Introdução à Microbiologia - Laboratório de Biologia - IFSC

Microbiologia
FFI0751
Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo
Laboratório de Epidemiologia e Microbiologia Molecular (LEMiMo)
Grupo de Cristalografia
Profa. Dra. Nelma Regina Seginini Bossolan
Grupo de Biofísica Molecular “Sergio Mascarenhas”
Microbiologia
FFI0751
Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo
LEMiMo – Campus II – Piso 1, sala 106
Ramal: 738654
[email protected]
http://biologia.ifsc.usp.br/
Microbiologia
• Microbiologia como ciência;
• Impactos sobre o homem;
• Tipos de organismos estudados;
Aula Parte I
• Células procarióticas e eucarióticas;
Aula Parte II
• Microscopia de microrganismos
Microbiologia
• É a ciência que estuda os microrganismos – um grande e diverso grupo de
organismos microscópicos- que podem ser encontrados como células
únicas ou grupamentos celulares.
• Diferente dos organismos macroscópicos, os microrganismos são em geral
capazes de realizar seus processos vitais de crescimento, geração de
energia e reprodução, sem depender de outras células.
http://www.ufrgs.br/alimentus/pao/fermentacao/fer_crescimento01.htm
Microbiologia como ciência
• O que estuda?
– Como ciência biológica básica: microrganismos
como modelos para estudo de funções celulares
de organismos superiores; as bases físicas e
químicas que permitiram o surgimento da vida
provêm de estudos com microrganismos.
– Como ciência biológica aplicada: trata de
questões práticas importantes da medicina,
agricultura e indústria.
Microbiologia como ciência
Meta dos
microbiologistas
Compreender
como os
microrganismos
atuam
Otimizar
seus efeitos
benéficos
Minimizar
atividades
danosas
Impactos sobre o Homem
© 2004 Pearson Education, Inc.
Impactos sobre o Homem
Bactérias são usadas para recuperar
metais valiosos de sucata de
eletrônicos e rejeitos de minas
Projeto FAPESP
Coordenador Jorge Soares Tenório / USP
2010/51009-0
Recuperação de ouro de placas de circuitos impresso de computadores
obsoletos através de processo bio-hidrometalúrgico
Dez 2013
Impactos sobre o Homem
Tipos de organismos estudados
Bactérias
Anabaena sp, 600X, MEV
Listeria monocytogenes (3000X,
MEV)
Halobacterium sp, 1600X, MEV
Fungos
Aspergillus ustus, 600X, MEV
Saccharomyces cerevisiae,
800X, MEV
Mucor sp, 400X, MEV
Algas
Volvox - Detalhe
Volvox aureus, 40X, MO
Spirogyra sp, 100X, MO
Protozoários
Ameba - pinocitose
Trypanosoma sp, 1000X, MEV
Paramecium
multimicronucleatum, 200X,
MEV
Vírus
Seres microscópios de natureza acelular
Retrovirus – HIV, 14.500X, TEM
Vírus da hepatite B, 50.000X,
MEV
Vírus do mosaico do tabaco, 27.300X,
MEV
Células Procarióticas e
Eucarióticas
Aula 1 - Parte I
Microbiologia FFI0751
Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo
Procariotos x Eucariotos
ribossomos
Nucleóide
citoplasma
Membrana nuclear
Membrana citoplasmática
Complexo de
Golgi
Mitocôndria
...
..
Peroxissomo
Lisossomo
Membrana citoplasmática
Parede celular
Espaço periplasmático
Membrana externa
Retículo
endoplasmático
rugoso
Vesícula
secretória
Organelas  estruturas delimitadas por membrana
Procariotos x Eucariotos
Mitocôndrias
Cloroplastos
Procariotos
Tamanho: 0,2 a 2 µm
Eucariotos
Eucariotos
Organelas delimitadas por membrana
Tamanho: 10 a 100 µm
Eucariotos
Célula eucariotas (algas, fungos e plantas)  parede celular: composta pelo
polissacarídeo quitina além de glicana e manana (fungos), ou celulose (plantas).
Protozoários não tem PC,
mas tem película
Animais contém o
glicocálice
(carboidratos adesivos)
Eucariotos
Comparação entre os tamanhos
Procariotos x Eucariotos
http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/immuno-port-chapter1.htm
http://www.fortunecity.com/greenfield/eco/813/mod2aula4.html
Trypanosoma em esfregaço sanguíneo. A
membrana ondulante e o núcleo são
visíveis.
Rickettsia ricketsi dentro de células
do sangue (bactéria).
http://anhembi.br/publique/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=1758&sid=203
Procariotos x Eucariotos
Células da mucosa vaginal
Célula superficial, cujo citoplasma é
avermelhado e cujo núcleo é picnótico,
entre duas células intermediárias. Há
grande quantidade de bacilos de
Döederlein.
http://www.pathology.com.br/papanicolaou/papanicolaou.html
Célula da mucosa bucal
http://clubeaprendiz.googlepages.com/observa%C3%A7%C3%B5esmicrosc%C3%B3picas
Microscopia de microrganismos
Aula 1 - Parte II
Microbiologia FFI0751
Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo
Microscopia de microrganismos
Tabela 1. Unidades de medidas comuns
0,01 m
0,001 m
0,000001
0,000000001 m
0,0000000001m
27
O primeiro microscópico da história
Ampliação de 300x e resolução de 1 m
28
Tipos de microscópios
-Microscópio óptico ou de Luz
-Microscópio confocal
-Microscópio eletrônico
-Microscópio de tunelamento
-Microscópio de força atômica
30
Relações entre os tamanhos
- Microscópio óptico ou de Luz
-Microscópio Eletrônico
31
Tortora, 6ª ed, 2000
Microscópio óptico composto
MO
-com várias lentes
-Utiliza a luz visível como fonte de iluminação
32
33
Rota de Luz no microscópio de baixo para cima
Oculares
Ampliação
Prisma
Objetivas
Ampliação
Amostra
Condensador
Iluminador
34
Laboratório
Objetivas
Código de
aumento
Tipo de
aberração
corrigida
Correção de curvatura de campo
Aumento
Comprimento do tubo/
espessura da lamínula
Abertura numérica
Distância de
trabalho
36
Objetivas
São classificadas como:
• Acromáticas: Ajustadas para duas cores, geralmente o vermelho e o verde
(ou seja, permite que apenas algumas cores sejam observadas, selecionando a
frequência de luz visível de interesse por meio de seu índice de refração
durante a fase de fabricação da lente).
• Apocromáticas: Ajustadas para três cores, normalmente o vermelho, o verde
e o violeta.
• Não-acromática: Não ajustada para cor alguma. Possui a característica de
formar halos coloridos ao redor da imagem.
Lente objetiva
Lente ocular
Ampliação total da amostra
Ampliação total =
potência de ampliação de lentes objetivas x da ocular
Objetivas:
10X (baixa potência)
40X (alta potência)
100X (imersão em óleo)
100X
400X
1000X
Ocular:
Amplia a amostra por um fator de 10
40
Amplificação e resolução
Resolução ou Potência de resolução
Capacidade das lentes de diferenciar detalhes finos e estruturas
Capacidade de individualizar dois pontos adjacentes
 Diferenciar entre dois pontos com uma distância específica entre os mesmos
Ex: Microscópio com resolução de 0,4 nm  pode distinguir 2 pontos se eles estão no
mínimo a 0,4 nm de distância um do outro.
Quanto menor o comprimento de onda luminosa usado no instrumento, maior a
resolução.
MO  Luz branca com comprimento de onda longo e não pode oferecer resolução a
estruturas menores que 0,2 m
Limitação da ampliação a cerca de 2000 X.
Microscópio eletrônico  resolução de cerca de 1000 vezes superior!
42
Limite de resolução
D = 0,61 
NA
D = limite de resolução (diâmetro do menor objeto que pode ser distinguido)
= comprimento de onda da luz visível (em geral 0,5m)
NA = Abertura numérica (medida da capacidade de concentrar a luz)
NA =  sen 
- metade do ângulo dos raios de luz extremos que ainda
penetram a objetiva (> valor = 90°)
- Índice de refração do meio intercalante (espaço entre
amostra e objetiva)

Ar   = 1
Óleo   = 1,4
Luz azul com menor
comprimento de onda
Melhor resolução = filtro azul!
43
Limite de resolução
Abertura numérica
(medida da capacidade de concentrar a luz)
> Largura angular e abertura numérica
Melhor resolução
< distância de trabalho
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Índice de refração
Obtenção de imagem clara e detalhada em MO
amostra com alto contraste com seu meio
Diferenciar o índice de refração das amostras
daquele do seu meio
Velocidade relativa com que a Luz
passa através de um material
Altera a direção dos raios de luz
sofrendo refração e aumenta o
contraste
Coloração
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Objetiva de imersão
Ampliação alta (100X) com boa resolução, a lente deve ser pequena
Embora necessitemos que a luz percorra a amostra e o meio para ser refratada de modo
diferente, não desejamos perder os raios de luz após eles terem passado através da
amostra corada  óleo de imersão e a lente de imersão
Mesmo índice de refração que o vidro
e torna-se parte da óptica do vidro do
microscópio.
Para estes raios refratados sejam capturados
a lente objetiva deve ter um diâmetro maior
Sem óleo de imersão nessa lente, a amostra
torna-se borrada
46
Objetivas
Tabela 2. As propriedades das objetivas do microscópio
47
Amplificação e resolução
Produto do aumento obtido com as lentes objetivas e ocular
Aumento
100 X, 400X, ou 1000X
10 X
10 X, 40X, ou 100X
Microscópio óptico
Limite de resolução é de ~0,2 µm
Aumento limite de ~1500x
Como limpar o MO
Solução de limpeza e algodão
Solução de limpeza:
· Solução de limpeza (50% éter sulfúrico PA, 50% clorofórmio PA);
· Cotonete caseiro ou palito isento de ferpas, com ponta envolvido com
algodão;
49
Como carregar o seu microscópio
50
Como colocar a lâmina no seu microscópio
Charriot
Platina
51
Como utilizar o seu microscópio
52
Como utilizar o seu microscópio
Ajuste as oculares quanto à distância
entre seus olhos, afim de observar
um só campo!!
53
Tabela 3.
54
Campo
escuro
Contraste
de fase
56
Microscopia de Fluorescência
Para visualizar compostos que fluorescem
(emitem luz de uma cor quando
iluminados com luz de outra cor)
57
Microscopia de Fluorescência
58
Microscópios ópticos
Tipo de
microscópio
Características
Utilização
Campo brilhante
Utiliza luz visível
Observar espécimes corados
mortos ou organismos vivos
com cor natural
Campo escuro
Usa luz visível com um condensador
especial com um disco opaco que bloqueia
a luz direta e impede-a de entrar na
objetiva diretamente
Observar organismos vivos
invisíveis no MO que não
podem ser corados ou que são
distorcidos pela coloração
Contraste de
fase
Fluorescência
Usa luz visível com um condensador
especial com um diafragma anular que
permite que luz direta passe através do
condensador, focalizando a luz na amostra e
em uma placa de difração na lente objetiva.
Os raios de luz direta e refletida ou
difratada são reunidos para produzir a
imagem. Não é preciso coloração
Usa luz ultravioleta para estimular
moléculas fluorescentes de microrganismos
para realçá-los
Observar estruturas internas
das amostras vivas
Para técnicas de fluorescência
com anticorpos para identificar
ou detectar rapidamente os
microrganismos em tecidos ou
amostras clínicas
59
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Para estudo
detalhado de
estruturas celulares
internas
Elétrons são
utilizados ao invés de
raios luminosos
Eletromagnetos
atuam como lentes
Sistema em vácuo
60
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Limite de resolução = 0,2 µm
Limite de resolução = 0,2 nm
Micrografia eletrônica
61
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Feixes de eletróns tem baixa penetrabilidade
A célula é muito
Espessa e por isso,
São necessários
Cortes finos (20-60nm)
Nas amostras
Microscopia Eletrônica de Transmissão
63
Microscopia Eletrônica de Transmissão
64
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Ilana Camargo
65
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Staphylococcus aureus
Microscópio óptico
Microscópio eletrônico de transmissão
Ilana Camargo
66
Microscopia Eletrônica de varredura
Características
externas de um
organismo
Cobrir com metal
pesado (ouro)
Aumentos de 15x a 100.000x
SEM
67
Microscopia Eletrônica de varredura
68
Imagens tridimensionais
•Microscopia de contraste por interferência
•Microscopia de força atômica
•Laser de varredura confocal
Microscopia Confocal
Raio laser acoplado ao
microscópio óptico
70
Microscopia Confocal
Laser é ajustado para que somente uma determinada camada do espécime torne-se visível
71
Microscopia Confocal
72
Microscopia de Tunelamento
A peça básica do STM é uma finíssima ponta metálica
que varre a superfície a ser analisada, mas não a toca.
Fica a uma distância muito pequena, inferior a um
nanômetro. O equipamento “vê” a estrutura da
superfície por causa do efeito túnel daí a origem do
seu nome. Assim, voando baixo sobre a superfície, a
agulha vai registrando as rugosidades em escala
atômica.
O microscópio de tunelamento,
conhecido pela sigla inglesa STM,
valeu aos seus inventores o
Prêmio Nobel de Física de 1986
73
http://www.funpar.ufpr.br:8080/funpar/boletim/novo2/externo/boletim.php?noticia=1811&boletim=71
74
Bibliografia:
- Madigan, M.T. et al. Microbiologia de Brock. São Paulo:
Prentice-Hall, 12ª ed., 2010.
- Tortora, G.J. et al. Microbiologia. Porto Alegre: ArtMed, 8ª
ed., 2005.