Funktionelle Untersuchungen zum HTLV Rex-Protein und dem

Transcrição

Funktionelle Untersuchungen zum HTLV Rex-Protein und dem
potentiellen Interaktionspartner Staufen-1
Bachelorarbeit
im Bachelor-Studiengang Biotechnologie/
Biotechnology
der Beuth Hochschule für Technik Berlin
– University of Applied Sciences –
zur Erlangung des akademischen Grades eines
Bachelor of Science (B. Sc.)
vorgelegt von
Nadine Lehmann
August 2012
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Dr. Norbert Bannert, der es mir ermöglicht hat meine Bachelorarbeit am Robert Koch-Institut im Zentrum für HIV und Retrovirologie durchzuführen. Ich
möchte mich auch herzlich bei Dr. Kirsten Hanke bedanken, die mich während meiner gesamten Zeit am RKI betreut hat und mir in vielen Gesprächen hilfreich zur Seite stand. Bei Prof.
Dr. A. Speer möchte ich mich für die Übernahme der Betreuung und für die Begutachtung
meiner Arbeit bedanken.
Für die Einarbeitung am cLSM und die Hilfe bei mikroskopischen Arbeiten bedanke ich mich
herzlich bei Dr. Kazimierz Madela. Meiner Arbeitsgruppe danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die hilfreiche Unterstützung im Labor. Besonderer Dank geht dabei an
Dr. Oliver Hohn für die kritische Durchsicht dieser Arbeit. Ebenso bedanke ich mich bei Veronika Lausch für die Cavidi-Messung.
Von ganzem Herzen möchte ich mich bei Jörg Dittmer bedanken, der mich in jeder Hinsicht
unterstützt und an mich glaubt.
Zum Schluss möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir durch ihre Liebe und Unterstützung so viel Halt gegeben haben.
Abkürzungsverzeichnis
AD
Aktivierungsdomäne
APOBEC3G / A3G
ATL
Adulte T-Zell-Leukämie
BSA
Bovine Serum Albumin
CIP
Alkaline Phosphatase Calf Intestinal
cLSM
konfokales Laser Scanning Mikroskop
FKS
Fetales Kälberserum
HERV
Humane Endogene Retroviren
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus
HTLV-1
Humanes T-Zell-Leukämie-Virus-1
IF
Immunfluoreszenz-Färbung
IP
Immunpräzipitation
NES
Kernexportsignal
NLS
Kernlokalisationssignal
LTR
Long Terminal Repeat
RBD
RNA-Bindedomäne
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ...........................................................................................................................I
1.1
Das erste humane Retrovirus HTLV-1 .......................................................................... I
1.2
Die Regulation der HTLV-1-Replikation ...................................................................... I
1.3
Das HTLV-1 Rex-Protein ............................................................................................ II
1.4
Das humane Staufen-1-Protein ................................................................................... III
1.5
Antivirale Abwehrmechanismen ................................................................................ IV
2
Zielsetzung ....................................................................................................................... V
3
Material und Methoden ................................................................................................. VI
3.1
3.1.1
Laborgeräte und Apparaturen............................................................................... VI
3.1.2
Reagenzien, Puffer und Medien ........................................................................... VI
3.1.3
Chemikalien, Enzyme und Enzympuffer .......................................................... VIII
3.1.4
Kits ....................................................................................................................... IX
3.1.5
Größenstandards ................................................................................................... IX
3.1.6
Bakterienstämme .................................................................................................. IX
3.1.7
Eukaryotische Zelllinien ...................................................................................... IX
3.1.8
Plasmide ............................................................................................................... IX
3.1.9
Antikörper ............................................................................................................. X
3.2
4
Materialien .................................................................................................................. VI
Methoden .................................................................................................................... XI
3.2.1
Übersicht der Methoden ....................................................................................... XI
3.2.2
DNA-Analytik .....................................................................................................XII
3.2.3
Zellkultur ........................................................................................................... XIV
3.2.4
Proteinanalytik ................................................................................................... XV
Ergebnisse ................................................................................................................. XVIII
4.1
Nachweis der Interaktion zwischen HTLV-1 Rex und Staufen-1 ........................ XVIII
4.2
Abhängigkeit der HTLV-1 Rex-Lokalisation von Staufen-1 .................................. XXI
4.3
Bestimmung der Staufen-1 interagierenden Domäne ............................................. XXII
4.4
Einfluss von Staufen-1 auf die HTLV-1 Partikelbildung ..................................... XXIV
4.5
Staufen-abhängiger Rex-Transport in Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe
XXVI
5
Diskussion ................................................................................................................. XXIX
5.1
Interaktion von HTLV-1 Rex und Staufen-1 ........................................................ XXIX
5.2
Einfluss von Staufen-1 auf die Partikelbildung von HTLV-1 .............................. XXXI
5.3
Antivirale Abwehrmechanismen ......................................................................... XXXII
6
Zusammenfassung ................................................................................................. XXXIV
7
Abstract ....................................................................................................................XXXV
8
Literatur ........................................................................ Fehler! Textmarke nicht definiert.
9
Anhang .......................................................................... Fehler! Textmarke nicht definiert.
1 Einleitung
1
1.1
I
Einleitung
Das erste humane Retrovirus HTLV-1
Seit Anfang des 20. Jahrhunderts wurde in der Krebsforschung ein besonderes Augenmerk auf
Retroviren gerichtet, da zu dieser Zeit Tumor-induzierende Retroviren aus verschiedenen Tieren isoliert werden konnten [1]. Zu nennen sind hier u.a. das Hühner-Leukämievirus (Ellermann und Bang 1908) und das Maus-Mammatumor-Virus ( Bittner 1936) [2]. Diesbezügliche
Untersuchungen brachten neue Erkenntnisse zu den Ursachen und Mechanismen von Krebserkrankungen. Bemühungen ein humanes Tumor-Retrovirus zu identifizieren, blieben jedoch
lange Zeit erfolglos. (Voisset Weiss 2008)
Erst die Entdeckung der Adulten T-Zell-Leukämie (ATL) 1977 war der Grundstein, welcher
zur Erforschung humaner Retroviren führte [4]. Um 1980 wurde schließlich ein humanes Retrovirus in einer Zelllinie eines ATL-Patienten entdeckt und als Humanes T-Zell-LeukämieVirus-1 (HTLV-1) beschrieben (Poizes 1982) [5]. Der Zusammenhang zwischen HTLV-1 und
der Adulten T-Zell-Leukämie konnte bestätigt werden, als in ATL-Patientenseren gegen
HTLV-1 gerichtete Antikörper gefunden wurden [6,7]. Von den rund 10 bis 20 Millionen
HTLV-1-Infizierten weltweit [8] erkranken allerdings nur 3-5 % an ATL, wohingegen der Rest
keinerlei Symptome aufweist [1]. Des Weiteren kann das Virus HTLV-1 assoziierte Myelopathie/tropische spastische Paraparese verursachen [6].
Seit der Entdeckung der Adulten T-Zell-Leukämie und HTLV-1 ist es endlich möglich die Ursachen sowie die Entstehung von Krebs durch Retroviren und den Krankheitsverlauf direkt am
Menschen zu erforschen. Die Erkenntnisse aus der HTLV-Forschung werden möglicherweise
zu dem allgemeinen Verständnis von Krebs, Immunreaktionen und möglichen Behandlungstherapien beitragen [9].
1.2
Die Regulation der HTLV-1-Replikation
Nach erfolgter viraler Infektion einer Wirtszelle wird zunächst das virale RNA-Genom durch
die Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben, welche im Zellkern an einer zufälligen Stelle in das Wirtsgenom integriert [10]. Das HTLV-Provirusgenom besitzt neben der für alle Retroviren typischen LTR-gag-pol-env-LTR-Sequenz eine zusätzliche px-Region. Diese px-
1 Einleitung
II
Region kodiert alternative Leserahmen für verschiedene Proteine wie u.a. das Tax- und RexProtein, welche maßgeblich an der Virusreplikation beteiligt sind (siehe Abbildung 1) [1].
Abbildung 1: Regulation der HTLV-1-Replikation: Das provirale HTLV-Genom besitzt eine zusätzliche pxSequenz, welche u.a. für die Proteine Tax und Rex kodiert. Tax und Rex entstehen aus doppelt gespleißter mRNA
mit alternativen Leserahmen. Tax verstärkt die Transkription der viralen Gene und führt zu einem Anstieg der
mRNA Menge (1). Rex verhindert das Spleißing dieser mRNA (2). Es folgt die Akkumulation ungespleißter und
einfach gespleißter Transkripte, die der Translation der viralen Proteine Gag, Pol und Env dienen (3). [1]
Zu Beginn der HTLV-Replikation werden die transkribierten Volllängen-mRNAs komplett
gespleißt, wodurch Tax und Rex exprimiert werden. Durch Interaktion mit der 5‘-LTR verstärkt Tax erheblich die Transkription des viralen Genoms [1,6]. Ist eine ausreichende Menge
an Rex vorhanden, bindet das Protein an das Rex-responsive Element viraler mRNA, verhindert deren Spleißing und transportiert sie aus dem Kern ins Cytoplasma. Die Akkumulation
ungespleißter und einfach gespleißter Transkripte im Cytoplasma führt zur Translation der viralen Proteine Gag, Pol und Env [10]. Zusätzlich wird der Anteil vollständig gespleißter mRNA
deutlich verringert, was in einer verminderten Tax-Expression resultiert. In der Folge wird die
Transkription des viralen Genoms herunterreguliert [1].
1.3
Das HTLV-1 Rex-Protein
Das regulatorische Rex-Protein ist strukturell und funktionell mit dem HIV-1 Rev und dem
HERV-K Rec verwandt [11]. Rex ist 27 kDa groß, setzt sich aus 189 Aminosäuren zusammen
und besitzt verschiedene funktionale Domänen (siehe Abbildung 2) [10,12]. Zum einen besitzt
das Protein eine RNA-Bindedomäne (RBD), welche an das Rex-responsive Element viraler
mRNA bindet, um sie zu stabilisieren. Die RNA-bindende Domäne überlappt zudem teilweise
mit dem Kernlokalisationssignal (NLS). Zum anderen besitzt Rex eine Aktivierungsdomäne
(AD), in der sich die Kernexportsequenz (NES) befindet. Durch die Kombination aus NLS und
1 Einleitung
III
NES wird Rex dazu befähigt seine Funktion als mRNA-Transportprotein auszuüben, indem es
zwischen Zellkern und Cytoplasma wandert [13,14]. Dies hat zur Folge, dass die Lokalisation
von Rex in einem dynamischen Gleichgewicht zwischen Zellkern und Cytoplasma steht. Verhältnismäßig befindet sich allerdings mehr Rex im Zellkern [10]. Des Weiteren besitzt das Protein zwei Multimerisierungsdomänen. Über diese Domänen können sich Rex-Rex-Multimere
bilden, die für die Transportfunktion wichtig sind [15].
Abbildung 2: Struktur des HTLV-1 Rex-Proteins: Das Protein besteht aus 189 Aminosäuren und verschiedenen
funktionalen Domänen. Es besitzt eine RNA-Bindedomäne (RBD), die zudem als Kernlokalisationssignal (NLS)
agiert, und zwei Multimerisierungsdomänen. Zudem besitzt Rex eine Aktivierungsdomäne (AD), welche das
Kernexportsignal (NES) beinhaltet. Verändert nach [16]
Da Rex essentiell an der Replikation des Humanen T-Zell-Leukämie-Virus-1 beteiligt ist, ist es
unabdingbar weitere Untersuchungen zu diesem Protein anzustellen. Dazu gehören u.a. die
Identifikation sämtlicher zellulärer Interaktionspartner sowie posttranslationaler Modifikationen. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse sollten stark zu dem Verständnis über ATL und
HTLV-1 assoziierter Myelopathie/tropisch spastischer Paraparese sowie deren Behandlungsmöglichkeiten beitragen [12].
1.4
Das humane Staufen-1-Protein
Staufen ist ein hochkonserviertes und ubiquitär vorkommendes RNA-bindendes Protein. Das
humane Staufen-1 besteht aus vier RNA-Bindedomänen und einer Tubulin-Bindedomäne [17].
Durch die Bildung von RNA-Transport-Granula ist es entscheidend am mRNA-Transport der
Zelle beteiligt [18]. Neben dieser Transport-Funktion besitzt das Protein zudem auch regulatorische Eigenschaften. Durch die Bindung an die 5‘-UTR bewirkt es die Translation reprimierter
mRNAs [19]. Im Gegensatz dazu leitet es einen neu entdeckten RNA-Abbauweg ein, wenn es
an die 3’UTR bindet [20].
Allerdings wird Staufen-1 auch mit dem viralen RNA-Transport in Verbindung gebracht. So
wurde schon die Interaktion mit den HIV-1 Rev-Protein und dem HERV-K Rec-Protein bestätigt [2,21]. Des Weiteren ist bekannt, dass Staufen-1 in Stressgranula einwandert, sobald Zellen
Stressbedingungen ausgesetzt sind [22].
1 Einleitung
1.5
IV
Antivirale Abwehrmechanismen
Sogenannte Stressgranula sind die zelluläre Antwort, um durch Stress verursachte Schäden zu
beheben oder um sich an veränderte Umgebungsbedingungen anzupassen [23]. Werden Zellen
z.B. einem Hitzeschock unterzogen, findet man die mRNAs vieler „housekeeping“-Proteine in
den induzierten Stressgranula. Hingegen sind mRNAs, die für Hitzeschock-Proteine kodieren,
nicht vorzufinden. Neben mRNAs beinhalten Stressgranula zusätzlich kleine ribosomale Untereinheiten, Translationsinitiationsfaktoren und verschiedene RNA-bindende Proteine wie z.B.
TIA, welche für die Hemmung der Translation sowie mRNA-Stabilisierung- und Abbau zuständig sind [24,25]. Daraus resultiert eine verminderte Translation der „housekeepingProteine“ zugunsten der Expression von Proteinen, welche den entstandenen Schaden reparieren können [23]. Des Weiteren befinden sich verschiedene miRNAs und siRNAs, die der antiviralen Abwehr dienen können, in den gebildeten Granula [2]. Durch die Bildung von Stressgranula wird demnach der mRNA-Metabolismus der Zelle an veränderte Umgebungsbedingungen wie Hitzeschock, oxidativer Stress, UV-Belastung oder auch virale Infektion angepasst
[24].
Ein weiterer zellulärer Abwehrmechanismus geht von dem zur Familie der CytidinDeaminasen gehörenden APOBEC3G-Protein aus [26]. Die antivirale Eigenschaft des Proteins
beruht darauf, dass es im viralen Genom und in endogenen retroviralen Elementen wie Retrotransposons Mutationen hervorruft. Dabei wird während der Reversen Transkription des viralen Genoms im Minus-Strang der neu synthetisierten DNA Cytosin zu Uracil deaminiert. Dieser Basenaustausch führt zu einer Anhäufung von G zu A-Hypermutationen im Plus-Strang,
wodurch das virale Genom wahrscheinlich seine Funktionalität verliert [26]. Von APOBEC3G
(A3G) sind zum einen die niedrigmolekulare (LMM A3G) und die hoch molekulare (HMM
A3G) Form bekannt, die sich in ihrer Funktion unterscheiden. Einzig die LMM-Form ist enzymatisch aktiv und kann die retrovirale Replikation nach Eintritt in die Zelle beeinträchtigen
[27]. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass HMM A3G die Zelle vor einer übermäßigen Retrotransposition endogener retroviraler Elemente schützt [28]. Es ist zudem bekannt,
dass Staufen-RNA-Transportgranula ein Bestandteil von HMM A3G-Komplexen sind, und
dass diese Komplexe unter Stressbedingungen in Stressgranula einwandern können [28].
2 Zielsetzung
2
V
Zielsetzung
Im Zuge dieser Arbeit soll eine mögliche Interaktion zwischen dem regulatorischen HTLV-1
Rex-Protein und dem humanen RNA-bindenden Staufen-1-Protein untersucht werden. Für das
HIV-1 Rev Protein oder das HERV K113 Rec Protein konnte eine solche Interaktion und deren
Einfluss auf den Transport viraler RNA bereits gezeigt werden.
Im ersten Schritt soll eine maximal exprimierte und über einen spezifischen V5-Tag nachweisbare Form von HTLV-1 Rex erzeugt werden, indem die synthetische, codon-optimierte rexSequenz in den pcDNA4/V5-HisA-Vector eingefügt wird.
Im nächsten Schritt soll mithilfe von Co-Immunpräzipitationen im Western Blot überprüft werden, ob tatsächlich eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen nachzuweisen ist. Durch
Immunfluoreszenzfärbungen soll das Ergebnis bestätigt und eine intrazelluläre Co-Lokalisation
gezeigt werden. Durch eine Titration der Menge des Staufen-Expressionskonstrukts bei konstanter Menge des Rex-codierenden Plasmids und anschließender Zellfraktionierung soll der
Einfluss von Staufen-1 auf das Verhältnis der Lokalisation von Rex zwischen Zellkern und
Cytoplasma untersucht werden. Des Weiteren soll mittels C-terminal verkürzten Staufen-1Deletionsmutanten die mit Rex interagierende Staufen-1-Domäne in Co-Immunpräzipitationen
identifiziert werden.
Ist die Interaktion bestätigt, werden Untersuchungen zu deren physiologischen Auswirkungen
in der Zelle angestellt. Mithilfe von Immunfluoreszenzfärbungen und Co-Lokalisationsstudien
soll überprüft werden, ob Rex und Staufen unter induzierten Stressbedingungen mit APOBEC3G-Komplexen und dem Markerprotein für Stressgranula TIA co-lokalisieren. Ebenso soll
die direkte Auswirkung auf die Bildung von HTLV-Partikeln durch die Überexpression von
Rex und Staufen untersucht werden, um die Bedeutung von Staufen im Falle einer HTLV Infektion näher zu charakterisieren.
VI
3 Material und Methoden
3
Material und Methoden
3.1
3.1.1
Materialien
Laborgeräte und Apparaturen
DNA Engine Thermocycler
BioRad
HERAEUS Multifuge1S-R Centrifuge
Thermo Scientific
Mikro 200R Zentrifuge
Hettich
NanoDrop Spectrophotometer ND-1000
Nanodrop
Sterilbank Thermo HeraSafe
Kendro
CO2-Inkubator C 200 für eukaryotische Zellen
Labotect
CoulterCounter
Coulter Electronics Inc.
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell
BioRad
Konfokales Laser Scanning Mikroskop LSM 780
Carl Zeiss
Odyssey Infrared Imaging System
LI-COR Biosciences
Optima-L100K Ultrazentrifuge
Beckmann
microplate reader „Sunrise“
TECAN
3.1.2
Reagenzien, Puffer und Medien
Agarose-Gelelektrophorese
6 x DNA-Probenpuffer
10 mM Tris-Acetat, 50 mM EDTA, 10 % Ficoll-400 (w/v)
(Serva), 0,4 % Orange-G (w/v) (Sigma) in H2O
1 x TAE
40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 7,2
Bakterienanzucht
SOB-Medium
20 g Bacto-Tryptone, 5 g Bacto-Yeast-Extract, 0,186 g KCl,
0,584 g NaCl ad. 970 ml H20, pH 7,0
VII
SOC-Medium
9,7 Teile SOB, 0,1 Teil Mg-Mix, 0,2 Teile Glukose
LB-Medium
1 % Bacto Hefe Extrakt; 1 % NaCl, pH 7,0
LB-Agar
LB-Medium mit 20 g/l Agar
Zellkultur
Dulbecco’s Modified Eagle
Gibco (Invitrogen Corporation)
Medium (DMEM)
FKS (Fetales Kälberserum)
Biochrom
Phosphate buffered saline
123 mM Natriumchlorid; 2,7 mM Kaliumchlorid; 10 mM
Dinatriumhydrogenphosphat; 2 mM Kaliumdihydrogenphosphat;pH 7,0
(PBS)
2 x HEPES Buffer Saline
5,6 ml 5 M NaCl; 10 ml 0,5 M HEPES (pH 7,1); 1 ml 0,15 M
(HBS)
Na2HPO4; ad. 100 ml Aqua bidest.
HEPES
0,05 M
Zelllysispuffer
1 % Triton-X 100; 20 mM Tris (pH 7,7); 150 mM NaCl
Trypsin/EDTA
0,05 % Trypsin (pH 7,2), 0,02 % EDTA in PBS;
(TPP/Biochrom)
Na-Arsenit
SIGMA-Aldrich
20 % Sucrose
D-Saccharose, w/v in A. bidest
Proteinanalytik
4 x Western Blot-Puffer
200mM Tris, pH 6,8, 8 % (w/v) SDS, 0,2 % (w/v) Bromphenolblau, 40% (v/v) Glycerol, 400 mM DTT
Acrylamid
Rotiphorese R 10 x SDS-PAGE (Carl Roth GmbH
TEMED
BioRad
APS 10 %
w/v in A. bidest gelöst (Carl Roth GmbH)
Trenngel-Puffer
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 (BioRad)
Sammelgel-Puffer
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (BioRad)
Laufpuffer
2,5 mM Tris, pH 8.3, 19,2 mM glycine, 0.01 % SDS (BioRad)
Transferpuffer
2,5 mM Tris, 19,2 mM glycine, pH 8.3, 20 % EtOH (BioRad)
VIII
Blockierungspuffer
2 % Milchpulver (Sucofin, TSI GmbH) in PBS/0,5 % Tween
2 % Formaldehyd
w/v in PBS
0,5 % Triton X-100
w/v in PBS
1 % Milchpulver
w/v in PBS
Hypotonischer Puffer
10 mM HEPES, pH 7.9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM
DTT, Proteaseinhibitor
Kernlysispuffer I
Hypotonischer Puffer + 0,1 % SDS, 100 mM Na2SO4,
400 mM (NH4)2SO4
Kernlysispuffer II
3.1.3
8 M Harnstoffpuffer, pH 4.6, 0,1 % SDS
Chemikalien, Enzyme und Enzympuffer
dNTP‘s
Fermentas International Inc.
Agarose
Peqlab Biotechnologie GmbH
Ethidiumbromid
Carl Roth GmbH
BigDye
ABI Terminator Chemie
5x ABI-Puffer
ABI Terminator Chemie
Protease-Inhibitor (Tabletten)
Roche Diagnostics GmbH
T4-DNA-Ligase
Fermentas
Ligationspuffer
Fermentas
HindIII
BioLabs
XhoI
BioLabs
Puffer 2
BioLabs
Benzonase
Novagen
IX
3.1.4
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit
Qiagen GmbH
Endo-free Plasmid Maxi Kit
Qiagen GmbH
QIAprep Spin Miniprep Kit
Qiagen GmbH
Effectene Transfection Reagent
Qiagen GmbH
HS-Mg RT Activity Kit
Cavidi
3.1.5
Größenstandards
Generuler 1kb Ladder Plus
PageRuler Prestained Protein Ladder
3.1.6
Bakterienstämme
E. coli TOP10
3.1.7
Invitrogen
Eukaryotische Zelllinien
HEK 293T (aus humanem embryonalen Nie- LGC Standards GmbH
renkarzinom)
3.1.8
Plasmide
pCMV-Tag2B
Stratagene
pcDNA4/V5-HisA
Invitrogen
pBud-CE4.1
Invitrogen
oricoRec-pBud
im RKI kloniert
Stau-Flag-pCMV
im RKI kloniert
X
coRex-pcDNA4/V5-HisA
im RKI kloniert
Stau-cherry
im RKI kloniert
APOBEC3G-CFP
im RKI kloniert
TIA-YFP
im RKI kloniert
HTLV-Klon
3.1.9
Antikörper
primäre Antikörper
𝛼V5
(Maus)
Serotec
𝛼Flag
(Kaninchen)
Sigma
𝛼Staufen
(Ratte)
am RKI immunisiert
𝛼Histon-H3
(Kaninchen)
Cell Signalin Technology
𝛼HTLV-1
(Ziege)
NIH
𝛼mouse-HRP
(Ziege)
Sigma
(Ziege)
Sigma
𝛼goat-HRP
(Kaninchen)
Dako
𝛼mouseA647
(Ziege)
Invitrogen
(Ziege)
Invitrogen
𝛼ratA547
(Ziege)
Invitrogen
𝛼mouseA800
(Ziege)
LI-COR Biosciences
(Ziege)
Invitrogen
sekundäre HRP-Antikörper
𝛼rabbit-HRP
sekundäre Fluoreszenz-Antikörper
𝛼mouseA488
sekundäre Infrarot-Antikörper
𝛼rabbitA680
3.2
3.2.1
Methoden
Übersicht der Methoden
XI
XII
3.2.2
DNA-Analytik
3.2.2.1 Restriktion
Für den Restriktionsverdau wurden Typ-2-Restriktionsendonukleasen eingesetzt. Die Zusammensetzung eines Restriktionsansatzes ist in Tabelle 1 aufgeführt. Der Ansatz wurde für zwei
Stunden bei 37 °C inkubiert. Vektoren wurden anschließend mit 1 µl CIP (BioLabs) versetzt
und für zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Tabelle 1: Restriktionsansatz
Komponente
Eingesetztes Volumen / Menge
DNA
10 µg
Puffer 2
5 µl
Restriktionsendonuklease 1
3 µl Unit?
Restriktionsendonuklease 2
3 µl Unit?
BSA
1 µl mg/ml?
A. bidest
ad. 50 µl
3.2.2.2 Ligation
Für die Ligation wurde 10 bis 30 ng des Vektors eingesetzt. Die benötigte Menge an Insert
wurde mit der folgenden Formel berechnet.
𝑛𝑔 𝐼𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡 = 5 ∗ 𝑛𝑔 𝑉𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 ∗
𝑏𝑝 𝐼𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡
𝑏𝑝 𝑉𝑒𝑘𝑡𝑜𝑟
Es wurden 1 µl T4-DNA-Ligase und 2 µl Ligationspuffer (10 x) zugefügt. Der Ansatz wurde
mit A. bidest auf 20 µl aufgefüllt und für eine Stunde bei 37 °C inkubiert.
3.2.2.3 DNA-Agarosegelelektrophorese
Agarose wurde mit 1 x TAE-Puffer auf eine Endkonzentration von 1,5 % (w/v) gebracht und
durch Erhitzen in einer Mikrowelle vollständig gelöst. Es wurden 0,5 µg/ml Ethidiumbromid
zugesetzt. Die Proben wurden mit 6 x DNA-Ladepuffer versetzt und in 1 x TAE-Puffer bei
einer Spannung von 90-120 V aufgetrennt. Der DNA-Marker „Generuler 1 kb Ladder Plus“
wurde als Größenstandard mitgeführt.
XIII
3.2.2.4 Aufreinigung von DNA-Fragmenten
Nach einer durchgeführten Agarosegelelektrophorese wurde das Gel auf einen UVTransilluminator gelegt. Die DNA-Banden wurden so sichtbar gemacht und konnten mit einem
Skalpell ausgeschnitten werden. Die DNA-Aufreinigung wurde mit dem „QIAquick Gel
Extraction Kit“ nach Herstellerangaben durchgeführt.
3.2.2.5 Chemische Transformation
Bei dieser Art der Transformation wurde die DNA zu dem Bakterienstamm E. coli TOP10
pipettiert. Der Ansatz wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend für 30 Sekunden bei 42 °C einem Hitzeschock unterzogen. Das Bakterien-DNA-Gemisch wurde mit 500 µl
SOC-Medium versetzt und für eine Stunde bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Im Anschluss an die
Inkubation wurden die Bakterien für 10 Minuten bei 300 g zentrifugiert und in 100 µl SOCMedium resuspendiert. Diese 100 µl Transformationsansatz wurden auf LB-Selektivplatten
ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
3.2.2.6 Plasmidisolierung
Die Plasmidisolierungen erfolgten mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit“ oder dem „Endo-free
Plasmid Maxi Kit“ nach Herstellerangaben.
3.2.2.7 DNA-Bestimmung
DNA-Bestimmungen wurden mit dem Nanodrop ND-1000 entsprechend den Herstellerangaben
durchgeführt.
3.2.2.8 Sequenzierungs-PCR
DNA-Sequenzierungen wurden im Sequenzierungslabor nach der Kettenabruchmethode durchgeführt. Die Zusammensetzung eines Sequenzierungs-Ansatzes ist in Tabelle 2 aufgelistet. Die
PCR wurde unter den folgenden Bedingungen
2 min 96 °C Denaturierung
10 sec 96 °C Denaturierung
5 sec 53 °C Primer-Annealing
25 x
4 min 60 °C Elongation
durchgeführt. Die Sequenzanalysen wurden mithilfe des Computerprogramms BioEdit Sequence Alignment Editor ausgewertet.
XIV
Tabelle 2: Sequenzierungs-Ansatz
Komponente
Eingesetztes Volumen / Menge
DNA
150 ng
Big-Dye
2 µl
5 x ABI-Puffer
1 µl
Sequenzierprimer
0,5 µl
A. bidest
ad. 10 µl
3.2.3
Zellkultur
3.2.3.1 Zellkultivierung
Die eukaryotische Zelllinie HEK 293T wurde in 75 cm2 Zellkulturflaschen bei 37 °C, 5 % CO2
und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Das verwendete Dulbecco’s Modified Eagle Medium
wurde mit 10 % FKS und 1 x Penicillin/Streptomycin komplementiert. Für das Passagieren
wurde zunächst das alte Medium entfernt. Die Zellen wurden mit 5 ml PBS gewaschen, mit
1 ml Trypsin/EDTA vom Kulturflaschenboden abgelöst und in 10 ml DMEM aufgenommen.
Ein Teil der Zellen wurde weiterkultiviert. Der Rest wurde entweder verworfen oder für weiterführende Experimente eingesetzt. In diesem Fall wurden die Zellen für 10 Minuten bei 300 g
zentrifugiert und in 10 ml Medium resuspendiert. Die Zellzahl wurde mit dem Coulter Counter
bestimmt und die Zellen unter Berücksichtigung ihrer Teilungsraten in verschiedenen Kultivierungsgefäßen ausgesät.
3.2.3.2 Transfektion
Für die Transfektion der HEK 293T-Zellen in 100 mm Platten wurde die CalciumchloridMethode eingesetzt. Dafür wurden 1 bis 10 µg DNA mit A. bidest auf 450 µl aufgefüllt und mit
50 µl 2,5 M Calciumchlorid versetzt. Dieser Ansatz wurde zu 500 µl 2 x HBS getropft und für
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die Zellen mit PBS
gewaschen und mit frischem Medium versehen. Anschließend wurde der Transfektionsansatz
zu den Zellen getropft. Nach 10 Stunden wurde das Medium gewechselt. Die Zellen wurden bis
zu einer ausreichenden Proteinexpression weiterkultiviert.
Für die Transfektion von Zellen in 6 well-Platten wurde das „Effectene Transfection Reagent“
entsprechend der Herstellerangaben verwendet.
3.2.4
XV
Proteinanalytik
3.2.4.1 Zelllyse / Proteinextraktion
Für die Herstellung von Zelllysaten wurden die in 100 mm Platten transfizierten Zellen vom
Plattenboden abgelöst, mit PBS gewaschen und für 10 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Das
Zellpellet wurde mit 200 µl Lysispuffer resuspendiert. Der Lysispuffer wurde zuvor mit einer
„complete“ Protease-Inhibitor-Tablette versetzt. Die Zelllysate wurden für 10 Minuten bei
19.000 g bei 4 °C zentrifugiert, die klaren Überstande in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und
direkt für Western-Blot-Analysen verwendet oder bei -20 °C gelagert.
3.2.4.2 Immunpräzipitation (IP)
Die gewonnenen Zelllysate wurden mit 20 bis 30 µl Antikörper-konjugierter Sepharose versetzt, mit Lysispuffer mit Protease-Inhibitor auf 1 ml aufgefüllt und für vier Stunden bei 4 °C
über Kopf rotierend inkubiert. Das Lysat-Sepharose-Gemisch wurde im Anschluss für zwei
Minuten bei 340 g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml Lysispuffer gewaschen und
nach 10 Waschschritten in 30 µl A. bidest aufgenommen. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C
3.2.4.3 Ultrazentrifugation (UZ)
Im Vorfeld der Ultrazentrifugation wurden Virusüberstände für 10 Minuten bei 3400 g und
Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend sterilfiltriert um Zelltrümmer abzutrennen.
Anschließend wurde die Virussuspension in Ultrazentrifugationsröhrchen auf ein 20 % Sucrose-Kissen geschichtet und für drei Stunden bei 66.000 g und 4 °C zentrifugiert. Für die Aufkonzentrierung der Virussuspension wurden die Optima-L100K Ultrazentrifuge und der
SW32Ti-Rotors eingesetzt. Die Virus-Pellets wurden in 100 µl 0,05 M HEPES resuspendiert.
3.2.4.4 Isolation von Kern- und cytoplasmatischen Proteinfraktionen
Für die Proteinfraktionierung wurden zunächst HEK 293T-Zellen in 100 mm Platten ausgesät
und transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit PBS gewaschen, vom Boden gelöst
und für fünf Minuten bei 300 g und 4°C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml PBS gelöst
und für sieben Minuten bei 300 g zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in 300 µl hypotonischem Puffer resuspendiert und fünf Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 20
µl 10 % NP-40 und einem Zentrifugationsschritt von fünf Minuten bei 50 g und 4 °C konnten
die klaren Überstände bzw. die cytoplasmatische Fraktion abgenommen werden. Im Anschluss
wurde das Kernpellet einmal in 1 ml hypotonischem Puffer gewaschen und in 300 µl Kernlysispuffer I resuspendiert. Nachdem die Proben mit 2 µl Benzonase für ca. eine Stunde inkubiert
XVI
wurden, folgte ein Zentrifugationsschritt von 10 Minuten bei 340 g. Es konnte die Kernfraktion
abgenommen werden. Das unlösliche Pellet bestehend aus Kern- und Membranproteinen wurde
in 300 µl Kernlysispuffer II resuspendiert.
3.2.4.5 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die zu untersuchenden Protein-Proben wurden mit 4 x Western Blot-Puffer versetzt und für
fünf Minuten bei 70 °C bzw. für 10 Minuten bei 90 °C denaturiert. Die Auftrennung der Proteine erfolgte mit einem 5 % Sammelgel und einem 15 % Trenngel bei einer Spannung von 120180 V. Als Größenstandard wurde die „Pageruler Prestained Protein Ladder“ mitgeführt. Im
Anschluss wurden die Gele für Western Blots verwendet.
3.2.4.6 Western Blot
Der Proteintransfer vom SDS-Gel auf eine geeignete Membran erfolgte nach der Semi-DryMethode. PVDF-Membranen wurden für drei Minuten in 96 % Ethanol aktiviert und anschließend in Transferpuffer äquilibriert. Nitrocellulose-Membranen wurden lediglich in Transferpuffer äquilibriert. Das SDS-Gel wurde nach 10 Minuten Äquilibrierung in Transferpuffer zwischen zwei Filterpapieren auf die Membran gelegt. Die Filterpapiere wurden zuvor mit Transferpuffer getränkt. Das Blotting erfolgte für 35 Minuten bei 20 V. Danach wurde die Membran
für eine Stunde in Blockierungspuffer geschwenkt. Anschließend wurde die Membran mit einem in Blockierungspuffer verdünnten primären Antikörper über Nacht bei 4 °C rotierend inkubiert. Als nächstes wurde die Membran 3 Mal für 10 Minuten mit PBS/Tween 0,1 % gewaschen. Es folgte eine einstündige Inkubation mit einem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur. PVDF-Membranen wurden mit einem mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierten
sekundären Antikörper inkubiert und anschließend 3 Mal für 10 Minuten mit PBS/Tween 0,1 %
gewaschen. Die Detektion erfolgte mit dem „Super-Signal West Dura Extended Duration Substrate“ (Thermo Scientific) durch die Schwärzung eines Röntgenfilms. NitrocelluloseMembranen wurden mit einem sekundären Infrarot-Antikörper inkubiert. Der letzte Waschschritt erfolgte hier mit PBS ohne Tween. Für die Detektion wurde der Odyssey Imager eingesetzt.
3.2.4.7 Immunfluoreszenz-Färbung (IF)
Als Vorbereitung wurden HEK 293T-Zellen in 6 well-Platten ausgesät und transfiziert. Nach
24 bis 48 Stunden wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit 1 ml 2 % Formaldehyd für 30 Minuten bei 37 °C fixiert. Nach drei Waschschritten mit PBS wurden die Zellen mit 1 ml 0,5 % Triton X-100 für 15 Minuten permeabilisiert. Nach weiteren drei Wasch-
XVII
schritten wurden unspezifische Bindungen mit 1 ml 1 % Milchpulver für 30 Minuten abgesättigt. Im Anschluss wurden die Zellen mit dem primären Antikörper für eine Stunde bei 37 °C
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen wieder 3 Mal gewaschen um danach mit dem
sekundären Fluoreszenz-markierten Antikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert
zu werden. Ab diesem Arbeitsschritt wurde lichtgeschützt gearbeitet. Nachdem die Zellen erneut gewaschen und die Kerne mit DAPI angefärbt wurden, wurden sie mit Mowiol luftblasenfrei mit Deckgläschen eingebettet. Die Lagerung erfolgte bei 4 °C im Dunkeln. Ausgewertet
wurden die Präparate am konfokalen Laser Scanning Mikroskop cLSM 780.
3.2.4.8 RT-assay (Cavidi)
Für die Bestimmung und Quantifizierung der Virusexpression wurde der „HS-Mg RT Activity
Kit“ nach Herstellerangaben verwendet.
4 Ergebnisse
4
XVIII
Ergebnisse
Für die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten retroviraler Erkrankungen müssen deren
genaue Ursachen und Mechanismen bekannt sein. Dafür ist es unabdingbar zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren, um zu verstehen an welchen Stellen das Virus in den Wirtsstoffwechsel eingreift. Für das HIV-1 Rev-Protein und das HERV-K Rec-Protein konnte das humane RNA-bindende Staufen-1-Protein bereits als Interaktionspartner identifiziert werden (Quelle). Da diese beiden viralen RNA-Transportproteine strukturell und funktionell mit dem
HTLV-1 Rex-Protein verwandt sind, kann eine mögliche Interaktion zwischen Rex und Staufen
vermutet werden. Die Interaktion mit Staufen-1 wäre somit ein verbreiteter Mechanismus unter
komplexen Retroviren.
Um dieser Frage nachzugehen, wurde zunächst die für maximale Expression codon-optimierte
HTLV-1 rex-Sequenz in den pcDNA4/V5-HisA-Vector kloniert. Dadurch konnte das RexProtein in folgenden Versuchen effektiv über den C-terminal eingefügten V5-Tag nachgewiesen werden. Für die Klonierung wurden HTLV-1 rex und pcDNA4/V5-HisA mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und XhoI für zwei Stunden bei 37 °C verdaut. Als nächstes folgte
die Ligation von rex-Insert und pcDNA4/V5-HisA-Vector für eine Stunde bei 37 °C. Nach
chemischer Transformation in den E. coli-Stamm TOP10 folgte die Plasmidisolierung. Anhand
von Sequenzierungen mit den Primern T7 und BGH konnte die Intaktheit der Sequenz bestätigt
werden Die Sequenz des Plasmids befindet sich im Anhang 9.1. Das Protein Rex-V5 konnte
somit für die nachfolgenden Interaktionsstudien eingesetzt werden.
4.1
Nachweis der Interaktion zwischen HTLV-1 Rex und Staufen-1
Der Nachweis einer möglichen Interaktion zwischen Rex und Staufen sollte mittels
Co-Immunpräzipitation erfolgen. Dafür wurden Rex-V5 und Staufen-Flag in HEK 293T-Zellen
co-transfiziert. Als Positivkontrolle wurde das 17 kDa große HERV-K Rec-V5 mit StaufenFlag und als Negativkontrolle pcDNA4 mit Staufen-Flag co-transfiziert. Nach zwei Tagen
wurden die hergestellten Zelllysate mit 𝛼V5-Sepharose inkubiert. Nur in den Ansätzen, in de-
nen Staufen-Flag mit dem V5-markierten Protein interagiert, kann es später im Western Blot
mit einem 𝛼Flag-Antikörper nachgewiesen werden. Rec-V5 und Rex-V5 wurden mit einem
𝛼V5-Antikörper detektiert. Unbehandeltes Lysat wurde als Kontrolle für die StaufenExpression mitgeführt. Dem Western Blot in Abbildung 3 ist zu entnehmen, dass Staufen in
4 Ergebnisse
XIX
allen Ansätzen exprimiert und im Lysat bei 55 kDa nachgewiesen wurde. Nach der Immunpräzipitation sind dagegen nur noch deutliche Staufen-Banden in der Positivkontrolle mit HERVK Rec und dem Rex-Ansatz zu erkennen. In der Negativkontrolle wurde kein Staufen nachgewiesen. Das Ergebnis des Blots deutet stark daraufhin, dass Staufen-1 ein zellulärer Interaktionspartner des HTLV-1 Rex-Proteins ist.
Abbildung 3: Nachweis der Interaktion zwischen HTLV-1 Rex und Staufen-1 mittels Co-Immunpräzipitation: Für
den Nachweis wurde Rex-V5 mit Stau-Flag in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Als Positivkontrolle diente RecV5 mit Stau-Flag und als Negativkontrolle pcDNA4 mit Stau-Flag. Die Zelllysate wurden mit 𝛼V5-Sepharose
inkubiert. Das unbehandelte Lysat wurde als Expressionskontrolle mitgeführt. In den Immunpräzipitationsproben
(IP) wurden Rec und Rex mittels 𝛼V5- und 𝛼mouse-HRP-Antikörper nachgewiesen. Staufen wurde mit einem
𝛼Flag- und 𝛼rabbit-HRP-Antikörper detektiert.
Mithilfe von Co-Lokalisationsstudien sollte das Ergebnis der Co-Immunpräzipitation bestätigt
werden. Zu diesem Zweck wurden Rex-V5 und das Fluoreszenz-markierte Staufen-cherry zunächst einzeln in HEK 293T-Zellen transfiziert, um die Lokalisation der Proteine in Abwesenheit des anderen zu ermitteln. Zwei Tage nach der Transfektion erfolgte die Immunfluoreszenzfärbung von Rex mit dem Antikörpern 𝛼V5. Die Proben wurden mit dem konfokalen Laser
Scanning Mikroskop (cLSM780) ausgewertet.
In der Abbildung 4 ist erkennbar, dass der Großteil von Rex diffus im Zellkern verteilt ist (Pfeil
A). Allerdings ist ein geringer Anteil des Proteins auch im Cytoplasma vorhanden (Pfeil B).
Obwohl Staufen-cherry dagegen überwiegend im Cytoplasma lokalisiert ist (Pfeil D), war das
Protein in seltenen Fällen ebenfalls im Zellkern nachzuweisen (Pfeil C).
4 Ergebnisse
XX
Abbildung 4: zelluläre Lokalisation von HTLV-1 Rex und Staufen-1: HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5
(links) bzw. Staufen-cherry (rechts) transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Formaldehyd fixiert. Rex
wurde mit einem 𝛼V5- und einem 𝛼mouseA647-Antikörper angefärbt. Der Zellkern wurde mittels DAPI (Blau)
gefärbt. Die Auswertung erfolgte an einem cLSM780. A: Rex im Kern lokalisiert. B: Rex im Cytoplasma lokalisiert. C: Staufen im Kern lokalisiert. D: Staufen im Cytoplasma lokalisiert.
Im nächsten Schritt wurden Rex-V5 und Staufen-cherry in HEK-293T-Zellen co-transfiziert,
um eine Co-Lokalisation der beiden Proteine, die der Interaktion zugrunde liegen müsste, nachzuweisen. Aus der Abbildung 5 geht hervor, dass Rex in Gegenwart von Staufen eine stark
veränderte Lokalisation aufweist. Der Großteil des Proteins befindet sich nun im Cytoplasma
wo eine starke Co-Lokalisation mit Staufen stattfindet Des Weiteren konnte vereinzelt die CoLokalisation von Rex und Staufen im Zellkern beobachtet werden (durch Pfeile markiert).
Abbildung 5: Co-Lokalisation von HTLV-1 Rex und Staufen-1: HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5 und Staufen-cherry co-transfiziert. Nach zwei Tagen folgte die Immunfluoreszenzfärbung von Rex mit einem 𝛼V5- und
einem 𝛼mouseA488-Antikörper. Die Auswertung erfolgte an einem cLSM780. Oben: Cytoplasmatische CoLokalisation. Unten: Co-Lokalisation in Kern und Cytoplasma.
4 Ergebnisse
XXI
Mit diesen Immunfluoreszenzfärbungen konnte bestätigt werden, dass eine Interaktion der beiden Proteine möglich ist, da in Co-Transfektionsversuchen eine deutliche Co-Lokalisation in
Zellkern und Cytoplasma festgestellt werden konnte. Zudem konnte beobachtet werden, dass
die Anwesenheit von Staufen einen Einfluss auf die Lokalisation von Rex ausübt.
4.2
Abhängigkeit der HTLV-1 Rex-Lokalisation von Staufen-1
Um den Effekt von Staufen auf eine verstärkte cytoplasmatische Lokalisation von Rex zu überprüfen, wurde eine Staufen-Titration mit anschließender Zell-Fraktionierung durchgeführt. Dafür wurden Co-Transfektionen mit einer konstanten Rex-V5-Menge und variierenden StaufenFlag-Mengen angesetzt. In dem Ansatz ohne Staufen wurden Rex-V5 und der Leervektor
pCMV co-transfiziert. Aus den Zelllysaten wurden die Proteinfraktionen aus Cytoplasma, Zellkern und unlöslichen Bestandteilen gewonnen und im Western Blot miteinander verglichen.
Rex wurde mit einem 𝛼V5- und Staufen mit einem 𝛼Flag-Antikörper detektiert. Histon wurde
als Kontrolle für die Sauberkeit der Fraktionen mit einem 𝛼Histon-Antikörper nachgewiesen
und ist nur in der Kern- und Pelletfraktion enthalten. Der Western Blot wurde mit dem
„Odyssey Infrared Imaging System“ ausgewertet. Für die Auswertung wurden die Intensitäten
der Rex-Banden gemessen. Von jedem Ansatz wurde die Intensität der Zellkern-Bande auf
100 % gesetzt. Bezogen auf diesen 100 %-Wert wurde der prozentuale Anteil von Rex im Cytoplasma und der unlöslichen Fraktion in jedem Ansatz berechnet (siehe Abbildung 6). In dem
Ansatz ohne transfiziertes Staufen beträgt der Anteil von Rex im Cytoplasma 40 %. Bei der
Zugabe von 1 µg Staufen ist Rex zu gleichen Teilen im Kern und Cytoplasma lokalisiert. In
den Ansätzen mit 2 und 8 µg Staufen ist der Anteil von Rex im Cytoplasma mit ca. 160 %
viermal höher als ohne Staufen. Der Ansatz mit 4 µg Staufen passt nicht zu den anderen Werten, da hier Rex wieder zu gleichen Teilen im Kern und Cytoplasma zu finden ist. Grundsätzlich bestätigt dieses Ergebnis jedoch die Beobachtungen aus den Immunfluoreszenzuntersuchungen. Rex allein ist überwiegend im Zellkern und nur zu einem geringen Anteil im Cytoplasma lokalisiert. Wird Staufen mit Rex co-transfiziert, hat dies durch die Interaktion der beiden Proteine eine verstärkte cytoplasmatische Rex-Lokalisation zur Folge.
Betrachtet man die Staufen-Blots fällt auf, dass das Protein bei einer Menge von 1 µg nur im
Cytoplasma nachgewiesen wurde. Mit steigender Proteinmenge konnte Staufen auch im Kern
und im unlöslichen Pellet detektiert werden. Die Veränderung der Staufen-Lokalisation resultiert jedoch wahrscheinlich aus der Überexpression des Proteins.
XXII
4 Ergebnisse
Abbildung 6: Abhängigkeit der HTLV-1 Rex-Lokalisation von Staufen-1: 8 µg Rex-V5 wurden jeweils mit 0, 1, 2,
4 und 8 µg Staufen-Flag in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. In dem Ansatz ohne Staufen wurde stattdessen
pCMV-Leervektor eingesetzt. Nach der Herstellung der Zelllysate wurde eine Protein-Fraktionierung durchgeführt. Für den Nachweis von Rex bzw. Staufen wurde der 𝛼V5- und 𝛼mouseA800-Antikörper bzw. der 𝛼Flag- und
𝛼rabbitA680 eingesetzt. Histon wurde als Kontrolle der Proteintrennung mitgeführt und mit dem 𝛼Histon-H3- und
dem 𝛼rabbitA680 detektiert. Unten: Darstellung der Rex,- Staufen- und Histon-Banden der Proteinfraktionen im
Western Blot. Oben: Quantitative Auswertung der gemessenen Banden-Intensitäten.
4.3
Bestimmung der Staufen-1 interagierenden Domäne
Um die an der Interaktion beteiligte Staufen-Domäne zu identifizieren, wurden im Vorfeld dieser
Arbeit
hergestellte
Flag-markierte
Deletionsmutanten
des
Proteins
in
Co-
Transfektionsversuchen eingesetzt. Die Deletionsmutanten wurden durch Einfügen von
Stoppcodons in die Sequenz unterschiedlich stark C-terminal verkürzt (siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: Flag-markierte Staufen-1-Deletionsmutanten: Durch das Einfügen von Stoppcodons in die StaufenSequenz wurde das Protein C-terminal verkürzt. Abbildung verändert nach [2]
4 Ergebnisse
XXIII
Für diesen Versuch wurde Rex-V5 mit Staufen-Flag und den Deletionsmutanten co-transfiziert.
Ein Ansatz mit HERV-K Rec-V5 und Staufen-Flag wurde als Positivkontrolle mitgeführt. Ein
weiterer Ansatz mit pcDNA4 und Staufen-Flag diente als Negativkontrolle. Die Lysate wurden
mit 𝛼V5-Sepharose inkubiert. Im Western Blot können die Staufen-Deletionsmutanten nur
dann nachgewiesen werden, wenn sie die für die Interaktion benötigte Domäne besitzen. Der
Nachweis von Staufen und den Protein-Mutanten erfolgte mit dem 𝛼Flag-Antikörper. Rec-V5
und Rex-V5 wurden mit dem 𝛼V5-Antikörper nachgewiesen. Unbehandeltes Lysat diente als
Kontrolle der Staufen-Expression. In der Abbildung 8 ist zu erkennen, dass Staufen bzw. die
Mutanten 2, 3 und 4 exprimiert und im Lysat detektiert wurden. Es fand jedoch keine Expression der Staufen-Mutante 1 statt. Nach der Immunpräzipitation kann das Volllängen-Staufen aufgrund der stattfindenden Interaktion in den Ansätzen mit Rec und Rex nachgewiesen werden.
Von den restlichen IP-Proben ist nur bei Mutante 3 eine deutliche Bande bei ca. 36 kDa zu erkennen. Dies könnte darauf hinweisen, dass am C-Terminus von Mutante 3, d.h. im hinteren
Teil der RBD4, die interagierende Domäne beginnt. Allerdings besitzt die Mutante 4 ebenfalls
diese Domäne. Da Mutante 4 jedoch nicht detektiert werden konnte, bleibt das Ergebnis uneindeutig.
Abbildung 8: Die mit Rex interagierende Staufen-1-Domäne: In HEK 293T-Zellen wurde Rex-V5 mit C-terminal
verkürzten Staufen-Flag-Deletionsmutanten co-transfiziert. Als Positivkontrolle diente Rec-V5 mit Staufen-Flag.
Als Negativkontrolle wurde pcDNA4 mit Staufen-Flag mitgeführt. Die Lysate wurde mit 𝛼V5-Sepharose inkubiert
und anschließend gewaschen. In den Immunpräzipitations-Proben wurde Staufen mit einem 𝛼Flag- und 𝛼rabbitHRP-Antikörper nachgewiesen. Der Nachweis von Rec-V5 und Rex-V5 erfolgte mit einem 𝛼V5- und 𝛼mouseHRP-Antikörper. Für die Expressionskontrolle wurde Staufen im Lysat nachgewiesen.
XXIV
4 Ergebnisse
4.4
Einfluss von Staufen-1 auf die HTLV-1 Partikelbildung
Nachdem die Interaktion zwischen dem HTLV-1 Rex-Protein und dem humanen Staufen-1Protein bestätigt werden konnte, stellte sich die Frage ob dies physiologische Auswirkungen
zur Folge hat. Von besonderem Interesse war der Einfluss der Staufen-1-Interaktion auf die
Viruspartikelbildung von
HTLV-1.
Um
dieser
Fragestellung nachzugehen,
wurden
Co-Transfektionsversuche mit einem HTLV-1-Molekularklon durchgeführt. Der Molekularklon wurde mit Rex-V5, Staufen-Flag sowie Rex-V5 und Staufen-Flag in HEK 293T-Zellen
co-transfiziert. Ein Ansatz mit dem HTLV-1-Klon und dem Leervektor pCMV wurde als Referenz mitgeführt. Untransfizierte Zellen dienten als Negativkontrolle. Nach erfolgter Ultrazentrifugation der Viruspartikel enthaltenden Kulturüberstände wurden die Proben im Western Blot
eingesetzt und mit einem 𝛼HTLV-1 polyklonalem Ziegenserum angefärbt (siehe Abbildung 9).
Abbildung 9: Nachweis erhöhter HTLV-1-Partikelbildung durch Staufen-1 mittels Ultrazentrifugation: Der
HTLV-1-Molekularklon wurde zusammen mit Rex, Staufen sowie Rex und Staufen in HEK 293T-Zellen cotransfiziert. Ein Ansatz mit HTLV-1 und pCMV-Leervektor wurde als Referenz mitgeführt. Als Negativkontrolle
dienten untransfizierte Zellen. Fünf Tage nach Transfektion wurden die Viruspartikel enthaltenden Kulturüberstände ultrazentrifugiert. Die Viruspellets wurden im Western Blot eingesetzt und mit einem 𝛼HTLV-1polyklonalem Serum und 𝛼goat-HRP-Antikörper angefärbt.
Die Masse an Proteinbanden ist womöglich damit zu erklären, dass das gegen das HTLV-1-
Vollvirus gerichtete Ziegenserum zudem unspezifisch einige zelluläre Proteine anfärbt. Bei
genauer Betrachtung sind allerdings die beiden Gag-Banden des Virus-Capsids und der VirusMatrix deutlich bei ca. 24 und 19 kDa zu erkennen. In dem Ansatz mit HTLV-1 und Rex sind
diese beiden Banden in etwa doppelt so breit wie jene in der Referenzprobe. Im Vergleich zu
der Probe mit Rex sind die Intensitäten der p24- und p19 Gag-Banden der Ansätze mit Staufen
bzw. Rex und Staufen sogar noch höher. Diese beobachtete Intensitätssteigerung der Capsid-
XXV
4 Ergebnisse
und Matrix-Banden ist ein Hinweis auf verstärkte Produktion viraler Partikel in dem Kulturüberstand der transfizierten Zellen.
Um die im Western Blot eingesetzten Proben quantitativ besser auswerten zu können, wurden
die Proben zusätzlich mit einem Assay zur Quantifizierung der Reversen-TranskriptaseAktivität analysiert. Mithilfe dieses RT-Assays war es möglich die Konzentration der Reversen
Transkriptase in den einzelnen Transfektionsansätzen zu berechnen. Die Höhe der RTKonzentration gibt ebenfalls Aufschluss über die Menge der produzierten Viruspartikel. Die
Konzentration des Enzyms in der Referenzprobe mit HTLV-1 und pCMV wurde auf 100 %
bzw. 1 gesetzt. Bezogen auf diesen Wert wurde die Faktorsteigerung der Enzymkonzentration
berechnet. Der Abbildung 10 ist zu entnehmen, dass die Konzentration in dem Ansatz mit
HTLV und Rex 3-mal höher ist als in der Referenz. Eine deutliche Steigerung ist jedoch erst
durch die Zugabe von Staufen zu beobachten. Verglichen mit der Referenz ist die Konzentration der Reversen Transkriptase in dem Ansatz mit Staufen bzw. Rex und Staufen um den Faktor
29 bzw. 23 höher. Die ermittelte Steigerung der Reversen Transkriptase-Konzentration korreliert mit dem Ergebnis des Western Blots. Die geringste Partikelproduktion wies die Referenzprobe mit HTLV allein auf. Eine Steigerung der Partikelbildung um den Faktor 3 konnte durch
die Transfektion mit Rex erreicht werden. Durch die Co-Transfektion des HTLV-Klons mit
Staufen wurde eine Steigerung um das 28-fache erzielt. Bei Co-Transfektion mit Rex sowie
Staufen wurde die Produktion viraler Partikel um das 23-fache gesteigert. Dieses Ergebnis lässt
die Vermutung zu, dass die Interaktion zwischen Rex und Staufen einen positiven Effekt auf
die HTLV-1-Partikelproduktion ausübt, solange Rex nicht im Überschuss vorliegt.
Faktorsteigerung der RTKonzentration
35
28,66
30
23,18
25
20
15
10
5
0
0
1,00
3,16
Abbildung 10: Nachweis erhöhter HTLV-1-Partikelbildung durch Staufen-1 mittels RT-Assay: Für das Assay
wurden die Proben der resuspendierten Viruspellets aus der zuvor durchgeführten Ultrazentrifugation verwendet.
Dargestellt ist die Steigerung der Reversen Transkriptase-Konzentration bezogen auf die Referenzprobe mit
HTLV und pCMV-Leervektor.
4 Ergebnisse
4.5
XXVI
Staufen-abhängiger Rex-Transport in Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe
Es ist bekannt, dass Staufen-1 in Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe einwandert. Daher
stellte sich die Frage ob Rex durch die Interaktion mit Staufen in diese Strukturen transportiert
wird. Um diese Vermutung zu überprüfen wurden HEK 293T-Zellen mit Rex-V5 und Staufencherry co-transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen durch die Zugabe
von Na-Arsenit zum Kulturmedium oxidativem Stress ausgesetzt. Anschließend wurde Rex mit
einem 𝛼V5-Antikörper angefärbt. Als Referenz wurden ungestresste Zellen mitgeführt, in denen Rex und Staufen diffus im Cytoplasma co-lokalisieren (siehe Abbildung 11, oben). In den
gestressten Zellen können die beiden Proteine zudem in granulären Strukturen im Cytoplasma
detektiert werden (siehe Abbildung 11, unten).
Abbildung 11: Nachweis des Staufen-abhängigen Rex-Transports in granuläre Strukturen unter induzierten Stressbedingungen: HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5 und Staufen-cherry transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die
Zellen mit Na-Arsenit (0,5 mmol/L) für eine Stunde gestresst. Anschließend erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung. Für die Detektion von Rex-V5 wurde ein 𝛼V5- und 𝛼mouseA488-Antikörper eingesetzt. Oben:
Ungestresste Zellen als Referenz. Rex und Staufen co-lokalisieren im Cytoplasma. Unten: Gestresste Zellen. Rex
und Staufen sind im Cytoplasma in granulären Strukturen vorzufinden.
Um sicher zu gehen, dass dieser Effekt nicht auf die Überexpression des transfizierten Staufens
zurückzuführen ist, wurde der Versuch mit zellulärem Staufen wiederholt. Hierfür wurden
HEK 293T-Zellen ausschließlich mit Rex-V5 transfiziert und erneut mit Na-Arsenit gestresst.
Für die Färbung von Rex wurde der 𝛼V5-Antikörper eingesetzt. Das endogene Staufen wurde
mit einem 𝛼Staufen-Rattenserum angefärbt. In Abbildung 12 ist erkennbar, dass Rex und Staufen auch unter diesen Bedingungen in granulären Strukturen im Cytoplasma nachgewiesen
werden können. Es konnte damit bestätigt werden, dass Rex unter Stressbedingungen durch die
Interaktion mit Staufen in cytoplasmatische Granula einwandert.
4 Ergebnisse
XXVII
Abbildung 12: Nachweis des Rex-Tranports in Stress-induzierte granuläre Strukturen durch zelleigenes Staufen:
HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5 transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Na-Arsenit (0,5
mmol/L) für zwei Stunden gestresst. Anschließend erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung. Für die
Detektion von Rex-V5 wurde ein 𝛼V5- und 𝛼mouseA488-Antikörper eingesetzt. Das endogene Staufen wurde mit
einem 𝛼Staufen-Rattenserum und 𝛼ratA547-Antikörper nachgewiesen. Neben der cytoplasmatischen CoLokalisation können deutliche granuläre Strukturen beobachtet werden. In diesen Strukturen können Rex und
Staufen nachgewiesen werden.
Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob es sich bei diesen granulären Strukturen um
Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe handelt. Für die Beantwortung dieser Frage wurde
Rex-V5 zusammen mit Staufen-cherry und TIA-YFP in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Bei
dem RNA-bindenden Protein TIA handelt es sich um ein Markerprotein für Stressgranula. Die
Zellen wurden gestresst und mit 𝛼V5 auf Rex gefärbt. In den ungestressten Zellen ist TIA dif-
fus im Zellkern verteilt und es findet keine Co-Lokalisation mit Rex und Staufen statt (siehe
Abbildung 13, oben). Erst unter Stressbedingungen wandert das Protein aus dem Zellkern ins
Cytoplasma und trägt dort zur Bildung von Stressgranula bei (siehe Abbildung 13, unten). In
den Stressgranula kann eine deutliche Co-Lokalisation mit Rex und Staufen beobachtet werden
(durch Pfeile markiert).
Abbildung 13: Nachweis des Staufen-abhängigen Rex-Transports in induzierte Stressgranula: HEK 293T-Zellen
wurden mit Rex-V5, Staufen-cherry und TIA-YFP transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit NaArsenit (0,5 mmol/L) für zwei Stunden gestresst. Anschließend erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung. Für die Detektion von Rex-V5 wurde ein 𝛼V5- und 𝛼mouseA647-Antikörper eingesetzt. Oben: Ungestresste
Zellen als Referenz. Während Rex und Staufen im Cytoplasma co-lokalisieren, ist TIA diffus im Cytoplasma verteilt. Unten: Gestresste Zellen. TIA ist aus dem Zellkern in cytoplasmatische Stressgranula eingewandert und colokalisiert dort mit Rex und Staufen.
4 Ergebnisse
XXVIII
Des Weiteren sollte überprüft werden, ob Rex und Staufen ebenfalls mit APOBEC3GKomplexen co-lokalisieren. Zu diesem Zweck wurden Rex-V5, Staufen-cherry und A3G-CFP
in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Nachdem die Zellen gestresst wurden, wurde Rex mittels
𝛼V5 angefärbt. Als Referenz wurden ungestresste Zellen mitgeführt, in denen A3G diffus im
Cytoplasma vorliegt und dort mit Rex und Staufen co-lokalisiert (siehe Abbildung 14, oben).
Durch die Zugabe von Na-Arsenit bilden sich deutliche A3G-Komplexe in den Zellen aus (siehe Abbildung 14, unten). Rex und Staufen können eindeutig in diesen Komplexen nachgewiesen werden (durch Pfeile markiert).
Abbildung 14: Nachweis der Co-Lokalisation von Staufen-gebundenem Rex und A3G-Komplexen: HEK 293TZellen wurden mit Rex-V5, Staufen-cherry und A3G-CFP transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit
Na-Arsenit (0,5 mmol/L) für eine Stunde gestresst. Anschließend erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung. Für die Detektion von Rex-V5 wurde ein 𝛼V5- und 𝛼mouseA647-Antikörper eingesetzt. Oben: Ungestresste Zellen als Referenz. Es findet eine diffuse Co-Lokalisation von Rex, Staufen und A3G statt. Unten: Gestresste Zellen. Rex und Staufen sind im Cytoplasma in A3G-Granula vorzufinden.
Die durchgeführten Co-Lokalisationsstudien weisen stark darauf hin, dass Staufen-1gebundenes HTLV-1 Rex-Protein unter Stressbedingungen in granuläre Strukturen im Cytoplasma transportiert wird. Unter anderem konnte gezeigt werden, dass Rex durch die Interaktion mit Staufen-1 in Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe einwandert.
5 Diskussion
5
XXIX
Diskussion
Der Transport von messenger RNA aus dem Zellkern ins Cytoplasma unterliegt strenger Regulation. Um die Translation fehlerhafter Proteine zu verhindern, gelangen ausschließlich korrekt
gespleißte mRNAs zu den Ribosomen, dem Ort der Proteinbiosynthese [16]. Virale Strukturproteine werden allerdings von ungespleißten bzw. nur teilweise gespleißten VolllängenmRNAs kodiert. Zudem darf das virale Genom, bestehend aus Volllängen-RNA, welches in
Viruspartikel eingebaut wird, nicht durch Spleißen zerstört werden. Diese Intron enthaltenen
mRNAs würden im Zellkern zurückgehalten werden bis sie schließlich gepleißt oder abgebaut
werden [15,16]. Retroviren haben jedoch Möglichkeiten entwickelt diesen Mechanismus zu
umgehen. Komplexe Retroviren kodieren neben den Strukturproteinen für sogenannte akzessorische Proteine. Durch die Bindung Intron enthaltener mRNAs verhindern akzessorische Proteine deren Spleißing und ermöglichen zusätzlich den Transport ins Cytoplasma [15,16]. Zu solchen Proteinen, die den cytoplasmatischen Export ungespleißter viraler mRNAs ermöglichen,
gehören das HERV-K Rec-, HIV Rev- und das HTLV Rex-Protein. Für die Ausführung ihrer
Funktion müssen sie mit zellulären Wirtsproteinen wie dem Kern-Exportfaktor Crm-1 interagieren [16]. Für die beiden Proteine Rec und Rev konnte zudem die Interaktion mit dem RNAbindenden Staufen-1 nachgewiesen werden [2,21]. Staufen ist einerseits an dem Transport zellulärer mRNAs zu den Ribosomen beteiligt [18]. Andererseits kann es die Translation reprimierter mRNAs oder deren Abbau bewirken [19,20]. Da die Proteine Rev und Rec strukturell
und funktionell verwandt mit Rex sind, beschäftigt sich diese Arbeit mit der Prüfung der Vermutung, dass Staufen-1 ein zellulärer Interaktionspartner von HTLV-1 Rex ist.
5.1
Interaktion von HTLV-1 Rex und Staufen-1
Um den Nachweis einer Interaktion zwischen Rex und Staufen zu erbringen, wurden die beiden
Proteine in Co-Immunpräzipitationen mit 𝛼V5-Sepharose eingesetzt. Rex-V5 wurde über den
C-terminal eingefügten V5-Tag an die Sepharose gebunden. Staufen-Flag hingegen konnte im
anschließenden Western Blot nur nachgewiesen werden, wenn es durch die Interaktion mit Rex
indirekt an das Trägermaterial gebunden wurde. Durch diesen Versuch konnte festgestellt werden, dass eine Interaktion zwischen Rex und Staufen stattfindet. Um dies mit Sicherheit sagen
zu können, bedarf es aber weiterer Immunpräzipitationsversuche mit reproduzierbaren Ergebnissen. Angesichts der Tatsache, dass die Interaktion mit Staufen bereits für HIV-1 sowie
5 Diskussion
XXX
HERV-K bestätigt werden konnte [2,21], könnte es sich hierbei um einen verbreiteten Mechanismus unter komplexen Retroviren handeln. In weiterführenden Experimenten könnte die Interaktion von HTLV-1 Rex und Staufen-1 mit weiteren Methoden wie z.B. der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestätigt werden.
Des Weiteren sollte durch Co-Lokalisationsstudien die Möglichkeit einer Interaktion zwischen
Rex und Staufen bekräftigt werden. In durchgeführten Immunfluoreszenzfärbungen des
HTLV-1 Rex-Proteins konnte zunächst festgestellt werden, dass sich der Großteil des Proteins
im Zellkern befindet. Ein weitaus geringerer Rex-Anteil ist zudem im Cytoplasma vorzufinden.
Diese Beobachtungen decken sich mit bereits publizierten Ergebnissen [16]. Die cytoplasmatische Lokalisation kann damit erklärt werden, dass das Protein im Cytoplasma translatiert und
erst anschließend durch das Kernlokalisationssignal (NLS) in den Zellkern geschleust wird.
Obwohl Staufen ebenfalls ein funktionales Kernlokalisationssignal besitzt, war das Protein
überwiegend im Cytoplasma und nur in seltenen Fällen im Zellkern vorzufinden. Dieser Umstand ist wahrscheinlich auf einen schnellen cytoplasmatischen Export zurückzuführen [21].
In anschließenden Co-Transfektionsversuchen und Immunfluoreszenzfärbungen mit Rex und
Staufen konnte die mittels Co-Immunpräzipitation festgestellte Interaktion bekräftigt werden.
Es konnte eine deutliche Co-Lokalisation der beiden Proteine im Cytoplasma sowie im Zellkern beobachtet werden. Dieses Ergebnis deckt sich mit Co-Lokalisationsstudien zu Rec bzw.
Rev und Staufen-1 [2,21]. Außerdem wies Rex in Gegenwart von Staufen eine stark veränderte
Lokalisation auf. Rex war überwiegend im Cytoplasma und nur noch zu einem geringen Anteil
im Zellkern lokalisiert. Diese Beobachtung konnte durch eine Staufen-Titration und anschließender Zellfraktionierung bestätigt werden. Mit steigender Staufen-Menge stieg der Anteil von
Rex im Cytoplasma. Dieser Umstand ist womöglich damit zu erklären, dass Staufen einem
schnellen cytoplasmatischen Export unterliegt [21]. Ist Rex an Staufen gebunden, wird es
wahrscheinlich ebenfalls schneller ins Cytoplasma ausgeschleust.
Im nächsten Schritt sollte die an der Interaktion mit Rex beteiligte Staufen-1-Domäne identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurden vier Staufen-Deletionsmutanten zusammen mit Rex in
Co-Immunpräzipitationen (IP) eingesetzt. Die Deletionsmutanten waren durch das Einfügen
von Stoppcodons in die Sequenz unterschiedlich weit C-terminal verkürzt worden. Allerdings
wurde die Mutante 1 bestehend aus den RNA-Bindedomänen (RBD) 2 und 3 nicht exprimiert.
Im Gegensatz zu Mutante 2, die aus RBD2 und 3 sowie dem vorderen Teil der RBD4 besteht,
konnte die Mutante 3 in der IP-Probe detektiert werden. Da Mutante 3 nur um den hinteren Teil
der RBD4 länger ist, könnte hier die interagierende Domäne vermutet werden. Die Staufen-
5 Diskussion
XXXI
Region, welche mit dem HERV-K Rec-Protein interagiert befindet sich ebenfalls im hinteren
Teil der RBD4 [2,21]. Sollte diese Region der RBD4 auch für die Interaktion mit Rex verantwortlich sein, hätte allerdings auch die Interaktion zwischen Rex und Mutante 4 stattfinden
müssen. Diese Mutante besteht aus den RNA-Bindedomänen 2, 3 und 4 sowie aus der TubulinBindedomäne, wurde aber nicht in der IP-Probe nachgewiesen. Eine mögliche Erklärung wären
Faltungsprobleme der Deletionsmutante 4, wodurch die Interaktion mit Rex beeinträchtigt
wurde. Der Versuch liefert somit nur einen Hinweis auf die beteiligte Domäne. Um die mit Rex
interagierende Staufen-1-Domäne exakt bestimmen zu können, müssen weitere Wiederholungen dieses Versuchs folgen.
5.2
Einfluss von Staufen-1 auf die Partikelbildung von HTLV-1
Ein wichtiger Teil dieser Arbeit war es die Auswirkungen der Interaktion des viralen Rex mit
dem humanen Staufen-1 auf die Partikelproduktion eines HTLV-1-Molekularklons zu untersuchen. Im Western Blot konnte ein positiver Effekt der Interaktion auf die Viruspartikelproduktion festgestellt werden. Verglichen mit Zellen, die ausschließlich mit dem Molekularklon
transfiziert wurden, konnte durch die Überexpression von Rex eine leicht erhöhte Partikelproduktion nachgewiesen werden. Da HTLV von sich aus Rex exprimiert, war durch die alleinige
Überexpression des Proteins keine massive Erhöhung zu erwarten. Im Gegensatz dazu konnte
durch die Co-Transfektion mit Staufen bzw. Rex und Staufen die Bildung von HTLV-Partikeln
stark gesteigert werden. Allerdings konnte der Blot aufgrund zahlreicher unspezifischer Banden
nicht optimal ausgewertet werden. Um das Ergebnis zu verbessern, könnte z.B. ein speziell
gegen Gag gerichteter Antikörper anstelle des HTLV-Vollserums eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit wäre der Einsatz eines Infrarot-markierten Antikörpers, um den Blot durch die
Messung der Bandenintensitäten am „Odyssey Infrared Imaging System“ besser auswerten zu
können.
Eine weitaus bessere Möglichkeit zur quantitativen Auswertung lieferte ein Assay zur Quantifizierung der Reversen Transkriptase-Aktivität. Es wurde bereits beschrieben, dass die Interaktion von Staufen-1 und Rec einen positiven Effekt auf die Partikelproduktion von HERV-K113
ausübt. Durch die Co-Transfektion eines HERV-K113-Provirus mit Staufen-1 konnte die Partikelproduktion um ein 20-faches gesteigert werden [2,21]. Mit dem durchgeführten RT-Assay
konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Aus der Überexpression von Rex resultierte
eine 3-mal höhere Produktion von HTLV-Partikeln, wohingegen die Co-Transfektion mit Stau-
5 Diskussion
XXXII
fen eine Steigerung um das 28-fache erzielte. Eine 23-mal höhere Produktion viraler Partikel
wurde durch die Überexpression beider Proteine erzielt. Mittels weiterer Wiederholungen des
Versuchs muss geklärt werden, ob das Ergebnis reproduzierbar ist. Eine mögliche Erklärung
für die verminderte Partikelproduktion durch Überexpression von Rex und Staufen im Gegensatz zu Staufen allein könnte in der regulatorischen Funktion des p13-Proteins zu suchen sein.
p13 ist ein weiteres akzessorisches HTLV-Protein, welches aus einfach gespleißter mRNA entsteht [p30,116]. Durch die zusätzliche Überexpression von Rex steigt der Anteil an ungespleißter und einfach gepleißter mRNA an, wodurch p13 verstärkt exprimiert werden kann. In Zellen,
die Tax exprimieren, ist p13 teilweise im Zellkern lokalisiert und bindet dort an das regulatorische Tax-Protein. Die Tax-abhängige Aktivierung der viralen Transkription wird durch die
Bindung an p13 vermindert. In der Folge werden die Expression viraler Strukturproteine und
die Produktion von Viruspartikeln herunterreguliert [p30,116]. Es wird vermutet, dass diese
Strategie dazu beiträgt die Detektion des Virus durch das Immunsystem zu verhindern.
Die Ergebnisse des Western Blots und des RT-Assays weisen darauf hin, dass durch eine alleinige Überexpression von Staufen verstärkt HTLV-Partikel gebildet werden. Es könnte vermutet
werden, dass an Rex gebundene virale mRNAs unter diesen Bedingungen verstärkt ins Cytoplasma transportiert werden. Das Resultat wäre eine erhöhte Expression viraler Strukturproteine, womit die beobachtete Steigerung der Partikelproduktion zu erklären wäre. Mithilfe von
RNA-Reporterkonstrukten, die u.a. für das Protein Luciferase kodieren, könnte z.B. ein verstärkter cytoplasmatischer Export viraler mRNAs überprüft werden.
5.3
Antivirale Abwehrmechanismen
Werden eukaryotische Zellen Stress ausgesetzt, tragen RNA-bindende Proteine wie TIA durch
Aggregation zu Bildung von sogenannten Stressgranula bei. Diese Granula beinhalten zudem
kleine ribosomale Untereinheiten, Transkriptionsinitiationsfaktoren und regulatorische Faktoren, die der antiviralen Abwehr dienen können [24,25]. Unter Stressbedingungen wird die
Translation der mRNAs vieler „housekeeping“-Proteine durch den Transport in Stressgranula
unterbrochen, um den RNA-Metabolismus verstärkt auf die Expression von Schutz- und Reparaturproteinen umzustellen [23]. Es ist bekannt, dass das RNA-bindende Staufen-1 in gebildete
Stressgranula einwandert [22]. Mittels Immunfluoreszenzfärbungen konnte festgestellt werden,
dass HTLV-1 Rex, genau wie HERV-K Rec und HIV-1 Rev [2,21], mit Staufen und dem
Stressprotein TIA co-lokalisiert. Demnach wird gebundenes Rex und womöglich virale mRNA
5 Diskussion
XXXIII
durch die Interaktion mit Staufen in Stressgranula transportiert. Allerdings konnte für HTLVinfizierte Zellen gezeigt werden, dass das regulatorische Tax-Protein unter Stressbedingungen
ins Cytoplasma wandert und dort die Bildung von Stressgranula verhindert [30]. Dieser Effekt
beruht auf der Bindung der Histon-Deacetylase 6, welche ebenfalls an der Bildung der Granula
beteiligt ist. Es wird vermutet, dass diese von HTLV entwickelte Methode zelluläre Stressbedingte Prozesse zu regulieren zum Überleben infizierter Zellen beitragen könnte [30].
In weiteren Immunfluoreszenzfärbungen konnte beobachtet werden, dass Rex zusammen mit
Staufen und APOBEC3G unter Stressbedingungen in granulären Strukturen co-lokalisiert. Für
bestimmte Staufen enthaltene HMMA3G-Subtypen wurde bereits beschrieben, dass sie unter
Stressbedingungen in Stressgranula einwandern können [28]. Es ist daher gut möglich, dass die
Co-Lokalisation von Rex und Staufen in Stressgranula stattfindet. Um dies zu prüfen, müssten
Co-Transfektionen und Immunfluoreszenzfärbungen von Rex und Staufen zusammen mit A3G
sowie TIA erfolgen. HMM-A3G-Komplexe sind zwar enzymatisch inaktiv, aber besitzen die
Fähigkeit die Retrotransposition retroviraler Elemente zu verhindern [28]. In wie fern die CoLokalisation von Rex mit diesem antiviralen Protein Auswirkungen auf die HTLV-Replikation
ausübt, muss in Zukunft geklärt werden.
6 Zusammenfassung
6
XXXIV
Zusammenfassung
Es besteht großes Interesse zelluläre Interaktionspartner von humanen Retroviren zu identifizieren. Das humane RNA-bindende Protein Staufen-1 wurde bereits als Interaktionspartner des
pathogenen HIV-1 Rev- und des endogenen HERV-K Rec-Proteins beschrieben. Basierend auf
der Vermutung, dass es sich bei der Interaktion mit Staufen-1 um einen verbreiteten Mechanismus unter komplexen Retroviren handelt, sollte in dieser Arbeit die Interaktion von HTLV-1
Rex mit dem humanen Staufen untersucht werden.
Für Interaktionsstudien zwischen dem humanen Staufen-1 und dem HTLV-1 Rex-Protein wurde die für maximale Expression codon-optimierte rex-Sequenz in den pcDNA4/V5-HisAVector kloniert, um einen C-terminalen V5-Tag einzufügen. Mittels Co-Transfektion und CoImmunpräzipitation von Rex-V5 und Staufen-Flag an 𝛼V5-Sepharose konnte im Western Blot
festgestellt werden, dass Staufen-1 mit dem Rex-Protein interagiert. Dies wurde durch Immunfluoreszenzfärbungen von Rex-V5 sowie Staufen-cherry exprimierender Zellen weiter bekräftigt. Rex und Staufen zeigten eine deutliche Co-Lokalisation in Zellkern und Cytoplasma. Verglichen mit Zellen, welche ausschließlich mit Rex-V5 transfiziert wurden, wies Rex zudem
eine erhöht cytoplasmatische Lokalisation auf. Diese Beobachtung lässt die Vermutung zu,
dass Rex durch die Interaktion mit Staufen verstärkt ins Cytoplasma geschleust wird. Die Bestimmung der interagierenden Staufen-1-Domäne erfolgte durch Co-Immunpräzipitation von
Staufen-1-Deletionsmutanten mit Rex-V5. Es konnte gezeigt werden, dass die RBD4-Region
wahrscheinlich an der Interaktion beteiligt ist. Um den Einfluss auf die Partikelproduktion zu
prüfen, wurden Rex-V5 und Staufen-Flag mit einem HTLV-1-Molekularklon co-transfiziert.
Die Virus-haltigen Kulturüberstände wurden durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und
mittels Western Blot und RT-Assay analysiert. Durch die Überexpression von Staufen wurde
eine Steigerung der Partikelproduktion um das 28-fache erzielt. In Co-Lokalisationsstudien mit
TIA und APOBEC3G sollten die Folgen der Interaktion für HTLV-1 in gestressten Zellen untersucht werden. Die Immunfluoreszenzfärbungen zeigten, dass an Staufen gebundenes Rex
unter Stressbedingungen in Stressgranula transportiert wird. Es konnten Co-Lokalisationen von
Rex-V5 und Staufen-cherry mit TIA-YFP sowie A3G-CFP in Arsenit-induzierten Stressgranula
beobachtet werden. Die Auswirkungen auf die Translation viraler mRNA in den Stressgranula
müssen in weiterführenden Experimenten geklärt werden.
7 Abstract
7
XXXV
Abstract
Human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) is the causative agent of adult T-cell leukemia
as well as HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis and was first discovered
in 1980. Understanding the exact mechanisms of such retroviral infections is important for the
development of new strategies for medical treatment. In order to replicate successfully, it is
necessary for retroviruses to interfere with their host cell metabolism. Identifying cellular proteins that play an important role during the life cycle of retroviruses is an important first step
towards gaining new insights into virus-host interactions. Human Staufen-1 has recently been
identified as an HIV-1 Rev and HERV-K Rec interacting protein and might contribute to the
transport of HTLV-1 RNA by binding to the accessory Rex protein. This work focuses on the
possible interaction between HTLV-1 Rex and human Staufen-1.
First, the HTLV-1 codon-optimized rex-sequence was cloned into the pcDNA4/V5-HisA vector adding a C-terminal V5-tag to Rex. The interaction between Rex and Staufen was confirmed by co-transfection and co-immunoprecipitation of Rex-V5 and Staufen-Flag. This was
confirmed by subsequent immunofluorescence experiments. Rex-V5 and Staufen-cherry were
observed to mainly co-localize in the cytoplasm and occasionally in the nucleus. In addition,
Rex-V5 showed an enhanced cytoplasmic localization compared to HEK 293T cells that were
transfected with Rex-V5 alone. These findings suggest that binding to Staufen results in an
enhanced nuclear export of Rex. The results of a further co-transfection and coimmunoprecipitation experiment using four Flag-tagged Staufen-1 truncation mutants and RexV5 indicated that the Staufen-1 interacting region was located within the RBD 4.
In order to investigate the impact of Rex-Staufen interaction on HTLV-1 particle production,
Rex-V5 and Staufen-Flag were co-transfected with an HTLV-1 molecular clone. The supernatants of transfected cells were ultracentrifuged and analyzed by means of immunoblot and RTassay. In comparison to HTLV-1 transfected cells, a surplus of Staufen increased the production of viral particles by a factor of 28. Furthermore, immunofluorescence microscopy revealed
the co-localization of Rex-V5 and Staufen-cherry with TIA-YFP and APOBEC3G in arsenide
stressed cells, suggesting that Rex is transported into stress granules. Future experiments should
investigate whether HTLV-1 RNA accumulates in such stress granules and the possible implications for virus replication.
8 Literaturverzeichnis
XXXVI
8
Literaturverzeichnis
1
Yoshida, M. (2005) Discovery of HTLV-1, the first human retrovirus, its unique regulatory mechanisms, and insights into pathogenesis. Oncogene 24, 5931–5937
Hanke, K. (2010) Funktionelle Charakterisierung der HERV-K Proteine Env und Rec,
Berlin
O'Brien, S. J., Troyer, J. L., Brown, M. A., Johnson, W. E., Antunes, A., Roelke, M. E.
and Pecon-Slattery, J. (2012) Emerging viruses in the Felidae: shifting paradigms. Viruses
4, 236–257
Takatsuki, K. (2005) Discovery of adult T-cell leukemia. Retrovirology 2, 16
Gallo, R. C. (2005) The discovery of the first human retrovirus: HTLV-1 and HTLV-2.
Retrovirology 2, 17
Matsuoka, M. (2005) Human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I) infection and the onset of adult T-cell leukemia (ATL). Retrovirology 2, 27
Hinuma, Y., Nagata, K., Hanaoka, M., Nakai, M., Matsumoto, T., Kinoshita, K. I., Shirakawa, S. and Miyoshi, I. (1981) Adult T-cell leukemia: antigen in an ATL cell line and
detection of antibodies to the antigen in human sera. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78,
6476–6480
Katri, P. and Ruan, S. (2004) Dynamics of human T-cell lymphotropic virus I (HTLV-I)
infection of CD4+ T-cells. C. R. Biol. 327, 1009–1016
Yoshida, M. (2010) Molecular approach to human leukemia: isolation and characterization
of the first human retrovirus HTLV-1 and its impact on tumorigenesis in adult T-cell leukemia. Proc. Jpn. Acad., Ser. B, Phys. Biol. Sci. 86, 117–130
Younis, I. and Green, P. L. (2005) The human T-cell leukemia virus Rex protein. Front.
Biosci. 10, 431–445
Boese, A., Sauter, M., Galli, U., Best, B., Herbst, H., Mayer, J., Kremmer, E., Roemer, K.
and Mueller-Lantzsch, N. (2000) Human endogenous retrovirus protein cORF supports
cell transformation and associates with the promyelocytic leukemia zinc finger protein.
Oncogene 19, 4328–4336
Kashanchi, F. and Brady, J. N. (2005) Transcriptional and post-transcriptional gene regulation of HTLV-1. Oncogene 24, 5938–5951
Kesic, M., Doueiri, R., Ward, M., Semmes, O. J. and Green, P. L. (2009) Phosphorylation
regulates human T-cell leukemia virus type 1 Rex function. Retrovirology 6, 105
Ye, J., Silverman, L., Lairmore, M. D. and Green, P. L. (2003) HTLV-1 Rex is required
for viral spread and persistence in vivo but is dispensable for cellular immortalization in
vitro. Blood 102, 3963–3969
Baydoun, H. H., Bellon, M. and Nicot, C. (2008) HTLV-1 Yin and Yang: Rex and p30
master regulators of viral mRNA trafficking. AIDS Rev 10, 195–204
Shida, H. (2012) Role of Nucleocytoplasmic RNA Transport during the Life Cycle of Retroviruses. Frontiers in microbiology 3, 179
Furic, L., Maher-Laporte, M. and DesGroseillers, L. (2008) A genome-wide approach
identifies distinct but overlapping subsets of cellular mRNAs associated with Staufen1and Staufen2-containing ribonucleoprotein complexes. RNA 14, 324–335
Miki, T., Takano, K. and Yoneda, Y. (2005) The role of mammalian Staufen on mRNA
traffic: a view from its nucleocytoplasmic shuttling function. Cell Struct. Funct. 30, 51–56
Kim, Y. K., Furic, L., Parisien, M., Major, F., DesGroseillers, L. and Maquat, L. E. (2007)
Staufen1 regulates diverse classes of mammalian transcripts. EMBO J. 26, 2670–2681
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
8 Literaturverzeichnis
XXXVII
20 Thomas, M. G., Martinez Tosar, L. J., Loschi, M., Pasquini, J. M., Correale, J., Kindler, S.
and Boccaccio, G. L. (2005) Staufen recruitment into stress granules does not affect early
mRNA transport in oligodendrocytes. Mol. Biol. Cell 16, 405–420
21 Hanke, K., Liedgens, L., Hohn, O., Kurth, R. and Bannert, N. ((eingereicht)) Staufen-1
interacts with HERV-K Rec and HIV-1 Rev to assist in nucleocytoplasmic RNA transport
and association with stress granules containing APOBEC3G
22 Thomas, M. G., Martinez Tosar, L. J., Desbats, M. A., Leishman, C. C. and Boccaccio, G.
L. (2009) Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.
J. Cell. Sci. 122, 563–573
23 Anderson, P. and Kedersha, N. (2006) RNA granules. J. Cell Biol. 172, 803–808
24 Mokas, S., Mills, J. R., Garreau, C., Fournier, M.-J., Robert, F., Arya, P., Kaufman, R. J.,
Pelletier, J. and Mazroui, R. (2009) Uncoupling stress granule assembly and translation initiation inhibition. Mol. Biol. Cell 20, 2673–2683
25 Beckham, C. J. and Parker, R. (2008) P bodies, stress granules, and viral life cycles. Cell
Host Microbe 3, 206–212
26 Imahashi, M., Nakashima, M. and Iwatani, Y. (2012) Antiviral Mechanism and Biochemical Basis of the Human APOBEC3 Family. Frontiers in microbiology 3, 250
27 Goila-Gaur, R. and Strebel, K. (2008) HIV-1 Vif, APOBEC, and intrinsic immunity. Retrovirology 5, 51
28 Chiu, Y.-L., Witkowska, H. E., Hall, S. C., Santiago, M., Soros, V. B., Esnault, C.,
Heidmann, T. and Greene, W. C. (2006) High-molecular-mass APOBEC3G complexes restrict Alu retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15588–15593
29 Sinha-Datta, U., Datta, A., Ghorbel, S., Dodon, M. D. and Nicot, C. (2007) Human T-cell
lymphotrophic virus type I rex and p30 interactions govern the switch between virus latency and replication. J. Biol. Chem. 282, 14608–14615
30 Legros, S., Boxus, M., Gatot, J. S., van Lint, C., Kruys, V., Kettmann, R., Twizere, J. C.
and Dequiedt, F. (2011) The HTLV-1 Tax protein inhibits formation of stress granules by
interacting with histone deacetylase 6. Oncogene 30, 4050–4062
XXXVIII
9 Anhang
9
9.1
Anhang
HTLV-1 corex-Sequenz
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
10
20
30
40
50
60
70
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AAGCTTGCCA CCATGCCCAA GACCAGAAGA AGGCCCAGAC GGTCCCAGAG CAAGAGGCCT CCTACCCCTT
AAGCTTGCCA CCATGCCCAA GACCAGAAGA AGGCCCAGAC GGTCCCAGAG CAAGAGGCCT CCTACCCCTT
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
80
90
100
110
120
130
140
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
GGCCTACAAG CCAGGGCCTG GACCGGGTGT TCTTCAGCGA CACCCAGAGC ACCTGTCTGG AAACCGTGTA
GGCCTACAAG CCAGGGCCTG GACCGGGTGT TCTTCAGCGA CACCCAGAGC ACCTGTCTGG AAACCGTGTA
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
150
160
170
180
190
200
210
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
CAAGGCCACA GGCGCCCCTA GCCTGGGCGA TTATGTGCGG CCTGCCTACA TCGTGACCCC CTACTGGCCT
CAAGGCCACA GGCGCCCCTA GCCTGGGCGA TTATGTGCGG CCTGCCTACA TCGTGACCCC CTACTGGCCT
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
220
230
240
250
260
270
280
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
CCCGTGCAGA GCATCAGAAG CCCTGGCACC CCTAGCATGG ATGCCCTGAG CGCCCAGCTG TACTCCAGCC
CCCGTGCAGA GCATCAGAAG CCCTGGCACC CCTAGCATGG ATGCCCTGAG CGCCCAGCTG TACTCCAGCC
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
290
300
310
320
330
340
350
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
TGTCTCTGGA CAGCCCCCCC AGCCCTCCTA GAGAACCTCT GAGGCCTAGC AGAAGCCTGC CCCGGCAGTC
TGTCTCTGGA CAGCCCCCCC AGCCCTCCTA GAGAACCTCT GAGGCCTAGC AGAAGCCTGC CCCGGCAGTC
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
360
370
380
390
400
410
420
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
TCTGATCCAG CCCCCTACCT TTCACCCCCC TAGCAGCAGA CCCTGCGCCA ACACACCTCC CAGCGAGATG
TCTGATCCAG CCCCCTACCT TTCACCCCCC TAGCAGCAGA CCCTGCGCCA ACACACCTCC CAGCGAGATG
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
430
440
450
460
470
480
490
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
GACACCTGGA ACCCTCCACT GGGCAGCACC AGCCAGCCTT GCCTGTTCCA GACACCCGAC AGCGGCCCTA
GACACCTGGA ACCCTCCACT GGGCAGCACC AGCCAGCCTT GCCTGTTCCA GACACCCGAC AGCGGCCCTA
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
500
510
520
530
540
550
560
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AGACCTGTAC ACCTTCTGGC GAGGCCCCTC TGAGCGCCTG TACAAGCACC AGCTTCCCAC CACCTAGCCC
AGACCTGTAC ACCTTCTGGC GAGGCCCCTC TGAGCGCCTG TACAAGCACC AGCTTCCCAC CACCTAGCCC
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
570
580
590
600
610
620
630
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AGGCCCTAGC TGTCCTACAC TCGAG~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
AGGCCCTAGC TGTCCTACAC TCGAGTCTAG AGGGCCCTTC GAAGGTAAGC CTATCCCTAA CCCTCTCCTC
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~GGTAAGC CTATCCCTAA CCCTCTCCTC
HTLV_coRex
coRex in pcDNA4A
V5-Tag
640
650
660
670
680
690
700
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
GGTCTCGATT CTACGCGTAC CGGTCATCAT CACCATCACC ATTGAGTTTA AACCCGCTGA TCAGCCTCGA
GGTCTCGATT CTACG~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~
XXXIX
9 Anhang
9.2
Sequenzierungprimer
Tabelle 3: Sequenzierungsprimer
Primer
T7_Promtor
BGH_rev
5‘  3‘ Sequenz
TAATACGACTCACTATAGGGA
TAGAAGGCACAGTCGAGG

Funktionelle Untersuchungen zum HTLV Rex-Protein und dem

Transcrição

Documentos relacionados

Ausgabe als pdf speichern

scinexx | T. rex schneller als Beckham: Dinosaurier konnten

- Staufen AG

KULTURPUNKT

DER GEDANKENGANG IN CICERO, DE RE PUBLICA 1,33,50

F-Kader-Datenbank BWLV

Pressemitteilung Gefährlichen Hautkrebs mit den

4. Ausgabe Dezember 2014

3. Ausgabe September 2014

05. Protokoll

Bearbeiten der Senderlisten (DVB-S)

Blutelektrifizierung nach Dr. Robert C. Beck