Am. Vet. Med. Assoc., v.168, p.934, 1976. Appud
Kaneco, J.j., Harvey, J.w., Bruss, M.l. Clinical Biochesmistry of Domestic Animals.5ª ed., Nova York, Academic Press, 932p.
Smith, I. et al. 1968. Separation of human tissue alkaline phosphatase by
electrophoresis on acrylamide dis gel. Clin. Chem. Acta., v.19, p.499
- 505.
Vallejos, C.E. Enzyme Activity staining. In: TANKSLEY, S.D. & ORTON, T.J. (Eds). Isozyme in Plant Genetics and Breeding. New
York: Elsevier, 1983. p.469-516.
Yashiki, K., et al. 1989. Serum alkaline Phosphatase Isozymes of horses.
Bulletin Equine Res. Inst., n.26, p.17-22.

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