Supporting Information

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Wiley-VCH 2012
69451 Weinheim, Germany
A Secondary Sialic Acid Binding Site on Influenza Virus
Neuraminidase: Fact or Fiction?**
Jimmy C. C. Lai, Jean-Michel Garcia, Jeffrey C. Dyason, Raphael Bçhm, Paul D. Madge,
Faith J. Rose, John M. Nicholls, J. S. Malik Peiris, Thomas Haselhorst,* and Mark von Itzstein*
anie_201108245_sm_miscellaneous_information.pdf
Supporting Information:
General – All chemicals except otherwise stated, were
purchased from Sigma-Aldrich with the highest purity available.
The known compounds a(2,3)-sialyllactose (2) and oseltamivir
carboxylate (3) were prepared in house. All NMR experiments
were performed on Bruker Avance 600 MHz spectrometer,
equipped with a 5-mm TXI probe with triple axis gradients.
Production and purification of influenza NA-containing VLPs
– Virus-like particles containing FLAG-tagged NA of influenza
A/Cambodia/JP52a/2005
(H5N1),
A/Gansu/Chenguan/1129/2007
(seasonal
H1N1)
or
A/California/04/2009 (swine origin pandemic H1N1) were
produced and analyzed as previously described (Lai et al. 2010).
Briefly, HEK-293T cells were transfected with pcDNA-NA(H5),
pcDNA-NA(H1) or pcDNA-NA(pdmH1). Culture medium were
collected and filtered, followed by ultracentrifugation with a 30%
sucrose-HEPES buffer (2 mM HEPES, 125 mM NaCl, 0.9 mM
CaCl2, 0.5 mM MgCl2, pH 7.4) cushion and the NA-VLP pellet
was resuspended in HEPES buffer and stored in -80 °C. NA
content in the VLP was quantified using western blotting with
Anti-FLAG monoclonal mouse antibody (Sigma). NA enzymatic
activity was checked with NA-Star chemoluminescent assay
(Applied Biosystems).
NMR-based influenza NA-VLP assay – NA-VLP were diluted
(~8 µM of NA in 250 µL of deuterated HEPES buffer) for each
experiment. Sample buffer was exchanged three times using
Amicon filters (100 kDa cutoff, Millipore) against 2 mM
HEPES-D18, 125 mM NaCl, 0.9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, in
D2O at 4 °C, with centrifugation at 13,000 rcf. The pH of the
buffer was adjusted with 1 M NaOH to 5.5 to 8.5. 3’SL or 6’SL
were added to the VLP samples to a concentration of 800 µM and
incubated at 4 °C or 37 °C. 1H NMR spectra were measured at
298 K upon different incubation time, acquired with 32 scans
with 2 s relaxation delay over a spectral width of 6000 Hz. For
the inhibition experiment, oseltamivir carboxylate (3, final conc.
8 µM to 1600 µM) was added to NA-VLP prior to the addition of
2, incubated at 37 °C and 1H NMR spectra were acquired at
different time intervals.
Influenza virus neuraminidase pH optimum– To ensure that
the influenza virus neuraminidase activity was abolished for the
STD NMR experiment a fluorescent-based assay was carried out
at different pH values using 4-methylumbelliferyl N-acetyl-α-Dneuraminide (MUN) as a substrate. In a standard 96-well plate
format, a recombinant neuraminidase from a 2009 pandemic
H1N1 strain was assayed for its activity at different pH by a
modification [1] of the fluorometric method of Potier et al.[2]
Stock solutions of neuraminidase were made in three different
buffers (A. 50 mM sodium acetate pH 5.5, 6 mM CaCl2, B. 50
mM HEPES pH 7.4, 6 mM CaCl2, C. 50 mM HEPES pH 8.4, 6
mM CaCl 2). The reaction mix with a final volume of 10 µL (0.1
mM MUN, 1.83 µg/mL neuraminidase) was prepared in a 96well solid black plate on ice. All assays were done in triplicate.
The reaction was started by brief centrifugation of up to 1,000
rpm for approx 10 sec. to combine all components. Immediately
after centrifugation the reaction was incubated at 37 °C with 900
rpm shaking for 20 min. To stop the reaction, 250 µL 0.25 M
glycine (pH 10.0) was added to each well and the fluorescence
was read at an excitation of 355 nm and emission of 460 nm. It
was found that the neuraminidase was inactive at pH 8.4 but
showed residual activity at pH 7.4.
NMR-based Influenza virus neuraminidase assay – The pH
dependency on influenza virus neuraminidase was additionally
investigated using an NMR-based neuraminidase assay.
Neuraminidase activity from 5.5 to 8.4 showed a considerable
decrease in consumption of the α(2,3)-sialyllactose (2) substrate,
however, after a 60 minute incubation period under the chosen
NMR conditions α(2,3)-sialyllactose (2) was completely cleaved
into β-Neu5Ac (95%), α-Neu5Ac (5%) and lactose (Figure S1).
To abolish cleavage of α(2,3)-sialyllactose (2) and to block the
active site we decided to add the high-affinity influenza virus
neuraminidase inhibitor 3 to the VLP:2–complex. Figure 1c
shows the 1H NMR spectrum after 240 minute incubation of
(H5)N1 influenza N1:2:3–complex at a molecular ratio of
1:100:1. It is obvious that the addition of one equivalent (N1:3)
significantly inhibits cleavage of N-acetylneuraminic acid from
of α(2,3)-sialyllactose (2). Only a minor H3eq signal (3%) of βNeu5Ac is visible at 2.10 ppm. A new sample containing a
(H5)N1:2:3–complex at a molecular ratio of 1:100:2 was
prepared and after 240 minute incubation no cleavage of Nacetylneuraminic acid (1) was observed (data not shown),
demonstrating 2 equivalents of OC (3) are sufficient to
completely block the active site of influenza virus NA and to
prevent N-acetylneuraminic acid cleavage.
Figure S1. H NMR spectra of α-(2,3)-sialyllactose (2) in complex
with avian N1-VLPs before (a) and after 60 minute incubation (b),
and with addition of OC (3) after 240 minute incubation (c).
1
STD NMR experiments – STD NMR spectra were performed
at 600 MHz and 279 K. NA-VLP were diluted to contain ~8µM
of NA (~8µM of catalytic binding site) in 250µL of HEPES
buffer for each experiment. Buffer were exchanged against 2 mM
HEPES-D18, 125 mM NaCl, 0.9 mM CaCl 2, 0.5 mM MgCl2,
pH8.0 as described above. The protein was saturated onresonance at -1.0 ppm and off-resonance at 300 ppm with a
cascade of 60 selective Gaussian-shaped pulses of 50 ms
duration. A 100 µs delay between each pulse was applied,
resulting in a total saturation time of 3 s. A relaxation delay of 4 s
was used. A total of 1024 scans per STD NMR experiment were
acquired and a WATERGATE sequence was used to suppress the
residual HDO signal. Spin-lock filter with 5 kHz strength and
duration of 10 ms was applied to suppress protein background.
3’SL or 6’SL were added to give a molecular protein:ligand ratio
of 1:100. On- and off-resonance spectra were stored and
processed separately, and the final STD NMR spectra were
obtained by subtracting the on- and off-resonance spectra.
Control STD NMR experiments were performed with an
identical setup but in the absence of protein or ligand. In the
competition experiment between oseltamivir carboxylate (3) and
2, the inhibitor (8 µM to 1600 µM) was added before the addition
of 2. Saturation transfer double difference (STDD) NMR spectra
were obtained by subtraction between STD NMR spectra in the
presence of ligands with the STD NMR spectra in the absence of
ligands
AutoDock Vina calculations – In order to study the possible
binding conformations of oseltamivir carboxylate (3) with the
secondary sialic acid binding site of several neuraminidases we
used AutoDock Vina 1.1.2 [3] Protein and ligands files for input
to Vina were prepared using AutoDock Tools 1.5.4. [4] The
docking box was a cube of 15 Å each side centred on the
secondary sialic acid binding site. For Vina nine docked poses
were generated with the exhaustiveness set to 25. Results were
visualised using AstexViewer.[5]
References
NMR-basierender Influenza NA-IVP Aktivitätstest – NA-IVPs
wurden für jedes Experiment verdünnt (~8 µM NA in 250 µL
deuteriertem HEPES Puffer). Probenpuffer wurde dreimal gegen
2 mM HEPES-D18 pH 8,0, 125 mM NaCl, 0,9 mM CaCl 2, 0,5
mM MgCl2 in D2O bei 4 ° durch Zentrifugation bei 13,000 rcf in
Amiconfiltern (100 kDa Ausschlussgrenze, Millipore)
ausgetauscht. Der pH-Wert wurde mit 1 M NaOH zwischen pH
5,5 und 8,5 eingestellt. 3´-SL oder 6`-SL wurde zu den IVP
Proben in einer Konzentration von 800 µM gegeben und bei 4 °C
bzw. 37 °C inkubiert. 1H NMR Spektra wurden bei 298 K und
verschiedenen Inkubationszeiten gemessen, aufgenommen mit 32
Scans und einer um 2 Sekunden verzögerten Relaxation über eine
spektrale Breite von 6000 Hz. Für das Inhibitionsexperiment
wurde Oseltamivir Carboxylat (3, Endkonzentration 8 bis 1600
µM) vor Zugabe von 3´-SL zu den NA-IVPs gegeben. Es wurde
bei 37 °C inkubiert und 1H NMR Spektra zu verschiedenen
Zeitintervallen aufgenommen.
[1] Chong, A. K. J., Pegg, M. S., von Itzstein, M., Influenza virus neuraminidase:
effect of calcium on steady-state kinetic parameters, (1991) Biochim. Biophys.
Acta 1077:65-71.
[2] Potier, M., Mameli, L., Belisle, M., Dallaire, L., Melançon, S. B., Fluorometric
assay of neuraminidase with a sodium (4-methylumbelliferyl α-D-Nacetylneuraminate) substrate, (1979) Anal. Biochem. 94:287-296
[3] Trott, O., Olson, A. J., AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of
docking
with
a
new
scoring
function,
efficient
optimization,
and
multithreading, (2010) J. Comput. Chem. 31: 455-461
[4] Sanner, M. F., Python: a programming language for software integration and
development, (1999) J. Mol. Graph. Model 17: 57-61
[5] Hartshorn, M. J., AstexViewer: a visualisation aid for structure-based drug
design, (2002) J. Comput. Aided Mol. Des. 16: 871-881
Anhang:
Allgemein – Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich mit
der höchstmöglichen verfügbaren Reinheit erworben, wenn nicht
anders vermerkt. Die bekannten Verbindungen a(2,3)Sialyllaktose (2, 3´SL) und Oseltamivir Carboxylat (3) wurden
hausintern synthetisiert. Alle NMR Experimente wurden mit dem
Bruker Avance 600 MHz Spektrometer durchgeführt, dass mit
einer 5-mm TXI-Probe mit dreifachem Achsengradienten
ausgestattet ist.
Produktion und Aufreinigung von Influenza NA-enthaltenen
IVPs – Virusähnliche Partikel mit FLAG-markierten NA von
Influenzavirusstämmen
A/Cambodia/JP52a/2005
(H5N1),
A/Gansu/Chenguan/1129/2007
(saisonale
H1N1)
oder
A/California/04/2009 (pandemischer H1N1) wurden wie zuvor
beschrieben produziert und analysiert (Lai et al. 2010). In Kürze,
HEK-293T Zellen wurden mit pcDNA-NA(H5), pcDNANA(H1) oder pcDNA-NA(pdm-H1) transfiziert. Kulturmedien
wurden gesammelt und gefiltert, gefolgt von Ultrazentrifugation
über ein 30 % Sucrose-HEPES Puffer (2 mM HEPES, 125 mM
NaCl, 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, pH 7,4) Kissen. Das NAIVP Pellet wurde in HEPES Puffer resuspendiert und bei -80 °C
aufbewahrt. Der NA-Gehalt in den IVPs wurde durch Western
Blot
mit
monoklonalem
Anti-FLAG
Mausantikörper
quantifiziert. Die enzymatische Aktivität wurde mit dem NA-Star
chemolumineszenten Test (Applied Biosystems) bestimmt.
pH Optimum von Influenzavirus Neuraminidase – Um sicher
zu gehen, dass die Influenzavirus Neuraminidaseaktivität für die
STD NMR Experimente vollständig inhibitiert ist, wurde ein auf
Fluoreszenz basierender Aktivitätstest bei verschiedenen pH
Werten und 4-Methylumbelifferyl-N-Acetyl-a-D-neuraminide
(MUN) als Substrat durchgeführt. In einer 96-well Platte wurde
die Aktivität einer rekombinanten Neuraminidase eines
pandemischen humanen 2009 Virusstammes nach einer
fluoremetrischen
Methode
von
Potier
gemessen[1,2].
Neuraminidase wurde in drei verschiedenen Stammlösungen
aufgesetzt (A. 50 mM Natriumacetat pH 5,5 und 6 mM CaCl 2, B.
50 mM HEPES pH 7,4 und 6 mM CaCl2, C. 50 mM HEPES pH
8,4 und 6 mM CaCl2). Der Reaktionsansatz mit einem
Gesamtvolumen von 10 µL (0,1 mM MUN, 1,83 µg/mL
Neuraminidase) wurde auf Eis in schwarze 96-well Platten
pipettiert. Alle Messungen wurden in Dreifachansätzen
durchgeführt. Um die Reaktion zu starten, wurden alle
Komponenten durch Zentrifugation bei bis zu 1,000 rpm für 10 s
vereinigt. Sofort danach wurde die Platte bei 37 °C für 20 min
unter Schütteln bei 900 rpm inkubiert, bevor die Reaktion durch
Zugabe von 250 µL 0,25 M Glycin (pH 10) abgestoppt wurde.
Die Fluoreszenz wurde bei einer Anregungswellenlänge von 355
nm und einer Emission von 460 nm gemessen. Es zeigte sich,
dass die Neuraminidase bei pH 8,4 inaktiv ist und eine
Restaktivität bei pH 7,4 besitzt.
NMR-basierender Influenzavirus Neuraminidase Aktivitätstest
– Die pH-Wert Abhängigkeit der Influenzavirus Neuraminidase
wurde zusätzlich duch einen auf NMR basierenden Aktivitätstest
untersucht. Der Verbrauch vom a(2,3)-Sialyllaktose (2) Substrat
nahm beträchtlich mit ansteigendem pH-Wert von pH 5,5 bis 8,4
ab. Dennoch wurde durch die Neuraminidase Aktivität unter den
gegebenen NMR Bedingungen a(2,3)-Sialyllaktose (2) nach 60
minütiger Inkubationszeit vollständig in die Produkte ß-Neu5Ac
(95%), a-Neu5Ac (5%) und Laktose gespalten (Abbildung S1).
Um die Spaltung von a(2,3)-Sialyllaktose (2) zu verhindern und
um das aktive Zentrum zu blockieren, gaben wir den hochaffinen Influenzavirus Neuraminidase Inhibitor 3 zum IVP:2Komplex dazu. Abbildung 1c zeigt das 1H NMR Spektrum nach
240-minütiger Inkubationszeit vom (H5)N1 Influenza N1:2:3Komplex für ein molekulares Verhältnis von 1:100:1. Es ist klar
ersichtlich, dass die Zugabe von einem Äquivalent (N1:3) die
Abspaltung von N-Acetylneuraminsäure von der a(2,3)Sialyllaktose (2) erheblich inhibiert. Nur ein geringes H3eqSignal (3%) vom ß-Neu5Ac erscheint bei 2,10 ppm. Eine neue
Probe, die den (H5)N1 Influenza N1:2:3-Komplex in einem
molekularen Verhältnis von 1:100:2 enthielt, zeigte nach 240-
minütiger Inkubationszeit keine Abspaltung von NAcetylneuraminsäure (1) (Daten nicht gezeigt). Dies zeigt, dass 2
Äquivalente des Oseltamivir Carboxylats (3) ausreichend sind,
um das aktive Zentrum der Influenzavirus Neuraminidase
vollständig zu blockieren und damit die Abspaltung von NAcetylneuraminsäure zu verhindern.
Abbildung S1. 1H NMR Spektrum von a(2,3)-Sialyllaktose (2)
im Komplex mit aviaren N1-IVPs vor (a) und nach 60-minütiger
Inkubation (b), und im Beisein von OC (3) nach 240-minütiger
Inkubation (c).
AutoDock Vina Berechnungen – Um die möglichen
Bindungskonformationen von Oseltamivir Carboxylat (3) mit der
sekundären Sialinsäure-Bindungsstelle von verschiedenen
Neuraminidasen zu studieren, wurde AutoDock Vina 1.1.2[3]
verwendet. Protein- und Ligandendateien für Vina wurden durch
AutoDock Tools 1.5.4[4]. gewonnen. Für das Docking wurde ein
Würfel mit einer Kantenlänge von 15 Å um die sekundäre
Sialinsäure-Bindungsstelle zentriert angenommen. Für die Vina
Simulation wurden 9 Start-Strukturen genommen und der
Erschöpfungsfaktor auf 25 gesetzt. Die Ergebnisse wurden mit
Hilfe vom AstexViewer visualisiert [5].
References
[1] Chong, A. K. J., Pegg, M. S., von Itzstein, M., Influenzavirus neuraminidase:
effect of calcium on steady-state kinetic parameters, (1991) Biochim. Biophys.
Acta 1077:65-71.
[2] Potier, M., Mameli, L., Belisle, M., Dallaire, L., Melançon, S. B., Fluorometric
assay of neuraminidase with a sodium (4-methylumbelliferyl α-D-Nacetylneuraminate) substrate, (1979) Anal. Biochem. 94:287-296
[3] Trott, O., Olson, A. J., AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of
docking
1
Abbildung S1. H NMR Spektrum von a(2,3)-Sialyllaktose (2) im
Komplex mit aviaren N1-IVPs vor (a) und nach 60-minütiger
Inkubation (b), und im Beisein von OC (3) nach 240-minütiger
Inkubation (c).
with
a
new
scoring
function,
efficient
and
[4] Sanner, M. F., Python: a programming language for software integration and
development, (1999) J. Mol. Graph. Model 17: 57-61
[5] Hartshorn, M. J., AstexViewer: a visualisation aid for structure-based drug
design, (2002) J. Comput. Aided Mol. Des. 16: 871-881
STD NMR Experimente – STD NMR Spektren wurden bei 600
MHz und 279 K aufgenommen. NA-IVPs wurden für jedes
Experiment verdünnt, so dass ~8 µM NA (~8µM katalytische
Bindungsstelle) in 250 µL HEPES Puffer vorlagen. Der Puffer
wurde wie zuvor beschrieben gegen 2 mM HEPES-D18 pH 8,0,
125 mM NaCl, 0,9 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2 in D2O ausgetauscht.
Das Protein wurde -1,00 ppm gesättigt (on-resonance) und die
off-resonance Frequenz wurde auf 300 ppm gesetzt. Das Protein
wurde dann mit einer Kaskade von 60 selektiven Gauss-Pulsen
mit einer jeweiligen 50 ms Dauer gefolgt von einer Verzögerung
von 100 µs zwischen jedem Puls angeregt, das in eine totale
Sättigungszeit von 3 s resultierte. Eine Relaxationsverzögerung
von 4 s wurde verwendet. Insgesamt wurden 1024 Scans pro
STD NMR Experiment aufgenommen und eine WATERGATE
Sequenz wurde benutzt, um restliche HDO-Signale zu
unterdrücken. Ein Spin-lock Filter mit einer Stärke von 5 kHz und
einer Länge von 10 ms unterdrückte den Proteinhintergrund. 3´SL und 6´-SL wurden so hinzugegeben, dass sich ein molares
Verhältnis von Protein zu Ligand von 1 zu 100 ergab. On- und
Off-Resonanzspektren wurden gespeichert und separat
prozessiert. Das entgültige STD NMR Spektrum wurde durch
Subtraktion der On- und Off-Resonanzspektren voneinander
gewonnen. STD NMR Experimente zur Kontrolle wurden
durchgeführt unter identischen Einstellungen allerdings in
Abwesenheit
von
Protein
oder
Ligand.
Im
Konkurrenzexperiment zwischen Oseltamivir Carboxylat (3) und
3´-SL wurde der Inhibitor (8 µM bis 1600 µM) vorgelegt vor der
Zugabe von 3´-SL. Sättigungstransfer-Doppeldifferenz (STDD)
NMR Spektren wurden durch Subtraktion des STD NMR
Spektrums in Gegenwart vom Ligand vom STD NMR Spektrum in
Abwesenheit des Liganden gewonnen.
optimization,
multithreading, (2010) J. Comput. Chem. 31: 455-461