BENZODIAZEPÍNICOS E ANTIDEPRESSIVOS TRICÍCLICOS (HPLC)

Fabricado por: Chromsystems Instruments &
Chemicals GmbH
Importado e distribuído por: BioSys Ltda
Rua Coronel Gomes Machado, 358, Centro, Niterói-RJ
CEP: 24020-112
CNPJ: 02.220.795/0001-79
MS – nº 10350840116
SAC: (21) 3907-2534 – [email protected]
www.biosys.com.br
BENZODIAZEPÍNICOS E ANTIDEPRESSIVOS TRICÍCLICOS
(HPLC)
Reagente diagnóstico para determinação quantitativa in vitro de Benzodiazepínicos e Antidepressivos Tricíclicos em Soro/Plasma por HPLC.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
Nº de lote, data de fabricação e validade: vide rótulos dos frascos e da embalagem.
Artigo
49000
Apresentação
Kit Reagente para Análise de Benzodiazepínicos e Antidepressivos Tricíclicos em Soro/Plasma (100 análises)
Para informações detalhadas sobre o método e procedimentos, favor consultar o Manual de Instruções para Análise de Benzodiazepínicos e
Antidepressivos Tricíclicos em Soro/Plasma por HPLC no site www.biosys.com.br.
SUMÁRIO
INSTRUÇÕES
REAGENTES
Este Kit de reagentes foi desenvolvido para análise e monitoração terapêutica
dos mais importantes benzodiazepínicos (BZD) e antidepressivos tricíclicos
(TCA), incluindo seus metabólitos mais relevantes e a clozapina. A análise é
realizada em amostras de soro ou plasma, empregando um sistema isocrático
de HPLC com detector UV. A preparação da amostra é simples e garante a
reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados. Os dois grupos de
substâncias são extraídos da amostra através da adsorção em colunas de
preparação e analisadas em duas corridas cromatográficas distintas, sem
necessidade de alteração dos parâmetros cromatográficos.
Artigo
49001
49003
49004
49005
49006
49007
49009
49010
49033
Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção UV.
PRINCÍPIO
Os benzodiazepínicos e antidepressivos tricíclicos são extraídos de amostras de
soro ou plasma por adsorção em colunas de preparação, eliminando os
interferentes em potencial. O padrão interno, adicionado antes da etapa de
extração, contém duas substâncias sintéticas não medicamentosas, uma para
cada grupo de drogas analisadas. Duas seletivas etapas de eluição separam os
benzodiazepínicos e os antidepressivos tricíclicos em dois diferentes eluatos (o
flurazepam aparece no eluato dos antidepressivos). Cada eluato é injetado no
sistema de HPLC com detecção UV (210 nm) e os componentes de cada grupo
de substâncias são analisados individualmente, em duas corridas
cromatográficas, sem alteração dos parâmetros analíticos.
49034
49035
49041
0051
REAGENTES
0054
Apresentação
1 x 1000 mL
(Equilibration Buffer 2)
Tampão de Lavagem
(Washer Buffer)
Tampão de Eluição 1
(Elution Buffer 1)
Tampão de Eluição 2
(Elution Buffer 2)
Colunas de preparação
Solução de acetonitrila em tampão
carbonato
Solução de acetonitrila em solução
fosfato de sódio
Solução de acetonitrila em solução
fosfato de sódio
Solução de metanol < 75% em
solução fosfato de sódio e
trietilamina
-
(Sample clean up columns)
E
ESTABILIDADE
DOS
Produto
Fase Móvel
Padrão de Calibração de BZD + TCA em
Plasma (liofilizado)
Padrão Interno
Tampão de Equilíbrio 1
Tampão de Equilíbrio 2
Tampão de Limpeza
Tampão de Eluição 1
Tampão de Eluição 2
Padrão de Calibração de Clozapina e
Norclozapina em Plasma (liofilizado)
Padrão de Calibração de Clobazam e
Norclobazam em Plasma (liofilizado)
Padrão de Calibração de Alprazolam e
Trazodom em Plasma (liofilizado)
Padrão Interno especial para análise de
Clozapina e Norclozapina
Controle de Benzodiazepínicos em Plasma, BiNível (I+II)
Controle de Antidepressivos Tricíclicos em
Plasma, Bi-Nível (I+II)
Temperatura
2 – 30°C
2 – 8 °C
2 – 8 °C
2 – 30 °C
2 – 30 °C
2 – 30 °C
2 – 30 °C
2 – 30 °C
2 – 8 °C
2 – 8 °C
2 – 8 °C
2 – 8 °C
2 – 8 °C
2 – 8 °C
CUIDADOS E PRECAUÇÕES
5 x 2,5 mL
Favor consultar a ficha de segurança dos reagentes e adotar as precauções
necessárias para o manuseio de reagentes de laboratório.
1 x 10 mL
GARANTIA
Estas instruções de uso devem ser lidas atentamente antes da utilização do
produto. As instruções nela contidas devem ser rigorosamente cumpridas. A
confiabilidade dos resultados do ensaio não poderá ser garantida em caso de
desvio às instruções.
1 x 100 mL
(Equilibration Buffer 1)
Tampão de Equilíbrio 2
ARMAZENAGEM
Os reagentes não abertos são estáveis até a data de validade indicada no rótulo,
desde que as condições de armazenamento estabelecidas sejam obedecidas. A
tabela seguinte mostra a temperatura de armazenagem para os reagentes do kit
e para outros reagentes da linha Chromsystems, disponíveis separadamente.
MÉTODO
Componentes e Composições:
Produto
Composição
Fase Móvel
Solução de acetonitrila em tampão
(Mobile Phase)
fosfato
Padrão de Calibração
Soro humano com níveis de
(liof.)
benzodiazepínicos e
(Calibration Standard)
antidepressivos tricíclicos
Padrão Interno
Solução de metanol contendo
(Internal Standard)
benzodiazepínicos
Tampão de Equilíbrio 1
Solução de metanol e trietilamina
DE
1 x 100 mL
1 x 200 mL
DESCARTE
1 x 40 mL
A fase móvel, o tampão de equilíbrio 1, o tampão de equilíbrio 2, o tampão de
limpeza, o tampão de eluição 1, o tampão de eluição 2 e os resíduos de
preparação das amostras contêm solventes orgânicos e devem ser descartados
como resíduo químico livre de halogênio, de acordo com as diretrizes e
regulamentos locais em vigor.
1 x 40 mL
2 x 50
unidades
IM 49000 BZD/TCA E June 2009 R4.2 / BS Rev 01 jul2012
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PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
Fase Móvel: pronto para uso.
Padrão Interno: pronto para uso.
Tampão de Equilíbrio 1 e 2: prontos para uso.
Tampão de Limpeza: pronto para uso.
Tampão de Eluição 1 e 2: prontos para uso.
Padrão de Calibração em Plasma (liofilizado):
O padrão de calibração em plasma de BZD + TCA (artigo 49003) e os demais
padrões (artigos 49033, 49034 e 49035) são rastreáveis a substância de
referência adquirida de fornecedor certificado. Após reconstituição, são
submetidos ao mesmo processo de preparo das amostras de pacientes. Para
reconstituir, pipetar exatamente 2,5 mL de água tipo I no frasco. Deixar
repousar em temperatura ambiente por cerca de 10-15 minutos, para permitir a
completa reconstituição. Agitar ocasional e gentilmente até que o conteúdo
esteja homogêneo e evitar a exposição direta à luz. O calibrador (ou padrão)
reconstituído é estável por 1 semana se protegido da luz e mantido refrigerado,
em temperatura entre 2 e 8°C. Para períodos maiores de armazenamento
(máximo de 3 meses), conservar a – 20 °C A concentração atual depende do
lote e será encontrada no folheto de informações que acompanha o produto.
Controles em Plasma (liofilizado):
Os controles em plasma (artigos 0051, 0054) são submetidos a todo o processo
de preparo das amostras. Os controles são incluídos em cada série analítica,
para monitorar a exatidão e a precisão do sistema. Para reconstituir o
controle liofilizado, pipetar exatamente 5,0 mL de água tipo I no frasco.
Deixar repousar em temperatura ambiente por cerca de 10-15 minutos, para
permitir a completa reconstituição. Agitar ocasional e gentilmente até que o
conteúdo esteja homogêneo e evitar a exposição direta à luz. O controle
reconstituído é estável por 1 semana se protegido da luz e mantido refrigerado,
em temperatura entre 2 e 8°C. Para períodos maiores de armazenamento
(máximo de 3 meses), conservar a – 20 °C A faixa de concentração depende do
lote e será encontrada no folheto de informações que acompanha os controles.
MATERIAIS REQUERIDOS E DISPONÍVEIS, NÃO FORNECIDOS
Coluna cromatográfica equilibrada (Chromsystems art. 49100).
Controle de Benzodiazepínicos em Plasma, Bi-Nível (I+II) (Chromsystems art.
0051).
Controle de Antidepressivos Tricíclicos em Plasma, Bi-Nível (I+II)
(Chromsystems art. 0054).
Água tipo I ou grau HPLC.
Acetonitrila grau HPLC
Metanol grau HPLC.
Centrífuga.
Material geral de laboratório.
Etapa de limpeza:
1.
Adicione 2 alíquotas de 1 mL do Tampão de Lavagem e descarte o
efluente. Após a segunda lavagem a coluna deve ficar completamente
seca (pode ser utilizado um sistema de sucção ou a coluna pode ser
centrifugada a 2500 rpm por 2 min).
Etapa de eluição e injeção:
1.
Para realizar a eluição dos compostos benzodiazepínicos, aplique 400μL
do Tampão de Eluição 1 e recolha o eluato em frascos de vidro
adequados (pode ser utilizado um sistema de sucção ou a coluna pode
ser centrifugada a 1000 rpm por 1 min e 2500 rpm por mais 1 min);
2.
Para realizar a eluição dos antidepressivos tricíclicos, aplique 400 μL do
Tampão de Eluição 2 e recolha o eluato em frascos de vidro adequados
(pode ser utilizado um sistema de sucção ou a coluna pode ser
centrifugada a 1000 rpm por 1 min e 2500 rpm por mais 1 min);
3.
Adicione 200 μL de água tipo I em cada eluato e agite. Injete 50 μL de
cada eluato no sistema cromatográfico.
A sequencia de etapas de eluição deve ser rigorosamente seguida. Caso haja
interesse de analisar apenas os antidepressivos tricíclicos, a etapa de eluição
dos compostos benzodiazepínicos ainda deve ser realizada. Neste caso, esta
etapa deve ser considerada como uma etapa de lavagem adicional e o efluente
deve ser descartado. A precisão e a exatidão da análise deve ser monitorada
através da inclusão de controles adicionais em cada corrida analítica.
Tempo de retenção esperado para Benzodiazepínicos:
*O flurazepam aparece no eluato dos antidepressivos
Analito
Tempo de retenção aprox. em minutos
Clordiazepóxido
5,0
Bromazepam
5,5
Padrão Interno
7,8
Oxazepam
9,2
Nitrazepam
9,9
Alprazolam
10,8
Clonazepam
11,4
Flunitrazepam
14,5
Nordiazepam
15,3
Clobazam
18,2
Diazepam
25,9
Flurazepam*
6,1
PROCEDIMENTOS DO TESTE
Tempo de retenção esperado para Antidepressivos Tricíclicos:
Analito
Tempo de retenção aprox. em minutos
Norclozapina
4,6
Clozapina
5,4
Nordoxepina
6,9
Doxepina
7,5
Desipramina
10,6
Imipramina
11,8
Nortriptilina
12,6
Maprotilina
13,2
Amitriptilina
14,0
Trimipramina
16,1
Padrão Interno
17,1
Norclomipramina
20,2
Clomipramina
22,8
Ajustes do instrumento:
Amostrador:
CÁLCULOS
AMOSTRA
Deverão ser analisadas amostras de soro ou plasma, coletadas durante o
intervalo entre as administrações do medicamento monitorado.
Estabilidade da amostra: as amostras coletadas são estáveis por 1 semana se
mantidas refrigeradas, em temperatura entre 2 e 8°C. Para períodos maiores de
armazenamento, conservar a – 20 °C.
Estabilidade das amostras preparadas (eluatos): as amostras preparadas são
estáveis por 2 dias em temperatura ambiente e por até 5 dias se mantidas
refrigeradas, em temperatura entre 2 e 8°C, e protegidas da luz. Para períodos
maiores de armazenamento, conservar a – 20 °C.
Detector UV:
Fluxo:
Temperatura da coluna:
Volume de injeção de 50µL
Tempo de corrida de 28 min para BZD e
de 25 min para TCA.
Comprimento de onda de 210 nm
0,6 mL/min
Ambiente (aprox. 25 ºC)
Procedimento de preparo de amostras:
Centrifugue as amostras antes de seguir o procedimento (10 min, 4000 rpm).
Condicionamento das colunas de extração:
1.
Pré-condicione as colunas de extração em fase sólida aplicando 1 mL do
Tampão de Equilíbrio 1;
2.
Aguarde a saída de todo o efluente (utilize um sistema de sucção ou
centrifugue a coluna a 1000 rpm por 30-60s);
Repita o mesmo procedimento anterior, aplicando 1 mL do Tampão de
3.
Equilíbrio 2. Não permita que a fase estacionária das colunas de extração
seque completamente.
Etapa de extração:
1.
Adicione primeiramente 1 mL da amostra de soro ou plasma e, em
seguida, 100 μL de Padrão Interno na coluna de extração condicionada;
2.
Misture bem, com auxílio de uma pipeta e proceda ao descarte do
efluente. Aguarde até a saída de todo o efluente por gravidade,
descartando-o em seguida (pode ser utilizado um sistema de sucção ou a
coluna pode ser centrifugada a 1000 rpm por 60s).
IM 49000 BZD/TCA E June 2009 R4.2 / BS Rev 01 jul2012
CAnalito [mg/L] = ____AAmostra x ISCalibrador x *CCalibrador
ACalibrador x ISAmostra
Área/altura do pico do analito A no cromatograma da amostra
= Aamostra
Área/altura do pico do analito A no cromatograma do calibrador
= ACalibrador
Área/altura do pico do padrão interno no cromatograma da amostra
= ISAmostra
Área/altura do pico do padrão interno no cromatograma do calibrador
= ISCalibrador
Concentração C do analito A no calibrador
= *CCalibrador
* A concentração dos analitos depende do lote e é encontrada no folheto de
informações que acompanha o calibrador. Uma vez que a mesma quantidade de
padrão interno é adicionada ao padrão de calibração e às amostras, a
concentração do padrão interno pode ser considerada como “1” para fins de
cálculo.
Fatores de conversão para Benzodiazepínicos:
Analito
ng/mL para nmol/L
Alprazolam
3,2386
Bromazepam
3,1630
Clordiazepóxido
3,3360
Clobazam
3,3251
nmol/L para ng/mL
0,3088
0,3162
0,2998
0,3007
Página 2 de 3
Clonazepam
Diazepam
Flunitrazepam
Flurazepam
Nitrazepam
Nordiazepam
Oxazepam
3,1674
3,5119
3,1920
2,5781
3,5553
3,6939
3,4877
0,3157
0,2847
0,3133
0,3879
0,2813
0,2707
0,2867
Fatores de conversão para Antidepressivos Tricíclicos:
Analito
ng/mL para nmol/L
nmol/L para ng/mL
Amitriptilina
3,6048
0,2774
Clomipramina
3,1760
0,3149
Clozapina
3,0597
0,3268
Desipramina
3,7539
0,2664
Doxepina
3,5793
0,2794
Imipramina
3,5661
0,2804
Maprotilina
3,6048
0,2774
Norclomipramina
3,3241
0,3008
Norclozapina
3,1969
0,3128
Nordoxepina
3,7685
0,2654
Nortriptilina
3,7967
0,2634
Trimipramina
3,3963
0,2944
CALIBRADORES E CONTROLES
A Chromsystems disponibiliza os seguintes produtos:
Artigo Produto
49003
Padrão de Calibração de BZD + TCA em
Plasma (liofilizado)
49033
Padrão de Calibração de Clozapina e
Norclozapina em plasma (liofilizado)
49034
Padrão de Calibração de Clobazam e
Norclobazam em plasma (liofilizado)
49035
Padrão de Calibração de Alprazolam e
Trazodom em plasma (liofilizado)
0051
Controle de Benzodiazepínicos em Plasma, Binível (I+II)
0054
Controle de Antidepressivos Tricíclicos em
Plasma, Bi-Nível (I+II)
Apresentação
5 x 2,5mL
5 x 2,5mL
5 x 2,5mL
2 x 5 x 5mL
2 x 5 x 5mL
Limite máximo de
linearidade (ng/mL)
65
580
5000
2300
250
3000
210
200
540
2400
1800
Faixa de Medição para Antidepressivos Tricíclicos:
Limite de quantificação
Limite máximo de
Analito
(ng/mL)
linearidade (ng/mL)
Amitriptilina
5,0
1000
Clomipramina
6,0
1000
Clozapina
5,0
2000
Desipramina
5,0
1000
Doxepina
5,0
1000
Imipramina
6,0
1000
Maprotilina
5,0
1000
Norclomipramina
6,0
1000
Norclozapina
6,0
2000
Nordoxepina
5,0
1000
Nortriptilina
5,0
1000
Trimipramina
6,0
1000
Recuperação:
A taxa de recuperação dos benzodiazepínicos, antidepressivos tricíclicos e do
padrão interno variam de 91 a 103%. Do flurazepam, a taxa é de 89 a 95%.
Precisão:
A determinação da precisão intra-ensaio foi realizada a partir da média de
múltiplas amostras, analisadas em três diferentes concentrações.
IM 49000 BZD/TCA E June 2009 R4.2 / BS Rev 01 jul2012
Alprazolam
Bromazepam
Clordiazepóxido
Clobazam
Clonazepam
Diazepam
Flunitrazepam
Flurazepam*
Nitrazepam
Nordiazepam
Oxazepam
Antidepressivos
Tricíclicos
Amitriptilina
Clomipramina
Clozapina
Desipramina
Doxepina
Imipramina
Maprotilina
Norclomipramina
Norclozapina
Nordoxepina
Nortriptilina
Trimipramina
Coeficiente de variação (%) /
Concentração (ng/mL)
6,2/4,3
5,0/33,1
10,9/75,2
2,2/18,7
3,6/125
1,1/248
10,3/33,7
4,0/365
0,8/1077
1,2/59,1
3,7/309
1,6/648
10,7/10,5
2,3/34,9
5,9/85,2
3,1/58,5
2,5/621
1,6/1637
4,0/7,9
3,3/33,3
1,6/65
9,7/7,0
1,7/19,5
1,1/49,3
5,2/15,7
3,5/82,1
0,4/159
3,3/38,9
1,1/421
0,8/1064
9,8/52,9
1,5/585
1,8/1582
Coeficiente de variação (%) /
Concentração (mg/L)
5/26,2
1/129
0,9/319
5,5/21,3
0,9/118
0,7/299
10/37,5
1,5/312
0,5/845
2/26,3
1,3/130
1,2/320
7,4/19
1,2/123
0,8/293
2,6/30,3
1,1/129
1/317
6,5/24,9
0,8/144
1,1/354
5,9/47,6
1,2/115
4,9/287
5,6/47,2
1,1/203
3,3/549
2,4/19,2
1/117
0,8/277
3,2/26,4
0,8/128
0,6/319
7/20,7
0,8/118
0,6/298
5 x 2,5mL
DESEMPENHO / CARACTERÍSTICAS
Faixa de Medição para Benzodiazepínicos:
Limite de quantificação
Analito
(ng/mL)
Alprazolam
7,0
Bromazepam
8,0
Clordiazepóxido
1,0
Clobazam
9,0
Clonazepam
7,0
Diazepam
8,0
Flunitrazepam
8,0
Flurazepam
6,0
Nitrazepam
7,0
Nordiazepam
7,0
Oxazepam
8,0
Benzodiazepínicos
VALORES DE REFERÊNCIA
Níveis Terapêuticos para Benzodiazepínicos:
Analito
Concentração em soro (ng/mL)
Alprazolam
5 – 50
Bromazepam
50 – 200 (tóxico > 300)
Clordiazepóxido
400 – 3000
Clobazam
200 – 500
Clonazepam
10 – 80 (tóxico > 100)
Diazepam
200 – 2000 (tóxico > 3000)
Flunitrazepam
5 – 40 (tóxico > 50)
Flurazepam*
20 – 100 (tóxico > 200)
Nitrazepam
30 – 100 (tóxico > 200)
Nordiazepam
20 – 800 (tóxico > 2000)
Oxazepam
200 – 1500 (tóxico > 2000)
Níveis Terapêuticos para Antidepressivos Tricíclicos:
Analito
Concentração em soro (ng/mL)
Amitriptilina
50 – 300 (tóxico > 500)
Clomipramina
90 – 250 (tóxico > 400)
Clozapina
50 – 700
Desipramina
30 – 300 (tóxico > 500)
Doxepina
50 – 250 (tóxico > 400)
Imipramina
50 – 150 (tóxico > 400)
Maprotilina
100 – 250 (tóxico > 500)
Norclomipramina
Aprox. 150 – 300
Norclozapina
1 – 2,5
Nordoxepina
Até 300
Nortriptilina
50 – 250 (tóxico > 500)
Trimipramina
20 – 200 (tóxico > 500)
Cada laboratório deve estabelecer seus próprios valores de referência para
adaptar o método às características do tratamento e da monitoração terapêutica.
LITERATURA
1.
2.
3.
4.
5.
F. E. Krapf, W. P. Bieger, F. W. Tiller. LaborDatenBuch (1995) Urban &
Schwarzenberg, Munchen.
O. Benkert, H. Hippius. Psychiatrische Erkrankungen (1992) SpringerVerlag, Berlim.
B. Woggon. Depressionen und Psychopharmaka. Medizin 2000 (1997)
pmi Verlagsgruppe, Frankfurt.
E. Mutschler. Arzneimittelwirkungen (1986) Wiss. Verlagsgesellschaft,
Stuttgart.
M. Schulz und A. Schmoldt, Therapeutic and toxic blood concentrations of
more than 800 drugs and other xenobiotics, Pharmazie 58 (2003) 7, 447474.
Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH
Am Haag 12
D-82166 Gräfelfing
Munique, Alemanha
Fone: +49 89 18930-0
Fax: +49 89 18930-199
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