Doktorarbeit final Druck

Transcrição

Aus der Klinik für Innere Medizin, Schwerpunkt Nephrologie
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. J. Hoyer
Des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität
Philipps
Marburg
Funktionelle Bedeutung des
TRPV4
TRPV4-Kationenkanals
bei endothelvermittelten
Vasodila
Vasodilatationsprozessen
Inaugural
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin
dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität
Philipps Universität Marburg
vorgelegt von Veronika Hartmannsgruber aus Hof/Saale
Marburg, 2010
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg
am: 24.06.2010
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund
Referent: PD Dr. R. Köhler
Korreferent: PD Dr. H. Braun
2. Korreferent: Prof. Dr. G. Lüers
2
Inhaltsverzeichnis
I INHALTSVERZEICHNIS:
I INHALTSVERZEICHNIS:................................................................................. 3
II ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS:...................................................................... 5
III ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................... 7
IV TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................ 8
1. Einleitung ...................................................................................................... 9
1.1 Das Endothel und die Blutdruckregulation ................................................ 9
1.1.1 Überblick über die Endothelfunktionen ............................................... 9
1.1.2 Ca2+ und die Endothelfunktion.......................................................... 10
1.2 Die Endothelfunktion und beteiligte Ionenkanäle .................................... 12
1.2.1 Kationenkanäle der TRP-Genfamilie ................................................ 12
1.2.2 TRPV4-Kanäle ................................................................................. 14
1.2.2.1 TRPV4-Gen ............................................................................... 14
1.2.2.2 Bau ............................................................................................ 14
1.2.2.3 Gewebeexpression des TRPV4 ................................................. 15
1.2.2.4 Aktivierung ................................................................................. 16
1.2.2.4.1 Physikalische Reize ............................................................ 16
1.2.2.4.2 Regulation der Kanalaktivität durch intrazelluläre secondMessanger und pharmakologische Öffner ......................................... 18
1.2.2.5 Phänotyp der TRPV4-KO-Maus................................................. 19
1.2.3 Die TRP-Kationenkanäle im Endothel .............................................. 22
1.2.4 Der TRPV4-Kanal und die Endothelfunktion .................................... 22
2. Fragestellung .............................................................................................. 25
3. Material und Methoden .............................................................................. 27
3.1 Substanzen ............................................................................................. 27
3.2 Geräte ..................................................................................................... 28
3.3 Vorgehensweise ..................................................................................... 29
3.4 Tiere........................................................................................................ 30
3.5 Gewichtsmessungen............................................................................... 30
3.6 Genotypisierung ...................................................................................... 30
3.6.1 Probenentnahme .............................................................................. 30
3.6.2 PCR.................................................................................................. 31
3.6.3 Gelelektrophorese ............................................................................ 32
3.7 Immunhistochemie .................................................................................. 33
3.8 Western blot............................................................................................ 33
3.9 Gefäßpräparation .................................................................................... 34
3.10 Elektrophysiologie ................................................................................. 34
3.11 Druckmyograph .................................................................................... 35
3.11.1 Versuchsaufbau ............................................................................. 35
3.11.2 Versuchsablauf............................................................................... 37
3.11.3 Datenaufzeichnung ........................................................................ 39
3.12 Statistische Analysen ............................................................................ 39
3
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse .................................................................................................. 40
4.1 Western Blot und Immunhistochemie ..................................................... 40
4.2 Elektrophysiologie ................................................................................... 41
4.2.1 4αPDD ............................................................................................. 41
4.2.2 Arachidonsäure ................................................................................ 42
4.2.3 Hypoosmotischer Stress .................................................................. 43
4.3 Untersuchungen am Druckmyographen ................................................. 45
4.3.1 Gefäßelastizität bei TRPV4-/--Mäusen .............................................. 45
4.3.2 Kontraktion und Relaxation mit PE und SNP ................................... 46
4.3.3 4αPDD-induzierte Vasodilatation ..................................................... 48
4.3.4 TRPV1 im Zusammenhang mit TRPV4 ............................................ 49
4.3.5 NO- und EDHF-mediierte Vasodilatation in TRPV4-defizienten
Mäusen ..................................................................................................... 50
4.3.6 Vasodilatation auf Erhöhung der Wandschubspannung................... 51
4.3.7 Flussinduzierte Vasodilatation .......................................................... 52
5. Diskussion .................................................................................................. 55
5.1 Elektrophysiologische Charakterisierung des endothelialen TRPV4 am
Endothel der murinen A.c.c........................................................................... 55
5.2 Bedeutung des TRPV4 für die Regulation des Gefäßtonus .................... 56
5.2.1 Einfluss von TRPV4 auf Gefäßelastizität und Kontraktilitaet der A.c.c.
.................................................................................................................. 56
5.2.2 TRPV4 und 4αPDD-induzierte Vasodilatation .................................. 57
5.2.3 TRPV4 und azetylcholininduzierte NO- und EDHF-mediierte
Vasodilatation............................................................................................ 58
5.2.4 TRPV4 und dessen Beitrag zur wandschubspannungsinduzierten
Vasodilatation............................................................................................ 59
5.2.5 Flussinduzierte Vasodilatation .......................................................... 61
5.3 Pharmakologische Relevanz .................................................................. 62
6. Zusammenfassung ..................................................................................... 63
7. Literaturverzeichnis ................................................................................... 64
8. Lebenslauf .................................................................................................. 72
9. Verzeichnis der akademischen Lehrer ..................................................... 73
10. Danksagung .............................................................................................. 75
11. Ehrenwörtliche Erklärung ........................................................................ 77
4
Abkürzungsverzeichnis
II ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS:
[Ca2+]frei
freie Ca2+-Konzentration
[Ca2+]i
intrazelluläre Ca2+-Konzentration
µmol/L
Mikromol/L (mikromolar)
4αPDD
4α-Phorbol-12,13-Didecanoat
4αPMA
4α-Phorbol-12-Myristate-13-Acetate
AACOCF3
1,1,1-Trifluormethyl-6,9,12,15-Heieicosatetraen-2-one
A.c.c.
Arteria carotis communis
AA
Arachidonsäure
ACh
Azetylcholin
ATP
Adenosin-5’-triphosphat
CaMBD
Calmodulin-Bindungsdomäne
CAEC
carotid artery endothelial cells (Endothelzellen der Arteria
carotis communis)
COX
Zyklooxygenase
dNTPs
Desoxynukleosidtriphosphate
EC50
Halbmaximale Effektivkonzentration
EDHF
endothelium derived hyperpolarizing factor (endothelialer
hyperpolarisierender Faktor)
EDTA
Ethylendiamintetraazetat
EET
Epoxyeicosatriensäure
HEPES
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N´-(2-ethansulfonsäure)
HTS
hypotones Zellschwellen
I
Stromstärke
If
Kompensationsstrom
IP3
Inositoltrisphosphat
KO/-/-
Knock-out
L-NNA
NG-Nitro-L-Arginin
Mmol/L
Millimol/L (millimolar)
mV
Millivolt
MSC
mechanosensitive Ca2+-permeable cation channel
(mechanosensitiver Ca2+-permeabler Kationenkanal)
5
Abkürzungsverzeichnis
n
Versuchsanzahl
nmol/L
Nanomol/L (nanomolar)
NO
Stickstoffmonoxid
NOS
NO-Synthase
p
Wahrscheinlichkeit
pA
Pikoampere
PBS
Phosphatgepufferte saline Lösung
PCR
polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
PE
Phenylephrin (Vasokonstriktion durch agonistische Wirkung
am α1-Adrenorezeptor, der an die PLC gekoppelt ist)
PGI2
Prostazyklin
pS
Pikosiemens
R
Widerstand
RuR
Ruthenium Red
SAC
stretch-activated channel (dehnungsaktivierter Kanal)
SEM
standard error of the mean (Standardfehler des
Mittelwertes)
SNP
Sodium-Nitro-Prussid
TRP
transient receptor protein
U
Spannung
Uaus
Ausgangsspannung
Upip
Pipettenspannung
Usoll
Sollspannung
Vhalte
Haltepotential
WT/+/+
Wildtyp
6
Abbildungsverzeichnis
III ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1: Charakteristika der N- und C-Termini der TRP-Subfamilien ................. 13
Abbildung 2: Schematische Darstellung des TRPV4-Kanals ..................................... 15
Abbildung 3: Schematische Illustration der hypothetischen Rolle von TRPC- und
mechanosensitiven TRPV4-Kanälen bei der Endothelfunktion ............. 24
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Aufbaus des Druckmyographen ........... 37
Abbildung 5: Immunhistochemie und Western-blot-Analyse...................................... 41
Abbildung 6: Elektrophysiologische Eigenschaften von TRPV4-Strömen, gemessen
an Endothelzellen der Arteria carotis communis von TRPV4-WT- und KO-Mäusen (Stimulation mit 4αPDD). .................................................. 42
an Endothelzellen der Arteria carotis communis von TRPV4-WT- und KO-Mäusen (Stimulation mit AA). ......................................................... 43
an Endothelzellen der Arteria carotis communis von TRPV4-WT- und KO-Mäusen (Stimulation mit hypoosmolarem Stress). ......................... 44
an Endothelzellen der Arteria carotis communis von TRPV4-WT- und KO-Mäusen (Vergleich 4αPDD, AA und hypoosmolarer Stress). ......... 45
Abbildung 10: Gefäßelastizität und Kontraktilität der Arteria carotis communis von
TRPV4-WT- und -KO-Mäusen.............................................................. 47
Abbildung 11: Pharmakologische Eigenschaften von durch 4αPDD induzierter
Vasodilatation bei CA von Mäusen. ...................................................... 49
Abbildung 12: Phorbol-Ester, 4α-phorbol-12,13-Didecanoat (4αPDD; 1µmol/L) und
Azetylcholin-induzierte Endothel-abhängige Vasodilatation in A.c.c. von
WT und TRPV4-/--Mäusen. ................................................................... 50
Abbildung 13: Durch Wandschubspannung und Fluss induzierte Vasodilatation in A.c.c.
von WT und TRPV4-/--Mäusen. ............................................................ 53
Abbildung 14: Pharmakologische Eigenschaften von wandschubspannungs- und
flussinduzierter Vasodilatation in A.c.c. von TRPV4+/+-Mäusen. ........... 54
7
Tabellenverzeichnis
IV TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1:
Tabelle 2:
Verwendete Substanzen und Hersteller ............................................... 28
Verwendete Geräte und Hersteller ....................................................... 29
8
Einleitung
1. Einleitung
1.1 Das Endothel und die Blutdruckregulation
1.1.1 Überblick über die Endothelfunktionen
Das Endothel ist eine hochspezialisierte, multifunktionelle einlagige Zellschicht
zwischen Blut und Gewebe. Es reguliert eine Vielzahl vaskulärer Funktionen,
wie
zum
Beispiel
die
Sauerstoffversorgung
von
Passage
von
Organen
Makromolekülen
und
Gewebe.
und
Es
die
vermittelt
Immunantworten, Angiogenese- und Gefäßumbauprozesse. Darüber hinaus
spielt das Endothel der Arterien als Signaltransduktionsschnittstelle eine sehr
wichtige
Rolle
bei
der
Kontrolle
des
Kontraktionsstatus
des
glatten
Gefäßmuskels. Es setzt vasoaktive Faktoren frei und wirkt so regulierend auf
den systemischen Blutdruck.
Eine
endotheliale
Krankheitsbilder
Dysfunktion
wie
trägt
zu
Arteriosklerose,
einer
Reihe
arterieller
kardiovaskulärer
Verschlusskrankheit,
Vaskulitiden oder arterieller Hypertonie bei.
Die entscheidende Rolle des Endothels bei der Kontrolle des vaskulären Tonus
wurde erstmals 1980 von Furchgott und Zawadzki gezeigt (Feletou et al,
2006)/(Furchgott et al, 1980). In dieser Pionierarbeit wurde deutlich, dass die
Stimulation des Endothels mit dem vasoaktiven Faktor Azetylcholin zur
Freisetzung eines Faktors mit geringer Halbwertszeit führt, der die glatte
Gefäßmuskulatur relaxieren lässt. Wie später gezeigt wurde, handelte es sich
bei diesem Faktor um das Gas Stickstoffmonoxid (NO) (Furchgott et al, 1980).
Neben NO als sehr gut charakterisierter endothelabhängiger Vasodilator sind
zwei
weitere
endothelabhängige
Vasodilatationssysteme,
das
Prostazyklin(PGI2)-System (Moncada S et al, 1976) und der sogenannte
endotheliale hyperpolarisierende Faktor (endothelium-derived hyperpolarizing
factor, EDHF) (Feletou et al, 2006) bekannt. Die genaue stoffliche
Beschaffenheit des EDHF ist jedoch nach wie vor umstritten. Derzeit werden
verschiedene
Kandidatenmoleküle
wie
Zytochrom-P450-generierte
Epoxyeicosatriensäuren (EETs), H2O2 und auch NO selbst als diffusionsfähige
EDHF diskutiert (Feletou et al, 2006). Es scheint jedoch auch möglich, dass die
EDHF-vermittelte Vasodilatation nicht auf der Wirkung eines diffusionsfähigen
9
Einleitung
Faktors beruht, sondern es sich vielmehr um ein elektrisches Phänomen
handelt (Griffith, 2004)/(Busse et al, 2002). Hier wird postuliert, dass sich eine
endotheliale Hyperpolarisation über myoendotheliale gap junctions auf den
glatten Gefäßmuskel ausbreitet und dort spannungsgesteuerte Ca2+-Kanäle
vom L-Typ schließt. Der Abfall der für die Kontraktion benötigen intrazellulären
Ca2+-Konzentration führt schließlich zur Relaxation und Vasodilatation.
Neben auf das Endothel einwirkende vasoaktive Faktoren wie Azetylcholin
stimulieren auch hämodynamische Kräfte das Endothel und können eine
Vasodilatation bewirken. Eine wichtige hämodynamische Kraft, die auf das
Endothel einwirkt, ist die durch den Blutfluss erzeugte Wandschubspannung
(Pohl
et
al,
1986).
Vasodilatationsprozesse
Durch
schützt
diese
das
wandschubspannungsinduzierten
Endothel
die
Gefäßwände
vor
mechanischer Zerstörung und stellt auch eine adäquate Organperfusion sicher.
Diese wandschubspannungsinduzierte Vasodilatation wird ähnlich wie die durch
zirkulierende Faktoren induzierte Vasodilatation, durch die Bildung von NO,
PGI2 und des EDHF vermittelt (Bellien et al, 2006)/(Köhler et al, 2000)/(Zhao et
al, 2005).
1.1.2 Ca2+ und die Endothelfunktion
Die Aktivierung der drei endothelabhängigen Vasodilatationssysteme ist Ca2+abhängig. So wird die endotheliale NO-Synthase Ca2+/Calmodulin-abhängig
aktiviert (Bredt et al, 1990). Die PGI2-Synthese ist Ca2+-abhängig, da die
Freisetzung der Ausgangssubstanz Arachidonsäure aus der Zellmembran
durch die Ca2+-abhängige Phospholipase-A2 vermittelt wird. Die Generation des
EDHF-Signals ist ebenso Ca2+-abhängig. So ist z.B. die Synthese der als
EDHF-Moleküle diskutierten EETs durch Zytochrom-P450 Enzyme analog zur
PGI2-Synthese abhängig von der Arachidonsäurefreisetzung und somit von
Ca2+. Wenn eine endotheliale Hyperpolarisation als Initiierung der EDHFvermittelten Vasodilatation angenommen wird, ist diese gleichwohl Ca2+abhängig, da eine Hyperpolarisation des Endothels durch das Öffnen Ca2+aktivierter K+-Kanäle zustande kommt (Busse et al, 2002)/(Eichler et al,
2003)/(Köhler et al, 2000)/(Köhler et al, 1996)/(Hoyer et al, 1998)/(Ishii et al,
1997).
10
Einleitung
Klassische Agonisten erhöhen die intrazelluläre Ca2+-Konzentration im Endothel
über
die
Bindung
an
ihre
membranständigen
G-protein-gekoppelten
Rezeptoren. Bei der nachgeschalteten Signaltransduktion kommt es zur Bildung
von Inositoltrisphosphat (IP3). IP3 vermittelt eine Ca2+-Freisetzung aus
intrazellulären Ca2+-Speichern, dem endoplasmatischen Retikulum. Diese
Freisetzung resultiert in einem schnellen Anstieg der intrazellulären Ca2+Konzentration. Im Anschluss bleibt die intrazelluläre Ca2+-Konzentration
mehrere Minuten lang (Wissenbach et al, 2004) erhöht. Diese sog.
Plateauphase der Ca2+-Erhöhung ist von einem Ca2+-Einstrom aus dem
Extrazellularraum abhängig. Ca2+-permeable Kationenkanäle, die sich in der
Plasmamembran befinden, vermitteln diesen Ca2+-Einstrom (Nilius et al, 2001).
Neben der gut untersuchten auf Rezeptorstimulation basierenden Ca2+Mobilisierung,
führt
auch
eine
Stimulation
des
Endothels
durch
hämodynamische Reize, wie der oben genannten Wandschubspannung, zu
einem Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration. Eine solche durch
Wandschubspannung induzierte Ca2+-Erhöhung wurde sowohl nach in-vitroStimulation von Endothelzellen (Hoyer et al, 1998)/(Helmlinger et al, 1996), als
auch in isolierten Gefäßen beobachtet (Falcone et al, 1993). Hier geht man
davon
aus,
dass
Kationenkanäle
ein
(MSC)
Ca2+-Einstrom
mit
einer
durch
speziell
konsekutiven
mechanosensitive
Ca2+-Freisetzung
aus
intrazellulären IP3- (Nollert et al, 1990) und Ryanodin-sensitiven Speichern
(Hoyer et al, 1998) wichtig ist. Auf Zellmembranebene wurden MSC in
Endothelzellen in vitro (Nilius et al, 2001)/(Lansman et al, 1987) als auch in situ
(Hoyer et al, 1997) als dehnungsaktivierbare Kanäle (Stretch-activated
channels, SAC) identifiziert. Die molekulare Identität, d.h. die MSC/SACkodierenden
Gene
sowie
wesentliche
molekulare
Determinanten
von
Mechanosensitivität, ist jedoch nicht geklärt. Es gibt allerdings verschiedene
Hinweise darauf, dass Kationenkanäle der TRP-Genfamilie mechanosensitive
Eigenschaften besitzen und somit dehnungsaktivierte MSC sein könnten
(Maroto et al, 2005)/(Liedtke et al, 2005). Im folgenden Kapitel sollen nun diese
TRP-Kationenkanäle vorgestellt werden.
11
Einleitung
1.2 Die Endothelfunktion und beteiligte Ionenkanäle
1.2.1 Kationenkanäle der TRP-Genfamilie
Die TRP-Kanäle gehören zu einer Genfamilie von Ionenkanälen mit 30
Mitgliedern. Aufgrund von Sequenzhomologien werden sieben Subfamilien
unterschieden.
Die
mitgliederreichsten
Subfamilien
sind
die
klassische/kanonische Subfamilie TRPC (7 Subtypen), die dem Melastatin
verwandte Subfamilie TRPM (8 Subtypen) und die dem Vanilloidrezeptor
verwandte Subfamilie TRPV (6 Subtypen) (Earley et al, 2007)/(Clapham, 2003).
Die weiteren Subfamilien sind die TRPP- (5 Subtypen), die TRPML- (3
Subtypen) und die TRPA-Subfamilie (1 Subtyp).
Das gemeinsame Bauprinzip sieht wie folgt aus: Vier Kanaluntereinheiten
bilden ein Homo- oder Heterotetramer, wobei Heterotetramere nur mit Subtypen
der eigenen Unterfamilie gebildet werden. Eine Kanaleinheit besteht dabei aus
sechs Transmembrandomänen (S1-S6) mit einer Porenregion, dem sog. poreloop zwischen der fünften und sechsten Transmembrandomäne (Clapham,
2003)/(Planells-Cases et al, 2007)/(Earley et al, 2007).
Weiterhin zeichnen sich die TRP-Kanal-Familien durch Gemeinsamkeiten in der
Struktur ihrer cytosolisch liegenden N- und C-Termini aus: Ein wichtiges
strukturelles Element der meisten TRP-Subfamilien ist die TRP-Box. Sie findet
sich bei den Subfamilien TRPC, TRPV und TRPM. Die Funktion dieser TRPBox ist jedoch bislang unbekannt. Des Weiteren gibt es sowohl Unterschiede
als auch Gemeinsamkeiten bei Protein-Protein-Interaktionsmotiven in der Cund N-terminalen Region, wie PDZ-Domänen und Ankyrin-Repeats oder auch
Calmodulin-Bindestellen (Gaudet, 2007). Eine Übersicht stellt Abbildung 1 dar.
12
Einleitung
Abbildung 1: Charakteristika der N- und C-Termini der TRP-Subfamilien
[nach (Birnbaumer et al, 2003)]
PDZ BD: PDZ-Domänen
Ank repeat: Ankyrin-Repeats
CamBD: Calmodulin- Bindestellen
Die überwiegende Zahl der verschiedenen TRP-Subtypen sind nicht-selektive
Kationenkanäle, d.h. sie leiten sowohl Na+ und K+, als auch Ca2+. Hierbei gibt
es folgende Ausnahmen: TRPV5 und TRPV6, die hochselektiv für Ca2+ sind,
sowie TRPM4 und TRPM5, die hochselektiv für einwertige Kationen und damit
impermeabel für Ca2+ sind (Earley et al, 2007).
TRP-Kanäle werden subtypenspezifisch durch eine Vielzahl physikalischer und
chemischer Reize und auch durch endogene Signalmoleküle aktiviert und
reguliert: Zu den physikalischen Stimuli gehören sowohl Temperatur, als auch
mechanische und hypoosmotisch induzierte Membrandehnung. Bei den
chemischen Reizen sind Schwankungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration,
Fettsäuren
und
Phorbol-Ester
und
Diacylglycerol
als
ein
endogenes
Signalmolekül zu nennen.
13
Einleitung
TRP-Kanäle sind an einer Reihe verschiedener physiologischer Funktionen
beteiligt und in fast allen Geweben und Zelltypen exprimiert (Clapham,
2003)/(Montell et al, 2002).
Zu den bereits gut verstandenen Funktionen spezifischer TRP-Suptypen gehört
die regulierende Funktion bei der Magnesiumhomöostase (Planells-Cases et al,
2007). Außerdem geht man davon aus, dass diese Kanäle aufgrund ihrer
Lokalisation in sensorischen Neuronen eine molekulare Schlüsselrolle in
sensorischen Systemen spielen (Planells-Cases et al, 2007)/(Muraki et al,
2007). Auch gibt es bereits Hinweise darauf, dass TRP-Kanäle vom TRPC6und TRPC3-Typ bei der Regulation des Gefäßtonus eine Rolle spielen (Dietrich
et al, 2005).
1.2.2 TRPV4-Kanäle
Im Mittelpunkt dieser Disserationsarbeit steht der Kationenkanal TRPV4 aus der
dem Vanilloidrezeptor verwandten Subfamilie TRPV. Daher soll im Folgenden
der
Bau
dieses
Kanals,
dessen
Aktivierungsmechanismen,
das
Expressionsmuster und der Phänotyp der TRPV4-KO-Maus beschrieben
werden.
1.2.2.1 TRPV4-Gen
Das TRPV4-Gen wurde im Jahr 2000 kloniert. Andere Gennamen sind auch
OTRPC4 (OSM-9-like TRP channel 4) (Strotmann et al, 2000), VR-OAC
(Vanilloid receptor-related osmotically activated channel) (Liedtke et al, 2000),
TRP12 (Wissenbach et al, 2000) und VRL-2 (Vanilloid receptor-related channel
2) (Delany et al, 2001). Die Genloci für TRPV4 sind für Mensch und Ratte auf
Chromosom 12, für die Maus auf Chromosom 5. Dabei ist die kodierende
Sequenz in 12 Exonen organisiert und umfasst 2,889 kb.
1.2.2.2 Bau
Der TRPV4-Kanal-Komplex besteht aus 4 Untereinheiten, die ein sog.
Homotetramer bilden. Es gibt keinen Anhalt für Heteromultimerisierung mit
anderen TRPV-Unterheinheiten (Hellwig et al, 2005).
Eine TRPV4-Untereinheit besteht aus 963 Aminosäuren (Delany et al, 2001).
Wie in Abbildung 2 schematisch dargestellt ist, verfügt eine Untereinheit über
sechs Transmembrandomänen (S1-S6). N- und C-Terminus liegen intrazellulär.
14
Einleitung
Die kationenleitende Pore wird durch den sog. pore loop zwischen den
Domänen S5 und S6 gebildet. Charakteristisch für alle Vertreter dieser TRPVSubfamilien sind drei Ankyrin-Repeats am cytosolischen N-Terminus (Plant et
al, 2007). Bezüglicher ihrer Funktion wird diskutiert, ob diese Ankyrin-Repeats
für die Protein-Protein Interaktion zwischen Kanälen und Cytoskelett oder
zwischen mehreren Kanälen verantwortlich sind (Erler et al, 2004).
Abbildung 2: Schematische Darstellung des TRPV4-Kanals
[nach (Plant et al, 2007)]
1.2.2.3 Gewebeexpression des TRPV4
TRPV4
wird
in
sehr unterschiedlichen Geweben
wie
dem
zentralen
Nervensystem und auch in verschiedenen Organen der Peripherie wie Niere,
Lunge und im Herzkreislaufsystem exprimiert:
Im ZNS wurde eine TRPV4-mRNA-Expression im zircumventriculären Organ, in
ependymalen Zellen des Plexus choroideus des Seiten- und vierten Ventrikels,
im Ganglion trigeminale, in der Pars compacta der Substantia nigra (Guatteo et
al, 2005), in den Ganglien der Hinterwurzeln (Liedtke et al, 2000)/(Delany et al,
2001)/(Alessandri-Haber et al, 2003), in hypothalamischen Neuronen (Liedtke
et al, 2000), in sympathischen Ganglien wie auch in sympathischen und
parasympathischen Nervenfasern nachgewiesen (Delany et al, 2001).
Eine TRPV4-Expression wurde auch in den inneren und äußeren Haarzellen
des Cortischen Organs des Innenohrs, in den Haarzellen der Bogengänge
(semicircular canals) und Utrikulae, im Ganglion cochlearis (auditory ganglion)
15
Einleitung
und in den Grenzzellen der Stria vascularis beschrieben (Liedtke et al,
2000)/(Shen et al, 2005).
Eine hohe TRPV4-Expression wurde in Nieren gefunden (Strotmann et al,
2000)/(Liedtke et al, 2000)/(Wissenbach et al, 2000)/(Delany et al, 2001). Dort
findet sich der Kanal in der basolateralen Membran der Tubulusepithelzellen
der wasserundurchlässigen Nephronabschnitte, d.h. im dünnen und dicken
aufsteigenden Teil der Henleschen Schleife, im distalen Tubulus (Pars
convoluta) und im Verbindungstubulus (Tian et al, 2004)/(Cohen, 2007). Auch in
den ableitenden Harnwegen, im Urothel, wurde eine Expression von TRPV4
gezeigt (Thorneloe et al, 2008).
Im Respirationstrakt wird TRPV4 im Alveolarepithel, Trachealepithel, in
submukösen Drüsen, in mononuklären Zellen und in der Bronachialmuskulatur
exprimiert (Delany et al, 2001)/(Jia et al, 2004)/(Arniges et al, 2004)/(Arniges et
al, 2005). Eine TRPV4-Expression lies sich ebenfalls im Herzen, in der Leber, in
der Plazenta, im Eileiter (Andrade et al, 2005), in Speicheldrüsen, in
Keratinozyten (Güler et al, 2002) und im Endothel nachweisen.
1.2.2.4 Aktivierung
Das sehr heterogene Expressionsmuster von TRPV4 lässt bereits vermuten,
dass TRPV4 an einer Vielzahl von Signaltransduktionsprozessen und
Organfunktionen beteiligt ist und möglicherweise durch sehr unterschiedliche
Stimuli aktiviert wird. Untersuchungen an TRPV4-exprimierenden Säugerzellen,
Organen und Geweben ergaben, dass TRPV4 ein äußerst variables
Öffnungsverhalten auf eine Vielzahl unterschiedlichster chemikalischer und
physikalischer Stimuli zeigt. Dieses überraschend vielseitige Öffnungsverhalten
soll im Folgenden näher betrachtet werden.
1.2.2.4.1 Physikalische Reize
Temperatur
TRPV4 gilt ebenso wie die meisten anderen Mitglieder der TRPV-Subfamilie als
temperatursensitiv. Anders als bei TRPV1, der durch noxische Hitzereize
(>40°C) aktiviert wird, erfolgt bei TRPV4 eine Aktivierung durch moderate
Temperaturerhöhung (~27-35°C) (Chung et al, 2003)/(Watanabe et al,
2002)/(Güler et al, 2002)/(Gao et al, 2003). Da TRPV4 durch Wärme stimuliert
16
Einleitung
werden
kann
und
in
sensorischen
Neuronen,
Keratinozyten
und
im
Hypothalamus exprimiert wird, liegt die Vermutung nahe, dass TRPV4 eine
Rolle bei der Wärmeempfindung und Temperaturregulation spielt.
Mechanische Reize
TRPV4 wird auch als putativ mechanosensitiver Kanal diskutiert. So kann eine
Kanalaktivität durch HTS-induzierte Membrandehnung, durch hohe Viskosität
des
perfundierenden
Mediums
oder
Veränderungen
der
Strömungsgeschwindigkeit ausgelöst werden.
Inwieweit TRPV4 als Membranprotein direkt im Sinne eines Mechanorezeptor
fungiert oder eher ein Bestandteil nachgeschalter Signaltransduktionsprozesse,
ist jedoch nach wie vor unklar (Liedtke et al, 2003)/(Suzuki et al, 2003).
Osmotische Reize
Einige Gewebe, in denen TRPV4 exprimiert wird (Niere, zirkumventrikuläre
Organe
[Organum
vasculosum
laminae
terminalis
(OVLT),
Organum
subfornicale (SFO), Area postrema (AP)], Haarzellen im Innenohr), sind
Osmolaritätsänderungen (Niere) ausgesetzt oder an der Osmoregulation
(zirkumventrikuläre
Organe)
Mechanowahrnehmung
bzw.
(Haarzellen
möglicherweise
im
Innenohr)
an
beteiligt.
der
Die
Osmolaritätsänderungen stellen dabei sowohl einen osmotischen als auch
einen mechanischen Stimulus dar, der Zellanschwellung und Membrandehnung
zur Folge hat (Plant et al, 2007).
TRPV4 ist hochsensitiv gegenüber extrazellulären Osmolaritätsänderungen im
Rahmen physiologischer Osmolaritätsschwankungen. Dabei führt extrazelluläre
Hypoosmolarität
Membranströmen.
zu
einem
Extrazelluläre
intrazellulären
Ca2+-Anstieg
Hyperosmolarität
(über
und
zu
300mosmol/l)
hingegen bewirkt einen Abfall sowohl der intrazellulären Ca2+-Konzentration als
auch der Membranströme (Strotmann et al, 2000)/(Liedtke et al, 2000). Die
Empfindlichkeit des Kanals gegenüber osmotischen Schwankungen erscheint
hoch. So wurden signifikante Änderungen des TRPV4-mediierten Ca2+Einstroms bereits ab Osmolaritätsänderungen von 1% beobachtet (Liedtke et
al, 2000).
17
Einleitung
1.2.2.4.2 Regulation der Kanalaktivität durch intrazelluläre second-Messenger
und pharmakologische Öffner
Arachidonsäure/5´-6´-Epoxyeicosanoide
Whole-cell patch-clamp-Untersuchungen an HEK-293 Zellen durch die
Arbeitsgruppe von Bernd Nilius zeigten, dass TRPV4 durch Arachidonsäure
(AA) aktivierbar ist. AA könnte somit ein endogener TRPV4-Aktivator oder
Vorläufer eines solchen darstellen. Hier konnte die Arbeitsgruppe zeigen, dass
die Abbauprodukte der Arachidonsäure die eigentlichen Kanalaktivatoren sind
(Watanabe et al, 2003). So ist eine Metabolisierung der Arachidonsäure über
die Cytochrom P450-Eypoxygenase zu den Epoxyeicosanoiden (EETs) 5,6Epoxyeicosatriensäure und 8,9-Epoxyeicosatriensäure für eine Aktivierung
unerlässlich. Eine Blockade dieses Enzyms konnte die Aktivierung des Kanals
durch Arachidonsäure unterdrücken. Eine Applikation von EETs dagegen
aktiviert TRPV4 (Vriens et al, 2005)/(Watanabe et al, 2002)/(Watanabe et al,
2003). Dieses Ergebnis ist höchst relevant und stellt einen interessanten
Einblick in die mögliche Rolle von TRPV4 für die endotheliale Funktion dar, da
EETs als potentielle molekulare Funktionsträger für die EDHF-vermittelte
Vasodilatation einiger Gefäße gelten oder das EDHF-Signal über intraendotheliale Mechanismen ermöglichen (Busse et al, 2002)/(Watanabe et al,
2003)/(Vriens et al, 2005). So ist denkbar, dass die EETs-Aktivierung von
TRPV4 und der Ca2+-Einstrom eine Rolle bei der Generierung oder
Amplifizierung von EDHF-Signalen nach Rezeptor-Stimulation spielen (Köhler
et al, 2007).
Ca2+
Über eine CaM-Bindungsdomäne erscheint der Kanal auch selbst Ca2+reguliert. Inwieweit dies zutrifft, wird jedoch noch nicht hinreichend verstanden.
Es kann aber vermutet werden, dass die meisten Ca2+-permeablen Ionenkanäle
einen Feedback-Regulationsmechanismen durch Ca2+ zeigen, um eine
schädliche Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration zu vermeiden oder
um die Kanalaktivität fein zu regulieren (Marrelli et al, 2007).
18
Einleitung
Synthetische Phorbol Ester
Eine sehr wichtige Entdeckung war die Identifizierung von bestimmten PhorbolEster-Derivaten als selektive TRPV4-Aktivatoren (Watanabe et al, 2002).
So stimulieren sowohl das PKC-aktivierende 4α-Phorbol-12-Myristate-13Acetate (4αPMA) als auch das nicht-PKC-aktivierende Derivat 4α-Phorbol12,13-Didecanoat (4αPDD) direkt den Kanal. Die Aktivierung durch 4αPDD ist
dabei unterschiedlich von dem Aktivierungsmechanismus, der bei hypotoner
Zellschwellung beobachtet wird. Bei letzterem erfolgt - wie oben beschrieben eine Aktivierung über die PLA2-vermittelte Freisetzung von Arachidonsäure und
deren Umwandlung über das CYP450-System in EETs (Plant et al, 2007). Die
durch 4αPDD hervorgerufene Aktivierung bleibt dagegen auch in Anwesenheit
von PLA2-Inhibitoren bestehen (Vriens et al, 2004). Als die putative 4αPDDBindungsstelle identifizierten Vriens et al. ein YS-Motiv am N-Terminus von S3
(Tyr555 und Ser556) (Vriens et al, 2004). Mutationen des Tyr555 bewirkten
einen Verlust der Antwort auf 4αPDD, beeinflussten aber nicht die Antwort auf
Arachidonsäure, was die Hypothese verschiedener Aktivierungswege für
Phorbol-Ester und Zellanschwellung weiter bestätigt (Vriens et al, 2005).
Die Aktvierung durch Phorbolester ist anscheinend spezifisch für TRPV4. Es
sind keine Interaktionen mit anderen Ionenkanälen bekannt.
1.2.2.5 Phänotyp der TRPV4-KO-Maus
Osmoregulation
Liedtke und Friedman beobachteten bei TRPV4-KO-Mäusen eine geringere
Flüssigkeitsaufnahme und erhöhte plasmatische Osmolaritäten. Sie stellten
außerdem fest, dass die Ausschüttung von ADH auf hyperosmotischen Stress
bei TRPV4-/--Mäusen reduziert ist. Dies ist ein Hinweis darauf, dass TRPV4 als
osmotischer Sensor des ZNS für die Aufrechterhaltung des systemischen
osmotischen Gleichgewichts fungiert (Liedtke et al, 2003)/(Liedtke, 2007).
Thermo und Mechanosensorik
Wie oben beschrieben stellen Wärme und mechanische Reizung ebenfalls
einen Stimulus für TRPV4 dar. TRPV4-KO-Mäuse zeigen eine veränderte
Weiterleitung und Wahrnehmung noxischer Wärme- und Druckstimuli (Todaka
et al, 2004)/(Alessandri-Haber et al, 2005)/(Alessandri-Haber et al, 2006).
19
Einleitung
So lässt sich eine verminderte wärmeevozierte elektrische Aktivität bei TRPV4-/-Mäusen beobachten (Todaka et al, 2004). KO-Tiere ziehen warme
Bodentemperaturen (34°C gegenüber 30°C) vor und zeigen eine verlängerte
Toleranz
gegenüber
einer
Schwanzerhitzung
(Lee
et
al,
2005).
Die
Körpertemperatur und das Antwortverhalten auf Kälteeinwirkung dieser Tiere ist
jedoch normal (Liedtke et al, 2003)/(Todaka et al, 2004)/(Suzuki et al, 2003).
Dass Kanalfunktionen mit Mechanotransduktionsprozessen assoziiert sein
könnten, lassen Untersuchungen an TRPV4-/-- Mäusen vermuten.
TRPV4-/--Mäuse
zeigen
so
eine
reduzierte
Empfindlichkeit
gegenüber
Druckreizen. Wird beispielsweise mechanischer Druck auf den Schwanz von
TRPV4-/--Mäusen ausgeübt, so zeigen diese Tiere im Vergleich zu den
TRPV4+/+-Mäusen eine deutlich längere Toleranz (Liedtke et al, 2003)/(Suzuki
et al, 2003).
Des Weiteren beobachteten Grant et al eine TRPV4-abhängige Freisetzung
nozizeptiver Peptide im Rahmen inflammatorischer Prozesse und dadurch
hervorgerufene
mechanische
Hyperästhesie.
Diese
mechanische
Hyperästhesie fehlt bei TRPV4-KO-Mäusen (Grant et al, 2007).
Ohr
Die Lokalisation von TRPV4 im Ohr macht eine Untersuchung der auditorischen
Fähigkeiten von TRPV4-/--Tieren interessant. Ältere (24 Wochen versus 8
Wochen) TRPV4-/--Tiere zeigten in einer Untersuchung von Tabuchi et al.
höhere Schwellenwerten bei akustisch evozierten Hirnstammpotentialen. Eine
Veränderung des Schwellenwertes nach akustischer Überstimulierung wird bei
TRPV4-KO-Mäusen verzögert beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin,
dass ein Verlust des TRPV4-Proteins mit einer einsetzenden Gehörschädigung
einhergeht und die Cochlea anfällig für akustische Schädigung macht (Tabuchi
et al, 2005).
Niere
Die Auswirkung des Fehlens von TRPV4 in der Niere ist noch unklar. Diskutiert
wird eine mögliche Rolle des Kanals als apikaler Sensor für Fluss oder bei der
lokalen Regulation der Osmolarität (Cohen, 2007) und des Na2+- und
20
Einleitung
Wasserhaushaltes (Hsu et al, 2007). Ob bei TRPV4-KO Mäusen eine
diesbezügliche Störung vorliegt, ist noch nicht untersucht.
Blasenfunktion
Die Notwendigkeit des TRPV4 für eine adäquate Funktion der Harnblase wurde
bereits beschrieben. So ist die Fähigkeit zur Kontraktion abhängig von der
TRPV4-Expression in den glatten Muskelzellen der Harnblase (Thorneloe et al,
2008). Weitere Studien zeigten, dass TRPV4-/--Mäuse inkontinent sind. Hierbei
wurde in cystometrischen Experimenten eine erniedrigte Frequenz von
Miktionskontraktionen
sowie
eine
erhöhte
Frequenz
von
Nicht-
Miktionskontraktionen beobachtet. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass
TRPV4 an der urothelvermittelten Transduktion des intravesicalen Druckes
beteiligt ist (Gevaert et al, 2007).
Lunge
Untersuchungen am Lungengewebe von Ratten und Mäusen zeigten, dass
TRPV4 an der Pathogenese akuter Lungenerkrankungen, wie dem adult
respiratory distress syndrom (ARDS), beteiligt sein könnte, da ein Ca2+Einstrom durch TRPV4 eine Veränderung der alveolären Barriere mit
konsekutiv beeinträchtigtem Gasaustausch zur Folge hat (Alvarez et al, 2006).
In den Alveolen der Lunge scheint TRPV4 an der Regulation der vaskulären
Permeabilität und dadurch an der Bildung von Ödemen beteiligt zu sein. So
wurde festgestellt, dass die TRPV4-vermittelte Erhöhung der [Ca2+]i eine
Erhöhung der vaskulären Permeabilität zur Folge hat. Gleichzeitig kommt es
über die dadurch hervorgerufene Freisetzung von NO zu einem negativen
Feedback
und
Limitierung
der
Permeabilität
durch
cGMP-abhängige
Abschwächung der druckinduzierten Ca2+-Antwort. Bei TRPV4-/--Mäusen zeigte
sich eine Blockade der Erhöhung der [Ca2+]i und NO-Synthese (Yin et al, 2007).
Außerdem
wurde
gezeigt,
dass
TRPV4
bei
Lungenschädigung
und
Flüssigkeitsaustritt in den Alveolarraum durch hohe Drücke im vaskulären
System eine Rolle spielt (Jian et al, 2007).
21
Einleitung
1.2.3 Die TRP-Kationenkanäle im Endothel
Im folgenden Abschnitt werden zunächst kurz endotheliale TRP-Kanäle
vorgestellt, um im Weiteren auf die putativen Funktionen von TRPV4 bei der
Endothelfunktion einzugehen.
In der letzten Dekade wurde die Expression der verschiedenen Mitglieder der
TRP-Superfamilie in humanen und anderen Endothelzellen untersucht.
Endothelzellen exprimieren mehrere Mitglieder der TRP-Subfamilie TRPC. Dies
sind:
TRPC1,
TRPC3,
TRPC4
und
TRPC6,
wobei
jedoch
die
Expressionsmuster zwischen den verschiedenen Spezies variieren. Man geht
davon aus, dass sowohl homo- als auch heteromere TRPC-Kanalkomplexe den
Ca2+-Einstrom nach Rezeptoraktivierung oder Speicherentleerung mediieren
(Nilius et al, 2003)/(Hofmann et al, 2002). Unter den endothelialen TRPCs,
wurde besonders für TRPC4 auch eine Funktion bei endothelmediierten
Vasodilatiationsprozessen postuliert. Dies wurde durch Versuche an Aorten der
TRPC4-KO-Mäuse
belegt,
die
eine
verminderte
Vasorelaxationsantwort
aufweisen (Freichel et al, 2001). Was die anderen TRP-Subfamilien betrifft, so
gibt es Berichte, die die Melastatin- (TRPM) und Vanilloid- (TRPV) Subfamilien
(z.B. TRPM4 und TRPV4) als endotheliale TRPs beschreiben (Nilius et al,
2003)/(Watanabe et al, 2002). Die funktionelle Rolle dieser Kanäle im Endothel
ist jedoch noch unklar.
1.2.4 Der TRPV4-Kanal und die Endothelfunktion
TRPV4 wurde im Endothel von Mäuse-Aorten erstmalig von Bernd Nilius und
Mitarbeitern identifiziert (Watanabe et al, 2002). Es scheint so, als sei TRPV4
der einzige im Endothel exprimierte Vertreter der TRPV-Subfamilie (Köhler et
al, 2006). Single-cell-RT-PCR-Analysen der mRNA-Expressionsmuster von
TRPV4 an in situ Endothelzellen aus der A.c.c. der Ratte zeigten eine
Expression von TRPV4, nicht aber der anderen engverwandten TRPV1-3. Auch
scheint innerhalb der Gefäßwand der A.c.c. von Ratten die TRPV4-Expression
auf das Endothel beschränkt zu sein, da eine mRNA-Expression im glatten
Gefäßmuskel der A.c.c. nicht nachgewiesen werden konnte. Dabei ist jedoch
anzumerken, dass eine TRPV4-Expression und entsprechende Kanalfunktionen
am glatten Gefäßmuskel zerebraler Rattenarterien gefunden wurden (Earley et
al, 2005). Hier bildet der Kanal eine funktionelle Einheit mit einem Ca2+22
Einleitung
aktivierten K+-Kanal hoher Leitfähigkeit, sog. Maxi K oder BKCa2+ Kanal. Dieser
heterogene Komplex kann für die Membranpotentialregulation im glatten
Gefäßmuskel von Bedeutung sein. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass die
gewebsspezifische
Expression
von
TRPV4
in
den
unterschiedlichen
Gefäßbahnen variieren kann.
Die exakte Rolle des TRPV4s bei der Endothelfunktion ist bis heute nicht
hinreichend geklärt (Köhler et al, 2007).
Es
kann
vermutet
werden,
dass
seine
funktionelle
Bedeutung
in
Zusammenhang mit dessen relativ hoher Ca2+-Permeabilität steht (Watanabe et
al, 2002)/(Strotmann et al, 2000). Eine Aktivierung des Kanals würde somit
einen signifikanten Ca2+-Einstrom erzeugen. In der Gefäßphysiologie nimmt der
Ca2+-Einstrom als Antwort auf mechanische oder rezeptormediierte Stimulation
eine Schlüsselrolle für eine Vielzahl endothelialer Funktionen ein.
Besonders wichtig ist er für die Ca2+-abhängige Synthese der vom Endothel
stammenden
vasodilatatorisch
wirksamen
Faktoren,
wie
etwa
des
diffusionsfähigen Stickoxids (Furchgott et al, 1980) und Prostazyklins (Moncada
S et al, 1976) als auch des endothelialen hyperpolarisierenden Faktors (EDHF).
EDHF-vermittelte Vasodilatation stellt einen beachtlichen Anteil der gesamten
Vasodilatation dar, der gegenüber NO-Synthase- und Prostacyclin-SynthaseHemmern
unempfindlich
Hyperpolarisation
glatter
ist.
Sie
wird
durch
Gefäßmuskelzellen
und
die
das
endothelabhängige
darauf
folgende
Schließen spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle hervorgerufen, was zu einer
Relaxation führt (Nilius et al, 2001)/(Feletou et al, 2006)/(Köhler et al, 2007). Für
Ca2+-permeable
(Clapham,
Kanäle
2003)/(Nilius
der
et
Transient-Rezeptor-Gen-Superfamilie
al,
2003)/(Harteneck
et
al,
(TRP)
2000)/(Montell,
2005)/(Caterina, 2007)/(Flockerzi, 2007)/(Trebak et al, 2007)/(Liedtke, 2007)
wurde postuliert, dass ein Ca2+-Einstrom sowohl nach Stimulation G-Proteingekoppelter Rezeptoren als auch nach mechanischer Stimulation durch Fluss
oder erhöhte Wandschubspannung erfolgt (Nilius et al, 2003)/(O'Neil et al,
2005)/(Oancea et al, 2006)/(Liedtke et al, 2005). Kürzlich veröffentlichte Studien
lieferten aber auch pharmakologische und molekularbiologische Evidenz dafür,
dass der Ca2+-Einstrom durch endotheliale TRPV4-Kanäle an der NO-Synthese
23
Einleitung
(Köhler et al, 2006) und der EDHF-Antwort (Vriens et al, 2005)/(Watanabe et al,
2003)/(Marrelli et al, 2007) beteiligt ist.
Das oben beschriebene, extrem vielseitige Öffunungsverhalten besonders auf
physikalische
(Temperatur,
mechanische
und
osmotische
Reize)
und
chemische Stimuli (Ca2+, Fettsäuren und synthetische Phorbole) (Nilius et al,
2004) könnte ferner ein Hinweis darauf sein, dass TRPV4 bei der
Signaltransduktion von mechanischen Reizen (Änderungen hämodynamischer
Kräfte wie Gefäßdehnung und Wandschubspannung) einerseits oder auch von
metabolischem und osmotischem Stress involviert sein könnte.
Abbildung
3
gibt
einen
Überblick
über
die
hypothetischen
Aktivierungsmechanismen und Funktionen von TRPC- und TRPV4-Kanälen.
Abbildung 3: Schematische Illustration der hypothetischen Rolle von TRPC- und
mechanosensitiven TRPV4-Kanälen bei der Endothelfunktion
[nach (Köhler et al, 2007)]
24
Fragestellung
2. Fragestellung
Das Endothel stellt eine wichtige Grenzschicht zwischen Gefäßlumen und
Gewebe dar und reguliert den Gefäßtonus durch die Freisetzung lokal
wirkender vasodilatierender und vasokonstringierender Faktoren. Dabei sind
über Ionenkanäle vermittelte Modulationen der [Ca2+]i in entscheidender Weise
daran beteiligt, die Synthese der drei vasodilatatorisch wirksamen Faktoren NO,
Prostazyklin und EDHF zu regulieren. Hierbei spielt die Aktivität von CalciumEinstrom
Kanälen
nach
hämodynamischer
Stimulation
und
nach
Rezeptorstimulation eine wesentliche Rolle.
Für den endothelialen Kationenkanal TRPV4 wird eine Beteiligung als
möglicher
Mechanosensor
bei
Mechanotransduktionsmechanismen
und
zugrunde
auch
bei
liegenden
agonisteninduzierten
Vasodilatationsprozessen vermutet.
Das Hauptziel der vorliegenden Untersuchung ist es daher, die funktionelle
Bedeutung
endothelialer
und
TRPV4
dabei
Kanäle
insbesondere
für
für
die
endotheliale
endotheliale
Mechanotransduktion anhand eines genetischen Ansatzes zu charakterisieren.
Es ergeben sich folgende spezifische Fragestellungen:
1. Zunächst soll die Expression von TRPV4 im Endothel der A.c.c. der
Maus
geprüft
werden.
Hierzu
werden
vergleichende
immunhistochemische und elektophysiologische Untersuchungen am
Endothel von TRPV4-WT- und –KO-Mäusen durchgeführt.
2. Es
soll
geklärt
werden,
ob
TRPV4
an
agonisteninduzierten
Vasodilatationsprozessen beteiligt ist. Hierbei soll die Azetylcholininduzierte Vasodilatation und auch die vasodilatatorisch Wirkung des
synthetischen TRPV4-Aktivator 4αPDD an der A.c.c. von TRPV4exprimierenden und TRPV4-defizienten Mäusen charakterisiert werden.
Es soll insbesondere geklärt werden, ob die Vasodilatation über einen
Beitrag zur NO-Bildung oder zum EDHF-Weg erfolgt.
25
Fragestellung
3. Es soll geklärt werden, ob TRPV4 an der Mechanotransduktion bei
TRPV4-WT-
und
-KO-Mäusen
beteiligt
ist.
Hierbei
sollen
wandschubspannungsinduzierte Vasodilatationsprozesse der A.c.c. von
TRPV4-exprimierenden und TRPV4-defizienten Mäusen vergleichend
untersucht werden. Es soll auch hier untersucht werden, ob diese über
einen Beitrag zur NO-Bildung oder zum EDHF-Weg vermittelt werden.
26
Material und Methoden
3. Material und Methoden
3.1 Substanzen
Substanz
Herstellende Firma
Azetylcholin
Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
BAPTA-AM
Taufkirchen, Deutschland
CaCl2
Cäsium-Methan-Sulfonat
CsOH
EDTA
EGTA
HEPES
Indometacin
Mannit
MOPS-Puffer
Na2ATP
NaCl
NG-Nitro-L-Arginin
Phenylephrin
SNP
AACOCF3
Tocris, BIOZOL Diagnostica Vertrieb
Capsaicin
GmbH, Eching, Deutschland
Ruthenium Red
UCL 1684
Proteinase K
Roche, Mannheim, Deutschland
TRAM-34
Heike Wulff, Davis, USA, frei
(1-[(2-chlorophenyl)diphenylmethyl]-
überlassen
1H-pyrazol)
PCR-Primer
Proligo, Hamburg, Deutschland
PBS-Puffer
PAA, Pasching, Österreich
Pyruvat
Trypsin
Äther
Roth, Karlsruhe, Deutschland
27
Dextran
Tris-HCl
Agarose
Fermentas, St. Leon-Rot,
Desoxynucleotid-Set
Deutschland
DNA-Sizer 100 bp
MgCl2
PeqLab, Erlangen, Deutschland
Taq-Polymerase
Alexafluor
Invitrogen-Molecular Probes,
Carlsbad, CA, USA
CsCl
Merck, Darmstadt, Deutschland
Ethidiumbromid
Glucose
KCl
KH2PO4
MgSO4
Na2HPO4
NaH2PO4
NaOH
Nitrozellulosemembranen
Bio-Rad, München, Deutschland
Kaninchen-Antiserum
GE Health care europe, Freiburg,
Deutschland
Anti-Tubulin-Antikörper
Labvision, Fremont, CA, USA
Tabelle 1: Verwendete Substanzen und Hersteller
3.2 Geräte
Gerät
Herstellende Firma
Pressure Myograph System P100
Fa. J.P. Trading I/S, Dänemark
Mikrodissektionsbesteck
Fa. Aesculap, Tuttlingen,
Deutschland
Stereomikroskop
Fa. Zeiss, Jena, Deutschland
Mikroskop Axiovert 135
Fa. Zeiss, Deisenhofen,
Deutschland
28
Schwingungsisolierter Tisch
Physik Instrumente, Waldborn,
Deutschland
Patch-Clamp Mikromanipulator
Eigenbau, Max-Planck-Institut,
Frankfurt/Main, Deutschland
Computergesteuerter EPC-9 Patch-
HEKA Elektronik, Lambrecht,
Clamp-Verstärker
Deutschland
Pipettenziehgerät DMZ-Universal-Puller
Fa. Zeitz, Augsburg, Deutschland
Borosilikatkapillaren, Länge: 7,5 cm,
Clark Electromedical Instruments,
Innendurchmesser: 0,9 mm, Wandstärke:
Pangbourne, Großbritannien
0,3 mm
Experimentierbad: Badkammer für 2 ml
Wolfgang Hampel, Neu Isenburg,
Volumen
Deutschland
Meß- und Referenzelektrode: Chlorierte
Silberdrähte (Silber-/SilberchloridElektrode)
Telemetrie TA11PA-C10
Fa. Data Quest International,
Portsmouth, Großbritannien
Netzteil EV243
Fa. PeqLab, Erlangen,
Deutschland
Elektrophoresebad, Agagel Mini Biometra
Fa. Blomed-Analytik, Göttingen,
Deutschland
Laborwaage BP310P
Fa. Sartorius, Göttingen,
Deutschland
Thermocycler
Gene Amp PCR System 2700,
Applied Biosystems, USA
Tabelle 2: Verwendete Geräte und Hersteller
3.3 Vorgehensweise
Der Verlust des TRPV4-Proteins und der endothelialen TRPV4-Funktion wurde
mit Hilfe von Western-Blot, Immunhistochemie und in situ-patch-clampTechniken an arteriellen Endothelzellen aus A.c.c. von TRPV4-/- Mäusen
nachgewiesen.
29
Vasodilatation, die durch Stimulation mit Azetylcholin und Wandschubspannung
hervorgerufen wird, wurde durch Druckmyographie an A.c.c. von TRPV4-/-Mäusen und Wildtypkontrollen gemessen.
3.4 Tiere
Die gezielte Genveränderung zur Schaffung einer KO-Maus wurde von Liedtke
et al. (Durham, Duke University NC) mittels Cre-lox-geführter Exzision von Exon
12 des TRPV4-Gens erreicht. Exon 12 codiert hierbei für die Porenschlaufe und
die angrenzende Transmembrandomäne (17,22).
Bei den TRPV4-/--Mäusen wurde der Verlust des TRPV4-Transkriptionsprodukts
mittels PCR, der des TRPV4-Proteins mittels Western-Blot eines Nierenextrakts
detektiert.
3.5 Gewichtsmessungen
Es erfolgten vor Entnahme der A.c.c. Gewichtsmessungen. Dabei wurden
gemessen:
Körpergewicht (in tiefer Äthernarkose), Herz (blutleer), Leber, Milz, rechte und
linke Niere, Blase (geleert), Thymus, Intestinum, Schilddrüse, Lunge, Gehirn.
3.6 Genotypisierung
3.6.1 Probenentnahme
Die Genotypisierung der TRPV4-Mäuse (Liedtke et al, 2003) erfolgte mittels
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR).
Dazu wurde zunächst ein etwa 8 mm langes Schwanzstück der Mäuse in einer
Lösung aus Tail-Buffer und Proteinase K (Verhältnis 10:1) bei 55°C für
mindestens 4 Stunden im Wasserbad inkubiert. Zur Denaturierung der
Proteinase wurde die Temperatur anschließend für weitere 20 min. auf 95°C
erhöht. Danach wurde den Proben 500 µL TE-Buffer (2M Tris-HCl mit 500 mM
EDTA im Verhältnis 5:2) zugegeben. So vorbereitet war es möglich, die Proben
bei Kühlschranktemperatur aufzubewahren.
30
3.6.2 PCR
Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) beruht auf
einer einfachen Idee, die Kary B. Mullis von der kalifornischen Firma Cetus
1984 hatte. Er erkannte, dass man bestimmte DNA-Polymerasen dazu
benutzen kann, im „Reagenzglas“ eine beliebige DNA-Sequenz, die einige
Kilobasen lang sein kann und zwischen 2 kleinen, bekannten DNA-Sequenzen
liegt, millionenfach zu vermehren. Dabei synthetisieren DNA-Polymerasen, wie
die prokaryotischen DNA-Polymerasen I, II, III oder die Säuger-DNAPolymerasen α, β, χ und δ, aus Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs) einen
neuen DNA-Strang. Heute wird aufgrund ihrer Thermostabilität die aus Thermus
aquaticus isolierte Taq-Polymerase verwendet, die ein Temperaturoptimum von
ca. 73°C besitzt und die Denaturierung der DNA gut übersteht. Alle
Polymerasen benötigen neben den genannten Desoxynukleosidtriphosphaten
und geeigneten Reaktionsbedingungen (pH, Salzkonzentration, Cofaktoren),
insbesondere einen einzelsträngigen DNA-Abschnitt als Vorlage oder Matrize
(Template), an den sie in 5´→3´-Richtung einen komplementären zweiten
Strang synthetisieren. Als „künstliche“ Startstelle kann an jede beliebige Stelle
eines Vorlagestranges ein kurzes einzelsträngiges DNA-Oligonukleotid (Primer)
mit einer zum Vorlagestrang komplementären Basensequenz gesetzt werden.
Durch den Einsatz von 2 Primern wird je eine Startstelle auf den beiden
Strängen
eines
DNA-Doppelstranges
festgelegt.
So
wird
durch
nacheinandergeschaltete DNA-Replikationsschritte ein doppelsträngiges DNAFragment hergestellt und amplifiziert, dessen Enden durch die beiden Primer
festgelegt werden.
Die praktische Durchführung der PCR lief wie folgt ab:
Zunächst wurde ein „Master Mix“ hergestellt. Dabei wurde die Reaktionslösung
für alle zu untersuchenden Proben zubereitet.
Die verwendeten Primer waren folgende:
Forward Primer 11 (bindet an Exon 11): CGCTTCCTGCTTGTGTACCT
Reverse Primer 13 (bindet an Exon 13): GGAGTGCCATCTGAGCTCTT
bzw. Reverse Primer 12 (bindet an Exon 12): CGATGGTGAGCTTGAAGAGG.
Für jede Probe ergab sich dabei folgende Zusammensetzung:
31
H2O:
15,5 µL
Pufferlösung:
2,5 µL
MgCl2 (50 mM):
1,25 µL
dNTPs:
1 µL
Forward Primer:
1 µL
Reverse Primer:
1 µL
Taq-Polymerase:
0,5 µL
Diese Reaktionslösung wurde dann mit jeweils 2,5 µL der Proben versetzt.
Anschließend erfolgte die Inkubation im Cycler gemäß folgendem Protokoll:
5 min.: 94°C; [25 Zyklen: 30s: 94°C; 30s: 55°C; 30s: 72°C]; 7min: 72°C;
∞ 4°C;
3.6.3 Gelelektrophorese
Um die DNA-Fragmente aufzutrennen und sichtbar zu machen, wurde im
Anschluss an die PCR eine Gelelektrophorese durchgeführt.
Die Herstellung des Agarosegels lief wie folgt ab: Zunächst wurde die Agarose
(400 mg) in 50 ml des Elektrophoresepuffers durch kurzes Aufkochen
(Mikrowelle) und vorsichtiges Schwenken aufgelöst. Nach dem Abkühlen der
Agaroselösung auf 45-50°C, wurden 2,5 µL der Ethidiumbromid-Stammlösung
zur Gellösung zugefügt. Anschließend wurde die Gellösung in die vorbereitete
Gießform des Flachbettgels eingefüllt. Nach Erstarren des Gels konnten die
Kämme entfernt und die Elektrophoresekammer soweit mit dem verdünnten
Elektrophoresepuffer aufgefüllt werden, dass der Flüssigkeitsspiegel einige
Millimeter über der Geloberfläche lag.
Es folgte das Einfüllen von jeweils 12 µL der Proben, die zuvor mit 4 µL Gloading Buffer versetzt worden waren, in die Taschen des Gels. Zur
Größenbestimmung der PCR-Fragmente wurde in eine Tasche ein DNALängenstandard eingefüllt.
Nach Aktivierung des Stromflusses dauerte es etwa 45 Minuten, bis der blaue
Pufferfarbstoff etwa 2,5 cm gewandert war.
Die Ethidiumbromid-gefärbten DNA-Fragmente im Gel wurden auf einen
Transilluminator
mit
UV-Licht
einer
Wellenlänge
von
302
nm
als
orangeleuchtende Banden sichtbar.
32
Dabei ergaben sich für den Exon 11 forward Primer und Exon 13 reverse
Primer folgende Fragmentlängen:
WT: ~3,6 kb
TRPV4-/-: ~2,0 kb.
Die Kombination Exon 11 forward Primer mit Exon 12 reverse Primer zeigte
folgende Produkte:
WT: ~1,7 kb
KO: kein Signal.
3.7 Immunhistochemie
Immunhistochemie
wurde
an
A.c.c.
von
TRPV4-/--
und
WT-Mäusen
durchgeführt. Die Tiere wurden hierfür mittels transkardieller Perfusion durch
10% neutralgepuffertes Formalin fixiert. Nachfixation erfolgte über Nacht im
selben Fixationsmedium, angereichert mit Saccharose. Von den gefrorenen
Blöcken
wurden
12µm
dicke
Schnitte
abgeschnitten,
fixiert
und
immunhistochemisch aufgearbeitet. Dafür wurde ein für den C-Terminus von
TRPV4 spezifischer Antikörper verwendet, der aus Kaninchen gewonnen
wurde. Er ist gegen ein synthetisches Peptid, das die Positionen 855 bis 873
des TRPV4 der Maus umspannt, gerichtet (CDGHQQGYPRKWRTDDAPL)
(Liedtke et al, 2003).
Diese Untersuchungen wurden in Kooperation mit Herrn Dr. Christian
Harteneck durchgeführt.
3.8 Western blot
Um den Verlust des TRPV4-Proteins nachzuweisen, wurden Western blotExperimente durchgeführt, wobei ein hochaffiner, polyklonaler Anti-TRPV4Antikörper verwendet wurde. Dieser war gegen das synthetisch hergestellte
Peptid gerichtet, das die Positionen 853 bis 868 (CDGHQQGYAPKWRTDD)
von TRPV4 umfasst (Reiter et al, 2006).
Diese Untersuchungen wurden in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. Wolfgang B.
Liedtke durchgeführt.
33
3.9 Gefäßpräparation
Die Mäuse wurden zunächst in tiefer Äthernarkose durch Entnahme des
Herzens getötet. Unter Vermeidung einer Überdehnung erfolgte im Anschluss
die Präparation beider Arteriae carotis communis (A.c.c).
Diese wurden im Anschluss entweder für die Vasoregibilitätsmessungen am
Druckmyographen direkt auf die Glaskapillaren aufgespannt oder für die
Endothelzellisolation bis zur Durchführung der Isolierung in kalte PBS-Lösung
überführt.
3.10 Elektrophysiologie
Für die Patch-Clamp-Experimente wurden aus der A.c.c. Endothelzellen
(carotid artery endothelial cell, CAEC) (Köhler et al, 2006) isoliert. Hierfür
wurden die linke und rechte A.c.c. von männlichen und weiblichen WT- und
TRPV4-/--Mäuse präpariert und deren Enden auf dünne Glaskapillaren
aufgezogen. Anschließend wurden die A.c.c.s in einem Phosphat-gepufferten
Salzbad ohne Ca2+/Mg2+ mit 0.05% Trypsin und 0.02% EDTA gefüllt und 10
Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dem folgte ein Auswaschvorgang. Daraufhin
wurden die Gefäße von außen komprimiert um die CAECs zu lösen. Bei den
longitudinal aufgeschnittenen A.c.c.s wurden schließlich von der luminalen
Seite aus vorsichtig mit einem sterilen Löffel die CAECs abgeschabt und im
Nährmedium in den Brutschrank gegeben.
Für die whole-cell patch-clamp-Experimente wurde die Patch-Pipette an die
Endotheloberfläche angenähert und eine einzelne Endothelzelle an der
Pipettenspitze fixiert, indem ein negativer Druck (- 5 mmHg) an die Pipette
angelegt wurde. Nach Erreichen eines Giga-Ω-Seals wurde die Zelle vorsichtig
aus dem Endothel herausgelöst. Um einen elektrischen Anschluss ans Zytosol
zu gewinnen, wurde der negative Druck im Pipetteninneren auf ~ -50 mmHg
erhöht. So konnte das Abreißen des Membranbereichs an der Pipettenspitze
erreicht werden.
Membranströme der CAEC wurden mittels eines EPC-9 (HEKA) patch-clampAmpifiers aufgezeichnet. Dabei kamen Spannungsrampen (Dauer: 1000 ms)
von –100 bis +100 mV zur Anwendung (Köhler et al, 2006). Anfängliche
ohmsche Leckströme bis zu 500 pS wurden subtrahiert. Hierfür wurde der
34
EPC9-Leckstrom-Korrektur-Modus verwendet. Zellen, die größere Leckströme
zeigten oder mit der Zeit unstabil wurden, fanden in der Auswertung keine
Berücksichtigung.
Die verwendeten Patch-Pipetten hatten in gleichwertiger KCl-Lösung einen
Spitzenwiderstand von 2-4 MΩ.
Dabei war die Standard-Pipettenlösung wie folgt zusammengesetzt:
20 mmol/L CsCl, 100 mmol/L Cäsium-Methan-Sulfonat, 1 mmol/L MgCl2, 4
mmol/L Na2ATP, 10 mmol/L EGTA, 0,9 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L HEPES, pH
eingestellt bei 7,2 mit CsOH.
Die berechnete Konzentration freier Ca2+-Ionen lag bei 0.04 µmol/L.
Die Badlösung war standardmäßig folgendermaßen zusammengesetzt:
137 mmol/L NaCl, 4,5 mmol/L Na2HPO4, 3 mmol/L KCl, 1,5 mmol/L KH2PO4,
0,4 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L Glucose und 1 mmol/L CaCl2. Der pH wurde auf
7,4 eingestellt.
Bei den Experimenten, bei denen mit hypotonem Stress gearbeitet wurde,
waren die isotonen und hypotonen Badlösungen wie folgt zusammengesetzt
(Angaben in mmol/L): 90 NaCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 Glucose, 10 HEPES,
pH 7.4. Die isotonen Lösungen enthielten zusätzlich 95 mmol/L Mannit.
Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Datenanalyse
erfolgte wie oben beschrieben (Köhler et al, 2001).
3.11 Druckmyograph
Mit dem Druckmyographen kann die Vasoreagibilität kleiner Arterien gemessen
werden. Das Besondere hierbei ist, dass die Messungen unter fast
physiologischen Bedingungen durchgeführt werden können. Dabei können
Perfusionsdruck und -geschwindigkeit je nach Experiment variiert werden,
während die Temperatur konstant bei 37°C eingestellt wird. Es ist eine
intravasale und extravasale Applikation von Substanzen möglich.
3.11.1 Versuchsaufbau
Das Experimentierbad verfügte über einen Zu- und Abfluß, die jeweils aus
dünnen
Glaskapillaren
bestanden.
An
diese
war
jeweils
über
ein
Schlauchsystem ein höhenverstellbares Flüssigkeitsreservoir angeschlossen,
35
welches mittels Joystick ausgerichtet werden konnte. So war es möglich, den
Druck vor und hinter dem zu untersuchenden Gefäß manuell zu regulieren. Der
entstehende intravasale Druck konnte dabei kontinuierlich von Drucksensoren
gemessen und aufgezeichnet werden. Die Temperatur des Experimentierbades
wurde über einen Messfühler konstant bei 37°C eingestellt.
Das so vorbereitete Bad wurde unter einem inversen Mikroskop befestigt.
Unterhalb des Experimentierbades befand sich eine Videokamera mit Hilfe
derer die Veränderungen des Gefäßdurchmessers kontinuierlich aufgezeichnet
und am angeschlossenen Monitor direkt verfolgt werden konnten. Auf dem
Bildschirm wurden zusätzlich der Gefäßdurchmesser (in Mikrometern), die
Temperatur in der Badlösung und der intravasale Druck des Gefäßes
angezeigt.
Über einen Dreiwegehahn am Zuflusssystem konnten mit einem zusätzlichen
Schlauchsystem verschiedene Substanzen intravasal appliziert werden. Der
hydrostatische Druck blieb dabei konstant. Dies wurde dadurch ermöglicht,
dass sich die Flüssigkeitsspiegel, die den intravasalen Druck erzeugten, jeweils
auf gleicher Höhe befanden.
Als Bad- und Perfusionslösung diente eine physiologische saline Lösung mit
folgender Zusammensetzung:
145 mmol/L NaCl, 1,2 mmol/L NaH2PO4, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgSO4,
2 mmol/L CaCl2, 5 mmol/L Glucose, 2 mmol/L Pyruvat und 3 mmol/L MOPSPuffer.
Sie enthielt je nach Experiment zusätzlich den NO-Synthase-Inhibitor NG-NitroL-Arginin (L-NNA, 300 µmol/L) sowie den Zyklooxygenase-Inhibitor Indometacin
(10 µmol/L) zur Unterbindung von NO- und Prostazyklin-Synthese.
Der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt.
In der Abbildung 4 wird der Versuchsaufbau schematisch dargestellt.
36
Höhenverstellbarer
Zu- und Ablauf
Mikroskop mit
Videokamera
Angeschlossener
Computer
Joystick
Steuerungseinheit
Experimentierbad
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Aufbaus des Druckmyographen
(nach: Pressure Myograph-Model P100 Bedienungsanleitung).
3.11.2 Versuchsablauf
Für die Versuchsdurchführung wurden die A.c.c. auf gleichbeschaffene
Glaskapillaren aufgespannt, unter einen Druck von 80 mmHg gesetzt und auf
in-vivo-Länge gebracht.
Zu Beginn einer jeden Versuchsreihe standen die A.c.c. unter einem
Perfusionsfluss von 30 µl/min. Dieser wurde durch Herstellung eines
Druckgradienten von 1 mmHg zwischen zu- und abführender Glaskapillare
erzeugt.
Nach einer Äquilibrierungszeit von 30 Minuten erfolgte die Stimulation der
Vorkontraktion der A.c.c. mittels 1 µmol/L Phenylephrin, das der Badlösung
zugesetzt wurde.
Nachdem sich ein stabiler Tonus eingestellt hatte, wurde der Druckgradient
zwischen zu- und abführender Glaskapillare auf 20 mmHg erhöht.
37
So stieg die Flussrate von 30 auf 600 µl/min an, was einer Erhöhung der
Wandschubspannung von ~0.1 auf 3 dyne/cm2 entspricht. Der mittlere
intraluminale Druck blieb unter diesen Bedingungen konstant bei 80 mmHg.
Um die durch Wandschubspannung hervorgerufene Vasodilatation isoliert zu
messen, wurde die Viskosität des Perfusionsmediums von 0.7 auf 2.9 mPa*s
erhöht. Die Flussrate blieb dabei konstant. Dies wurde durch den Zusatz von
5%igem Dextran zum Perfusionsmedium erreicht, was zu einer Erhöhung der
Wandschubspannung in den A.c.c. von ~3 auf 7 dyne/cm2 führt. Dabei wurde
die Wandschubspannung mathematisch mittels des Gesetzes von HagenPoiseuille geschätzt, das folgendermaßen lautet:
τ=
4ηQ
. Dabei gilt:
πr 2
τ=Wandschubspannung; η=Viskosität; Q=Fluss; r=Radius.
Bei anderen Versuchsreihen wurden die A.c.c. von 4αPDD (1 µmol/L) oder
Azetylcholin (Ach, 1 nmol/L – 10 µmol/L) in Ab- und Anwesenheit des NOSynthase-Inhibitors
NG-Nitro-L-Arginin
(L-NNA,
300
µmol/L)
und
des
Cyclooxygenase-Inhibitors Indometacin (INDO, 10 µmol/L) perfundiert.
Um die Abhängigkeit der durch 4αPDD-, erhöhte Wandschubspannung oder
Fluss/Reperfusion induzierten Vasodilatation von endothelialen, intrazellulären
Ca2+-Signalen zu untersuchen, wurde das Endothel im Ca2+-Chelator 1,2-bis-(oaminopenoxy)Ethan-N,N,N´,N´-Tetrazetisch aziden Tetra-(Acetoxy-Methyl)Ester
(BAPTA-AM, 10 µmol/L), der der Perfusionslösung zugesetzt wurde, für 10 min
vorinkubiert. Anschließend wurden die Stimulationsexperimente durchgeführt.
Bei einer anderen Versuchsreihe erfolgte die Vorinkubation mit dem PLA2Inhibitor 1,1,1-Trifluormethyl-6,9,12,15-Heieicosatetraen-2-one (AACOCF3, 3
µmol/L) 10 Minuten lang.
Die Änderungen des Durchmessers wurden als Prozentsatz der maximal
möglichen Dilatation angegeben, die durch 10 µmol/L Natrium-Nitroprussid
(SNP) hervorgerufen wurde.
Die Elastizität der A.c.c. wurde auf folgende Weise getestet:
Der intraluminale Druck wurde in Anwesenheit des NO-Donors SNP in
20 mmHg-Schritten bis auf 140 mmHg erhöht.
Zur Bestimmung der maximalen Kontraktionsfähigkeit der A.c.c. erfolgte das
Austauschen der Badlösung gegen eine Kaliumchloridlösung (60 mM) zum
Ende einer Experimentierreihe.
38
3.11.3 Datenaufzeichnung
Die Änderungen im Gefäßdurchmesser wurden mit dem Programm
„Vessel View“ 1.0 aufgezeichnet.
3.12 Statistische Analysen
Die vorliegenden Daten stellen Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes
(SEM) dar.
Hierbei gilt:
Mittelwert: √
∑
, wobei ∑
Um Unterschiede zwischen den Gruppen herauszustellen, wurde der unpaarige
Students t-Test verwendet.
Hierbei gilt:
√ ·
Das Signifikanzniveau wurde bei p-Werten von <0,05 festgelegt.
39
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Western Blot und Immunhistochemie
Vor den eigentlichen Untersuchungen stand der Nachweis des TRPV4Kationenkanals im verwendeten Material.
Dabei erfolgte die Messung der Expression des TRPV4-Proteins im Endothel
der A.c.c. und im Nierenextrakt von WT-Mäusen mittels Immunhistochemie und
Western-blot-Analysen wie oben beschrieben. Bei den TRPV4-/--Mäusen sollte
das Fehlen dieses Proteins nachgewiesen werden.
Im Material, das von TRPV4-WT-Mäusen gewonnen wurde, detektierte der
Antikörper ein ~95 kDa großes Protein. Dies stimmt mit dem für den TRPV4Kanal berechneten Molekulargewicht (98 kDa) gut überein.
Weiterhin wurde vom Antikörper ein zweites Protein mit der Größe von ~107
kDa detektiert. Dabei handelte es sich vermutlich um das glykosylierte TRPV4Protein (Liedtke et al, 2003).
Im Material, das von TRPV4-/--Mäusen extrahiert wurde, waren keine Signale
messbar (Abbildung 5).
Diese Ergebnisse wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. Wolfgang B.
Liedtke und Herrn Dr. Christian Harteneck erstellt.
40
Ergebnisse
Abbildung 5: Immunhistochemie und Western-blot-Analyse
Western
oben: Immunhistochemie für TRPV4 an A.c.c.
unten: Western-blot-Analyse
Western
der TRPV4-Protein-Expression
Expression in Nieren
N
-/von WTWT und TRPV4 -Mäusen.
Zu beachten ist das Fehlen der spezifischen Färbung bei den A.c.c. der
TRPV4-/--Mäuse.
Mäuse.
Me=Media, Lu=Lumen, En=Endothel
4.2 Elektrophysiologie
4.2.1 4αPDD
Zunächst erfolgten Patch-Clamp-Untersuchungen
Patch
Untersuchungen mit dem synthetischen
synthetisch
TRPV4-Aktivator 4αPDD.
PDD.
In
allen
In-situ-Patch--Clamp-Experimenten
Experimenten
an
CAEC
von
WT
WT-Mäusen
generierte 4αPDD
PDD (1µmol/L) auswärts-gerichtete Ströme
röme (Abb. 6 links).
Ruthenium Red
ed (RuR, 1µmol/L,
1µ
n=7), ein unselektiver TRPV--Kanal-Blocker,
unterdrückte
Einwärtsströme
Einwärtsströme
spannungsabhängig
auf
10
10±3%
des
41
Ergebnisse
Ausgangswertes. Ströme, die bei WT-Tieren durch 4αPDD induzierbar waren,
konnten in CAEC von TRPV4-/--Mäusen nicht ausgelöst werden (Abb. 6
rechts/Abb. 9 links).
an Endothelzellen der Arteria carotis communis von TRPV4-WT- und KO-Mäusen (Stimulation mit 4αPDD).
Links:
Repräsentative Aufzeichnung von durch 4αPDD
(1 µmol/L) induzierten TRPV4-Strömen in CAEC von WTTieren. Spannungsabhängige Inhibition durch Ruthenium
Red (1 µmol/L).
Rechts:
Keine Beobachtung von durch 4αPDD (1 µmol/L)
induzierbaren Strömen in CAEC der TRPV4-/--Mäuse.
4.2.2 Arachidonsäure
Auch
Arachidonsäure
wird
als
Aktivator
des
TRPV4-Kationenkanals
beschrieben (Watanabe et al, 2003).
Arachidonsäure (AA, 10µmol/L) generierte TRPV4-Ströme bei CAEC von WTTieren, die um 40±5% durch 1µmol/L RuR reduziert werden konnten (Abb. 7
links). Im Gegensatz dazu konnten nach Stimulation mit Arachidonsäure bei
CAEC von KO-Mäusen Ströme beobachtet werden, die signifikant kleiner waren
(Abb. 7 rechts/Abb. 9 Mitte).
42
Ergebnisse
an Endothelzellen der Arteria carotis communis von TRPV4-WT- und KO-Mäusen (Stimulation mit AA).
Links:
Repräsentative Aufzeichnung von durch Arachidonsäure
(AA; 10 µmol/L) induzierten TRPV4-Strömen in CAEC von
WT-Tieren und Blockade durch RuR (1 µmol/L)
Rechts:
Schwache, durch AA-induzierte Ströme in CAEC von
TRPV4-/--Mäusen.
4.2.3 Hypoosmotischer Stress
Da eine Aktivierung von TRPV4 vermutlich nicht nur über chemische
Stimulatoren erfolgt, sondern TRPV4 darüber hinaus als mechanosensitiver
Kanal diskutiert wird (Alessandri-Haber et al, 2003, Gao et al, 2003, Liedtke et
al, 2005, Alessandri-Haber et al, 2006), wurden Untersuchungen durchgeführt,
bei denen physikalischer Stress auf die Zellmembran ausgeübt wird.
So wurde mit – im Vergleich zum Zellinneren – hypotonen Badlösungen
gearbeitet, was zum Anschwellen der Zellen und so zur Dehnung der
Plasmamembran führt.
Dabei generierte hypoosmotischer Stress (HTS; 206 mosmol/L in der
Badlösung) TRPV4-Ströme in CAEC der WT-Tiere (Abb. 8 oben links). Diese
Ströme konnten durch RuR auf 35±5% des Ausgangswertes reduziert werden
(n=6; Abb. 8 unten links). Der fortbestehende, RuR-unempfindliche Strom,
konnte weiterhin durch Zugabe von 10µmol/L Gd3+, ein unspezifischer
anorganischer Blocker, der auf mechanosensitive und verschiedene TRPKanäle wirkt (Halaszovich et al, 2000, Trebak et al, 2002, Clapham, 2003,
Moran et al, 2004, Leffler et al, 2007), auf 10±4% inhibiert werden. Durch
43
Ergebnisse
Hypoosmolarität induzierte Ströme wurden auch in CAEC von TRPV4-/--Mäusen
beobachtet (Abb. 8 oben rechts), wobei die Amplituden dieser Ströme im
Vergleich zu den CAEC von WT-Tieren signifikant kleiner waren (Abb. 9
rechts). Dieser kleinere, durch Hypotonizität induzierbare Strom in CAEC von
TRPV4-/--Mäusen war gegenüber RuR unempfindlich, konnte aber durch 10
µmol/L Gd3+ um 70±5% verringert werden (Abb. 8 unten rechts).
an Endothelzellen der Arteria carotis communis von TRPV4-WT- und KO-Mäusen (Stimulation mit hypoosmolarem Stress).
Oben links: Durch hypoosmolaren Stress (HTS; 206 mosmol/L)
induzierte TRPV4-Ströme in CAEC von TRPV4-/--Tieren.
Oben rechts: Durch
hypoosmolaren
Stress
hervorgerufene
Kationenströme geringerer Amplitude in CAEC von
TRPV4-/--Mäusen.
Unten links: Partiell spannungsabhängige Inhibition der HTSinduzierten Ströme in CAEC von WT-Tieren und nahezu
vollständige Blockade mittels einer Kombination aus RuR
und Gd3+ (10 µmol/L).
Unten rechts: RuR-Insensitivität und Gd3+-Sensitivität der durch HTS
induzierten Kationenströme in CAEC von WT und
TRPV4-/--Mäusen.
44
Ergebnisse
Abbildung 9: Elektrophysiologische Eigenschaften von TRPV4-Strömen,
TRPV4 Strömen, gemessen
an Endothelzellen der Arteria carotis communis von TRPV4-WTTRPV4
und KO-Mäusen
Mäusen (Vergleich 4αPDD,
4 PDD, AA und hypoosmolarer Stress).
Mittelwerte der durch 4αPDD-, AA- und HTS-induzierbaren
induzierbaren TRPV4TRPV4 und
anderer Kationenströme in CAEC von TRPV4-WTTRPV4
und -KO-Mäusen.
Die Zahlen in Klammern stellen die Anzahl untersuchter Zellen dar. Bei
den aufgeführten Werten handelt es sich um Mittelwerte ±SEM;
*: P<0.05; **: P<0.01, t-Test
4.3 Untersuchungen am Druckmyographen
Um die funktionelle Rolle von TRPV4 im Endothel weiter zu untersuchen und
charakterisieren zu können, wurden Experimente am Druckmyographen
durchgeführt. Dabei wurde an Arteriae carotis communis von TRPV4-WTTRPV4
und
KO-Mäusen gearbeitet.
4.3.1
.1 Gefäßelastizität bei TRPV4-/--Mäusen
Hier wurde zunächst geprüft, ob ein struktureller Unterschied von A.c.c. der
TRPV4-WT- und –KO-Mäus
Mäusen die Gefäßelastizität verändert.
Es ergaben sich für die unter 80 mmHg Druck stehenden A.c.c. von WTWT und
KO-Mäusen
Mäusen jedoch keine Unterschiede im Durchmesser, unabhängig davon, ob
in An- oder Abwesenheit von NONO und Cyclooxygenaseinhibitoren (L-NNA
(L
und
INDO)
O) gearbeitet wurde (Abb. 10 A und B).
Zusätzlich wiesen TRPV4-KO-A.c.c.
TRPV4
im Vergleich zu WT-A.c.c.
A.c.c. eine ähnliche
passive Gefäßerweiterung auf, sobald der intravasale Druck vergrößert wurde
45
Ergebnisse
(Spannweite bis 140 mmHg). Diese Versuche wurden in Anwesenheit von SNP
durchgeführt,
um
mögliche
myogene
Kontraktionen
(Bayliss-Effekt)
auszuschließen (Abb. 10 D).
4.3.2 Kontraktion und Relaxation mit PE und SNP
Neben der Gefäßelastizität, die für die passive Einstellung eines adäquaten
Gefäßdurchmessers wichtig ist, wurden im Folgenden die aktiven Kontraktionsund die Relaxationsfähigkeit der A.c.c. der beiden Genotypen geprüft.
Verglichen wurde zunächst die Kontraktionsfähigkeit der A.c.c. von TRPV4-WTund KO-Mäusen.
Untersucht wurde dies mittels Zugabe von Phenylephrin (≤ 1 µmol/L) bzw.
durch Einfüllen einer spasmogen wirkenden hochprozentigen K+-Lösung (60
mmol/L) ins Experimentierbad.
Hinsichtlich der Gefäß-Kontraktion nach Zugabe von Phenylephrin, einem α1adrenerger Agonist (≤ 1 µmol/L) (Abb. 10 A, B und C) oder K+ (60 mmol/L)
(Abb. 10 A und B), unterschieden sich TRPV4-/-- und WT-Mäusen statistisch
nicht. Demnach scheint das Kontraktionsvermögen der A.c.c. von TRPV4-KOTieren normal zu sein.
Die Dilatationsfähigkeit der A.c.c. wurde mittels Sodium-Nitro-Prussid (SNP
untersucht.
Dabei war die durch SNP (10 µmol/L) ausgelöste Vasodilatation ebenfalls in
beiden Gruppen ähnlich (Abb. 10 A und B), was vermuten lässt, dass die vom
Endothel unabhängige Relaxation glatter Gefäßmuskelzellen durch das Fehlen
von TRPV4 nicht beeinträchtigt wird.
46
Ergebnisse
Abbildung 10: Gefäßelastizität
ßelastizität und Kontraktilität der Arteria carotis communis von
TRPV4-WT-- und -KO-Mäusen.
A und B:
Durchmesser der A.c.c., gemessen bei 80 mmHg (basal)
und in extravasaler Anwesenheit von Phenylephrin, K+,
und Natriumnitroprussid (SNP) in An- und Abwesenheit
Abwesenh
der NO-Synthase- und Cyclooxygenaseblocker NG-NitroL-Arginin (L-NNA, 300 µmol/L)
mol/L) und Indometacin (INDO,
10 µmol/L);
WT-A.c.c.:
-LNNA/INDO: n=11; +LNNA/INDO: n=8.
TRPV4-/--A.c.c.:
-LNNA/INDO: n=7; +LNNA/INDO: n=8.
C:
Dosisabhängige Kontraktion der A.c.c. von WT (CA; n=4)
und TRPV4-/--Mäusen
Mäusen (CA; n=4) nach Applikation von PE
in Anwesenheit von L-NNA und INDO.
D:
Änderungen des Gefäßdurchmessers (bezogen auf das
Körpergewicht) der A.c.c. von WT- (CA; n=13) und
TRPV4-/--Mäusen
Mäusen (CA; n=10) als Antwort auf erhöhten
intravasalen Druck in Anwesenheit von SNP.
Bei den Werten handelt es
e sich um Mittelwerte ± SEM.
47
Ergebnisse
4.3.3 4αPDD-induzierte Vasodilatation
4αPDD ist eine selektiver Aktivator von TRPV4-Kanälen, der TRPV4 mit einer
halbmaximalen Wirkkonzentration von 0,3 µM (Watanabe et al, 2002) stimuliert.
In der vorliegenden Untersuchung wurde selektiv das Endothel durch
intraluminale Applikation von 4αPDD (1 µmol/L) angeregt. 4αPDD erzeugte hier
eine mit ~60% sehr starke Vasodilatationsantwort in A.c.c. der WT-Mäuse (Abb.
11/12 A). Diese Vasodilatationsantwort konnte vollständig unterdrückt werden,
wenn 4αPDD in Kombination mit dem TRPV-Blocker RuR (1 µmol/L, wie in
anderen Untersuchungen der AG gezeigt wurde) appliziert wurde.
Zusätzlich wurde untersucht, ob 4αPDD eine EDHF-typische Vasodilatation in
WT-A.c.c. auslöst. Hier ist die EDHF-vermittelte Vasodilatation als die Form der
Vasodilatation definiert, die durch endothelabhängige Hyperpolarisierung glatter
Gefäßmuskelzellen
hervorgerufen
wird
und
resistent
gegenüber
einer
Kombination von Inhibitoren der NO-Synthase und Cyclooxygenase (L-NNA
und INDO) ist. In Anwesenheit beider Inhibitoren war die 4αPDD-induzierte
Vasodilatation deutlich auf ~30% vermindert, was darauf hinweist, dass die
pharmakologische
Aktivierung
von
TRPV4
eine
sowohl
NO-vermittelte
Vasodilatation als auch eine Vasodilatation vom EDHF-Typ in murinen A.c.c.
erzeugt (Abb. 11/12 A).
Bei den A.c.c. der Maus wurde diese durch 4αPDD induzierte Vasodilatation
vom EDHF-Typ durch Inhibition der SKCa- und IKCa-Kanäle, die die
zugrundeliegenden Effektoren des EDHF-Signals dieser Arterien (Si et al, 2006)
sind, nahezu ausgelöscht. Dabei wurden als Blocker UCL 1684 (1 µmol/L)
(Rosa et al, 1998) und TRAM-34 (1 µmol/L) (Wulff et al, 2000) (Abb. 11)
verwendet. Weiterhin konnte diese Antwort vom EDHF-Typ ebenso wie die
NO/PGI2-abhängige Komponente ausgelöscht werden, wenn das Endothel dem
Ca2+-Chelator BAPTA-AM ausgesetzt wurde, um endotheliale Ca2+-abhängige
Signale zu eliminieren (Abb. 11). Dadurch wird deutlich gezeigt, dass eine
Aktivierung des TRPV4-Kanals durch eine Applikation von 4αPDD eine
Vasodilatation hervorruft, die in entscheidender Weise vom Anstieg der
intrazellulären Ca2+-Konzentration der Endothelzelle abhängt.
Im Gegensatz zu den WT-Tieren konnte bei den TRPV4-/--Mäusen keine
vasodilatatorische Reaktion auf die Stimulation mit 4αPDD beobachtet werden.
48
Ergebnisse
Dabei
war
es
unerheblich,
unerheblich,
ob
mit
oder
ohne
NO
NO-
und
Cyclooxygenaseinhibitoren
bitoren gearbeitet wurde (Abb. 12 A).
Abbildung 11: Pharmakologische Eigenschaften von durch 4αPDD
4 PDD induzierter
Vasodilatation bei CA von Mäusen.
von links nach rechts:
Inhibition von Antworten vom EDHF-Typ
EDHF Typ (in Anwesenheit von L-NNA
L
und INDO) durch eine Kombination von IKCa/SKCa-Blockern
Blockern (TRAM-34
(1 µmol/L)
mol/L) und UCL 1684 (1 µmol/L);
mol/L); n=4), nachdem das Endothel 10
min lang BAPTA-AM
BAPTA AM (10 mol/L; n=6) ausgesetzt war, um intrazelluläres
Ca2+ abzupuffern.
Inhibition
der
zusammengesetzten
NO/EDHF
NO/EDHF-Antworten
(in Abwesenheit von
vo L-NNA und INDO) durch BAPTA-AM
AM (n=4).
Bezüglich der Kontrollen (ctrl, weiße Balken) sind die Werte ± SEM
Abbildung 12 zu entnehmen. ‫ ٭‬p<0,05; t-Test
4.3.4
.4 TRPV1 im Zusammenhang mit TRPV4
Es liegen Befunde vor, die eine Expression des mit TRPV4 engverwandten
engverwand
TRPV1-Subtyps
Subtyps in Arterien nahe legen (Yang et al, 2006)/(Ständer
(Ständer et al, 2004).
2004)
Dieser Kanaltyp könnte somit auch im Endothel
Endothel exprimiert und an
sprozessen beteiligt sein.
Um dies zu prüfen, wurde der TRPV1-Kanalöffner
TRPV1 Kanalöffner Capsaicin (1 µmol/L) als
selektiver Stimulus eingesetzt. Eine Perfusion der A.c.c. mit einer 1 µmolaren
Capsaicin Lösung verursachte jedoch keine
kei
Vasodilatation (keine Abbildung).
Abbildung)
Demnach scheint TRPV1 im Endothel der A.c.c. von TRPV4+/+- und TRPV4-/-Tieren nicht wesentlich exprimiert zu sein.
49
Ergebnisse
4.3.5 NO- und EDHF-mediierte
mediierte Vasodilatation in TRPV4-defizienten
TRPV4 defizienten Mäusen
TRPV4-Kanäle
Kanäle im vaskulären System
System wurden insbesondere im Zusammenhang
mit EDHF-vermittelten
vermittelten Dilatationsprozessen diskutiert (Nilius et al, 2003).
2003)
Die vorliegenden Untersuchungen zu Agonist-stimulierten
stimulierten Dilatationsprozessen
(hier durch Azetylcholin erzielt) ergaben, dass die kombinierten NO/EDHFNO/EDHF
vermittelten
ten Dilatationen (in Abwesenheit von L-NNA
L
und
nd INDO) bei TRPV4-/-Mäusen im Vergleich mit WT-Tieren
WT Tieren unverändert waren (Abb. 12 B). Die durch
Azetylcholin induzierte und allein EDHF-vermittelte
EDHF vermittelte Vasodilatation war in der
A.c.c. von TRPV4-/--Mäusen
Mäusen intakt und es konnten keine Unterschiede bzgl. der
Amplitude
litude der Dilatationen festgestellt werden (Abb. 12 C).
Abbildung 12: Phorbol-Ester,
Ester, 4α-phorbol-12,13-Didecanoat
4
(4αPDD;
PDD; 1µmol/L)
1µ
und
Azetylcholin--induzierte Endothel-abhängige
abhängige Vasodilatation in A.c.c. von
WT und TRPV4-/--Mäusen.
A:
4αPDD (1 µmol/L)-induzierte
induzierte Vasodilatation in A.c.c. von WTWT
und TRPV4-/--Mäusen in Ab- und Anwesenheit der NO-SynthaseNO
und Cyclooxygenase-Blocker
Cyclooxygenas
NG-Nitro-L-Arginin
Arginin (L-NNA,
(L
300
µmol/L)
mol/L) und Indometacin (INDO, 10 µmol/L).
WT-A.c.c.:
A.c.c.: -LNNA/INDO:
LNNA/INDO: n=12 und +LNNA/INDO: n=9.
50
Ergebnisse
B:
C:
TRPV4-/--A.c.c.: -LNNA/INDO: n=6 und +LNNA/INDO: n=8.
Gesamte Azetylcholin-induzierte Vasodilatation in A.c.c. von WT
(n=7) und TRPV4-/-- (n=6) Tieren in Abwesenheit von L-NNA und
INDO.
Gesamte Azetylcholin-induzierte Vasodilatation in A.c.c. von WT
(n=6) und TRPV4-/-- (n=6) Tieren in Anwesenheit von L-NNA und
INDO.
Bei den aufgeführten Werten handelt es sich um Mittelwerte ±
SEM. *: P<0.001, t-Test.
4.3.6 Vasodilatation auf Erhöhung der Wandschubspannung
In diesem Teil der Arbeit wurde die funktionelle Bedeutung von TRPV4 bei
untersucht,
die
durch
eine
Veränderung
der
Hämodynamik hervorgerufen wird.
Um die durch Wandschubspannung vermittelte Vasodilatation von TRPV4-/-und WT-Mäusen zu vergleichen, wurde die Viskosität des Perfusionsmediums
durch Zugabe von Dextran in einer Konzentration von 5% erhöht, was zu einer
physiologisch relevanten Erhöhung der Wandschubspannung von ~3 auf 7
dyn/cm2 führt. Bei den WT-Mäusen führte die Erhöhung der Viskosität zu einer
Vasodilatation
von
~20%
in
Abwesenheit
der
NO-Synthase-
und
Cyclooxygenaseinhibitoren (Abb. 13 A). Eine Blockierung der Cyclooxygenasen
verkleinerte
diese
Antwort
nicht,
was
vermuten
lässt,
dass
die
Prostacyclinproduktion zu dieser vasodilatatorischen Antwort keinen Beitrag
leistet.
In
Anwesenheit
beider
Inhibitoren
hatte
die
Erhöhung
der
Wandschubspannung eine insgesamt verringerte Vasodilatation von nur noch
~10% zur Folge, die ausschließlich über das EDHF-System vermittelt war (Abb.
13 A). So ist festzustellen, dass die Vasodilatationsantwort auf Stimulation mit
erhöhter Wandschubspannung zu annährend gleichen Teilen über NO und
EDHF vermittelt wird. Ferner war die EDHF-Komponente durch Inhibition
endothelialer SKCa- und IKCa-Kanäle (mittels UCL 1684 und TRAM-34) nahezu
vollständig aufgehoben (Abbildung 14A), was die übergeordnete Bedeutung
dieser endothelialen KCa-Kanäle für EDHF-vermittelte Vasodilatationsprozesse
belegt,
insbesondere
für
die
Dilatationsprozesse,
die
durch
erhöhte
Wandschubspannung induziert werden. Ein Abpuffern des endothelialen Ca2+
(mittels BAPTA-AM) hob auch hier sowohl das EDHF-Signal allein als auch die
gemeinsame NO/EDHF-vermittelte Antwort zum großen Teil auf (Abbildung
14A), ähnlich dem Effekt, wie er bei 4αPDD-Antworten beobachtet wurde.
51
Ergebnisse
Es wurden weiterhin Untersuchungen mit AACOCF3 durchgeführt. AACOCF3
wurde hierbei verwendet, um der Freisetzung von AA und der Produktion von
AA-Metaboliten, also von potentiellen endogenen Aktivatoren von TRPV4,
vorzubeugen (Vriens et al, 2005)/(Watanabe et al, 2003).
Die durch Wandschubspannung induzierte Vasodilatation der A.c.c. der Maus
konnte durch den TRPV-Blocker RuR oder mittels vorausgehender Inkubation
mit 3 µmol/L AACOCF3 (Abbildung 14A) blockiert werden.
Bei TRPV4-/-- Tieren war die über erhöhte Wandschubspannung vermittelte
Vasodilatation nicht zu beobachten. Es zeigte sich vielmehr eine schwache
Vasokonstriktion (Abb. 13 A).
4.3.7 Flussinduzierte Vasodilatation
Die
flussinduzierte
Vasodilatation
ist
ein
wichtiger
Mechanismus
zur
Aufrechterhaltung einer adäquaten Organperfusion zur Sauerstoff- und
Nährstoffversorgung des Gewebes. Es liegen Berichte vor, dass TRPV4 hier an
den Signalmechanismen der Mechanotransduktion beteiligt ist (Taniguchi et al,
2007)/(O'Neil et al, 2005)/(Loot et al, 2008)/(Wu et al, 2007). In der
vorliegenden Studie wurde daher untersucht, ob durch das Fehlen endothelialer
TRPV4-Kanäle diese Art hämodynamischer Stimulation und die konsekutive
Vasodilatation verändert oder gar gestört ist. Eine Flussstimulation wurde über
eine Erhöhung der Flussrate von sehr niedrigen Werten (30 µl/min) auf 600
µl/min erhöht. Diese Erhöhung der Flussrate entspricht einer berechneten
Erhöhung der Wandschubspannung von ~0,1 auf 3 dyn/cm2, was annährend
physiologischen Durchflussraten entspricht.
Bei WT-Mäusen wurde auf diesen Stimulus eine Vasodilatation von ~30% bei
intakter NO-Synthese und PGI2-Synthese (in Abwesenheit von L-NNA und
INDO) beobachtet (Abb. 13 B). Eine weitere Erhöhung der Durchflussrate von
600 µl/min auf 900 µl/min führte jedoch nicht zu einer weiteren Vasodilatation.
Ähnlich
der
durch Wandschubspannung
induzierten
vasodilatatorischen
Antworten war die flussinduzierte und EDHF-mediierte Vasodilatation (in
Anwesenheit von L-NNA und INDO) auf ~10% reduziert (Abb. 13 B). Die
alleinige Inhibition der Cyclooxygenase hatte keine Verminderung der
flussinduzierten Vasodilatation zur Folge, was darauf hindeutet, dass PGI2 an
52
Ergebnisse
den flussinduzierten Dilatationsprozessen in der A.c.c. der Maus nicht
nennenswert beteiligt ist.
In Anwesenheit endothelialer SKCa- und IKCa-Kanalinhibitoren
Kanalinhibitoren war die EDHFEDHF
Antwort (in Anwesenheit der NO- und Cyclooxygenaseinhibitoren) vollständig
volls
unterdrückt
(Abbildung
14B).
14B).
Ähnlich
wie
bei
den
durch
erhöhte
Wandschubspannung und 4αPDD
4 PDD hervorgerufenen Antworten,
Antworten führte ein
Abpuffern des intrazellulären endothelialen Ca2+-Spiegels
gels mit dem Ca2+Chelators BAPTA-AM
AM auch zur Unterdrückung des EDHF-Anteils
EDHF
der
flussinduzierten Antwort und zu einer deutlichen Reduktion der gesamten
NO/EDHF-Antwort
Antwort um ca. 17 % (Abbildung 14B).
). Dies deutet darauf hin, dass
die flussinduzierte und EDHF-mediierte
EDHF
Vasodilatation strikt
rikt von einer Erhöhung
der
intrazellulären
Ca2+-Konzentration
Konzentration
abhängt
ist,
wohingegen
die
flussinduzierte NO-vermittelte
vermittelte Vasodilatation partiell Ca2+-unabhängig
unabhängig erscheint.
Es zeigte sich in weiteren Versuchsreihen, dass eine pharmakologische
Inhibition der PLA2
mittels des PLA2 selektiven Inhibitors AACOCF3 die
flussinduzierte und NO/EDHF-vermittelte
NO/EDHF
Vasodilatation signifikant
fikant unterdrückt
(Abbildung 14B).
Der Vergleich der flussinduzierten Antworten bei TRPV4-/--Mäusen
Mäusen und WTWT
Tieren
ergab,
dass
bei
den
K Mäusen
KO-Mäusen
eine
signifikant
reduzierte
Vasodilatation von ~15% bzw. 5% in AbAb bzw. Anwesenheit der NO-SynthaseNO
und Cyclooxygenaseinhibitoren vorlag (Abb. 13 B).
Abbildung 13: Durch Wandschubspannung und Fluss induzierte Vasodilatation in A.c.c.
von WT und
d TRPV4-/--Mäusen.
A:
Durch Wandschubspannung induzierte Vasodilatation in A.c.c.
von WTWT und TRPV4-/--Mäusen in Ab- und Anwesenheit der NONO
53
Ergebnisse
B:
Synthase- und Cyclooxygenase-Inhibitoren NG-Nitro
Synthase
Nitro-L-Arginin (LNNA, 300 µmol/L) und Indometacin (INDO, 10 µmol/L);
WT-A.c.c.:
A.c.c.: n=12 (-L-NNA/INDO)
(
und n=9 (+L-NNA/INDO).
NNA/INDO).
TRPV4-/--A.c.c.: n=6 (-L-NNA/INDO) und n=8 (+L--NNA/INDO).
Durch Wandschubspannung induzierte Vasodilatation wurde
durch Wechsel zu einem Perfusionsmedium, das 5% Dextran
enthielt, ausgelöst.
Flussinduz
sinduzierte
ierte Vasodilatation bei A.c.c. von WTWT und TRPV4-/-Mäusen in AbAb und Anwesenheit von L-NNA
NNA und INDO.
WT-A.c.c.:
A.c.c.: n=9 (-L-NNA/INDO)
(
und n=8 (+L-NNA/INDO).
NNA/INDO).
TRPV4-/--A.c.c.: n=7 (-L-NNA/INDO) und n=7 (+L--NNA/INDO).
Bei den aufgeführten Werten handelt es sich
sich um Mittelwerte ±
SEM. *: P<0.05; **: P<0.01, t-Test.
Abbildung 14: Pharmakologische Eigenschaften von wandschubspannung
andschubspannungs- und
flussinduzierter
induzierter Vasodilatation in A.c.c. von TRPV4+/+-Mäusen.
Mäusen.
A:
Inhibition von durch Wandschubspannung
Wandschubspannung induzierten Antworten
vom EDHF-Typ
EDHF
durch IKCa/SKCa-Blocker
Blocker (n=11), nachdem
intrazelluläres Ca2+ mit BAPTA-AM
AM abgepuffert wurde (n=7).
Inhibition der zusammengesetzten NO/EDHF-Antworten
NO/EDHF Antworten durch
BAPTA
BAPTA-AM
(n=8), den TRPV4-Blocker
Blocker RuR (1 µmol/L; n=4) und
durch den PLA2-Inhibitor AACOCF3 (3 µmol/L;
mol/L; n=4).
Bezüglich der Kontrollen (ctrl, weiße Balken) sind die Werte ±
SEM Abbildung 13A zu entnehmen. ‫ ٭‬p<0,05; t-Test.
Test.
B:
Inhibition der Antworten vom EDHF-Typ
Typ durch IKCa/SKCa-Blocker
(n=5), und Abpufferung des intrazelluläres Ca2+ durch BAPTAAM (n=3).
Inhibition von zusammengesetzten NO/EDHF-Antworten
NO/EDHF Antworten durch
BAPTA
BAPTA-AM
(n=7) und den PLA2-Inhibitor
Inhibitor AACOCF3 (n=8).
Bezüglich der Kontrollen (ctrl, weiße Balken) sind die Werte ±
SEM der Abbildung 13B
13 zu entnehmen. ‫ ٭‬p<0,05; t-Test.
54
Diskussion
5. Diskussion
Ziel dieser Dissertationsarbeit war es, die funktionelle Bedeutung des TRPV4Kationenkanals
für
endothelabhängige
zu
charakterisieren. Es sollte dabei speziell untersucht werden, inwieweit
endotheliale und osmo-/mechanosensitive Ca2+-permeable TRPV4-Kanäle für
die
Azetylcholin-induzierte
Vasodilatation
und
für
die
wandschub-
spannungsinduzierte Vasodilatationen mechanistisch bedeutend sind. Hierzu
wurden Untersuchungen an TRPV4-WT- und –KO-Mäusen durchgeführt. Die
Ergebnisse
zeigen
eine
Schlüsselfunktion
des
Vasodilatation
Kanals
auf.
bei
Für
der
die
agonisteninduzierte Vasodilatation konnte nachgewiesen werden, dass TRPV4
hierbei keine Rolle spielt.
Im Folgenden werden nun diese erzielten Ergebnisse diskutiert.
5.1 Elektrophysiologische Charakterisierung des
endothelialen TRPV4 am Endothel der murinen A.c.c.
In TRPV4-WT-Tieren konnte mittels elektrophysiologischer Patch-clampUntersuchungen in CAEC der A.c.c. eine funktionelle Expression von TRPV4
nachgewiesen werden. So konnten in CAEC von WT-Mäusen unter
Verwendung des synthetischen und selektiven TRPV4-Agonisten 4αPDD, mit
AA und durch hypoosmotischen Stress Ströme induziert werden, die für
TRPV4-charakteristische Eigenschaften wie Auswärtsrektifizierung und eine
Sensivität auf den TRPV4-Blocker RuR aufwiesen. Während die durch 4αPDDinduzierten Ströme vollständig durch RuR inhibierbar waren, war dies bei den
durch AA und HTS induzierten Strömen nur partiell der Fall. Der gegenüber
RuR insensitive Strom konnte durch Gd3+, ein Blocker von mechanosensitiven
und TRP-Kanälen, inhibiert werden, was auf einen kleineren Beitrag anderer
AA-sensitiver
Kationenkanäle
und/oder
HTS-sensitiver
mechanisch
induzierbarer Kanäle noch undefinierter molekularer Natur und/oder anderer
TRP-Kanäle hindeutet.
Diese Schlussfolgerung wurde durch die Untersuchungen an CAEC von
TRPV4-defizienten Mäusen gestützt. So waren in CAEC von TRPV4-/--Mäusen
4αPDD-sensitive Ströme nicht nachweisbar. Dies zeigt auch, dass 4αPDD ein
55
Diskussion
TRPV4-selektiver Aktivator ist. Es wurde ebenfalls eine starke Abschwächung
der durch Arachidonsäure und hypotones Zellschwellen induzierten Ströme bei
CAEC von TRPV4-/--Mäusen festgestellt.
Die Tatsache, dass es sich nicht um ein vollständiges Fehlen dieser Ströme
handelt, unterstützt die Hypothese der Beteiligung weiterer Ionenkanäle an
diesen Strömen.
Vergleichbare Ergebnisse wurden auch bei Endothelzellen aus Mäuseaorten
(Vriens et al, 2005) eines anderen TRPV4-/--Stammes (Suzuki et al, 2003)
erzielt. TRPV4-aktivierende Stimuli wie 4αPDD, AA, AA-Metabolite (EETs) und
HTS konnten weder TRPV4-charakteristische Ströme noch TRPV4-assoziierte
Ca2+-Antworten hervorrufen (Vriens et al, 2005).
Diese pharmakologischen Untersuchungen stützen also die These, dass
TRPV4 in CAEC von Mäusen funktionell exprimiert ist, durch 4αPDD spezifisch
aktiviert wird und an den AA- und HTS-induzierten Strömen neben anderen
Ionenkanälen beteiligt ist.
5.2 Bedeutung des TRPV4 für die Regulation des
Gefäßtonus
5.2.1 Einfluss von TRPV4 auf Gefäßelastizität und Kontraktilität der A.c.c.
Im Hinblick auf die Gefäßelastizität von TRPV4-Tieren konnte gezeigt werden,
dass sich für die bei 80 mmHg druckequilibrierten A.c.c. von WT- und KOMäusen keine Unterschiede im Durchmesser ergaben. Dabei war nicht von
Bedeutung,
ob
in
An-
oder
Abwesenheit
von
NO-
und
Cyclooxygenaseinhibitoren gearbeitet wurde. Zusätzlich wiesen TRPV4-/--A.c.c.
im Vergleich zu WT-A.c.c. eine ähnliche passive Gefäßerweiterung auf, wenn
der intravasale Druck gesteigert wurde (Spannweite 0-140 mmHg).
Auch die Kontraktion der Gefäße nach Zugabe von Phenylephrin oder K+
unterschied sich statistisch nicht bei TRPV4-/-- und WT-Mäusen.
Die durch Sodium-Nitro-Prussid ausgelöste Vasodilatation war ebenfalls in
beiden Gruppen ähnlich.
56
Diskussion
Diese Ergebnisse zeigen also einerseits, dass das Fehlen des TRPV4 Kanals in
A.c.c. glattmuskuläre Funktionen nicht beeinträchtigt. Somit lässt sich darauf
schließen, dass TRPV4 für die glattmuskulären Funktionen wie Kontraktilität
und endothelunabhängige Relaxationsfähigkeit, keine nennenswerte Bedeutung
in der murinen A.c.c. hat. Dass TRPV4 auch an der Kontraktilität in anderen
Organen nicht beteiligt zu sein scheint, wird durch Untersuchungen anderer
Arbeitsgruppen
Arbeitsgruppe,
gestützt.
die
mit
Untersuchungen
Hilfe
des
neuen
von
Willette
selektiven
und
seiner
TRPV4-Aktivator
GSK1016760A durchgeführt wurden, ergaben dass GSK1016760A die
Kontraktilität isolierter, pufferperfundierten Rattenherzen nicht veränderte
(Willette et al, 2008). Birder und Kollegen untersuchten die Kontraktilität von
Rattenblasen. Sie stellten fest, dass 4αPDD die Kontraktilität elektrisch
stimulierter Blasenmuskulatur nicht beeinflusste (Birder et al, 2007).
Andererseits konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die
Elastizität und die Antwort auf statischen mechanischen Druck im Gefäßinneren
TRPV4-unabhängig sind.
Insgesamt deuten diese Befunde also darauf hin, dass die Gesamtcompliance
durch den Verlust von TRPV4 nicht beeinträchtigt wird.
5.2.2 TRPV4 und 4αPDD-induzierte Vasodilatation
Die Druckmyographenexperimente ließen erkennen, dass der selektive TRPV4Aktivator
4αPDD
bei
den
TRPV4-WT-Mäusen
eine
robuste
Vasodilatationsantwort von bis zu 60% der maximal möglichen Vasodilatation
auslöste. Diese ist somit vergleichbar mit der Antwort, die durch Stimulation mit
hohen Konzentrationen des klassischen Agonisten Azetylcholin hervorgerufen
wurde.
Die 4αPDD-induzierte Vasodilatation konnte durch Blockade der NO-Synthese
nur partiell inhibiert werden, was auf eine Beteiligung von sowohl NO- als auch
EDHF-mediierten Prozessen hindeutet. Durch 4αPDD induzierte EDHFAntworten wurden auch bei Arbeiten an der A. gracilis von Ratten beobachtet
(Köhler et al, 2006). Im Gegensatz zu den vorliegenden Ergebnissen bei den
TRPV4-Mäusen wurden bei den A.c.c. der Ratte keine EDHF-Antworten
festgestellt.
57
Diskussion
Der Anteil des EDHF-Weges an der endothelvermittelten Vasodilatation nimmt
mit zunehmend kleineren Gefäßdurchmessern zu und ist in größeren Gefäßen
eher klein oder vernachlässigbar (Köhler et al, 2006)/(Si et al, 2006)/(Eichler et
al, 2003). Dieser Umstand könnte also erklären, warum in den rein
morphologisch größeren A.c.c. der Ratte keine 4αPDD induzierte EDHFAntworten zu beobachten waren.
Bei TRPV4-/--Mäusen konnte keine NO- oder EDHF-mediierte Vasodilatation
nach Stimulation mit 4αPDD beobachtet werden.
Dies ist ein klarer Beweis dafür, dass die durch 4αPDD induzierte
Vasodilatation bei WT-Mäusen durch TRPV4 vermittelt ist. Die robuste
Amplitude dieser vasodilatatorischen Antwort bei den TRPV4+/+-Tieren weist auf
die zentrale Rolle von TRPV4 bei der endothelabhängigen Regulation des
Vasotonus hin.
5.2.3 TRPV4 und azetylcholininduzierte NO- und EDHF-mediierte
Vasodilatation
Insgesamt war die azetylcholininduzierte Vasodilatation bei TRPV4-/--Mäusen
im Vergleich zu TRPV4+/+-Tieren unverändert. Dies gilt sowohl für die NO- als
auch für die EDHF-vermittelte Vasodilatation.
Diese Ergebnisse zeigen also, dass TRPV4 an der azetylcholininduzierten und
NO- oder EDHF-vermittelten Vasodilatation der A.c.c. nicht wesentlich oder gar
nicht beteiligt ist und damit möglicherweise bei dem agonisten-induzierten Ca2+Einstrom im Endothel von murinen Leitungsarterien keine Rolle spielt. Dass
TRPV4 jedoch in kleineren Arterien an dieser Stelle eine Rolle spielen kann,
zeigte
eine
Studie
von
Zhang
et
al,
bei
der
eine
verminderte
azetylcholininduzierte Vasodilatation kleiner Mesenterialarterieren bei TRPV4-/-Mäusen beobachtet wurde (Zhang et al, 2009).
Eine weitere Untersuchung an Zerebralarterien der Ratte zeigte, dass der
TRPV4-Inhibitor RuR auch eine agonisteninduzierte Vasodilatation (Stimulus:
UTP) reduziert (Marrelli et al, 2007).
Dies deutet darauf hin, dass TRPV4 gefäßbettspezifisch und möglicherweise
speziesspezifisch auch an azetylcholininduzierten Vasodilatationsprozessen
58
Diskussion
beteiligt sein kann. Dies muss jedoch in weiteren Untersuchungen geklärt
werden.
5.2.4 TRPV4 und dessen Beitrag zur wandschubspannungsinduzierten
Vasodilatation
Bei TRPV4+/+-Mäusen konnte eine durch erhöhte Wandschubspannung
induzierte Vasodilatation beobachtet werden.
Diese war dabei sowohl NO- als auch EDHF-mediiert. Bezüglich der Beteiligung
der
verschiedenen
endothelialen
Vasodilatationssysteme
gibt
es
unterschiedliche Erkenntnisse. In Studien von Köhler et al, Holtz et al und
Joannides et al wurde festgestellt, dass in der A.c.c. und in der Arteria gracilis
der Ratte (Köhler et al, 2007) und in anderen Spezies (Holtz et al, 1984) aber
auch bei humanen Arterien (Joannides et al, 1995) die vasodilatorischen
Antworten auf erhöhte Wandschubspannung ausschließlich NO vermittelt sind.
Sun et al. hingegen kamen für Mäuse zu dem Ergebnis, dass die shear stress
induzierte Vasodilatation sowohl PGI2- als auch NO-mediiert wird (Sun et al,
1999).
Die Befunde der vorliegenden Arbeit zeigen nun, dass eine erhöhte
Wandschubspannung neben NO-mediierten Antworten auch eine EDHFAntwort in der A.c.c. der Maus erzeugt.
Eine wichtige Fragestellung dieser Arbeit war, ob der putativ mechanosensitive
TRPV4-Kationenkanal für Vasodilatationsprozesse, die durch eine erhöhte
Wandschubspannung induziert werden, funktionell bedeutend ist. In der
vorliegenden Arbeit konnte hierzu festgestellt werden, dass die durch
Wandschubspannung induzierte Vasodilatation durch RuR blockiert werden
kann. Auch in vorhergehenden Untersuchungen an der A. carotis communis der
Ratte
konnte
eine
durch
erhöhte
Wandschubspannung
ausgelöste
Vasodilatation durch RuR gehemmt werden (Köhler et al, 2006). Da RuR als
Blocker von TRPV4-Kanälen angesehen wird, sprechen diese Befunde der
vorliegenden Arbeit zusammen mit früheren Befunden für eine Beteiligung von
TRPV4 an den zugrunde liegenden Signaltransduktionsmechanismen.
59
Diskussion
Das Puffern des endothelialen [Ca2+]i mit BAPTA-AM hatte bei diesen
Untersuchungen eine Suppression der durch erhöhte Wandschubspannung
induzierten Vasodilatation zur Folge. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte
durch BAPTA-AM eine Unterdrückung der wandschubspannungsinduzierten
Vasodilatation beobachtet werden. Diese Befunde legen also bereits nahe,
dass eine Erhöhung der Wandschubspannung über die Aktivierung von TRPV4
eine Erhöhung der [Ca2+]i generiert und somit die calciumabhängige Bildung
von NO und des EDHF-Signals induziert.
Bezüglich der beteiligten intrazellulären Signaltransduktionskaskaden, die
möglicherweise zur Aktivierung von TRPV4 führen, konnte in dieser Arbeit
festgestellt werden, dass eine Inhibition der PLA2 und damit der AA-Freisetzung
mittels des selektiven Antagonisten AACOCF3 die wandschubspannungsinduzierte Vasodilatation unterdrückt. Dieser Befund steht im Einklang zu
vorhergehenden Untersuchungen an der A.c.c. der Ratte (Köhler et al, 2006).
Da AA als endogener Aktivator bzw. als Vorläufersubstanz diskutiert wird,
unterstützen diese Befunde weiter die Annahme, dass TRPV4 an dieser
endothelialen Mechanotransduktion beteiligt ist. Diese Abhängigkeit von einer
intakten AA-Bildung könnte aber auch daraufhin deuten, dass TRPV4-Kanäle
damit nicht direkt als Mechanosensoren fungieren, sondern entscheidende
Komponenten einer nachgeschalteten Signalkaskade darstellen (Liedtke et al,
2005).
Ein sehr wichtiger Befund der vorliegenden Untersuchung ist, dass das Fehlen
des TRPV4 in bei TRPV4-/--Mäusen zu einem vollständigen Verlust der
Vasodilatation
führte.
Neben
dem
pharmakologischen Befund belegt dieser Befund nun klar, dass der
endotheliale TRPV4 von übergeordneter Bedeutung ist und als wesentlicher
Bestandteil der Signaltransduktionsmechanismen, die wandschubspannungsinduzierte
Vasodilationsprozesse
vermitteln,
angesehen
werden
kann.
Interessant ist dabei auch, dass in Abwesenheit von TRPV4 dessen Funktion
nicht durch einen anderen TRP-Kanal oder alternativen Signaltransduktionsweg
kompensiert werden kann.
60
Diskussion
Insgesamt zeigen also die Befunde zur Wandschubspannung bei TRPV4+/+und TRPV4-/--Mäusen, dass der Ca2+-Einstrom durch TRPV4 einen wichtigen
Schritt
bei
der
endothelialen
Mechanotransduktion
als
Antwort
auf
Wandschubspannung darstellt.
5.2.5 Flussinduzierte Vasodilatation
Bei den durchgeführten Untersuchungen konnte außerdem festgestellt werden,
dass die A.c.c. der TRPV4-/--Mäuse eine abgeschwächte Vasodilatation bei
Wiederherstellung des Flusses durch das Gefäß zeigten. Diese durch Fluss
ausgelöste Vasodilatation ist ein komplexer Ablauf, der sowohl Ca2+-abhängig
als
auch
Ca2+-unabhängig,
NO-
und
EDHF-vermittelt
und
streng
endothelabhängig ist (Falcone et al, 1993)/(Muller et al, 1999)/(Fleming et al,
1998). Unter diesen Gesichtspunkten betrachtet, zeigt er Ähnlichkeiten zur
durch Wandschubspannung hervorgerufenen Vasodilatation.
Diese Befunde lassen also weiterhin vermuten, dass TRPV4 auch entscheidend
an der Signaltransduktion der durch Fluss induzierten Vasodilatationsprozesse
beteiligt ist.
Analog zu den Befunden zur wandschubspannungsinduzierten Vasodilatation,
führte die pharmakologische Inhibition der PLA2 durch AACOCF3 auch zu einer
Unterdrückung der flussinduzierten und NO/EDHF-vermittelten Vasodilatation.
Dies weist darauf hin, dass die Freisetzung von AA aus der Zellmembran und
die Bildung von AA-Metaboliten mit konsekutiver Aktivierung von TRPV4 auch
wichtig für die flussinduzierte Vasodilatation ist.
Die Beobachtung, dass TRPV4 eine Rolle bei der Wahrnehmung von Fluss
spielt, ergaben auch Untersuchungen am Epithel kortikaler Sammelrohre von
Mäusen (Wu et al, 2007)/(Taniguchi et al, 2007). In einer kürzlich erschienenen
Studie von Loot et al. konnte gezeigt werden, dass durch RuR speziell EDHFvermittelte flussinduzierte Vasodilatation inhibiert wird (Loot et al, 2008). Diese
Studien geben zusammen mit den vorliegenden Befunden also weitere gute
Hinweise dafür, dass TRPV4 auch an flussinduzierten Prozessen beteiligt ist.
Insgesamt legen diese Befunde in den unterschiedlichen Geweben nahe, dass
TRPV4 eine wichtige Komponente bei Mechanotransduktionsprozessen von
physikalischen Strömungsreizen darstellt.
61
Diskussion
5.3 Pharmakologische Relevanz
Bezüglich der pharmakologischen Relevanz von TRPV4 ist grundsätzlich zu
sagen, dass TRPV4 aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der Regulation des
vaskulären Tonus über intrazelluläre Ca2+-Signale und daher bei der Synthese
von vasodilatatorisch wirksamen Faktoren ein pharmakotherapeutisches
Zielmolekül darstellt. Es kann dabei vermutet werden, dass TRP-Kanalöffner
eine
antihypertensive
Wirksamkeit
haben
könnten,
indem
über
eine
pharmakologische Aktivierung von TRP-Kanälen ein erhöhter Ca2+-Einstrom die
endotheliale
Funktion
durch
Förderung
der
Synthese
endothelialer
Vasodilatatoren verbessert. Aufgrund der heterogenen Expression von TRPV4
auch im Epithel der Atemwege und der Niere, im autonomen Nervensystem und
hier speziell in den sympathischen Nerven, welche Gefäße innervieren, und im
Gehirn (z.B. in neurosensorischen Zellen der zircumventrikulären Organe, die
sensibel gegenüber dem systemischen osmotischen Druck sind) könnten sich
aber eine Vielzahl von Nebenwirkungen einstellen.
Kürzlich von Willette et al. durchgeführte Untersuchungen an Mäusen zeigten,
dass eine Aktivierung von TRPV4 mittels GSK1016790A, einem neuartigen
TRPV4-Aktivator,
einen
Abfall
des
Blutdrucks
-
gefolgt
von
einem
Kreislaufkollaps - zur Folge hat. Bei TRPV4-/--Mäusen hatte eine Applikation
von GSK1016790A hingegen akut keinen kardiovaskulären Effekt (Willette et al,
2008).
Es bedarf daher weiterer Untersuchungen, um zu klären, ob TRPV4-Öffner als
blutdrucksenkende Mittel von klinischem Nutzen sind (Köhler et al, 2007).
62
Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Endotheliale Ionenkanäle und insbesondere Ca2+-permeable Kationenkanäle
vom TRP-Typ sollen eine wichtige Rolle für die Endothelfunktion spielen, indem
sie einen Calciumeinstrom erzeugen und somit wichtige Vasodilatationsysteme
wie das NO-system und das EDHF-system stimulieren. Ziel der vorliegenden
Arbeit war es, die funktionelle Bedeutung von osmo- und potentiell
mechanosensitiven TRPV4-Kanälen für endotheliale Vasodilatationsprozesse
zu charakterisieren. Hierzu sollten genetisch manipulierte Mäuse, denen das
TRPV4-Protein fehlt, und korrespondiere Wildtyp-Tiere verwendet werden und
vergleichende elektrophysiologische Untersuchungen an Endothelzellen und
gefäßphysiologische
Untersuchungen
zur
Endothelfunktion
mittels
des
Druckmyographen durchgeführt werden.
Die vergleichenden elektrophysiologischen Untersuchungen an Endothelzellen
der A.c.c. von TRPV4+/+- und TRPV4-/--Tieren zeigten, dass TRPV4 AAinduzierte
und
HTS-induzierte
gefäßphysiologischen
Ströme
Befunde
stellten
wesentlich
heraus,
vermittelt.
dass
Die
durch
Wandschubspannung und durch Reperfusion hervorgerufene Vasodilatation der
Arteria carotis communis bei den TRPV4-/--Mäusen fehlten. Im Gegensatz dazu
traten bezüglich der vom glatten Gefäßmuskel abhängigen SNP-vermittelten
und der Azetylcholin-induzierten Vasodilatation zwischen TRPV4-/-- und WTMäusen keine Unterschiede auf.
Diese Hauptbefunde der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass endotheliale
TRPV4-Kanäle
eine
essentielle
Signaltransduktionskomponente
bei
der
endothelialen Mechanotransduktion darstellen. Es kann ferner spekuliert
werden, dass durch eine pharmakologische Modulation von endothelialen
TRPV4-Kanälen der arterielle Gefäßtonus manipuliert werden kann. Dies
könnte
einen
pharmakologischen
Ansatzpunkt
für
eine
neuartige
antihypertensive Therapieform darstellen.
63
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71
Lebenslauf
8. Lebenslauf
Veronika Hartmannsgruber
07.08.1982
in Hof/Saale geboren
Eltern: Doris und Günter Hartmannsgruber
(Gemeindereferentin, Architekt)
Schulbesuch
Gymnasium der Englischen Fräulein, Bamberg (Hochschulreife 2002)
Grundschule in Bamberg
Studium
Studium der Humanmedizin an der Philipps-Universität in Marburg
(Oktober 2003 - Dezember 2009)
⋅ Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung, Herbst 2009
⋅ Praktisches Jahr:
⋅
Chirurgie, Universitätsklinikum Marburg, August - November 2008
⋅
Innere Medizin, Spital Schwyz, Schweiz, Dezember 2008 - März
2009
⋅
Neurologie, Berner Klinik Montana, Schweiz, März – Juli 2009
⋅ Famulaturen:
⋅
Innere Medizin; Kardiologie, Klinikum Bamberg, Februar/März 2006
⋅
Chirurgie, Medizinisches Versorgungszentrum Dr. Schellerer
GmbH, Bamberg, August/September 2006
⋅
Pädiatrie, Kinder- und Jugendarzt Dr. Waldmann, Bamberg,
September/Oktober 2007
⋅
Neurologie, Universitätsklinikum Marburg, Januar/Februar 2008
⋅ Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Herbst 2005
72
Verzeichnis der akademischen Lehrer
9. Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer waren folgende Damen und Herren in Marburg:
Dr. Adolph, Prof. Dr. Aigner, PD Dr. Albert, Dr. Al Kadah, Dr. Alpmann, PD Dr.
Alter, Prof. Dr. Aumüller, Dr. Bahr, PD Dr. Dr. Bals, Dr. Barth, Prof. Dr. Barth,
PD Dr. Bartsch, Prof. Dr. Dr. Basler, PD Dr. Bastians, Prof. Dr. Bauer, Dr.
Bauer, Prof. Dr. Baum, Dr. Baumann, Prof. Dr. Becker, Prof. Dr. Behr, PD Dr.
Benes, Prof. Dr. Berger, Prof. Dr. Besedovsky, PD Dr. Bette, Prof. Dr. Bien, Dr.
Bock, PD Dr. Boeckhoff, Dr. Bolm, PD Dr. Braun, Prof. Dr. Brehm, Dr. Breit, Dr.
Büch, PD Dr. Buchholz, Dr. Burbelko, PD Dr. Burchert, Dr. Busch, Prof. Dr.
Cetin, Prof. Dr. Christiansen, Dr. Chubanov, Prof. Dr. Czubayko, Prof. Dr. Dr.
Daut, Prof. Dr. Del Rey, PD Dr. Dietrich, Dr. Dinges, PD Dr. Dominguez, Prof.
Dr. Donner-Banzhoff, Dr. Duda, Dr. Ebel, Prof. Dr. Eberhart, Prof. Dr. Eilers, PD
Dr. Ellenrieder, Prof. Dr. Elsässer, Prof. Dr. Engenhart- Cabillic, PD Dr. Feiber,
Dr. Fensterer, PD Dr. Fritz, Prof. Dr. Fuchs-Winkelmann, Dr. Funck, Prof. Dr.
Garten, Dr. Geks, Prof. Dr. Gerdes, Prof. Dr. Görg, PD Dr. Graf, Prof. Dr.
Gress, Prof. Dr. Grimm, PD Dr. Groß, Dr. Grundmann, Prof. Dr. Grzeschik,
Prof. Dr. Gudermann, Prof. Dr. Hadij, Prof. Dr. Hamer, Prof. Dr. Hasilik, PD Dr.
Hassan, Dr. Hegele, Dr. Hellmeyer, Prof. Dr. Hellwig, Dr. Helwig- Rolig, Prof.
Dr. Hermann- Lingen, Prof. Dr. Hertl, PD Dr. Herzum, PD Dr. Höffken, Dr.
Hörle, Dr. Hoffmann, Prof. Dr. Hofmann, PD Dr. Hofstaetter, Prof. Dr. Hoyer, Dr.
Iwinska- Zelder, Dipl. Jacke, Dr. Jackowski- Dohrmann, Prof. Dr. Jacob, PD Dr.
Jaques, Dr. Kalder, PD Dr. Kalinowski, Prof. Dr. Kann, Dr. Kanngiesser, Dr.
Käuser, Dr. Kerwat, Dr. Kill, Dr. Kim- Berger, Prof. Dr. Klaus, Prof. Dr. Klenk,
Prof. Dr. Kingmüller, Prof. Dr. Koch, Prof. Dr. Klose, PD Dr. Köhler, Prof. Dr.
Köhler, Prof. Dr. König, Dr. Köster, Prof. Dr. Koolmann, PD Dr. Krebber, Prof.
Dr. Kretschmer, Prof. Dr. Krieg, Prof. Dr. Kroh, Prof. Dr. Kroll, PD Dr. Krones,
PD Dr. Kühnert, Prof. Dr. Kuhlmann, Dr. Kwee, PD Dr. Langer, Dr. Lemke, PD
Dr. Leonhardt, Dr. Likoyiannis, Prof. Dr. Lill, Prof. Dr. Liß, Prof. Dr. Löffler, Prof.
Dr. Loff, Prof. Dr. Lohoff, PD Dr. Lüers, Dr. Lukasewitz, Prof. Dr. Maier, Dr.
Maier, Prof. Dr. Maisch, PD Dr. Maisner, Dr. Malek, Dr. Dr. Mandrek, Dr. Mann,
PD Dr. Martin, Dr. Martinovic, Dr. Mederos Y Schnitzler, PD Dr. Mennel, Dr.
Merte, PD Dr. Michl, PD. Dr. Mittag, Prof. Dr. Moll, Prof. Dr. Moosdorf, Prof. Dr.
73
Verzeichnis der akademischen Lehrer
Dr. Mueller, PD Dr. Müller, Prof. Dr. Müller, PD Dr. Mühlberger, Prof. Dr.
Mutters, Dr. Nachtigall, Prof. Dr. Neubauer, Prof. Dr. Oertel, Dr. Olbert, Prof. Dr.
Pagenstecher, Dr. Pfützner, Prof. Dr. Pieper, Prof. Dr. Plant, Dr. Pressel, PD Dr.
Printz, PD Dr. Quante, Dr. Ramaswany, Dr. Rausch, Dr. Reichel, Prof. Dr.
Renz, Prof. Dr. Richter, Dr. Riera-Knorrenschild, Dr. Rohlfs, Prof. Dr. Röhm, Dr.
Rolfes, PD Dr. Rominger, Prof. Dr. Röper, Prof. Dr. Rose, Prof. Dr. Rosenow,
Prof. Dr. Rothmund, Dr. Rybinski, Dr. Sattler, Dr. Schäfer, Prof. Dr. Schäfer,
Prof. Dr. Schäfer, Prof. Dr. Schmidt, Prof. Dr. Schmidt, PD Dr. Schmitt, Dr.
Schmitz, Prof. Dr. Schnabel, Prof. Dr. Schneider, Dr. Schierl, Dr. Schofer, PD
Dr. Schrader, Dr. Schulze, Prof. Dr. Schultz, Prof. Dr. Seitz, PD Dr. Sesterhenn,
Dr. Shiratori, Dr. Skrzypek, Dr. Skwara, Dr. Steinkamp, Prof. Dr. Steiniger, PD
Dr. Stiletto, Dr. Stiller, PD Dr. Straßmann, Prof. Dr. Strempel, Prof. Dr. Sure,
Prof. Dr. Suske, PD Dr. Tebbe, PD. Dr. Teymoortash, PD Dr. Torossian, Dr.
Varga, Prof. Dr. Vogelmeier, Prof. Dr. Voigt, Prof. Dr. Wagner, Prof. Dr.
Waldegger, Dr. Walthers, Prof. Dr. Weihe, Prof. Dr. Werner, PD Dr.
Westermann, Prof. Dr. Wiegandt, PD Dr. Wilhelm, Dr. Wollmer, Dr. Wündisch,
Prof. Dr. Wulf, Dr. Zemelin, Dr. Zettl, Dr. Zwiorek
74
Danksagung
10. Danksagung
Mein herzlichster Dank gilt Herrn Prof. Dr. Joachim Hoyer und Herrn PD Dr.
Ralf Köhler zunächst für die Überlassung dieses interessanten und spannenden
Themas.
Weiterhin bedanke ich mich für die Bereitstellung von Laboren und
Forschungsmitteln, die für meine Arbeit nötig waren.
Schließlich möchte ich ihnen für die überaus gute Betreuung bei den
Auswertungen der Ergebnisse und beim Erstellen dieser schriftlichen Arbeit
meinen besonderen Dank aussprechen.
Das Arbeitsklima im Labor empfand ich stets als sehr angenehm.
Herrn Prof. Dr. Wolfgang B. Liedtke möchte ich ganz herzlich für die
Bereitstellung seiner TRPV4-KO-Maus und für die Westernblottanalysen an
Nieren von TRPV4+/+- und TRPV4-/--Mäusen danken.
Bei Herrn
Dr.
Christian
Zusammenarbeit
bei
Harteneck bedanke
der
Erstellung
der
ich mich für die
gute
immunhistochemischen
Untersuchungen.
Bei Herrn Dr. Willm-Thomas Heyken bedanke ich mich besonders für das
immer geduldige Erklären von Arbeitstechniken und Methoden, für die Hilfe bei
der Arbeit in der tierexperimentellen Einheit und für die Übernahme der
Nachbestellungen.
Die freundschaftliche Atmosphäre, die gegenseitige Hilfsbereitschaft und das
gemeinschaftliche Arbeiten verdanke ich unserer gesamten Forschungsgruppe.
Hier möchte ich besonders meinen Mitdoktoranden Stefan Bojarski, Luise
Bormann, Sebastian Brähler, Jörg Faber, Michael Kacik, Anuradha Kaistha,
Annette Klockner, Michael Klos, Anja Müller, Steffen Paschen, Kirsten Plefka
und Julia Sautter ganz herzlich danken.
75
Danksagung
Danke auch an meine Schwestern Johanna, Pia und Elisabeth. Unseren guten
Zusammenhalt schätze ich sehr. Danke besonders auch für das Korrekturlesen
dieser Arbeit.
Mein größter Dank gilt meinen Eltern.
Sie standen mir während meiner schulischen und universitären Ausbildung
stets zur Seite. Bei allen Fragen und Problemen konnte ich mich immer auf ihre
Unterstützung verlassen.
Dir, Jochen, Danke, für die Zeit, die ich mit Dir verbringen darf. Mit Dir fühlt sich
das Leben so wunderbar leicht an.
76
Ehrenwörtliche Erklärung
11. Ehrenwörtliche Erklärung
„Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur
Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „Funktionelle Bedeutung
des TRPV4-Kationenkanals bei endothelvermittelten Vasodilatationsprozessen“
im Institut für Innere Medizin/Nephrologie unter Leitung von Prof Dr. J. Hoyer
mit Unterstützung durch PD Dr. R. Köhler ohne sonstige Hilfe selbst
durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der
Dissertation aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keinem
in- oder ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um Zulassung
zur Promotion eingereicht, noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als
Dissertation vorgelegt.
Vorliegende Arbeit wurde in folgendem Publikationsorgan veröffentlicht:
Hartmannsgruber V, Heyken W, Kacik M, Kaistha A, Grgic I, et al. (2007)
Arterial Response to Shear Stress Critically Depends on Endothelial TRPV4
Expression. PloS ONE 2(9): e827.doi:10.1371/journal.pone.0000827 “
Ort, Datum
Unterschrift
77

Doktorarbeit final Druck

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