Agrobacterium tumefaciens E BIOBALÍSTICA: EFICIÊNCIA EM

Área: Biotecnologia
Agrobacterium tumefaciens E BIOBALÍSTICA: EFICIÊNCIA EM FEIJÃO-CAUPI
(Vigna unguiculata (L.) Walp.).
Hayana Millena de Arruda Azevedo1; Francisco José Lima Aragão2; Ana Maria Benko-Iseppon3
1
Bióloga, Aluna de Doutorado, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Morais Rego 1235, CEP 50.670-420, Recife, PE. E-mail:
[email protected].
2
Engº Agrônomo, Pesquisador, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen), Parque Estação Biológica, Asa Norte, CEP
70.777-901, Brasilia, DF.
3
Bióloga, Pesquisadora, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Morais Rego 1235, CEP 50.670-420, Recife, PE.
Resumo – Importante leguminosa utilizada na alimentação humana, o feijão-caupi vem aumentando seu
potencial produtivo ao longo dos anos, embora ainda não tenha atingido sua potencialidade máxima. A
biotecnologia tem tornado possível uma redução dos danos devido a pragas e doenças, além de aumentar a
tolerância a alguns estresses abióticos. A transformação genética de plantas utilizando ferramentas como a
transferência indireta de genes via Agrobacterium tumefaciens ou direta através da biobalística é aplicada a mais
de 120 espécies de plantas. Como são tecnologias importantes e sabendo-se que já foram estabelecidos
protocolos com objetivos diferentes, o presente trabalho teve como finalidade revisar o tema, dando ênfase à
eficiência de ambas as técnicas e ressaltando os fatores atribuídos ao sucesso de cada experimento. Em feijãocaupi, no caso da transferência indireta de genes a diferença na eficiência dos resultados vem sendo atribuída a
fatores como o genótipo da planta, o explante, o procedimento de cocultivo, o meio de inoculação e a cepa da
Agrobacterium. Já na Biobalística, os diferentes autores atribuem o sucesso dos seus trabalhos os componentes
do vetor plasmidial. Em virtude de ambas envolverem respostas genótipo-dependentes (especialmente em feijãocaupi), comparações entre frequências de transformação devem ser feitas apenas com a finalidade de se obter um
parâmetro quantitativo.
Palavras-chave: Vigna unguiculata, Agrobacterium tumefaciens, Biobalística.
Introdução
Uma vez que o sistema de produção do feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp.) exige significativo
trabalho manual, a cultura tem uma cadeia produtiva onde predomina a agricultura familiar nas regiões Norte e
Nordeste, regiões carentes da aplicação de tecnologias modernas pelo pequeno agricultor (FREIRE-FILHO et
al., 2011). Nos últimos dois séculos, as tecnologias modernas têm melhorado as práticas agrícolas, aumentando,
assim, os métodos convencionais de melhoramento de plantas. No entanto, vários fatores bióticos e abióticos têm
gerado demandas por melhorias na produtividade, bem como na qualidade das colheitas. A engenharia genética
de plantas oferece novos caminhos, tendo se tornado uma das mais importantes ferramentas moleculares no
melhoramento vegetal (BARAMPURAM & ZHANG, 2011).
A biotecnologia tem o potencial de reduzir as perdas de colheitas devido a pragas e doenças, de melhorar
a eficiência dos nutrientes dos alimentos, além de aumentar a tolerância aos estresses inerentes às plantas
permitindo maior tolerância a condições ambientais extremas como frio e seca (MOHAMMED & ABALAKA,
1
2011). A engenharia genética de plantas utilizando ferramentas biotecnológicas como a transferência indireta de
genes via Agrobacterium tumefaciens – método que utiliza uma bactéria que ocorre naturalmente – ou direta
através do bombardeamento de micropartículas – envolvendo o emprego de meios mecânicos – ou ainda uma
combinação de ambos, vem sendo aplicada a mais de 120 espécies de pelo menos 35 famílias de plantas,
incluindo aquelas de importância econômica, ornamental e medicinal (MOHAMMED & ABALAKA, 2011).
Transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens e por Biobalística
A bactéria patogênica A. tumefaciens é encontrada no solo, tendo a transformação de plantas mediada
por cepas manipuladas (não patogênicas) desta bactéria, se tornando o método mais utilizado para a introdução
de genes em células vegetais com subsequente regeneração de plantas transgênicas (RIVA et al., 1998).
Apresenta capacidade de infectar naturalmente locais injuriados em plantas dicotiledôneas causando a formação
de tumores com posterior transferência de um segmento de DNA do plasmídeo chamado de T-DNA para dentro
do genoma do hospedeiro (ALIMOHAMMADI & BAGHERIEH-NAJJAR, 2009). Sabe-se também que a
introdução de um gene exógeno para o T-DNA pode permitir a sua transferência para o núcleo da célula vegetal,
levando à transformação de plantas utilizando uma versão oncogênica, porém desarmada, do plasmídeo Ti que
poderia transferir o DNA para plantas sem causar a produção de tumores (MOHAMMED & ABALAKA, 2011).
Para a transformação de plantas, a expressão transiente é normalmente usada devido à sua elevada
precisão e reprodutibilidade, apesar de ser limitada a algumas espécies não recalcitrantes e de exigir a construção
complicada de um vetor binário. Por outro lado, há também a transferência direta de genes que pode ser aplicada
em todos os tecidos vegetais, tanto de mono como dicotiledôneas, além de poder fazer uso de qualquer vetor
plasmidial. No entanto, são necessários dispositivos especiais para a projeção das partículas até o meristema alvo
(CHENG et al., 2009). Por sua vez, o sistema de bombardeamento de micropartículas foi criado, em parte, para
compensar as limitações do sistema de Agrobacterium tumefaciens, tornando-se o método mais eficiente de
transferência direta de genes (ZIOLKOWSKI, 2007). Para o bombardeamento de micropartículas devem ser
considerados vários fatores e parâmetros para a transferência bem sucedida do gene, sendo o primeiro parâmetro
biológico a concepção de um apropriado vetor plasmidial (KIKKERT et al., 2004).
A fase de aceleração de partículas envolve a projeção das micropartículas já revestidas com a DNA a ser
transferido (ZIOLKOWSKI, 2007). Na fase de separação, os aglomerados de partículas são acelerados até se
aproximarem do tecido a ser transformado, decompondo-se em partículas menores. A terceira fase é o processo
de desaceleração. Esta etapa tem lugar depois que as partículas entram no tecido a ser transformado. Ao atingir o
tecido, elas se movem com uma velocidade decrescente até chegar às células-alvo (ZHANG et al., 2007). Esta
tecnologia é limitada devido a alguns inconvenientes, tais como a integração multi-cópias do transgene desejado,
além de sequências supérfluas de DNA associadas ao vetor plasmidial (BARAMPURAM & ZHANG, 2011). No
entanto, a biobalística tornou-se uma ferramenta útil, uma vez que tem permitido o direcionamento de um gene
específico a um sítio pré-determinado no genoma de uma planta (ZIOLKOWSKI, 2007). Além disso, é o único
método bem sucedido de transformação disponível para certos genótipos (TAYLOR & FAUQUET, 2002).
Agrobacterium tumefaciens e Biobalística: Eficiência em Feijão-Caupi
Garcia et al. (1986, 1987) foram os primeiros a usar Agrobacterium tumefaciens em feijão-caupi,
mostrando estabilidade na integração do gene e sua expressão. Porém, apenas 10 anos após a confirmação da
2
viabilidade da técnica é que se produziu o primeiro exemplar geneticamente modificado (MUTHUKUMAR et
al., 1996). Por sua vez, a técnica de biobalística levou também um tempo considerável para gerar o primeiro
relato de transformação da espécie através das pesquisas de Ikea et al. (2003).
Diferenças na eficiência da transformação via A. tumefaciens podem ser atribuídas a vários fatores como
o genótipo da planta, o tipo do explante, o procedimento de cocultivo, componentes do meio de inoculação e o
tipo de cepa da Agrobacterium (WU et al., 2003).
Em relação aos tecidos-alvo, diversos trabalhos foram elaborados fazendo uso, primeiramente, de discos
foliares (GARCIA et al., 1986; 1987), embriões maduros (PENZA et al., 1991), cotilédones (MUTHUKUMAR et al.,
1996), evoluindo para o uso dos nós cotiledonares – região onde o embrião se insere no cotilédone (UMAHARAN
et al., 1997; POPELKA et al., 2006; CHAUDHURY et al., 2007; SOLETTI et al., 2008; RAVEENDAR &
IGNACIMUTHU, 2010). Essa mudança no explante usado para introdução do gene deve-se à maior totipotência
dos meristemas de nós cotiledonares (RAVEENDAR & IGNACIMUTHU, 2010).
Os primeiros a aplicarem modificações protocolares com o objetivo de estabilizar o processo de
integração das características nas progênies foram Popelka et al. (2006), obtendo uma frequência de
transformação de 0,15%. Os parâmetros alterados pelos autores foram mudanças no tipo de explante, a adição da
citocinina BAP (6-Benzilaminopurina) para alongamento e, paralelamente, remoção da auxina no estágio de
desenvolvimento proliferativo, além de suplementarem o meio cultura com um composto thiol que inibe a
resposta de defesa das plantas induzida por patógenos.
Adesoye et al., (2010) atribuíram ao sucesso da eficiência de transformação (3,9%) do seu trabalho a
presença do surfactante Silwet e do composto fenólico acetoseringona. O primeiro reduz a tensão superficial e
mantém a suspensão bacteriana por mais tempo na planta, melhorando, assim, a penetração da bactéria nos
espaços intercelulares (ADESOYE et al., 2010). Já a acetoseringona é um indutor fenólico que promove a
expressão dos genes de virulência da Agrobacterium que mediam a integração do T-DNA (WU et al., 2003).
Raveendar e Ignacimuthu (2010) associaram à sua taxa de transformação (1,61%) o tipo de cepa da
Agrobacterium. Nesse caso foi utilizada a LBA 4404 carregando o vetor binário pCAMBIA. Resultado bastante
próximo a esse foi o apresentado por Solleti et al. (2008) que obtiveram um percentual de 1,64% utilizando a
mesma cepa, mas carregando um vetor diferente. Por sua vez, Chaudhury et al. (2007) fizeram uso de uma cepa
distinta e apresentaram uma eficiência de transformação abaixo das anteriores (0,76%), como mostra o Quadro 1.
Quadro 1. Principais trabalhos com feijão-caupi envolvendo o uso da Agrobacterium
tumefaciens e as características fundamentais de suas abordagens.
Citação
Garcia et al., 1986
Garcia et al., 1987
Penza et al., 1991
Muthukumar et al., 1996
Kononowicz et al., 1997
Umaharan et al., 1997
Popelka et al., 2006
Chaudhury et al., 2007
Solleti et al., 2008
Adesoye et al., 2010
Raveendar e Ignacimuthu, 2010
Cepa da
Agrobacterium
C58C1
C58C1
A281/C58
LBA4301
LBA4404
não relatado
não relatado
EHA105
LBA4404
pGV3850
LBA4404
Gene
Tecido-alvo
CPMV
CPMV
neo/gus
hpt
αAI-1
αAI-1
gus
gus
gus
gus
gus
Discos foliares
Discos foliares
Embriões maduros
Cotilédones
Eixos embrionários
Nós cotiledonares
Nós cotiledonares
Nós cotiledonares
Nós cotiledonares
Eixos embrionários
Nós cotiledonares
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Kononowicz et al. (1997) foram os primeiros a relatar a tentativa de transformação de embriões de feijãocaupi por transferência direta de genes, mas com resultados insatisfatórios. Subsequentemente, apenas dois
estudos foram relatados para a espécie com a aplicação da mesma técnica. Por sua vez, Ikea et al. (2003) não
obtiveram resultados que comprovassem a segregação mendeliana dos transgenes, além de não terem reportado
uma frequência de transformação e os métodos de regeneração. Contudo, Ivo et al. (2008) obtiveram a taxa de
0,9%. Os três trabalhos acima citados fizeram uso do GUS (β-Glucoronidase) como gene repórter. Kononowicz
et al. (1997) não relataram o uso de genes de seleção para sua pesquisa. Já Ikea et al. (2003), de forma
inovadora, relataram um sistema viável de transformação através da biobalística, no entanto, com uso de outros
genes exógenos além da característica de interesse. Eles usaram um plasmídeo contendo o gene repórter uidA
que codifica a β-glucuronidase e um gene marcador de seleção (bar), que codifica a fosfinotricinaacetiltransferase (glufosinato), uma enzima que confere resistência ao herbicida biolaphos.
Visando minimizar os efeitos danosos na transformação direta, Aragão et al. (2000) desenvolveram um
vetor circular que não possui genes de resistência contra antibióticos para a produção de soja (Glycine max)
transgênica. Este sistema contém um gene mutante isolado de Arabidopsis thaliana (ahas) utilizado para
selecionar células meristemáticas transgênicas após sua introdução, tendo como principal característica a
resistência ao Imazapyr, uma molécula herbicida que se transloca até a região apical da planta, ou seja, a mesma
área usada para a inserção do gene de interesse, não havendo nenhum fator limitante que possa impedir sua
ampla utilização em qualquer sistema de transformação utilizando a seleção de células do meristema apical
(ARAGÃO et al., 2000). Assim, pesquisadores do mesmo grupo (IVO et al., 2008) obtiveram sucesso na sua
frequência de transformação devido ao fato de terem desenvolvido um sistema de bombardeamento de
micropartículas revestidas com o DNA exógeno para a introdução do gene nas células do meristema apical em
combinação com o herbicida Imazapyr, baseando-se nas descobertas de Aragão et al. (2000). Novas aplicações
com estas metodologias estão sendo desenvolvidas por nosso grupo visando à transformação de feijão-caupi com
um gene codificante para um peptídeo antimicrobiano (uma defensina) com resultados preliminares bastante
promissores.
Conclusões
Em virtude das diversas variáveis tanto entre os trabalhos usando a mesma técnica e os trabalhos com
metodologias diferentes, especialmente pelo fato de ambas envolverem respostas genótipo-dependentes,
comparações entre frequências de transformação em feijão-caupi devem ser feitas apenas com a finalidade de se
obter um parâmetro quantitativo e não para se concluir definitivamente quais as melhores aplicações de forma
generalizada.
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