Células somáticas no leite

Células somáticas no leite
José Renaldi Feitosa Brito
Pesquisador - Embrapa Gado de Leite/CNPq
Rua Eugênio do Nascimento, 610, Dom Bosco,
36038-330 Juiz de Fora, MG
1. Introdução
Nos anos recentes, vem aumentando a demanda pelos consumidores por produtos
lácteos de alta qualidade. Essa demanda é sentida pela indústria que, por sua vez, necessita
de matéria prima (leite cru) de qualidade. Tal demanda, juntamente com a pressão do mercado
internacional por alimentos com reconhecida qualidade e segurança do ponto-de-vista da
saúde pública, são os principais fatores que direcionam o uso disseminado da contagem de
células somáticas (CCS) no leite. Atualmente, todos os países que possuem uma indústria
leiteira desenvolvida usam a CCS como medida da qualidade do leite.
A CCS no leite é um sinal de inflamação da glândula mamária da vaca e a maior parte
dos pesquisadores e especialistas concordam que a causa primária dessa inflamação são as
infecções causadas por bactérias. Dessa forma, a manutenção da saúde da glândula mamária
das vacas é a melhor garantia para a produção de leite de qualidade. Consequentemente, a
CCS tem sido usada como indicadora do status de qualidade do leite em todos os níveis:
vacas, rebanhos, cooperativas, regiões e países.
A principal razão com a preocupação em manter baixos os níveis de CCS nos rebanhos
é econômica. Há uma perda crescente de produção de leite à medida que aumenta a CCS do
leite total do rebanho (Tabela 1). Outras razões para a necessidade de redução da CCS nos
rebanhos são: a interferência direta de altas CCS com a composição química do leite e a
relação entre altas CCS e as taxas de infecção dos quartos mamários.
2. Definição, origem e função das células somáticas no leite
As células somáticas (do grego “somatikós”, que significa “referente ao corpo”)
encontradas no leite têm esse nome porque se originam do corpo da vaca. Elas são
constituídas principalmente pelos leucócitos (ou células brancas do sangue), cuja função é a
defesa do organismo. Os leucócitos são constituídos por vários tipos de células. Os
encontrados no leite da glândula mamária sadia são (aproximadamente): macrófagos (60%),
neutrófilos (15%) e linfócitos (25%). Além dos leucócitos, as células epiteliais podem estar
presentes em pequeno número (1 a 2%), embora alguns autores tenham registrado percentuais
de 10 e até 20% destas células no leite normal. A maioria dos leucócitos é atraída do sangue
para a glândula mamária, em resposta a uma agressão física, química ou infecciosa
(principalmente de origem bacteriana) sofrida pela glândula mamária. O processo inflamatório
resultante dessa agressão atrai os leucócitos e quando a agressão é muito intensa, os
mecanismos de defesa do animal são requeridos a agir com maior intensidade, o que resulta
no aumento exagerado de células e de outras substâncias que são também transferidas do
sangue para o interior da glândula mamária e, por extensão, para o leite.
O leite da glândula mamária sadia da vaca tem entre 20.000 (ou menos) e 50.000
células/mL, mas considera-se como um valor limite para a definição de “normal” contagens de
até 100.000 células/mL (com base em estudos onde foram consideradas a média de 20.000
células e dois desvios padrão). Considera-se que vacas com CCS menor que 200.000/mL têm
maior probabilidade de não estarem infectadas com os chamados patógenos principais da
mastite, enquanto vacas com CCS acima de 300.000 têm maior probabilidade de estarem
infectadas. Dependendo do estudo, o limite usado como indicativo de inflamação ou mastite
tem sido estipulado como 200.000/mL, 250.000/mL ou 283.000/mL. A contagem de células de
250.000/mL tem sido recomendada como valor limiar para indicar a presença ou ausência de
inflamação ou mastite. Deve-se registrar, entretanto, que um pequeno percentual de vacas
comprovadamente infectadas com os patógenos principais pode apresentar contagens
celulares de menos de 250.000/mL, enquanto que algumas vacas infectadas com os chamados
patógenos secundários, como os estafilococos coagulase negativos, podem ter CCS acima de
250.000/mL. Os microrganismos classificados como patógenos principais (Staphylococcus
aureus, Streptococcus agalactiae, outros estreptococos e coliformes) causam, em média,
aumentos da CCS além de 1.000.000/mL, enquanto os patógenos secundários
(Corynebacterium bovis e estafilococos coagulase negativos) são responsáveis, em média,
por contagens de 370.000/mL.
É importante, ainda considerar que o número de células no leite não é estático, mas
parte de um processo dinâmico, independente do status infeccioso da glândula mamária
(Harmon 1994). Dessa forma, considerando-se a natureza dinâmica da CCS na glândula
mamária, a interpretação de dados baseada em uma única amostra é arriscada porque pode
levar a falhas no diagnóstico ou na interpretação dos resultados laboratoriais.
3. Fatores que influenciam a contagem de células somáticas
Além do papel preponderante dos patógenos da glândula mamária na elevação da CCS,
deve-se considerar a influência de outros fatores, entre eles, a extensão e a duração da
infecção, a prévia exposição da vaca aos patógenos, a individualidade da resposta imunológica
de cada animal, etc. Observa-se, ainda, variação entre os microrganismos do mesmo grupo.
Os estafilococos coagulase negativos, por exemplo, podem induzir uma resposta celular mais
alta que os demais patógenos secundários.
A CCS é alta imediatamente após o parto, mas em vacas sadias o número de células
vai sendo reduzido à medida que decresce a quantidade de colostro no leite, chegando a
menos de 200.000/mL dentro de quatro a cinco dias após o parto. Na segunda semana, a CCS
é reduzida para menos de 100.000/mL.
Em vacas de alta produção, a CCS aumenta ligeiramente quando a produção de leite
cai para menos de 4 kg/dia. Considera-se que a CCS do leite de vacas não infectadas é maior
logo após o parto, baixa durante a lactação e volta a aumentar no período próximo à secagem.
Essa variação pode ser devida ao fator diluição (número de células por maior ou menor volume
de leite produzido). Entretanto, o aumento observado em quartos mamários não infectados não
é significativo a ponto de alterar a interpretação diagnóstica (por exemplo, a reação observada
no “California Mastitis Test” [CMT]). Já se observou um aumento de 80.000 células entre 35
dias e 265 dias de lactação. Após o parto, a CCS de vacas com mastite subclínica diminui mais
lentamente do que a de vacas sadias e o aumento é significativo à medida que elas chegam ao
final da lactação. Nas vacas sadias, ao contrário, essas diferenças não são tão evidentes.
A idade da vaca não afeta a CCS se a glândula mamária é livre de infecção. Entretanto,
a reação celular contra agentes infecciosos em vacas que tenham tido mastite aumenta com a
idade. Muitas vezes, a mastite é subclínica e passa despercebida. Dessa forma, é comum que
as vacas mais velhas apresentem CCS mais alta, mesmo quando o úbere é aparentemente
sadio. Após uma infecção, a CCS desses animais demora mais tempo a voltar ao normal.
Ocorrem variações diárias na CCS de vacas individuais, mas essa variação é maior em
animais infectados e pode ser causada pelas diferenças dos intervalos de ordenha e por
2
problemas de diluição do leite. Quando se examinam amostras composta da produção diária,
por exemplo, essa variação desaparece. Isso justifica a necessidade de se realizar o exame de
amostras representativas do leite total da ordenha diária e de reunir vários exames do mesmo
animal e do mesmo rebanho, em determinado espaço de tempo. Recomenda-se, no mínimo,
três exames consecutivos dos rebanhos (a intervalos semanais, quinzenais ou mensais) para
se fazer um diagnóstico ou para se formular programas (por exemplo, de pagamento por
qualidade, de controle da mastite, etc.) que incluam a CCS como parâmetro.
A CCS é mais alta imediatamente após a ordenha e se mantém assim por três a quatro
horas. Quando a produção de leite do animal aumenta, a CCS diminui e atinge o mínimo
imediatamente antes da ordenha. Essas variações são menores nos animais sadios que em
animais infectados.
Alguns estudos demonstram que CCS pode ser influenciada pela raça do animal. A
média de CCS no leite de vacas Ayrshire é menor que a de vacas da raça Holandesa, sendo
essas diferenças evidentes quando se compararam vacas sadias e também vacas com
infecção subclínica. Considera-se que aproximadamente 10% das diferenças entre a CCS de
vacas é devida à genética, mas elas não são suficientes para influenciar significativamente o
diagnóstico de mastite subclínica. Em um estudo realizado com cerca de 290.000 vacas
Ayrshire e Holandesa, em que se comparou a relação de CCS entre essas raças e a produção
anual de leite, as diferenças entre raças variaram de menos de 50.000 a menos de 100.000
células/mL.
Outros estudos mostram que vacas com mastite subclínica quando estressadas
(mudança das condições atmosféricas, agitação, estresse térmico) apresentam um aumento
significativo da CCS no leite, quando comparadas a vacas sadias submetidas às mesmas
condições de estresse.
4. Métodos de aferição da CCS
Pode-se avaliar a CCS a partir de amostras de leite provenientes de:
(a) quartos mamários individuais,
(b) produção total diária do animal e
(c) leite total do rebanho.
Em alguns países essa amostra do leite total é analisada separadamente, considerandose as vacas de primeira cria em um grupo e as demais em outro grupo. Isso porque as
primeiras têm CCS mais baixa.
Vários testes podem ser usados para avaliar a CCS. O método padrão adotado
internacionalmente e referendado pelo IDF é o microscópico, em que esfregaços de leite
preparados em lâminas são corados e examinados ao microscópio. É um método laborioso e
cansativo e, por isso, sujeito a erros de contagem, tornando-se inadequado para o exame de
grande número de amostras.
Outro método usado emprega um equipamento eletrônico (“Coulter counter”) que pode
ser calibrado para reconhecer e contar determinados tipos de células. Nos últimos anos ganhou
grande aceitação o sistema que usa o princípio da fluorescência ótica (equipamento
Fossomatic, fabricado na Dinamarca). Mais recentemente, sistemas que usam como princípio
para contagem a citometria de fluxo foram colocados no mercado. Eles são: Somascope
(fabricado na Holanda), Somacount (Estados Unidos) e ANADIS (França). Esses sistemas
foram analisados e considerados apropriados pelo IDF/FIL, (Federação Internacional de
Laticínios) (Reichmuth, 1996).
As vantagens e as limitações, assim como o fundamento dos principais métodos usados
para aferição da CCS no leite são apresentados na Tabela 3. Uma das características da
3
maioria dos equipamentos usados em laboratório é a dificuldade de diferenciarem contagens
abaixo de 50.000 células. Em um estudo recente em que se compararam quatro equipamentos,
o Somacount e o ANADIS diferenciaram melhor as contagens abaixo de 50.000.
Um dos métodos mais simples, práticos e mais usados em todo mundo é o CMT, em
que cerca de 2 mL de leite é misturado com igual volume de solução de detergente (lauril
sulfato de sódio a 3%). Isso é suficiente para coagular o DNA das células presentes no leite. O
teste pode ser feito ao lado do animal, no próprio local da ordenha, usando-se uma raquete
com quatro compartimentos. A interpretação mais comum do CMT considera cinco escores:
negativo (normal), reação suspeita ou traços (T), reação positiva fraca (+), reação positiva (++)
e reação fortemente positiva (+++). Em alguns países adota-se o critério numérico, que varia de
1 (negativo) a 5 (fortemente positivo). As reações 3, 4 e 5 ou +, ++ e +++ indicam maior
probabilidade de infecção. Apesar de o CMT ser um teste subjetivo (não conta as células,
apenas faz uma estimativa), existe uma correlação entre os escores (1 a 5) e a CCS (Tabela
2).
É importante observar os cuidados na coleta das amostras (para que sejam
representativas dos animais ou do leite total do rebanho), o acondicionamento e o transporte
para o laboratório (sob refrigeração, dentro do prazo, em recipientes e com conservantes
apropriados, etc.) No laboratório é importante que sejam usadas metodologias padronizadas e
que os equipamentos sejam calibrados e revisados periodicamente, com supervisão externa.
Não se deve esquecer que mesmo métodos e equipamentos altamente sofisticados não podem
corrigir os erros cometidos por ocasião da coleta e manuseio das amostras.
5. Aplicações dos diferentes métodos de CCS
Os dados individuais do animal são usados para determinar se a vaca ou o quarto
mamário têm mastite ou com a probabilidade de estarem infectados. Tem-se demonstrado que
em 80% dos casos, a CCS acima de 250.000/mL é relacionada com a presença de infecção.
A CCS do leite total do rebanho tem três usos principais:
a) monitoramento da prevalência de mastite no rebanho (Tabela 2);
b) indicador da qualidade do leite cru e
c) indicador das condições higiênicas da produção de leite na fazenda.
Além desses, a CCS tem sido usada em esquemas de pagamento de leite por qualidade
e como um padrão internacional de monitoramento da produção higiênica e de segurança do
leite.
6. Emprego da CCS como exigência de qualidade e sua influência no comércio internacional
Na União Européia há um limite de 400.000 células/mL para o leite total do rebanho
poder ser entregue para consumo ou industrialização (a partir de 1998, mesmo o leite
destinado à produção industrial teve de obedecer a este limite). Nos Estados Unidos, o limite é
de 750.000 células, mas alguns estados estabelecem limites mais rígidos. Em países como
Austrália, África do Sul, Japão e Nova Zelândia, as exigências variam entre 250.000 e 500.000
células.
No momento não existem exigências internacionais para o limite de CCS do leite, mas
existem exigências nacionais (ou, no caso da Comunidade Européia, de vários países em
conjunto) que poderão ou deverão influenciar o comércio internacional. No caso da
Comunidade Européia, por exemplo, o limite de 400.000 células/mL estabelecido para os
produtos lácteos dos países membros é também aplicado para os produtos exportados para a
Comunidade por outros países.
4
É possível que com o incremento do comércio internacional de leite e derivados haja
necessidade de se estabelecer um padrão internacional para CCS. Sabe-se que a mastite não
pode ser erradicada dos rebanhos leiteiros, mas a redução das infecções nos rebanhos é um
alvo atingível, e já se dispõe de tecnologia para a produção econômica de leite (do rebanho)
com CCS abaixo de 400.000 células/mL. A relação entre a CCS do leite total do rebanho e o
percentual de quartos mamários infectados apresentada na Tabela 1 justificam essa política.
De acordo com os dados apresentados, observa-se que mesmo rebanhos que atendem o limite
de 400.000 células ainda apresentam um percentual elevado de animais infectados. Rebanhos
com CCS acima de 400.000/mL têm claramente um sério problema de mastite que resulta em
perdas econômicas consideráveis para o produtor.
7. Influência da CCS na qualidade do leite
Verifica-se perda da qualidade do leite quando a contagem de células do leite total do
rebanho é de 400.000/mL. Há um aumento indesejável de alguns componentes do leite (sódio,
cloretos, proteínas do soro, soroalbumina, lactoferrina, imunoglobulinas) e um decréscimo
(indesejável) de outros componentes (gordura, lactose, caseína, cálcio, potássio, etc.). Como
resultado, a produção de vários derivados do leite, incluindo queijos, leite em pó e produtos
fermentados, é prejudicada. Além disso, a estocagem do leite pasteurizado com alta CCS é
prejudicada porque seu tempo de prateleira é menor.
A política de melhoria da qualidade do leite pela redução da CCS afeta a todos, desde o
produtor de leite (aumento de produção e ao melhor preço do leite, quando há programas de
incentivo pela qualidade) até a indústria processadora (melhor rendimento, melhor qualidade e
estabilidade dos derivados e maior tempo de prateleira), com reflexos positivos no mercado,
pela maior aceitação dos produtos pelo consumidor.
8. Uso dos dados de CCS no gerenciamento dos rebanhos
Os resultados laboratoriais da CCS dos rebanhos e de animais individuais devem ser
analisados e as informações resultantes são úteis para orientar o gerenciamento da saúde dos
rebanhos. Essas informações podem ser usadas para:
a) monitorar a saúde do rebanho, ou, mais apropriadamente, a saúde do úbere dos
animais, tanto quanto a efetividade das medidas de prevenção e tratamento das infecções;
b) estabelecer políticas de controle da qualidade do leite, em bases objetivas;
c) ampliar o conhecimento da epidemiologia (medidas de prevalência, incidência, e
análise dos padrões da mastite no rebanho no decorrer do tempo) que contribuirá para a
implementação e acompanhamento de programas de controle das infecções causadas pelos
patógenos “contagiosos”, principais responsáveis pelas mastites subclínicas;
d) monitorar a eficácia dos esquemas de tratamento da mastite, especialmente a terapia
à secagem;
e) identificar deficiências de manejo e possibilitar a recomendação de procedimentos
específicos e efetivos;
f) demonstrar a importância da mastite subclínica e funcionar como um motivador dos
programas de controle da mastite e da melhoria da qualidade do leite.
Entretanto, não se deve superestimar o alcance dessas informações. Os dados de CCS
não servem, por exemplo, para:
5
a) selecionar animais para tratamento (antibiótico) da mastite subclínica durante a
lactação. Tem sido demonstrado que o tratamento realizado com base na CCS não traz
benefício econômico ao produtor e as taxas de cura das infecções são muito baixas.
b) ser usada como diagnóstico da mastite, se usada isoladamente. É um método
excelente de triagem, que deve ser associado ao exame microbiológico.
c) monitorar as mastites causadas por patógenos do ambiente. A prevalência da
infecção por esses microrganismos tende a ser baixa e rebanhos com predominância de
problemas de mastite ambiental podem ter CCS abaixo de 300.000 células/mL. As exceções
que ocorrem se devem ao aumento da incidência de mastite clínica, em determinados
períodos.
Além disso, os dados de CCS são úteis se usados e analisados em série (dados
mensais e reunidos a intervalos trimestrais ou semestrais, por exemplo). É necessário o
resultado de vários exames, em seqüência, para estimar os níveis de infecção do rebanho e
determinar as tendências de ocorrência de novas infecções. Isso permitirá avaliar a
necessidade de implementação de medidas corretivas ou simplesmente acompanhar as
medidas recomendadas. Deve-se considerar, também, a necessidade de se trabalhar com as
médias das contagens, sendo a média geométrica a mais recomendada.
9. Medidas para reduzir a CCS dos rebanhos
O fundamental é a prevenção de novas infecções da glândula mamária, principalmente
por meio de medidas higiênico-sanitárias. Estas incluem:
a) medidas gerais: redução da prevalência de mastite; atenção ao manejo e instalações
(condições de estabulação, umidade, ventilação, cuidados durante o parto, etc.)
b) intervalo entre as ordenhas: qualidade da cama e do ambiente de circulação dos
animais (limpos e secos), atenção aos animais no período da secagem (aplicação de
antibióticos específicos);
c) durante a ordenha: condições de tetas (limpas e secas antes da ordenha);
desinfecção de tetas (depois da ordenha, sempre, e antes, em casos específicos);
procedimentos adequados antes e durante a ordenha (prevenção de estresse, conforto do
animal, ordenha rápida e completa); higienização e manutenção adequada dos equipamentos
de ordenha; fornecimento de ração aos animais após a ordenha (para evitar que se deitem).
10. Bibliografia consultada
Brito, J. F. F.; Caldeira, G. A. V.; Verneque, R. S.; Brito, M. A. V. p. Sensibilidade e
especificidade do “California Mastitis Test” como recurso diagnóstico da mastite subclínica
em relação à contagem de células somáticas. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 17, p. 4953, 1997.
Bramley, A. J. et al. Current concepts of bovine mastitis. 4. ed. Madison: National Mastitis
Council, 1996. 64 p.
Hamman, J. Somatic cells: factors of influence and practical measures to keep a physiological
level. Bruxelas: International Dairy Federation, 1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 9-11.
Harmon, R. J. Physiology of mastitis and factors affecting somatic cell counts. Journal of Dairy
Science, v. 77, p. 2103-2108, 1994.
Heeschen, W. & Reichmuth, J. Mastitis: influence on qualitative and hygienic properties of milk.
In: INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION, INTERNATIONAL MASTITIS SEMINAR, 3º Tel
Aviv, 1995. Proceedings... p. 3.3-3.13.
6
Munro, G. L.; Grieve, p. A.; Kitchen, B. J. Effects of mastitis on milk yield, milk composition,
processing properties and yield and quality of milk products. The Australian Journal of Dairy
Technology, v. 39, p. 7-16, 1984.
Reichmuth, J. New systems for somatic cell counts. Bruxelas: International Dairy Federation,
1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 16-19.
Smith, K. L. Standards for somatic cells in milk: physiological and regulatory. Bruxelas:
International Dairy Federation, 1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 7-9.
Tabela 1. Relação entre contagem de células somáticas (CCS) e percentual de perda de
produção de leite.
CCS do leite total do
Quartos mamários infectados (%)
Decréscimo da produção
rebanho
(%)
200.000
6
0*
500.000
16
6
1.000.000
32
18
1.500.000
48
29
*Perda calculada como um percentual da produção esperada a 200.000 células/mL.
Fonte: Bramley et al. (1996).
Tabela 2. Contagem de células somáticas (CCS) de 3.012 amostras de leite, distribuídas entre
diferentes classes de escores do “California Mastitis Test” (CMT).
Escore do CMT
Interpretação do CMT
Nº de amostras
CCS (x1.000/mL)
2.029
80
1 (-)
negativo
2 (T)
reação suspeita
313
334
3 (+)
fracamente positivo
311
670
4 (++)
positivo
237
1.354
5 (+++)
fortemente positivo
122
4.456
Fonte: Brito et al. (1997).
Tabela 3. Fundamentos, vantagens e limitações dos testes de contagem de células
somáticas no leite.
Teste
Contagem microscópica direta
Fundamento
As células são fixadas e
coradas em lâmina de vidro e
contadas, usando-se
microscópio ótico comum.
Contador tipo “Coulter”
Usa um contador eletrônico
que pode ser calibrado para
reconhecer e contar células.
Vantagens e limitações
É o teste padrão, reconhecido
pelo IDF (FIL). É laborioso,
cansativo (induz a erros de
contagens); não é apropriado
para grande número de
amostras.
Método amplamente usado.
Apresenta limitações para o
teste de grande número de
7
Ótico-fluorescente
(equipamento Fossomatic)
Conta células que têm
intensidade mínima de
fluorescência, devido à
coloração do DNA nucléico.
Citometria de fluxo
(equipamentos: Somascope,
Somacount e ANADIS)
Usa um sistema ótico (laser)
para detectar e contar células,
cujos núcleos são corados com
uma substância química
(coloração do DNA).
“Wisconsin Mastitis Test”
O leite é misturado com um
detergente e o DNA das células
(WMT); Viscosímetro
se torna viscoso. Quanto mais
células, mais DNA e mais
viscosidade. A velocidade de
passagem da mistura
leite+detergente pelo orifício de
um tubo é a medida do número
e células.
“California Mastitis Test” (CMT) É uma adaptação do WMT em
que o detergente é misturado
com o leite em uma raquete e o
grau de formação do gel
(viscosidade) é estimado
visualmente.
amostras e por não ser
informatizado.
Método automático, barato, de
fácil processamento e muito
usado na maioria dos países
desenvolvidos. Os vários
modelos se adaptam a
diferentes exigências dos
laboratórios. Limitações: preço
do equipamento e manutenção
(dependendo da região).
Praticamente as mesmas do
equipamento Fossomatic.
Método indireto. Não
apropriado para grande número
de amostras. Não permite
automação. Não diferencia
contagens baixas de células.
É prático, barato e pode ser
aplicado ao lado do animal,
com resultado imediato.
A interpretação é subjetiva e
pode variar entre pessoas.
Permite estimar o número de
células, geralmente em cinco
categorias, com enorme
variação entre categorias.
Fonte: diversos autores.
Literatura
Esses textos, infelizmente, não estão publicados, mas abaixo envio algumas referências
de livros e artigos sobre o assunto e o endereço de um site (do National Mastitis Council. dos
Estados Unidos) onde você pode ampliar sua pesquisa.
1. Existe um livro (The bovine udder and mastitis), editado por Markus Sandholm e
outros, que aborda em vários capítulos aspectos relativos à imunologia da glândula mamária. O
livro foi publicado pela Universidade de Helsinque, em 1995.
2. No livro "Bovine Medicine. Diseases and husbandry of cattle", editado por Andrews, A.
H. e outros, da editora Blackwell Scientific Publications, de Oxford, Inglaterra, há alguns
capítulos que abordam o tema.
8
3. Existe um artigo de revisão muito bom (Sordillo, L. M.; Shafer-Weaver, K. and
DeRosa, D. Immunobiology of the mammary gland. Journal of Dairy Science, v. 80, p. 18511865, 1997. Nesse artigo você encontrará várias referências úteis.
4. Outro artigo (em espanhol), mas um pouco mais antigo:
Diaz Otero, F. & Santiago Cruz, J. R. Mecanismos de defensa de la glándula mamária bovina
en las fases de involución y lactación. Veterinaria Mexico, v. 23, n. 4, p. 357-365.
5. Em alguns sites na Internet poderão ser encontrados trabalhos ou referências:
www.nmconline.org A partir desse site, existem numerosos outros em que podem ser
encontradas informações (a maioria em inglês, infelizmente).
\\c\Sac - Pastas\Cartas Padrão\Qualidade do Leite\1 - CCS\Ccs.doc
9