MC6 - Cromatografia e os jogos olímpicos de 2016

CROMATOGRAFIA LIQUIDA NO
CONTROLE ANTI DOPING
PROF. RICARDO MATHIAS ORLANDO
[email protected]
Ricardo Mathias Orlando
BELO HORIZONTE
1
A summary of the history of drug abuse in sports is found
in the following timeline:
1950s: Drug use seen in competitions: drug controls begin.
1960: Danish cyclist dies at Rome Olympic Games: amphetamine use.
1967: British cyclist dies at Tour de France: amphetamine use.
1967: IOC Medical Commission formed: sub-commission on doping control.
1968: Mexico City Olympic Games: first preliminary drug tests; only nonsteroidal
drugs.
1972: Munich Olympic Games: first formal drug control program; preliminary steroid
tests.
1976: Montreal Olympic Games: first formal steroid control.
1980: Moscow Olympic Games: no positive drug cases reported.
1984: Los Angeles Olympic Games.
1988: Seoul Olympic Games: stanozolol positive; unreported positives.
1992: Barcelona Olympic Games: clenbuterol positives.
1994: Chinese swimmers found positive for dihydrotestosterone.
1995: Dope testing pioneer Manfred Donike dies.
1996: Atlanta Olympic Games: Bromantan positives using high
resolution mass spectrometry (HRMS) results not reported.
Ganhou 7 vezes consecutivas o Tour de France e foi banido do ciclismo
em 2012 pelo uso de eritropotina (EPO), testosterona e transfusão
Lance Armstrong net worth is 125 million of dollars and he is a
professional American cyclist
ENTREVISTA DO PRESIDENTE DA WADA CRAIG REEDIE À REDE
DE TELEVISÃO CNN
"If somebody produces a completely new substance that should
be banned, it will take us some time to firstly identify it and then
create a test (for it).”
“One test can cost as much as $1,500, which
means that anti-doping agencies prefer to test an
individual they suspect of doping rather than
blanket test across the board”
"People who wish to cheat have different and more opportunities
to cheat than we have to resolve it in conventional ways"
POR QUÊ SEPARAR?
TIRAR OU REDUZIR INTERFERÊNCIAS;
 REDUZIR O RUÍDO e ELEVAR O SINAL DO ANALITO;
COMPATIBILIZAR A AMOSTRA;
 OBTER DADOS QUALITATIVOS ADICIONAIS (tempo de retenção);
COMO SEPARAR?
CROMATOGRAFIA A GÁS;
CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO;
 ELETROFORESE;
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GC-MS/MS
Trailer-borne laboratory supervised by Dr. Manfred Donike
screened athletes for drug usage during the XXth Olympic games
in Munich using eight HP 7600A Gas Chromatographs.
LC-MS/MS
DETECÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
GAS CHROMATOGRAPHY (CROMATOGRAFIA A GÁS)
 Primeira escolha
 Grande velocidade e eficiência de separação, baixo consumo de solventes,
menor custo dos equipamentos
 Bibliotecas de massas
 Sensibilidade geralmente superior
LIQUID CHROMATOGRAPHY (CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO)
 Para compostos não voláteis e termo instáveis
 Atualmente as velocidade e eficiência de separação são mais próximos do GC
 Preparo de amostras menos intensivo e não precisa de derivatização
MASS SPECTROMETRY (ESPECTRÔMETRO DE MASSAS)
Sistema de detecção “inequívoco”, universal e seletivo
LIQUID
CHROMATOGRAPHY
GAS
CHROMATOGRAPHY
MASS
SPECTROMETRY
 Mikhail Semyonovich Tsvet, (Tsvett, Tswett, Tswet,
Zwet ou Cvet em outros idiomas) , em russo ‘’’Михаил
Семенович Цвет’’’ (1872 - 1919) foi um botânico
“russo” que inventou a cromatografia por adsorção.
 Foi durante estudos sobre a clorofila das plantas que
utilizou a cromatografia.
 Separou clorofila de uma mistura
de pigmentos de plantas, através de
uma coluna recheada de carbonato
de cálcio em pó, fazendo a eluição
com éter de petróleo.
Cromatografia líquida
de alta eficiência
(CLAE, HPLC)
Cromatografia líquida
de ultra eficiência
(CLUE, UHPLC)
UPLCTM
COLUNAS E FASES ESTACIONÁRIAS DE HPLC E UHPLC (CLAE E CLUE)
21:22
18
Nicoli et al 2016.
ESTUDO DE CASO
 A UHPLC–HRMS method for the screening of a large number of analytes including
anabolic agents, 2-agonists, hormone antagonists and modulators, diuretics,
stimulants, narcotics, glucocorticoids and –blockers ( 180 compounds!).
 The method presented has been used for the analysis of over 5000
samples in about one month and proved to be reliable.
CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
 A Waters Acquity UPLC® system equipped with a 2777 open architecture
autosampler (Waters, Milford, MA, USA) was used.
 Separation was carried out on an Acquity UPLC® BEH C18 column (2.1 mm ×
50 mm, 1.7 m).
 Mobile phase A consisted of 0.3% aqueous formic acid and mobile and phase
B was 0.3% formic acid in acetonitrile.
UHPLC versus HPLC
Cromatografia é um MÉTODO DE SEPARAÇÃO que depende
fundamentalmente da diferença de interação/distribuição dos analitos entre
uma fase que permanece móvel (FM) e outra fase que permanece estacionária
(FE), ambas em contato íntimo.
A alta ou ultra eficiência da separação está relacionada à menor
dispersão das moléculas durante sua passagem pelo sistema
cromatográfico (coluna e tubulações)
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DISTRIBUIÇÃO NORMAL (CURVA DE GAUSS):
Distribuição hipotética das espécies químicas em um
volume de injeção Vinj chegando ao detector caso
não houvesse nenhum fenômeno de dispersão
Distribuição hipotética das espécies químicas
chegando ao detector m função dos diferentes
fenômenos de dispersão ao passar pelas tubulações
e pela coluna cromatográfica
O QUE É O ALARGAMENTO (DISPERSÃO) DA BANDA
Durante o movimento dentro da tubulação (antes, durante e após a coluna) as
espécies químicas se dispersam em um plug (volume) de amostra maior do que
o original em que foram injetadas.
Neste exemplo apesar da
diferença de cores todas as
espécies químicas são
Algumas chegam na
frente
iguais.
Uma parte chega em um tempo médio
(tempo de retenção tR)
Algumas chegam
“atrasadas”
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EFEITO DO ALARGAMENTO (DISPERSÃO) DA BANDA NA CONCENTRAÇÃO
Concentração de dois compostos em função da distância percorrida na
coluna cromatográfica
21:22
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CONSEQUÊNCIAS DE UMA MAIOR DISPERSÃO DA BANDA
CROMATOGRÁFICA
■ Maior dificuldade na determinação das áreas verdadeiras dos picos
cromatografados (maior erro e a incerteza de quantificação).
Incerteza e erros
maiores
Incerteza e erros
menores
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CONSEQUÊNCIAS DE UMA MAIOR DISPERSÃO DA BANDA
CROMATOGRÁFICA
■ Diminui a concentração do analito que atinge o detector e reduz a
detectabilidade do método.
DETECTORES – PARÂMETRO BÁSICO DE DESEMPENHO
Quantidade Mínima Detectável Massa de um analito que gera um pico com altura
igual a três vezes o nível do ruído
SINAL (S)
S
N
=3
Qualquer componente do sinal gerado pelo detector
que não se origina da amostra/analito
TEORIA DO ALARGAMENTO DA BANDA
H é chamado de altura do prato: representa o grau de dispersão da
banda (largura do pico w) em função do caminho percorrido (L, comprimento
da coluna). Depende de três parâmetros físicos principais (descritos pelos
termos A, B e C) além da vazão.
CAMINHOS MÚLTIPLOS OU CAMINHOS PREFERENCIAIS
(TERMO A)
TAXA DE DIFUSÃO LONGITUDINAL (TERMO B)
TEMPO DE EQUILÍBRIO FINITO OU TAXA DE TRANSFERÊNCIA DE
MASSA (TERMO C)
wt1
wt2 > wt1
CURVA DE VAN DEEMTER
Nesse gráfico são constantes: o
comprimento e diâmetro da
coluna, diâmetro da partícula,
composição da fase móvel,
temperatura, volume e massa de
injeção.
Combinação dos três parâmetros
(A, B e C) e a “vazão” empregada
(F  ).
Existe uma velocidade linear (ou
vazão) ótima onde H será mínimo
e N máximo para uma dada
coluna.
■ Frequentemente emprega materiais particulados
(CLAE também emprega monolitos).
■ Partículas esféricas e de tamanho próximos
(regulares).
■ Frequentemente partículas porososas ou altamente
porosas (área superficial próxima ou superior a 500 m2
g-1).
■ Partículas pequenas (CLAE  10 a 3 m) (CLUE 
< 2 m).
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QUANTO MENOR A PARTÍCULA MENOR É A DIFERENÇA DA
TAXA DE TRANSFERÊNCIA DE MASSA (TERMO C)
CURVA DE VAN DEEMTER
21:22
Liane Maldaner; Isabel Cristina Sales Fontes Jardim, 2009
40
(A) CLAE: Coluna C18 (150 x 4,6 mm, 5
μm); vazão da FM: 1000 μL/min e volume
de injeção: 20 L. GRADIENTE: T(A:B) = T0
(100:0), T30 (40:60), T31 (100:0), T45
(100:0).
(B) CLUE: Coluna C18 (50 x 2,1 mm, 1,7
μm); vazão da FM: 610 μL/min, volume de
injeção: 1,4 μL . GRADIENTE: T (A:B) = T0
(100:0), T3,4 (40:60), T3,5 (100:0), T5,1
(100:0).
FM: A – 0,01% de ácido fórmico em H2O e
B – 0,01% de ácido fórmico em
acetonitrila:água (50:50 v/v); temperatura:
30 ºC e detecção UV.
21:22
Liane Maldaner; Isabel Cristina Sales Fontes Jardim, 2009
41
Impureza II da primaquina. Condições Cromatográficas: (A) CLAE: FM:
acetonitrila:água acidificada com 0,01% de ácido trifluoracético (25:75 v/v),
vazão de FM: 1,0 mL/min, volume de injeção: 10 μL, detecção UV a 265 nm e
temperatura: 35 ºC. (B) CLUE: as mesmas condições que em (A) com exceção
da vazão
21:22
de FM: 0,5 mL/min e volume de injeção: 0,8 μL. Adaptada da ref.42
21
DISPERSÃO DEVIDO AO MOVIMENTO DOS LÍQUIDOS DENTRO DAS
TUBULAÇÕES
Quer seja em uma coluna ou tubo
sem recheio (fase estacionária) ou
com recheio (coluna cromatográfica)
a dispersão do “plug” de amostra irá
ocorrer com esse perfil.
DISPERSÃO DEVIDO AO MOVIMENTO DOS LÍQUIDOS DENTRO DAS
TUBULAÇÕES
Aço inoxidável
(poli-éter-éter-cetona)
PEEK
 Quanto menor o comprimento e, especialmente, menor o
diâmetro da tubulação menor será a dispersão.
A CONTRAPARTIDA DE UM MENOR DIÂMETRO DE PARTÍCULA (ALÉM DO
COMPRIMENTO E DIÂMETRO DA COLUNA) É UMA ELEVAÇÃO DA
PRESSÃO PELO QUADRADO DA VARIAÇÃO DO DIÂMETRO DA
PARTÍCULA:
Comprimento da coluna
Viscosidade da FM
vazão
Diâmetro da coluna
Diâmetro da partícula
Pressão em psi
UHPLC
 15000 psi
HPLC
5000 psi
H = 0,5 µm para uma
partícula típica de 1.7 µm
H = 1,25 µm para uma
 1.5 a 2 vezes o preço
partícula típica de 5.0 µm
de um HPLC
SEPARAÇÃO ISOCRÁTICA E GRADIENTE
3 TIPOS DE RESOLUÇÕES INADEQUADAS
1. Falta de resolução em todo o cromatograma
2. Falta de resolução no final do cromatograma
3. Falta de resolução no início do cromatograma
O GRADIENTE DE SEPARAÇÃO É UMA MUDANÇA DA
COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL DURANTE A CORRIDA
CROMATOGRÁFICA PROMOVIDA OU POR UMA VÁLVULA OU
MUDANÇA DE VELOCIDADE DOS PISTÕES
EXEMPLO DE GRADIENTE DE SEPARAÇÃO
Fig. 1. Gradient profile and distribution of the analytes. Mobile phase
A: 0.3% formic acid in water; mobile phase B: 0.3% formic acid in
acetonitrile; flow rate: 0.3 mL/min.
Nicoli et al 2016.
PREPARO DE AMOSTRAS
1) To the urine samples (1 mL of urine sample added of 100 uL of the IS
solution and 1 mL of -glucuronidase solution (vortex-mixing, samples were
incubated for 1 h at 50 ◦C);
2) 2 mL of the 2% formic acid solution in water was
added to the samples with mixing (centrifugation).
3) The SPE procedure employed Bond-Elut Plexa PCX (60 mg, 3 mL) SPE
cartridges from Agilent Technologies (Lake Forest, CA).
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
PREPARO DE AMOSTRAS
3) The SPE procedure employed Bond-Elut Plexa PCX (60 mg, 3 mL) SPE
cartridges from Agilent Technologies (Lake Forest, CA).
3.1) Samples were loaded onto pre-conditioned using 0.5 mL of methanol,
followed by 0.5 mL of formic acid 2% solution) SPE cartridges.
3.2) Sample loading.
3.3) Three washing steps were applied in the following order: 1 mL of 2% formic
acid in water, 1 mL of water and 1 mL of (20%, v/v) methanol in
water. Washing solvents were then removed from the cartridges
by applying vacuum.
3.4) Elution of analytes was performed using 3 mL of 3% ammonium hydroxide in
methanol:acetonitrile (50:50, v/v).
PREPARO DE AMOSTRAS
4) Samples were evaporated under a nitrogen flow for 20 min at 60 ◦C and then
re-dissolved into 100 µL of a solution composed of acetonitrile (5%, v/v) in water
containing formic acid (0.3%, v/v).  Samples were processed in batches of 20
and the total sample preparation time for a single batch was 2 h. 
 1 mL amostra inicial e no final 100 µl
 5000 amostras ÷ 20 = 250 batches
 250 batches  2 horas cada = 500 horas
 500 horas ÷ 30 dias = 16,7 horas por dia extraindo e
preparando as amostras para realizar o trabalho
ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQÜENCIAL
DETECÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Bomba
Turbo Molecular
Sistema de alto vácuo
Introdução
da amostra
Fonte de
ionização
Onde a cromatografia faz sua
maior diferença
Analisador
de massas
Detector
Detetor
Aquisição
de dados
INCOMPATIBILIDADE DA FASE MÓVEL COM SISTEMAS DE
DETECÇÃO
■ Espectrômetro de massas: A fonte de ionização
■ ELETRONEBULIZAÇÃO (ESI, ELECTROSPRAY IONIZATION). Processo no qual
espécies ionizadas na fase gasosa são produzidas a partir de uma solução pela formação e
dessolvatação de minúsculas gotas altamente carregadas, que são resultantes da aplicação
de uma diferença de potencial da ordem de kV entre um capilar e um contraeletrodo, sob
pressão atmosférica.
EFEITO DE MATRIZ EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS
CAUSAS DO EFEITO DE MATRIZ EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS
RESOLUÇÃO E EXATIDÃO NA ESPECTROMETRIA DE
MASSAS PARA ANÁLISES CONFIÁVEIS
Figure 1. Mass resolution of R = 25,000 at m/z 200 masks the pesticide isopyrine due
to a non-resolved matrix interference (red); whereas, resolution setting of R = 100,000
at m/z 200 resolves the analyte molecule from the matrix background.
500 ppm
Fig. 2. Extracted ion
chromatograms of a urine
sample containing 30 ng/mL of
formoterol (m/z 345.1809)
obtained with different mass
range windows. RT: retention time
(min); AA: peak area; BP: base
peak (m/z).
5 ppm
ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQÜENCIAL
Cela de colisão MS2
Gaiola de
íons para
acumular íons
Filtro de massas
octapolar
Resolução de 140.000 em m/z 200
Velocidade de aquisição de 12 Hz para uma resolução de 17500
Exatidão de massa: erro menor 3 ppm
Fig. 4. Use of CID fragmentation to increase selectivity for the detection of
acebutolol: (A) urine sample spiked with acebutolol at 100 ng/mL; (B and C)
blank urine samples from different volunteers; (D) proposed fragmentation pattern.
RELATÓRIO, REDIGIDO PELO PROFESSOR CANADENSE DE
DIREITO ESPORTIVO RICHARD MCLAREN:
"O ministro de Esportes russo comandou, controlou e supervisionou a
manipulação dos resultados dos atletas, ou as trocas de amostras,
com a ativa participação da FSB (serviço secreto russo), CSP (Centro
de Preparação Esportiva para atletas russos) e os laboratórios de
Moscou e Sochi".
AGRADECIMENTOS
[email protected]