Seqüenciamento - Embrapa/CNPTIA

Transcrição

Seqüenciamento
Felipe Rodrigues da Silva
BIEM - Seqüenciamento 2005
Fases da História da Genética
• Mendeliana
• DNA (identidade)
• Dogma Central (DNA - RNA - Proteína)
• Regulação da expressão gênica
• DNA recombinante
• Totalidade da informação genética
• Previsão do desenvolvimento
Watson, JD (1993). Gene 135: 309-315
Felipe R. da Silva
1
1928: Frederick Griffith
princípio transformante
Griffith, F. (1928)
Significance of pneumococcal types.
Lisa
(S)
J. Hygiene 27:113-159.
Felipe R. da Silva
1944: Oswald T. Avery
DNA é o
“princípio transformante”
Avery, O.T., MacLeod, C.M. & McCarty, M.
(1944).
Studies on the chemical nature of the substance
inducing transformation of Pneumococcal
types.
J. Exp. Med. 79, 137-159 (1944)
Felipe R. da Silva
2
1953: Watson, J.D. & Crick, F.H.C.
Felipe R. da Silva
1960: Sydney Brenner, Francis Crick,
François Jacob e Jacques Monod
descoberta do mRNA
Felipe R. da Silva
3
1961: Marshall Nirenberg
quebra o código genético
Nobel 1968
“pela interpretação do
código genético e sua
função na síntese protéica”
Nirenberg, M. W. and Matthaei, J. H. (1961)
The dependence of cell-free protein synthesis
in E. coli upon naturally occurring or
synthetic polyribonucleotides.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 47, 1588-1602
Felipe R. da Silva
1970: Hamilton O. Smith
primeira enzima de restrição
Nobel 1978
“pela descoberta das enzimas de
restrição e sua aplicação nos
problemas de genética molecular”
Hamilton O. Smith and K. W. Wilcox (1970).
A restriction enzyme from Haemophilus
influenzae. I. Purification and general
properties.
Journal of Molecular Biology 51, 379-391.
Felipe R. da Silva
4
1972: Paul Berg
primeira molécula de DNA recombinante
Nobel 1980
“pelos estudos da bioquímica de
ácidos nucleicos, especialmente de
DNA recombinante”
Jackson, DA, Symons, RH and Berg, P (1972).
A Biochemical Method for Inserting New Genetic
Information into SV40 DNA: Circular SV40 DNA
Molecules Containing Lambda Phage Genes and
the Galactose Operon of E. coli.
Proc. Nat. Sci. USA 69: 2904-2909.
Felipe R. da Silva
1977: Walter Gilbert
e Frederick Sanger
seqüenciamento de DNA
Nobel 1980
“pelas contribuições na determinação de seqüências
de ácidos nucleicos”
Felipe R. da Silva
5
Felipe R. da Silva
Procedimento enzimático
(Sanger, 1977)
A posição das bases é determinada pelo
tamanho dos fragmentos obtidos
através de reações de
polimerização
na presença de
dideoxinucleotídeos.
Felipe R. da Silva
6
Polimerização de DNA
T
G
G C
T
C
T T GA
T T
C
G
G T
A T
T C T AA C
A G
G T C C
G
A
GC A
AA CC
AC
5’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
5’
Felipe R. da Silva
Dideoxinucleotídeo
OOO
O-P-P-P-O-CH
2
O OO
-
-
-
BASE
O
-
3'
H
2'
-
H
OOO
O-P-P-P-O-CH
2
O OO
-
-
-
-
BASE
O
-
dideoxinucleotídeo
3'
OH
2'
H
deoxinucleotídeo
Felipe R. da Silva
7
Seqüenciamento de DNA
Felipe R. da Silva
Polimerização de DNA
o dideoxi
A
T
T GAA CC
T
G
A
T T
G
C A
GT
C
T
T
G G
A
T C AC G
T G
T C
GC A
C
CA
AC
5’
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
5’
Felipe R. da Silva
8
ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
Felipe R. da Silva
• molde
• polimerase
• dNTPs
•ddGTPs
•ddATPs
G
A
Felipe R. da Silva
•ddTTPs
T
•ddCTPs
C
9
Nucleotídeos Radioativos
35
[S ]dNTP S
OO S
O-P-P-P-O-CH2
-O -O -O
γ β α
Adenina
-
O
-
35
A baixa energia da emissão do S
resulta em bandas mais nítidas o que
aumenta a eficiência de leitura no topo
do gel. A menor energia permite também
provoca menor número de clivagens
permitindo o armazenamento das reações
por tempos mais prolongados do que as
32
reações com incoporação de P .
Radioisótopo
OH
H
Meia-vida
Energia (MeV)
87,4 dias
0,167
32
14,3 dias
1,710
P33
25,5 dias
0,249
S35
[S ]dATPα S
35
P
32
[P ]dNTP
32
A maior energia da emissão do P apresenta a vantagem de menores
tempos de exposição, no entanto apresenta menor resolução e estabilidade das reações que não devem ser armazenadas por tempos prolongados.
OOO
O-P-P-P-O-CH2
-O -O -O
γ β α
Adenina
-
-
[P33]dNTP
33
As partículas emitidas por P apresentam
35
energia média 50% superior a de S . As se33
quências geradas utilizando-se P apresentam
tempos de exposição mais curtos e de mesma
35
resolução daquelas obtidas com S .
O
OH
H
33
[α -P ]dATP
Felipe R. da Silva
ATGCTTCT
ATGCTTCTG
ATGCTTCTGG
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGCA
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAGA
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATC
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
Felipe R. da Silva
G A T C
10
Felipe R. da Silva
Felipe R. da Silva
11
Felipe R. da Silva
Felipe R. da Silva
12
Felipe R. da Silva
Gel inteiro
Felipe R. da Silva
13
Gel e cromatograma
Felipe R. da Silva
Felipe R. da Silva
14
Felipe R. da Silva
Felipe R. da Silva
15
Felipe R. da Silva
Procedimento químico
(Maxam & Gilbert, 1977)
DNA marcado na extremidade 5'
5'
5'
separação
das fitas
5'
reações parciais
de clivagens
específicas
TGACGCTGAT
G
A+G
T+C
8 pb
C
5 pb
8 pb
5 pb
2 pb
5 pb
2 pb
eletroforese
T
G
A
C
G
C
T
G
A
T
2 pb
2 pb
5'
gel desnaturante de poliacrilamida (uréia 8 M)
Felipe R. da Silva
16
Felipe R. da Silva
1996, tese de mestrado:
2000, tese de doutorado:
Felipe R. da Silva
17
1831-1836: Viagem do Beagle
Felipe R. da Silva
1859: Charles Darwin
A Origem das Espécies
Felipe R. da Silva
18
J. Craig Venter
Felipe R. da Silva
2004-2006: Viagem do Sorcerer II
Felipe R. da Silva
19
“Novas metodologias promissoras”(2001)
• Seqüenciamento por hibridização
– Khrapko et al. (1989). FEBS Lett. 256: 118-122
http://dx.doi.org/10.1016/0014-5793(89)81730-2
• Seqüenciamento paralelo de assinaturas
baseado em ligação e corte (MPSS)
– Brenner et al. (2000). Nature Biot. 18: 630 - 634
http://dx.doi.org/10.1038/76469
• Pirosseqüenciamento
– Ronaghi et al. (1996). Anal. Biochem. 242: 84–89.
http://dx.doi.org/10.1006/abio.1996.0432
Genome Research
11:
3–11 (2001). http://www.genome.org/cgi/content/full/11/1/3
Felipe R.
da Silva
Advanced Sequencing Technology
Awards 2005 (NHGRI)
•
Droplet-Based Digital Microfluidic Genome Sequencing
•
Single-Molecule DNA Sequencing with Engineered Nanopores
•
Electronic Sequencing in Nanopores
•
Real-Time DNA Sequencing
•
Massively Parallel Cloning and Sequencing of DNA
•
Modulating Nucleotide Size in DNA for Detection by Nanopore
•
Haplotype Sequencing via Single Molecule Hybridization
•
Sequencing a DNA Molecule using a Synthetic Nanopore
•
Real-time Multiplex Single-Molecule DNA Sequencing
•
Bead-Based Polony Sequencing
•
Ultra High Throughput DNA Sequencing System Based on Two-Dimensional
Monolith Multi-Capillary Arrays and Nanoliter Reaction Volume
•
$100,000 Genome Using Integrated Microfluidic CE
Felipe R. da Silva
20
Genome Sequencer 20 System
Genome sequencing in
Roche Applied Science microfabricated high-density
454 Life Sciences
picolitre reactors.
Nature 437, 376-380
(15 September 2005)
The apparatus (…) is able to
sequence 25 million bases, at 99%
or better accuracy, in one 4-hour
run. (…) shotgun sequencing and de
novo assembly of the Mycoplasma
genitalium [580 Mb] genome with
96% coverage at 99.96% accuracy
in one run of the machine.
http://dx.doi.org/10.1038/nature03959
Felipe R. da Silva
Pirosseqüenciamento
DNAn + Nucleotídeo
PPi + APS
ATP + Luciferina + O2
Polimerase
ATP Sulforilase
Luciferase
Felipe R. da Silva
DNAn+1 + PPi
SO4 + ATP
AMP + PPi + Oxiluciferina + CO2 + Luz
21
Felipe R. da Silva
Felipe R. da Silva
22
fragmentação
ligação dos adaptadores
reação de PCR em gotículas
Felipe R. da Silva
Felipe R. da Silva
23
http://go.to/felipes
http://www.cenargen.embrapa.br/~felipes/
[email protected]
Felipe R. da Silva
24

Seqüenciamento - Embrapa/CNPTIA

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