Manual Salmonella GSS 2008 doc.

Transcrição

Gênero Salmonella:
Características Epidemiológicas e
Laboratoriais
Norma dos Santos Lázaro, Eliane Moura Falavina dos Reis, Christiane
Soares Pereira & Dalia dos Prazeres Rodrigues
Laboratório de Referência Nacional de Cólera e outras Enteroinfecções
Bacterianas – Laboratório de Enterobactérias
LRNCEB/LABENT
IOC/VPSRA/FIOCRUZ
Outubro/2008
0
Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ
LRNCEB/LABENT
Gênero Salmonella: Características Epidemiológicas e Laboratoriais
INDICE
Página
1. Taxonomia .......................................................................................
2.
2. Características Gerais .....................................................................
4
3. Habitat ............................................................................................
6
4. Características clínicas e patogenia ................................................
6
5. Ecologia ...........................................................................................
10
6. Epidemiologia .................................................................................
11
7. Diagnóstico Laboratorial – Coleta de Espécimes Clínicos .......... ...
12
7.1. Sangue............................................................................................
12
7.2. Fezes .............................................................................................
13
7.3. Transporte de espécimes clínicos .................................................
15
. Diagnóstico Laboratorial de Salmonella spp. de Espécimes Fecais.......
16
Esquema de Isolamento - Fluxograma................................................
17
8.1. Pré-Enriquecimento .......................................................................
18
8.2. Enriquecimento Seletivo ................................................................
18
8.3. Meios Seletivos-Indicadores ..........................................................
20
7.4. Identificação Bioquímica Presuntiva (Meios de Triagem) ..............
25
8.5.Caracterização Bioquímica Complementar .....................................
31
9. Aspectos Gerais sobre os Antígenos das Enterobactérias ..............
41
10. Controle de Qualidade de Meios de Cultura, Reagentes
e Equipamentos ................................................................................
47
11. Anexos .............................................................................................
50
12. Bibliografia .......................................................................................
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1. Taxonomia
A designação do gênero Salmonella foi adotada em 1900 por Lignières em
homenagem a Daniel Salmon, o qual isolou o microrganismo conhecido como
Salmonella enterica sorovar Choleraesuis de suínos. Sua nomenclatura teve como
orientação inicial informações relacionadas às condições clínicas ou ao hospedeiro
do qual o microrganismo era isolado.
Entretanto, a diversidade inicial de sorovares que apresentavam etiologia não
específica de um determinado hospedeiro, levou inicialmente a designação do
mesmo sorovar em hospedeiros distintos, em locais diferentes. A partir de 1920, um
grupo de microbiologistas, liderados por Fritz Kauffmann em Copenhagen e por
Philip Bruce White em Londres unificaram a taxonomia, tendo seu trabalho
reconhecido pelo subcomitê de Salmonella da Sociedade Internacional de
Microbiologia em 1933, como esquema de Kauffmann-White. A partir de então sua
nomenclatura sofreu algumas modificações tendo por base a utilização de métodos
clássicos e métodos moleculares, como AFLP, e seqüenciamento 16S rRNA, MLEE,
FAFLP.
Na atualidade o gênero é dividido em duas espécies e seis subespécies ou
subgêneros, S.enterica (subespécies enterica, salamae, arizonae, diarizonae,
houtenae e indica) e S.bongori.
A forma de redação na nomenclatura atual como por ex. do sorovar
Typhimurium, deve ser reportada como Salmonella enterica subespécie enterica
sorovar Typhimurium. Contudo pode ser redigida de uma forma reduzida onde o
nome do sorovar é iniciado com letra maiúscula, porém nunca itálico, como por
exemplo, Salmonella sorovar Typhimurium ou Salmonella Typhimurium.
Salmonella é o gênero de maior relevância na família Enterobacteriaceae,
embora sua relação filogenética seja de certo modo conjuntural. Dependendo do
método empregado, S.enterica é mais relacionada com Citrobacter do que com
Escherichia coli (homologia de DNA) ou em sentido inverso quando empregado
método de avaliação de grandes fragmentos (23S rRNA).
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Em geral, acredita-se que Salmonella e E.coli descendam de um ancestral
comum a 160-180 milhões de anos, durante o período terciário, em paralelo com os
invertebrados. E.coli e Salmonella difásica se adaptaram aos mamíferos, enquanto
sorovares monofásicos permaneceram adaptados aos repteis.
Em cada subespécie são reconhecidos diferentes números de sorovares
tendo por base a caracterização de seus antígenos somáticos (O) e flagelares (H),
perfazendo atualmente >2.500 sorovares. Entre as espécies, a subespécie
S.enterica apresenta maior número de sorovares, sendo responsável por 99% dos
isolamentos, usualmente de animais de sangue quente, cuja distribuição editada por
Popoff M.Y. & Le Minor L., 2001 encontra-se apresentada na Tabela 1.
Em 2002, foram incluídos 18 novos sorovares, sendo 12 pertencentes a
S.enterica subespécie enterica, 2 subespécie salamae, 2 diarizonae, 1 houtenae e 1
S. bongori.
Atualmente são reconhecidos cerca de 2510 sorovares incluídos em duas
espécies S.enterica e S. bongori, como discriminados abaixo:
Salmonella enterica subsp. enterica –
1490 sorovares
Salmonella enterica subsp salamae -
500
Salmonella enterica subsp arizonae -
94
Salmonella enterica subsp diarizonae - 320
Salmonella enterica subsp houtenae
72
Salmonella entérica subsp. indica
12
Salmonella bongori
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Em 2004 uma nova espécie foi proposta, tendo sido designada Salmonella
subterranea. Seu isolamento foi efetuado em sedimento subterrâneo, de solo com
baixo pH na Oak Ridge, Tennessee. Esta amostra apresentou forte inter-relação
com S.bongori, através de seqüenciamento 16S rRNA além de algumas
características como indol positivo, H2S e lisina descarboxilase negativa, pigmento
amarelo e um flagelo lateral. A amostra tipo proposta é ATCC BAA-86.
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Tabela 1. Nomenclatura atual
Espécies
S.enterica
Subespécies
enterica
salamae
arizonae
diarizonae
houtenae
indica
ATCC no.
43971
43972
13314
43973
43974
43976
S.bongori
43975
2. Características Gerais
Pertencente
a
família
Enterobacteriaceae,
sendo
que
morfologicamente
bastonetes Gram negativos, geralmente móveis, formam ácido e, na maioria das
vezes, gás a partir da glicose, excetuando-se os sorovares S. Typhi, S. Pullorum e
S.Gallinarum (≤5% produzem gás). Também fermentam
arabinose, maltose,
manitol, manose, ramnose, sorbitol, trealose, xilose e dulcitol. A maioria das
salmonelas de interesse clínico não fermenta lactose, contudo, muitas cepas podem
adquirir esta característica através de transferência plasmidial. São oxidase negativo,
catalase positivo, indol, Voges-Proskauer (VP), vermelho de metila (VM), malonato
e uréia negativos. Produzem gás sulfídrico a partir da redução do enxofre por ação
da enzima cisteína desulfidrase. Apresentam ainda como características metabólicas
a capacidade de descarboxilar os aminoácidos lisina e ornitina, reduzir nitratos a
nitritos e utilizar o citrato como fonte única de carbono. No entanto, ocorrem
variações em função do sorovar e/ou subspécie. Por exemplo, S.Arizonae não
fermenta o dulcitol, mas freqüentemente é malonato positivo. S. Pullorum não
fermenta o dulcitol e S. Gallinarum não descarboxila ornitina e não produz gás a
partir da fermentação da glicose. Somando-se a estas características, S. Pullorum e
S. Gallinarum são imóveis, enquanto as salmonelas paratíficas são móveis.
As características bioquímicas que permitem diferenciar as distintas
subespécies dentro da espécie enterica e as espécies S. bongori e S. subterranea
são apresentadas na tabela 2.
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Tabela 2. Características diferenciais de espécies e subespécies de Salmonella spp.
Espécies
Dulcitol
ONPG(2h)
Malonato
Gelatinase
Sorbitol
Crescimento KCN
L(+)Tartarato(a)
Galacturonato
γ-glutamyl transferase
β-glucuronidase
Mucato
Salicina
Lactose
Lise-fago O1
Habitat normal animais
Sangue
quente
+
+
+
+
+
+
- (75%)
-
+
+
+
+
+
+
+
- (70%)
+ (75%)
+
+
+
+
+
+
+
-
Indica
Características
houtenae
+
+
+
+
+
D
+
+
diarizonae
salamae
+
+
+
+(b)
D
+
+
arizonae
enterica
Subespécies
S.enterica
S.bongori
S.subterranea
d
d
+
+
d
+
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+
D
+
+
+
+e
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Sangue frio e meio ambiente
?
a: d-tartarato; b: S.Typhimurium (d), S.Dublin (-); +: ≥90% reações positivas; - : ≥90% reações negativas; d:
diferentes reações(sorovares); e: crescimento sem produção de ácido
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Tabela 3. Diferenciação bioquímica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e sorovares de S.enterica
subsp. enterica mais freqüentes.
S. Typhi
S.Paratyphi A
-
+
S. enterica
subsp. enterica
+
Dulcitol
+/-
+
+
Arabinose
-/ +
+
+
+
-
+
+
+
Dehidrolação Arginina
+/-
+
+
H2S
+*
- / (+)
+
-
-
+
Glicose (gás)
Ácido:
Descarboxilação:
Lisina
Ornitina
Citrato de Simmons
+ : positivo; -: negativo; (+) 75% positivo após 48 horas; *: fraco.
3. Habitat
O habitat natural das salmonelas pode ser dividido em 3 categorias com base
na especificidade do hospedeiro e padrão clínico por eles determinado: altamente
adaptadas ao homem incluindo S. Typhi e S. Paratyphi A, B e C, agentes da febre
entérica (febres tifóide e paratifoide); altamente adaptadas aos animais
representadas por S. Dublin (bovinos), S.Choleraesuis e S. Typhisuis
(suínos),
S.Pullorum e S.Gallinarum (aves), responsáveis pelo paratifo dos animais.
Entretanto, em determinadas situações (idade jovem, pacientes com doenças
crônicas, idosos, imunocomprometidos) os sorovares S.Dublin e S.Choleraesuis
podem determinar no homem, um quadro septicêmico, i.é., mais grave do que o
causado por S.Typhi.
A
terceira
categoria
inclui
a
maioria
dos
sorovares
que
atingem
indiferentemente o homem e animais, designadas salmonelas zoonóticas, as quais
são responsáveis por quadro de gastrenterite (enterocolite) ou doenças de
transmissão alimentar. Sua distribuição é mundial, sendo os alimentos os principais
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veículos de sua transmissão. São responsáveis por significantes índices de
morbidade e mortalidade, tanto nos países emergentes como desenvolvidos,
determinando pequenos e grandes surtos envolvendo, principalmente, o consumo
de alimentos de origem animal como ovos, aves, carnes e produtos lácteos.
4. Características clínicas e patogenia
A dose infectante varia de 105 a 108 células, porém em pacientes
imunocomprometidos têm sido observadas doses ≤103 para alguns sorovares,
envolvidos em surtos de doenças de transmissão alimentar (DTA). A manifestação
clínica inclui quadros entéricos agudos ou crônicos, além de localização
extraintestinal, como infecções septicêmicas, osteomielite, artrite, hepatite, etc.
Os microrganismos penetram por via oral invadindo a mucosa intestinal, com
disseminação para a submucosa, resultando em enterocolite aguda. Normalmente o
quadro diarréico é moderado, sem a presença de sangue, entretanto, em alguns
quadros clínicos, pode ocorrer perda de pequeno volume de fezes associado a
tenesmo e sangue.
Seu transporte, através do sistema reticulo endotelial, aliado a capacidade de
multiplicação no interior dos macrófagos, possibilitam sua manutenção e
disseminação no organismo. Indivíduos subnutridos ou com deficiências do sistema
imune podem apresentar infecções de extrema gravidade, como por exemplo, à
incidência de bacteremia em pacientes aidéticos, dos quais 20 a 60% relatam
infecção gastrintestinal prévia.
Sua virulência é multifatorial, incluindo mobilidade, habilidade de penetrar e
replicar nas células epiteliais, resistência à ação do complemento, produção de
entero, cito e endotoxina, sendo desconhecido o exato papel de cada um, para a
manifestação da doença. Em alguns sorovares a virulência é mediada por um
plasmídio, em uma região do operon de 8Kb que contem os genes spvR ABCD, cuja
origem ainda encontra-se desconhecida. A relação entre a presença deste plasmídio
de virulência e sorovar já se encontra bem estabelecida em S.Dublin, S.Gallinarum e
S.Choleraesuis.
Em pacientes imunodeprimidos a salmonelose pode ser assintomática ou
ainda determinar diarréia auto-limitada em 95% dos casos. As infecções clínicas
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humanas determinadas por Salmonella spp. apresentam quatro síndromes clínicas
distintas: gastrenterite, febre entérica, septicemia com ou sem infecções localizadas
e determinar o estado de portador assintomático. Entre a totalidade de sorovares
S.Enteritidis e S.Typhimurium são os sorovares de maior prevalência em casos de
septicemia e infecções localizadas.
4.1. Infecções gastrentéricas:
O quadro clinico humano pode variar com fezes diarréicas de características
aquosas semelhante à diarréia colérica a consistentes com sangue oculto ou visível
e muco. O quadro diarréico regride usualmente de 3 a 4 dias. Pode ocorrer febre
(39ºC) em cerca de 50% dos casos e normalmente de curta duração (dois dias),
cólicas abdominais leves a intensas quando ocorre invasão dos linfonodos
(linfadenite mesentérica), podem mimetizar apendicite. Desenvolvimento de
síndrome de cólon irritado (SCI), que se caracteriza por diarréia branda persistente
seguida de quadro agudo de gastrenterite. Em pacientes portadores de SCI, a
persistência como portador assintomático em 31% após cinco anos. Em pacientes
hospitalizados, portadores de câncer, o quadro reincide ocasionando quadro de
pneumonia
semelhante
àquele
ocasionado
por
Pneumocystis.
Salmonella
permanece presente nas fezes após cessarem os sintomas, com uma média de
excreção durante o período de cinco semanas. O estágio de portador persiste por
até nove semanas em 90% dos adultos, sendo em crianças <5 anos inferior a sete
semanas. A freqüência deste estagio entre manipuladores de alimentos usualmente
é reduzida (0,5%). Entre estes profissionais normas de educação e higiene no
manuseio de alimentos representam os principais aspectos para minimizar o risco de
transmissão alimentar.
4.2. Bacteremia
Febre entérica é usualmente determinada por S.Typhi, S.Paratyphi A e C e
S.Sendai entretanto pode ser determinada por outros sorovares. Sua freqüência é
mais elevada entre pacientes do sexo masculino, acometendo de 1 a 4% dos
pacientes imunodeprimidos (especialmente doenças do sistema reticoendotelial,
linfoma, leucemia, câncer, lúpus sistêmico e outras doenças vasculares. O risco de
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desenvolvimento de bacteremia entre pacientes com HIV é de 20-100 vezes maior
do que na população normal. Entre estes somente 20% dos pacientes apresentam
quadro posterior diarréico.
Usualmente a bacteremia é apresenta elevada prevalência em adultos, os
quais tem como histórico o uso prévio de drogas imunosupressoras. Entre estes
pacientes, a complicação subseqüente usualmente é a pneumonia, sendo entre
idosos a responsável por elevados índices de letalidade.
4.3. Infecções do Sistema Nervoso Central
As infecções incluem meningites, ventriculite, abcessos, empiema subdural. A
presença de diarréia e outros sintomas gastrentericos é apontada em 50% dos
casos. Embora a bacteremia seja comum em pacientes com AIDS, complicações do
sistema nervos central raramente são apontadas. A maior prevalência destas
infecções é apontada entre pacientes de longo período de hospitalização, drenagem
cirúrgica, terapia antimicrobiana prolongada, especialmente em pacientes com HIV.
Os sorovares de maior prevalência em bacteremia e nas infecções do sistema
nervoso central são S. Typhimuriume S.Enteritidis.
4.4. Infecções em outros sítios
Variam de bacteriuria
ao comprometimento de juntas (mais comuns), de
ossos a tecidos e endocardites (<1 a 0.1%), e raramente no baço, genital e
complicações pulmonares. Podem determinar infecções no trato urinário, de maior
prevalência em mulheres, das quais 50% com quadro diarréico. Os principais fatores
de risco são imunossupressão, cistite, pielonefrite, abscesso renal e manuseio de
repteis, entretanto a maioria dos casos ocorre em pacientes sem fatores de risco
conhecidos.
Alem das meningites, Salmonella é reconhecida por ocasionar lesões
endovasculares e osteomielite acometendo 7 a 10% dos pacientes >50 anos.
Em pacientes que apresentam como fatores de risco a diabetes, Infecção por
HIV e aterosclerose a presença de Salmonella é observada em placas
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arteroscleróticas, tendo em vista a propriedade de se multiplicar nos fagócitos
encontradas nestas placas.
Entre as complicações da gastrenterite podem ser citadas a rabdomiolise
(injúria do músculo esquelético, usualmente acompanhado de falha renal;
osteomielite que pode levar ao aparecimento de aneurisma abdominal aórtico, com
elevado índice de mortalidade, linfadenite mesentérica, apendicite, peritonite,
colecistite, pericardite, pleutopneumonia, insuficiência renal, têm sido amplamente
apontadas como infecções extra-intestinais determinadas por Salmonella.
Artrite reativa, artrite inflamatória e a síndrome de Reiter (ocorrência
simultânea de uretrite e/ou cervicite, conjuntivite e artrite) tem sido reportadas por
uma ampla variedade de enteropatógenos incluindo Salmonella spp. A incidência de
artrite reativa e síndrome de Reiter em surtos variam de 6-29% e 3%
respectivamente. Estudos recentes apontam entre pacientes com o marcador
imunogenético HLA-B27 apresentam elevada probabilidade de desenvolver a
síndrome de Reiter. A antibioticoterapia não é efetiva para o tratamento de artrite
reativa.
5. Ecologia
Salmonella spp. é eliminada em grande número nas fezes contaminando o
solo e água. A sobrevida no meio ambiente pode ser muito longa, em particular na
matéria orgânica. Pode permanecer viável no material fecal por longo período
(anos), particularmente em fezes secas, podendo resistir mais de 28 meses nas
fezes de aves, 30 meses no estrume bovino, 280 dias no solo cultivado e 120 dias
na pastagem, sendo ainda encontrada em efluentes de água de esgoto, como
resultado de contaminação fecal.
Os produtos agrícolas não processados, como hortaliças
e frutas e os
alimentos de origem animal, como as carnes cruas, o leite e os ovos, são veículos
freqüentes de salmonelas. A contaminação de origem fecal é geralmente a fonte
para os produtos agrícolas, pela exposição à água contaminada; para o leite e ovos,
através da exposição direta e para a carne, usualmente durante as operações de
abate.
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A contaminação cruzada é o fator principal no caso de alimentos elaborados
como cereais, chocolate, doces, produtos a base de soja, produtos a base de ovos
pasteurizados, leite em pó, ingredientes de rações para animais (farinha de peixe, de
penas e de ossos) e condimentos. A contaminação durante a elaboração ou preparo
pode resultar do contato direto com alimentos antes de sua cocção ou proveniente
do meio ambiente, como no caso de superfícies contaminadas em cozinhas ou
indústrias.
Comparando com outros bastonetes Gram negativos, as salmonelas são
relativamente resistentes a vários fatores ambientais. A adaptabilidade fisiológica de
Salmonella é demonstrada por sua habilidade para proliferar em valores de pH entre
7.0 e 7.5 (extremos 3.8 – 9.5), temperatura de 35 - 43oC (extremos 5 a 46oC) e uma
atividade hídrica (≥0,94), ocorrendo variações entre sorovares e/ou cepas. Nos
produtos secos como o chocolate, o cacau em pó, as especiarias ou o leite em pó e
em produtos congelados como os sorvetes, o normal é a sobrevivência por períodos
de tempo prolongados. A bactéria é sensível ao calor, não sobrevivendo à
temperatura superior a 700C, no entanto a termorresistência pode incrementar-se
com menor coeficiente de atividade de água.
A inativação ocorre rapidamente em temperatura de pasteurização em
alimentos com atividade de água ≥0,95 a qual quando inferior, aumenta a
termorresistência. Esta associação entre tolerância ao sal e ácido resistência são
interdependentes. Certos processos como salmoura (≥9,0%) e defumação têm efeito
limitado na sobrevivência das salmonelas, podendo sobreviver por vários meses na
salmoura com cerca de 20% de sal, em produtos de elevado teor protéico ou de
gordura. Como exemplos, podem ser citados a carne seca defumada e o pescado,
onde apresentam capacidade de sobrevivência de várias semanas a meses. A
relativa
resistência
que
estes
microrganismos
apresentam
à
dessecação,
congelamento, salmoura e defumação, explica porque sobrevivem em muitas
classes de alimentos. O efeito bactericida das condições ácidas varia de acordo com
a natureza do ácido utilizado no processo, onde os ácidos acético e propiônico são
mais inibitórios que os ácidos lático e cítrico.
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6. Epidemiologia
A salmonelose é uma das zoonoses mais complexas em sua epidemiologia e
controle, cujos PA
drões diferem de uma região para outra. Isto se deve a diferenças nos hábitos
alimentares, práticas de elaboração de alimentos, criação de animais e padrões de
higiene e saneamento. O controle das salmoneloses representa um desafio para
a Saúde Pública, tendo em vista a emergência de novos sorovares e a
reemergência de outros em determinadas áreas, tanto nos países emergentes
quanto naqueles industrializados.
O fator epidemiológico mais destacado nos animais é o estado de portador,
onde a falta de sintomas e as dificuldades técnicas para sua detecção antes ou
durante a inspeção dos produtos de origem animal, os convertem em fonte contínua
de contaminação do meio ambiente e, portanto, dos alimentos.
Qualquer alimento que contém Salmonella é um risco potencial para o
consumidor, cuja veiculação é facilitada, na atualidade, pela mudança nos hábitos
alimentares da população. A necessidade cada vez mais intensa de produção/oferta
de alimentos tem como fatores de risco, falhas quanto ao manuseio, transporte
muitas vezes em condições inadequadas, aliados à ausência de critérios básicos de
higiene e saneamento, os quais favorecem a disseminação.
Considerando que sua principal via de transmissão está na cadeia alimentar,
sua presença em animais, criados com objetivo comercial, aponta este
microrganismo
como
o
mais
incidente
e
relevante
agente
etiológico
de
enteroinfecções. Isto resulta em milhões de dólares em perdas para a indústria,
particularmente de bovinos, suínos e aves, tanto para o mercado interno quanto para
exportação, onde em alguns países, a rigidez na inspeção representa uma
necessidade constante de qualidade.
Neste contexto, observa-se o aumento da resistência de Salmonella spp. aos
antimicrobianos, com o percentual se elevando de 17% na década de 70 para 31%
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no final dos anos 80 incluindo-se a resistência as fluoroquinolonas. Tal fato vem
culminando neste século com o aparecimento, em diferentes paises, de cepas
produtoras de diferentes tipos de beta-lactamases.
A incidência de resistência bacteriana a antimicrobianos representa risco à
saúde humana e animal. Este tema de extrema importância tem sido objeto de
atenção de instituições como a Organização Mundial da Saúde (OMS), Escritório
Internacional de Epizootias (OIE) e Codex Alimentarius, que vêm discutindo
soluções globais para o problema. Tal fato tem por base sua distribuição mundial,
sendo detectadas na maioria das espécies animais utilizados para consumo
humano, além de animais silvestres e domésticos.
7. Diagnóstico Laboratorial - Espécimes clínicos
7.1.
Sangue
O hemocultivo reveste um interesse especial no caso de febre tifóide e
paratifóide, porém não é constantemente positivo. Os percentuais de positividade,
na ausência de tratamento antibiótico, são de 90% durante a primeira semana de
evolução, 75% na segunda, 40% na terceira e 10% na quarta semana.
Os hemocultivos são negativos nas síndromes de infecções transmitidas por
alimentos (infecções intestinais), no entanto, estes sorovares podem causar
septicemia em indivíduos imunocomprometidos.
Principais cuidados para coleta:
•
A coleta deve ser efetuada antes da utilização de antimicrobianos
•
Efetuar a desinfecção da superfície dos frascos de cultivo (álcool 70ºGL);
•
Fazer a assepsia do sítio de punção (álcool 70ºGL ou solução iodada) em
movimentos concêntricos do centro para a extremidade;
Volume para cultura:
Adultos: 20mL, coletados com seringa, divididos em duas alíquotas para inoculação
em dois frascos de meio de cultura (inocular 10mL/100mL de meio enriquecido
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acrescido de anticoagulante SPS (Polianetolsulfonato sódico).
Crianças: (inocular 1mL/10mL de meio enriquecido acrescido de SPS).
Peso
Volume total
<1,5 kg
1 mL
< 4 kg
1 mL
4-13 kg
3 mL
13-25 kg
10 mL
>25 kg
20 mL
Processamento das amostras de sangue
•
Todas as culturas de sangue (hemocultura) devem ser incubadas a 35ºC e
quando o hemocultivo por efetivado por metodologia tradicional, avaliado por
7 dias. Paralelamente pode ser empregada a semeadura direta em meio
seletivo-indicador.
•
A partir do crescimento de colônias com morfologia típica, deverá ser
efetuado o isolamento e subseqüente identificação bioquímica e antigênica.
•
Caso ocorra o recebimento de sangue coagulado, deve ser efetuada a
dilaceração do coágulo, através de uma pipeta e em seqüência a semeadura
em meio de enriquecimento e paralelamente em seletivo-indicador.
7.2.
Fezes:
Aspectos relevantes para a coleta
•
As fezes devem ser coletadas durante a fase aguda, antes de se iniciar o
tratamento com antibióticos.
•
Swabs retais devem ser priorizados para pacientes com infecção ativa, do
mesmo modo que para crianças ou indivíduos com dificuldade de obtenção
de amostras.
14
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•
A pesquisa de Salmonella Typhi nas fezes é indicada a partir da segunda
semana da doença, assim como na convalescença e na detecção de
portadores.
Fezes de emissão espontânea:
•
Estas amostras devem ser colhidas em recipientes de boca larga, limpos e/ou
esterilizados, sendo mantidos sem processamento laboratorial por um período
máximo de duas horas após a coleta. Como amostra deve ser tomada de 0,5
a 2g de fezes e quando da presença de sangue ou muco, esta deve ser a
porção selecionada para a avaliação laboratorial.
•
Evitar a coleta de espécimes fecais a partir das roupas do paciente, da
superfície de camas e/ou chão.
Espécimes retais:
•
Umedecer o swab em solução fisiológica ou água destilada esterilizada;
•
Introduzir o swab na ampola retal do paciente ou comunicante, comprimindo-o
em movimentos rotatórios suaves, por toda a extensão da mesma;
•
Processar no período até duas horas e caso não seja possível, introduzir o
swab no meio de Cary & Blair. Neste meio de transporte o espécime pode ser
conservado por até cinco dias em refrigeração.
Coleta de fezes em papel filtro.
•
Utilizar tiras de papel de filtro, tipo xarope ou mata-borrão, com dimensões de
2,5cm de largura por 6,0cm de comprimento.
•
As fezes diarréicas ou emocionadas em água, devem ser espalhadas em 2/3
de uma das superfícies do papel, com auxílio de um fragmento de madeira
(palito individual) ou de qualquer outro material semelhante, disponível no
momento.
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•
As tiras de papel de filtro devem ser acondicionadas em invólucros plásticos
após dessecar naturalmente. Sob estas condições, Salmonella se mantém
viável por um período aproximado de 30 dias.
7.3. Transporte de espécimes clínicos
•
Utilizar na medida do possível containeres plásticos ou de isopor para
manutenção por período curto (duas a quatro horas) de transporte das
amostras;
•
Envolver os isolados ou espécimes clínicos com plástico ou papel e
colocá-los em outra embalagem no interior da caixa de transporte;
•
Manter as fichas contendo as informações clínicas e/ou epidemiológicas à
parte de espécimes clínicos;
•
Para reutilização dos containeres para transporte, efetuar a desinfecção
utilizando solução de hipoclorito de sódio (100 ppm);
Exame direto de fezes: avaliação presuntiva
•
Presença de piócitos e células mononucleares indicam processo inflamatório.
•
A presença de polimorfonucleares é indicativa de síndrome disenteriforme ou
colite determinada por patógenos invasivos.
•
Células mononucleares podem predominar em pacientes com febre tifóide.
Metodologia: Utilizar solução de azul de metileno de Loeffler, misturado em igual
quantidade com as fezes, colocada sobre lâmina, coberta por lamínula e
examinar com microscópio ótico (objetiva de 10X e 40X).
8.
Diagnóstico Laboratorial de Salmonella spp em Espécimes Fecais
A procura de uma metodologia ideal para o isolamento de Salmonella, tem
sido uma constante entre os pesquisadores o que tem trazido melhorias na
especificidade, sensibilidade, simplicidade e rapidez na execução dos exames
bacteriológicos.
16
LRNCEB/LABENT
Numerosos métodos e técnicas assegurando o isolamento de diferentes
sorovares de Salmonella procedentes de distintas fontes, têm sido descritos. As
fórmulas incluem componentes que não só inibem o crescimento de certas espécies
bacterianas, como também revelam uma variedade de características bioquímicas,
que são importantes na identificação preliminar do microrganismo.
Particularmente, em relação aos alimentos, o isolamento de Salmonella
representa um problema para os bacteriologistas em função do baixo número de
microrganismos presentes, associados a uma microbiota mista e numerosa,
considerando-se ainda a complexa composição dos alimentos. Neste caso, as
técnicas de cultura convencionais envolvem as etapas subseqüentes de préenriquecimento, enriquecimento seletivo e isolamento em meios seletivos indicadores.
Por outro lado, no caso de espécimes clínicos, durante a fase aguda da
doença,
se
um
espécime
é
apropriadamente
obtido,
procedimentos
de
enriquecimento não são requeridos pelo fato de que um grande número de células
está presente. Contudo na forma crônica, ou mesmo, na identificação de portadores,
caldos de enriquecimento seletivo e agar seletivo são necessários.
17
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Esquema de Isolamento
Fezes (suspensão)
Swab fecal/retal
Semeadura Direta
Agar EMB
Agar MacConkey
Enriquecimento
Caldo Selenito Cistina
Caldo Tetrationato Kauffmann
Caldo Rappaport Vassiliadis*
18/24h-37ºC
*18/24h-43ºC
18/24h-37ºC
Isolamento
Agar Hektoen
Agar SS
Agar XLD
Agar Sulfito Bismuto
Agar Verde Brilhante
Isolamento 5 -10 colônias:
Meio de Triagem
Caracterização bioquímica
Identificação antigênica
18
LRNCEB/LABENT
8.1. Pré-Enriquecimento
Na etapa de pré-enriquecimento, o espécime é enriquecido em um meio não
seletivo para restaurar salmonelas injuriadas, a uma condição fisiológica estável. A
água peptonada a 1,0% tamponada e o caldo lactosado são comumente usados,
mas outros meios tais como triptona de soja e caldo nutriente, podem ser
empregados. O caldo lactosado pode eventualmente ser inconveniente como préenriquecimento quando utilizado em amostras que contém alta população de
microrganismos fermentadores da lactose, pois a subsequente redução do pH do
meio pode limitar a multiplicação de salmonelas, em particular das células injuriadas,
no entanto a literatura aponta que Salmonella se multiplica a uma faixa ampla de pH
(pH 3.8 – 9.5).
8.2. Enriquecimento Seletivo
O enriquecimento seletivo determina um aumento contínuo de Salmonella
restringindo a proliferação de outras bactérias. Devido à utilização dos diferentes
agentes inibitórios adicionados aos meios, estes também diferem em sua
seletividade e aplicação específica.
Diferentes tipos de inibidores têm sido propostos para enriquecimento seletivo
de salmonelas, sendo a bile, o tetrationato, o selenito e corantes como o verde
brilhante e o verde malaquita, os mais usados. Estes inibidores são incorporados
aos meios, isolados ou em combinação.
Vários meios de enriquecimento são conhecidos, destacando-se o Caldo
Tetrationato, o Caldo Tetrationato-Verde Brilhante segundo MULLER-KAUFFMANN,
Caldo Selenito, Caldo Gram-Negativo, Caldo Cloreto de Magnésio-Verde Malaquita
segundo RAPPAPORT, o Caldo Rappaport-Vassiliadis, e variações destes.
Caldo Tetrationato
A seletividade do Caldo Tetrationato depende de sua capacidade de
restringir a multiplicação de coliformes. Sorovares de Salmonella (exceto
19
LRNCEB/LABENT
Choleraesuis, Typhisuis, Gallinarum e Pullorum) possuem a enzima tetrationatoredutase e, consequentemente, são capazes de multiplicar-se no meio. Porém, o
desenvolvimento excessivo de Proteus, que também produz essa enzima, pode
interferir na detecção de Salmonella. Neste caso, o Caldo Tetrationato - Verde
Brilhante segundo Muller-Kauffmann contendo verde brilhante e bile, inibe a
multiplicação de Proteus.
Caldo Selenito
Um outro meio de enriquecimento, o Caldo Selenito vem sendo recomendado
para o enriquecimento de Salmonella em espécimes fecais, o qual vem sendo
recomendado para o isolamento de S. Typhi e S. Paratyphi B, sendo também útil
para a detecção de outros sorovares de Salmonella, mesmo quando os
microrganismos estão presentes em pequeno número. A adição de cistina melhora a
qualidade do meio de cultura.
Caldo Rappaport.
O Caldo Cloreto de Magnésio-Verde Malaquita (Caldo Rappaport) vem
demonstrando eficácia na detecção de Salmonella. A associação do cloreto de
magnésio com um corante bacteriostático (verde malaquita) veio a se constituir no
meio de enriquecimento para a maioria dos sorovares de Salmonella, com exceção
de S. Typhi. Posteriormente, uma modificação desse meio, resultante da diminuição
da concentração de verde malaquita e adotando-se a temperatura de 430C para
incubação, o qual foi denominado meio de Rappaport-Vassiliadis, vem evidenciando
maior eficiência quando da utilização de pequenas quantidades de inóculo, bem
como por inibir totalmente os microrganismos competitivos.
Caldo Gram Negativo (Caldo GN)
Este meio é utilizado para o enriquecimento seletivo de bactérias Gram
negativas, particularmente Shigella e Salmonella, a partir de todo tipo de
20
LRNCEB/LABENT
espécimes clínicos. Devido à concentração relativamente baixa de desoxicolato, é
menos inibidor de Escherichia coli e outros coliformes, enquanto a maior
concentração de manitol em relação a glicose, limita o crescimento de Proteus e
favorece o de Salmonella e Shigella, que são fermentadores do manitol.
Tabela 4. Características dos meios de enriquecimento seletivos
MEIOS
Caldo
Selenito
SUBSTÂNCIAS
INIBIDORAS
Selenito de sódio
BACTÉRIAS INIBIDAS
BACTÉRIAS
FAVORECIDAS
Coliformes
Salmonella sorovares
Typhisuis, Choleraesuis,
Gallinarum, Pullorum
Salmonella spp.
Caldo GN
Citrato
Desoxicolato
de sódio
Gram positivos,
Coliformes, Proteus
Maioria das
Enterobacteriaceae
Caldo
Rappaport
Cloreto de
magnésio
Verde malaquita
Gram positivos, coliformes
S. Typhi Shigella
Salmonella spp.
Caldo
Tetrationato
Sais biliares
iodo
Gram positivos, coliformes
Salmonella sorovares
Pullorum, Gallinarum,
Typhisuis, Choleraesuis,
Typhi, Paratyphi
Salmonella spp.
8.3. Meios Seletivos-Indicadores
Além dos meios de enriquecimento, tem-se a considerar no esquema de
diagnóstico das enterobactérias os chamados meios indicadores seletivos, de
natureza sólida, que desempenham uma função primordial para o isolamento de
diferentes membros desta família.
21
LRNCEB/LABENT
Todos estes meios contêm um sistema diagnóstico para permitir diferenciação
de Salmonella com outras bactérias, em função das diferenças em suas
propriedades inibitórias e no aspecto macroscópico das colônias (Tabela 4).
Estes são comumente baseados na incapacidade da maioria das salmonelas para
fermentar a lactose e, em alguns casos, outros substratos, tais como a sacarose e a
salicina, bem como na capacidade de produção de sulfeto de hidrogênio.
Vários meios, tais como o Agar Verde Brilhante, Agar Entérico Hektoen,
Agar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), Agar Salmonella-Shigella (Agar SS) e
Agar Sulfito de Bismuto, são amplamente usados nos métodos padrões para o
isolamento de Salmonella.
O Agar SS, XLD e Hektoen são relacionados à média seletividade e à
incidência de numerosas reações falso-positivas, enquanto o Agar Sulfito de
Bismuto e Verde Brilhante, apresentam alta seletividade. O Agar Sulfito de Bismuto
é altamente recomendado para o isolamento de S. Typhi, entretanto não deve ser
utilizado se foi estocado por período superior a 24–36 horas. Da mesma forma, tem
demonstrado inibir outros sorovares de Salmonella a menos que seja refrigerado a
4oC por no mínimo 24 horas antes de uso.
Meios de baixa seletividade tais como Agar Eosina Azul de Metileno e Agar
MacConkey poderão ser utilizados para o isolamento de Salmonella quando
provenientes de material clínico, onde espera-se um maior número.
Mais recentemente, novos meios de cultura que incorporam substâncias
cromogênicas em sua fórmula estão disponíveis no mercado, os quais por serem
seletivos e indicadores, permitem a diferenciação de Salmonella de outras bactérias,
pelo desenvolvimento de cores características para cada gênero/grupo bacteriano.
Dentre os meios cromogênicos, destacam-se o Agar Rambach, Cromocen SC,
CHROMagar Salmonella.
O Agar Rambach vem sendo utilizado para identificar Salmonella em
gêneros alimentícios e amostras clínicas, permitindo a diferenciação com membros
do gênero Proteus e outras bactérias entéricas. Além de um composto cromogênico
que indica a presença de β-galactosidase, própria dos coliformes, possibilita a
22
LRNCEB/LABENT
identificação de Salmonella por formar ácido a partir do propilenoglicol que, em
combinação com um indicador de pH, resulta em uma coloração vermelho carmin,
característica de suas colônias.
A presença de fragmentos de ß-galactosidase, característica dos coliformes é
evidenciada pelo desenvolvimento de colônias azul-esverdeadas ou violetaazuladas. Outras enterobactérias ou bactérias Gram-negativas, como por exemplo,
Proteus, Pseudomonas, Shigella, S. Typhi e S. Paratyphi A apresentam colônias
incolores.
CROMOCEN SC é um meio para a detecção, isolamento, diferenciação e/ou
contagem de Salmonella (exceto S. Typhi) e coliformes totais de outras bactérias
Gram-negativas. O meio se baseia na combinação de uma reação cromogênica para
detectar a atividade β-galactosidase e uma reação bioquímica de degradação de
fontes de carbono que produzem uma diminuição do pH, com a conseqüente
alteração de cor do indicador incluído na formulação. Salmonella (exceto S. Typhi)
apresenta colônias com centro vermelho e bordas mais claras; coliformes (exceto
Klebsiella e Citrobacter), colônias verde-azuladas e Klebsiella e Citrobacter, colônias
violeta. As colônias incolores ou com pigmentação própria, correspondem a outras
bactérias Gram-negativas.
CHROMagar Salmonella é um meio seletivo e diferencial para o isolamento e
identificação presuntiva de Salmonella spp. de outras bactérias coliformes e não
coliformes em amostras fecais e de alimento. Colônias de Salmonella incluindo S.
Typhi se caracterizam pela cor púrpura, outras espécies bacterianas são inibidas,
incolores ou azuis.
COLOREX Salmonella é um meio cromogênico para isolamento e
diferenciação de Salmonella spp., incluindo S. Typhi, diretamente de espécimes
clínicos e de alimento. Apresenta em sua composição uma mistura cromogênica
especial que permite diferenciar Salmonella de outras bactérias, com base na cor e
morfologia das colônias além de inibir bactérias Gram-positivas. Colônias de
Salmonella se apresentam na cor púrpura, E. coli e outros coliformes, azulesverdeadas enquanto os microrganismos incapazes de hidrolizar o composto
cromogênico são incolores.
23
LRNCEB/LABENT
A recuperação de múltiplos sorovares de Salmonella em um espécime requer
dois ou mais meios seletivos-indicadores, e a escolha de um deles, ou do esquema
a ser utilizado para o isolamento e identificação deste microrganismo, é, em grande
parte, uma questão de preferência pessoal. Portanto, na escolha do meio, deve-se
levar em consideração o espécime a ser analisado e os sorovares usualmente
detectados.
Salienta-se ainda que, a interação dos meios de enriquecimento e seletivos
com a temperatura e tempo de incubação, seria fundamental para melhor isolamento
desta bactéria.
A prevalência de Salmonella no ambiente natural e nos setores de alimentos
tem realçado a necessidade de procedimentos analíticos mais rápidos e
equivalentes em sensibilidade e especificidade, aos métodos culturais comuns, os
quais estão baseados em testes bioquímicos miniaturizados, novos meios de
cultura, métodos baseados em anticorpos e hibridização de DNA .
Apesar de vários destes métodos serem considerados rápidos, a maioria dos
sistemas de detecção de Salmonella, ainda recorre aos métodos culturais para
ressuscitar células injuriadas e ampliar a população de Salmonella em caldo de
cultura. Desta forma, pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo ou procedimentos
pós-enriquecimento, ou alguma combinação destes, deve ser usada em conjunto
com métodos rápidos.
24
Enterobactérias
Bactérias
favorecidas
Aspecto
das
colônias
Não
fermentadoras
transparentes
Fermentadoras
Púrpura / verde
metálico
sais biliares
cristal violeta
eosina / azul de
metileno
Inibidores
Não
fermentadoras
Incolores/
discretamente
amarelas
Fermentadoras
Vermelhas
Enterobactérias
fermentação da
lactose
Detectado
Indicadores
fermentação da
lactose
sacarose
lactose
azul de
bromotimol
fucsina ácida
citrato férrico
lactose
proteose peptona
extrato de
levedura
AGAR
HEKTOEN
Salmonella
Shigella
sais biliares
Salmonella
Shigella
xilose, lactose
sacarose, produção
de H2S,
descarboxilação
da lisina
desoxicolato
de sódio
vermelho de fenol
citrato férrico
xilose, lactose
sacarose
extrato de levedura
AGAR XLD
Salmonella
verde brilhante
fermentação
lactose
sacarose
vermelho de
fenol
proteose
peptona
extrato de
levedura
lactose
sacarose
AGAR VERDE
BRILHANTE
Fermentadoras:
Fermentadoras Fermentadoras
Fermentadoras
Amarelas
Núcleo rosado,
Salmão
Não fermentadoras;
periferia clara
Não
Amarelo
fermentadoras
esverdeadas
Não
Cor do meio
Descarboxilação da
fermentadoras
Verdes a
Lisina
incolores
azuladas
Não
Produção de Produção de H2S vermelho-púrpura ao fermentadoras
H2S
Ponto negro no
redor das colônias
Produção de H2S
centro
Ponto negro no
Vermelhas
centro
Ponto negro no centro
Salmonella
Shigella
sais biliares
citrato de sódio
fermentação
fermentação
lactose, sacarose,
lactose
salicina
produção deH2S
H2S
vermelho neutro
citrato férrico
lactose
proteose
peptona
peptona
proteose peptona
vermelho neutro
lactose
sacarose
proteose peptona
AGAR SS
MAC CONKEY
eosina,
azul de metileno
Carboidratos
Fontes
de aminoácido
AGAR EMB
Tabela 5. Características dos Meios Seletivos - Indicadores
25
S.Typhi - Colônias
negras circundadas
por halo de brilho
metálico.
Outros sorovares:
Colônias negras
ou verdes
Salmonella
particularmente
S. Typhi
verde brilhante
sulfito de bismuto
produção de H2S
redução do bismuto
sulfito de bismuto
sulfato de ferro
glicose
proteose peptona
extrato de levedura
AGAR SULFITO DE
BISMUTO
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8.4. Identificação Bioquímica Presuntiva (Meios de Triagem)
Uma vez selecionadas colônias sugestivas nos meios indicadores seletivos,
estas serão transferidas para meios de triagem, tais como Agar Ferro-Açúcar Triplo
(Agar TSI), Agar Ferro - Dois Açucares (Kligler – KIA), Agar Lisina Ferro (LIA), Meio
de Costa & Vernin (CV), Meio IAL (modificação do meio de Rugai e Araújo), Agar
Motilidade-Indol-Lisina (MILi), Agar Motilidade-Indol-Ornitina (MIO) e Meio EPM,
isolados ou em associação, os quais proporcionam uma caracterização bioquímica
presuntiva, indicando quais testes bioquímicos complementares são necessários
para identificar os microrganismos.
A associação do LIA, EPM, MIO ou Mili, com qualquer um dos demais meios
de triagem indica a probabilidade de Salmonella que, após complementação
bioquímica será submetida à caracterização antigênica.
Agar Ferro - Açúcar Triplo (Agar TSI)
Este meio é utilizado para diferenciar bacilos Gram negativos com base na
fermentação de carboidratos (glicose - lactose - sacarose), produção de sulfeto de
hidrogênio e gás. Propicia a verificação da fermentação da glicose pela bactéria,
conferindo coloração amarela na base. Caso haja fermentação da lactose e/ou
sacarose a colocação da parte superior do tubo será o amarelo. Quando estes dois
24
açúcares não são fermentados o ápice permanece com a cor original (âmbar). A
produção de H2S é indicada pela cor negra na base do tubo e a produção de gás,
indicada pela formação de bolhas ou rachaduras no meio. Microrganismos como
Proteus, Edwardsiella, Citrobacter e Salmonella podem apresentar o mesmo
aspecto.
Agar Ferro - Dois Açúcares (Kligler Iron Agar - KIA)
Este meio apresenta as mesmas indicações, leitura e interpretação do Agar
TSI, porém com diferença na sua formulação por não conter sacarose.
26
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Agar Lisina-Ferro (LIA)
É um outro meio para identificação presuntiva de enterobactérias. A
descarboxilação da lisina é evidenciada pela coloração púrpura (alcalina) da base
que neutraliza o ácido (amarelo) formado pela fermentação da glicose. A
desaminação da lisina é vista no ápice (vermelho) e a produção de H2S (negro) na
base do tubo.
Meio de Costa e Vernin (CV)
Este meio é uma modificação do meio de Monteverde (Mem. Inst. Oswaldo
Cruz, 53:105,1955) e é composto de uma camada semi-sólida e outra sólida,
permitindo avaliar as seguintes reações: indol (tampão de algodão), fermentação da
lactose e sacarose, produção de gás, hidrólise da uréia, produção de H2S o qual se
forma na interface entre semi-sólido e sólido e motilidade. Permite identificação dos
principais gêneros de enterobactérias indicando a presença de bactérias não
fermentadoras.
O ataque à lactose ou sacarose, ou ambas, com a produção de ácido, torna o
meio vermelho. A presença de um anel negro na base da camada sólida indica
produção de H2S; a turvação difusa ou não da parte semi-sólida, revela a motilidade;
a coloração azul, distribuída por todo o meio, identifica as bactérias produtoras de
urease. Além desses testes, o aparecimento de uma coloração rósea ou vermelha
na tira de papel de filtro ou no algodão, caracteriza as bactérias produtoras de indol.
Meio IAL (INSTITUTO ADOLFO LUTZ)
Elaborado para triagem de enterobactérias; consiste de 9 provas em apenas
um tubo de ensaio: indol (tampa), fermentação da sacarose e glicose, produção de
gás, fenilalanina desaminase, hidrólise da uréia, produção de H2S, descarboxilação
da lisina e motilidade.
Este meio identifica os principais gêneros de enterobactérias, indicando
também a presença de bactérias não fermentadoras e Vibrio.
27
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Meio MIO (Motilidade- Indol – Ornitina)
Meio MILi (Motilidade – Indol- Lisina)
Estes meios evidenciam a descarboxilação dos aminoácidos ornitina ou lisina,
a motilidade e a produção de indol. A motilidade é interpretada pela difusão do
microorganismo na zona da inoculação; a descarboxilação da ornitina ou lisina é
evidenciada pela coloração púrpura (alcalina) da base, que neutraliza o ácido
(amarelo), formado pela fermentação da glicose. A produção de indol é observada
pela formação de um anel vermelho após acrescentar 2-4 gotas do reativo de
Kovac’s à superfície do meio.
Meio EPM
O meio EPM é uma modificação do meio de Rugai e Araújo, evidenciando a
produção de gás por fermentação da glicose, produção de H2S, hidrólise da uréia e
desaminação do triptofano.
Tabela 6. Características diferenciais entre Kligler Iron Agar, Triple Sugar Iron
Agar e Lysine Iron Agar
Kligler Iron Agar
Triple Sugar Iron
Agar
Lysine Iron Agar
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Fontes de
aminoácidos
(desaminação)
peptona,
extrato de carne
extrato de levedura
peptona,
extrato de carne
extrato de levedura
peptona
extrato de levedura
lisina
não
não
lisina
Fermentação de
carboidratos
lactose (1%),
glicose (0.1%)
lactose (1%),
sacarose (1%)
glicose (0.1%)
glicose (0.1%)
Indicador de pH
vermelho de fenol
ácido = amarelo
alcalino = vermelho
vermelho de fenol
ácido = amarelo
alcalino = vermelho
bromocresol
purpura:
acido = amarelo
alcalino = púrpura
tiossulfato de sódio
sulfato ferroso
sulfato ferroso
citrato de ferro
amoniacal
aminoácidos
(descarboxilação)
Fonte para
produção
de H2S
Indicador da
produção
de H2S
Tabela 7. Características diferenciais de TSI , KIA, MIO, MILi e LIA
Fontes de
aminoácidos
(desaminação)
aminoácidos
(descarboxilação)
Fermentação de
carboidratos
Indicador
de pH
Fonte para produção
de H2S
Indicador de
produção
de H2S
TSI e KIA
MIO/MILi
LIA
peptona,
extrato de carne
extrato de levedura
peptona
extrato de levedura
ornitina ou lisina
peptona
extrato de levedura
lisina
não
ornitina ou lisina
lisina
lac+sac+glic = TSI
lac+ glic = KIA
glicose (0,1%)
glicose (0.1%)
vermelho de fenol
ácido = amarelo
alcalino = vermelho
bromocresol
purpura:
acido = amarelo
alcalino = púrpura
bromocresol
purpura:
acido = amarelo
alcalino = púrpura
não
sulfato ferroso
não
citrato de ferro
amoniacal
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Tabela 8. Reações nos meios de triagem TSI e KIA*
LEITURA
INTERPRETAÇÃO
DIAGNÓSTICO
PRESUNTIVO
Escherichia,Klebsiella
Enterobacter
Providencia,Serratia
Reação ácida (amarelo) e
gás na profundidade.
Reação ácida na
superfície.
Ausência de H2 S.
fermentação da glicose
fermentação da lactose e/ou
sacarose, inclusive com produção
de gás
Reação ácida e gás na
profundidade.
Superfície alcalina
(vermelha).
Presença de H2S
Reação ácida sem gás na
profundidade,
superfície alcalina.
ausência de H2S.
fermentação da glicose sem
ataque à lactose e/ou sacarose
Salmonella,
Edwardsiella
Citrobacter,Proteus
glicose fermentada apenas
formando ácido;
nenhuma ação sobre a lactose e
sacarose
Shigella, Salmonella
Proteus
Providencia,Serratia,
Yersinia
Meio inteiramente ácido
com gás.
Presença de H2S.
Meio inteiramente ácido,
sem gás.
Ausência de H2S
fermentação da glicose com gás;
fermentação da glicose e/ou
sacarose
fermentação da glicose com
formação de ácido; fermentação da
lactose e/ou sacarose
Citrobacter,Proteus
Escherichia coli,
Serratia
* Para a interpretação do Agar Kligler (KIA) não considerar a fermentação sobre a sacarose
Tabela 9. Reações no Agar Lisina-Ferro (LIA)
Microrganismos
Base
Ápice
Púrpura
Púrpura
Salmonella
Amarelo
Púrpura avermelhado
Proteus,Morganella
Amarelo
Púrpura avermelhado
Providencia
Amarelo
Púrpura
Citrobacter
Amarelo/ Púrpura
Púrpura
Escherichia
Amarelo
Púrpura
Shigella
Púrpura
Púrpura
Klebsiella
Exceção: S.Paratyphi A = base amarela/ ápice púrpura
H2S
+
+/+
-
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LRNCEB/LABENT
Tabela 10. Reações observadas no meio de Costa e Vernin (CV)
Leitura
Microrganismos
Meio inalterado, com certa alcalinidade no ápice (esverdeado
ou azulado). Presença de H2S; ausência de gás; móvel ou
imóvel
Reações idênticas às acima citadas, sem H2S
Meio inalterado no prazo de 24h, podendo se acidificar em
períodos mais longos (fermentação lenta); ausência de H2S;
móvel ou imóvel
Meio inteiramente azul, com produção ou não de H2S;
dificuldade na leitura da mobilidade.
Camada sólida azul e amarelo-azulado na porção semi-sólida
(ataque à sacarose). Presença de H2S.
Meio totalmente vermelho, por vezes podendo apresentar
áreas amareladas (redução); grande produção de gás.
Ausência de H2S. Mobilidade presente ou não. Ápice do meio
sólido com discreta alcalinidade na Tribo Klebsielleae.
Meio com discreta acidez na profundidade, ligeira alcalinização
na superfície. Presença de H2S, Móvel
Meio inalterado com 24 h; pequena alcalinização na superfície,
acentuando-se após 48 h. Forte tonalidade azul-esverdeada
na superfície. Ausência ou discreto crescimento no meio semisólido.
Salmonella,
Edwardsiella
Citrobacter
Certos sorovares de
Salmonella H2S
Shigella
Providencia
Proteus
Proteus vulgaris
Escherichia
Enterobacter
Klebsiella
Serratia (meio sem gás)
Citrobacter
Pseudomonas
Tabela 11. Interpretação do meio EPM
Base
Superfície
Produção de gás
Formação de bolhas ou rachaduras no meio
Produção de H2S
Presença de pigmento negro de qualquer
intensidade
Hidrólise da uréia
Coloração azul-esverdeada (fraca) na base indica
prova positiva
Desaminação do
triptofano
Reação positiva: verde escuro ou acastanhado
Reação negativa: superfície inalterada
31
LRNCEB/LABENT
8.5. Caracterização Bioquímica Complementar
Embora
seja
possível
uma
identificação
preliminar
com
base
nas
características das colônias e reações bioquímicas, nos diferentes meios indicadores
seletivos e de triagem, a identificação de membros da família Enterobacteriaceae
requer a utilização de provas bioquímicas complementares, Como provas
preliminares destacam-se a detecção da produção de citocromo-oxidase e a
redução do nitrato para a inclusão nesta família. Além destas, dispõe-se de uma
variedade de provas diferenciais complementares, destacando-se entre outras,
aquelas amplamente utilizadas em laboratórios clínicos, as quais permitem avaliar
as características metabólicas, contribuindo para a identificação posterior dos
gêneros/espécies.
Estas características são: fermentação de carboidratos, produção de indol,
reação de vermelho de metila, produção de acetil-metil-carbinol, utilização de citrato,
produção de urease, descarboxilação de aminoácidos, produção de sulfeto de
hidrogênio e motilidade.
Citocromo-Oxidase
Os citocromos são hemoproteínas que contém ferro e funcionam como a
última ligação da cadeia respiratória aeróbica, transferindo eletrons (hidrogênio) ao
oxigênio com a formação de água. O sistema citocromo é encontrado nos
organismos aeróbios ou microaeróbios e anaeróbios facultativos. Portanto, o teste
da oxidase é importante na identificação de microrganismos que não possuem a
enzima ou são anaeróbios obrigatórios. O teste é muito útil em estudos preliminares
para
diferenciação
shigelloides)
de
de
outras
Enterobacteriaceae
enterobactérias
(negativas,
como,
por
exceto
Plesiomonas
exemplo,
Aeromonas,
Pseudomonas e Vibrio (positivas).
A prova de citocromo-oxidase utiliza certos reativos corantes, como o
dicloridrato de p-fenilenodiamina ou oxalato de p-amino-dimetil-anilina, que atuam
como aceptores artificiais de eletrons, substituindo o oxigênio. Estes são incolores
no estado reduzido, mas na presença de citocromo-oxidase e oxigênio atmosférico
se oxidam formando um produto de tonalidade azul ou rosa, respectivamente.
32
LRNCEB/LABENT
Redução de Nitratos
A capacidade de um microrganismo reduzir nitrato a nitrito é uma
característica importante utilizada na identificação e diferenciação de espécies de
muitos grupos de microrganismos. Todas as enterobactérias, exceto certos biotipos
de Panthoea agglomerans e Erwinia, reduzem nitratos. Os microrganismos que
reduzem nitratos têm a capacidade de retirar oxigênio destes para formar nitritos e
outros produtos de redução.
A presença de nitritos no meio teste é evidenciada pela cor vermelha após
adição de dois reagentes: solução A (ácido sulfanílico - 0,8g, ácido acético – 30 mL,
água destilada – 75 mL) e solução B (alfa-naftilamina – 0,5g, ácido acético – 30 mL,
água destilada - 75mL).
Pesquisa da produção de indol
Indol é um dos produtos metabólicos de degradação do aminoácido triptofano.
As bactérias que possuem a enzima triptofanase são capazes de
hidrolisar e desaminar o triptofano com produção de indol, ácido pirúvico e amônia.
A prova está baseada na formação de um complexo de cor vermelha quando o indol
reage com o grupo aldeído do p-dimetilaminobenzaldeído (reativos de Kovacs ou
Ehrlich). Deve-se usar um meio rico em triptofano.
Prova do Vermelho de Metila
Esta prova é uma análise quantitativa de produção de ácidos fortes (lático,
acético, fórmico) a partir da glicose através da via da fermentação ácida mista. Visto
que muitas espécies de enterobactérias podem produzir quantidades suficientes de
ácidos fortes detectáveis pelo indicador vermelho de metila durante as fases iniciais
da incubação, somente os organismos que podem manter este pH baixo após
incubação prolongada (48 a 72 h) superando o sistema estabilizador de pH do meio,
é que podem ser chamados de vermelho de metila positivos.
33
LRNCEB/LABENT
Prova de Voges-Proskauer
O ácido pirúvico, composto principal formado pela degradação fermentativa
da glicose, é metabolizado através de várias vias, de acordo com os sistemas
enzimáticos que possuem as diferentes bactérias. Uma destas vias leva à produção
de acetoína (acetil-metil-carbinol), um subproduto inativo. Os organismos tais como
membros do grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia produzem acetoína como
principal subproduto do metabolismo da glicose e formam quantidades menores de
ácidos mistos. Na presença de oxigênio atmosférico e de hidróxido de potássio a
40%, a acetoína é convertida em diacetila e o alfa-naftol atua como catalizador para
revelar um complexo de cor vermelha.
Reações no VM e VP
Glicose
Ácido pirúvico
Acetilmetilcarbinol
(Acetoína)
Fermentação ácida mista
pH < 4,4
VM +
Butilenoglicol Diacetila
KOH + Ar
Alfa-naftol
Complexo vermelho = VP +
Utilização do Citrato
O citrato de sódio é um sal de ácido cítrico, um composto orgânico simples
que constitui um dos metabólitos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (Ciclo de Krebs).
Algumas bactérias podem obter energia por via diferente da fermentação de
carboidratos, utilizando citrato como única fonte de carbono. A avaliação desta
característica é importante na identificação de muitos membros da família
Enterobacteriaceae. Qualquer meio utilizado para detectar utilização de citrato
34
LRNCEB/LABENT
pelas bactérias deve ser isento de proteínas e carboidratos como fontes de carbono.
O meio contém citrato de sódio, um ânion, como única fonte de carbono e
fosfato de amônia como única fonte de nitrogênio. As bactérias capazes de utilizar o
citrato também são capazes de extrair nitrogênio do sal de amônio, levando à
alcalinização do meio a partir da conversão do NH3 em hidróxido de amônia
(NH4OH). Como indicador é utilizado o azul de bromotimol, que na presença de
reação positiva ocorre a viragem para um pH acima de 7,6, sendo evidenciado pela
tonalidade azul do meio.
Hidrólise da Uréia
A urease é uma enzima presente em muitas espécies de microrganismos que
podem hidrolisar a uréia. A uréia é uma diamina do ácido carbônico; todas as
aminas são facilmente hidrolisadas com liberação de amônia e dióxido de carbono.
A amônia reage em soluçâo para formar carbonato de amônio resultando na
alcalinização e aumento do pH do meio.
São utilizados dois meios para a detecção de urease, o Caldo Uréia de
Stuart e o Agar Uréia de Christensen. O caldo de Stuart é fortemente tamponado
com sais de fosfato a um pH 6,8. O organismo em estudo deve produzir
quantidades relativamente grandes de amônia para superar o sistema e elevar
suficientemente o pH do meio para produzir uma viragem do indicador (acima de
8,0), sendo seletivo para espécies de Proteus. O Agar Uréia de Christensen
possui um sistema tampão muito mais fraco, permitindo detectar produções
menores de amônia sendo, portanto apropriado para a análise de bactérias que
apresentam formação escassa de urease ativa.
Produção de sulfeto de hidrogênio
Capacidade de certas espécies de bactérias para liberar enxofre na forma de
H2S a partir de aminoácidos ou de outros compostos. A produção de H2S pode ser
detectada em um sistema analítico se as seguintes condições estiverem presentes:
liberação de sulfeto a partir da cisteína ou do tiossulfato por ação enzimática
bacteriana; acoplamento do sulfeto com o íon hidrogênio para formar
35
LRNCEB/LABENT
H2S; detecção do H2S pelos sais de metais pesados tais como ferro, bismuto ou
chumbo, na forma de sulfeto de metal pesado, um precipitado negro.
H2S + metal pesado = sulfeto = precipitado negro
Descarboxilases
As descarboxilases representam um grupo de enzimas substrato-específicas,
capazes de atuar sobre a porção carboxíla dos aminoácidos, formando aminas de
reação alcalina. Lisina, Arginina e Ornitina são os três aminoácidos habitualmente
avaliados na identificação das enterobactérias e produzem as seguintes aminas
específicas:
Lisina
cadaverina
Ornitina
putrescina
Arginina
citrulina
Na conversão de arginina para citrulina intervém uma desidrolase ao invés de
uma descarboxilase, visto que na primeira etapa, o NH2 é retirado da arginina. Em
seqüência, a citrulina é transformada em ornitina que em seguida sofre
descarboxilação para formar putrescina.
Durante os períodos iniciais da incubação o meio torna-se amarelo devido à
fermentação da pequena quantidade de glicose presente. Se o aminoácido for
descarboxilado, formam-se aminas alcalinas e o meio volta à cor púrpura original.
Fenilalanina desaminase
A fenilalanina é um aminoácido que por desaminação forma um cetoácido, o
ácido fenilpirúvico. Entre os membros da família Enterobacteriaceae, somente
espécies dos gêneros Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima
desaminase, necessária para esta conversão.
A prova da fenilalanina baseia-se na detecção de ácido fenilpirúvico no meio,
após o crescimento do organismo teste. A prova é positiva quando aparece uma cor
verde, visível após a adição de uma solução de cloreto férrico a 10%.
Fenilalanina
desaminação__
ácido fenil pirúvico
Cloreto férrico 10%
36
LRNCEB/LABENT
Fermentação de carboidratos
Fermentação é um processo metabólico de oxidação - redução que tem lugar
em um ambiente anaeróbico, no qual um substrato orgânico serve como aceptor de
hidrogênio (elétron) em lugar do oxigênio. Nos sistemas de provas bacteriológicas
este processo é detectado por observação da mudança de cor dos indicadores de
pH quando os produtos ácidos são formados. A fermentação dos carboidratos
produz ácido, ou ácido e gás. A produção de gás (dióxido de carbono e hidrogênio)
se detecta pelo acúmulo de gás em um tubo de vidro (tubo de Duhram) invertido no
meio.
37
LRNCEB/LABENT
Tabela 12. Comportamento de Salmonella spp. nas diferentes provas
bioquímicas
Meios
TSI/KIA
LIA
Reações
Reação ácida e gás na profundidade. Superfície alcalina (vermelha).
Presença de H2S
Reação ácida sem gás na profundidade, superfície alcalina. Discreta produção
ou ausência de H2S.
Base e ápice cor púrpura, presença de H2S
(Exceção: S.Paratyphi A = base amarela/ ápice púrpura)
CV
Meio inalterado, com certa alcalinidade no ápice (esverdeado ou azulado).
Presença de H2S na interfase sólida/semi-sólida; ausência de gás;
móvel ou imóvel
REAÇÃO NEGATIVA – não há viragem do pH
URÉIA
Lisina
Descarboxilase
Positivo:Reação alcalina (cor púrpura do meio) e amarelo no meio controle.
(exceção S. Paratyphi)
LDC
Ornitina
Descarboxilase
Positivo: Reação alcalina (cor púrpura do meio) e amarelo no meio controle
(exceção S. Gallinarum – ODC negativo)
ODC
Coloração vermelha do meio após adição do reagente
Vermelho de
Metila (VM)
Meio sem alteração após adição dos reagentes
VogesProskauer (VP)
Fenilalanina
desaminase
(FD)
Meio inalterado após colocação do reagente
Positivo: Reação alcalina – cor azul do meio
Utilização do
Citrato
Meio SIM
Indol
H2S
Motilidade
Negativo – anel amarelo após colocação do reagente – Kovacs
Presença de pigmento negro de qualquer intensidade ou somente na picada
(cepas imóveis)
Crescimento ao longo da picada (imóvel) ou turvação do meio (móvel)
Fermentação de açucares
Glicose
Lactose
Manitol
Sacarose
Positivo (reação ácida) com/sem gás no tubo de Durhan
Negativo
Positivo
Negativo
38
LRNCEB/LABENT
Tabela 13. Percentuais de positividade/negatividade nas provas bioquímicas
para Salmonella spp.
Reação
Positiva ou negativa
+
Percentual de isolamento
de Salmonella que
apresentam esta reação2
100
TSI glicose (gás)
+
91,93
TSI lactose
-
99,24
TSI sacarose
-
99,5
TSI H2S
+
91,6
LIA
+
98
SIM (H2S)
+
97
SIM (indol)
-
98,9
SIM (motilidade)
+
97
Hidrólise da uréia
-
99
Lisina descarboxilase
+
94,65
Ornitina descarboxilase
+
97
Reação de Voges-Proskauer
-
100
Reação do Indol
-
98,9
Provas1
TSI glicose (ácido)
1.
Ewing, W.H. & Ball, M.M. The biochemical reactions of members of the genus
Salmonella.NationalCommunicable Disease Center. Atlanta, Georgia,USA.1966.
2.
Estes percentuais indicam que nem todas as cepas apresentam as reações marcadas como + ou
_.
3.
Salmonella Typhi é anaerogênica
4.
Salmonella enterica susp.arizonae dá reações + ou – para lactose, porém é sempre β-galactosidase
positiva; Salmonella enterica susp.salamae dá reação – para lactose e – para β-galactosidase.
39
LRNCEB/LABENT
Tabela 14. Caracterísiticas bioquímicas diferenciais de Salmonella spp. ,
Edwardsiella
tarda
Proteus
mirabilis
Proteus
vulgarsis
Salmonella
spp.
Salmonella
Typhi
+/-
+
+
+
+
+/-
+
-
+
+/+/-/+
+/+
-
+
+/-/+
-/+
+
+
-
+
-/+
-/+
+
+
-
+
-
-/+
+
+/-
+
+
-
+
+
+
-
+
+
-
-/+
+/-
+
+
+
+
+
-
+/-
+
-/+
+
-
-/+
-/+
+/+/-/+
+/+
+
+/-
+/-/+
+
+/-
+
+
-
-/+
+
+
+
-/+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
+
-
-
+
+
+/-
+/-
+/-
-
-
-
+/-
-
-
+
+
+
+
-
+
-
+/-
-
+
-
+
+
-
-
Cirobacter
diversus
Citrobacter
freundii
Glicose (gás)
Fermentação
Manitol
Lactose
Sacarose
Dulcitol
ONPG
Vermelho Metila
Voges
Proskauer
Indol
Citrato
Simmons
Acetato
Malonato
H2S
Mobilidade
Hidrólise da
uréia
Fenilalanina
desaminase
Lisina
descarboxilase
Arginina
dehidrolase
Ornitina
descarboxilase
KCN
Citrobacter
amalonaticus
Proteus spp., Citrobacter spp. e Edwardsiella tarda.
+ : positivo; - : negativo
40
LRNCEB/LABENT
Tabela 15. Diferenciação bioquímica entre S. enterica subsp. enterica,
Citrobacter sp. e Edwardsiella tarda
S. enterica
sub. enterica
Citrobacter
freundii
Citrobacter
diversus
Edwardsiell
a tarda
Descarboxilação:
Lisina
+
-
-
+
Ornitina
+
[-]
+
[+]
Indol
-
-
+
+
Citrato Simmons
+
+
+
-
H2S
+/
[+]
-
+
Urease
-
+/-
+/-
-
KCN
-
+
+
-
ONPG
-
+
-
-
+ : positivo; - : negativo; [+] : 76 a 89% positivo; [-] : 11 a 25% negativo.
Tabela 16. Diferenciação entre Citrobacter freundii e Salmonella arizonae e
S.diarizonae
LDC
Glicerol
Malonato
ODC
Gelatinase
Citrobacter freundii
-
+
-
-
-
Salmonella arizonae
+
-
+
+
+ (lenta)
Salmonella diarizonae
+
-
+
+
+ (lenta)
LDC: lisina descarboxilase; ODC: ornitina descarboxilase
Tabela 17. Diferenciação entre Salmonella Paratyphi C e Salmonella
Choleraesuis
Dulcitol
+
H2S
+
Mucato
-
S.Choleraesuis
-
-
-
S.Choleraesuis var. Kunzendorf
-
+
-
+
-
S. Paratyphi C (Vi ou Vi )
S. Paratyphi C é essencialmente adaptada ao homem
S.Choleraesuis possui característica ubiquitária
41
LRNCEB/LABENT
9. Aspectos Gerais sobre os Antígenos das Enterobactérias
Antígenos comuns: Todas as espécies da família Enterobacteriaceae apresentam
um antígeno comum, também designado de antígeno de “Kunin”. Sua presença
usualmente não é avaliada tendo em vista que não representa um critério relevante
para a diferenciação entre gêneros ou espécies.
Antígeno de parede ou antígeno “O” (Ohne): composição lipopolissacaridica
(hexosamina (3.5 a 4.5%), complexo fosfolipídico (20 a 30%), polissacarídeos (60%).
É termoestável (1hora a 100oC), não sendo destruído pelo álcool etílico a 50oGL. A
aglutinação das células bacterianas pelo antissoro específico, apresenta como
características ser lenta, formar grânulos finos não dissociáveis pela agitação, tendo
em vista que a reação ocorre pela interrelação entre a parede celular das células
bacterianas.
Este antígeno é composto de três partes:
•
Porção lipídica, a qual é responsável pela toxicidade e características
pirogênicas;
•
Porção basal ou “core”;
•
Polissacarídeo, característico da especificidade somática das formas lisas (S).
É constituído de cadeias repetitivas, cujo arranjo espacial confere natureza
definida. Esta, aliada ao tipo de ligação, determinam a especificidade dos
antígenos “O “.
Cepas em fase lisa (“S”-Smooth) apresentam colônias com superfícies
homogêneas, brilhantes, bordos regulares indicativos de antígeno “O” completo. A
ocorrência de mutação que afete sua porção basal, ou na síntese de sua cadeia
resulta na perda da especificidade do antígeno. São designadas rugosas “R”
(Rough) de superfície e bordos irregulares. São autoaglutináveis em solução salina,
facilmente fagocitáveis e sensíveis a ação do complemento e como conseqüência,
perdem sua capacidade patogênica.
42
LRNCEB/LABENT
Antígeno flagelar ou antígeno “H” (Hauch): Estão presentes nas enterobactérias
móveis, sua composição é protéica, designada flagelina. As diferenças antigênicas
surgem devido a variações na estrutura primária (contendo aminoácidos) das
diferentes moléculas de flagelina.
A estrutura flagelar possui como uma característica importante de
termolabilidade podendo ser destruídos a 100oC, bem como após ação lenta do
álcool 50oGL, sendo resistentes à solução de formol a 0,5%.
Anticorpos flagelares se fixam aos flagelos, cuja aglutinação apresenta como
característica, a formação de grumos espessos que se dissociam rapidamente
através de agitação. Esta ocorre em tempo mais rápido do que aglutinação
somática, devido ao número existente na célula se apresentar mais elevado, quando
comparado à aglutinação somática (entre as células bacterianas).
O arranjo espacial e características intrínsecas ao gênero possibilitam a
produção de dois tipos de flagelos distintos. Em uma população bacteriana de uma
cepa de Salmonella spp, que produza dois tipos distintos de flagelo, a freqüência de
variação de células que apresentam um dos tipos ou fases é na ordem de 104.
Antígeno de superfície ou envoltório “Vi” (Félix & Pitt): apresenta sua
localização espacial externa, a qual impede a detecção do antígeno somático.
Usualmente encontra-se presente em cepas de S.Typhi isoladas de pacientes,
podendo também ser detectados em S.Paratyphi C e S. Dublin. São termolábeis
podendo ser destruídos através do aquecimento da suspensão a 100oC por 10-15
minutos. Apresenta como relevância, a possibilidade de uso como ferramenta
epidemiológica através de um conjunto de preparados fágicos.
43
LRNCEB/LABENT
Caracterização Antigênica de Salmonella:
A
sorotipificação
complementar
na
constitui
identificação
uma
de
importante
ferramenta
epidemiológica
Salmonella
permitindo
determinar
a
prevalência/emergência ou apontar tendências de um sorovar em distintas zonas
geográficas, bem como identificar surtos, conhecer as fontes de infecção e vias de
transmissão.
A identificação dos sorovares é definida pelo esquema de Kauffmann & White,
(Poppof & LeMinor, 2001) e envolve a identificação dos antígenos somáticos e
flagelares.
Esquema de Kauffmann-White
Baseado nos componentes antigênicos somáticos O e flagelares H foi
estabelecido o esquema denominado Kauffmann-White, este contém informações
quanto as espécies, sub-espécies e apresenta listadas as fórmulas antigênicas de
todos os sorovares. Sua editoração é efetuada pelo Centro Colaborador para
referência e pesquisa em Salmonella da Organização Mundial de Saúde (Instituto
Pasteur-Paris), sendo revisado anualmente quanto à caracterização de novos
soravares e a editoração completa desta listagem é efetivada a cada cinco anos.
Apresenta-se representado sob a forma de tabela, contendo o conjunto das
características antigênicas, compreende na 1a coluna a estrutura somática, cujos
sorovares que apresentam tais características são identificados por letras
maiúsculas. Ex. grupo A(O:2), grupo B(O:4); grupo C1(O:6,7), grupo C2 (O:6,8,20),
grupo D (O:9), grupo E1 (O:3,10), grupo E2 (O:3,15), grupo E4 (O:1,3,19),etc.
A 2a e 3a colunas apresentam suas estruturas flagelares, indicadas por letras
minúsculas (fase 1) e a fase 2, representada por números arábicos, além de letras
minúsculas..
Exemplos: S.Typhimurium: 1,4,[5],12: i : 1,2
S.Enteritidis:
1,9,12: g,m: -
S.Typhi:
1,9,12,[Vi]: d: -
S. Agona:
1,4,12:f,g,s:-
S. Paratyphi:
1, 2,12:a:-
S.Saintpaul:
1, 4, 5, 12:e,h:1,2
44
LRNCEB/LABENT
Em relação aos antígenos O e H, alguns aspectos que devem ser
considerados:
Antígeno O:
•
Fatores que identificam o grupo antigênico por exemplo, o fator O:4, o fator O:9.
•
Aqueles que tem pouco ou nenhum valor discriminatório estando associados a
outros fatores, por exemplo O:12, associado com O:2, O:4 e O:9 como ocorre
com S. Paratyphi A (O:1,2,12), S.Typhimurium (O:1,4,5,12) e S. Enteritidis
(O:1,9,12).
•
Aqueles que surgem como conseqüência de uma modificação da estrutura dos
antígenos, por exemplo: O:5 resultante de uma reação de acetilação presente
nas unidades repetidas do polissacarídeo responsável pela especificidade
O:4,12; O:1 resulta da inserção de uma cadeia de galactose no polissacarídeo
como é o caso do sorovar S. Typhimurium O:1,4,5,12.
Antígenos H
Alguns sorovares de Salmonella dispõem de apenas uma fase flagelar,
i.e. monofásicas como S. Enteritidis (9,12:g,m:-), S.Typhi (9,12 [VI]:d:-), porém a
grande maioria dos sorogrupos apresentam duas fases flagelares ou seja são cepas
difásicas como por exemplo S.Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) e S.Hadar (6,8:z10:e,n,x)
que expressam a fase 1 (antígenos i ou z10) e fase 2 (antígenos 1,2 e e,n,x
respectivamente), contudo também são reconhecidas cepas desprovidas de flagelos
(imóveis).
Identificação antigênica
Alguns
sorovares
apresentam
características
bioquímicas,
as
quais
associadas ao quadro clínico do paciente possibilitam orientar com maior facilidade
sua caracterização, entretanto faz-se obrigatória em todos os casos a caracterização
antigênica empregando os antissoros específicos.
45
LRNCEB/LABENT
Ex. Salmonella Typhi: ausência de gás em glicose, produção reduzida de H2S, lisina
descarboxilase positiva, ornitina descarboxilase e uso do citrato de Simmons como
fonte única de carbono, negativas.
Salmonella Paratyphi A: produção de gás em glicose, ornitina descarboxilase
positiva, produção de H2S, lisina descarboxilase e uso do citrato de Simmons como
fonte única de carbono negativas.
Principais cuidados:
•
Nunca utilizar crescimento a partir de meios de cultura que contenham
carboidratos;
•
Semear preferentemente a cepa em tubo 13x100 contendo Agar Nutriente
inclinado, envasado com bizel longo (4 a 5 cm);
•
Preparar uma suspensão utilizando solução salina (0.85% NaCl);
•
A suspensão deverá apresentar turbidez correspondente ao tubo 3 da escala
de MacFarland. Usualmente o volume de solução salina adicionada ao tubo
contendo Agar nutriente inclinado é aproximadamente 1,5mL.
•
Realizar o teste somente a partir de cultivos recentes (máximo de 18-24h de
crescimento a 37°C);
•
Para efetuar avaliação em amostras com antígeno de envoltório, efetuar a
retirada, através do aquecimento da suspensão em banho-maria (100°C por
15 minutos);
•
Observar se a suspensão apresenta-se homogênea antes de realizar o teste,
certificando-se que esteja em sua forma lisa.
Execução do teste de soroaglutinação rápida:
•
Semear a cepa isolada em agar nutriente inclinado;
•
Incubar a 37o C por 18-24 horas;
•
Preparar suspensão adicionando solução salina (0,85%);
•
Homogeneizar a suspensão;
46
LRNCEB/LABENT
•
Em uma lâmina de vidro adicionar uma gota (10µl) de antissoro polivalente e
uma gota da suspensão bacteriana, homogeneizando com o auxílio de uma
alça utilizada dentro dos procedimentos de rotina;
•
Impelir movimentos rotatórios e observar até o período de um minuto em
caixa de Huddleson a presença de aglutinação (grumos finos);
•
Em seqüência repetir o procedimento empregando antissoros somáticos
específicos (grumos finos - somáticos);
•
Para a caracterização dos antígenos flagelares (grumos espessos) é
necessário que o laboratório possua antissoros que permitam fazer a
diferenciação entre sorovares com estrutura comum. Ex. Hg,m; Hg,p; Hg,q;
Hg,m,s; Hf,g,s; Hg,z51; Hg,z62 , etc
•
Particularmente no diagnóstico de Salmonella Typhi, empregar inicialmente o
antissoro Vi para caracterização do antígeno de envoltório. Caso a reação
seja positiva, aquecer a suspensão em banho-maria (15 minutos a 100oC)
reavaliando com antissoro Vi. Caso não seja observada aglutinação,
confirmar a estrutura somática através do antissoro “OD”;
•
A identificação conclusiva de S.Typhi deverá ser efetivada através da
caracterização do antígeno flagelar Hd;
Variações que afetam a Tipagem Antigênica em Salmonella spp.:
Variação Capsular (V-W): fenotípica
•
Impede aglutinação somática;
•
Utilizada em avaliação epidemiológica (lisotipia em Salmonella Typhi);
•
Quando as cepas apresentarem aglutinação com antissoro Vi, a suspensão
bacteriana deve ser submetida ao aquecimento em banho-maria (100oC-15
minutos) e em seqüência reavaliadas para confirmar a eliminação desta
estrutura.
Variação da estrutura somática (S-R): genotípica
•
Apresenta como característica fundamental ser de natureza genotípica.
•
Determina alterações quanto à morfologia colonial.
47
LRNCEB/LABENT
•
Usualmente apresenta ausência de estabilidade em solução salina.
•
Sua ocorrência impede o diagnóstico antigênico tendo em vista que determina
reações inespecíficas ou cruzadas.
Variação flagelar (OH-O): fenotípica
•
Permitem a formação de grandes flocos que se dissolvem com agitação;
•
Importantes na caracterização conclusiva dos sorovares de Salmonella spp;
•
Apresentam natureza fenotípica. Quando da perda de uma de suas fases,
podem ser, na maioria das vezes, recuperados utilizando o meio de Craigie
(agar semi-sólido -0,5%):
Semear a cepa
Adicionar
antissoro de fase
conhecida
Repicar cepa e
caracterizar fase
desconhecida
Variações mediadas por fagos:
•
Presença de fagos temperados: grupos A, B, D de Salmonella spp.
•
Conversão lisogênica: fração 12 (Salmonella spp.)
10. Controle de Qualidade de Meios de Cultura, Reagentes e Equipamentos.
1.
Principais aspectos quanto à manutenção:
•
Somente devem ser recebidos meios de cultura, adquiridos através de
compra, cujo prazo de validade seja ≥ seis meses da data de recebimento;
•
Apertar todas as tampas dos frascos;
•
Observar prazo máximo de estocagem;
•
Registrar quantitativo em estoque, recepção e saída;
•
Nenhum meio de cultura pode ser utilizado após a data de vencimento: a
revalidação somente pode ser efetuada pelo fabricante.
48
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2. Estocagem dos meios de cultura
•
Proteger da luz solar e calor;
•
Manter em área com ventilação.
3. Preparo dos meios de cultura:
•
Seguir obrigatoriamente as instruções do fabricante;
•
Preparar a quantidade mínima, suficiente para o uso;
•
Observar o tempo de validade de meios preparados, estocados sob
condições adequadas.
Duração máxima de meios de cultura
Meio de cultura
4°C
4°C
Embalagem plástica
Agar sangue
Agar EMB
Agar MacConkey
15 dias
15 dias
15 dias
50 dias
60 dias
60 dias
Agar SS
Agar XLD
Agar Hektoen
Agar Verde Brilhante
6 dias
5 dias
5 dias
2 dias
10 dias
10 dias
10 dias
4 dias
Agar Sulfito Bismuto
24 horas
24 horas
Tubos com agar
Meio de Cultura
Bucha de algodão
Bucha de
4°C
algodão - TA
N° semanas
N° semanas
Fechamento
hermético-plástico4°C - N° meses
Agar LIA
1-2
1-2
3-6
Agar TSI
1-2
2-4
3-6
Agar KIA
3-4
2-4
2-4
Agar Müller Hinton
1-2
2-4
3-6
Agar Nutriente
3-4
1-2
2-4
Agar Uréia
3-4
1-2
2-4
Agar Citrato
3-4
1-2
2-4
Agar Fenilalanina
3-4
1-2
2-4
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LRNCEB/LABENT
Controle de Qualidade de Meios de Cultura
•
Controlar o pH de cada partida de meio;
•
Efetuar teste de esterilidade;
•
Realizar teste de desempenho: inocular uma alça do crescimento da cepa
padrão e incubar nas condições de rotina até obter turvação correspondente
ao tubo 0.5 da escala de MacFarland.
•
Anotar e registrar resultados em cada lote, como o exemplo abaixo.
Meio de cultura:______________________________________
Cepas para controle: positivo:__________________________
negativo:__________________________
Data
Data - Lote
Controle Fabricação
Data
Vencimento
pH
Desempenho Esterilidade Responsável
+/+/-
50
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11. ANEXOS
Meios de Cultura e Reagentes
Os meios de cultura, reagentes e soluções não discriminadas abaixo foram
preparados segundo as especificações ditadas pelos fabricantes.
10.1. Água Peptonada 1% Tamponada (pH 7,2)
Peptona ........................................................................... 10,0 g
Cloreto de sódio ................. ............................................ 5,0 g
Fosfato de sódio bibásico ................................................ 3,5 g
Fosfato de potássio monobásico ....................................
1,5g
Água destilada ............................................................ 1000 ml.
Suspender e dissolver os componentes em água destilada, esterilizar em autoclave
a 121°C por 15minutos.
pH final: 7,2 ± 0,2 a 2°C
10.2. Meio de Costa & Vernin (CV)
A - Base Semi-Sólido
Peptona............................................................................20,0 g
Cloreto de Sódio............................................................. 5g
Solução de Azul de Timol ............................................. 3 mL
Indicador de Andrade .................................................... 10 mL
Agar ............................................................................... 5g
Água destilada ............................................................... 1000 mL
Adicionar todos os elementos à água e aquecer até dissolver completamente o Agar.
Ajustar o pH a 7,3 ou 7,4. Distribuir quantidades exatas do meio em balões e
esterilizar a 121°C por 15 minutos.
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LRNCEB/LABENT
B - Base Sólida
Peptona (Bacto) .......................................................... 1g
Triptona ou tripticase ................................................... 5 g
Tiossulfato de Sódio .................................................... 0,2 g
Sulfato ferroso Amoniacal............................................ 0,2 g
Solução de Azul de Timol ........................................... 3 mL
Indicador de Andrade ................................................... 10 mL
Agar .............................................................................. 20 g
Água destilada .............................................................. 1000 mL
Adicionar os componentes em água destilada e aquecer em banho maria
fervente até completa dissolução. Ajustar o pH a 7,3 ou 7,4. Distribuir quantidades
exatas do meio em balões e esterilizar a 121°C por 15 minutos.
Preparo e distribuição final do meio
Fundir as bases e resfriar entre50 a 60°C, aproxima damente. Adicionar a
cada um deles, na proporção de 5mL por cada 100 mL de meio, a solução de uréia e
açúcares. Distribuir inicialmente o agar semi-sólido em volume de 2,5mL em tubos
esterilizados de 13mm de diâmetro com altura variável. Deixar solidificar à
temperatura ambiente cerca de 30 minutos, e acrescentar em seguida, volume
idêntico por tubo, da base sólida. Inclinar os tubos de modo a deixar uma base de 2
a 3cm de altura, aproximadamente.
Solução de Azul de Timol
Azul de Timol .............................................................. 1,6 g
NaOH 0,1N .................................................................. 34,4 mL
Água destilada .............................................................. 65,6 mL
Indicador de Andrade
Fucsina ácida ............................................................... 0,5 g
Hidróxido de Sódio N ................................................. 16 mL
Água destilada ............................................................ 100 mL
Dissolver a fucsina em água destilada e adicionar o hidróxido.
52
LRNCEB/LABENT
Solução de Uréia e Açúcares
Uréia ........................................................................... 20 g
Lactose ....................................................................... 30 g
Sacarose ...................................................................... 30 g
Água destilada ............................................................. 100 mL
Dissolver a mistura por aquecimento brando em banho maria e esterilizar por
filtração. Conservar em geladeira.
A semeadura é executada com auxílio de agulha, introduzindo-a até o terço
superior da metade da camada semi-sólida e sob a forma de estrias, na superfície
da parte sólida. Neste meio, poderá ser pesquisada a produção de indol, fixando no
tampão, após a inoculação, uma tira de papel de filtro, embebida no reativo para
pesquisa de indol ou então impregnando o próprio algodão (hidrófilo) na sua base
interna, com esse reativo. Incubar a 37°C durante 2 4 a 48 horas.
10.3. Meio para Fermentação de Carboidratos
Peptona ............................................................... 10 g
Extrato de Carne ................................................. 3 g
Cloreto de Sódio ................................................. 5 g
Indicador de Andrade ........................................... 10mL
Água destilada ...................................................... 1000mL
Ajustar pH a 7,1 – 7,2. Distribuir em volumes de3 a 5mL e esterilizara121°C
por 15 minutos.
Os carboidratos glicose, lactose, sacarose e manitol são incorporados ao
meio, na concentração final de 1,0%, os demais carboidratos são geralmente
utilizados a 0,5%.
A glicose, manitol, dulcitol, salicina, adonitol e inositol, podem ser incluídos ao
meio básico e esterilizados a 121°C por 15 minutos, pois resistem a este processo.
No entanto a lactose, sacarose, celobiose, arabinose, ramnose e xilose devem ser
esterilizados a parte, principalmente sob a forma de soluções a 10 ou
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LRNCEB/LABENT
20%, recorrendo-se para tanto, aos processos físicos, como a filtração ou o
aquecimento a 121°C por 10 minutos, seguido de resf riamento brusco.
A presença de ácido no meio, em decorrência do metabolismo da bactéria, é
revelada pela viragem do indicador de Andrade para uma coloração avermelhada.
12. Bibliografia
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LRNCEB/LABENT
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LRNCEB/LABENT
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Interpretação dos testes de confirmação no ensaio de Salmonella pelo método ISO 6579 (2007)
LRNCEB/LABENT
61
LRNCEB/LABENT
Esquema de análise de Salmonella pelo Método BAM/FDA (2006)
62
LRNCEB/LABENT
63
LRNCEB/LABENT
Identificação Bioquímica Presuntiva – LIA x TSI
BAM/FDA (2006)
Reação no LIA
Reação no TSI
Ações
Ápice e base alcalinos com/sem
H2S (típica)
Ápice alcalino, base ácida,
com/sem H2S (típica)
continuar
Ápice e base alcalinos com/sem
H2S (típica)
Ápice e base ácidos,
com/sem H2S (atípica)
continuar
Base ácida, ápice alcalino
Ápice alcalino, base ácida,
com/sem H2S (típica)
continuar
Base ácida, ápice alcalino
Base e ápice ácidos (atípica) descartar
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LRNCEB/LABENT
Método MLG/FSIS (2004)
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LRNCEB/LABENT
66
descartar
Continuar
**
Base ácida sem H 2S
ápice alcalino
ápice alcalino
Base ácida com/sem H 2S
ápice alcalino
Base alcalina ou ácida
sem H 2S, ápice alcalino
Base e ápice alcalinos
com H 2S
Base ácida, ápice
alcalino sem H 2 S
ápice alcalino
Base ácida com H 2S,
ápice alcalino
Base e ápice ácidos sem
H 2S
Base e ápice ácidos com
H 2S
-
+
-
+
•S. Typhisuis – eventualmente encontrada em suínos nos Estados Unidos
•** S. enterica subsp. arizonae ou diarizonae
Sem alteração de cor no meio
continuar
sem H 2S
-
67
descartar
descartar
Continuar
*
Continuar
continuar
continuar
Base ácida, ápice
alcalino sem H 2 S
+
+
com H 2S
+
Base ácida, ápice
alcalino com H 2 S
Ações
com H 2S
Poli
H
Base ácida/ápice
alcalino com H 2 S
Poli
O
LIA
TSI
Método MLG/FSIS (2004)
LRNCEB/LABENT

Manual Salmonella GSS 2008 doc.

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