SERION ELISA antigen Candida V1-deu

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Institut Virion\Serion GmbH
Институт Вирион\Серион ООО
SERION ELISA antigen Candida
DIAGNOSTICS
SERION ELISA antigen
Candida
Friedrich-Bergius-Ring 19
Кольцевая ул. Фридриха Бергиюса 19
D - 97076 Würzburg, Germany
D - 97076 Вюрцбург, Германия
Telefon/Телефон: +49 (0) 9 31 / 30 45 0
Fax/Факс: +49 (0) 9 31 / 30 45 100
Gebrauchsanweisung - Deutsch
Instructions - English
Mode d´emploi - Français
Istruzioni per l´uso - Italiano
Инструкция по применению – русский язык
E-Mail/Эл. почта: [email protected]
Internet/Интернет: www.virion-serion.de
KAL200-1
(Version/Versione/версия 1.12/09-1)
DE
DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG
3
SERION ELISA antigen - TESTPRINZIP
4
INHALT UND ZUSAMMENSETZUNG
5
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN
6
LAGERUNG UND HALTBARKEIT
7
DURCHFÜHRUNG DES SERION ELISA antigen
7.1
Allgemeine Hinweise
7.2
Probenvorbereitung und Lagerung
7.3
Reagenzienvorbereitung
7.4
Übersicht - Testablauf
7.5
Manuelle Testdurchführung
7.6
Automatische Testdurchführung
7.7
Positivkontrolle / Richtigkeitskontrolle
8
FR
2
IT
ANWENDUNGSBEREICH
RU
1
EN
INHALTSVERZEICHNIS
TESTAUSWERTUNG
8.1
Ein-Punkt-Quantifizierung nach der 4PL-Methode
8.2
Testgültigkeitskriterien
8.3
Auswertung SERION ELISA antigen Candida
8.4
Quantifizierungsgrenzen
8.5
Grenzwertbereich
8.6
Interpretation der Ergebnisse
8.7
Referenzbereich gesunder Probanden
9
LEISTUNGSMERKMALE
9.1
Sensitivität und Spezifität
9.2
Präzision
10
SICHERHEITSMASSNAHMEN
10.1
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
10.2
Entsorgung
11
LITERATUR
vorliegende Version: V 1.12/09-1
Vorversion: --
Pos : 1 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Allgemei ne Texte ELISA antigen/Einl eitung " Enz ymimmunoass ay" C andi da antigen @ 8\mod_1265790547166_6.doc @ 28518 @
Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Candida Antigen
für die in vitro-Diagnostik
Pos : 2 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für nur ei n D okument/Bestellnummer n/C andida antigen: Bestell nummer @ 11\mod_1346680555914_6.doc @ 51999 @
Best.-Nr.:
ESR200
Pos : 3 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Allgemei ne Texte ELISA antigen/Kapitelüberschrift " Anwendungs ber eich" @ 8\mod_1265792390921_6.doc @ 28661 @ 1
1
ANWENDUNGSBEREICH
Pos : 4 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für nur ei n D okument/Anwendungsbereic h/C andi da antigen: Anwendungsbereic h @ 8\mod_1265794146291_6.doc @ 29054 @
Der SERION ELISA antigen Candida ist ein qualitativer und quantitativer Immunoassay für
den Nachweis von Candida Antigen in humanem Serum und Plasma. Der Test dient zur
Unterstützung bei der Erfassung von systemischen Candidosen.
Pos : 5 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Allgemei ne Texte ELISA antigen/Kapitelüberschrift "Diag nostisc he Bedeutung" @ 8\mod_1265792408092_6.doc @ 28677 @ 1
2
DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG
Pos : 6 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für nur ei n D okument/Di agnostisc he Bedeutung/Candida antigen: Diag nos tisc he Bedeutung @ 11\mod_1346939232903_6.doc @ 52276 @
Candida albicans ist ein ubiquitär vorkommender Hefepilz, der wie alle Candida ssp. zur
Familie der Sprosspilze zählt. Neben der Hefeform, welche in erster Linie bei
oberflächigen Infektionen auftritt, sind so genannte Pseudomyzelien eine weitere
morphologische Erscheinungsform. Die Ausbildung von Keimschläuchen sowie die
Entwicklung der Pseudomyzelien treten überwiegend bei systemischen Mykosen auf.
Candida Sprosspilze produzieren und sezernieren eine Vielzahl von Enzymen, die den
fakultativ pathogenen Mikroorganismen die Penetration von Blutgefäßen und
Schleimhautbarrieren ermöglichen.
Meist werden Candida ssp. über Schmierkontaminationen von Mensch zu Mensch
übertragen. Die Haupteintrittspforte ist der Mund-Rachen-Raum. Bei Störungen der
fungistatischen Eigenschaften der Hautoberfläche, die durch einen leicht sauren pH-Wert
und eine antagonistisch wirkende Standortflora vermittelt werden, können oberflächige,
superfizielle Candidosen entstehen. Systemische Mykosen gehen im Anschluss an eine
Besiedlung der Schleimhäute vor allem vom Bereich des Gastrointestinaltraktes aus
(Abb. 1).
Kolonisierung des
Mund-Rachen-Raums
Passage des
Magenlumens
Übertritt in das
Darmlumen
Eintritt
in die Blutbahn
Übertritt in das
Lymphsystem
Persorption der
Candida-Zellen
Invasion einer
Vielzahl von Organen
Abbildung 1:
deutsch
Verlauf von Candida-Infektionen
2
Generell können Candidosen in zwei große Gruppen eingeteilt werden, deren
Hauptmerkmale in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst sind.
Lokalisierung
Immunkompetenz
des Wirtes
Risikofaktoren
klinischer Verlauf
Therapie
Tabelle 1:
Candida-Infektionen
oberflächig (superfiziell)
Tiefenmykose (invasiv)
Haut, Schleimhäute
Hauptorgane
+
+, -/Schwangerschaft
Diabetes
AIDS
Störungen der Hauteigenschaften
mangelnde Mundhygiene
Chemotherapie
iatrogene Immunsuppression
zentrale Venenkatheter
Radiotherapie
hochgradige Verbrennungen
chirurgische Eingriffe
meist harmlos, keine Lebensgefahr oft lebensbedrohlich
gut therapierbar
stadiumabhängige
Therapierbarkeit
Charakteristika von Candida-Infektionen
Die serologische Diagnostik bei Candida-Infektionen gestaltet sich als schwierig.
Einerseits können auch transiente Hefebesiedelungen eine Antikörperantwort induzieren,
andererseits führen systemische Candida Mykosen bei immunsupprimierten Patienten
häufig nur zu geringen Titerbewegungen. Erschwerend kommt hinzu, dass es sich bei der
Gruppe der Patienten mit hohem Mykoserisiko häufig um immunologische
Problempatienten handelt und somit serologische Befunde einer besonderen Interpretation
bedürfen. Systemische Candida-Infektionen verursachen zudem kein typisches
Krankheitsbild.
Beim aktuellen Stand der Candida Serologie kann nicht davon ausgegangen werden, dass
die Ergebnisse verschiedener Testsysteme zur Antikörperbestimmung vergleichbar oder
sogar austauschbar sind. Die Spezifität der in einer Untersuchungsprobe nachgewiesenen
Antikörper hängt entscheidend vom Testsystem (ELISA oder HAT) bzw. von der
verwendeten Antigenpräparation ab. Beim HAT werden IgM Antikörper aufgrund ihres
Agglutinationsverhaltens stärker erfasst als IgG Antikörper. Dies macht die serologische
Befundinterpretation noch komplexer, eröffnet aber auch die Möglichkeit einer
differenzierteren Befundinterpretation. So ermöglicht die Kombination von HAT und ELISA,
selbst bei stagnierenden HAT Titern potentielle Veränderungen der Immunglobulinklassen-spezifischen Antikörperaktivität zu erkennen. Derzeit bietet keine Nachweismethode allein die Möglichkeit einer umfassenden serologischen Diagnostik. Zur
optimalen Überwachung von Risikopatienten und zur Therapiesteuerung sollten deshalb
mehrere Nachweismethoden kombiniert eingesetzt werden. Der Antigennachweis mit
SERION ELISA antigen Candida stellt dabei eine wichtige unterstützende Maßnahme dar.
deutsch
3
DE
Die Anheftung der Sprosspilze an Epithelien unterschiedlicher Schleimhäute erfolgt durch
Adhärenzproteine und andere Strukturen der äußeren Zellhülle. In der Übersicht sind die
(hypothetischen) Schritte dargestellt, die im Falle schwerwiegender Grunderkrankungen
zu disseminierten Infektionen führen können. Eine exakte Abtrennung der Stadien ist
dabei kaum möglich.
Pos : 7 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/T estprinzi p/T estprinzi p ELISA antigen @ 8\mod_1265792007310_6.doc @ 28637 @ 1
3
SERION ELISA antigen - TESTPRINZIP
Der ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ist ein immunologisches Verfahren,
das sich insbesondere in der Infektionsserologie zur Erfassung von Antikörpern und
Antigenen bewährt hat. Die Nachweisreaktion im vorliegenden Sandwich ELISA basiert
auf der spezifischen Interaktion von Antikörpern und Antigenen. Zu diesem Zweck wurden
die Teststreifen der Mikrotiterplatten des SERION ELISA antigen mit spezifischen, gegen
den Erreger gerichteten Antikörpern zur Bindung der in der Patientenprobe vorhandenen
Antigene beschichtet. Weitere, mit Peroxidase markierte Sekundärantikörper detektieren
die so gebildeten Immunkomplexe. Das Enzym katalysiert eine Reaktion, in deren Verlauf
das farblose Substrat Wasserstoffperoxid und das Chromogen Tetramethylbenzidin in
einen blauen Farbstoff umgewandelt werden. Durch Zugabe der Stopplösung erfolgt ein
Farbumschlag zu gelb. Die Signalstärke des Reaktionsprodukts ist proportional zur
Antigenkonzentration in der Probe und wird photometrisch erfasst.
Pos : 8 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für nur ei n D okument/Inhalt und Z us ammens etz ung/C andi da antigen: Inhalt und Zusammens etzung @ 11\mod_1346845806738_6.doc @ 52089 @ 1
deutsch
4
DE
4
INHALT UND ZUSAMMENSETZUNG
Testkomponenten
Stück /
Volumen
Brechbare Mikrotiterstreifen mit je acht antikörperbeschichteten Einzelkavitäten
(insg. 96) MTP ,
1 Testrahmen.
12 Stück
Standardserum STD ,
Candida albicans Antigen in Humanserum mit Zusatz von fötalem Kälberserum (FKS);
negativ getestet für anti-HIV-Ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen)
und anti-HCV-Ak;
Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid.
3 x 3 ml
Negatives Kontrollserum NEG ,
Humanserum mit Zusatz von fötalem Kälberserum (FKS);
negativ getestet für anti-HIV-Ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen)
und anti-HCV-Ak;
Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid.
2 x 3 ml
Anti-Candida albicans Konjugat (gebrauchsfertig) PODCR ,
Gegen Candida albicans gerichteter Antikörper konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase,
stabilisiert in proteinhaltiger Lösung mit Detergenz;
Konservierungsmittel: 0,1 % ProClin® 300.
13 ml
Waschlösungskonzentrat (ausreichend für 1500 ml) WASH ,
TRIS-gepufferte Natriumchlorid Lösung mit Tween 20; 30-fach konzentriert;
Konservierungsmittel: < 0,1 % ProClin® 300.
2 x 25 ml
Verdünnungspuffer SAMB ,
Saure Lösung ohne Konservierungsmittel.
15 ml
Stopplösung STOP ,
0,5 N Schwefelsäure.
13 ml
TMB-Substratlösung (gebrauchsfertig) TMB ,
TMB-Wasserstoffperoxid-Substratlösung;
Konservierungmittel: < 0,01% Kathon CG.
13 ml
Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle INFO ,
(Quantifizierung des Antigens in U/ml).
Pos : 9 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Z us ätzlic h benötigte M ateriali en/Zus ätzlich benötigte M ateri alien @ 8\mod_1265796058727_6.doc @ 29301 @ 1
deutsch
5
2 Stück
5
-
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN
Übliche Laborausrüstung
Spektralphotometer für Mikrotiterplatten mit Filter, Wellenlänge 450 nm,
empfohlene Referenzwellenlänge im Bereich von 620 nm - 690 nm (z. B. 650 nm)
Inkubator 37 °C
Heizblock 110 °C
feuchte Kammer
Aqua dest.
Click-Clips (Best.-Nr. VT120)
Pos : 10 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Lager ung und H altbarkeit/Lagerung und H altbar keit @ 11\mod_1346935956390_6.doc @ 52259 @ 1
deutsch
6
DE
6
LAGERUNG UND HALTBARKEIT
Reagenz
Lagerung
Haltbarkeit
Mikrotiterstreifen
(mit Antikörper
beschichtet)
ungeöffnet
bis Verfallsdatum;
nach Anbruch bei 2 – 8 °C in Gegenwart von
Trockenmittel und wieder verschlossen gelagert
Mindesthaltbarkeit:
4 Wochen
Die unbenutzten Kavitäten sollen trocken und
luftdicht im verschlossenen Aluminiumbeutel
gelagert werden.
Haltbarkeit bei
sachgerechter
Lagerung: bis zum
Verfallsdatum
Kontrollseren /
Standardseren
nach Anbruch bei 2 – 8 °C
bis Verfallsdatum;
24 Monate ab
Herstellungsdatum
Konjugat
Gebrauchsfertige Lösung bei 2 – 8 °C
Kontaminationen sind u. a. durch den Gebrauch
steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden.
bis Verfallsdatum;
18 Monate ab
Herstellungsdatum
Verdünnungspuffer
ungeöffnet
bis Verfallsdatum;
24 Monate ab
Herstellungsdatum
6 Monate
nach Anbruch bei 2 – 8 °C
Eingetrübte Lösungen bitte verwerfen.
Waschlösung
Konzentrat nach Anbruch bei 2 – 8 °C
Gebrauchsverdünnung bei 2 – 8 °C
Gebrauchsverdünnung bei Raumtemperatur
Behälter für Gebrauchsverdünnung regelmäßig
reinigen! Eingetrübte Lösungen bitte verwerfen.
bis Verfallsdatum;
24 Monate ab
Herstellungsdatum
2 Wochen;
1 Woche
Substrat
bis Verfallsdatum;
Gebrauchsfertige Lösung bei 2 – 8 °C,
lichtgeschützt gelagert
24 Monate ab
Kontaminationen sind u. a. durch den Gebrauch Herstellungsdatum
Bei stärkerer Blaufärbung (Extinktion bei 650 nm
gegen Aqua dest. > 0,2 OD) bitte verwerfen.
Stopplösung
nach Anbruch bei Raumtemperatur
bis Verfallsdatum
Pos:
ELISA antigen/Gültig
für alle
Dokumente/ELISA
antigen/Testdurchführung/Überschrift:
Durchführung
@ 8\mod_1265792572851_6.doc
@
2874911@/Arbeitsanleitungen
1
deutsch
7
7
DURCHFÜHRUNG DES SERION ELISA antigen
Pos : 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Allgemei ne Hinweis e ELISA antig en @ 11\mod_1346845965842_6.doc @ 52106 @ 2
7.1
Allgemeine Hinweise
Für die sachgemäße Anwendung des SERION ELISA antigen sind ausschließlich die
SERION ELISA antigen Komponenten zu verwenden. Letztere können nicht durch
Reagenzien anderer Hersteller ersetzt werden. Die Standard- und Kontrollseren sowie das
Konjugat des SERION ELISA antigen sind chargenspezifisch für jeden Testkit optimal
eingestellt und können nicht in anderen Chargen eingesetzt werden. Verdünnungspuffer,
Waschlösung, Substratlösung und Stopplösung können mit allen SERION ELISA antigen
chargen- und kitunabhängig angewendet werden.
Unter Voraussetzung einer sachgerechten Lagerung sind alle Komponenten des SERION
ELISA antigen ungeöffnet bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett) verwendbar.
Die Reagenzien sollen nicht über das Verfallsdatum hinaus benutzt werden.
Die unsachgemäße Verdünnung
Nachweisempfindlichkeit führen.
der
Reagenzien
kann
zum
Verlust
an
Die Testreagenzien sollen während der Lagerung und Inkubation vor hellem Licht
geschützt werden. Nach Gebrauch sind die Komponenten gut zu verschließen, um deren
Austrocknung und Kontamination zu vermeiden.
Der Verschlussbeutel für die Kavitäten der Mikrotiterplatte soll nur an der Schweißnaht
aufgeschnitten werden, um ein Wiederverschließen zu gewährleisten. Bei Beschädigung
sowie nach unsachgemäßem Verschließen des Verschlussbeutels zur Aufbewahrung der
nicht benutzten Kavitäten sollen die Mikrotiterstreifen nicht mehr verwendet werden.
Um Kontamination zu vermeiden, sollten immer aseptische Techniken zur Entnahme von
Reagenzienaliquots angewendet werden. Zur Vermeidung verfälschter Ergebnisse darf die
Pipettenspitze bei der Konjugatpipettierung keinesfalls den oberen Rand der Kavitäten
berühren und benetzen. Beim Verschließen der Fläschchen ist darauf zu achten, wieder
den entsprechenden, zur Flasche gehörenden Deckel einzusetzen.
Insbesondere die TMB-Substratlösung ist empfindlich gegenüber oxidierenden
Substanzen und Schwermetallionen. Sie ist ständig lichtgeschützt aufzubewahren. Die
TMB-Substratlösung ist unter möglichst geringer Lichteinwirkung kurz vor Gebrauch zu
öffnen. Diese Lösung ist schwach blau-grün gefärbt.
Der Hautkontakt mit Substrat– und Stopplösung ist zu vermeiden!
Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist u. a. von der sorgfältigen Mischung der
angesetzten Reagenzien abhängig. Aus diesem Grund sollen die Behältnisse von
Kontrollseren und Konjugaten vor Entnahme gut geschüttelt werden. Auch die
Probenverdünnungen sollen vor dem ersten Pipettierschritt mit einem Monomixer (z. B.
Vortex) gut durchmischt werden.
Weiterhin ist auf eine sorgfältige Pipettierung und die Einhaltung der vorgegebenen
Inkubationszeiten und -temperaturen zu achten. Große Zeitdifferenzen zwischen der
Pipettierung der ersten und der letzten Kavität bei der Zugabe von Proben- und
deutsch
8
Nur die strikte Einhaltung der Arbeitsvorschrift gewährleistet korrekte Ergebnisse.
Der SERION ELISA antigen kann nur ausgewertet werden, wenn die chargenspezifischen
Validitätswerte des im Kit enthaltenen Qualitätskontrollzertifikates erfüllt wurden.
Korrektes Waschen verhindert Testunspezifitäten. Aus diesem Grund sollten die
Gebrauchsanleitungen der verwendeten Waschgeräte befolgt werden. Wichtig sind die
gleichmäßige Befüllung der Kavitäten der Flachbodenplatten mit Waschlösung und deren
vollständige Entfernung, um unkontrollierbare Verdünnungseffekte auszuschließen.
Schaumbildung ist in jedem Fall zu vermeiden!
Die Beschriftung der Mikrotiterstreifen mit den Kürzeln des Erregers in Kombination mit
dem Kürzel AG für SERION ELISA antigen sollte nicht zerkratzt werden, um ein
Verwechseln zu vermeiden.
Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estdurc hführung/Pr obenvor ber eitung und Lagerung/Candida antigen: Probenvorbereitung und Lager ung @ 11\mod_1346846025700_6.doc @ 52140 @ 2
7.2
Probenvorbereitung und Lagerung
Lipämische, hämolytische sowie ikterische Proben (Serum oder Plasma) sollten nur unter
Vorbehalt eingesetzt werden. Bakteriell kontaminierte Proben sollten nicht verwendet
werden. Geeignete Untersuchungsmaterialien sind nach Standardlabortechniken
gewonnene Seren oder Plasmen (EDTA, Citrat, Heparin).
Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estdurc hführung/Pr obenver dünnung/Candida antigen: Probenverdünnung @ 11\mod_1346846162855_6.doc @ 52208 @ 3
deutsch
9
DE
Kontrollseren, Konjugat und Substrat führen zu unterschiedlichen Inkubationszeiten,
welche die Präzision und Reproduzierbarkeit der Messwerte beeinflussen können.
7.2.1 Probenvorbereitung
Vor Testbeginn die Proben (Patientenproben, Standard und Negativkontrolle) (V1) in
Verdünnungspuffer (V2) verdünnen:
V1 + V2 = 3+1
je
zu je
300 µl Probe (V1)
100 µl Verdünnungspuffer (V2)
Nach jeder Verdünnung und vor dem Pipettierschritt sollten die Proben mit einem
Monomixer (z. B. Vortex) gut durchmischt werden, um eine homogene Lösung
herzustellen.
Im Anschluss werden die Proben 10 Min. bei 110 °C (+/- 5 °C) erhitzt. Es ist unbedingt
darauf zu achten, dass sowohl die Zeit als auch die Temperatur eingehalten werden!
Standardreaktionsgefäße sind für die Thermolyse nicht geeignet. Wir empfehlen SafeLock Reaktionsgefäße bzw. Reaktionsgefäße mit Drehverschluss.
Bei Verwendung von Heizblockthermostaten sollte die eingestellte Temperatur von 110 °C
(+/- 5 °C) mit einem geeichten Thermometer überprüft werden. Bei Diskrepanzen ist das
Heizblockthermometer entsprechend zu justieren. Die gerätespezifische Vorheizdauer ist
zu berücksichtigen. Während der Thermolyse bildet sich ein weißer, fester Niederschlag.
Die Probe wird anschließend mit einer auf 4 °C vorgekühlten Tischzentrifuge für 10 Min.
bei 10.000 × g zentrifugiert und der klare Überstand für den weiteren Testablauf
verwendet.
Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Probenl agerung ELISA antig en @ 8\mod_1265791164461_6.doc @ 28563 @ 3
7.2.2 Probenlagerung
Die so behandelten Proben sollten nicht länger als 24 Stunden bei 2 – 8 °C aufbewahrt
werden. Unbehandelte Patientenproben sollten nicht länger als 7 Tage bei 2 – 8 °C
aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung der Proben ist bei ≤ -20 °C möglich.
Mehrmaliges Auftauen und Wiedereinfrieren soll vermieden werden.
Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/R eagenzienvorbereitung ELISA antigen @ 11\mod_1346845998930_6.doc @ 52123 @ 2333333
deutsch
10
DE
7.3
Reagenzienvorbereitung
Alle Testreagenzien müssen vor dem Testansatz auf Raumtemperatur erwärmt
werden.
7.3.1 Mikrotiterstreifen
Die Teststreifen bzw. Kavitäten sind zusammen mit einem Trockenmittel verpackt.
Nicht benötigte Teststreifen bzw. Kavitäten sollten wieder mit dem Trockenmittel im
Aluminiumbeutel luftdicht eingeschlossen werden.
7.3.2 Kontrollseren / Standardseren
Kontroll- und Standardseren müssen mit Probenpuffer verdünnt und anschließend
denaturiert werden. Bei jedem Testlauf müssen unabhängig von der Anzahl der
eingesetzten Teststreifen Kontrollseren in Einfach-, Standardseren in Doppelbestimmung mitgeführt werden.
7.3.3 Konjugat (gebrauchsfertig)
Kontaminationen des gebrauchsfertigen Konjugats sind u. a. durch den Gebrauch
7.3.4 Waschlösung
Das Waschlösungskonzentrat (V1) ist im Verhältnis 1:30 mit Aqua dest. auf ein
Endvolumen (V2) zu verdünnen.
Beispiel:
Waschlösungskonzentrat (V1)
Endvolumen (V2)
25 ml
750 ml
1 ml
30 ml
7.3.5 TMB-Substratlösung (gebrauchsfertig)
Kontaminationen der gebrauchsfertigen Substratlösung sind u. a. durch den
Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden. Die TMB-Substratlösung
ist schwach blau-grün gefärbt; stark gefärbte Lösungen (Extinktion bei 650 nm
gegen Aqua dest. > 0,2 OD) bitte verwerfen.
7.3.6 Stopplösung (gebrauchsfertig)
Pos: 17 /Arbeitsanleitungen ELISA
antigen/Gültig
für
alle Dokumente/ELISA
antigen/Testdurchführung/Testablauf/Überschrift
Testablauf
@
8\mod_1265793631810_6.doc
@ 28922
@2
deutsch
11
7.4
Übersicht - Testablauf
Pos : 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/T es tablauf/Tes tablauf Candida antigen @ 11\mod_1346681847716_6.doc @ 52067 @
quantitativ
Vorbereitung der Proben, des Kontroll- und Standardserums
Probenverdünnung
(Patientenproben, Kontroll- und Standardserum)
300 µl Probe + 100 µl Verdünnungspuffer
INKUBATION 10 Min. / 110 °C
ZENTRIFUGATION 10 Min. / 10.000 × g / 4 °C
Überstand abnehmen, Pellet verwerfen
Pos: 26 /Arbeitsanleitungen/Gültig
für alle 21335
Zugabe der Überstände (je 100 µl)
feuchte Kammer
WASCHEN (5 x 300 µl DIL WASH )
Zugabe der Konjugatlösung PODCR (100 µl)
feuchte Kammer
WASCHEN (5 x 300 µl DIL WASH )
Zugabe der Substratlösung TMB (100 µl)
feuchte Kammer
Zugabe der Stopplösung STOP (100 µl)
EXTINKTIONSMESSUNG bei 450 nm (Ref. 650 nm)
Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estdurc hführung/Tes tdurc hführ ung/C andi da antigen: Manuelle Testdurc hführ ung @ 11\mod_1346846068724_6.doc @ 52157 @ 2
deutsch
12
DE
7.5
Manuelle Testdurchführung
1. Vorbehandlung der Proben (Patientenproben, Standard- und Kontrollserum) wie
beschrieben.
2. Erforderliche Anzahl Kavitäten in den Testrahmen einsetzen und Protokollblatt
anlegen.
3. Je 100 µl der Überstände von Standard (Doppelansatz) sowie von Negativkontrolle und Patientenproben in die benötigten Kavitäten der Teststreifen
pipettieren. Eine Kavität für den Substratleerwert (Blank) freilassen, z. B.:
Candida antigen quantitativ
Kavität A1
Substratleerwert (Blank)
Kavität B1
Negative Kontrolle
Kavität C1
Standardserum
Kavität D1
Standardserum
Kavität E1
Patientenprobe 1....
4. Probeninkubation für 60 Minuten (+/- 3 Min.) bei 37 °C (+/- 1 °C) in der feuchten
Kammer.
5. Am Ende der Inkubationszeit die Kavitäten waschen (mit Waschgerät oder manuell):
- Inkubationsflüssigkeit aus den Kavitäten absaugen oder ausschütten
- in jede Kavität 300 µl Waschlösung füllen
- Waschlösung absaugen oder ausschütten
- Vorgang 4 x wiederholen (also insgesamt 5 x waschen)
- die Platte auf Papiertüchern ausklopfen
6. Konjugatzugabe
Je 100 µl des gebrauchsfertigen Konjugats in die entsprechenden Kavitäten
pipettieren (ohne Substratleerwert).
7. Konjugatinkubation für 60 Minuten (+/- 3 Min.) bei 37 °C (+/- 1 °C) in der feuchten
Kammer.
8. Am Ende der Inkubationszeit die Kavitäten waschen (wie oben).
9. Substratzugabe
Je 100 µl gebrauchsfertige TMB-Substratlösung in alle Kavitäten (auch
Substratleerwert) pipettieren.
10. Substratinkubation für 30 Minuten (+/- 1 Min.) bei 37 °C (+/- 1 °C), lichtgeschützt in
der feuchten Kammer.
11. Stoppen der Reaktion
Je 100 µl Stopplösung in alle Kavitäten pipettieren. Mikrotiterplatte zum Mischen
leicht schütteln.
12. Extinktionsmessung
Innerhalb 60 Minuten bei 450 nm gegen den Substratleerwert messen;
Referenzwellenlänge im Bereich zwischen 620 nm und 690 nm (z. B. 650 nm).
Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Automatis che T estdurchführung @ 8\mod_1265792441716_6.doc @ 28693 @ 2
deutsch
13
7.6
Automatische Testdurchführung
Die SERION ELISA sind validiert für die Anwendung auf ImmunomatTM und Gemini und
geeignet für die Anwendung auf baugleichen Automaten. Die automatische Prozessierung
erfolgt analog zur manuellen Bearbeitung. Bitte beachten Sie, dass unter speziellen
Arbeitsbedingungen laborinterne Anpassungen der Inkubationszeiten notwendig sein
können.
Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Positi vkontrolle / Ric htig keits kontrolle @ 9\mod_1280219364971_6.doc @ 34538 @ 2
7.7
Positivkontrolle / Richtigkeitskontrolle
Zur periodischen Überprüfung der Untersuchungsmethode im Rahmen des laborinternen
Qualitätsmanagements empfehlen wir die Anwendung unserer SERION ELISA control.
Die Positivkontrollen dienen als Richtigkeitskontrollen sowie zur Überprüfung der Präzision
der angewandten Methode. Der Gebrauch ist in einer separaten Arbeitsanleitung
beschrieben.
Pos : 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Kapitelüberschrift: T ESTAU SWERTUN G + Erreger @ 8\mod_1265792998663_6.doc @ 28844 @ 1
deutsch
14
DE
8
TESTAUSWERTUNG
Pos : 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/T estaus wertung: Ein- Punkt- Quantifizier ung @ 11\mod_1346846096430_6.doc @ 52174 @ 2
8.1
Ein-Punkt-Quantifizierung nach der 4PL-Methode
Die größtmögliche Genauigkeit der Zuordnung von Messsignalen zu quantitativen Werten
bieten nichtlineare Funktionen, die sigmoidale Kurven direkt, ohne jede weitere
Transformation, der OD-Skala anpassen. Die Konzentrationsbestimmung des Antigens im
SERION ELISA antigen erfolgt nach dem ‘’4-Parameter logistic-log-Modell (4PL)’’, dessen
mathematische Funktion durch folgende Formel beschrieben wird:
D-A
OD = A +
1 + e B(C - ln Konz.)
Die Parameter A, B, C und D geben den Kurvenverlauf exakt wieder und definieren
1. die untere Asymptote
2. die Steigung der Kurve im Wendepunkt
3. den Wendepunkt der Kurve
4. die obere Asymptote
Parameter A
Parameter B
Parameter C
Parameter D
Die Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg) ermittelt für jede Kitcharge die Standardkurven
in mehrfachen Testläufen unter Einhaltung optimaler Bedingungen. Auf diese Weise
entfällt die kosten- und zeitintensive Konstruktion der Standardkurve durch den Anwender.
Zur Auswertung der Testläufe wird jedem SERION ELISA antigen ein chargenspezifisches
Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle beigelegt. Die Software
SERION evaluate sowie die Microsoft® Excel-basierte Auswertehilfe SERION activity
werden auf Anfrage gerne zur Verfügung gestellt.
Zum Ausgleich von Testschwankungen und um die Qualität des Testlaufes zu überprüfen,
wird das so genannte Standardserum mitgeführt. Diesem Standardserum werden in der
Qualitätsendkontrolle ein Sollwert sowie ein Gültigkeitsbereich zugeordnet, innerhalb
dessen Grenzen eine sichere und zuverlässige Bewertung der Testergebnisse garantiert
wird.
Pos : 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/T estg ültig keits kriteri en @ 8\mod_1265793547923_6.doc @ 28905 @ 2
deutsch
15
8.2
-
-
Testgültigkeitskriterien
Der Substratleerwert sollte einen OD-Wert < 0,25 aufweisen.
Die negative Kontrolle muss in der Testauswertung als negativ bewertet werden.
Bei quantitativen SERION ELISA antigen muss der OD-Mittelwert des
Standardserums nach Abzug des Substratleerwertes innerhalb des
Gültigkeitsbereiches liegen, welcher auf dem chargenspezifischen
Qualitätskontrollzertifikat angegeben ist.
Die OD-Werte des Standardserums dürfen nicht mehr als 20 % differieren.
Sind diese Kriterien nicht erfüllt, ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden.
Pos: 25@/Arbeitsanleitungen
für8\mod_1265792620271_6.doc
antigen/Testauswertung/Auswertung:
Überschrift @
@
28765
2
8.3
Auswertung SERION ELISA antigen Candida
Pos : 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Nic htautomatisi erte Aus wertung ELISA antigen @ 11\mod_1346846114323_6.doc @ 52191 @ 3
8.3.1 Nichtautomatisierte Auswertung
Zur Auswertung der Testläufe wird jedem SERION ELISA antigen ein chargenspezifisches
Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle beigelegt. Der
Substratleerwert (Blank) muss vor den Auswertungen von allen Messergebnissen
abgezogen werden.
Pos : 27 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/T estaus wertung Methoden @ 11\mod_1346849110626_6.doc @ 52242 @
Methode 1: Qualitative Auswertung
Zur Festlegung des cut-off Bereiches in OD multipliziert man den Mittelwert der
gemessenen OD des Standardserums mit dem angegebenen Zahlenwert auf dem
Qualitätskontrollzertifikat (siehe Formeln für spezielle Auswertesysteme), z. B.:
OD = 0,502 x MW(STD) bei oberer cut-off Grenze
OD = 0,352 x MW(STD) bei unterer cut-off Grenze
Wird beispielsweise ein Extinktionmittelwert des Standardserums von OD 0,970
gemessen, ergibt sich ein cut-off Bereich von OD 0,341 bis 0,487.
Methode 2: Stufenlose Bestimmung der Antigenaktivitäten mittels Standardkurve:
Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen/Gültig für alle Dokumente/Tes taus wertung/T estaus wertung: M ethode 2 (für alle T ests) @ 4\mod_1255348201981_6.doc @ 21415
Testschwankungen, die von Tag zu Tag sowie von Labor zu Labor auftreten können, so
genannte Interassay-Varianzen, werden durch Multiplikation des aktuellen Messwerts der
Patientenproben mit dem Korrekturfaktor F ausgeglichen:
OD-Sollwert (des Standardserums)
F =
OD-Tageswert (des Standardserums)
deutsch
16
1.
2.
3.
4.
Mittelwert aus den beiden Extinktionswerten des Standardserums bilden und
prüfen, ob der ermittelte Wert im angegebenen Gültigkeitsbereich liegt.
Berechnung des Faktors F: Der angegebene Sollwert des Standards wird durch den
Mittelwert der Extinktion des Standardserums geteilt:
F = Sollwert Extinktion Standardserum / Mittelwert Extinktion Standardserum.
Alle Messwerte der Patientenproben werden mit F multipliziert.
Über die korrigierten Messwerte können anhand der Standardkurve
Antigenaktivitäten in IU/ml bzw. U/ml abgelesen werden.
Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Automatisc he Aus wertung @ 8\mod_1265792721689_6.doc @ 28780 @ 3
8.3.2 Automatische Testauswertung mit der Software SERION evaluate
Durch Eingabe der vier Parameter und des Sollwertes des Standardserums werden
Antigenaktivitäten nach Prozessierung und Messung des SERION ELISA antigen durch
das Auswerteprogramm SERION evaluate errechnet.
Falls ein Wert außerhalb des Gültigkeitsbereiches liegt, werden
Fehlermeldungen in englischer Sprache angezeigt:
„Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24.” bzw.
„Standard value differ more than 20 % in following groups: Group 1-24.”
folgende
In diesen Fällen ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden.
Die vier Kurvenparameter und der Sollwert müssen nur bei Chargenwechsel geändert
werden (Parameter und Sollwert sind auf der Wertetabelle angegeben). Die korrekte
Eingabe dieser chargenspezifischen Daten kann anhand der dem Standardserum
zugeordneten Aktivität (in IU/ml bzw. U/ml) überprüft werden. Der erhaltene Mittelwert der
Antigenaktivität muss mit der auf dem chargenspezifischen Qualitätskontrollzertifikat
angegebenen Bewertung übereinstimmen. Eine Messwertkorrektur erfolgt automatisch. Im
Ausdruck der Messergebnisse erscheint:
Probenbezeichnung
OD-Wert
U/ml
Bewertung
Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Quantifizi erungsgrenz en @ 8\mod_1265793123986_6.doc @ 28860 @ 2
deutsch
17
DE
Dieses Verfahren ist notwendig, um das aktuelle Testniveau des Anwenders an die
chargenspezifische Standardkurve anzugleichen bzw. zu normalisieren. Auf diese Weise
werden Tageswertschwankungen korrigiert.
8.4
Quantifizierungsgrenzen
Die Quantifizierungsgrenzen kennzeichnen den Bereich der zulässigen Wertelage. Sie
sind auf dem Kontrollzertifikat des SERION ELISA antigen angegeben. Im Rahmen der
Leistungsbewertungsstudie wurde die Verdünnungslinearität über diesen Bereich
nachgewiesen. Sollten Patientenproben Messwerte oberhalb dieses Bereichs erzielen,
können die Proben in einer höheren Verdünnung analysiert werden. Die erhaltenen
Antigenkonzentrationen sind dann mit dem zusätzlichen Verdünnungsfaktor zu
multiplizieren.
Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Grenz wertbereic h @ 9\mod_1280134439293_6.doc @ 34520 @ 2
8.5
Grenzwertbereich
Der Grenzwertbereich des SERION ELISA antigen Candida ist auf dem
Qualitätskontrollzertifikat angegeben und kennzeichnet den Bereich grenzwertiger
Messergebnisse. Die Bewertung einer Patientenprobe unterhalb des Grenzwertbereichs
charakterisiert ein negatives Testergebnis; die Bewertung einer Patientenprobe oberhalb
des Grenzwertbereichs wird als positives Testergebnis interpretiert. Im Falle eines
grenzwertigen Ergebnisses ist keine sichere Bewertung der Patientenprobe möglich. In
einem solchen Fall sollte der Test parallel mit einer, im Abstand von ein bis zwei Wochen
entnommenen, neuen Serumprobe (Serumpaar) wiederholt werden.
Pos : 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Kapitelüberschrift: Inter pretati on der Ergebniss e @ 8\mod_1265792956649_6.doc @ 28812 @ 2
8.6
Interpretation der Ergebnisse
Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estaus wertung/Candi da antigen/Candi da antig en: Interpr etation der Ergebni sse @ 11\mod_1346846245660_6.doc @ 52225 @
Ein positives Testergebnis im Patienten-Material weist auf eine Candida-Fungämie hin.
Die Interpretation der Ergebnisse kann nur in Zusammenhang mit dem klinischen Bild und
anderen Nachweismethoden erfolgen.
Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn mindestens 2,6 Units ermittelt werden. Dieses
Ergebnis in einer Probe bedeutet, dass darin die Menge an Mannan nachgewiesen
werden kann, die mit 2,6 ng Protein des Candida-Erregers assoziiert ist. Dabei kann es
sich um lebende bzw. um tote Erreger handeln.
Ein negatives Testergebnis schließt eine akute Infektion mit den entsprechenden Erregern
nicht aus. Besonders bei hohen anti-Candida Antikörper-Titern kann es sein, dass die
Antikörper das Antigen so stark maskieren, dass selbst durch die Denaturierungsschritte in
der Probenvorbereitung das Antigen nicht erkannt wird. Auch der Zeitpunkt der
Probennahme während der Infektion, eine ungeeignete Probennahme, Probenvorbereitung oder Probenlagerung können ein negatives Testergebnis verursachen.
Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Kapitelüberschrift: R eferenz ber eich ges under Pr obanden @ 8\mod_1265792966477_6.doc @ 28828 @ 2
deutsch
18
DE
8.7
Referenzbereich gesunder Probanden
Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/T estaus wertung/Candi da antigen/Candi da antig en: R efer enzbereic h g esunder Probanden @ 11\mod_1346681759863_6.doc @ 52050 @
Die Untersuchung von Seren unselektierter Blutspender aus dem süddeutschen Raum mit
dem SERION ELISA antigen Candida ergab folgende Verteilung: Von 103 untersuchten
Blutspenderseren wurden 92 (89,3 %) mit dem SERION ELISA antigen Candida negativ
bewertet, sechs Seren (5,8 %) lieferten einen positiven Befund und fünf Seren (4,9 %)
wurden grenzwertig bewertet.
Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Leistungsmer kmal e/Kapitelüberschrift Leis tungs mer kmale @ 8\mod_1265793732010_6.doc @ 28955 @ 1
9 LEISTUNGSMERKMALE
antigen/Gültig
für alle Dokumente/ELISA
antigen/Leistungsmerkmale/Kapitelüberschrift:
Sensitivität
und Spezifität @
8\mod_1265793737103_6.doc
@ 28987
@2
9.1
Sensitivität und Spezifität
Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/Leis tungs mer kmale/Candi da antig en/Candi da antig en: Sensiti vität und Spezifität @ 11\mod_1346681729877_6.doc @ 52016 @
In einer internen Studie zur Validierung des SERION ELISA antigen Candida wurden 148
Seren von erwachsenen Blutspendern bzw. von 93 Patienten, die im Laufe einer intensivmedizinischen Behandlung Anzeichen einer systemischen Candidose zeigten, untersucht
und mit den Ergebnissen eines kommerziell erhältlichen Antigennachweises verglichen.
Für die Berechnung der Sensitivität und Spezifität wurden die grenzwertig eingestuften
Seren nicht berücksichtigt.
Leistungsmerkmale
Sensitivität
Spezifität
> 99,9 %
97,8 %
In einer weiteren internen Studie wurden Kreuzreaktionen mit den Candida-Spezies
Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis und
Candida tropicalis im SERION ELISA antigen Candida festgestellt, so dass eine
umfangreiche Candida Diagnostik gewährleistet ist.
Weiterhin wurde die Kreuzreaktivität von Hydroxyethylstärke (HES) untersucht, die als
Plasmaexpander bei der Behandlung von Kreislaufschwächen (hypovolämischer,
hämorrhagischer und septischer Schock) eingesetzt wird. Trotz der molekularen
Ähnlichkeit dieser Substanz mit Mannan konnte keine Kreuzreaktivität im SERION ELISA
antigen Candida nachgewiesen werden.
Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Leistungsmer kmal e/Kapitelüberschrift Pr äzisi on @ 8\mod_1265793734510_6.doc @ 28971 @ 2
deutsch
19
9.2
Präzision
Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/Leis tungs mer kmale/Candi da antig en/Candi da antig en: Pr äzision @ 11\mod_1346681737927_6.doc @ 52033 @
Die intraserielle Präzision wurde mit unterschiedlich reaktiven Seren im Mehrfachansatz
(n = 20) innerhalb einer antigenbeschichteten Platte ermittelt. Für die Bestimmung der
interseriellen Präzision wurden Serumproben mit unterschiedlicher Reaktivität in 10
unabhängig voneinander durchgeführten Ansätzen geprüft.
Standardabweichung
Variationskoeffizient (VK %) =
x 100
Mittelwert
SERION ELISA antigen Candida:
Mittlere
Extinktion (OD)
Intraassay
(VK %)
Mittlere
Extinktion (OD)
Interassay
(VK %)
negativ
grenzwertig
0,223
0,507
9,6
2,4
0,225
0,476
7,3
5,3
positiv
1,413
2,5
1,356
2,7
positiv
2,851
2,0
2,442
8,1
Probe
Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Allgemeine T exte ELISA antigen/Sicherheits maßnahmen @ 8\mod_1265797262616_6.doc @ 29411 @ 122
deutsch
20
DE
10 SICHERHEITSMASSNAHMEN
10.1 Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Der SERION ELISA antigen ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen,
welches die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht.
Für die Handhabung der Testreagenzien und der Patientenproben gelten die anerkannten
Laborregeln:
-
Die Testpackung enthält Verdünnungen humaner Seren. Obwohl alle eingesetzten
Seren negativ auf anti-HIV-Ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und antiHCV-Ak getestet wurden, müssen sie als potentiell infektiös betrachtet werden.
-
Nicht mit dem Mund pipettieren.
-
In Bereichen, in denen mit Testreagenzien oder mit Patientenproben gearbeitet wird,
nicht essen, trinken oder rauchen.
-
Beim Umgang mit Testreagenzien und Patientenproben direkten Kontakt durch das
Tragen von Laborkittel, Einweghandschuhen und Schutzbrille vermeiden. Hände
anschließend gründlich reinigen.
-
Die Patientenproben und alle potentiell infektiösen Materialien sind nach der Testdurchführung zu dekontaminieren.
-
Die Reagenzien sind unzugänglich für Kinder aufzubewahren.
10.2 Entsorgung
Bitte beachten Sie die jeweils geltenden gesetzlichen Vorschriften!
Pos : 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Liter atur /Kapi tel übersc hrift: Literatur @ 8\mod_1265793744978_6.doc @ 29003 @ 1
deutsch
21
11 LITERATUR
Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für nur ein Dokument/Liter atur/C andida antigen: Literatur @ 8\mod_1265797355862_0.doc @ 29427 @
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R.
=== Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===
deutsch
22
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
EN
DIAGNOSTIC RELEVANCE
3
SERION ELISA antigen - TEST PRINCIPLE
4
KIT COMPONENTS
5
MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
6
STORAGE AND STABILITY
7
TEST PROCEDURE SERION ELISA antigen
7.1
General Notes
7.2
Sample Preparation and Storage
7.3
Preparation of Kit Reagents
7.4
Overview - Test Procedure
7.5
Manual Test Procedure
7.6
Automated Test Procedure
7.7
Positive Control / Accuracy Control
8
EL
2
PT
INTENDED USE
CS
1
EN
CONTENTS
TEST EVALUATION
8.1
Single-Point Quantification with the 4PL Method
8.2
Criteria of Validity
8.3
Calculation SERION ELISA antigen Candida
8.4
Limits of Quantification
8.5
Borderline Range
8.6
Interpretation of Results
8.7
Reference Range of healthy Individuals
9
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
9.1
Sensitivity and Specificity
9.2
Reproducibility
10
SAFETY MEASURES
10.1 Statements of Warning
10.2 Disposal
11
REFERENCES
current version No.: V 1.12/09-1
previous version: --
Enzyme-immunoassay for determination of Candida Antigen
for in vitro diagnostic use
Order Nr.: ESR200
Pos:
3 /Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Allgemeine
Texte ELISA
antigen/Kapitelüberschrift
"Anwendungsbereich" @
8\mod_1265792390921_18.doc
@ 28662
@1
1
INTENDED USE
SERION ELISA antigen Candida is a quantitative and qualitative immunoassay for the
detection of Candida antigen in human serum or plasma. The assay is recommended for
the detection of systemic candidosis.
Pos : 5 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Allgemei ne Texte ELISA antigen/Kapitelüberschrift "Diag nostisc he Bedeutung" @ 8\mod_1265792408092_18.doc @ 28678 @ 1
2
DIAGNOSTIC RELEVANCE
Candida albicans is an ubiquitous yeast which, like all Candida species, belongs to the
family of yeast-like fungi. Apart from the yeast form which primarily causes superficial
infections, so called pseudo mycelia are a further morphologic manifestation of yeast-like
fungi. Germ tubes and the development of pseudo mycelia mainly occur in cases of
systemic mycosis. Candida ssp. produce and excrete a range of destructive enzymes that
enable the facultative pathogen microorganisms to penetrate mucous membrane barriers
and blood vessels barriers.
Candida ssp. are primarily transmitted by smear contamination from person to person. The
primary portal of entry is the oral cavity. Changes in the fungistatic properties of the skin,
which are a consequence of a slightly acidic pH value and the antagonistic bacterial flora,
can facilitate the establishment of superficial candidiasis of the skin surface. Systemic
mycosis results from colonization of mucous membranes, particularly in the
gastrointestinal tract.
Candida ssp. are able to adhere to the epithelia of a variety of mucosal membranes by
adherence proteins and other cell surface structures. The schematic below shows
hypothetical steps that may lead to disseminated infections in cases of severe underlying
conditions. An exact description of the various stages is not practical (Fig. 1).
english
2
transfer to the
nasopharyngeal tract
stomach lumen
intestine lumen
entry into
transfer to
blood circulation
lymphoid system
persorption of
Candida- ssp.
EN
passing of the
EL
EN
colonization of the
progression of Candida-infections
Candidiasis can generally be classified into two major groups whose main characteristics
are listed in the table below.
Candida-infections
superficial
deep mycosis (invasive)
localization
skin, mucosa
prime organs
immunocompetence
of the host
+
+,-/-
risk factors
pregnancy
chemo therapy
diabetes
iatrogene immune suppression
AIDS
central vein catheter
dysfunction of the skin
radiotherapy
deficient oral hygiene
high-grade burns
surgery
clinical progression
harmless in most cases,
life-threatening in most cases
no danger of life
therapy
effective therapy
effectiveness
of
therapy
depends on stage of infection
Table 1: Characteristics of Candida-infections
english
3
CS
Figure 1:
PT
invasion of
multiple organs
The diagnosis of candidiasis on the basis of serological methods is not straight forward:
On the one hand transient yeast colonization may induce an antibody response, on the
other hand systemic Candida mycosis in immunosuppressed patients may only lead to
minor changes in antibody activities. Such situations make critical interpretation of
serological findings necessary. In addition, systemic Candida-infections may not cause
typical symptoms.
Currently it is not possible to conclude that the results of different test systems for antiCandida antibody detection are comparable or even exchangeable. Specificity of detected
antibodies significantly depends on the test system (ELISA or HAT) or on the antigen
preparation used. The detection of IgM antibodies with HAT is better than the IgG
detection due to higher agglutination properties of IgM molecules. HAT mainly detects
antibodies against cell wall antigens of yeast-like fungi which makes serological
interpretation even more complex but gives the opportunity for differentiation. Changes in
antibody concentrations may be detectable with ELISA but not with HAT, making a
combination of the two techniques advantageous, e.g. in case of decreasing IgM antibody
activity and simultaneously increasing IgG antibody activity.
Currently no single technique in isolation allows for a definitive serological diagnosis of
candidiasis. Surveillance of at risk patients and therapy control requires the use of a
variety of methods including serology and antigen detection. The SERION ELISA antigen
Candida test is of particular help in such situations by detecting Candida specific antigen in
patient samples.
Pos:
7@
/Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Testprinzip/Testprinzip
ELISA
antigen @für
8\mod_1265792007310_18.doc
@
28639
1
3 SERION ELISA antigen - TEST PRINCIPLE
The ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) is an immunoassay, which is
particularly suited to the determination of antibodies and antigens in the field of infectious
serology. The reaction is based on the specific interaction of antibodies with their
corresponding antigen. The test strips of the SERION ELISA antigen microtiter plate are
coated with specific antibodies directed against the pathogen of interest. If antigens in the
patient´s sample are present, they bind to the fixed antibody. A secondary antibody, which
has been conjugated with the enzyme peroxidase, detects and binds to the immune
complex. The colourless substrate hydrogen peroxide (H2O2) and the chromogen tetramethylbenzidine (TMB) are converted into a blue coloured product. Addition of stopping
solution changes the colour to yellow. The signal intensity of this reaction product is
proportional to the concentration of the antigen in the sample and is measured
photometrically.
english
4
EN
Standard serum STD ,
Candida albicans antigen in human serum supplemented with fetal calf serum (FCS);
negative for anti-HIV Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-HCV Ab;
preservative: < 0.1 % sodium azide.
3 x 3 ml
Negative control serum NEG ,
Human serum supplemented with fetal calf serum (FCS);
negative for anti-HIV Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-HCV Ab;
preservative: < 0.1 % sodium azide.
2 x 3 ml
Anti-Candida albicans conjugate (ready-to-use) PODCR ,
Anti-Candida albicans antibody conjugated to horseradish-peroxidase;
stabilised with protein stabilisation solution containing detergent;
preservative: 0.1 % ProClin® 300.
Washing solution concentrate (sufficient for 1500 ml) WASH ,
TRIS-buffered salt solution with Tween 20; 30-fold concentrated;
preservative: < 0.1 % ProClin® 300.
13 ml
2 x 25 ml
Dilution buffer SAMB ,
Acid solution without preservative.
15 ml
Stopping solution STOP ,
0.5 N sulfuric acid.
13 ml
TMB-substrate solution (ready-to-use) TMB ,
TMB-hydrogen peroxide substrate solution;
preservative: < 0.01 % Kathon CG.
13 ml
Quality control certificate with standard curve and evaluation table INFO ,
(quantification of antigens in U/ml).
Pos: 9 /Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
für benötigte
antigen/Zusätzlich
benötigte
Materialien/Zusätzlich
Materialien @
8\mod_1265796058727_18.doc
@ 29303
@1
english
5
2 pieces
EN
Break apart microtiter test strips each with eight antibody coated single wells,
(altogether 96) MTP ,
1 frame.
Pieces /
Volume
12 pieces
EL
Test Components
PT
KIT COMPONENTS
CS
4
5
-
MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
common laboratory equipment
photometer for microtiter plates with filter, wavelength 450 nm,
recommended reference wavelength 620 nm - 690 nm (e.g. 650 nm)
incubator 37 °C
heating block 110 °C
moist chamber
distilled water
Click-Clips (order no. VT120)
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Lagerung
und Haltbarkeit/Lagerung
@
11\mod_1346935956390_18.doc
@ 52260
@ 1 und Haltbarkeit
english
6
EN
STORAGE AND STABILITY
Microtiter strips
unopened
(coated with antibody)
see expiry date;
after opening at 2 – 8 °C in closed aluminum bag with minimum shelf-life:
desiccant
4 weeks
Strips which are not used must be stored dry and air shelf-life in case of
tight in the closed aluminum bag.
proper use and
storage: until expiry
date
Control sera /
Standard sera
after opening at 2 – 8 °C
Conjugate
ready-to-use solution at 2 – 8 °C
see expiry date;
Avoid contamination e.g. by using sterile tips.
18 months as of date
of production
unopened
see expiry date;
Dilution buffer
see expiry date;
of production
of production
Washing solution
after opening at 2 – 8 °C
Discard cloudy solutions.
6 months
Concentrate after opening at 2 – 8 °C
see expiry date;
of production
working dilution at 2 – 8 °C
working dilution at room temperature
2 weeks
1 week
Bottles used for the working dilution should be
cleaned regularly. Discard cloudy solutions.
TMB substrate
ready-to-use solution at 2 – 8 °C,
stored protected from light
Avoid contamination e.g. by using sterile tips.
see expiry date;
of production
Discard if solution turns blue (extinction at 650 nm
against aqua dest. > 0.2 OD).
Stopping solution
After opening at room temperature
Pos : 11 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/Ü berschrift: D urchführung @ 8\mod_1265792572851_18.doc @ 28750 @ 1
english
EN
Stability
EL
Storage
PT
Reagent
7
see expiry date
CS
6
7
TEST PROCEDURE SERION ELISA antigen
7.1
General Notes
Only use SERION ELISA antigen reagents when using SERION ELISA antigen
immunoassays. The components must not be exchanged for reagents of other
manufacturers. Standard and control sera as well as the conjugate of SERION ELISA
antigen immunoassays are defined exclusively for the test kit to be used and must not be
used in other lots. Dilution buffer, washing solution, substrate and stop solution can be
used for all SERION ELISA antigen immunoassays irrespective of the lot and the test.
Unopened, all components of the SERION ELISA antigen tests may, if stored accordingly,
be used up to the expiry dates given on the labels. Reagents may not be used after date of
expiry.
Dilution or alteration of the reagents may result in a loss of sensitivity.
Avoid exposure of reagents to strong light during storage and incubation. Reagents must
be tightly closed after use to avoid evaporation and contamination.
To open the aluminium bag of the microtiter plate please cut off the top of the marked side
only, in order to guarantee proper resealing. Do not use the strips if the aluminium bag is
damaged or if the bag with remaining strips and desiccant was not properly resealed.
Use aseptic techniques when removing aliquots from the reagent tubes to avoid
contamination. To avoid false positive results ensure not to contact or splash the top-walls
of wells while pipetting conjugate. Take care not to mix the caps of the bottles and/or vials.
In particular, the TMB-substrate solution is sensitive to oxidising substances and heavy
metal ions. It must be stored away from light at all times and only opened in low light
conditions immediately prior to use. This solution is coloured light blue-green.
Skin contact with substrate and stop solution should be avoided.
Reproducibility of test results is dependent on thorough mixing of the reagents. Agitate the
flasks containing control sera before use and also all samples after dilution (e.g. by using a
vortex mixer).
Be sure to pipette carefully and comply with the given incubation times and temperatures.
Significant time differences between pipetting the first and last well of the microtiter plate
when dispensing samples and control sera, conjugate or substrate can result in different
pre-incubation times, which may influence the precision and reproducibility of the results.
Optimum results can only be achieved if the instructions are strictly followed.
The SERION ELISA antigen immunoassay is only valid if the lot-specific validation criteria
on the quality control certificate are fulfilled.
english
8
EN
EN
Adequate washing avoids test unspecificities. Therefore, the washing procedure should be
carried out carefully. All of the flat bottom wells should be filled with equal volumes of
washing buffer. At the end of the procedure ensure that the wells are free of all washing
buffer in order to avoid uncontrolled dilution effects. Avoid foaming!
Take care not to damage the inscription (pathogen / AG) on the microtiter test strips during
washing and aspiration to avoid confusion.
Sample Preparation and Storage
Lipaemic, hemolytic or icteric samples (serum or plasma) should only be tested with
caution. Obviously contaminated samples should not be tested. Serum or plasma (EDTA,
citrate, heparin) collected according to standard laboratory methods are suitable samples.
PT
7.2
EL
Before running the test, specimens (patient samples, standard and negative control) (V1)
must be diluted in dilution buffer (V2) as follows:
V1 + V2 = 3+1
add
each to
300 µl sample (V1)
100 µl dilution buffer (V2)
After dilution and before pipetting into the microtiter plate, the samples must be mixed
thoroughly to prepare a homogenous solution.
Finally, the samples must be heated at 110 °C (+/- 5 °C) for 10 minutes. It is essential to
keep both the time and temperature stated! Standard reagent vessels are not suitable for
this thermolysis step and we recommend the use of safe-lock reaction vessels or similar
vessels with a screw closure.
Usage of a heating block thermostat requires controlling of the actual temperature by a
calibrated thermometer. Consider the device-specific pre-heating period of the heating
block. If necessary, the heating block must be adjusted to the required temperature.
During thermolysis, a white cloudy precipitate will form and should be removed by
centrifugation in a pre-cooled (4 °C) table top centrifuge at 10,000 × g for 10 minutes. The
clear supernatant can then be used in the test.
7.2.2 Sample Storage
The treated patient’s samples should not be stored for more than 24 hours at 2 – 8 °C.
Untreated samples should not be stored at 2 – 8 °C for more than 7 days. Extended
storage is possible at ≤ -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing of samples.
english
9
CS
7.2.1 Sample Preparation
7.3
Preparation of Kit Reagents
Bring all reagents to room temperature before testing.
7.3.1 Microtiter Test Strips
The microtiter test strips in frames are packed with a desiccant in an aluminum bag.
Take unrequired cavities out of the frame and put them back into the aluminum bag.
Close bag carefully to ensure airtight conditions.
7.3.2 Control Sera / Standard Sera
Control and standard sera must be diluted with sample buffer and subsequently
denatured. For each test run – independent of the number of microtiter test strips to
be used – control and standard sera must be included. The standard sera should be
set up in duplicate.
7.3.3 Conjugate (ready-to-use)
Avoid contamination of the ready-to-use conjugate, e.g. by using sterile tips.
7.3.4 Wash solution
Dilute washing buffer concentrate (V1) 1:30 with aqua dest. to a final volume of V2.
Example:
Buffer concentrate (V1)
Final volume (V2)
25 ml
750 ml
1 ml
30 ml
7.3.5 TMB Substrate (ready-to-use)
Avoid contamination of the ready-to-use substrate solution, e.g. by using sterile tips.
The TMB substrate is coloured light blue-green and any solutions which exhibit a
strong colour (extinction at 650 nm against distilled water of >0.2 OD) should be
discarded.
7.3.6 Stopping Solution (ready-to-use)
Pos : 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/T es tablauf/Übersc hrift T establauf @ 8\mod_1265793631810_18.doc @ 28923 @ 2
english
10
EN
Overview - Test Procedure
quantitativ
EN
7.4
INCUBATION 10 min. / 110 °C
CENTRIFUGATION 10 min. / 10,000 × g / 4 °C
PT
Sample dilution
(Patient samples, control and standard serum)
300 µl Sample + 100 µl Dilution buffer
EL
Preparation of samples, control and standard serum
Add supernatant from samples (100 µl)
moist chamber
WASH (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipette conjugate solution PODCR (100 µl)
moist chamber
WASH (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipette substrate solution TMB (100 µl)
moist chamber
Pipette stop solution STOP (100 µl)
READ EXTINCTION at 450 nm (ref. 650 nm)
english
11
CS
Retain supernatant, discard pellet
7.5
Manual Test Procedure
1. Pretreatment of samples (patient samples, standard and control serum) as described.
2. Place the required number of cavities in the frame and prepare a protocol sheet.
3. Add each 100 µl of the supernatants from the standard serum (in duplicate),
negative control and patient samples into the appropriate wells of microtiter test
strips. Spare one well for substrate blank, e.g.:
Candida antigen quantitative
cavity A1
Substrate blank
cavity B1
Negative control
cavity C1
Standard serum
cavity D1
Standard serum
cavity E1
Patient sample 1....
4. Sample incubation for 60 minutes (+/- 3 min.) at 37 °C (+/- 1 °C) in moist chamber.
5. After incubation wash all wells with washing solution (by automated washer or
manually):
- aspirate or shake out the incubation solution
- fill each well with 300 µl washing solution
- aspirate or shake out the washing buffer
- repeat the washing procedure 4 times (altogether 5 times!)
- dry by tapping the microtiter plate on a paper towel
6. Addition of conjugate
Add 100 µl of the ready-to-use conjugate into the appropriate wells (except
substrate blank).
7. Conjugate incubation for 60 minutes (+/- 3 min.) at 37 °C (+/- 1 °C) in moist
chamber.
8. After incubation wash all wells with washing solution (see above).
9. Addition of substrate
Add 100 µl of ready-to-use TMB-substrate solution into each well (including well for
substrate blank!).
10. Substrate incubation for 30 minutes (+/- 1 min.) at 37 °C (+/- 1 °C), protected from
light in moist chamber.
11. Stopping of the reaction
Add 100 µl stopping solution into each well. Agitate the microtiter plate gently to mix.
12. Read extinction
Read optical density (OD) within 60 minutes at 450 nm against substrate blank,
reference wavelength between 620 nm and 690 nm (e.g. 650 nm).
english
12
EN
Automated Test Procedure
SERION ELISA are suited for processing on automats and evaluated for use with
ImmunomatTM and Gemini. The automated processing is performed analogous to manual
use. Please note, that under special working-conditions internal laboratory adaptations of
the incubation times may be necessary.
EN
7.6
Positive Control / Accuracy Control
For the periodic verification of the test method, in order to fulfil the requirements of
laboratory internal quality management systems, we recommend using SERION ELISA
controls to determine precision and accuracy of SERION ELISA antigen test runs. The use
of SERION ELISA controls is described in specific instruction manuals.
PT
7.7
EL
CS
english
13
8
TEST EVALUATION
8.1
Single-Point Quantification with the 4PL Method
Optimised assignment of extinction signals to quantitative values is guaranteed by using
non-linear functions, which adjust a sigmoide curve without any further transformation to
OD-values. Determination of antigen concentrations with the SERION ELISA antigen is
carried out by the 4 parameter logistic-log-model (4 PL) which is ideal for exact curvefitting. It is based on the formula:
D-A
OD = A +
1 + e B(C - ln Conc.)
The parameters A, B, C, and D are representative for the exact shape of the curve:
1. lower asymptote
2. slope of the curve
3. turning point
4. upper asymptote
parameter A
parameter B
parameter C
parameter D
For each lot the standard curve is evaluated by Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg,
Germany) in repeated test runs under optimal conditions. Time consuming and cost
intensive construction of the standard curve by the user is not necessary.
For evaluation of antigen concentrations a lot specific standard curve as well as a lot
specific evaluation table is included with each SERION ELISA antigen test kit. The
evaluation software SERION evaluate as well as the Microsoft® Excel-based software tool
SERION activity are available on request.
To compensate for normal test variations and also for test run control a standard serum is
used in each individual test run. For this control serum a reference value with a validity
range is determined by the quality control of the producer. Within this range a correct
quantification of antigen concentration is ensured.
english
14
EN
-
The substrate blank must be < 0.25 OD.
-
The negative control must produce a negative test result.
-
By use of quantitative SERION ELISA antigen tests the mean OD-value (after
subtraction of the substrate blank!) of the standard serum must be within the validity
range, which is given on the lot specific quality control certificate.
-
The variation of OD-values of the standard serum may not be higher than 20 %.
EN
Criteria of Validity
EL
8.2
PT
If these criteria are not met, the test is not valid and must be repeated.
Pos : 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/Aus wertung: Ü bersc hrift @ 8\mod_1265792620271_18.doc @ 28766 @ 2
8.3
Calculation SERION ELISA antigen Candida
CS
8.3.1 Non-automated Evaluation
For the SERION ELISA antigen test evaluation a lot-specific quality control certificate with
standard curve and an evaluation table is included in the test kit. The substrate blank must
be substracted from all OD values prior to evaluation.
Pos:
27 /Arbeitsanleitungen ELISA
antigen/Gültig
für@alle Dokumente/ELISA
antigen/Testauswertung/Testauswertung
Methoden
11\mod_1346849110626_18.doc
@ 52243
@
Method 1: Qualitative Evaluation
To fix the cut-off ranges multiply the mean value of the measured standard OD with the
numerical data of the quality control certificate (see special case formulas), e.g.:
OD = 0.502 x MW(STD) with upper cut-off
OD = 0.352 x MW(STD) with lower cut-off
If the measured mean absorbance value of the standard serum is 0.970 OD, the range of
the cut-off is in between 0.341 - 0.487 OD.
Method 2:
Continuous Determination of Antigen Activities using the Standard Curve
So called interassay variations (day to day deviations and laboratory to laboratory
deviations) are compensated by multiplication of the current measured value obtained with
a patient’s sample with the correction factor F. This factor is calculated as follows:
OD-reference value (of standard serum)
F =
OD-current value (of standard serum)
english
15
The procedure is necessary to adjust the current test level of the user with the lot-specific
standard curve. First, daily deviations have to be corrected by calculating the correction
factor F.
1.
The mean of the two OD-values of the standard serum has to be calculated and
checked that it is within the given validity range.
2.
Calculation of the factor F: the given reference value is divided by the mean of the
extinction of the standard serum:
F = reference value extinction STD serum / mean value extinction STD serum.
3.
All measured values of patient samples are multiplied by F.
4.
Antigen activities in IU/ml or U/ml can be determined from the standard curve with
the corrected values.
8.3.2 Automatic Test Evaluation with Software SERION evaluate
After input of the four parameters and the reference value of the standard serum, antigen
activities are calculated online from processed and measured SERION ELISA antigen test
runs by the evaluation software SERION evaluate.
If the optical density of the standard is out of the valid range, the following message will
appear.
„Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24.” or
„Standard values differ more than 20 % in following groups: Group 1-24.”
In such cases the test run is invalid and should be repeated.
Parameters and reference value need to be changed only if there is a change of lot
(evaluation table shows parameters and reference values). Correct input of the lot specific
data can be checked on the basis of the standard serum activity (in IU/ml or U/ml)
assigned to the standard serum. The calculated mean value of the units has to correspond
to the unit value indicated on the lot specific certificate. There is an automatic correction of
the measured values. In the standard version the printout displays the following:
Sample code
OD-value
U/ml
Evaluation
english
16
EN
Limits of Quantification
The limits of quantification are specified on the quality control certificate of the SERION
ELISA antigen test. The linearity of dilution within this range has been demonstrated in
comprehensive evaluation studies. In case a patient sample shows a test result above the
upper limit of quantification, the sample may be tested at a higher dilution. The thereby
determined antigen activity must be multiplied by the additional dilution factor.
EN
8.4
The borderline range of the SERION ELISA antigen Candida test is specified on the
quality control certificate and indicates the range for borderline test results. Values
obtained, when testing a patient’s sample, which fall below this range indicate a negative
test result; values above the borderline range are interpreted positive. In cases where the
results are within the borderline range a definitive interpretation of the result is not
possible. In such cases, the test should be repeated in parallel with a follow-up sample
taken one to two weeks later (serum pair).
8.6
Interpretation of Results
Positive test results for patient samples indicate a Candida fungemia. Results can only be
interpreted in combination with the clinical picture and other detection methods.
A result can be considered as positive when at least 2.6 units are measured in the test.
Such a result indicates that the sample contains the quantity of Mannan that is associated
with 2.6 ng of Candida protein. However, it cannot distinguish between live or dead
organisms, respectively.
Negative test results do not exclude an acute infection, especially if high antibody titers are
found. In such cases it may be that the antigen is completely masked by antibodies and
even the denaturing procedure during sample preparation is not sufficient to allow
detection of the antigen. In addition, the point in time during an infection when a sample is
obtained, an unsuitable sample, poor sample preparation and storage can all lead to a
negative result.
8.7
Reference Range of healthy Individuals
Testing of random blood donor sera, collected in the region of southern Germany, with the
SERION ELISA antigen Candida test resulted in the following distribution. From 103 sera
tested with the SERION ELISA antigen Candida test, 92 (89.3 %) were negative, six sera
(5.8 %) gave a positive result and five samples (4.9 %) were determined to be borderline.
english
17
PT
Borderline Range
CS
8.5
EL
9
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Leistungsmer kmal e/Kapitelüberschrift: Sensiti vi tät und Spezifität @ 8\mod_1265793737103_18.doc @ 28988 @ 2
9.1
Sensitivity and Specificity
The SERION ELISA antigen Candida test was validated by the analysis of 148 serum
samples from blood donors and 93 specimens from patients, who showed signs of
candidiasis during intensive care treatment, in comparison to the results obtained with a
commercially avaliable assay of a leading European manufacturer. Sera classified as
borderline were not included in the calculation of sensitivity and specificity values.
Performance Characteristics
Sensitivity
Specificity
> 99.9 %
97.8 %
In another internal study, cross-reactivity with the species Candida guillermondii, Candida
glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis and Candida tropicalis with the SERION
ELISA antigen Candida was demonstrated in order to guarantee a comprehensive
Candida diagnosis.
Due to a similiarity of mannan with hydroxyethylstarch (HES), which is used in plasma
expanders for treatment of circulatory failure (hypovolemic, hemorrhagic and septic
shock), potential cross-reactivity was assessed. However, no cross-reaction with HES was
measureable when using the SERION ELISA antigen Candida test.
9.2
Reproducibility
Intraassay reproducibility was determined by testing sera of different reactivities 20 times
in one test run. Interassay reproducibility was determined by testing sera of different
reactivities in 10 independent test runs.
Standard deviation
Coefficient of Variation (CV %) =
x 100
Mean value
Mean Value
Intraassay
Mean Value
Interassay
(OD)
(CV %)
(OD)
(CV %)
negative
borderline
0.223
0.507
9.6
2.4
0.225
0.476
7.3
5.3
positive
1.413
2.5
1.356
2.7
positive
2.851
2.0
2.442
8.1
Sample
english
18
EN
10.1 Statements of Warning
The SERION ELISA antigen is designed for use by qualified personnel who are familiar
with good laboratory practice.
EL
EN
10 SAFETY MEASURES
This kit contains human blood components. Although all control- and cut-off sera
have been tested and found negative for anti-HIV-ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virussurface Antigen) and anti-HCV-ab, they should be considered potentially infectious.
-
Do not pipette by mouth.
-
Do not smoke, eat or drink in areas in which specimens or kit reagents are handled.
-
Wear disposable gloves, laboratory coat and safety glasses while handling kit
reagents or specimens. Wash hands thoroughly afterwards.
-
Patient’s material and other potentially infectious material should be
decontaminated after the test run.
Reagents should be stored safely and be unaccessible to unauthorized access e.g.
children.
-
10.2 Disposal
Please observe the relevant statutory requirements!
english
19
CS
-
PT
All kit reagents and human specimens should be handled carefully, using established good
laboratory practice.
11 REFERENCES
[1]
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
[3]
[4]
Rev. 3, 32-45.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
[15]
[16]
R.
english
20
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
1
UTILISATION PRÉVUE
2
PERTINENCE DU DIAGNOSTIC
3
SERION ELISA antigen - PRINCIPE DU TEST
4
COMPOSANTS DE LA TROUSSE
5
PRODUITS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS
6
STOCKAGE ET STABILITÉ
7
PRINCIPLE DU TEST SERION ELISA antigen
7.1
Remarques générales
7.2
Préparation et stockage de l'échantillon
7.3
Préparation des réactifs de la trousse
7.4
Aperçu général - Procédure de test
7.5
Procédure de test manuel
7.6
Procédure de test automatisée
7.7
Contrôle positif / Contrôle de la précision
8
FR
SOMMAIRE
ÉVALUATION DU TEST
8.1
Quantification en un point selon la méthode 4PL
8.2
Critères de validité
8.3
Calcul SERION ELISA antigen Candida
8.4
Limites de la quantification
8.5
Fourchette limite
8.6
Interprétation des résultats
8.7
Fourchette de références des personnes en bonne santé
9
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE
9.1
Sensibilité et Spécificité
9.2
Reproductibilité
10
MESURES DE SÉCURITÉ
10.1
Mises en garde
10.2
Élimination
11
RÉFÉRENCES
Version actuelle nr.: V 1.12/09-1
version précédente: --
Tests immuno-enzymatiques pour la détermination de l'antigène de Candida
pour le diagnostic in vitro
No de commande:
ESR200
Pos : 3 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Allgemei ne Texte ELISA antigen/Kapitelüberschrift " Anwendungs ber eich" @ 8\mod_1265792390921_23.doc @ 28663 @ 1
1
UTILISATION PRÉVUE
SERION ELISA antigen Candida est un test immuno-enzymatique quantitatif et qualitatif
pour le dépistage de l'antigène Candida dans le sérum humain ou le plasma. L'essai est
recommandé pour la détection de la candidose systémique.
Pos:
ELISAantigen/Kapitelüberschrift
antigen/Gültig
für @
alle
antigen/Allgemeine
Texte ELISA
"Diagnostische
Bedeutung"
@ 8\mod_1265792408092_23.doc
@ 28679
1 Dokumente/ELISA
2
PERTINENCE DU DIAGNOSTIC
Candida albicans est une levure ubiquitaire qui, comme toutes les sous-espèces de
Candida, appartient à la famille de champignons lévuliformes (voir tableau 1). À l'exception
de la forme levure qui donne principalement des infections superficielles, les dits pseudomycéliums représentent une autre forme morphologique de la manifestation des
lévuliformes. La formation de tubes germinatifs et le développement de pseudo-mycèles
ne sont observés que dans les cas de mycose systémique. Candida ssp. produit et
sécrète une diversité d’enzymes destructrices qui permettent aux microorganismes
facultativement pathogènes de pénétrer les barrières vaisseaux sanguins et de la
membrane muqueuse.
Les espèces de Candida ssp. sont principalement transmises par contact avec des
matières biologiques souillées de personne à personne. La voie d'entrée principale étant
la cavité orale. La perturbation des propriétés fongistatiques de la peau, qui est la
conséquence d’un pH légèrement acide et une flore bactérienne antagoniste, peut faciliter
une candidose sur la surface de la peau. La mycose systémique peut être due à une
colonisation de la membrane muqueuse et en particulier le tractus gastro-intestinal.
Les Candida ssp. sont capables de se fixer à l'épithélium d'une diversité de membranes
muqueuses grâce aux protéines d'adhérence et autres structures de la surface cellulaire.
Le schéma ci dessous illustre des étapes hypothétiques qui peuvent entraîner des
infections disséminées en présence de conditions existantes graves. Une description
exacte des différents stades n'est pas réalisable ici. (Figure 1)
français
2
FR
Figure 1 : évolution des infections à Candida
Les Candidoses peuvent généralement être classée en deux groupes principaux dont les
caractéristiques sont énumérées dans le tableau ci dessous.
Infections au Candida
superficielle
Mycose profonde (invasive)
localisation
Peau, muqueuse
Organes principaux
Immunocompétence
de l'hôte
+
+,-/-
Facteurs de risque
grossesse
chimiothérapie
diabète
Immunosuppression iatrogène
SIDA
Cathéter veineux central
Dysfonctionnement de la peau
radiothérapie
Hygiène buccale déficiente
Brûlures de hauts degrés
chirurgie
Évolution clinique
Bénigne dans la plupart des cas,
Ne met pas la vie en danger
thérapie
Thérapie efficace
Efficacité de la thérapie dépend
du stade de l'infection
Tableau 1 : Caractéristiques des infections aux Candida
français
Dans la plupart des cas, met la
vie en danger
3
Le diagnostic sérologique des infections Candida est particulièrement difficile. D’un côté,
des colonies temporaires de levures peuvent aussi induire une réponse des anticorps, de
l'autre, des mycoses systémiques par Candida chez des patients dont l’immunité a été
supprimée, ne produisent souvent que des changements mineurs au niveau de l’activité
de l’anticorps. Cette situation rend nécessaire l'interprétation critique des résultats
sérologiques. En outre, les infections systémiques de Candida ne causent pas de
symptômes types.
Actuellement, il est impossible de conclure si les résultats des différents systèmes de test
pour la détection des anticorps anti-Candida sont comparables ou même échangeables.
La spécificité des anticorps détectés dépend significativement du système de test (ELISA
ou test d’hémagglutination) ou de la préparation d'antigène utilisée. La détection des
anticorps de classe IgM avec le test d’hémagglutination est meilleure que la détection
d'IgG, étant donné que les molécules d’IgM ont de meilleures propriétés d'agglutination.
Le test d’hémagglutination détecte principalement des anticorps dirigés contre les
antigènes de la paroi cellulaire des levures telles que les champignons lévuliformes, ce qui
complique encore plus l'interprétation sérologique mais qui permet aussi la possibilité
d’une interprétation différentielle des résultats.
Les modifications au niveau des concentrations des anticorps peuvent être détectables
avec l'ELISA mais pas avec le test d'hémagglutination, ce qui rend l'association des deux
techniques très avantageuse, par ex., dans le cas d'une diminution de l'activité des
anticorps IgM et d'une augmentation, simultanée, de l'activité des anticorps IgG.
Actuellement, il n'existe pas de technique qui procure, à elle seule, un diagnostic
sérologique complet de Candida. Le suivi des patients à risque et la thérapie de contrôle
exigent l’utilisation d’une diversité de méthodes comme la sérologie et la détection de
l’antigène. Le test SERION ELISA antigen Candida nous aide particulièrement dans ces
situations en détectant l'antigène spécifique au Candida dans les échantillons de sérums.
Pos:
/Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
ELISA
antigen @für
8\mod_1265792007310_23.doc
@
286407 @
1
3 SERION ELISA antigen - PRINCIPE DU TEST
L'ELISA (test utilisant un immunosorbant lié à une enzyme) est un test
immunoenzymatique, qui convient particulièrement à la détermination d'anticorps et des
antigènes dans le domaine de la sérologie infectieuse. La réaction est basée sur
l'interaction spécifique des anticorps avec leurs antigènes correspondants. Les barrettes
de test de la microplaque de dosage du SERION ELISA antigen sont recouvertes
d'anticorps spécifiques du pathogène d'intérêt. Si les antigènes présents dans l'échantillon
de sérum du patient sont présents, ils se lient à l'anticorps fixé. Un anticorps secondaire,
qui a été conjugué avec l'enzyme peroxydase, détecte le complexe immunologique et s'y
lie. La peroxyde d'hydrogène (H2O2), substrat incolore, et le chromatogène tetraméthylbenzidine (TMB) sont transformés en un produit de couleur bleue. L'ajout de la
solution d'arrêt change la couleur au jaune. L'intensité du signal de ce produit de réaction
est proportionnelle à la concentration de l'antigène dans l'échantillon et elle est mesurée
par une méthode photométrique.
français
4
4
COMPOSANTS DE LA TROUSSE
Pièces /
Volume
Séparez chaque barrette de test de microtitraion, chacun à huit puits uniques 12 pièces
recouverts d'anticorps,
(au total 96) MTP ,
1 cadre.
Sérum standard STD ,
Candida albicans antigen dans le sérum humain supplémenté avec du sérum de veau
fœtal (SVF) ;
négatif pour l'Ac anti-VIH, HBs-Ag (antigène de surface du virus de l'hépatite B) et l'Ac
anti-VHC;
agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium.
3 x 3 ml
Sérum de contrôle négatif NEG ,
Sérum humain supplémenté avec du sérum de veau fœtal (SVF) ;
négatif pour l'Ac anti-VIH, HBs-Ag (antigène de surface du virus de l'hépatite B) et l'Ac
anti-VHC;
agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium.
2 x 3 ml
Conjugué anti-Candida albicans (prêt-à-l’emploi) PODCR ,
Anticorps anti-Candida albicans conjugué à la peroxydase de raifort ;
stabilisé avec une solution de stabilisation de protéine contenant un détergent ;
agent de conservation : 0,1 % ProClin® 300.
Concentré de solution de lavage (en quantité suffisante pour 1 500 ml) WASH ,
Solution de sel tamponné avec du TRIS avec Tween 20 ; 30 fois concentrée ;
agent de conservation : < 0.1 % ProClin® 300.
13 ml
2 x 25 ml
15 ml
Tampon de dilution SAMB ,
Solution acide sans agent de conservation.
Solution d'arrêt STOP ,
Acide sulfurique à 0,5 N.
13 ml
Solution de substrat (prêt à l'emploi) TMB ,
Solution de substrat de peroxyde d’hydrogène TMB ;
agent de conservation : < 0.01 % Kathon CG.
13 ml
Certificat de contrôle de la qualité avec courbe d'étalonnage et tableau
d'évaluation INFO ,
(quantification des antigènes en U/ml).
ELISA
antigen/Gültig
für benötigte
antigen/Zusätzlich
benötigte
Materialien @
8\mod_1265796058727_23.doc
@ 29304
@1
français
5
2 pièces
FR
Composants pour l'essai
5
-
PRODUITS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS
équipement général de laboratoire
photomètre pour plaques de microtitration avec filtre, longueur d'onde 450 nm,
longueur d'onde de référence recommandée 620 nm à 690 nm (par ex. 650 nm)
incubateur à 37 °C
bloc de chauffage à 100 °C
chambre humide
eau distillée
Agrafes (no de commande VT120)
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Lagerung
@
11\mod_1346935956390_23.doc
@ 52261
@ 1 und Haltbarkeit
français
6
STOCKAGE ET STABILITÉ
Réactif
Stockage
Stabilité
Barrettes de
microtitration
(recouvertes
d'anticorps)
cachetées
voir la date
d'expiration;
Sérum de contrôle /
Sérum standard
après ouverture entre 2 et 8 °C
après ouverture, entre 2 et 8 °C dans sachet en durée minimale de
stockage :
aluminium fermé avec déshydratant
4 semaines
Les barrettes non utilisées doivent être stockés à sec
dans des sachets en aluminium fermés à l’abri de durée de stockage en
cas d'utilisation selon
l’air.
les consignes et
stockage : jusqu'à la
date d'expiration
voir la date
d'expiration;
24 mois à partir de la
date de fabrication
Conjugué
Tampon de dilution
solution prête à l'emploi entre 2 et 8 °C
voir la date
d'expiration;
Évitez les contaminations, par ex., en utilisant des
barrettes stériles.
date de fabrication
cachetées
voir la date
d'expiration;
date de fabrication
Solution de lavage
après ouverture entre 2 et 8 °C
Jetez les solutions troubles.
Concentrez après ouverture entre 2 et 8 °C
6 mois
voir la date
d'expiration;
date de fabrication
dilution de travail à 2 – 8 °C
dilution de travail à température ambiante
2 semaines
1 semaine
Les bouteilles utilisées pour effectuer la dilution
d'utilisation doivent être régulièrement nettoyées.
Jetez les solutions troubles.
Substrat TMB
solution prête à l'emploi entre 2 et 8 °C,
stockez à l'abri de la lumière
voir la date
d'expiration;
Évitez les contaminations, par ex., en utilisant des 24 mois à partir de la
barrettes stériles.
date de fabrication
Jetez la solution si elle devient bleue (extinction à 650
nm contre vis à vis de l'eau distillée > 0,2 DO).
Solution d'arrêt
Après ouverture à température ambiante
français
7
voir la date d'expiration
FR
6
7
PRINCIPLE DU TEST SERION ELISA antigen
7.1
Remarques générales
Seuls les réactifs SERION ELISA antigen doivent être utilisés avec les immunoessais
SERION ELISA antigen. Les composants ne doivent pas être échangés avec des réactifs
provenant d'autres fabricants. Le sérum standard et contrôle aussi bien que le conjugué
des immunoessais SERION ELISA antigen sont définis exclusivement pour la trousse
d'analyse devant être utilisée et ne doit pas être utilisé avec d'autres lots. Le tampon de
dilution, la solution de lavage, le substrat et la solution d'arrêt peuvent être utilisés pour
tous les immunoessais SERION ELISA antigen indépendamment du lot ou l'analyse.
S'ils sont toujours cachetés et stockés selon les consignes, tous les composants du test
SERION ELISA antigen peuvent être utilisés jusqu'à la date d'expiration indiquée sur les
étiquettes. Les réactifs ne doivent pas être utilisés après la date d'expiration.
La dilution et la modification des réactifs peuvent entraîner une perte de sensibilité.
Évitez d'exposer les réactifs à une lumière trop forte lors du stockage et l'incubation. Les
réactifs doivent être bien fermés après utilisation pour éviter l'évaporation et la
contamination.
Pour ouvrir le sachet en aluminium de la plaque de microtitration, veuillez découper le haut
du sachet à l'endroit indiqué, pour que vous puissiez fermer le sachet correctement après
utilisation. Il ne faut pas utiliser les barrettes si le sachet en aluminium est endommagé ou
si le sachet, contenant le reste des barrettes et le déshydratant, n'a pas été correctement
refermé.
Utilisez de techniques aseptiques pour le prélèvement des aliquotes dans les tubes de
réactif afin d'éviter la contamination. Afin d'éviter les faux positifs, il faut s'assurer de ne
pas toucher les parois supérieures des puits ou de les éclabousser lors du pipetage du
conjugué. Il faut faire attention de ne pas mélanger les bouchons des bouteilles et/ou des
flacons.
En particulier, la solution de substrat TMB est sensible aux substances oxydantes et les
ions des métaux lourds. Elle doit être conservée à l’abri de la lumière en tout temps et
ouverte seulement dans des conditions de faible luminosité, juste avant l’utilisation. Cette
solution a une couleur bleu-vert pâle.
Le contact du substrat avec la peau et la solution d’arrêt doit être évité.
Pour assurer la reproductibilité des résultats des tests, il faut bien mélanger les réactifs.
Agitez les flacons contenant les sérums de control avant de les utiliser, mais également
tous les échantillons après dilution (par ex., à l'aide d'un mélangeur vortex).
Assurez-vous de pipeter soigneusement et respectez les durées et températures
d'incubation. S'il existe une différence de temps importante entre le pipetage du premier et
du dernier puits de la plaque de microtitration, lors de la distribution des échantillons et
des sérums de contrôle, du conjugué ou du substrat, on peut avoir des durées de pré
incubation différentes qui influenceront la précision et la reproductibilité des résultats.
français
8
Des résultats optimaux ne seront obtenus que si les consignes sont scrupuleusement
respectées.
Un nombre suffisant de lavage permet d'éviter les tests non spécifiques. Il est donc
recommandé de soigneusement effectuer la procédure de lavage. Tous les puits à fond
plat doivent être remplis avec un volume égal de tampon de lavage. À la fin de la
procédure, assurez-vous que les puits ne contiennent plus de tampon de lavage afin
d'éviter les effets de dilutions incontrôlées. Évitez de faire des bulles!
Prenez soin de ne pas endommager l'inscription (pathogène/AG) figurant sur la plaque de
microtitration au cours des étapes de lavage et d'aspiration afin d'éviter les confusions.
7.2
Préparation et stockage de l'échantillon
Les échantillons lipémique, hémolytique ou ictérique (sérum ou plasma) doivent être
analysés avec réserve seulement. Les échantillons qui sont à l'évidence contaminés ne
doivent pas être analysés. Le sérum ou le plasma (EDTA, citrate, héparine) recueillis
selon les procédés standard de laboratoire sont des échantillons convenables.
7.2.1 Préparation des échantillons
Avant d'effectuer le test, les échantillons (échantillon patients, standard et contrôle négatif)
(V1) doivent être dilués dans le tampon de dilution (V2) comme suit :
V1 + V2 = 3+1
ajouter
chacun à
300 µl échantillon de (V1)
100 µl de tampon de dilution (V2)
Après dilution et avant le pipetage dans la plaque de microtitration, les échantillons doivent
être bien mélangés pour obtenir une solution homogène.
Finalement les échantillons doivent être chauffés à 110 °C (+/- 5 °C) pendant 10 minutes.
Il est essentiel de respecter l'heure et la température indiquées! Les récipients du réactif
standard ne sont pas adaptés à l'étape de thermolyse et nous recommandons l'utilisation
d'un récipient de réaction safe-lock ou semblable avec une fermeture vissée.
L'utilisation d'un bloc chauffant muni d'un thermostat exige le contrôle de la température
avec un thermomètre étalonné. Il faut prendre en compte la période de préchauffage
spécifique à l’appareil du bloc de chauffage. Si nécessaire, le bloc de chauffage doit être
ajusté à la température requise. Au cours de la thermolyse, un précipité nuageux blanc se
formera et doit être éliminé par centrifugation dans un centrifuge de paillasse pré-refroidi
(4 °C) à 10,000 × g pendant 10 minutes. Le surnageant clair peut ensuite être utilisé dans
le test.
français
9
FR
L'immunoessai SERION ELISA antigen n'est valable que si les critères de validation,
spécifiques au lot en question, et figurant sur le certificat de contrôle de la qualité sont
respectés.
7.2.2 Stockage de l'échantillon
Les échantillons patients traités ne doivent pas être stockés pendant plus de 24 heures à
2 – 8 °C. Les échantillons non traités ne doivent pas être stockés à 2-8°C pendant plus de
7 jours. Un stockage prolongé est possible à ≤ -20 °C. Évitez les cycles de congélation et
décongélation des échantillons.
7.3
Préparation des réactifs de la trousse
Tous les réactifs doivent être à température ambiante avant leur utilisation.
7.3.1 Barrettes de test pour la microtitration
Les barrettes de test pour la microtitration sont emballées dans un sachet en
aluminium avec un produit déshydratant. Enlevez seulement les puits dont vous
avez besoin de la plaque et replacez le reste dans le sachet en aluminium.
Refermez soigneusement le sachet pour qu'il soit étanche à l'air.
7.3.2 Sérum de contrôle / Sérum standard
Les sérums contrôle et standard doivent être dilués avec le tampon d’échantillon et
ultérieurement dénaturé. Pour chaque cycle de test, indépendamment du nombre
de barrettes de test de microtitration devant être utilisé, les sérums de contrôle et
standard doivent être mis dans la plaque. Le sérum standard doit être mis en
double.
7.3.3 Conjugué (prêt à l'emploi)
Il fait éviter de contaminer le conjugué prêt à l'emploi, par ex., en utilisant des
embouts stériles.
7.3.4 Solution de lavage
Diluez le concentré de tampon de lavage (V1) 1:30 avec de l'eau distillée jusqu'à un
volume final de V2.
Exemple :
Concentré de tampon (V1)
Volume final (V2)
25 ml
750 ml
1 ml
30 ml
7.3.5 Substrat TMB (prêt à l'emploi)
Il fait éviter de contaminer le substrat prêt à l'emploi, par ex., en utilisant des
embouts stériles.
Le substrat TMB a une couleur bleu-vert pâle et toute solution qui démontre une
coloration forte (densité optique à 650 nm par rapport à l’eau distillée >0,2 DO) doit
être jetée.
7.3.6 Solution d'arrêt (prêt à l'emploi)
antigen/Gültig
für
Testablauf
@
8\mod_1265793631810_23.doc
@ 28924
@2
français
10
7.4
Aperçu général - Procédure de test
quantitatif
Dilution de l’échantillon
(Échantillons patient, contrôle et sérum standard)
300 µl d’échantillon + 100 µl tampon de dilution
CENTRIFUGATION 10 min. / 10,000 × g / 4 °C
Gardez le surnageant, jetez le culot
Ajoutez le surnageant à partir des échantillons (100 µl)
chambre humide
LAVAGE (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipetez la solution conjuguée PODCR (100 µl)
chambre humide
LAVAGE (5 x 300 µl DIL WASH )
Pipetez la solution de substrat TMB (100 µl)
chambre humide
Pipetez la solution d'arrêt STOP (100 µl)
LISEZ LA DENSITÉ OPTIQUE à 450 nm (réf. 650 nm)
français
11
FR
Préparation des échantillons, contrôle et sérum standard
7.5
Procédure de test manuel
1. Le prétraitement des échantillons (échantillons patient, standard, sérum de contrôles)
tel que décrit.
2. Placez le nombre de puits dont vous avez besoin dans le cadre et préparez une
feuille de protocole.
3. Ajoutez chaque 100 µl de surnageant provenant des standards de sérum (en
double), le contrôle négatif et les échantillons patients dans les puits appropriés
des bandelettes de microtitration. Laissez un puits pour le blanc du substrat, par ex.,
Candida antigen quantitatif
puits A1
Blanc du substrat
puits B1
Contrôle négatif
puits C1
Sérum standard
puits D1
Sérum standard
puits E1
Échantillon patient 1...
4. Incubation de l'échantillon pendant 60 minutes (+/- 3 min) à 37 °C (+/- 1 ℃) dans
une chambre humide.
5. Après incubation lavez tous les puits avec une solution de lavage (avec un laveur
automatisé ou manuellement) :
- aspirez ou agitez la solution d'incubation
- remplissez chaque puits avec 300 µl de solution de lavage
- aspirez ou agitez le tampon de lavage
- refaites le lavage 4 fois (en tout 5 fois!)
- séchez la plaque de microtitration en la tapant sur un mouchoir en papier
6. Ajout du conjugué
Ajoutez 100 µl de conjugué prêt à l'emploi aux puits appropriés (sauf le blanc du
substrat)
7. Incubation du conjugué pendant 60 minutes (+/- 3 min) à 37 °C (+/- 1 ℃) dans une
chambre humide.
8. Après incubation, lavez tous les puits avec la solution de lavage (voir plus haut)
9. Ajout de substrat
Ajoutez 100 µl de solution de substrat TMB prête à l'emploi à chaque puits (y
compris le puits pour le blanc de substrat!)
10. Incubation du substrat pendant 30 minutes (+/- 1 min) à 37 °C (+/- 1 °C) à l’abri de la
lumière dans une chambre humide.
11. Arrêt de la réaction
Ajoutez 100 µl de solution d'arrêt à chaque puits. Agitez doucement la plaque de
microtitration pour mélanger
12. Lecture de la densité optique
Lisez la densité optique (DO) dans les 60 minutes à 450 nm par rapport à un blanc de
substrat, longueur de référence entre 620 nm et 690 nm (ex. 650 nm).
français
12
7.6
Procédure de test automatisée
SERION ELISA est compatible avec un traitement sur automate et a été évalué quant à
son utilisation avec ImmunomatTM et Gemini. Le traitement automatique est effectué de
façon analogue à l'utilisation manuelle. Veuillez noter que dans des conditions de
manipulation particulières, il peut s'avérer nécessaire d'adapter les temps d'incubation
selon le laboratoire.
7.7
Contrôle positif / Contrôle de la précision
Pour la vérification périodique du procédé de test, pour satisfaire aux exigences des
systèmes de gestion de la qualité internes des laboratoires, nous recommandons
l'utilisation des SERION ELISA controls afin de déterminer la précision et la précision des
cycles de test du SERION ELISA antigen. L'utilisation des SERION ELISA controls est
décrite dans les modes d'emploi spécifiques.
français
13
FR
8
ÉVALUATION DU TEST
8.1
Quantification en un point selon la méthode 4PL
La transformation optimisée des signaux d'extinction en valeurs quantitatives est assurée
par les fonctions non linéaires, qui permettent d'ajuster une courbe sigmoïde sans autres
transformations des valeurs de DO. La détermination des concentrations d'antigènes avec
le SERION ELISA antigen est effectuée par le modèle logistique logarithmique à 4
paramètres (4 PL) qui est idéal pour l'ajustement de courbe. Il est basé sur la formule :
D-A
DO = A +
Les paramètres A, B, C et D sont représentatifs de la forme exacte de la courbe :
1. asymptote inférieure
2. gradient de la courbe
3. point d'inflexion
4. asymptote supérieure
paramètre A
paramètre B
paramètre C
paramètre D
Pour chaque lot, la courbe de référence est évaluée par l'Institut Virion\Serion GmbH
(Würzburg, Allemagne) dans des cycles d'analyse dans des conditions optimales. On
épargne ainsi à l'utilisateur le temps qu'il aurait consacré à tracer cette courbe ainsi que
les coûts qui y sont liées.
En ce qui concerne l'évaluation des concentrations d'antigènes, une courbe spécifique au
lot ainsi qu'un tableau d'évaluation spécifique au lot sont fournis avec la trousse de test
SERION ELISA antigen. Le logiciel d'évaluation SERION evaluate et l'outil logiciel basé
sur Microsoft® Excel SERION activity sont disponibles sur demande.
Afin de compenser les variations normales du test mais également pour le contrôle du
test, un sérum de référence est utilisé dans chaque cycle de test. Pour ce sérum de
contrôle, une valeur de référence avec une fourchette de validité est déterminée par le
contrôle de la qualité du fabricant. Dans ces limites, une bonne quantification de la
concentration d'antigènes est assurée.
français
14
Critères de validité
-
Le blanc du substrat doit avoir une DO < 0,25.
-
Le contrôle négatif doit donner un résultat de test négatif.
-
Avec l'utilisation des tests SERION ELISA antigen la valeur de DO moyenne (après
soustraction du blanc du substrat !) du sérum standard doit être dans les limites de
la fourchette de validité, qui est indiqué sur le certificat de contrôle de la qualité
spécifique au lot.
-
La variation des valeurs de DO du sérum standard ne doit pas dépasser 20 %.
En cas de non respect de ces critères, le test n'est pas valide et doit être refait.
8.3
Calcul SERION ELISA antigen Candida
8.3.1 Évaluation non-automatisée
Pour l'évaluation du test SERION ELISA antigen, un certificat de contrôle de la qualité lotspécifique avec une courbe d'étalonnage et un tableau d'évalaution sont inclus dans la
trousse de test. Le blanc du substrat doit être soustrait des valeurs de DO avant
l'évaluation.
alle
Dokumente/ELISA
Pos:
für@
Methoden
11\mod_1346849110626_23.doc
@
52244
@
Méthode 1 : Évaluation quantitative
Pour établir les fourchettes de seuil, multipliez la valeur moyenne du DO standard mesuré
avec les données numériques du certificat de contrôle de la qualité (voir les formules des
cas spéciaux), par ex. :
OD = 0,502 x PM(STD) avec limite supérieure
OD = 0,352 x PM(STD) avec limite inférieure
Si la valeur d'absorbance moyenne mesurée du sérum standard est DO 0,970, la
fourchette du seuil est de 0,341 à 0,487 DO.
français
15
FR
8.2
Méthode 2 : Détermination en continue des activités antigéniques avec l'aide de la courbe
de référence
Les variations entre les tests (déviations de jour en jour et déviations entre laboratoires)
sont compensées par multiplication de la valeur mesurée obtenue avec un échantillon de
patient avec le facteur de correction F. Ce facteur est calculé comme suit :
valeur de référence de DO (du sérum standard)
F =
valeur réelle de DO (du sérum standard)
Cette procédure est nécessaire pour ajuster le niveau réel du test de l'utilisateur avec la
courbe de référence spécifique au lot. Premièrement, les déviations journalières doivent
être corrigées en calculant le facteur de correction F.
1.
La moyenne des deux valeurs de DO du sérum standard doit être calculée et il faut
vérifier que cette valeur est dans les limites de la fourchette de validité.
2.
Calcul du facteur F : la valeur de référence donnée est divisée par la moyenne de
l'extinction du sérum standard :
F = valeur de référence d'extinction du sérum STD / valeur moyenne d'extinction du
sérum STD.
3.
Toutes les valeurs mesurées pour les échantillons du patient sont multipliées par F.
4.
Les activités antigéniques en UI/ml ou U/ml peuvent être déterminées à partir de la
courbe de référence, avec des valeurs corrigées.
français
16
8.3.2 Évaluation automatique du test avec le logiciel SERION evaluate
Si la densité optique du standard est hors des limites de validité, le message suivant
apparaîtra.
„Valeurs de référence hors limite pour les groupes suivants : Groupe 1-24.” ou
„Valeurs de référence diffère de plus de 20 % dans les groupes suivants : Groupe 1-24.”
Dans ces cas, le cycle de test n'est pas valide et doit être refait.
Les paramètres et la valeur de référence doivent être modifiés seulement s'il y a un
changement de lot (le tableau d'évaluation contient les paramètres et les valeurs de
référence). La saisie correcte des données spécifiques au lot peut être vérifiée la base de
l'activité du sérum standard (en UI/ml ou U/ml) attribuée au sérum standard. La valeur
moyenne calculée des unités doit correspondre à la valeur unitaire indiquée sur le
certificat spécifique au lot. Une correction automatique des valeurs mesurées est
effectuée. Dans la version standard, les affichages à la sortie de l'imprimante sont les
suivants :
Code d'échantillon
Valeur de la DO
U/ml
Évaluation
8.4
Limites de la quantification
Les limites de quantification sont mentionnées sur le certificat de contrôle de la qualité du
test SERION ELISA antigen. La linéarité de la dilution dans les limites de cette fourchette
a été démontrée lors des études d'évaluation complètes. Dans le cas où l'échantillon du
patient donne un résultat au dessus de la limite supérieure de quantification, l'échantillon
peut être testé à une dilution plus élevée. L'activité de l'antigène ainsi déterminée doit être
multipliée par un facteur de dilution additionnel.
8.5
Fourchette limite
La limite de la fourchette du test SERION ELISA antigen Candida est mentionnée sur le
certificat de contrôle de la qualité et indique la fourchette pour les résultats limites des
tests. Les valeurs obtenues, lors de l'analyse de l'échantillon du patient, qui sont en
dessous de cette fourchette indiquent un résultat de test négatif; les valeurs qui sont au
dessus sont interprétées comme des résultats positifs. Dans les cas où les résultats sont
des la fourchette limite, une interprétation définitive du résultat n'est pas possible. Dans de
tels cas, le test doit être refait en parallèle avec un échantillon de suivi prélevé une ou
deux semaines plus tard (paire de sérum).
français
17
FR
Après saisi des quatre paramètres et de la valeur de référence du sérum standard, les
activités des anticorps sont calculées enligne à partir de cycles de test de SERION ELISA
antigen, traités et mesurés, par le logiciel d'évaluation SERION evaluate.
8.6
Interprétation des résultats
Les résultats positifs des tests pour les échantillons patients indiquent une fungemie à
Candida. Les résultats ne peuvent être interprétés qu'en association avec un tableau
clinique et d'autres méthodes de détection.
Un résultat peut être considéré comme positif lorsqu'au moins 2,6 unités sont mesurées
dans le test. Un tel test indique que l’échantillon contient la quantité de mannane qui est
associée avec 2,6 ng de la protéine de Candida. Cependant, il ne fait pas la distinction
entre les organismes vivants et morts, respectivement.
Les résultats de tests négatifs n'excluent pas une infection aiguë, spécialement si des
titres d'anticorps élevés sont présents. Dans de tels cas, il se peut que l'antigène soit
complètement masqué par les anticorps et même la procédure dénaturante au cours de la
préparation de l'échantillon n'est pas suffisante pour permettre la détection de l'antigène.
En outre, le moment au cours de l'infection auquel l'échantillon est obtenu, un échantillon
non adéquat, une piètre préparation de l’échantillon ou un mauvais stockage peuvent
entraîner un résultat négatif.
8.7
Fourchette de références des personnes en bonne santé
Des tests dans des échantillons de sérum aléatoires provenant de donneurs de sang,
prélevés dans la région du sud de l'Allemagne, avec le test SERION ELISA antigen
Candida nous donne la distribution suivante. Sur les 103 sérums testés avec le test
SERION ELISA antigen Candida, 92 (89,3 %) étaient négatifs, six sérums (5,8 %) ont
donné un résultat positif et cinq échantillons (4,9 %) étaient limites.
9 CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE
Pos:
antigen/Gültig
antigen/Leistungsmerkmale/Kapitelüberschrift:
Sensitivität
und Spezifität @
8\mod_1265793737103_23.doc
@ 28989
@2
9.1 Sensibilité et Spécificité
Le test SERION ELISA antigen Candida a été validé par l’analyse de 148 échantillons de
sérums provenant de donneurs de sang et 93 échantillons provenant de patients, qui ont
démontré des signes de candidiose au cours du traitement en soins intensif, en
comparaison avec les résultats obtenus avec un test disponible dans le commerce d’un
fabricant européen important. Les sérums classés comme limites n'ont pas été inclus dans
le calcul des valeurs de la sensibilité et de la spécificité.
Caractéristiques de performance
Sensibilité
Spécificité
> 99,9 %
97,8 %
Dans une autre étude, la réactivité croisée avec les espèces Candida guillermondii,
Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis et Candida tropicalis avec le
SERION ELISA antigen Candida a été démontrée afin de garantir un diagnostic de
Candida complet.
français
18
Étant donné la similiarité de la mannanne avec l’hydroxyéthylamidon (HES), qui est utilisé
dans le remplissage du plasma pour le traitement de déficiences circulatoires
(hypovolémique, hémorrhagique et choc septique), une réactivité potentielle a été évaluée.
Cependant, aucune réactivité croisée avec HES n’était mesurable avec le test SERION
ELISA antigen Candida.
9.2
Reproductibilité
La reproductibilité entre les essais a été déterminée en analysant des sérums ayant
réactivités différentes, 20 fois dans un même test. La reproductibilité inter- essais a été
déterminée en analysant des sérums ayant réactivités différentes, lors de 10 tests
indépendants.
Écart type
Coefficient de Variation (CV %) =
x 100
Valeur moyenne
SERION ELISA antigen Candida :
Échantillon
Valeur
moyenne
(DO)
Intra-essai
(CV %)
Valeur
moyenne
(DO)
Inter-essai
(CV %)
négatif
0,223
9,6
0,225
7,3
limite
0,507
2,4
0,476
5,3
positive
1,413
2,5
1,356
2,7
positive
2,851
2,0
2,442
8,1
français
19
FR
10 MESURES DE SÉCURITÉ
10.1 Mises en garde
Le SERION ELISA antigen est conçu pour être utilisé par un personnel compétent qui est
familier avec les bonnes pratiques de laboratoire.
Tous les réactifs de la trousse et les spécimens humains doivent être manipulés avec
précaution, en usant des bonnes pratiques de laboratoire.
-
-
Cette trousse contient des composants du sang humain. Même si tous les sérums
de contrôle et de seuil sont négatifs pour l'anticorps anti-VIH, HBs-Ag (Antigène de
surface du virus de l'hépatite B) et l'anticorps anti-VHC, ils doivent être considérés
comme potentiellement infectieux.
Ne pas pipeter à la bouche.
Il ne faut pas fumer, consommer de la nourriture ou des boissons dans les endroits
où les réactifs de la trousse ou les échantillons sont manipulés.
Utilisez des gants jetables et portez un sarreau et des lunettes de protection lors de
la manipulation des réactifs de la trousse ou des échantillons. Lavez-vous bien les
mains après la manipulation.
Les échantillons de patient et autres produits potentiellement infectieux doivent être
décontaminés après le cycle de test.
Les réactifs doivent être stockés dans un endroit sûr et doivent être inaccessibles
pour les personnes non autorisées, comme des enfants.
10.2 Élimination
Veuillez respecter les dispositions légales pertinentes!
français
20
11 RÉFÉRENCES
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
[3]
[4]
Rev. 3, 32-45.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
[15]
[16]
R.
français
21
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
FR
[1]
1
CAMPO DI APPLICAZIONE
2
RILEVANZA DIAGNOSTICA
3
SERION ELISA antigen - PRINCIPIO DEL TEST
4
COMPONENTI DEL KIT
5
MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI
6
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
7
PROCEDURA PER IL TEST SERION ELISA antigen
7.1
Considerazioni generali
7.2
Preparazione e conservazione dei campioni
7.3
Preparazione dei reagenti del kit
7.4
Schema riassuntivo della procedura ra
7.5
Procedura di analisi manuale
7.6
Procedura automatica
7.7
Controllo positivo / controllo di accuratezza
8
IT
INDICE
VALUTAZIONE DEL TES
8.1
Quantificazione a singolo punto con il metodo 4PL
8.2
Criteri di validità
8.3
Calcolo SERION ELISA antigen Candida
8.4
Limiti di quantificazione
8.5
Zona grigia
8.6
Interpretazione dei risultati
8.7
Valori di riferimento negli individui sani
9
CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
9.1
Sensibilità e specificità
9.2
Riproducibilità
10
MISURE DI SICUREZZA
10.1
Avvertenze
10.2
Smaltimento
11
BIBLIOGRAFIA
versione attuale nr.: V 1.12/09-1
versione precedente: --
Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione dell’antigene Candida
per uso diagnostico in vitro
N. di ordinazione: ESR200
Pos:
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Allgemeine
Texte ELISA
8\mod_1265792390921_33.doc
@ 28665
@1
1
CAMPO DI APPLICAZIONE
SERION ELISA antigen Candida è un dosaggio immunoenzimatico quantitativo e
qualitativo per la determinazione nel siero umano o plasma dell’antigene Candida. Il
dosaggio è indicato per la diagnosi della candidosi sistemica.
Pos:
antigen/Gültig
für @
alle
antigen/Allgemeine
Texte ELISA
"Diagnostische
Bedeutung"
@ 8\mod_1265792408092_33.doc
@ 28681
1 Dokumente/ELISA
2
RILEVANZA DIAGNOSTICA
Candida albicans è un lievito ubiquitario appartenente, come tutte le specie di Candida,
alla famiglia dei miceti lievitiformi. Le varianti morfologiche dei miceti lievitiformi
comprendono i lieviti, che causano principalmente infezioni superficiali, e i cosiddetti
pseudomiceli. Gli elementi germinali e lo sviluppo di pseudomiceli si osservano soprattutto
in caso di micosi invasiva. La Candida produce e secerne diversi enzimi distruttivi che
consentono al microrganismo patogeno facoltativo di attraversare le barriere mucose e le
barriere dei vasi sanguigni.
Candida ssp. si trasmette soprattutto attraverso il contatto tra soggetto e soggetto e la
principale via di ingresso nell’organismo è la cavità orale. Le alterazioni delle proprietà
fungistatiche della pelle, che sono mediate dal pH leggermente acido e dalla flora batterica
antagonista, possono favorire una candidiasi cutanea superficiale. La micosi sistemica è
dovuta alla colonizzazione delle mucose, in particolare del tratto gastrointestinale.
Candida ssp. aderisce agli epiteli di svariate mucose grazie alle proteine di adesione e ad
altre strutture della superficie cellulare. Lo schema seguente riporta le fasi ipotetiche che
possono causare infezioni disseminate in caso di gravi patologie concomitanti. Non è
possibile una descrizione precisa delle varie fasi. (Fig. 1)
italiano
2
Colonizzazione
del tratto naso-faringeo
Ingresso nella
circolazione ematica
Passaggio nel
lume gastrico
Passaggio nel lume
intestinale
Passaggio nel
sistema linfatico
Persorpzione delle
cellule di Candida
IT
Invasione di
organi multipli
Figura 1: Progressione dell’infezione da Candida
La candidiasi può essere suddivisa in due categorie principali, le cui caratteristiche sono
riportate nella tabella seguente.
Infezioni da Candida
superficiale
micosi profonda (invasiva)
localizzazione
cute, mucosa
organi principali
immunocompetenza
dell’ospite
+
+,-/-
fattori di rischio
gravidanza
chemioterapia
diabete
immunosoppressione iatrogena
AIDS
catetere venoso centrale
disfunzione cutanea
radioterapia
scarsa igiene orale
ustioni di grado elevato
interventi chirurgici
progressione clinica
innocua nella maggior parte dei potenzialmente
fatale
casi,
maggior parte dei casi
nella
nessun pericolo di vita
terapia
terapia efficace
l’efficacia della terapia dipende
dallo stadio dell’infezione
Tabella 1: Caratteristiche dell’infezione da Candida
italiano
3
La diagnosi sierologica delle candidiasi è particolarmente difficile: da un lato, una
colonizzazione transitoria dei lieviti può indurre una risposta anticorpale, mentre dall’altro
lato una micosi sistemica da Candida in pazienti immunosoppressi può comportare solo
variazioni minime dell’attività anticorpale. Queste situazioni rendono necessaria
un’interpretazione critica dei risultati sierologici. Inoltre, non sempre le infezioni sistemiche
da Candida causano sintomi tipici.
Attualmente, i risultati di test differenti per il rilevamento degli anticorpi anti-Candida non
sono né equivalenti, né tanto meno intercambiabili. La specificità degli anticorpi rilevati
dipende in misura significativa dal tipo di test (ELISA o emoagglutinazione, HAT) o dalla
preparazione antigenica utilizzata. Con il test HAT, gli anticorpi IgM sono più facilmente
rilevabili delle IgG grazie alle maggiori proprietà agglutinanti delle molecole IgM. Con il test
HAT si rilevano soprattutto gli anticorpi diretti contro antigeni della parete cellulare dei
miceti lievitiformi; ciò complica ulteriormente l’interpretazione dei dati sierologici, ma
consente anche una differenziazione.
Le variazioni delle concentrazioni anticorpali possono essere rilevabili con il test ELISA,
ma non con HAT; è quindi opportuno combinare i due metodi, ad esempio in caso di
attività anticorpale IgM decrescente e contemporanea attività IgG crescente.
Attualmente non esiste alcun metodo singolo che consenta una diagnosi sierologica
definitiva della candidiasi. La sorveglianza dei pazienti a rischio e il controllo della terapia
richiedono l’impiego di metodi diversi, comprendenti la sierologia e la determinazione
antigenica. Il test SERION ELISA antigen Candida è particolarmente utile in questi casi,
perché consente di determinare un antigene specifico di Candida nei campioni dei
pazienti.
Pos:
7@
/Arbeitsanleitungen
ELISA
antigen/Gültig
ELISA
antigen @für
8\mod_1265792007310_33.doc
@
28642
1
3 SERION ELISA antigen - PRINCIPIO DEL TEST
Il test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) è un immunodosaggio
particolarmente indicato per la determinazione degli anticorpi nel campo della sierologia
infettiva. La reazione si basa sull’interazione specifica degli anticorpi con gli antigeni
corrispondenti. Le strisce reattive della piastra per microtitolazione del test SERION ELISA
antigen sono rivestite con anticorpi specifici diretti contro l’agente patogeno di interesse.
Se il campione del paziente contiene l’antigene, questo si lega agli anticorpi fissati sulle
strisce. Un anticorpo secondario, coniugato con l’enzima perossidasi, rileva e lega gli
immunocomplessi. Il substrato incolore perossido di idrogeno (H2O2) e il cromogeno tetrametilbenzidina (TMB) vengono convertiti in una sostanza di colore blu. L’aggiunta della
soluzione di arresto fa virare il colore verso il giallo. L’intensità di segnale del prodotto
della reazione è proporzionale alla concentrazione dell’antigene nel campione e viene
misurata con metodo fotometrico.
antigen/Gültig
für nur ein Dokument/Inhalt
und
Zusammensetzung/Candida
antigen:
Inhalt
@
11\mod_1346845806738_33.doc
@ 52093
@ 1 und Zusammensetzung
italiano
4
4
COMPONENTI DEL KIT
Pezzi /
volume
Strisce reattive per microtitolazione separabili, ciascuna con otto pozzetti 12 pezzi
singoli rivestiti da anticorpo,
(in totale 96) MTP ,
1 telaio.
3 x 3 ml
Siero standard STD ,
antigene Candida albicans in siero umano supplementato con siero fetale bovino
(FCS);
negativo per anti-HIV Ab, HBs-Ag (antigene di superficie del virus dell’epatite B) e
anti-HCV Ab;
conservante: sodio azide < 0,1%.
2 x 3 ml
Siero di controllo negativo NEG ,
siero umano supplementato con siero fetale bovino (FCS);
negativo per anti-HIV Ab, HBs-Ag (antigene di superficie del virus dell’epatite B) e
anti-HCV Ab;
conservante: sodio azide < 0,1%.
Coniugato anti-Candida albicans (pronto per l’uso) PODCR ,
anticorpi anti-Candida albicans coniugati con perossidasi di rafano,
stabilizzati con soluzione stabilizzante per proteine contenente un detergente;
conservanti: ProClin® 300 0.1 %.
13 ml
Soluzione di lavaggio concentrata (sufficiente per 1500 ml) WASH ,
soluzione salina in tampone TRIS con Tween 20; concentrato 30x;
conservante: ProClin® 300 < 0,1 %.
2 x 25 ml
Tampone di diluizione SAMB ,
soluzione acida senza conservanti.
15 ml
Soluzione di arresto STOP ,
0,5 N acido solforico.
13 ml
Soluzione substrato TMB (pronta per l’uso) TMB ,
soluzione substrato TMB-perossido di idrogeno,
conservante: Kathon CG < 0,01%.
13 ml
Certificato di controllo qualità con curva standard e tabella interpretativa INFO , 2 pezzi
(quantificazione dell’antigene in U/ml).
ELISA
antigen/Gültig
für benötigte
antigen/Zusätzlich
benötigte
Materialien @
8\mod_1265796058727_33.doc
@ 29306
@1
italiano
5
IT
Componenti del test
5
-
MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI
normale equipaggiamento di laboratorio
fotometro per piastre da microtitolazione con filtro, lunghezza d’onda 450 nm,
lunghezza d’onda di riferimento consigliata 620 nm - 690 nm (ad es. 650 nm)
incubatore a 37 °C
blocco termico 110 °C
camera umida
acqua distillata
Click-Clips (n. di ordinazione VT120)
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Lagerung
@
11\mod_1346935956390_33.doc
@ 52263
@ 1 und Haltbarkeit
italiano
6
6
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Reagente
Conservazione
Stabilità
Strisce per
microtitolazione
(rivestite con
anticorpi)
non aperto
vedere data di scadenza;
dopo l’apertura a 2 – 8 °C nella busta di alluminio validità minima:
chiusa, con essiccante
4 settimane;
Sieri di controllo /
sieri standard
dopo l’apertura, a 2 – 8 °C
Coniugato
soluzione pronta per l’uso a 2 - 8 °C
24 mesi dalla data di
produzione
Evitare le contaminazioni, ad es. utilizzando puntali
sterili.
Tampone di diluizione non aperto
dopo l’apertura, a 2 – 8 °C
Eliminare le soluzioni torbide
Soluzione di lavaggio
Concentrata dopo l’apertura a 2 – 8 °C
produzione
produzione
6 mesi
produzione
alla diluizione di lavoro a 2 – 8 °C
2 settimane;
alla diluizione di lavoro a temperatura ambiente
1 settimana
I flaconi usati per le diluizioni di lavoro devono essere
lavati regolarmente. Eliminare le soluzioni torbide
Substrato TMB
soluzione pronta per l’uso a 2 - 8 °C,
al riparo dalla luce
Evitare le contaminazioni, ad es. utilizzando puntali produzione
sterili.
Eliminare la soluzione se vira verso il blu (estinzione
a 650 nm contro acqua distillata > 0,2 OD).
Soluzione di arresto
Dopo l’apertura, a temperatura ambiente
italiano
7
vedere data di scadenza
IT
Le strisce non utilizzate devono essere conservate validità in caso di uso e
all’asciutto e a tenuta d’aria nella sacca di alluminio conservazione corretti
chiusa.
fino alla data di scadenza
7
PROCEDURA PER IL TEST SERION ELISA antigen
7.1
Considerazioni generali
Utilizzare esclusivamente i reagenti SERION ELISA antigen con gli immunodosaggi
SERION ELISA antigen. I componenti non devono essere sostituiti con reagenti di altri
produttori. I sieri standard, i sieri di controllo e il coniugato degli immunodosaggi SERION
ELISA antigen sono destinati esclusivamente all’uso con il kit corrispondente e non
devono essere utilizzati con altri lotti.
Il tampone di diluizione, la soluzione di lavaggio, il substrato e la soluzione di arresto
possono essere utilizzati con tutti gli immunodosaggi SERION ELISA antigen,
indipendentemente dal numero di lotto e dal test.
Finché sono chiusi e conservati correttamente, tutti i componenti dei test SERION ELISA
antigen possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sulle etichette. I
reagenti non devono essere utilizzati dopo la data di scadenza.
La diluizione o qualsiasi modifica apportata ai reagenti può comportare una perdita di
sensibilità.
Non esporre i reagenti alla luce intensa durante la conservazione e l’incubazione. Dopo
l’uso, i reagenti devono essere chiusi saldamente per evitare l’evaporazione e la
contaminazione.
Per aprire la busta di alluminio della piastra per microtitolazione, tagliare solo l’estremità
del lato appositamente contrassegnato, per poter richiudere correttamente la busta. Non
utilizzare le strisce se la busta di alluminio risulta danneggiata o se la busta contenente le
strisce rimanenti e l’agente essiccante non è stata richiusa correttamente.
Per evitare contaminazioni, utilizzare tecniche asettiche per prelevare aliquote dalle
provette dei reagenti. Per evitare risultati falsamente positivi, prestare attenzione a non
toccare o bagnare con la pipetta la parte superiore delle pareti dei pozzetti quando si
dispensa il coniugato. Prestare attenzione a non scambiare i tappi dei flaconi e/o dei
flaconcini.
In particolare, la soluzione substrato TMB è sensibile alle sostanze ossidanti e agli ioni dei
metalli pesanti. Deve sempre essere conservata al riparo dalla luce e aperta solo in un
ambiente poco illuminato immediatamente prima dell’uso. La soluzione ha un colore bluverde chiaro.
Evitare il contatto cutaneo con il substrato e la soluzione di arresto.
Per ottenere risultati riproducibili, mescolare con cura i reagenti. Prima dell’uso, agitare i
contenitori dei sieri di controllo e tutti i campioni dopo la diluizione (ad es. utilizzando un
vortex).
Pipettare con attenzione e attenersi ai tempi e alle temperature di incubazione indicati. Se,
quando si dispensano i campioni e i sieri di controllo, il coniugato o il substrato, trascorre
un arco di tempo significativo tra la pipettata nel primo pozzetto e la pipettata nell'ultimo
italiano
8
pozzetto della piastra da microtitolazione, possono derivarne tempi di pre-incubazione
differenti, con conseguenti effetti sulla precisione e sulla riproducibilità dei risultati.
Solo attenendosi scrupolosamente alle istruzioni è possibile ottenere risultati ottimali.
L’immunodosaggio SERION ELISA antigen è valido solo se vengono rispettati i criteri di
validazione specifici per ogni lotto, riportati nel certificato di controllo qualità.
Per evitare confusioni, prestare attenzione a non danneggiare la scritta (agente patogeno /
AG) sulle strisce reattive per microtitolazione durante le procedure di lavaggio e
aspirazione.
7.2 Preparazione e conservazione dei campioni
I campioni lipemici, emolitici o itterici (siero o plasma) devono sempre essere analizzati
con cautela. Campioni contaminati non devono essere analizzati. Sono campioni idonei i
campioni di siero o plasma (EDTA, citrato, eparina) prelevati secondo le metodiche
standard di laboratorio.
7.2.1 Preparazione dei campioni
Prima dell’analisi, i campioni (campioni dei pazienti, standard e controlli negativi) (V1)
devono essere diluiti nel tampone di diluizione (V2) nel modo seguente:
V1 + V2 = 3+1
aggiungere
300 µl
di campione (V1)
a ogni
100 µl
di tampone di diluizione (V2)
Dopo la diluizione e prima di dispensare i campioni nella piastra per microtitolazione, i
campioni devono essere miscelati con cura per ottenere una soluzione omogenea.
Infine, i campioni devono essere riscaldati a 110°C (+/- 5 °C) per 10 minuti. È essenziale
attenersi alle temperature e ai tempi indicati! I contenitori standard per reagenti non sono
indicati per la termolisi; si consiglia l’uso di contenitori safe-lock o di contenitori simili con
tappo a vite.
Se si utilizza un blocco termico, la temperatura deve essere controllata con un termometro
calibrato. Tenere in considerazione la fase di preriscaldamento specifica del blocco
termico utilizzato. Se necessario, il blocco termico deve essere regolato sulla temperatura
richiesta. Durante la termolisi si formerà un precipitato bianco torbido, che deve essere
rimosso tramite centrifugazione a 10.000 g per 10 minuti in una centrifuga da banco
refrigerata (4 °C). Il sovranatante limpid può quindi essere utilizzato nel test.
italiano
9
IT
Un lavaggio corretto consente di evitare risultati non specifici. Pertanto, la procedura di
lavaggio deve essere effettuata con cura. Riempire tutti i pozzetti a fondo piatto con volumi
uguali di tampone di lavaggio. Al termine di questa procedura, assicurarsi che non
rimangano residui del tampone di lavaggio nei pozzetti, per evitare effetti di diluizione
incontrollabili. Evitare la formazione di schiuma!
7.2.2 Conservazione dei campioni
I campioni trattati non devono essere conservati per più di 24 ore a 2 – 8 °C. I campioni
non trattati non devono essere conservati per più di 7 giorni a 2-8°C . Per una
conservazione più lunga, congelare i campioni a ≤ 20 °C. Evitare di congelare e
scongelare ripetutamente i campioni.
7.3
Preparazione dei reagenti del kit
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell’uso.
7.3.1 Strisce reattive per microtitolazione
Le strisce reattive per microtitolazione inserite in un telaio sono confezionate in una
sacca di alluminio con un agente essiccante. Prelevare dal telaio i pozzetti non
necessari e riporli nella sacca di alluminio. Chiudere la sacca con cura per garantire
la chiusura ermetica.
7.3.2 Sieri di controllo / sieri standard
I sieri di controllo e i sieri standard devono essere diluiti con tampone per campioni
e quindi denaturati. I sieri di controllo e i sieri standard devono essere inclusi in ogni
analisi, indipendentemente dal numero di strisce reattive per microtitolazione
utilizzate. I sieri standard devono essere analizzati in duplicato.
7.3.3 Coniugato (pronto per l’uso)
Evitare una contaminazione del coniugato pronto per l’uso, ad es. utilizzando
puntali sterili.
7.3.4 Soluzione di lavaggio
Diluire il tampone di lavaggio concentrato (V1) 1:30 con acqua distillata, per un
volume finale V2.
Esempio:
Tampone concentrato (V1)
25 ml
1 ml
Volume finale(V2)
750 ml
30 ml
7.3.5 Substrato TMB (pronto per l’uso)
Evitare una contaminazione della soluzione substrato pronta per l’uso, ad es.
utilizzando puntali sterili.
Il substrato TMB è di colore blu-verde chiaro e le soluzioni con colorazione intensa
(estinzione a 650 nm contro acqua distillata >0,2 OD) devono essere eliminate.
7.3.6 Soluzione di arresto (pronta per l’uso)
Pos : 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testdurc hführ ung/T es tablauf/Übersc hrift T establauf @ 8\mod_1265793631810_33.doc @ 28926 @ 2
italiano
10
7.4
Schema riassuntivo della procedura ra
analisi quantitativa
Preparazione dei campioni e dei sieri di controllo e standard
INCUBARE 10 min. / 110 °C
CENTRIFUGARE 10 min. / 10.000 × g / 4 °C
Trattenere il sovranatante, eliminare il pellet
Aggiungere il sovranatante dei campioni (100 µl)
in camera umida
LAVARE (5 x 300 µl DIL WASH )
Dispensare la soluzione di coniugato PODCR (100 µl)
in camera umida
LAVARE (5 x 300 µl DIL WASH )
Dispensare la soluzione di substrato TMB (100 µl)
in camera umida
Dispensare la soluzione di arresto STOP (100 µl)
LEGGERE L’ESTINZIONE a 450 nm (rif. 650 nm)
italiano
11
IT
Diluizione del campione
(campioni dei pazienti, sieri di controllo e standard
300 µl di campione + 100 µl di tampone di diluizione
7.5
Procedura di analisi manuale
1. Pretrattamento dei campioni (campioni dei pazienti, sieri standard e di controllo) come
descritto.
2. Collocare la quantità necessaria di pozzetti nel telaio e preparare un foglio
protocollo.
3. Aggiungere 100 µl dei sovranatanti del siero standard (in duplicato), del controllo
negativo e dei campioni dei pazienti ai pozzetti corrispondenti delle strisce reattive
per microtitolazione. Lasciare un pozzetto vuoto per il bianco substrato, ad es.
Candida antigen analisi quantitativa
pozzetto A1 bianco substrato
pozzetto B1 controllo negativo
pozzetto C1 siero standard
pozzetto D1 siero standard
pozzetto E1 Campione paziente 1...
4. Incubare i campioni per 60 minuti (+/- 3 min) a 37 °C (+/- 1 °C) in camera umida.
5. Dopo l’incubazione, lavare tutti i pozzetti con la soluzione di lavaggio (con dispositivo
automatico o manualmente):
- aspirare o rimuovere per capovolgimento la soluzione di incubazione
- riempire ogni pozzetto con 300 µl di soluzione di lavaggio
- aspirare o rimuovere per capovolgimento la soluzione di lavaggio
- ripetere il lavaggio 4 volte (per un totale di 5 volte!)
-asciugare battendo leggermente la piastra da microtitolazione su un foglio assorbente
6. Aggiunta del coniugato
Aggiungere 100 µl di coniugato pronto per l’uso nei pozzetti corrispondenti (escluso
il bianco substrato).
7. Incubare il coniugato per 60 minuti (+/- 3 min.) a 37 °C (+/- 1 °C) in camera umida.
8. Dopo l’incubazione, lavare tutti i pozzetti con la soluzione di lavaggio (vedere sopra).
9. Aggiunta del substrato
Aggiungere 100 µl di soluzione substrato TMB pronta per l’uso a ogni pozzetto
(compreso il pozzetto del bianco substrato!)
10. Incubare il substrato per 30 minuti (+/- 1 min.) a 37°C (+/- 1°C) in camera umida.
Tenere al riparo dalla luce!
11. Arresto della reazione
Aggiungere 100 µl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto e agitare dolcemente la
piastra per microtitolazione per mescolare.
12. Leggere l’estinzione
Leggere la densità ottica (OD) entro 60 minuti a 450 nm contro il bianco substrato;
lunghezza d’onda di riferimento tra 620 nm e 690 nm (ad es. 650 nm).
italiano
12
7.6
Procedura automatica
I test SERION ELISA possono essere analizzati con apparecchi automatici e validati sia
con ImmunomatTM e Gemini. L’analisi automatica viene effettuata analogamente alla
procedura manuale. Si prega di notare che, in particolari condizioni di lavoro, possono
essere necessarie modifiche interne di laboratorio ai tempi di incubazione.
Controllo positivo / controllo di accuratezza
Per la verifica periodica del metodo di analisi, in conformità ai requisiti dei sistemi di
gestione qualità interni al laboratorio, raccomandiamo l’uso dei controlli SERION ELISA
controls per determinare la precisione e l’affidabilità delle analisi effettuate con SERION
ELISA antigen. L’uso dei SERION ELISA controls è descritto nei manuali di istruzioni
specifici.
italiano
13
IT
7.7
8
VALUTAZIONE DEL TES
8.1
Quantificazione a singolo punto con il metodo 4PL
Una corrispondenza ottimale dei segnali di estinzione con i valori quantitativi è data dalle
funzioni non lineari, che consentono di correlare le curve sigmoidali direttamente, senza
ulteriore trasformazione, ai valori OD. La determinazione della concentrazione antigeni
con il SERION ELISA antigen viene effettuata con il modello logistic-log a 4 parametri (4
PL), ideale per una corrispondenza esatta della curva. Il modello si basa sulla formula
seguente:
D-A
OD = A +
I parametri A, B, C e D rappresentano l'andamento esatto della curva:
1. asintoto inferiore
2. pendenza della curva
3. punto di flesso
4. asintoto superiore
parametro A
parametro B
parametro C
parametro D
L’Istituto Virion\Serion GmbH (Würzburg, Germania) determina le curve standard per
ciascun lotto in test ripetuti e in condizioni ottimali. Non è quindi necessaria una lunga e
dispendiosa costruzione della curva standard da parte dell’utilizzatore.
Per la determinazione delle concentrazioni antigeni, una curva standard e una tabella di
valutazione specifiche per il lotto sono allegate a ogni kit SERION ELISA antigen. Il
software di valutazione SERION evaluate e il software basato su Microsoft® Excel
SERION activity sono disponibili su richiesta.
Per compensare le normali oscillazioni e per valutare il test di controllo, in ogni test viene
utilizzato un siero standard. Il controllo qualità del produttore determina il valore di
riferimento e l’ambito di validità del siero di controllo. All’interno di tale ambito si garantisce
la quantificazione corretta della concentrazione antigeni.
italiano
14
8.2
Criteri di validità
-
Il bianco substrato deve essere < 0,25 OD.
-
Il controllo negativo deve fornire un risultato negativo.
-
Con i test quantitativi SERION ELISA antigen, il valore OD medio (dopo sottrazione
del bianco substrato!) del siero standard deve essere compreso nel range di
validità, riportato nel certificato di controllo qualità specifico per ogni lotto.
-
Le oscillazioni dei valori OD del siero standard non devono superare il 20%.
IT
Se questi criteri non sono soddisfatti, il test non è valido e deve essere ripetuto.
8.3
Calcolo SERION ELISA antigen Candida
8.3.1 Valutazione non automatica
Per la valutazione del test SERION ELISA antigen, il kit contiene un certificato di controllo
qualità specifico per ogni lotto, comprendente una curva standard e una tabella di
valutazione. Il bianco substrato deve essere sottratto da tutti i valori OD prima della
valutazione.
Pos:
antigen/Gültig
für@alle Dokumente/ELISA
Methoden
11\mod_1346849110626_33.doc
@ 52246
@
Metodo 1: determinazione qualitativa
Per fissare gli ambiti di cut-off, moltiplicare il valore medio di OD dello standard con i
numeri riportati nel certificato di controllo qualità (vedere le formule per determinazioni
particolari), ad es.:
OD = 0,502 x MW(STD) con cut-off superiore
OD = 0,352 x MW(STD) con cut-off inferiore
Se il valore di assorbanza medio del siero standard è 0,970 OD, il range del cut-off è
compreso tra 0,341 e 0,487 OD.
italiano
15
Metodo 2:
determinazione continua dell’attività antigenica tramite la curva standard
Le cosiddette variazioni intersaggio (oscillazioni che possono verificarsi di giorno in giorno
e di laboratorio in laboratorio) vengono compensate moltiplicando il valore misurato nel
campione del paziente con il fattore di correzione F. Il fattore di correzione è calcolato nel
modo seguente:
valore OD di riferimento (del siero standard)
F =
valore OD attuale (del siero standard)
Questa procedura è necessaria per correlare il livello attuale del test effettuato
dall’utilizzatore alla curva standard specifica per il lotto. Innanzitutto, le deviazioni
giornaliere devono essere corrette con il calcolo del fattore di correzione F.
1.
Calcolare la media dei due valori OD del siero standard e verificare che rientrino nel
range di validità prestabilito.
2.
Calcolo del fattore F: il valore di riferimento viene diviso per la media di estinzione
del siero standard:
F = valore di riferimento estinzione siero STD / valore medio estinzione siero STD.
3.
Tutti i valori determinati con i campioni dei pazienti vengono moltiplicati per F.
4.
Le attività antigeniche espresse in UI/ml o U/ml possono essere determinate tramite
la curva standard con i valori corretti.
italiano
16
8.3.2 Valutazione automatica del test con il software SERION evaluate
Inserendo i quattro parametri e il valore di riferimento del siero standard, le attività
antigeniche vengono calcolate online dal software di valutazione SERION evaluate in base
alle analisi effettuate e misurate con SERION ELISA antigen.
Se la densità ottica dello standard non è compresa nel range di validità, apparirà il
seguente messaggio (in lingua inglese).
“Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24.” oppure
“Standard value differ more than 20 % in following groups: Group 1-24.”
I parametri e il valore di riferimento devono essere modificati solo in occasione del cambio
di lotto (la tabella di valutazione riporta i parametri e i valori di riferimento). L’inserimento
corretto dei dati specifici per il lotto può essere controllato in base all’attività (in UI/ml o
U/ml) assegnata al siero standard. Il valore medio calcolato in unità deve corrispondere al
valore in unità riportato nel certificato specifico del lotto. Viene effettuata una correzione
automatica dei valori misurati. Nella versione standard, la stampa riporta quanto segue:
Codice campione
Valore OD
U/ml
Valutazione
8.4
Limiti di quantificazione
I limiti di quantificazione sono specificati nel certificato di controllo qualità del test SERION
ELISA antigen. La linearità della diluizione in questo range è stata dimostrata in ampi studi
di validazione. Qualora un campione di un paziente fornisca un risultato superiore al limite
di quantificazione superiore, può essere analizzato a una diluizione maggiore. L’attività
antigenica così determinata deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione addizionale.
8.5
Zona grigia
La zona grigia del test SERION ELISA antigen Candida è specificata nel certificato di
controllo qualità e indica i valori del test della zona grigia. I valori dei campioni dei pazienti
inferiori a tale zona grigia indicano un risultato negativo, mentre i valori superiori alla zona
grigia sono considerati positivi. Se i risultati sono compresi nella zona grigia, non è
possibile un’interpretazione definitiva dei dati. In questi casi, ripetere il test in parallelo con
un nuovo campione prelevato dopo una o due settimane (coppia di sieri).
italiano
17
IT
In questi casi, l’analisi non è valida e deve essere ripetuta.
8.6
Interpretazione dei risultati
Un risultato positivo nei campioni dei pazienti è indice di fungemia da Candida.
L’interpretazione dei risultati deve sempre tenere conto del quadro clinico e dei risultati
ottenuti con altri metodi diagnostici.
Un risultato è da considerarsi positivo se sono state misurate almeno 2,6 unità. Ciò
significa che il campione contiene la quantità di mannano corrispondente a 2,6 ng di
proteina di Candida. Non è tuttavia possibile discriminare, rispettivamente, tra
microrganismi vivi o morti.
Un risultato negativo non esclude un’infezione acuta, soprattutto in presenza di titoli
anticorpali elevati. In tal caso è possibile che l’antigene sia completamente mascherato
dagli anticorpi e che neanche la fase di denaturazione compresa nella preparazione dei
campioni consenta di rilevare l’antigene. Inoltre, altri fattori come il momento del prelievo
del campione durante l’infezione, un campione non idoneo, la preparazione o
conservazione scorretta del campione possono essere responsabili di risultati negativi.
8.7
Valori di riferimento negli individui sani
L’analisi di sieri di donatori di sangue scelti a caso, provenienti dalla Germania
meridionale, con il test SERION ELISA antigen Candida ha fornito i seguenti risultati. Su
103 sieri analizzati con il test SERION ELISA antigen Candida, 92 (89,3 %) sono risultati
negativi, sei sieri (5,8 %) sono risultati positivi e cinque campioni (4,9 %) sono risultati
all’interno della zona grigia.
9
CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
9.1
Sensibilità e specificità
Il test SERION ELISA antigen Candida è stato convalidato tramite l’analisi di 148 campioni
di siero di donatori di sangue e 93 campioni di pazienti con segni di candidiasi in corso di
terapia intensiva e il successivo confronto dei risultati ottenuti con un dosaggio disponibile
in commercio di uno dei principali produttori europei. I sieri con risultati compresi nella
zona grigia non sono stati inclusi nei valori di sensibilità e specificità.
Caratteristiche di prestazione
Sensibilità
Specificità
> 99,9 %
97,8 %
In un altro studio interno è stata dimostrata la reattività crociata con le specie Candida
guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis e Candida tropicalis
nel test SERION ELISA antigen Candida, per una diagnosi di Candida completa.
italiano
18
Inoltre, è stata determinata la potenziale reattività crociata dovuta alle analogie tra
mannano e idrossietilamido (HES), utilizzato nei sostituti plasmatici per il trattamento
dell’insufficienza circolatoria (shock ipovolemico, emorragico e settico). Tuttavia, con il test
SERION ELISA antigen Candida non è stata misurata alcuna reazione crociata con HES.
9.2
Riproducibilità
IT
La riproducibilità intrasaggio è stata determinata analizzando per 20 volte in una sessione
di analisi sieri con reattività differente. La riproducibilità intersaggio è stata determinata
analizzando sieri con reattività differente in 10 sessioni di analisi indipendenti.
Deviazione standard
Coefficiente di variazione (CV %) =
x 100
Valore medio
Valore medio
Intrasaggio
Valore medio
Intersaggio
(OD)
(CV %)
(OD)
(CV %)
negativo
0,223
9,6
0,225
7,3
zona grigia
0,507
2,4
0,476
5,3
positivo
1,413
2,5
1,356
2,7
positivo
2,851
2,0
2,442
8,1
Campione
italiano
19
10 MISURE DI SICUREZZA
10.1 Avvertenze
Il SERION ELISA antigen deve essere utilizzato da personale qualificato che abbia
familiarità con la buona pratica di laboratorio.
Maneggiare con attenzione tutti i reagenti del kit e i campioni di origine umana, secondo le
regole della buona pratica di laboratorio.
-
Questo kit contiene emoderivati di origine umana. Benché tutti i sieri di controllo e
cut-off siano risultati negativi per gli anticorpi anti-HIV, per HbsAg (antigene di
superficie del virus dell’epatite B) e per gli anticorpi anti-HCV, devono essere
considerati potenzialmente infetti.
-
Non pipettare con la bocca.
-
Non fumare, mangiare o bere nelle aree dove vengono maneggiati i campioni o i
reagenti del kit.
-
Indossare guanti monouso, camici da laboratorio e occhiali di protezione quando si
lavora con i reagenti del kit o con i campioni. Al termine, lavarsi accuratamente le
mani.
-
Decontaminare i campioni dei pazienti e gli altri materiali potenzialmente infetti dopo
l’esecuzione del test.
Conservare i reagenti in luogo sicuro e inaccessibile alle persone non autorizzate,
ad es. ai bambini.
-
10.2 Smaltimento
Rispettare le disposizioni di legge vigenti!
italiano
20
11 BIBLIOGRAFIA
[1]
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
[3]
[4]
Rev. 3, 32-45.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
[15]
[16]
R.
italiano
21
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
IT
1
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
2
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
3
SERION ELISA antigen – принцип работы теста
4
СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ ТЕСТ-НАБОРА
5
ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
6
ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ
7
ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA antigen
7.1
Общие указания
7.2
Подготовка проб и хранение
7.3
Подготовка реактивов
7.4
Обзор - проведение теста
7.5
Проведение теста вручную
7.6
Автоматическое прохождение теста
7.7
Положительный контроль/контроль правильности
8
RU
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА
8.1
Количественное измерение по методу 4PL
8.2
Критерии действительности теста
8.3
Обработка данных SERION ELISA antigen Candida
8.4
Количественные пределы
8.5
Область предельных значений
8.6
Интерптетация результатов
8.7
Эталонные области здоровых пробантов
9
ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1
Чувствительность и специфичность
9.2
Точность
10
МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1
Предостережения и меры предосторожности
10.2
Утилизация
11
ЛИТЕРАТУРА
Данная версия № V: V 1.12/09-1
предыдущая версия: --
Иммуноферментный набор для определения антигена кандиды
для диагностики in vitro
№ для заказа:
ESR200
ELISA
antigen/Gültig
antigen/Allgemeine
Texte ELISA
8\mod_1265792390921_78.doc
@ 28674
@1
1
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Иммунноферментные тест-наборы SERION ELISA antigen Candida это качественные
и количественные тесты для выявления антигенов Candida в сыворотке человека
или плазма. Тест служит для помощи в учете систематических кандид.
antigen/Gültig
für @
alle
antigen/Allgemeine
Texte ELISA
"Diagnostische
Bedeutung"
@ 8\mod_1265792408092_78.doc
@ 28690
1 Dokumente/ELISA
2
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Белая кандида (Candida albicans) это встречающийся везде дрожжевой грибок,
который относится, как и все кандиды, к семейству дрожжевых грибков. Наряду с
дрожжевой формой, которая в первую очередь возникает при поверхностных
инфекциях, имеется еще т.н. псевдомицелии, морфологическая форма проявления
дрожжевых грибков. Образование спороцист, а также псевдомицелий происходит в
основном при инвазивных микозах.
Дрожжевые грибки кандида образуют и
выделяют большое количество энзим, которые дают возможность дополнительным
патогенным микроорганизмам проникать в кровяные сосуды и преодолевать
барьеры слизистых оболочек.
Чаще всего заражение кандидой происходит через контакт от человека к человеку.
Основной путь проникновения это рото-гортанная полость. При нарушениях
микостатических свойств поверхностей кожи, передающихся посредством
свободных жирных кислот, слегка кислых значений pH, и антагонистически
действующей флорой, могут возникать поверхностные кандиды. Инвазивные микозы
исходят после колонизации слизистых оболочек из области желудочно-кишечного
тракта (Рис. 1).
Колонизация ротоглоточной -полости
Пассаж желудочного
просвета
Переход в кишечный
просвет
Вхождение в
кровопоток
Переход в лимфатическую систему
Персорбция кандидных клеток
Инвазия многочисленных органов
Рисунок 1: Развитие кандидных инфекций
russian
2
Прикрепление дрожжевых грибков к эпителиям различных слизистых оболочек
происходит при помощи прикрепляющего (спаечного) протеина и других структур
внешней оболочки клетки. В таблице представлен (гипотетически) путь развития,
который в случае тяжелого основного заболевания может привести к
диссеменированной инфекции.
Точное разделение на стадии при этом едва ли возможно (рис. 1).
В общем кандиды можно разделить на две большие группы, основные признаки
которых приведены в таблице ниже.
Кандидные инфекции
Глубокий микоз (инвазивный)
Локализация
Кожа, слизистые оболочки
Главные органы
Иммунная
компетентность
+
+, -/-
Беременность
Химиотерапия
Диабет
Ятрогенная
подавленность
иммунная
Центральный
катетер
венозный
RU
поверхностные
хозяина
Факторы риска
СПИД
Нарушения свойств кожи
Недостаточная гигиена полости
Радиотерапия
рта
Ожоги высокой степени
Хирургические операции
Клиническое
развитие
обычно безвредное, нет угрозы Часто угроза жизни
жизни
Лечение
Хорошо поддается лечению
Поддается
лечению
зависимости от стадии
в
Таблица 1: Характеристика кандидных инфекций
Проводить серологическую диагностику при кандидных инфекциях сложно. С одной
стороны, временные дрожжевые колонизации могут индуцировать реакцию антител,
с другой стороны систематические кандидамикозы приводят у пациентов с иммунной
подавленностью часто лишь к незначительному движению титра. Дело осложняет и
то, что к группе пациентов с высоким риском микозы относятся иммуннологически
проблемные пациенты, и таким образом, серологические результаты требуют
особой интерпретации. Систематические кандидные инфекции не вызывают к тому
же типичной клинической картины.
russian
3
При актуальном положении в серологии кандиды нельзя исходить из того, что
результаты различных тестовых систем для определения антител можно сравнивать
или заменять. Специфичность антител, выявленных в одной пробе, зависит во
многом от тестовой системы (ELISA или HAT) и от используемого антигенного
приготовления.
При HAT антитела IgM бывают из-за их агглютативного поведения более охвачены,
чем антитела IgG. Это делает серологическую интерпретацию результатов еще
более сложной, но дает возможность дифференцированной интерпретации
результатов. Поэтому комбинирование НАТ и ELISA дает возможность даже при
стагнирующих НАТ-титрах распознать потенциальные изменения специфических
иммунноглобулиновым классам активности антител.
В настоящее время ни один из методов определения в отдельности не дает
возможности полной серологической диагностики. Для оптимального наблюдения за
пациентами группы риска и для быстрого начала лечения следует применять
методы выявления в комбинации. Выявление антигена с помощью теста SERION
ELISA antigen Candida представляет собой важное средство поддержки.
Pos : 7 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/T estprinzi p/T estprinzi p ELISA antigen @ 8\mod_1265792007310_78.doc @ 28651 @ 1
3
SERION ELISA antigen – принцип работы теста
Тест ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) это иммуннологический метод,
который особенно себя зарекомендовал в инфекционной серологии для
определения антител и антигенов. Реакция выявления в сэндвичной ELISA основана
на специфической межактивности антител и антигенов. Для этой цели микрострипы
теста SERION ELISA antigen покрыты специфическими к возбудителю антителами,
которые связываются с антигенами, находящимися в пробе пациента. Другие,
помеченные пероксидазой, вторичные антитела отыскивают образовавшиеся
иммунные комплексы. Энзим катализует реакцию, при которой бесцветный субстрат
перикись водорода и хромоген тетраметилбензидин получают голубую окраску.
После добавления стоп-реагента происходит изменение окраски на желтую.
Интенсивность окраски продукта реакции пропорциональна концентрации антигена в
пробе и измеряется фотометрическим способом.
russian
4
4
СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ ТЕСТ-НАБОРА
Шт. /
объем
Компоненты теста
Отрывные микротитровальные стрипы, каждый по 8 отдельных лунок,
покрытых специфическими возбудителю антителами (всего 96) MTP ,
12 штук
1 планшет
3 x 3 мл
Отрицательная контрольная сыворотка NEG ,
Человеческая сыворотка с добавлением сыворотки плода телёнка (FKS);;
Отрицательная на anti-HIV-Ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen)
и anti-HCV-Ak;
консервант: < 0,1 % азид натрия;
2 x 3 мл
Конъюгат к Candida albicans (готовый к использованию) PODCR ,
Антитела к Candida albicans, конъюгированные с пероксидазой хрена,
стабилизированные протеиновым стабилизирующим раствором и детергенцем
RU
Стандартная сыворотка STD ,
Candida albicans антиген в человеческой сыворотке с добавлением сыворотки
плода телёнка (FKS); отрицательная на anti-HIV-Ak, HBs-Ag (Hepatitis B-VirusSurfacеАntigen) и anti-HCV-Ak;
консервант: < 0,1 % азид натрия;
13 мл
Консервант: 0,1 % ProClin® 300.
Промывочный концентрат (достаточно для 1500 мл) WASH ,
TRIS-буферный раствор хлористого натрия с твин 20 (Tween 20); 30-кратная
концентрация
консервант: < 0,1 % ProClin® 300.
2 x 25 мл
Буфер для разведения SAMB ,
Кислый раствор без консервантов.
15 мл
Стоп-раствор STOP ,
0,5 N серная кислота.
13 мл
TMB-раствор субстрата (готовый к использованию) TMB ,
TMБ-раствор субстрата перекиси водорода;
консервант: <0,01 % катон CG.
13 ml
Сертификат контроля качества со стандартной кривой и таблицей
значений INFO ,
(определение количества антигена в Ед/мл).
2 штук
Pos : 9 /Arbeits anl eitung en ELISA antigen/Gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/Z us ätzlic h benötigte M ateriali en/Zus ätzlich benötigte M ateri alien @ 8\mod_1265796058727_78.doc @ 29315 @ 1
russian
5
5
ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
-
-
Обычное лабораторное оборудование
Спектрофотометр для микротитровальных стрипов с фильтром, длина волны
450 нм, рекомендуемая длина эталонной волны в пределах от 620 нм до 690
нм (например, 650 нм)
Термостат инкубатор 37°C
Нагреватель 110 °C
Влажная камера
Дистиллированная вода
Зажимы (№ для заказа VT120)
Pos : 10 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Lager ung und H altbarkeit/Lagerung und H altbar keit @ 11\mod_1346935956390_78.doc @ 52272 @ 1
russian
6
6
ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ
Реактивы
Хранение
Срок годности
Микротитровальные
стрипы (покрытые
антителами)
В закрытом виде
До истечения срока
действия;
После вскрытия хранить при 2 – 8 °C с
осушителем закрытыми
Минимальный срок
хранения:
Неиспользованные лунки хранить в сухом месте 4 недели
герметично закрытыми в алюминиевом пакете. Сохраняемость при
соответствующем
хранении: до
истечения срока
годности
Контрольные /
стандартные
сыворотки
После вскрытия при 2 – 8 °C
Конъюгат
Готовый раствор при 2 – 8 °C
до истечения срока
годности;
Избегайте загрязнения микробами напр.
используйте стерильные наконечники пипеток.
18 месяца с даты
выпуска
В закрытом виде
годности;
Буфер для
разбавления
выпуска
После вскрытия при 2 – 8 °C
Помутневшие растворы не использовать.
Промывочный раствор Концентрат после вскрытия при 2 – 8 °C
выпуска
6 месяцев
годности;
выпуска
2 недели;
Разбавленный для использования при 2– 8 °C
Разбавленный для использования при комнатной 1 неделя
температуре
Емкость для готового раствора следует
регулярно промывать! Помутневшие растворы
не использовать.
Субстрат
Разбавленный раствор хранить при 2 – 8 °C,
защищенным от света
Избегайте
загрязнения
микробами
напр.
используйте стерильные наконечники пипеток.
При интенсивной синей окраске (экстинкция при
650 нм по отношению к дистиллированной воде
> 0,2) не использовать.
russian
7
годности
выпуска
RU
годности;
Стоп-раствор
После вскрытия при комнатной температуре
годности
Pos:
für alle
Dokumente/ELISA
antigen/Testdurchführung/Überschrift:
Durchführung
@ 8\mod_1265792572851_78.doc
@
28762
@1
7 ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA antigen
7.1
Общие указания
Для правильного использования SERION ELISA antigen, следует применять
исключительно компоненты SERION ELISA antigen. Не следует заменять их
реактивами других производителей. Стандартные и контрольные сыворотки, а также
конъюгат SERION ELISA antigen в зависимости от партии адаптированы к
конкретному тест-набору и не могут использоваться в тест-наборах других партий.
Разбавляющий буфер, буфер для промывания, стоп-реактив и раствор субстрата
могут использоваться во всех тестах SERION ELISA antigen не зависимо от партий и
наборов.
Все компоненты теста SERION ELISA antigen следует использовать до истечения
срока годности (см. указания на этикетке) при соблюдении правильных условий
хранения. Не применять реактивы после истечения срока годности.
Неверное разбавление реактивов может привести к потерям чувствительности.
Реактивы теста во время хранения и инкубации необходимо защищать от яркого
света. После использования плотно закрыть упаковку во избежание высыхания и
бактериального загрязнения.
Специальный пакет для лунок микротитровального планшета следует разрезать
только по предусмотренному для этого спаечному шву, чтобы можно было опять его
закрыть. При повреждении пакета или не плотной упаковке пакета для хранения
неиспользованных лунок, микротитровальные стрипы не следует больше
использовать для теста.
Во избежание контаминации, следует всегда использовать асептическую технику
забора реагентов. Во избежание ложных результатов наконечник пипетки при вводе
конъюгата ни в коем случае не должен касаться и смачивать верхний край лунок.
При закрывании флаконов следить за тем, чтобы флакон был закрыт
соответствующей крышкой.
Особенно раствор субстрата ТМБ чувствителен к окисляющим веществам и
тяжелым металлам. Его следует всегда держать в защищённом от света месте. ТМБ
раствор субстрата открывать непосредственно перед использованием по
возможности при наименьшем освещении. Этот раствор слегка окрашен в зеленоголубой цвет.
Избегать контакта кожных покровов с растворами субстрата и стоп-реактива!
Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, и от тщательного
перемешивания соответствующих реактивов. Перед забором контрольных
материалов и конъюгата емкости необходимо хорошо встряхнуть.
Также
разбавления проб перед пипетированием необходимо хорошо перемешать
мономиксером (например, Vortex).
russian
8
Необходимо следить за аккуратным заполнением лунок и соблюдением указанных
времени и температуры инкубации.
Значительные различия во времени между заполнением первой и последней лунок
при добавлении сывороток проб и контрольных сывороток, конъюгата и субстрата
приводит к различиям инкубационного периода, которые могут значительно
повлиять на точность и воспроизводимость измеренных значений.
Лишь строгое
результаты.
соблюдение
рабочей
инструкции
обеспечивает
правильные
Правильная промывка препятствует неспецифичности теста. Поэтому следует
придерживаться инструкции к используемому прибору. Важно равномерное
наполнение лунок буфером для промывания и его полное удаление после
промывки, чтобы избежать возможных неконтролируемых эффектов разбавления.
Избегать образования пены!
Не повреждать маркировку микротитровальных стрипов с сокращенными
обозначениями возбудителя и сокращениями антигенов для SERION ELISA antigen,
чтобы не спутать.
7.2
Подготовка проб и хранение
Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы (сыворотка или плазма)
следует использовать лишь с оговоркой. Пробы загрязненные микробами
использовать не следует. Пригодными для исследований материалами являются
сыворотки, полученные стандартными лабораторными методами (EDTA, Citrat,
Heparin).
russian
9
RU
SERION ELISA antigen может быть оценен только, если будут соблюдены
специфические партии подтвержденные значения, содержащиеся в сертификате
контроля качества каждого набора.
7.2.1 Подготовка проб
Перед началом теста, пробы (пробы пациентов, стандартные и отрицательные
контрольные) (V1) разбавить буфером проб (V2):
V1 + V2 = 3+1
по
300 мкл пробы (V1)
на каждые
100 мкл разбавляющего буфера (V2)
После каждого разведения и перед отбором пробы следует хорошо размешать
мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора.
В заключение пробы нагревают при 110 °C (+/- 5 °C) в течение 10 минут. Обратить
обязательно внимание на выдержку времени и температуры! Обычные реактивные
сосуды для термолиза не пригодны; мы рекомендуем реакционные сосуды с
предохранительным или с завинчивающимся затвором.
При использовании термостата блока нагрева проверить настройку температуры на
110 °C (+/- 5 °C) подходящим термометром. При отклонениях соответственно
отъюстировать термометр блока нагрева. Учитывать специфическое прибору время
предварительного нагрева. Во время термолиза образуется белый плотный осадок.
Затем отцентрифугировать пробу в течение 10 минут при 10.000 × г в охлажденной
до 4 °C настольной центрифуге и светлую надосадочную жидкость использовать в
дальнейшем ходе теста.
7.2.2 Хранение проб
Подготовленные таким образом пробы следует хранить не более 24 часов при
температуре 2-8°C. Необработанные пробы пациентов хранятся не более 7 дней при
температуре 2-8°C. Более длительное хранение проб возможно при температуре ≤ 20°C. Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.
russian
10
7.3
Подготовка реактивов
Все реактивы теста должны быть перед использованием в тесте нагреты до
комнатной температуры.
7.3.1 Микротитровальные стрипы
Тестовые стрипы или лунки теста упакованы вместе с осушителем.
Ненужные лунки следует снова
закрывающийся герметически.
положить
в
алюминиевый
пакет,
7.3.2 Контрольные сыворотки/стандартные сыворотки
RU
Контрольные и стандартные сыворотки следует развести буфером проб и
затем денатурировать. При каждом тесте независимо от количества
использованных титровальных стрипов должны проводиться у контрольных
сывороток простой, а у стандартных сывороток двойной анализ.
7.3.3 Конъюгат (готовый к применению)
Избегать контаминации готового к применению
использовать стерильные наконечники пипеток.
конъюгата,
например
7.3.4 Раствор для промывания
Концентрат раствора для промывания (V1) развести в соотношении 1:30
дистилированной водой до конечного объёма (V2).
Например:
Концентрат раствора для
промывания (V1)
25 мл
Конечный объём
(V2)
750 мл
1 мл
30 мл
7.3.5 TMB- раствор субстрата ( готовый к применению)
Избегать контаминации готового к применению раствора субстрата, например
использовать стерильные наконечники пипеток.
ТМБ-раствор субстрата слегка окрашен в зелёно-голубой цвет, если окраска
станет интенсивной (экстинкция при 650 нм к дистиллированной
воде > 0,2 OD ), его не следует использовать.
7.3.6 Стоп-раствор (готовый к применению)
antigen/Gültig
für
Testablauf
@
8\mod_1265793631810_78.doc
@ 28935
@2
russian
11
7.4
Обзор - проведение теста
количественный
Подготовка проб, контрольных и стандартных сывороток
Разбавление проб
(пробы пациентов, контрольные и стандартные
сыворотки)
300 мкл пробы + 100 мкл разбавляющего буфера
ИНКУБАЦИЯ 10 мин. / 110 °C
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ 10 мин. / 10.000 × g / 4 °C
Снять надосадочную жидкость, удалить осадок
Pos: 26 /Arbeitsanleitungen/Gültig
für alle 21335
Добавление надосадочных жидкостей (по 100 мкл)
влажная камера
ПРОМЫВКА (5 x 300 мкл DIL WASH )
Добавление раствора конъюгата PODCR (100 мкл)
ПРОМЫВКА (5 x 300 мкл DIL WASH )
Добавление раствора субстрата TMB (100 мкл)
Добавление стоп-раствора STOP (100 мкл)
ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 450 нм (реф.
650 нм)
russian
12
7.5 Проведение теста вручную
1. Обработка проб (стандартных, контрольных, пациентов) как описано
2. Установить необходимое количество лунок в планшет и закрепить лист
протокола.
3. Накапать по 100 мкл надосадочной жидкости стандартных (двойное
приготовление) проб, а также отрицательных контролей и проб пациентов в
необходимое количество лунок тестовых стрипов. Оставить одну лунку пустую
для холостого значение субстрата (светлого). Например:
Лунка A1
Холостое значение
субстрата (светлый)
Лунка B1
Отрицательный контроль
Лунка C1
Стандартная
Лунка D1
Стандартная
Лунка E1
Проба 1....
RU
Candida antigen количественный
4. Инкубация проб в течение 60 минут (+/- 3 мин.) при 37°C (+/-1°C) во влажной
камере.
5. По истечении времени инкубации промыть лунки (в промывателе или вручную):
отсосать или вытряхнуть инкубационную жидкость из лунок
ввести в каждую лунку по 300 мкл буфера для промывания
отсосать или вытряхнуть буфер для промывания
повторить процедуру 4 раза (т.е. всего промыть 5 раз)
вытряхнуть планшет на бумажные салфетки
6. Добавление конъюгата
По 100 мкл готового к употреблению конъюгата накапать во все лунки (без
холостого значения субстрата).
7. Инкубация конъюгата в течение 60 минут (+/-3 мин.) при 37°C
влажной камере.
(+/- 1 °C) во
8. По истечении времени инкубации промыть лунки (как описано выше).
9. Добавление субстрата
По 100 мкл готового к употреблению ТМБ-раствора субстрата накапать во все
лунки (в т.ч. и в лунку для холостого значения субстрата).
10. Инкубация субстрата в течение 30 минут (+/-1 мин.) при при 37°C (+/- 1 °C) во
влажной камере, защищенно от света.
11. Остановка реакции
Ввести по 100 мкл стоп-раствора во все лунки, слегка встряхнуть планшет,
чтобы перемешать.
12. Измерение поглощения
Измерить в течение 60 минут при 450 нм к холостому значению субстрата,
эталонная длина волны в пределах 620 нм и 690 нм (напр. 650 нм).
russian
13
7.6
Автоматическое прохождение теста
Тесты SERION ELISA пригодны для применения с иммуноматомTM и Gemini и
пригодны для использования с аналогичными автоматами. Автоматические
процессы аналогичны процессам при ручном режиме. Обратите внимание, что при
особых условиях в лаборатории бывает необходимо изменение инкубационного
времени.
7.7
Положительный контроль/контроль правильности
Для периодической проверки метода исследования в рамках внутрилабораторного
менеджмента качества рекомендуется применение теста SERION ELISA control.
Положительные контроли служат в качестве контролей правильности, а также для
проверки точности используемого метода. Способ применения описан в отдельной
инструкции.
russian
14
8
ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА
8.1
Количественное измерение по методу 4PL
Наибольшую точность соотношения между измеренными сигналами и
количественными значениями предоставляют нелиниальные функции, которые
подстраивают сигмоидальные кривые напрямую без дальнейшей трансформации
под шкалу OD. Определение концентрации антигенов в тесте SERION ELISA antigen
производится по “логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL)”,
математическая функция которой описывается следующей формулой:
OD = A +
1 + e B(C - ln Konz.)
Параметры A, B, C и D точно передают ход кривой и определяют
1. нижнюю асимптоту
2. подъем кривой в точке перегиба
3. точку перегиба кривой
4. верхнюю асимптоту
параметр A
параметр B
параметр C
параметр D
Институт Вирион\Serion ГмбХ (Вюрцбург) определяет для каждой партии наборов
стандартные кривые в нескольких тестах при соблюдении оптимальных условий. У
пользователя отпадает необходимость в дорогостоящем и занимающем много
времени построении стандартной кривой.
Для расчетов результатов теста пользователь в каждой упаковке теста SERION
ELISA antigen получает соответственно адаптированную к партии стандартную
кривую в виде графика и таблицу значений. Соответственное программное
обеспечение SERION evaluate , а также базирующееся на Microsoft® Excel SERION
activity для помощи в расчетах, предоставляются по запросу.
Для выравнивания колебаний тестов и проверки качества хода теста в поставку
включена т.н. стандартная сыворотка. Этой контрольной сыворотке при контроле
качества присваивается номинальное значение и область применения, в пределах
которой возможна точная и надежная обработка результатов теста.
russian
15
RU
D-A
8.2
Критерии действительности теста
-Холостое значение субстрата должно иметь значение OD < 0,25.
-Отрицательный контроль при оценке теста должен быть оценен как отрицательный.
-При количественном варианте SERION ELISA antigen среднее значение OD
стандартной сыворотки, после вычета значения холостого субстрата, должно быть
в пределах области применения, указанной в сертификате контроля качества
данной партии.
-Значения OD стандартной сыворотки не должны расходиться более чем на 20%.
Если эти критерии не выполняются, тест является не действительным и его
необходимо повторить.
8.3
Обработка данных SERION ELISA antigen Candida
8.3.1 Неавтоматизированная обработка
Для обработки результатов к каждому тесту SERION ELISA antigen прилагается
специфическая каждой партии стандартная кривая, а также таблица значений.
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо до обработки данных
вычитать из всех результатов измерений.
Pos : 27 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/Gültig für alle D okumente/ELISA antigen/Testaus wertung/T estaus wertung Methoden @ 11\mod_1346849110626_78.doc @ 52255 @
Метод 1:
Качественный расчет
Для установления области Cut-off в OD среднее значение измеренного стандартного
OD умножают на числовое значение, указанное в сертификате качества (см.
формулы для специальных систем оценок), например:
OD = 0,502 x MW(STD) при верхнем значении Cut-off
OD = 0,352 x MW(STD) при нижнем значении Cut-off
Если, например, среднее значение поглощения стандартной сыворотки равно 0,970,
получается, что область Cut-off находится в пределах от 0,341 до 0,487.
russian
16
Метод 2:
Бесступенчатое определение активности антигена при помощи
стандартной кривой
Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen/Gültig für alle Dokumente/Tes taus wertung/T estaus wertung: M ethode 2 (für alle T ests) @ 4\mod_1255348201981_6.doc @ 21415
Колебания тестов, в зависимости от того или иного дня или лаборатории,
выравниваются за счет умножения актуальной измереной величины пробы пациента
на поправочный коэффициент F:
Номинальное значение OD (стандартной сыворотки)
F =
Этот метод необходим, чтобы актуальный уровень теста пользователя подровнять
или нормализировать к специфической каждой партии стандартной кривой. Таким
образом выравнивают суточные колебания.
1. Из двух значений поглощения стандартной сыворотки образовать среднее
значение и проверить, находится ли полученное значение в допустимых
пределах.
2. Расчет коэффициента F: Указанное номинальное значение стандарта делится
на среднее значение поглощения стандартной сыворотки:
F = номинальное значение поглощения стандартной сыворотки / среднее
значение поглощения стандартной сыворотки.
3. Все измеренные величины проб пациентов умножаются на "F".
4. На основании откорректированных измеренных величин при помощи
стандартной кривой считываются значения активности антигена в мЕд/мл или
Ед/мл.
russian
17
RU
Значение OD (стандартной сыворотки) в определенный день
8.3.2 Автоматическая обработка данных теста при помощи программы
SERION evaluate
В результате ввода 4 параметров и номинального значения стандартной сыворотки
после процесса и замера SERION ELISA antigen активность антигена
рассчитывается специальной программой для расчета SERION evaluate.
В случае, если значение выходит за рамки области применения, программа может
выдать следующие сообщения об ошибках на английском языке:
„Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24.” bzw.
„Standard value differ more than 20 % in following groups: Group 1-24.”
”Стандарты выходят за пределы допусков в следующих группах: группы 1-24”; и/или
”Стандарты различаются более чем на 20% в следующих группах: группы 1-24”.
В этих случаях результат теста является недействительным и его следует повторить.
Четыре параметра кривой и номинальное значение необходимо менять только при
изменении партии (параметры и номинальное значение приведены в таблице
значений). Верность ввода этих зависящих от партии значений можно проверить при
помощи соответствующих стандартной сыворотке значений активности (в мЕд/мл и
Ед/мл). Полученное среднее значение активности антигена должно совпадать со
значением, указанным в сертификате контроля качества партии. Корректировка
значения замера производится автоматически. На дисплее учета результатов
появляется следующий текст:
Наименование пробы
Значение OD
Ед/мл
Подсчёт
8.4
Количественные пределы
Количественные пределы ограничивают область расположения допустимых
значений. Они даны в контрольном сертификате SERION ELISA antigen. В рамках
исследования
функциональных
параметров
была
выявлена
линейность
разбавления этой области. Если измеренные значения проб пациентов будут
находиться над этой областью, можно пробы проанализировать в более высоком
разбавлении. Полученные концентрации антигена следует затем умножить на
дополнительный фактор разбавления.
russian
18
8.5
Область предельных значений
Область предельных значений теста SERION ELISA antigen Candida указана в
сертификатах контроля качества и означает область погранично измеренных
значений. Оценка проб пациентов ниже области предельных значений
характеризует отрицательный результат теста; оценка проб пациентов выше
области предельных значений рассматривается как положительный результат. В
случае пограничного результата (сомнительные пробы) невозможна однозначная
оценка пробы. В таких случаях тест следует повторить с пробой, взятой одну-две
недели позже (парная сыворотка).
8.6
Интерптетация результатов
Положительный результат теста в материале пациента указывает на наличие грибка
кандиды. Интерпретацию результатов следует проводить только с учетом всей
клинической картины и дополнительных методов исследования.
О положительном результате можно говорить, если выявлено по крайней мере 2,6
единиц. Такой результат в пробе означает, что в ней имеется количество маннана,
ассоциирующееся с 2,6 нгр. протеина возбудителя кандиды. При этом речь может
идти как о живом возбудителе, так и о не живом.
Отрицательный результат теста не исключает наличия острой инфекции
соответствующим возбудителем. Особенно при высоком титре антител к кандиде
может быть, что антитела так сильно маскируют антиген, что даже после
денатурации при подготовке пробы антиген не может быть распознан.
Отрицательный результат теста может так же быть вызван временем забора пробы
во время инфекции, неподходящим забором пробы, подготовкой пробы или её
хранением.
8.7
Эталонные области здоровых пробантов
Исследование сывороток неотобранных доноров из южного региона Германии
тестом SERION ELISA antigen Candida дало следующее распределение: из 103
донорских сывороток были 92 (89,3 %) тестом SERION ELISA antigen Candida
определены как отрицательные, шесть сывороток (5,8 %) дали положительный
результат, и пять сывороток (4,9 %) были сомнительными.
russian
19
RU
9
ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1
Чувствительность и специфичность
Во внутриинститутском исследование для подтверждения теста Serion ELISA antigen
Candida были проверены 148 сывороток взрослых доноров и 93 пациентов, у
которых во время интенсивного медицинского лечения были установлены признаки
системного кандидоза, и результаты сравнены с имеющимся в продаже тестом
выявления антигена. Для расчета чувствительности и специфичности пограничные
сыворотки во внимание не принимались.
Чувствительность Специфичность
Функциональные параметры
> 99,9 %
97,8 %
В другом внутриинститутском исследование были установлены перекрёстные
реакции с видами кандиды Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei,
Candida parapsilosis и Candida tropicalis в тесте SERION ELISA antigen Candida;
таким образом достигается всеохватывающая диагностика кандиды.
Так же была исследована перекрёстная реактивность гидрооксиэтилового крахмала
(HES), который используется в качестве экспандера плазмы при лечение
недостаточности
кровоснабжения
(гиповолемический,
геморрагический
и
септический шок). Несмотря на молекулярную схожесть этого вещества с мананном
тест Serion ELISA antigen Candida не выявил перекрёстной реактивности.
russian
20
9.2
Точность
Точность в пределах серии сывороток определялась многократно при
использовании сывороток с различной реактивностью (n = 20) в планшете с
антигенным покрытием. Для определения точности вне серии пробы сывороток с
различной реактивностью испытывались в 10 независимых друг от друга
приготовлениях.
Стандартное отклонение
Коэффициент изменения (VK %) =
x 100
Среднее значение
Межсерийный
(VK %)
Среднее
значение
поглощения
(OD)
0,223
9,6
0,225
7,3
пограничная
0,507
2,4
0,476
5,3
положительная
1,413
2,5
1,356
2,7
положительная
2,851
2,0
2,442
8,1
Среднее
значение
поглощения
(OD)
Внутрисериный
отрицательн
Проба
russian
21
(VK %)
RU
10 МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
Тест SERION ELISA antigen предназначен только для использования специалистами,
безупречно владеющим необходимыми навыками.
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов необходимо выполнение
общепринятых лабораторных правил:
-
Упаковка теста содержит человеческие сыворотки. Хотя все контрольные
сыворотки протестированны и являются отрицательными к вирусам anti-HIV-Ak,
HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) и anti-HCV-Ak, их следует
рассматривать, как потенциально инфекционно опасные материалы.
-
Не набирайте растворы в пипетку при помощи рта.
-
В помещениях, где ведется работа с реагентами теста и пробами пациентов, не
разрешается принимать пищу, пить или курить.
-
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов следует избегать
прямого контакта, поэтому следует использвать лабораторный халат,
одноразовые перчатки и защитные очки. Руки по окончании работы следует
тщательно мыть.
-
Пробы пациентов и все потенциально
проведения теста следует обеззаразить.
-
Реагенты необходимо хранить в месте, недоступном для детей.
инфекционные
материалы
10.2 Утилизация
Пожалуйста, выполняйте предписания, предусмотренные действующим
законодательством!
russian
22
после
11 ЛИТЕРАТУРА
[1]
Fegeler, W. (1992)
Pilzdialog 4, 61-2.
Möglichkeiten
[2]
[3]
[4]
Rev. 3, 32-45.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Pilzdialog 4, 55-6.
[14]
[15]
[16]
R.
russian
23
einer
differenzierten
(1991)
Candida-Serologie.
Labor-Diagnostik
systemischer
RU
SERION ELISA antigen
(V 12/09-1)
Symbole auf den Etiketten/ symbols on labels/ symboles et étiquettes/ simboli sulle etichette/ символы на
этикетках/símbolos sobre las etiquetas/ σύµβολα στις ετικέτες/ símbolos nos rótulos / Symboly na štítcích /
symboler på etiketter/ symboler på etiketterna/ Symbole na etykietach/ symboly na označení/ Simboli na
oznakah/ symbol på etiketter
Hersteller/ Manufacturer/ Fabricant/ Produttore/ Производитель/ Fabricante/ Κατασκευαστής/
Fabricante/ Výrobce/ Fremstiller/ Tillverkare/ Producent/ Výrobca/ Izdelovalec/ Produsent
Ausreichend für 96 Tests/ sufficient for 96 tests/ suffisant pour 96 tests/ sufficiente per 96 test/
достаточно для 96 тестов / suficiente para 96 pruebas/ επαρεκεί για 96 δοκιµασίες/ suficiente para
96 ensaios/ stačí na 96 testů/ nok til 96 test/ tillräckligt för 96 tester/ Wystarcza na 96 testów/
postačuje na 96 testov/ Zadostuje za 96 testov/ Tilstrekkelig til 96 tester
96
96
LOT
Charge/ lot/ lot / lotto/ lote/ παρτίδα/ lote/ šarže/ lot/ lot/ seria/ šarža/ serija/ lot /lot
REF
Referenz oder Bestellnummer/ reference or order number/ numéro de référence ou de commande/
numero di riferimento o ordinazione/ ссылка или номер для заказа / referencia o número de
pedido/ Αριθµός αναφοράς ή παραγγελίας/ referência ou número para encomenda/ reference nebo
číslo objednávky/ reference eller bestillingsnummer/ referens eller beställningsnummer/ Numer
referencyjny lub numer zamówienia/ referenčné číslo alebo číslo objednávky/ referenčna ali
kataloška številka/ Referanse eller ordrenummer
8°C
2°C
Lagern zwischen 2 und 8 Grad Celsius/ store between 2 and 8 degree celsius/ entre 2 et 8 degré
celsius/ conservare a temperatura compresa tra 2 e 8 gradi centigradi/ хранить при температуре
от 2 до 8 градусов цельсия / conservar entre 2 y 8 grados celsius/ Φύλαξη µεταξύ 2 και 8 βαθµούς
Κελσίου/ Armazenar entre 2º e 8º Celsius/ uchovávejte při teplotě 2 až 8 °C/ opbevares mellem 2
og 8 grader celsius/ förvara vid 2 till 8 grader Celsius/ Przechowywać w temp. pomiędzy 2 a 8
stopni Celsjusza/ skladovať pri teplote 2 až 8 stupňov Celzia/ Shranjujte pri temperaturi od 2 do 8 C/
Oppbevares mellom 2 og 8 grader Celsiu
CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG/ CE marking according to IVD guideline
98/79 EC/ Étiquetage CE selon les directives DIV/ marcatura CE in conformità alla direttiva IVD
98/79 EC/ маркировка СЕ согласно директивам IVD 98/79 /marca CE según la directiva IVD
98/79 CE/ Σήµανση CE σύµφωνα µε την οδηγία IVD 98/79 EΕ/ Marcação CE de acordo com a
Directiva 98/79/ značení CE podle směrnice IVD 98/79/ES/ CE-mærkning iht. IVD-retningslinje
98/79/EF/ CE-märkning enligt riktlinjerna för IVD i direktiv 98/79/EC/ Oznakowanie CE zgodne z
wytycznymi dot. diagnostyki in vitro 98/79 EC/ označenie CE podľa smernice IVD 98/79/ES/ oznaka
CE, skladna s smernico IVD 98/79/ES/ CE-merking i henhold til IVD-retningslinjer 98/79/EØF
0197
CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG gemäß Anhang II, Liste B/ CE marking
according to IVD guideline 98/79 EC according to annex II, list B/ Étiquetage CE selon les directives
DIV 98/79 CE selon l'annexe II, liste B/ marcatura CE in conformità alla direttiva IVD 98/79 EC
secondo l’allegato II, elenco B/ маркировка СЕ согласно директивам IVD 98/79, приложение II,
список В / marca CE según la directiva IVD 98/79 CE de acuerdo con el anexo II, lista B/ Σήµανση
CE σύµφωνα µε την οδηγία IVD 98/79 EΕ, σύµφωνα µε το παράρτηµα ΙΙ, κατάλογο Β/ Marcação
CE de acordo com a Directiva 98/79/ CE relativo aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro,
segundo a lista B do anexo II/ značení CE podle směrnice IVD 98/79/ ES podle příloh II, seznamu
B/ CE-mærkning iht. IVD-retningslinje 98/79 /EF iflg. anneks II, liste B/ CE-märkning enligt
riktlinjerna för IVD i direktiv 98/79/EC, bilaga II, lista B/ Oznakowanie CE zgodne z wytycznymi dot.
diagnostyki in vitro 98/79 EC, zgodnie z aneksem II, lista B/ označenie CE podľa smernice IVD
98/79 ES v znení dodatku II, zoznam B/ oznaka CE, skladna s smernico IVD 98/79/ES in
seznamom B v Dodatku II/ CE-merking i henhold til IVD-retningslinjer 98/79/EØF, tillegg II, liste B
Verfallsdatum/ expiry date/ date d'expiration/ data di scadenza/ срок годности до/ fecha de
caducidad/ ηµεροµηνία λήξης/ data de validade/ datum exspirace/ udløbsdato/ förfallodatum/ data
upływu ważności/ dátum exspirácie/ datum izteka roka uporabnosti/ utløpsdatp
MTP
Mikrotiterplatte (brechbare Streifen)/ microtiter plate (breakable strips)/ plaque de microtitration
(bandelettes détachables)/ piastra per microtitolazione (strisce separabili)/ микротитровальная
панель (отрывные стрипы) /placa de microtitulación (tiras rompibles)/ Πλάκα µικροτιτλοποίησης
(αποσπωµενες ταινίες)/ placa de microtitulação (tiras quebráveis)/ mikrotitrační deska (rozlomitelné
proužky)/ mikrotiterplade (afbrækkelige strimler)/ mikrotiterplatta (brytbara strips)/ Płytka
mikrotitracyjna (paski do odrywania)/ mikrotitračná platnička (rozlomiteľné prúžky)/ vsebnik za
mikrotitriranje (z razdelki, ki jih je mogoče odlomiti)/ Mikrotiterplate (avbrytbare strips)
AK
Antikörper/ antibodies/ Anticorps/ anticorpi/ антитела / anticuerpos/ αντίσωµα/ anticorpos/
protilátky/ antistoffer/ antikroppar/ Przeciwciała/ protilátky/ protitelesa/ Antistoffer
STD
Standardserum/ standard serum/ Sérum standard/ siero standard/ стандартная сыворотка /suero
patrón/ πρότυπος ορός/ soro padrão/ standardní sérum/ standardserum/ standardserum/ Surowica
standardowa/ štandardné sérum/ standardni serum/ Standardserum
NEG
Negativkontrolle/ negative control/ Contrôle négatif/ controllo negativo/ отрицательные контроли
/control negativo/ αρνητικός έλεγχος/ controlo negativo/ negativní kontrola/ negativ kontrol/ negativ
kontroll/ Kontrola negatywna/ negatívna kontrola/ negativna kontrola/ Negativ kontroll
PODCR
Peroxidase Konjugat (gebrauchsfertig)/ peroxidase conjugate (ready-to-use)/ conjugué peroxydase
(prêt à l'emploi)/ coniugato con perossidasi (pronto per l’uso)/ конъюгат пероксидазы (готовый к
применению)/ conjugado de peroxidasa (listo para usar)/ Συζευξη υπεροξειδάσης (έτοιµο προς
χρήση)/ conjugado com peroxidase (pronto a utilizar)/ konjugát peroxidázy (připravený k použití)/
peroxidasekonjugat (klar til brug)/ peroxidaskonjugat (bruksfärdigt)/ Koniugat peroksydazy (gotowy
do użycia)/ konjugát peroxidázy (pripravený na použitie)/ konjugat peroksidaze (pripravljena za
uporabo)/ Peroksidasekonjugat (bruksklart)
SAMB
Probenpuffer/ buffer of specimens/ tampon pour échantillons/ tampone per campioni/ буфер проб
/solución amortiguadora de muestras/ Ρυθµιστικό διάλυµα δειγµάτων/ tampão para espécimes/ pufr
vzorků/ prøvebuffer/ provbuffert/ Bufor próbek/ vzorkový pufor/ pufer za vzorce/ Prøvebuffer
WASH
Waschlösungskonzentrat/ washing solution concentrate/ concentré de solution de lavage /
soluzione di lavaggio concentrata / промывочный концентрат /concentrado de solución de lavado/
συµπύκνωµα έκπλυσης/ concentrado de solução de lavagem/ koncentrát promývacího roztoku/
vaskeopløsningskoncentrat/ tvättlösningskoncentrat/ Stężony roztwór do płukania/ koncentrát
premývacieho roztoku/ koncentrat za raztopino za izpiranje/ Vaskeløsningskonsentrat
TMB
TMB Substratlösung/ TMB substrate solution/ solution de substrat TMB/ soluzione substrato TMB/
раствор субстрата ТМВ /solución sustrato TMB/ ∆ιάλυµα υποστρώµατος ΤΜΒ/ solução do
substrato TMB/ roztok substrátu TMB/ TMB-substratopløsning/ TMB-substratlösning/ Roztwór TMB
substrat/ substrátový roztok TMB/ raztopina substrata TMB/ TMB-substratløsning
STOP
Stopplösung/ stopping solution/ solution d'arrêt/ soluzione di arresto/стоп-раствор/ solución de
parada/ διάλυµα διακοπής/ solução de paragem/ zastavovací roztok/ stopopløsning/ stopplösning/
roztwór zatrzymujący reakcję/ ukončovací roztok/ raztopina za ustavitev reakcije/ stoppeløsning
CERT
Zertifikat/ certificate/ certificat/ certificato/ сертификат /certificado/ Πιστοποιητικό/ certificado/
certifikát/ certifikat/ certifikat/ Certyfikat/ certifikát/ certifikat/ Sertifikat
INFO
Gebrauchsanweisung, Zertifikat (Standardkurve und Auswertetabelle), CD/ instructions, certificate
(standard curve and evaluation table), CD/ instructions, certificat (courbe de référence et tableau
d'évaluation), CD/ istruzioni per l’uso, certificato (curva standard e tabella interpretativa), CD/
Инструкция по применению, сертификат (стандартная кривая и таблица для оценки),
компактный диск /instrucciones, certificado (curva patrón y tabla de evaluación), CD/ Οδηγίες
χρήσης, Πιστοποιητικό (πρότυπη καµπύλη και πίνακας υπολογισµού), CD/ instruções, certificado
(curva padrão e tabela de avaliação), CD/ (standardní křivka a vyhodnocovací tabulka), CD/
brugsanvisning, certifikat (standardkurve og evalueringstabel), CD/ instruktioner, certifikat
(standardkurva och utvärderingstabell), CD/ Instrukcje, certyfikat (krzywa standardowa i tabela do
określania wyników/ CD/ pokyny, certifikát (štandardná krivka a hodnotiaca tabuľka), disk CD/
navodila, certifikat (standardna krivulja in ocenjevalna tabela), CD/ Instruksjoner, sertifikat
(standardkurve og evalueringstabell), CD
RTU
gebrauchsfertig/ ready-to-use/ prêt à l'emploi/ pronto per l'uso/ готовый к использованию /listo
para usar/ έτοιµο προς χρήση/ pronto a utilizar/ připravený k použití/ klar til brug/ bruksfärdig/
gotowy do użycia/ pripravené na použitie/ pripravljen za uporabo/ klar til bruk
CONC
Konzentrat/ concentrate/ concentré/ concentrato/ концентрат / concentrado/ Συµπύκνωµα/
concentrado/ koncentrát/ koncentrat/ koncentrat/ Koncentrat/ koncentrát/ koncentrat/ Konsentrat
DIL
verdünnen oder lösen in/ dilute or disolve in/ diluez ou dissoudre dans/ diluire o sciogliere in/
разбавить или растворить в /diluir o disolver en/ αραίωση ή διάλυση σε/ diluir ou dissolver em/
nařeďte nebo rozpusťte v/ fortynd eller opløs i/ späd eller lös i/ Rozcieńczyć lub rozpuścić w/
rozriediť alebo rozpustiť v/ razredčite ali raztopite v/ Fortynnes eller løses opp i
AQUA
destilliertes Wasser/ aqua detillata/ eau distillée/ acqua distillata/ дистиллированная вода /agua
destilada/ αποσταγµένο νερό/ água destilada/ destilovaná voda/ destilleret vand/ destillerat vatten/
woda destylowana/ destilovaná voda/ destilirana voda/ Destillert vann
IVD
In-vitro Diagnostik Anwendung/ in-vitro diagnostic use/ utilisation en diagnostic in-vitro/ uso
diagnostico in vitro/ использование в диагностике ин-витро /uso diagnóstico in-vitro/ ∆ιάγνωση,
χρήση in-vitro/ para diagnóstico in vitro/ diagnostické použití in-vitro/ til in-vitro diagnostik/ in vitrodiagnostisk användning/ do diagnostyki in vitro/ diagnostické použitie in-vitro/ uporaba pri
diagnostiki in vitro/ In vitro-diagnostisk bruk
200
Candida

SERION ELISA antigen Candida V1-deu

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