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Gentherapie: Klinische Erfolge und
Forschungsdesiderate
Individuum
Organe/Gewebe
Zellen
 100.000.000.000.000 im Erwachsenen
 > 1.000 Varianten
 lebenslange
l b
l
R
Regeneration
i
Omnis cellula e cellula (Virchow)
Gene
~ 25.000 pro Zelle
Mehrere Editionen
Komplexe Interaktionen
Epigenetische Kontrolle
Gefahr von Mutationen
~1017 Gene pro Individuum!
Ek k
Erkrankungen
infolge
i f l von Genfehlern
G f hl
Therapie mit korrigierten Genen
Information – Wirkort - Quantität
Wirkort im Genom
http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/Bilder/de/
Auswirkungen im Organismus?
Gentransfer: Prinzip
p
Milieu,
Pharmaka
= extrinsisch
Gene =
intrinsisch
Korrektur
• Genetische
G
ti h Erkrankung
Ek k
• Infektion
• Krebs
• Degenerative
Erkrankung
g
Funktionskontrolle
• Proliferation
P lif ti
• Fitness
• Migration
• Differenzierung
• Reprogrammierung
g
g
• Eliminierung
Aber nicht: Enhancement
http://www.ksta.de/ks/images/mdsBild/126
4186552512l jpg
4186552512l.jpg
Auf keinen Fall: Transgene Menschen
Man
Dr. Jekyll
D F
Dr.
Faustt
http://www.ksta.de/ks/images/mdsBild/126
4186552512l jpg
4186552512l.jpg
Somatischer Gentransfer:
Dreifache Dosisfindung
1-10:
1 10 25000
Transgen : Zelluläre Gene
1:100-1:1.000.000
Transgenprodukt:
andere RNA/Proteine
6 1011:10
1061014
Genmodifizierte Zellen : Körperzellen
Besonders geeignet: kleines Ziel
Ebenfalls besonders interessant: expandierbare
p
Zellen
http://www.jyi.org/articleimages/1077/origin
htt //
j i
/ ti l i
/1077/ i i
als/img0.jpg
GENTHERAPIE: Erfolge in klinischen Studien
~2000: Einzelfälle
~2020: Tausende
Krebs
(Phase III)
Hä
hili
Hämophilie
Stoffwechseldefekte
ALD, MLD, M. Parkinson
Netzhautdegeneration
S
Spender-gegen-Wirt
d
Wi t
Epidermolysis
bullosa
Immundefekte
(SCID, CGD, WAS, AIDS)
Speicherkrankheiten (ALD
(ALD, MLD)
Thalassämie
GENTHERAPIE: wachsendes Interesse Pharma/Biotech
~2000: Einzelfälle
~2020: Tausende
Roche
ALD, MLD, M. Parkinson
OBM
Novartis
Pfizer
Juno, …
Krebs
(Phase III)
Netzhautdegeneration
MolMed, …
Hä
hili
Hämophilie
Stoffwechseldefekte
TBD…
S
Spender-gegen-Wirt
d
Wi t
Epidermolysis
bullosa
Roche BBB
Roche,
BBB, Sangamo,…
Sangamo
Immundefekte
(SCID, CGD, WAS, AIDS)
(ALD MLD)
Speicherkrankheiten (ALD,
Thalassämie
Wachsende Bedeutung
• Vektor- und Zellproduktion
• Skalierung, Automatisierung
• Long-term follow-up
Gentransfer:: Vektorvielfalt
Gentransfer
Barrieren:
Serum
Blutzellen
Gewebeverbund
Zellmembran
Rezeptor
E d
Endosom
Electroporation
Kernmembran
Chromatin
Effizienz? Spezifität?
Antwort der Zelle?
Modified from Seow and Wood, Mol Ther 2009
Neue Werkzeuge für Gen
Gen--K.O. und homologe
Rekombination
Zunehmend
simpleres
Design
Electroporation
Nach Qasim & Thrasher, 2014
Zunehmende
Sicherheit
Off-Target Aktivität schwer zu detektieren
F kti
Funktionelle
ll Assays
A
notwendig
t
di
Neue retrovirale Vektoren reduzieren
das Risiko der Insertionsmutagenese
Transgen, nächste Generation
Retrovirales Transgen
En‐
hancer
SD
En‐
hancer
SA
cDNA
Pro‐ p(A)
moter
cDNA
Pro‐ p(A)
moter

Exon
Enhancer
Pro‐ codon‐ Ex‐
moter optim. port
lenti
SD
Repressive
Histone
SIN
p(A)
Promoter
SIN
p(A)

SA
Exon
Intron
p(A)
Zelluläres Gen
Chromosom
Alpharetroviral SIN Vectors
Suerth et al., J Virol 2010
Suerth et al., Mol Ther 2012
Kaufmann et al., Mol Ther 2013
High titer SIN vector production
Long-term
Long
term expression in mHSC
Reduced genotox in IVIM assay
Intergene Region
Vektorbiologie
Zellinteraktionen zunehmend besser verstanden, erweitertes Repertoir
Vektorforschung von zentraler Bedeutung
für die Entwicklung der Gentherapie
Brass, Elledge et al., Science 2008
GENTHERAPIE:
Prima Blut bald verfügbar?
g
Klinische Erfolge bei
Selektionsvorteil oder
nach hoher
Gentransferrate und
starker Konditionierung
Hämatopoese:: Gentherapie
Hämatopoese
Transfer redirected immune cells
Induce or overcome tolerance
Autoimmunity
Infection (anti HIV)
Cancer (redirected T cells)
Vaccination
Infection
Cancer
Monogenetic disorders
SCID-X1, SCID-ADA, CGD, WAS
Thalassemia
ALD, MLD
Sickle cell anemia,
Aplastic anemia (Fanconi, CAMT)
…
Acquired disorders
Cancer (Chemoprotection)
Infection (HIV)
Red = efficiency demonstrated in clinical trials
Underlined = SAE related to insertional mutagenesis
Italics = clonal skewing observed without SAE
Blue = animal model promising
Protein delivery
y
Metabolic enzymes
Coagulation factors
Erste Erfolge und Probleme
Gene marking
Brenner et al
al., Lancet 1993
Trace origin of relapse
ADA-SCID
36 pts. treated
Most patients with benefit
No SAE
SCID X1
SCID-X1
20 pts. treated in Paris/London
Most patients with benefit
5 SAE, Leukemias
CGD
2 pts.
t treated
t t d in
i F
Frankfurt,
kf t
2 pts. in Zürich
Transient benefit
3 Pre-MDS,, Monosomyy 7
WAS
9 pts. treated in Hannover,
>5
5 pts.
t in
i Mil
Milan, P
Paris,
i …
Strong benefit
High risk of ALL, AML in Hannover
Gene transfer for SCID‐X1 using a self‐inactivating gammaretroviral vector
A multi‐institutional phase I/II trial evaluating the treatment of SCID‐X1 patients with retrovirus‐mediated gene transfer
Sites:
Great Ormond Street Hospital, UK (1)
Hôpital Necker Enfants Malades, France (5)
Children’s Hospital Boston, US (2)
Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, US (2)
M
Mattel Children’s Hospital, Los Angeles, US (1)
l Child ’ H i l L A l US (1)
Pei et al., in revision
Kinetics of T lymphocyte recovery
Combined first trial ((UK + Paris)) and current trial
(US) data
p = 0.4
10000
CD3++/l
1000
Integrome (F. Bushman)
LMO2 cluster not detected
Evi1 cluster not detected
Significantly less clones with
integrations in protooncogenes
100
10
SCID 1
SCID 2
m
12
6m
4m
3m
2m
1m
G
e
pr
2‐sided Wilcoxon rank‐sum test
T
1
Months after gene therapy
David Williams, SYP, previous trial data courtesy of A. Thrasher, S. Hacein-Bey-Abina
Hämatopoetische Stammzellen
Effizienz nicht mehr limitierend (Biffi et al., 2013)
Prävention der Insertionsmutagenese durch
Vektordesign (Pei et al
al., in revision)
Allerdings: interindividuelle Varianz
Langzeitrisiko unklar
Ziele
Aussagefähige Toxikologie
- Insertionsmutagenese
- Änderung der Stammzelleigenschaften
Vektorentwicklung
- Integrationsspektrum
- Gestaltung der Transgenkassette
Vektor- und Zellproduktion
- reproduzierbar, semi-automatisch
Aussicht
Routine für monogene Defekte
- Speicherkrankheiten
- Thalassämie, Sichelzellanämie
- Immundefizienzen
- …
Anwendung
A
d
für
fü erworbene
b
Erkrankungen
- HIV
- Krebs
K b
Entwicklung „reifzelliger“ Produkte
- Monozyten
- Granulozyten
- Plättchen, ...
Redirektionierte T-Zellen
Cancer Cell
T lymphocyte infusions against cancer
Qasim & Trasher 2014
Redirektionierte T-Zellen
Effizienz nicht mehr limitierend
Beginnende Routine bei ausgewählten Indikationen
Risiko infolge hoher Wirksamkeit
- Tumorlyse
y
- Zytokinsturm
- Antigen auf gesunden Zellen
Ziele
Aussagefähige Toxikologie
- Antigenspezifität
Vektorentwicklung
- Gestaltung der Transgenkassette
- Suizidgen
Vektor und Zellproduktion
Vektor- reproduzierbar, semi-automatisch
Aussicht
Routine bei definierten Antigenen
- CD19
- …
Universelle T-Zellen
- TCR k.o.
- Induzierte T-Zellen
Hämophilie
Effizienzgrenze überwunden (F. IX)
Langzeiteffekte nachweisbar
Risiko der T-Zellantwort
- Transienter Effekt,, beherrschbar
Unklares Risiko der Insertionsmutagenese
Aussicht
Massive Reduktion der
Therapiekosen und erhöhte LQ
Applikation auch für andere
Gendefekte
Ziele
Aussagefähige Toxikologie
- Insertionsmutagenese in Hepatozyten
- Kofaktoranalyse
Vektorentwicklung
- „Stealth“ AAV
- Dosisreduktion durch Effizienzsteigerung
Vektorproduktion
- Skalierung
Nair et al., 2014
Patient-specific iPSCs creates fascinating avenues in
Patientin disease modeling
g and regenerative
g
medicine
Nishikawa et al. 2008, Nat Rev Mol Cell Biol
„Alles in 1“‐Genvektor zur Reprogrammierung
Titer determined by qPCR ≈ 1x107 t.u./ml
Geburt einer Stammzelle
Unmodifiziert/
keine Zelle
Day 4.5
Genmodifizierte
Zelle
Reprogrammierte
Zelle (pluripotent)
fibroblasts
Day 8
Day 11
11.5
5
iPS cells
Eva Warlich
T bi C
Tobias
Cantz
t
Hans Schöler
Timm Schröder
Axel Schambach
iPSC entstehen in Patchwork-Kolonien
Kulturadaptierung induziert pluripotenter Stammzellen (iPSC)
1
Amplifikationen
• Chr 12p (or Trisomy) [NANOG, CCND2; …]
• Chr 17q [BIRC5, …]
• Chr X [ELK1, ARAF, …]
• …
Mutanten
M
nfrequenzz
in Popu
ulation
Humane pluripotente Stammzellen
0,1
0,01
SCF, IL3
,
Medium
Medium 1
1
0 001
0,001
Medium 2 ?
STIF
0,0001
0 00001
0,00001
Ähnlich in Keimbahntumoren
0,000001
0
10
20
30
Tage in Kultur
in Kultur
Zelldichte
Medium Additiva
Medium, Additiva
Stromazellen
Splitting Methode
O2 Sättigung
O2 Sättigung
…
Schlechte Kulturen
fördern Mutanten
Gute Kulturen
unterdrücken Mutanten
40
50
Identität und Kontrolle induziert pluripotenter Stammzellen (iPSC)
RMCE
Genkassettenaustausch (RMCE)
zur Kontrolle des Zellverhaltens
Fußabdruck des Vektors als Personalausweis“ als „Personalausweis
des iPSC‐Klons
= Genmarkierung
(Sensitivität 1:100.000)
(Sensitivität ~1:100.000)
Voelkel et al., PNAS 2010; Ellis et al., Cell Stem Cell 2010; Kühle et al., Mol Ther 2014
Induzierte Stammzellen
Forschung top, Applikation ?
Klonale Herkunft per se kein Heilsversprechen
Risiko der genetischen Instabilität
Unklares Risiko der Immunantwort
Ziele
Aussagefähige Toxikologie
Zellproduktion
- Prozessoptimierung
- Skalierung
Aussicht
Transdifferenzierung (polyklonal)
Gentransfer zur Kontrolle des
Zellverhaltens

•
Gentherapie öffnet neue therapeutische Möglichkeiten für schwere Erkrankungen
•
Aussichten maßgeblich abhängig von methodischer Entwicklung, adäquaten
p
, quantitativer
q
Toxikologie
g
Krankheitsmodellen und spezifischer,
•
Technische, biologische und ethische Grenzen der Anwendungen antizipierbar
•
Faire, evidenzbasierte Risiko-Nutzen-Abwägung notwendig
•
Wachsendes Engagement der Pharmaindustrie
•
Balance von Grundlagenwissenschaft und translationaler Forschung notwendig
•
Zunehmende Bedeutung der synthetischen Biologie
Thank you!
y
Vector development, reprogramming:
Julia Sürth, Johannes Kühle, Juliane Schott, Verena Thies, Tobias Mätzig,
M l i Galla,
Melanie
G ll A
Axell S
Schambach
h b h
Collaborators
Insertional mutagenesis, transformation, hematopoietic regeneration:
David Williams
Olga Kustikova, Martijn Brugman, Adrian Schwarzer, Bernhard Schiedlmeier.
Punam Malik
Niels Teng Cheong Ha, Ute Modlich
Manuel Grez
Heinz
Adrian Thrasher
Marina Cavazzana-Calvo Targeted genome modification:
Daniel
Boris Fehse
Sö
T
Jü
B d
Sören
Jürgen
Bode
Dirk Turan,
Wicke
Christof von Kalle
Heckl
Hans Schöler
Tobias Cantz
Thomas Moritz
Timm Schröder
Brigitte Schlegelberger