Anleitung - SERVA Electrophoresis GmbH
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Anleitung - SERVA Electrophoresis GmbH
BlueLine Instruments for Electrophoresis GEBRAUCHSANLEITUNG Blue Horizon™ Horizontale Flachbett-Elektrophorese-Kammer SERVA Electrophoresis GmbH Carl-Benz-Str. 7 D-69115 Heidelberg Phone +49-6221-138400, Fax +49-6221-1384010 e-mail: [email protected] http://www.serva.de Inhaltsverzeichnis 1. Packliste 3 2. Spezifikationen 3 3. Betriebsbedingungen 4 4. Weiteres Zubehör (optional) 4 5. Bedienung des Gerätes 5 5.1. Sicherheitsvorkehrungen 5 5.2. Pflege und Wartung der Elektrophoresekammer 5 5.3. Befüllen der Keramik-Kühlplatte mit Flüssigkeit 6 5.4. Arbeiten mit dem Umlaufkühler 6 5.5. Durchführung einer Horizontalelektrophorese 7 5.6 6. 5.5.1. Empfohlene Probenvorbereitung für die Isoelektrische Fokussierung (IEF) 7 5.5.2. Auflegen eines Horizontalgels 7 5.5.3. Standardfokussierungsprogramm für IEF Polyacrylamidgele 8 5.5.4. Richtwerte für IEF mit Agarosegelen 8 Beenden des Laufes 9 Empfohlene Reagenzien für die Horizontalelektrophorese 10 Achtung Dieses Gerät darf nur von geschultem Personal betrieben werden. Wenn es an eine Stromversorgung angeschlossen wird, steht es potentiell unter elektrischer (Hoch-)Spannung, die bei falscher Handhabung gesundheitsgefährdend ist. Das BlueHorizon™ Flachbett-Elektrophorese-System ist gemäß den gültigen Sicherheitsrichtlinien hergestellt (CE). Es ist für die Erreichung bester Ergebnisse im Einklang mit langer Lebensdauer ausgelegt. Um dies zu gewährleisten, lesen Sie bitte vor Inbetriebnahme die Bedienungs-anleitung sorgfältig durch. Bitte überprüfen Sie nach dem Auspacken an Hand der Packliste, ob die Bestandteile des Gerätes vollständig sind und ob das Gerät unbeschädigt ist. Sollte dies nicht der Fall sein, benachrichtigen Sie bitte sofort SERVA Electrophoresis GmbH in Heidelberg bzw. den zuständigen Distributionspartner, um eine reibungslose Berichtigung zu gewähren. Die Garantiezeit beträgt 12 Monate und beginnt mit der Auslieferung. Auf die Carbonelektroden gewähren wir 3 Jahre Garantiezeit, die ebenfalls mit der Auslieferung beginnt. Wir bitten Sie, die Verpackungsmaterialien bis zu dem Ablauf der Garantiezeit aufzubewahren. Ver. 05/06 2 1. Packliste BlueHorizon Kat.-Nr.: BH-2C Anzahl 1 1 Beschreibung Elektrophoreseeinheit Bedienungsanleitung Kat.-Nr. BH-2C 2. Spezifikationen Stabile Acrylglas-Konstruktion Alle Acrylglas-Nahtstellen sind mit einem Spezialkleber verbunden Doppelt isolierte Stromkabel, ausgelegt bis 1500 V, Prüfspannung bis 3000 V Vergoldete Steckanschlüsse, korrosionsfrei In dem Deckel integrierte, zurückversetzte Anschlüsse Elektroden aus synthetischem Karbonmaterial; Standardausführung mit 2-PunktElektrodendeckel (Kat.-Nr. BH-2C); optional 3-Punkt-Methode mit 3-Punkt-Elektrodendeckel (Kat.-Nr. BHL-3) als Zubehör möglich Durch Federhalterung flexibel befestigte Elektroden, für optimale Anpassung an die Geloberfläche Elektroden können durch Justierung der flexiblen Führung mittels Stellschrauben an das Gelformat angepasst werden Keramik-Kühlplatte für effiziente, gleichmäßige Temperierung An der Rückfront angebrachte Anschlüsse für Kühlaggregat (Umlaufkühler); maximaler Druck: 1 bar Höhenverstellbare Keramik-Kühlplatte zur Anpassung an die jeweilige Gelstärke von 0,1 bis 10 mm Auf der Keramik-Kühlplatte aufgedrucktes Raster zur Vereinfachung der Gel- und Probenpositionierung 3 3. Betriebsbedingungen BH-2C 1500 V 25 mA 285 x 197 mm 15,0 cm 5,0 cm Maximale Spannung (Volt) Maximaler Stromwert (mA) Maximales Gelformat Maximaler Elektrodenabstand Minimaler Elektrodenabstand Geeignetes Umfeld: Diese Geräte sind nur für den Gebrauch in geschlossenen Räumen einzusetzen. Die Betriebstemperatur beträgt 4 °C bis 30 °C. Für den Betrieb ist empfohlen: Maximale relative Luftfeuchtigkeit bis zu 80 % (bei einer Temperatur bis 31°C), linear abnehmend bis zu 50 % relativer Luft-feuchtigkeit (bei einer Temperatur bis 40 °C), bei maximaler Höhe von 2000 m (NN). Vor Inbetriebnahme des Gerätes bitte beachten: Zum Schutz vor Beschädigung werden das Gerätegehäuse (Bodentank und Deckel) und die Kühlplatte getrennt voneinander verpackt, versendet. Nach Entfernen der Verpackung ist die Kühlplatte in den Bodentank derart einzusetzen, dass die abgewinkelten Anschlüsse zum Verbinden an ein Kühlaggregat in die Aussparungen (Schlitze) im Bodentank einzuführen sind. Die Kühlplatte wird behutsam in den Bodentank aus Acryl eingelassen. 4. Weiteres Zubehör (optional) Zur Durchführung der 3-Punkt-Methode ist ein Austauschdeckel mit 3 Karbon-elektroden zusätzlich erhältlich (Kat.-Nr. BHL-3). Der Deckel ist anstelle des 2-Elektroden-Deckels zu benutzen; die Mittel-Elektrode ist fest verbunden mit dem Deckel, die beiden Elektroden an den Rändern sind in Führungsschienen beweglich montiert und können - wie bei dem Standarddeckel mit 2 Elektroden - auf die gewünschte Trennstrecke justiert werden. 4 5. Bedienung des Gerätes Wichtiger Hinweis: SERVA Electrophoresis GmbH übernimmt keine Verantwortung für Beschädigungen, die durch Bedienungsfehler und Missachtung der folgenden Bedingungen entstehen. 5.1. Sicherheitsvorkehrungen Bitte lesen Sie vor Gebrauch die Bedienunganleitung. Vor Entfernen des Kammerdeckels die Elektrophoresekammer von dem Stromgeber trennen (Stecker ziehen). Maximal zulässige Spannung und zulässiger Strom dürfen nicht überschritten werden (siehe "Betriebsbedingungen"). Betreiben Sie diese Elektrophoresekammer nicht in einer Metallschale. 5.2. Pflege und Wartung der Elektrophoresekammer Um den Kammerdeckel zu entfernen, drücken Sie mit beiden Daumen die Plastikstege nach unten und heben Sie parallel dazu den Deckel an. Reiben Sie vor Gebrauch die Keramik-Kühlplatte und die Karbonelektroden mit einem mit destilliertem Wasser getränkten Tuch ab. Benutzen Sie keine Scheuermittel. Trocknen Sie die Bestandteile vor Gebrauch mit einem sauberen Papiertuch. Reinigen Sie nach jedem Fokussierungsvorgang die Unterkanten der Karbonelektroden mit einem mit destilliertem Wasser getränkten Tuch. Reinigen Sie die Elektroden mit einem Schwamm mit Scheuerauflage nach ca. 10 Anwendungen. Diese Reinigung ist auch vor jedem Wechsel der Anwendung (insbesondere von SDS-PAGE zur IEF) erforderlich; schon geringe Spuren von SDS-Puffer, die in den Mikroporen der Karbonelektroden zurückbleiben, können bei der Durchführung der IEF Störungen verursachen. Versichern Sie sich, dass die Elektroden sauber und trocken sind, bevor Sie die Kammer zur Aufbewahrung lagern. Überprüfen Sie die Kammer vor der ersten Anwendung und dann in monatlichen Intervallen auf einwandfreie Funktion. Im Fall einer Fehlfunktion versuchen Sie nicht die Elektrophoresekammer zu reparieren, sondern unterrichten Sie SERVA Electrophoresis GmbH Heidelberg bzw. den Vertriebspartner von SERVA Electrophoresis GmbH unverzüglich. Die chemische Beständigkeit der synthetischen Karbonelektroden ist ermittelt gegen: Aceton Methylenchlorid Benzol Methanol Benzin Mineralöle Toluol 5 höhere Alkohole Perchlorethylen Trichlorethylen 5.3. Befüllen der Keramik-Kühlplatte mit Flüssigkeit 1. Stellen Sie die Kammer auf die Stirnseite, so dass die Anschlüsse zur KeramikKühlplatte senkrecht noch oben zeigen. Verbinden Sie die Anschlüsse dann mit der Flüssigkeitsquelle (Wasser/Umlaufkühler). 2. Füllen Sie die Keramik-Kühlplatte stetig, mit mittlerer Flussgeschwindigkeit (überschreiten Sie auf keinen Fall 1 bar). Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, da diese eine inhomogene Wärmeableitung verursachen können. 5.4. Arbeiten mit dem Umlaufkühler 1. Schließen Sie an die beiden Anschlüsse an der Rückseite der Kammer je ein kurzes Stück eines Gummischlauches an. 2. Verbinden Sie diese mit den beiden Anschlüssen des Umlaufkühlers (Eingangs- und Ausgangsanschluß). 3. Der maximal benötigte Wasserdruck beträgt 1 bar. Dieser darf nicht überschritten werden. Benützen Sie ein Druckmessgerät (Manometer). 4. Bei Anschluss an ein Kühlgerät mit höherem Wasserdruck können Sie einen T- Anschluss anbringen, so dass das Wasser sich auf 2 Ausgänge verteilen kann (ein Anschluss an die Elektrophoresekammer, der andere Anschluss führt zurück zu dem Kühler). Der Wasserdurchfluss in der Verbindung zu der Elektrophorese-einheit kann durch eine Schlauchklemme reguliert werden. Messen Sie den Wasserdruck nach und regulieren Sie diesen auf die benötigte Rate, bevor Sie den Kühler an die Elektrophoreseeinheit anschließen. Beachten Sie, dass ein Überschreiten der maximalne Durchflussrate zu einer Beschädigung der Keramikkühlplatte führen kann. 5. Anstelle von reinem Wasser kann auch ein Gemisch mit Gefrierschutzmittel (z.B. Polyethylenglykol) verwendet werden. Die Kühltemperatur der Platte sollte mindestens +10 °C betragen. 6 5.5. Durchführung einer Horizontalelektrophorese 5.5.1. Empfohlene Probenvorbereitung für die Isoelektrische Fokussierung (IEF) Probenkonzentration auf ca. 1 - 10 mg Protein/ml einstellen und entsalzen: durch Dialyse; empfehlenswert Elektrodialyse bei gleichzeitiger Konzentrierung. durch verdünnen mit H2O dest. (Umpuffern) und im Konzentrator über Membranfilter konzentrieren. durch lyophilisieren (wird bei flüchtigen Puffersalzen angewendet) und aufnehmen in H2O dest. 5.5.2. Auflegen eines Horizontalgels 1. Justieren Sie die Keramik-Kühlplatte entsprechend der Auflagedicke des Trennmediums (Gelstärke plus Dochte). Die Keramik-Kühlplatte ist justierbar für Gesamtauflagedicken von 0,1 mm bis 10 mm. Mittels Schraubenzieher lassen sich die Stellschrauben an den Ecken der Keramik-Kühlplatte verstellen, wodurch die KeramikKühlplatte selbst in der Höhe (d.h. in ihrem Abstand zu den Elektroden) reguliert wird. Achten Sie darauf, dass der Anpressdruck der Elektroden auf das Gel (und die Dochte) richtig gewählt ist, um effizienten Transfer zu gewährleisten. Die Elektroden sind federnd im Deckel eingebaut und schmiegen sich flexibel an die Oberfläche an; allerdings ist es beim Wechsel von dünnen Gelen (bis 0,3 mm dick) zu dicken Gelen (0,5 auf 1,0 mm) notwendig, die Keramik-Kühlplatte entsprechend zu justieren. Damit wird verhindert, dass dickere Gele gequetscht werden bzw. der Deckel nicht vollständig aufliegt (führt ggf. zu inhomogenem Spannungsfeld). 2. Kühlen Sie die Keramik-Kühlplatte mittels eines Umlaufkühlers auf die benötigte Arbeitstemperatur vor. 3. Geben Sie mittels einer Pipette wenige Tropfen eines Kühlübermittlers (z.B. Kerosin, Kat.-Nr. 26940) auf die Keramik-Kühlplatte. 4. Legen Sie das vorbereitete Horizontalgel auf die Keramik-Kühlplatte, indem Sie das Gel mit einer Kante der Trägerfolie an den Kühlübermittler heranführen. Wenn sich der Flüssigkeitsfilm unter dieser Kante verteilt hat, senken Sie das Gel langsam ab, um zu vermeiden, dass sich unter der Trägerfolie Luftblasen bilden, die zu einer ungleichmäßigen Kühlung des Gels führen. 5. Auf die obere und untere Gelkante legen Sie die mit Elektrodenpuffer getränkten Filterstreifen. Die Dochte dürfen nicht über die Ränder des Gels hinausragen. Sie müssen parallel zueinander ausgerichtet werden und an der Stelle aufgelegt werden, wo die Elektroden platziert werden sollen. 6. Legen Sie zum Auftragen der Proben einen Applikatorstreifen auf das Gel. 7. Zentrifugieren Sie die Proben 5 Minuten bei ca. 12,000 g. Falls Sie diesen Schritt auslassen, kann es zu Streifen im Bandenbild oder zu Präzipitationen in dem Applikatorstreifen während der Elektrophorese kommen (Beachten Sie Punkt 5.5.1. zu der Probenvorbereitung für die IEF). 8. Tragen Sie nun das benötigte Volumen an Proben mittels einer Pipette auf. Bei isoelektrischen Fokussierungen empfehlen wir, nicht benötigte Probentaschen mit 7 Markermischung (IEF Marker 3-10, SERVA Liquid Mix, Kat.-Nr. 39212) aufzufüllen, um Randeffekte zu vermeiden. 9. Setzen Sie nun den Sicherheitsdeckel auf die Kammer, so dass die Elektroden die Pufferstreifen noch nicht berühren. In dieser Position können Sie die Elektroden über den Pufferstreifen positionieren, indem Sie die Schrauben auf dem Deckel etwas lockern und die Elektroden innerhalb der Führungsrille verschieben. Wenn die Elektroden durch Anziehen der Schrauben in der gewünschten Position fixiert sind, senken Sie den Deckel bis zum Anschlag nach unten. 10. Schließen Sie die Elektrophoresekammer an das Stromversorgungsgerät an (z.B. SERVA BluePower 3000 (Kat.-Nr. BP-3000). Setzen Sie vor Einschalten des Netzgerätes die Parameter auf "0". Wählen Sie dann die für den Lauf benötigten Parameter am Stromversorgungsgerät. Achtung: Überschreiten Sie nicht die zulässigen Spannungs- und (oder) Strom-werte, da dies Beschädigungen an der Kammer hervorrufen kann. 5.5.3. Standardfokussierungsprogramm für IEF Polyacrylamidgele (z.B. SERVALYT™ PRECOTES™ 3-10) Anfangsspannung 150 - 250 V* Endspannung 2000 V* Kühlung 4 °C nach Erreichen von 2500 Vh Ende bzw. nach ca. 3 Stunden * Die entsprechende Leistung sollte den doppelten Wert der Stromstärke haben. Limits Gelgröße 125 x 125 mm 245 x 125 mm 125 x 125 mm 245 x 125 mm 5.5.4. Geldicke 150 µm 150 µm 300 µm 300 µm mA 4 8 7 14 W 8 16 14 28 Endspannung (V) 2000 2000 2000 2000 Richtwerte für IEF mit Agarosegelen 1 % Agarosegel, 0,4 - 0,5 mm dick, 4 % SERVALYT™ 3-10, Format 10 x 10 cm Limits Ende Stromstärke Leistung Kühlung Spanung Dauer 15 mA 10 W 10 °C 600 V Ca. 60 Minuten 8 5.6. Beenden des Laufes 1. Setzen Sie alle Parameter an dem Stromversorgungsgerät wieder auf "0" und schalten Sie dieses dann ab. Unterbrechen Sie die Verbindungen zur Elektrophoreseeinheit. 2. Entfernen Sie den Sicherheitsdeckel, indem Sie den Plastiksteg mit einem Daumen nach unten drücken und parallel mit der anderen Hand den Deckel nach oben wegheben. 3. Heben Sie das Gel mit einer Pinzette von der Keramik-Kühlplatte ab. 4. Reinigen Sie die Keramik-Kühlplatte und die Carbonelektroden mit einem mit destilliertem Wasser getränkten Papiertuch. Benutzen Sie keine Scheuermittel. Wir empfehlen, nach jeder 10. Anwendung die Elektroden mit einem Schwamm mit Scheuerauflage zu reinigen. Dies gilt auch bei jedem Wechsel von SDS-PAGE zur IEF und nativen Anwendungen. Versichern Sie sich vor Lagerung oder weiterem Gebrauch der Kammer, dass die Anschlüsse sauber und trocken sind. 5. Nach Beendigung des Laufes fixieren Sie das IEF-Gel mit 20 % (w/v) TCA (Kat.-Nr. 36913) und färben Sie das Gel z.B. mit SERVA Violet 17 (Kat.-Nr. 35072 – Farbstoffpulver, Kat.-Nr. 35074 – kompletter Färbekit), SERVA Blue W (Kat.-Nr. 35053) oder dem SERVA Silberfärbekit (SERVA silver staining kit for native PAGE, Kat.-Nr. 35077). 9 6. Empfohlene Reagenzien für die Horizontalelektrophorese SERVA Electrophoresis GmbH empfiehlt die Verwendung der SERVA-Reagenzien für die Elektrophorese. Diese unterliegen der ständigen Qualitäts- und Applikationskontrolle, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten. Produkt Kat.-Nr. GEL-FIX™ for PAG, 245 x 125 mm, 36 sheets GEL-FIX™ for PAG, 260 x 125 mm, 36 sheets GEL-FIX™ for PAG, 260 x 203 mm, 36 sheets GEL-FIX™ for PAG, 265 x 125 mm, 36 sheets GEL-FIX™ for PAG, 265 x 193 mm, 36 sheets GEL-FIX™ for PAG, 265 x 213 mm, 36 sheets GEL-FIX™ for PAG, 50 m x 125 mm, 1 roll GEL-FIX™ for PAG, 50 m x 193 mm, 1 roll GEL-FIX™ for PAG, 50 m x 233 mm, 1 roll GEL-FIX™ for PAG, 200 m x 193 mm, 1 roll GEL-FIX™ for Agarose* GEL-FIX™ Covers* NetFix™ for PAG* NetFix™ for Agarose* Acrylamid -Bis solution, 29:1 (40 % w/v) 3.3 %C Acrylamid-Bis solution, 37.5:1 (40 % w/v) 2.6 %C weitere Fertiglösungen und Acrylamid sowie N,N’-Methylenbisacrylamid in Pulverform Ammonium persulfate N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine SERVALYT™ 2-4 SERVALYT™ 2-11 SERVALYT™ 2-9 Seed-Mix SERVALYT™ 3-4 SERVALYT™ 3-5 SERVALYT™ 3-6 SERVALYT™ 3-7 SERVALYT™ 3-10 SERVALYT™ 3-10 Iso-Dalt, for 2D SERVALYT™ 4-5 SERVALYT™ 4-6 SERVALYT™ 4-7 SERVALYT™ 5-6 SERVALYT™ 5-7 SERVALYT™ 5-7 PGM SERVALYT™ 5-8 SERVALYT™ 5-9 SERVALYT™ 6-7 SERVALYT™ 6-8 SERVALYT™ 6-9 SERVALYT™ 7-9 SERVALYT™ 9-11 SERVALYT™ 4-9 T 10 42980.01 42999.01 42961.01 42993.01 42983.01 42939.01 42966.01 42968.01 42934.01 42996.01 siehe Hauptkatalog siehe Hauptkatalog 10680 10681 siehe Hauptkatalog 13375 35925 42902 42900 42935 42922 42903 42944 42945 42940 42951 42923 42904 42948 42924 42905 42936 42949 42950 42925 42906 42913 42907 42909 42910 Produkt Kat.-Nr. SERVALYT™ PRECOTES™ 3-10, 150 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 3-10, 150 µm, 245 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 3-10, 300 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 3-10, 300 µm, 245 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 3-10, 150 µm, 45 x 50 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 3-6, 150 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 3-6, 150 µm, 245 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 3-6, 300 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 4-6, 150 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 4-6, 150 µm, 245 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 4-6, 300 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 5-7, 150 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 5-7, 150 µm, 245 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 5-7, 300 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 6-9, 150 µm, 125 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 6-9, 150 µm, 245 x 125 mm SERVALYT™ PRECOTES™ 6-9, 300 µm, 125 x 125 mm Blank PRECOTES™, 125 x 125 mm, 5 pcs. Blank PRECOTES™, 245 x 125 mm, 5 pcs. Blank PRECOTES™, 45 x 50 mm, 5 pcs. Blank PreNets™, 125 x 125 mm, 5pcs. Blank PreNets™, 245 x 125 mm, 5pcs. SDS PreNets™ Blotting Kit, 125 x 125 mm, 5 gels SDS PreNets™ Blotting Kit, 245 x 125 mm, 5 gels Anode fluid 3 for IEF, 50 ml Cathode fluid 10 for IEF, 50 ml Electrode wicks extra size, 300 x 6 x 1 mm, 100 pcs. Electrode wicks long size, 240 x 6 x 1 mm, 100 pcs. Electrode wicks standard size, 120 x 6 x 1 mm, 100 pcs. Applicator strips 7 x 1 (24 slots, 100 mm long), 3 pcs. Applicator strips 3.5 x 2 (15 slots, 260 mm long), 6 pcs. Applicator strips 2 x 3.5 (19 slots, 100 mm long), 6 pcs. Applicator strips 3.5 x 2 (43 slots, 240 mm long), 3 pcs. Applicator strips kit Bayol F, 100 ml Kerosene, 1 l Agarose SERVA without EEO Agarose SERVA neutral for IEF IEF sample buffer (2x), 20 ml IEF Marker 3-10, SERVA Liquid MIx Protein test mixture for pI-determination, pH 3-10 (lyophil.) SERVA Violet 17 (Pulverform) SERVA Violet 17 staining kit SERVA Blue W (Pulverform) SERVA silver staining kit for native PAGE Trichloroacetic acid. 20 % solution 42965 42967 42866 42867 42881 42974 42919 42874 42975 42942 42875 42979 42946 42879 42978 42954 42878 42759 42710 42711 42758 42718 42700 42701 42984 42986 42972 42987 42988 42989 42915 42914 42899 42937 14500 26940 11401 11402 42537 39212 39211 35072 35074 35053 35077 36913 *Die oben aufgeführten SERVA Produkte stellen nur eine Auswahl der am häufigsten benötigten Produkte dar. Eine komplette Auflistung aller SERVA Reagenzien für die Elektrophorese finden Sie im SERVA Electrophoresis Hauptkatalog, den wie Ihnen auf Wunsch gerne zusenden. 11