Entwicklung von Real-Time PCR Nachweissystemen

Entwicklung von Real-Time PCR Nachweissystemen
für getränkerelevante Hefen
vorgelegt von
Diplom-Ingenieur
Hans-Henno Dörries
Angefertigt bei der Firma
BIOTECON Diagnostics GmbH
in Potsdam
Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurwissenschaften
- Dr.-Ing. -
genehmigte Dissertation
Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. L. Kroh
Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl
Berichterin: Dr.-Ing. K. Berghof-Jäger
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 01.03.2006
Berlin 2006
D 83
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl für die wissenschaftliche
Betreuung und Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit.
Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger danke ich für die hevorragende Unterstützung und die ununterbrochene Begeisterung für alle Ergebnisse dieser Arbeit.
Herrn Dr. Cordt Grönewald und Herrn Dr. Thomas Zippel möchte ich für ihre Hilfe bei der
Lösung von praktischen Problemen, für wertvolle Anregungen und ihre ständige Diskussionsbereitschaft danken.
Ivonne Remus danke ich für die tatkräftige Unterstützung bei einigen der durchgeführten
Versuche.
Ganz besonders danke ich Jana Kohlmann für die große Geduld und die Unterstützung bei
der Anfertigung der schriftlichen Arbeit.
Herrn Dipl. Biol. Benjamin Junge danke ich für die kritische Durchsicht dieser Arbeit.
Allen Mitarbeitern der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH danke ich für die Hilfsbereitschaft und angenehme Arbeitsatmosphäre.
II
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... VI
Tabellenverzeichnis .............................................................................................. VII
Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... IX
Zusammenfassung................................................................................................ XII
1
Einleitung ..................................................................................................................1
1.1
Getränkerelevante Hefen .........................................................................................1
1.1.1
Alkoholfreie Getränke ..............................................................................................2
1.1.2
Bier ............................................................................................................................5
1.1.3
Wein...........................................................................................................................6
1.2
Nachweis und Identifizierung von getränkerelevanten Hefen .............................7
1.2.1
Kultivierungsabhängiger Nachweis........................................................................8
1.2.2
Mikroskopie, Durchflusszytometrie und Immunoassay .....................................10
1.2.3
Elektrometrische Methoden und ATP-Messung..................................................12
1.2.4
Phänotypische Identifizierung ..............................................................................13
1.2.5
Konventionelle, PCR-basierte Methoden .............................................................13
1.2.6
Real-Time PCR-Methoden .....................................................................................17
1.3
Ziele der Arbeit .......................................................................................................18
2
Material und Methoden ..........................................................................................19
2.1
Mikroorganismen ...................................................................................................19
2.2
Nährmedien.............................................................................................................22
2.3
Oligonucleotide ......................................................................................................24
2.4
Probenmatrices ......................................................................................................26
2.5
Anzucht von Mikroorganismen .............................................................................27
2.6
Extraktion von Nucleinsäuren...............................................................................27
2.6.1
Mechanisch/thermische DNA-Extraktion .............................................................27
2.6.2
Extraktion quantifizierbarer und RNA-freier DNA ...............................................27
2.6.3
Erweiterte, mechanisch/thermische DNA-Extraktion..........................................27
2.7
Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen ...............................................28
2.7.1
Fluorometrische Bestimmung...............................................................................28
2.7.2
Konzentrationsbestimmung über Absorptionsspektrometrie ...........................28
2.8
Agarosegelelektrophorese ....................................................................................28
2.9
Klonierung von PCR-Fragmenten.........................................................................29
2.9.1
Erzeugung von PCR-Fragmenten für die Klonierung .........................................29
2.9.1.1 EF-3-Gen Fragmente ..............................................................................................29
2.9.1.2 Interne Amplifikationskontrolle und Positivkontrolle .........................................30
2.9.2
Reinigung von PCR-Fragmenten für die Klonierung ..........................................31
III
Inhaltsverzeichnis
2.9.3
Ligation von gereinigten DNA-Fragmenten .........................................................31
2.9.4
Transformation von E. coli Zellen.........................................................................31
2.9.4.1 Herstellung kompetenter E. coli Zellen ................................................................31
2.9.4.2 Transformationsansatz ..........................................................................................31
2.9.4.3 Kontrolle der Transformation................................................................................31
2.9.5
Präparation von Plasmid-DNA ..............................................................................32
2.9.6
Restriktionsverdau von Plasmid-DNA..................................................................32
2.10
Sequenzierung........................................................................................................32
2.11
Sequenzanalyse .....................................................................................................32
2.12
Zellzahlbestimmung ...............................................................................................32
2.13
Real-Time LightCycler® PCR .................................................................................33
2.13.1
Real-Time LightCycler® PCR-Programme ............................................................33
2.13.1.1 S. cerevisiae var. diastaticus Nachweis mit Hybridisierungssonden ...............33
2.13.1.2 Hefegesamtnachweis mit Hybridisierungssonden .............................................34
2.13.1.3 Hefegesamtnachweis mit SYBR®-Green I ............................................................34
2.13.2
Real-Time PCR-Ansätze.........................................................................................35
2.13.2.1 S. cerevisiae var. diastaticus Nachweis mit Hybridisierungssonden ...............35
2.13.2.2 Hefegesamtnachweis mit Hybridisierungssonden .............................................35
2.13.2.3 Hefegesamtnachweis mit SYBR®-Green I ............................................................36
2.14
Spezifitätstestung der Real-Time LightCycler® PCR...........................................36
2.15
Sensitivitätstestung der Real-Time LightCycler® PCR .......................................36
2.15.1
Sensitivität ermittelt mit quantifizierter, RNA-freier DNA ...................................36
2.15.2
Sensitivität ermittelt mit dotierten Probenmatrices ............................................36
2.15.3
Sensitivität ermittelt bei einer hohen Begleitflora...............................................36
2.16
Praxisnahe Testung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus ......37
3
Ergebnisse ..............................................................................................................38
3.1
Entwicklung einer Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus ................38
3.1.1
Auswahl der STA1-3 Gene als Zielregionen ........................................................38
3.1.2
Anordnung der Primer und Hybridisierungssonden im STA Gen .....................39
3.1.3
Konstruktion der internen Amplifikationskontrolle und der Positivkontrolle ..40
3.1.4
Spezifität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus ........................42
3.1.5
Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus .....................45
3.1.6
Kompatibilität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus mit
unterschiedlichen Probenmatrices.......................................................................48
3.1.7
Anwendbarkeit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus in der
Praxis.......................................................................................................................49
3.1.7.1 Versuchsteil 1: Robustheit ....................................................................................49
3.1.7.2 Versuchsteil 2: Spezifität .......................................................................................51
3.1.7.3 Versuchsteil 3: Sensitivität....................................................................................51
IV
Inhaltsverzeichnis
3.2
Entwicklung einer Real-Time Consensus-PCR für Hefen...................................53
3.2.1
Auswahl des EF-3 Gens als Zielregion ................................................................53
3.2.2
Sequenzierung und Alignment des EF-3 Genbereichs.......................................54
3.2.3
Sequenzvergleich des EF-3 Genbereichs ............................................................55
3.2.4
Anordnung der Primer und Hybridisierungssonden im EF-3 Gen ....................57
3.2.4.1 Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I..................................58
3.2.4.2 Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden...................58
3.2.5
Konstruktion der internen Amplifikationskontrolle und der Positivkontrolle ..59
3.2.6
Spezifität und Auswahl des Detektionssystems .................................................61
3.2.6.1 Spezifität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I ..........61
3.2.6.2 Spezifität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit
Hybridisierungssonden .........................................................................................63
3.2.7
Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit
Hybridisierungssonden .........................................................................................64
3.2.7.1 Sensitivitätstestung mit quantifizierter, RNA-freier DNA ...................................64
3.2.7.2 Sensitivität in Kombination mit der mechanisch/thermischen
DNA-Extraktion.......................................................................................................66
3.2.7.3 Sensitivität in Kombination mit der erweiterten, mechanisch/thermischen
DNA-Extraktion.......................................................................................................68
3.2.7.4 Detektionszeit für unterschiedliche Hefearten ....................................................68
3.2.7.5 Sensitivität bei einer hohen Begleitflora ..............................................................71
4
Diskussion ..............................................................................................................73
4.1
Beurteilung der STA1-3 und EF-3 Gene als Targetmoleküle..............................73
4.2
Spezifität und Sensitivität der Real-Time PCR-Assays.......................................78
4.3
Anwendbarkeit der Real-Time PCR in Kombination mit der
Probenaufarbeitung ...............................................................................................81
4.4
Ausblick ..................................................................................................................92
5
Literatur...................................................................................................................93
6
Anhang ..................................................................................................................110
6.1
Getestete Mikroorganismen ................................................................................110
6.2
Sequenzauswertung ............................................................................................111
6.3
Real-Time RT-PCR................................................................................................124
6.3.1
RNA-Extraktion.....................................................................................................124
6.3.2
Real-Time One-Step RT-PCR...............................................................................124
6.3.3
Real-Time One-Step RT-PCR-Programm............................................................125
6.3.4
Real-Time One-Step RT-PCR-Ansätze................................................................126
6.3.5
Ergebnisse der Real-Time One-Step RT-PCR....................................................127
V
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 3.1:
Anordnung der identischen Sequenzabschnitte der Gene SGA1 und
MUC1 in der STA Multigen-Familie................................................................38
Abb. 3.2:
Anordnung der Primer und Hybridisierungssonden im STA1 Gen............39
Abb. 3.3:
Sequenzvergleich der IAK mit dem STA1 Gen.............................................40
Abb. 3.4:
Sequenzvergleich der PK mit dem STA1 Gen ..............................................41
Abb. 3.5:
Differenzierung zwischen der PK und positiven Proben bei der
Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus.........................................42
Abb. 3.6:
Amplifikation und Schmelzkurven-Analyse des STA Genfragments
von S. cerevisiae. var. diastaticus Stämmen ...............................................43
Abb. 3.7:
Agarosegelelektrophorese nach Real-Time PCR mit dem S. cerevisiae
var. diastaticus System ..................................................................................44
Abb. 3.8:
Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus..............46
Abb. 3.9:
Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei
einer hohen Begleitflora .................................................................................47
Abb. 3.10:
Real-Time PCR Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus in
Flaschenbier....................................................................................................52
Abb. 3.11:
Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz des
Elongationsfaktors 3 von Hefen ....................................................................53
Abb. 3.12:
Dendrographische Auswertung der EF-3 Gensequenzen...........................57
Abb. 3.13:
Konstruktion der Hybridisierungssonde Yff3 für das EF-3
Genfragment....................................................................................................59
Abb. 3.14:
Sequenzvergleich der IAK mit dem EF-3 Gen von S. cerevisiae var.
diastaticus .......................................................................................................60
Abb. 3.15:
Agarosegelelektrophorese nach Real-Time PCR mit SYBR®-Green I ........61
Abb. 3.16:
Schmelzkurven-Analyse von spezifischen Amplifikaten und
Primerdimeren.................................................................................................62
Abb. 3.17:
Schmelzkurven-Analyse von unspezifisch amplifizierter
Bakterien-DNA.................................................................................................63
Abb. 3.18:
Schmelzkurven-Analyse unterschiedlicher Hefearten ................................64
Abb. 3.19:
Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen ................................66
Abb. 3.20:
Real-Time PCR Nachweis von D. bruxellensis in Orangensaft ..................69
Abb. 3.21:
Sensitivität bei Anwesenheit einer hohen Begleitflora ...............................72
Abb. 6.1:
Alignment der Nucleinsäuresequenzen des EF-3 Sequenzabschnitts
(Position 2272-2637) mit Angabe der Primerpositionen............................111
Abb. 6.2:
Real-Time One-Step RT-PCR .......................................................................127
Abb. 6.3:
Agarosegelelektrophorese nach Real-Time One-Step RT-PCR................128
Abb. 6.4:
Schmelzkurven-Analyse zur Kontrolle des DNA Abbaus .........................128
VI
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1:
Hefestämme.....................................................................................................19
Tab. 2.2:
Bakterienstämme ............................................................................................21
Tab. 2.3:
Schimmelpilzstämme .....................................................................................22
Tab. 2.4:
YM-Medium (yeast extract-malt extract broth) .............................................22
Tab. 2.5:
CASO-Bouillon ................................................................................................22
Tab. 2.6:
Peptonwasser (gepuffert)...............................................................................23
Tab. 2.7:
MRS-Bouillon ..................................................................................................23
Tab. 2.8:
LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) ..............................................................23
Tab. 2.9:
LB-Agarplatten ................................................................................................23
Tab. 2.10:
SOC-Medium ...................................................................................................23
Tab. 2.11:
Primer für die DNA-Kontrolle .........................................................................24
Tab. 2.12:
Primer zur Amplifikation von PCR-Fragmenten des EF-3 Gens.................24
Tab. 2.13:
Primer für Real-Time PCR Nachweissysteme ..............................................24
Tab. 2.14:
Mutageneseprimer zur Herstellung von internen Amplifikationskontrollen und Positivkontrollen ...................................................................25
Tab. 2.15:
Hybridisierungssonden für die Real-Time PCR-Assays .............................25
Tab. 2.16:
Getränkeproben ..............................................................................................26
Tab. 2.17:
Nährmedien .....................................................................................................26
Tab. 2.18:
Prozessproben von Brauerei A......................................................................26
Tab. 3.1:
Spezifität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus .................43
Tab. 3.2:
Abbaubarkeit von Amplifikaten des STA Gens mit dem Enzym UNG .......45
Tab. 3.3:
Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus..............46
Tab. 3.4:
Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei
einer hohen Begleitflora .................................................................................47
Tab. 3.5:
Amplifikation der IAK der Real-Time PCR für S. cerevisiae var.
diastaticus bei einer hohen Begleitflora .......................................................48
Tab. 3.6:
Eignung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus in
Kombination mit der mechanisch/thermischen Aufarbeitung für
unterschiedliche Probenmatrices .................................................................48
Tab. 3.7:
Ergebnisse des Versuchsteils 1: Robustheit ...............................................50
Tab. 3.8:
Ergebnisse des Versuchsteils 2: Spezifität ..................................................51
Tab. 3.9:
Ergebnisse des Versuchsteils 3: Sensitivität...............................................52
Tab. 3.10:
Sensitivitätstestung mit quantifizierter, RNA-freier DNA ............................65
Tab. 3.11:
Eignung der Real-Time Consensus-PCR für Hefen in Kombination
mit der mechanisch/thermischen Aufarbeitung für unterschiedliche
Probenmatrices und Hefearten......................................................................67
VII
Tabellenverzeichnis
Tab. 3.12:
Eignung des Real-Time Consensus-PCR für Hefen in Kombination
mit der erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbeitung für
unterschiedliche Probenmatrices .................................................................68
Tab. 3.13:
Detektionszeit für langsam wachsende Hefen .............................................69
Tab. 3.14:
Detektionszeit in Abhängigkeit von der Hefeart und der
Probenaufarbeitung ........................................................................................70
Tab. 3.15:
Sensitivität bei einer hohen Begleitflora.......................................................71
Tab. 6.1:
Stämme für die Spezifitätstestung der Real-Time PCR für S. cerevisiae
var. diastaticus..............................................................................................110
Tab. 6.2:
Distanz-Matrix: Prozentuale Übereinstimmung der EF-3 Aminosäuresequenzen innerhalb der Unterabteilung der Ascomycota ......................119
Tab. 6.3:
Distanz-Matrix: Prozentuale Übereinstimmung der EF-3 Aminosäuresequenzen innerhalb der Unterabteilung der Basidiomycota ..................124
VIII
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A
Abb.
Acc. No.
AFLP
ATCC
ATP
aw
B
B.
BCD
bp
BSA
Bul.
C
C.
Ci
Cl.
Cr.
c.
CBS
Cp
dATP
dCTP
dGTP
D
D.
Deb.
DEFT
DNA
DNase
dNTP
DSM
dTTP
dUTP
E.
EDTA
ELISA
En.
EPS
et al.
F.
fg
FRET
G
G.
g
xg
GÄ
H.
Hy.
I
I.
Adenin
Abbildung
accession number
amplified fragment length polymorphism
American Type Culture Collection
Adenosintriphosphat
Wasseraktivität
Cytosin, Guanin oder Thymin
Brettanomyces
BIOTECON Diagnostics GmbH (Potsdam, Deutschland)
Basenpaar
bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)
Bullera
Cytosin
Candida
Citeromyces
Clavispora
Cryptococcus
cerevisiae
Centraalbureau voor Schimmelcultures
crossing point
Desoxyadenosintriphosphat
Desoxycytosintriphosphat
Desoxyguanosintriphosphat
Adenin, Guanin oder Thymin
Dekkera
Debaryomyces
direct epifluorescent filter technique
deoxyribonucleic acid (Desoxyribonucleinsäure)
Deoxyribonuclease
Desoxynucleotidtriphosphat; (dATP, dCTP, dGTP und dTTP und/oder dUTP)
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
Desoxytymidintriphosphat
Desoxyuridintriphosphat
Escherichia
Ethylendiamintetraessigsäure
enzyme linked immunosorbant assay
Endomyces
extrazelluläre Polysaccharide
et alii (und andere)
Filobasidiella
Femtogramm (10-15 Gramm)
fluorescence resonance energy transfer
Guanin
Guilliermondella
Gramm
Vielfaches der Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m s-2)
Genomäquivalent
Hanseniaspora
Hyphopichia
Inosin
Issatchenkia
IX
Abkürzungsverzeichnis
IAK
ITS
ISO
K
K.
Ka.
Kap.
KBE
kbp
l
L.
La.
M
M.
Mbp
MEA
min
ml
mM
MPN
mRNA
MUCL
N
NCYC
ng
nm
OD
P.
past.
PCR
pg
pH
PK
R
R.
RAPD
rDNA
RFLP
RNA
RNase
rRNA
RT
S
S.
Sch.
sp.
Sp.
T
T.
Tab.
TBE
TE
TGYA
Tr.
interne Amplifikationskontrolle
internal transcribed spacer
International Organization for Standardization
Guanin oder Thymin
Kluyveromyces
Kazachstania
Kapitel
Koloniebildende Einheiten
Kilobasenpaare (103 Basenpaare)
Liter
Lodderomyces
Lachancea
Adenin oder Cytosin
Metschnikowia
Megabasenpaare (106 bp)
Malzextrakt Agar
Minuten
Milliliter (10-3 Liter)
millimolar (10-3 molar)
most probable number
messenger RNA (Boten-RNA)
Stammnummer der BCCM (Belgian co-ordinated Collection of Microorganisms)
Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin
National Collection of Yeast Cultures
Nanogramm (10-9 Gramm)
Nanometer (10-9 Meter)
optische Dichte
Pichia
pastorianus
polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
Pikogramm (10-12 Gramm)
negativer, dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
Positivkontrolle
Adenin oder Guanin
Rhodotorula
random amplified polymorphic DNA
ribosomale DNA
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen
ribonucleic acid (Ribonucleinsäure)
Ribonuclease
ribosomale RNA
Reverse Transkriptase
Cytosin oder Guanin
Saccharomyces
Schizosaccharomyces
species
Sporidiobolus
Thymin
Torulaspora
Tabelle
Tris-Borat-EDTA-Puffer
Tris-EDTA-Puffer
Trypton Glucose Hefeextrakt Agar
Trichosporon
X
Abkürzungsverzeichnis
Tris
var.
VBNC
VTT
W
X-Gal
Y
Y.
YM
Z.
µg
µl
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
variety (Varietät)
viable but nonculturable
Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus, Kulturstammsammlung (Finnland)
Adenin oder Thymin
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-galactodid
Cytosin oder Thymin
Yarrowia
yeast extract-malt extract
Zygosaccharomyces
Mikrogramm (10-6 Gramm)
Mikroliter (10-6 Liter)
XI
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Real-Time PCR-Systeme zum Nachweis von getränkerelevanten Hefen auf Basis der LightCycler® Technologie mit Hybridisierungssonden entwickelt. Für beide Systeme wurden interne Amplifikationskontrollen und Positivkontrollen
hergestellt und zwei DNA-Extraktionssysteme bereitgestellt.
Ein hoch spezifischer und sensitiver Einzelnachweis für die wichtigste, bierschädliche Saccharomyces Fremdhefe, S. cerevisiae var. diastaticus, wurde entwickelt, indem die sequenziellen Unterschiede zwischen den Glucoamylase kodierenden Genen von S. cerevisiae var.
diastaticus (STA1-3) und S. cerevisiae (SGA1) ausgenutzt wurden. Die hohe Nachweisempfindlichkeit des PCR-Systems von 5 bis 10 GÄ pro Reaktion ermöglichte in Kombination mit
einer schnellen, mechanisch/thermischen Probenaufarbeitung, die sich aus einem Zellaufschluss mit Glaskügelchen, hohen Temperaturen und dem Ionenaustauscher Chelex® 100
zusammensetzte, den Nachweis von 102 bis 103 S. cerevisiae var. diastaticus Zellen/ml bei
einer Hintergrundpopulation von 108 Zellen/ml S. cerevisiae. Die Robustheit des Systems
wurde durch Testung von 66 unterschiedlichen Probenmatrices, von denen sich nur eine als
ungeeignet für das Real-Time PCR-System herausstellte, gezeigt und die Praxistauglichkeit
wurde direkt bei vier Brauereien verifiziert. Der gesamte Assay mit Probenaufarbeitung und
PCR ist innerhalb von 2,5 Stunden durchführbar und damit signifikant schneller als kultivierungsabhängige Methoden.
Die Sequenzierung eines Abschnitts des Gens des Elongationsfaktors 3 (EF-3) von 93 Hefestämmen lieferte die Grundlage für die Entwicklung einer Real-Time Consensus-PCR zum
Nachweis von getränkerelevanten Hefen. Der Nachweis von allen 252 getesteten Hefestämmen wurde bei dem Assay durch degenerierte Primer und Hybridisierungssonden ermöglicht, ohne dass mit DNA von einer der 71 getesteten Bakterien falsch-positive Ergebnisse auftraten. Der Nachweis konnte nicht zur Identifizierung der Hefearten oder -gattungen
eingesetzt werden und die Abgrenzung zu den Schimmelpilzen, die ebenfalls das EF-3 Gen
enthalten, ließ sich nicht zu 100 % erreichen. Die Sensitivität des Systems lag in Abhängigkeit von der Hefeart zwischen 10 und 250 GÄ pro Reaktion und in Kombination mit einer
Erweiterung der mechanisch/thermischen Probenaufarbeitung bei 103 bis 104 Zellen/ml. Bei
sehr niedrig kontaminierten Getränkeproben mit 1 bis 100 Zellen/ml war ein Nachweis nach
zwei bis drei Tagen Flüssiganreicherung in YM-Medium möglich.
XII
1 Einleitung
1
Einleitung
1.1
Getränkerelevante Hefen
Die Anwesenheit von Mikroorganismen in Getränken kann aus drei Gründen für den Menschen von Interesse sein. Das Getränk kann zum einen pathogene Mikroorganismen beherbergen, die bei Aufnahme ein Gesundheitsrisiko für den Menschen darstellen. Zum anderen
können Mikroorganismen zu unerwünschten Veränderungen von Getränken führen, sodass
sie nicht mehr für den Verzehr geeignet sind. Dem gegenüber übernehmen einige Arten entscheidende Prozesse bei der Produktion einer Vielzahl von Getränke, die durch Fermentation hergestellt werden (Fleet 1992).
Hefen sind besonders für ihren positiven Beitrag bei der Herstellung von Getränken bekannt.
Die Gefahr sich über Getränke mit pathogenen Hefearten (Candida albicans, Candida tropicalis oder Cryptococcus neoformans) zu infizieren ist dagegen von untergeordneter Bedeutung (Fleet 1992). Zu den Hefen zählen Pilze aus den Unterabteilungen der Asco- oder Basidiomycota, die einzellig oder mit Pseudohyphen vorliegen können, sich entweder vegetativ
durch Sprossung oder binäre Spaltung reproduzieren oder sexuelle Stadien bilden, die nicht
in Fruchtkörpern eingeschlossen sind (Boekhout und Phaff 2003).
Hefen können als Verderbniserreger von Getränken eine bedeutende Rolle spielen, wobei
hierzu oftmals auch Getränke wie z.B. Bier oder Wein zählen, bei deren Produktion Hefen
beteiligt waren. Visuell erkennbare Beeinträchtigungen wie Trübung und Bodensatzbildung
können dabei durch die gebildete Hefebiomasse hervorgerufen werden. Einige Hefearten
bilden bei ihrem Wachstum Pseudohyphen oder Zellverbände, die in klaren Getränken als
Partikel oder an der Oberfläche von Getränken als Filme sichtbar werden (Kato 1981, Pitt
und Hocking 1997). Die Produktion von extrazellulären, pektolytischen Enzymen kann
Fruchtsäfte ausklären. Sensorische Beeinträchtigungen durch Geruchs- oder Geschmacksveränderungen können durch primäre und sekundäre Stoffwechselendprodukte wie Alkohole, organische Säuren, Aldehyde und Ester entstehen (Weidenbörner 1998). Eine der extremsten, sichtbaren Auswirkungen stellt sicher das Anschwellen oder die Bombage von
Produktverpackungen aufgrund einer starken CO2-Produktion dar (Fleet 1992).
Die Quellen, über die Hefen in Getränke gelangen, sind vielfältig und reichen von den Ausgangssubstanzen, Staub- und Luftkontaminationen, Insekten als Vektoren (z. B. Drosophila
spp.), Flaschenabfüllanlagen, Flaschenverschlüssen (Kronkorken, Korken) bis hin zu mangelhaft gereinigten Flaschen (Back 1994, Deák 1991, Fleet 1992, Mortimer und Polsinelli
1999). Nach Schätzungen sind 95 % aller Kontaminationen von alkoholfreien Getränken mit
Hefen, auf ungenügende Hygiene zurückzuführen (Stratford und James 2003). In der Brauerei wird eine Unterteilung der Kontaminationen in Primärkontaminationen, die im Prozess
1
1 Einleitung
vorkommen wie z. B. Kontaminationen der Anstellhefe, und Sekundärkontaminationen, die
bei der Abfüllung entstehen, vorgenommen (Back 1994, Fleet 1992).
Die Vermehrung von Hefen in einem Habitat hängt entscheidend von vier Parametergruppen
ab. Zu den intrinsischen Parametern zählen die Wasseraktivität (aw-Wert), der pH-Wert, das
Redoxpotential, das Nährstoffangebot und die Konzentration an Konservierungsmitteln. Für
Hefen bestehen teilweise Wachstumsvorteile gegenüber anderen Mikroorganismen, wenn
diese Parameter bestimmte Werte annehmen. Niedrige aw-Werte durch hohe Salz- oder Zuckerkonzentrationen und niedrige pH-Werte können selektiv zu Gunsten von Hefen wirken.
Unter anaeroben oder semi-anaeroben Verhältnissen sind von den bekannten Hefearten ca.
ein Drittel in der Lage, ihren Energiestoffwechsel aufrechtzuerhalten und von aerober Atmung auf Gärung umzustellen (Pasteur Effekt). Auch Resistenzen gegenüber Konservierungsmitteln wie z. B. Benzoesäure, Sorbinsäure oder SO2 oder die direkte Nutzung dieser
Substanzen als Substrat sind bei einigen Arten möglich (Miller 1979, Steels et al. 1999a,
Steels et al. 2000). Von den extrinsischen Parametern sind bei Getränken besonders die
Temperatur und die Atmosphäre für Hefen von Bedeutung. Neben dem Aspekt, dass Hefen
teilweise anaerobe oder semi-anaerobe Verhältnisse tolerieren, können auch Toleranzen
gegenüber erhöhten CO2-Konzentrationen und niedrigen Temperaturen bestehen (Stratford
und James 2003, Steels et al. 1999a). Die Art der Herstellung und Abfüllung von Getränken
beeinflusst entscheidend die Anwesenheit von Hefen. Während vegetative Hefezellen in Abhängigkeit von weiteren Parametern wie pH-Wert, Ethanol-Gehalt und Konzentration an Konservierungsmitteln relativ schnell bei Temperaturen oberhalb von 65 °C abgetötet werden,
werden für Ascosporen wesentlich höhere D-Werte ermittelt (Fleet 1992).
Antagonismus oder Synergismus mit anderen Hefearten oder Mikroorganismen beeinflussen
ebenfalls das Wachstum von Hefen durch z. B. unterschiedliche Wachstumsgeschwindigkeiten, gebildete Endprodukte oder Killertoxine (Deák 1991).
1.1.1
Alkoholfreie Getränke
Die Gruppe der alkoholfreien Getränke, auch Soft-Drinks genannt, beinhaltet unterschiedliche Getränketypen wie Fruchtsäfte, Fruchtnektars, karbonisierte Getränke (Limonaden und
Cola-Limonaden), stille Getränke und Mineralstoffgetränke (isotonische Getränke), die unterschiedliche Anteile an Zusätzen wie Zucker, Frucht- oder Gemüseextrakten enthalten. Getränke wie Fruchtsäfte und -nektars, die in erster Linie aus Fruchtmuttersäften oder Saft- und
Aromakonzentraten hergestellt werden, bieten für ein mikrobielles Wachstum ein ideales
Nährstoffangebot (Weidenbörner 1998). Ein niedriger pH-Wert zwischen 2,5 und 4,5, hervorgerufen durch Fruchtsäuren, selektiert jedoch zu Gunsten von säuretoleranten Mikroorganismen unter ihnen auch einige Hefearten (Back 1994). In Fruchtsaftkonzentraten wachsen
2
1 Einleitung
nahezu ausschließlich Hefen (Weidenbörner 1998). Karbonisierte, alkoholfreie Getränke, die
einen hohen Zuckeranteil, einen niedrigen pH-Wert, eine niedrige Sauerstoffkonzentration
und eine hohe CO2-Konzentration haben, bieten nur einer geringen Zahl an Hefen, Schimmelpilzen und einigen säuretoleranten Bakterien (z. B. Lactobacillus und Acetobacter spp.)
gute Wachstumsbedingungen. Ein hoher CO2-Gehalt hat besonders gegenüber Bakterien
und Schimmelpilzen einen selektierenden Einfluss zugunsten von Hefen (Stratford und James 2003).
Aufgrund ihrer physiologischen Merkmale wurden Hefearten, die in alkoholfreien Getränken
vorkommen, von Davenport (1996) in Gruppen unterschiedlicher Relevanz klassifiziert. Die
wichtigste Gruppe aus obligaten Schadhefen bilden osmotolerante, stark gärfähige und gegenüber Konservierungsmitteln wie z. B. Essigsäure, Sorbinsäure und Benzoesäure resistente Hefearten. Auch in sehr geringer Zahl führen Arten dieser Kategorie in jedem Fall zu
einem Verderb der Produkte, wenn sie ihren Vitaminbedarf decken können (Davenport
1996). Zu den wichtigsten Vertretern dieser Gruppe gehören Arten der Gattungen Saccharomyces, Dekkera (anamorph: Brettanomyces), Zygosaccharomyces und Schizosaccharomyces.
Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces bayanus (Synonym: S. uvarum) sind die am
weitesten verbreiteten Verursacher für den Verderb von karbonisierten und stillen, alkoholfreien Getränken (Back 1999, Back und Anthes 1979). Eine größere Relevanz hat S. exiguus
(anamorph: Candida holmii) in Fruchtsäften und karbonathaltigen Getränken (Stratford und
James 2003).
Schizosaccharomyces pombe ist nicht so weit verbreitet, zeigt aber alle Charakteristika einer
Hefe mit hohem Verderbnispotential wie starke Gasproduktion durch Gärung, Resistenzen
gegenüber Konservierungsstoffen und Osmotoleranz (Davenport 1996). Das Wachstum dieser Art, die sich durch binäre Spaltung vermehrt, ist mit einer Verdoppelungszeit von 4 Stunden sehr langsam und kann zu einem verzögerten Verderb führen (Stratford und James
2003).
Das Wachstum von Dekkera Spezies (anamorph: Brettanomyces) kann besonders aufgrund
ihrer Resistenz gegenüber hohen CO2-Konzentrationen karbonathaltige, alkoholfreie Getränke aber auch Fruchtsäfte durch Geschmacks- und Geruchsveränderungen verderben (Back
und Anthes 1979, Ison und Gutteridge 1987, Sand und van Grinsven 1976, Heresztyn
1986a,b). Die wichtigsten Arten sind D. bruxellensis, D. anomala und D. naardensis (Davenport 1996).
Zu der Gattung Zygosaccharomyces gehören einige Arten, die aufgrund ihrer hohen Gärfähigkeit, Osmotoleranz und Resistenz gegenüber Konservierungsmitteln in hohem Maße zum
Verderb von Getränken führen können. Saure (pH 2,5 bis 5,0) Getränke und Getränke mit
3
1 Einleitung
einem hohen Zuckergehalt (z. B. Fruchtsäfte, Fruchtkonzentrate, Soft-Drinks, Zuckersirup)
sind ein ausgezeichnetes Habitat für diese Gattung. Die Art Z. rouxii kann bei aw-Werten von
0,62 wachsen und besitzt damit die höchste Osmotoleranz aller bekannten Hefearten (Erickson und McKenna 2000). Die Bildung von Filmen auf der Oberfläche von Getränken ist für
diese Gattung beschrieben worden (Kato 1981). Die wichtigsten, verderbniserregenden Arten sind Z. bailii, Z. bisporus, Z. rouxii und Z. mellis, die auch phylogenetisch eine separate
Gruppe innerhalb der Gattung Zygosaccharomyces bilden (Kurtzman und Robnett 1998).
Aber auch die Arten Z. cidri, Z. fermentati, Z. florentinus und Z. microellipsoides können als
Verderbniserreger auftreten, wobei Z. microellipsoides in Soft-Drink Produktionsanlagen weit
verbreitet ist (James und Stratford 2003). Die 1999 neu beschriebene Art Z. lentus ist osmotolerant, resistent gegenüber Konservierungsmitteln und kann außerdem bei niedrigen Temperaturen (z. B. 4 °C) wachsen (Steels et al. 1999a,b).
Opportunistische Verderbniserreger sind nach Davenport (1996) Hefearten, die nur durch
Produktionsfehler wie z. B. Unterdosierung von Konservierungsmitteln, Fehler bei der Pasteurisation, Reinigungsfehler oder Sauerstoffzufuhr während der Produktion von alkoholfreien Getränken auftreten. Zu dieser Gruppe gehören Arten wie Debaryomyces hansenii, Candida parapsilosis, Lodderomyces elongisporus, Hanseniaspora uvarum (anamorph: Kloeckera apiculata), Pichia anomala (=Hansenula anomala) und Pichia membranaefaciens (anamorph: Candida valida). Die thermotolerante Art Candida magnoliae kann konzentrierten
Fruchtsaft verderben (Deák und Beuchat 1993). Pichia membranaefaciens und seltener Pichia farinosa und Pichia fermentans bilden wie Issatchenkia orientalis beim Verderb Filme
auf der Oberfläche der Getränke aus (Back 1987, Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003, Parish und Higgins 1989, Pitt und Hocking 1997).
Eine weitere Gruppe bilden Arten, die reine Hygiene-Indikatoren darstellen und selbst bei
hohen Zellzahlen nicht schädlich für das Produkt sind, deren Anwesenheit aber die Reinigungseffizienz und allgemeine Betriebshygiene anzeigt (Back 1994). Indikatorhefen sind oft
mit obligat schädlichen Hefen vergesellschaftet, sodass deren Nachweis die Rolle einer
Früherkennung hat. Im Bereich der Herstellung von alkoholfreien Getränken werden oft die
Hefearten Candida sake, Candida solani, Candida tropicalis, Clavispora lusitaniae, Cryptococcus albidus, Cryptococcus laurentii, Debaryomyces etchellsii, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa und Trichosporon cutaneum (=Trichosporon beigelii) nachgewiesen
(Back 1999, Davenport 1996).
4
1 Einleitung
1.1.2
Bier
Die hauptsächlich als Bierhefen eingesetzten Stämme gehören zu den Arten Saccharomyces pastorianus (=S. carlsbergensis, untergärige Hefen) und S. cerevisiae (obergärige Hefen), die zusammen mit S. bayanus und S. paradoxus den Saccharomyces sensu stricto
Komplex bilden (Vaughan Martini und Martini 1987a, Vaughan Martini 1989). In geringerem
Ausmaß werden auch Dekkera Arten z. B. in einigen belgischen Bieren und Mischkulturen
mit Milchsäurebakterien (Berliner Weisse) eingesetzt (Back 1994). Die Reinheit dieser Anstellkulturen ist für jede Brauerei von entscheidender Bedeutung, da sich jede Kontamination
in Veränderungen des Fermentationsverhaltens und des Biergeschmacks auswirken kann.
Als Fremdhefen werden in Brauereien alle Hefestämme eingestuft, die nicht bewusst eingesetzt werden. Demnach kann auch jede Brauhefe in einem anderen Brauprozess eine Kontamination darstellen (Dufour et al. 2003). Besonders in Brauereien, die mit unterschiedlichen Hefestämmen zur Produktion von unterschiedlichen Biersorten arbeiten, besteht das
Risiko, eine Brauhefe mit einer charakteristisch anderen Brauhefe zu kontaminieren (Campbell 2002). Für Primärkontaminationen der Kulturhefe und im Unfiltratbereich sind oft Arten
aus dem Saccharomyces sensu stricto Komplex, Saccharomyces exiguus (anamorph: C.
holmii) und Saccharomycodes ludwigii verantwortlich (Back 1994). Geschmacksfehler durch
phenolische Verbindungen, die durch Primärkontaminationen hervorgerufen werden und bis
ins Endprodukt gelangen, können z. B. durch Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus
Stämme verursacht werden, die über ein POF- (phenolic off flavour) Gen verfügen (Dufour et
al. 2003).
Wild- oder Fremdhefen der Gattungen Candida, Pichia (z. B. P. membranaefaciens), Debaryomyces, Hanseniaspora, Issatchenkia, Kluyveromyces, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Cryptococcus, Filobasidium, Rhodotorula und Zygosaccharomyces sind ebenfalls als
Kontaminationen zu finden, sie sind jedoch weniger an die Fermentationsbedingungen angepasst und sind daher für die Produktqualität weniger gefährlich (Barnett et al. 1983, Dufour
et al. 2003). Eine Kontamination des Sauerguts kann besonders durch thermotolerante Arten
wie Kluyveromyces marxianus (=Candida kefyr) oder Candida magnoliae erfolgen (Back
1994). Eine Reihe dieser Hefearten sind als Indikatorkeime wichtig, da sie zwar nicht direkt
bierschädlich sind, ihr Nachweis aber für die Betriebskontrolle wichtige Informationen über
die hygienischen Bedingungen liefert. Debaryomyces hansenii (anamorph: C. famata) kommt
häufig vergesellschaftet mit Bierschädlingen vor, besitzt aber selbst keine ausgeprägte Gärfähigkeit (Back, 1994).
Sekundärkontaminationen von Bier sind aufgrund der selektiven Bedingungen wie anaerobe
Atmosphäre, niedriger pH-Wert, Hopfenbitterstoffe, Alkoholgehalt, Mangel an Nährstoffen
und niedrige Temperaturen nur durch wenige Hefen und Bakterien möglich (Back 1994).
5
1 Einleitung
Neben den eigentlichen Brauhefen können Saccharomyces Arten oder Varietäten des Saccharomyces sensu stricto Komplexes (z. B. S. bayanus, Wildtypen von S. cerevisiae, S. c.
var. cratericus, S. c. var. ellipsoideus und S. c. var. chevalieri) im abgefüllten Bier in Abhängigkeit vom Restnährstoffgehalt wachsen und dadurch zur Trübung, zu Bodensatz, zur Übersättigung mit CO2, zu Geruchs- und Geschmacksveränderungen führen (Back 1994).
Eine obligat bierschädliche Hefe ist S. c. var. diastaticus durch ihre Fähigkeit höhere Dextrine und Stärke, die als Restnährstoffe im Endprodukt Bier vorliegen, über eine extrazelluläre
Glucoamylase zu verwerten (Dufour et al. 2003). Schon sehr geringe Zellzahlen dieser Hefe
können zu einer Übervergärung des Bieres führen (Campbell 2002).
Die Mehrheit der bierschädlichen Hefearten gehört zu der Gattung Saccharomyces. Nur ca.
20-30 % bilden Mitglieder einer anderen Gattung wie z. B. Candida, Dekkera, Pichia, Hanseniaspora, Debaryomyces, Torulaspora (Deák 1991). Wie in alkoholfreien Getränken können
auch im Bier schwach gärfähige Arten der Gattung Dekkera (anamorph: Brettanomyces) bei
ihrem Wachstum durch die Bildung von z. B. Essigestern für Geschmacks- und Geruchsveränderungen sorgen (Heresztyn 1986a,b). Arten wie Pichia anomala (=Hansenula anomala),
Pichia membranaefaciens und Kluyveromyces marxianus (=Candida kefyr) führen im Bier zu
Geschmacksfehlern durch die Bildung von Äthylacetat, flüchtigen Phenolen, Säuren und
Estern. Sie sind jedoch wie einige Candida Arten (z. B. C. boidinii, C. sake, C. intermedia, C.
vini, C. parapsilosis und C. tropicalis) auf Sauerstoff angewiesen und bilden daher beim
Wachstum auf Flüssigkeitsoberflächen Filme aus (Back 1994, Fleet 1992).
1.1.3
Wein
Am Anfang der Weinherstellung wird der Most von einer Mischpopulation unterschiedlicher
Hefearten dominiert, die zu einer spontanen Fermentation führen und je nach Ausmaß das
Endprodukt beeinflussen können. Zu diesen Arten zählen z. B. Metschnikowia pulcherrima,
Zygosaccharomyces sp., Kluyveromyces lactis, Lachancea thermotolerans (=Kluyveromyces
thermotolerans), Saccharomyces exiguus (anamorph: C. holmii), Debaryomyces hansenii
(anamorph: C. famata) Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora sp. (anamorph: Kloeckera
sp.), Issatchenkia orientalis, Pichia sp. (=Hansenula sp.), Cryptococcus albidus und Cryptococcus laurentii (Deák 1991, Back 1994, Dequin et al. 2003). In diesem Stadium der Fermentation ist es schwierig, vorteilhafte und schädliche Aktivitäten der beteiligten Hefen von
einander abzugrenzen. Die Art Hanseniaspora uvarum (anamorph: Kloeckera apiculata) ist
wie Hanseniaspora vineae (anamorph: Kloeckera africana) oft an Weintrauben und im
Weinmost vorhanden und kann durch übermäßige Produktion von Acetat den Weingeschmack negativ beeinflussen (Back 1994, Weidenbörner 2000). Saccharomycodes ludwigii
kann selbst in stark geschwefeltem Most hohe Konzentrationen an Acetaldehyd produzieren
6
1 Einleitung
(Back 1994, Fleet 1992). Dagegen wird die Produktion von 4-Ethylphenol durch Dekkera sp.
(anamorph: Brettanomyces sp.) in Rotwein erst als störend angesehen, wenn eine Konzentration von 620 µg/l überschritten wird (Chatonnet et al. 1992). Konzentrationen unterhalb von
400 µg/l wirken sich dagegen vorteilhaft auf die geschmackliche Komplexität des Weines aus
(Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003). Im weiteren Verlauf der Fermentation selektieren die
Bedingungen wie z. B. die Zugabe von SO2 und die erhöhte Ethanolkonzentration zu Gunsten von S. cerevisiae oder seltener S. bayanus, die zumeist als Starterkulturen zugegeben
werden und die Fermentation abschließen (Fleet et al. 1984, Heard und Fleet 1985, Naumov
et al. 2000).
Nach Abschluss des Fermentationsprozesses ist für die Weinqualität jede weitere Aktivität
von Hefen schädlich (Deák 1991). Die Mehrheit der Hefearten, die für den Verderb von
Wein, der in Fässern und Tanks gelagert wird, verantwortlich sind, gehört zu den filmbildenden, aeroben oder schwach gärfähigen Arten wie C. vini, C. zeylanoides, C. rugosa, I. orientalis, P. anomala und P. membranaefaciens (Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003, Minárik
1981). In Fässern gealterter Rotwein ist ein klassisches Habitat für die Gattung Dekkera (anamorph: Brettanomyces), die große Mengen Acetat durch die Oxidation von Ethanol bilden
kann (Back 1987). Selbst in Sherry, der mit mehr als 15 % Ethanol ein sehr ungeeignetes
Habitat für die meisten Mikroorganismen darstellt, kann die Art D. bruxellensis wachsen (Ibeas et al. 1996). Neben den genannten Arten sind außerdem für den Verderb von Weinen,
die nach GMP (good manufacturing practice) produziert und verpackt wurden, die ethanoltoleranten Stämme der Hefearten Z. bailii und S. cerevisiae besonders gefährlich (Fleet 1992,
Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003).
1.2
Nachweis und Identifizierung von getränkerelevanten Hefen
Für die Qualitätskontrolle und die Qualitätssicherung in der Getränkeindustrie sind möglichst
schnelle und zuverlässige Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von Hefen notwendig, um die mikrobielle Stabilität der Endprodukte sicherzustellen. Die Sensitivität dieser
Methoden muss so hoch sein, dass z. B. eine Zelle in 100 ml Wein nachweisbar ist (Loureiro
und Malfeito-Ferreira 2003). Je schneller die Ergebnisse für die mikrobiologischen Untersuchungen vorliegen, desto aktiver und schneller kann im Herstellungsprozess reagiert werden
oder die Auslieferung der Produkte erfolgen. Eine genaue Identifizierung der detektierten
Hefen bietet, neben der Möglichkeit deren Schädlichkeitspotential zu beurteilen, auch die
Möglichkeit eine Kontamination bis zu ihrem Ursprung zu verfolgen und damit Verbesserungen des Produktionsablaufes einzuleiten (van der Vossen und Hofstra 1996). Eine große
Anzahl an unterschiedlichen Methoden steht für diese Zwecke zur Verfügung, um Hefen auf-
7
1 Einleitung
grund von phänotypischen oder genotypischen Merkmalen zu detektieren und/oder zu identifizieren.
1.2.1
Kultivierungsabhängiger Nachweis
Klassische, mikrobiologische Methoden zum Nachweis von Hefen basieren auf der Kultivierung und Anreicherung von Hefen mit festen oder flüssigen Nährmedien, nachdem von der
Ursprungsprobe eine geeignete Verdünnungsreihe hergestellt wurde. Zur Verdünnung, die
üblicherweise dekadisch im 1:10 Verhältnis vorgenommen wird, werden Medien wie Peptonwasser (0,1 %), Salzlösungen (0,85 %), Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) oder Mischungen
dieser Komponenten verwendet. Die Kultivierung erfolgt normalerweise bei Temperaturen
zwischen 25 und 28 °C für 5 Tage, kann jedoch bei langsam wachsenden Arten (Z. bailii,
D./B. bruxellensis) auch bis zu 14 Tage in Anspruch nehmen (Deák 1991, Millet und Lonvaud-Funel 2000, Rodrigues et al. 2001).
Eine große Anzahl an unterschiedlichen, komplexen, nährstoffreichen und unselektiven Medien wird verwendet, die Zucker als Energiequelle (z. B. Glucose, Fructose, Sucrose), verdaute Proteine als Stickstoffquelle (z. B. Pepton, Trypton, Casein) und komplexe Zusätze
(z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt) enthalten (Loureiro und Malfeito-Ferreira 2003). Im Idealfall
sollten die Medien den Nährstoffansprüchen möglichst aller relevanten Hefen genügen, das
Wachstum von geschädigten Hefen unterstützen, Bakterienwachstum unterdrücken und ein
Überwachsen von Schimmelpilzen vermeiden (Fleet 1992). Oft ist jedoch auch nur der summarische Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen erforderlich (Anonymus 1987, Deák
2003). Einige der wichtigsten Universalmedien sind der Glucose-Hefeextrakt Agar (GYE),
der Plate-Count Agar (PCA), der Trypton-Glucose-Hefeextrakt Agar (TGYA), der KartoffelDextrose Agar (PDA), der Malzextrakt Agar (MEA) der Hefeextrakt-Malzextrakt Agar (YMA
oder MYGPA), der Hefeextrakt-Pepton-Glucose Agar (YPGA) und der Sabouraud-Dextrose
Agar (SDA).
Das Bakterienwachstum wird entweder durch den Zusatz von Antibiotika (z. B. Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Chloramphenicol, Gentamycin oder Streptomycin) oder durch Absenkung des pH Wertes auf 3,5 unterdrückt, wobei die Verwendung von Antibiotika bevorzugt
wird, da die Wiederfindungsrate höher ist (Beuchat 1979, Cava und Hernandez 1994). Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol Agar (YGCA) wird als ISO-Standardmedium empfohlen
(Anonymus 1987). Falls das Wachstum von Schimmelpilzen, die eine Agarplatte komplett
überwachsen können, problematisch ist, werden Zusätze wie z. B. Bengalrot, Dichloran und
Natrium- oder Kaliumpropionat zu dem Medium gegeben (Henson 1981, King et al. 1979).
Dichloran-Bengalrot-Chloramphenicol Agar (DRBC) ist ein oft verwendetes Medium, das
sowohl Bakterien als auch Schimmelpilze inhibiert. Beim Einsatz dieser Medien ist zu be-
8
1 Einleitung
rücksichtigen, dass deren Zusammensetzung auch das Wachstum von Hefen negativ beeinflussen kann (Banks und Board 1987, Chilvers et al. 1999).
Neben den Universalmedien werden selektive Medien eingesetzt, die auf die Ansprüche eines Industriezweiges (z. B. Brauereien, Winzereien) oder der nachzuweisenden Hefearten
(z. B. D. bruxellensis) abgestimmt sind. In Brauereien werden selektive Medien verwendet,
um Fremdhefen in sämtlichen Bereichen des Produktionsprozesses nachweisen zu können.
Ein Nachweis muss hier teilweise so selektiv sein, dass nicht nur Fremdhefen der Gattungen
Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Pichia, Torulaspora oder Zygosaccharomyces,
sondern auch als Fremdhefen eingeordnete S. cerevisiae Varietäten, die sich von der Brauhefe nur in wenigen Eigenschaften unterscheiden, nachzuweisen sind (Back 1987). Außerdem muss der Nachweis nicht nur selektiv, sondern auch sehr sensitiv sein, wenn sehr geringe Zellzahlen einer Fremdhefe in der Anstellhefe detektiert werden müssen. Eine Reihe
von selektiven Medien wurde entwickelt, da kein einzelnes Medium für den Nachweis aller
Kontaminationen geeignet ist. Die Selektivität wird dabei durch Zugabe von für S. cerevisiae
inhibierenden Substanzen (Kupfersulfat, Cycloheximid, Fuchsinsulfit), von Nährstoffen, die
von S. cerevisiae nicht verwertet werden (Lysin, Nitrat, Xylose, Dextrin), durch Farbstoffe
(Kristallviolett, Bromkresolgrün), durch Inkubation bei 37 °C oder durch eine Kombination
dieser Bedingungen erreicht. (Deák 1991, Back 1994).
Für osmotolerante Hefen wie z. B. Z. rouxii werden Verdünnungslösungen und Medien mit
hohen, prozentualen Anteilen an Glucose, Glycerol oder Sucrose verwendet, die eine verminderte Wasseraktivität aufweisen und die Zellen vor einem osmotischen Schock bewahren
(Beuchat und Hocking 1990). Medien wie z. B. Dichloran-18 % Glycerol Agar (DG18), Malzextrakt-Hefeextrakt Agar mit 30 % Glucose (MY30G), Plate-Count Agar mit 52 % Sucrose
oder Trypton-Hefeextrakt Agar mit 10 % Glucose (TY10G) können in Kombination mit Verdünnungslösungen wie z. B. 40 % Glucose oder 30 % Glycerol verwendet werden, um osmotolerante Hefen in konzentrierten Produkten (z. B. Saftkonzentrate) nachzuweisen (Andrews et al. 1997, Beuchat et al. 1998, Hocking und Pitt 1980). Ein weiterer in diesem Bereich
eingesetzter Agar ist der Orangenfruchtsaftagar (Back 1999).
Hefen wie z. B. Zygosaccharomyces bailii, Pichia membranaefaciens und Schizosaccharomyces pombe, die Resistenzen gegen Säuren und Konservierungsmittel aufweisen, können
mit angesäuerten Universalmedien wie MEA oder TGYA selektiv nachgewiesen werden (Hocking 1996).
Als Techniken kommen sowohl das Plattengussverfahren als auch das Oberflächenverfahren mit Spatel oder Spiralplater zum Einsatz. Vergleiche der beiden Techniken zeigten, dass
das Oberflächenverfahren zu höheren Zellzahlen führt, da beim Plattengussverfahren höhere
Temperaturen (ca. 45 °C) eingesetzt werden, die zu einem Hitzestress bei Hefen führen kön-
9
1 Einleitung
nen (Deák 2003). Die Sensitivität des Oberflächenverfahrens ist dagegen durch das geringere, einsetzbare Probenvolumen von normalerweise 0,1 ml gegenüber dem beim Plattengussverfahren eingesetzten 1,0 ml vermindert. Wenn die initiale Zellzahl sehr klein ist, können demnach Hefen bei Anwendung des Oberflächenverfahrens unentdeckt bleiben (Deák
1991). Dies kann besonders bei Hefen wie z. B. Z. bailii problematisch sein, die schon bei
sehr geringen Zellzahlen Produkte schädigen können. Schon das Inokulum von einer Zelle
Z. bailii kann eine Dose mit karbonathaltigem Soft-Drink verderben (Pitt und Hocking 1997,
Davenport 1996). Solche geringen Inokula können entweder durch Anwendung von Membranfiltern mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm oder durch Voranreicherung in geeigneten, flüssigen Nährmedien vor dem Gebrauch von festen Nährmedien detektiert werden (Pitt
und Hocking 1997).
Eine weitere klassische, kultivierungsabhängige Methode ist die „most probable number“
(MPN) Technik, die in Kombination mit selektiven Medien zur Bestimmung von Hefearten
eingesetzt werden kann, die nur einen geringen prozentualen Anteil an einer Gesamtpopulation haben (Rodrigues et al. 2001).
Die routinemäßige Detektion und Quantifizierung von Hefen über Koloniebildende Einheiten
(KBE) ist einfach, günstig und allgemein akzeptiert. Nachteile der kultivierungsabhängigen
Methoden sind jedoch in dem hohen Arbeitsaufwand, der geringen Reproduzierbarkeit und
der langsamen Datengenerierung, die mindestens drei bis fünf Tage Kultivierung benötigt, zu
sehen. Die erhaltenen Daten sind demnach für eine Qualitäts- und Prozesskontrolle nur eingeschränkt verwendbar (Deák 1995). Mit weiterentwickelten Methoden wie dem ISO-GRID®
Membranfiltrationssystem, das die Membranfiltration mit der MPN Technik verbindet, lässt
sich die benötigte Zeit bis zum Ergebnis auf zwei Tage reduzieren (Entis und Lerner 1996).
Auch die Anwendung von Petrifilm® YM Platten [3M Microbiology] oder SimPlate® YM Platten
[Biocontrol Systems] liefert in kürzerer Zeit vergleichbare Ergebnisse wie die Verwendung
konventioneller Nährmedien (Beuchat et al. 1990 und 1991, Ferrati et al. 2005, Vlaemynck
1994).
1.2.2
Mikroskopie, Durchflusszytometrie und Immunoassay
Neben den kultivierungsabhängigen Methoden wird seit langem die Mikroskopie zur direkten
Quantifizierung von Hefen verwendet, wobei in Kombination mit einer Anfärbung mit Methylenblau eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen möglich ist (Back 1994,
Smart et al. 1999). Die Lebensfähigkeit von Hefezellen lässt sich auch sehr präzise mit Methoden der Epifluoreszenzmikroskopie, die auf der Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen wie
z. B. Acridinorange beruhen, ermitteln (Back 1994, Betts et al. 1989). In Kombination mit der
Membranfiltration ist diese als „direct epifluorescent filter technique“ (DEFT) bekannte Me-
10
1 Einleitung
thode sehr effizient bei der Detektion von Hefen in Bier, Wein oder karbonathaltigen Getränken (Hope und Tubb 1985, Rodrigues und Kroll 1986). Ein Nachteil der mikroskopischen
Techniken stellt die eingeschränkte Sensitivität dar, die bei der DEFT bei 103 Zellen/ml liegt,
jedoch bei filtrierbaren Proben wie Bier und Wein durch Filtration von größeren Volumina
leicht zu erreichen ist. Eine Automatisierung ist durch die Kopplung mit einem Bildauswertungssystem möglich (Pettipher et al. 1992). Die Fluoreszenz In Situ Hybridisierung, die ebenfalls auf der Detektion durch Epifluoreszenzmikroskopie beruht, wurde zum Nachweis
von D. bruxellensis (anamorph: B. bruxellensis) angewendet (Stender et al. 2001). Der Test
beruht auf fluorescein-markierten „peptide nucleic acid“ Sonden, die mit einem artspezifischen Sequenzbereich der 26 S rRNA hybridisieren.
Die Durchflusszytometrie ist eine effektive Methode zur schnellen Zellzahlbestimmung (15
bis 30 min) von Hefen in Bier (Jespersen et al. 1993). Eine Differenzierung zwischen Hefen,
Pilzen und Bakterien ist möglich und in Kombination mit Fluoreszenzsonden können Aussagen über die Lebensfähigkeit der Zellen gemacht werden (Deere et al. 1998, Millard et al.
1997).
Eine weitere Möglichkeit, um z. B. Fremdhefen in obergäriger Anstellhefe zu detektieren,
bietet die Immunofluoreszenzmethode, bei der fluoreszenzmarkierte Antikörper spezifisch an
Antigene auf der Oberflächen von Hefen binden und mit der Epifluoreszenzmikroskopie
nachweisbar sind (Campbell 2002). Eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen ist jedoch mit dieser Methode nicht möglich. Einige weitere Immunoassays zur Detektion
von Hefearten sind beschrieben worden, die mit polyklonalen Antikörpern extrazelluläre Polysaccharide (EPS) oder lebende Hefezellen mit der ELISA (enzyme linked immunosorbant
assay) Technik nachweisen (García et al. 2004, Marcilla et al. 1999, Middelhoven und Notermans 1988 und 1993, Yoshida et al. 1991). Der Nachweis über EPS war jedoch nicht
spezifisch genug und die Produktion der EPS zu sehr von den jeweiligen Wachstumsbedingungen abhängig, um für eine Anwendung in der Lebensmittelindustrie geeignet zu sein
(Middelhoven und Notermans 1988 und 1993). Mit polyklonalen Antikörpern, die gegen lebende Zellen gerichtet waren, wurden höchstens 104 bis 105 KBE/ml in Orangensaft oder
Milch nachgewiesen (García et al. 2004, Yoshida et al. 1991). Die Spezifität der Systeme
war immer eingeschränkt auf einige wenige, für das jeweilige Lebensmittel relevante Arten,
die nicht alle gleich sensitiv nachzuweisen waren. Ein weiteres ELISA-System wurde für den
Nachweis von Brettanomyces-Kontaminationen in Wein beschrieben (Kuniyuki et al. 1984).
11
1 Einleitung
1.2.3
Elektrometrische Methoden und ATP-Messung
Mikroorganismen verändern durch ihr Wachstum die elektrischen Eigenschaften (Kapazität,
Leitfähigkeit und Impedanz) ihrer Umgebung. Diese Veränderungen können elektronisch
gemessen werden und die Detektionszeit, als die Zeit bis diese Veränderung messbar wird,
ist direkt proportional zu der mikrobiellen Ausgangspopulation (Fleet 1992, Deák und Beuchat 1994). Wenn diese Methode gegen eine konventionelle, kultivierungsabhängige Methode kalibriert wurde, kann sie zur Bestimmung der Zellzahl genutzt werden (Deák 1995). Verglichen mit der Ermittlung der KBE verringert sich mit dieser Methode, die auch leichter zu
automatisieren ist, der Zeitaufwand auf 10 bis 30 % (Deák 1995). Die Entwicklung von selektiven Medien, die das Wachstum von Bakterien unterdrücken und den Probenmatrices angepasst wurden, ermöglicht den Nachweis von 102 bis 103 Hefezellen/ml nach 12 bis 24 Stunden (Connolly et al. 1988, Schaertel et al. 1987, Watson-Craik et al. 1990, Zindulus 1984).
Durch die indirekte Messung der Leitfähigkeit, bei der die produzierte CO2-Menge nach Absorption in einer alkalischen Lösung gemessen wird, kann die Methode unabhängig vom
Wachstumsmedium eingesetzt werden (Deák und Beuchat 1994). Zur Anwendung kam die
Impedanz Methode bereits zur Überwachung von unterschiedlichen Probenmatrices wie Orangensaftkonzentrat (Weihe et al. 1984), Wein (Henschke und Thomas 1988) und Bier (Evans 1982).
Die ATP-Messung über Biolumineszenz ist eine schnelle und sensitive Methode, da unter
optimalen Bedingungen 10 Zellen/ml innerhalb von 5 Minuten nachweisbar sind (Fleet 1992).
Besonders für Bereiche der Getränkeindustrie wie die Herstellung von Bier und karbonathaltigen Getränken ist die Methode als Summenparameter zur Überwachung geeignet (Hope
und Tubb 1985, Hysert et al. 1976, La Rocco et al. 1985, Miller und Galston 1989). Wenn die
Filtration von Endprodukten (z. B. Bier) über Membranfilter möglich ist, kann die Sensitivität
noch in den Bereich von einigen Zellen pro Liter verbessert werden (Takahashi et al. 2000).
Eine Differenzierung zwischen Bakterien, Hefen und Pilzen ist mit dieser Methode jedoch
nicht möglich, da alle lebenden Mikroorganismen ATP enthalten. Auch können falschpositive Ergebnisse durch die benutzten Filter, Medien und das Endprodukt auftreten. Daher
hat diese Methode in der Lebensmittelindustrie den Stellenwert einer universellen Hygieneüberwachung z. B. bei der Überprüfung der Reinigungseffektivität und der Sterilitätskontrolle
von Lebensmitteln (Fleet 1992, Hawronskyj und Holah 1997, Krämer 1997).
12
1 Einleitung
1.2.4
Phänotypische Identifizierung
Methoden zur Identifizierung können in der Praxis nicht nur angewendet werden, um zwischen Hefearten zu differenzieren und die relevante Spezies, die für den Verderb verantwortlich ist, zu erkennen, sondern auch, um den Ausgangspunkt für den Verderb in einer Produktionslinie auszumachen (van der Vossen und Hofstra 1996). Typischerweise benötigt man
zur Identifizierung von Reinkulturen über phänotypische Merkmale 50 bis 100 Tests, um genügend morphologische, physiologische und biochemische Charakteristika zur sicheren,
taxonomischen Einordnung zu erhalten. Diese Prozedur ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig,
benötigt ein besonderes Maß an Erfahrung und kann aufgrund der Instabilität von physiologischen Merkmalen, zu unklaren Ergebnissen führen (Deák 1995, Scheda und Yarrow
1966). Einige kommerziell erhältliche Hefeidentifizierungssysteme (wie z. B. API 20C, API ID
32C [BioMerieux] oder Biolog MicroLog YT Station [Biolog]) können diesen Aufwand minimieren, sind allerdings für den Bereich der Getränkeindustrie nur begrenzt einsetzbar (Török
und King 1991). Die Saccharomyces sensu stricto Gruppe lässt sich z. B. nicht differenzieren
oder Z. bailii von Z. bisporus unterscheiden (Baleiras Couto et al. 1996b).
1.2.5
Konventionelle, PCR-basierte Methoden
Die Bemühungen, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Nachweisen und Identifizierungen zu erhöhen, führten in den letzten Jahren in zunehmendem Maße zur Nutzung genotypischer Differenzierungsmerkmale. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben dies durch
die Entwicklung einer großen Anzahl an DNA- und RNA-basierten Methoden für die Identifizierung und Charakterisierung ermöglicht. Unterschiede der genomischen DNA, der rRNA
oder der Mitochondrien-DNA von Hefen können mit Hilfe der DNA-DNA Hybridisierung (Török et al. 1993, Vaughan Martini und Martini 1987b), der Dot Blot Hybridisierung mit Oligonucleotid-Sonden (Kosse et al. 1997), der Restriktionsenzym Analyse, der Puls-FeldGelelektrophorese (Vezinhet et al. 1990, Guillamón et al. 1996), des RestriktionsfragmentLängenpolymorphismus (RFLP) (Belloch et al. 1997, Guillamón et al. 1994, 1997, Versavaud
und Hallet 1995), des DNA-Fingerprinting und der DNA-Sequenzierung (Kurtzman und Robnett 1998) bestimmt werden. Für die Anwendbarkeit in der Routine der Lebensmittelindustrie
sind diese Methoden jedoch zu arbeitsaufwändig und zeitintensiv (van Vossen und Hofstra
1996).
Eine Weiterentwicklung bei den molekularbiologischen Methoden in Bezug auf Zeit- und Arbeitsaufwand konnte durch die Einbeziehung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die von
Kary Mullis 1983 erdacht und von Saiki et al. (1985) zuerst angewandt wurde, erzielt werden.
Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird ein spezifisches DNA-Fragment über einen
13
1 Einleitung
enzymatischen Prozess, der von einem Temperaturzyklus abhängig ist, amplifiziert. Dabei
wird die DNA zunächst in einem ersten Schritt (Denaturierungsschritt) bei hoher Temperatur
(z. B. 95 °C) denaturiert, sodass zwei spezifische Oligonucleotide als Primer mit den komplementären Strängen hybridisieren können. Diese Oligonucleotide sind so angeordnet, dass
sie das zu amplifizierende DNA-Fragment einschließen. Damit die Hybridisierung (Annealingschritt) stattfindet, wird die Temperatur in einem zweiten Schritt auf die so genannte Annealingtemperatur abgesengt, die unterhalb der Schmelztemperatur der Oligonucleotide
liegt. Abschließend verlängert eine thermostabile DNA-Polymerase, nachdem die optimale
Temperatur für dieses Enzym eingestellt wurde, die Oligonucleotide (Elongationsschritt). Als
Resultat wird die DNA zwischen den beiden Oligonucleotiden verdoppelt. Wird das dreistufige Temperaturprofil mehrere Male wiederholt, kann das DNA-Fragment zwischen den Oligonucleotiden exponentiell amplifiziert werden (Saiki et al. 1988). Im Gegensatz zu konventionellen Methoden können hiermit Proben direkt getestet werden, ohne dass eine Kultivierung
nötig ist. Außerdem sind PCR-Methoden schnell, sehr spezifisch und können zum Nachweis
von sehr geringen DNA-Mengen verwendet werden (Atkins und Clark 2004, van der Vossen
und Hofstra 1996). Die einzelnen PCR-abhängigen Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von Hefen unterscheiden sich in der Spezifität der Primer, der Stringenz der PCRBedingungen, der weiteren Behandlung der Amplifikate und der Detektionsmethode für die
Amplifikate.
Die DNA-Zielregion, die neben taxonomischen Untersuchungen auch zur Entwicklung von
Nachweis- und Identifizierungssystemen für Hefen am häufigsten eingesetzt wird, ist das in
allen Hefen in hoher Kopienzahl vorhandene, ribosomale Gen-Cluster, das aus den Genen
für die 26 S, 18 S, 5,8 S rRNA und teilweise auch 5 S rRNA und deren ITS- (internal transcribed spacer 1 und 2) Regionen besteht (Kurtzman 1994, White et al. 1990). Diese Region
weist sowohl hoch konservierte als auch hoch variable Bereiche auf, sodass unterschiedlich
spezifische PCR-Primer abgeleitet werden können. Die Amplifikation und anschließende
Sequenzierung der D1/D2 Region der 26 S rDNA mit universalen Primern scheint, eine zuverlässige Methode zur Arttypisierung von Hefen der Unterabteilung Ascomycota zu sein
(Kurtzman und Robnett 1998). Die Mehrheit der Hefen der Unterabteilung Basidiomycota
lässt sich ebenfalls über die Sequenz der D1/D2 Region identifizieren und die Variabilität der
ITS1- oder der ITS2-Region scheint, zur Differenzierung zwischen phylogenetisch nah verwandten Arten geeignet zu sein (Fell et al. 2000, Scorzetti et al. 2002). Klinisch relevante
Hefen konnten allein aufgrund der Längenpolymorphismen der gebildeten PCR-Produkte der
ITS1- und ITS2-Regionen identifiziert werden (Chen et al. 2001, Turenne et al. 1999).
Auch wenn die Mehrzahl der PCR-Systeme besonders im klinischen Bereich die ribosomalen Gene als Target nutzt, wurden auch gattungs-, art- und stammspezifische Systeme für
14
1 Einleitung
andere Zielregionen entwickelt. Ein Beispiel für eine gattungsspezifische PCR ist das System
von Yamagishi et al. (1999), bei dem das FLO1 Gen nur bei Arten der Gattung Saccharomyces vervielfältigt wird. Der stammspezifische Nachweis von Saccharomyces cerevisiae var.
diastaticus war mit den STA1-3 Genen als Targetregion möglich (Yamauchi et al. 1998).
Falls mit einem einzelnen Primerpaar keine ausreichende Spezifität erreicht wird, kann der
Einsatz einer Nested-PCR sinnvoll sein, die auch sensitiver ist (Atkins und Clark 2004). Bei
dieser Methode wird nach der ersten PCR mit dem dabei erhaltenen Fragment als Target
eine zweite PCR durchgeführt. Bei dieser zweiten PCR wird ein Primerpaar verwendet, das
komplementär zu einer innerhalb des ersten Produktes liegenden Sequenz ist. Ibeas et al.
(1996) konnten eine Nested-PCR zur Detektion von Dekkera sp. in Sherry entwickeln. Verschiedene PCR-Systeme können zu einer so genannten Multiplex-PCR kombiniert werden,
um in einer Probe das Vorhandensein von unterschiedlichen Arten simultan zu prüfen. Eine
Differenzierung zwischen S. cerevisiae, S. bayanus und deren Hybriden, die wichtig im Bereich der Wein- und Bierherstellung sein kann, war durch eine Multiplex-PCR ebenso möglich (Torriani et al. 2004) wie die Unterscheidung zwischen S. cerevisiae, Z. bailii und Z. rouxii (Pearson und McKee 1992).
Weitere Möglichkeiten, ohne Sequenzierung Polymorphismen im Genotyp aufzudecken, bieten die RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA-PCR) und das PCR-Fingerprinting.
Die RAPD-PCR beruht auf der Nutzung von kurzen Primern aus 5 bis 15 Nucleotiden, mit
willkürlichen Sequenzen, die bei niedrigen Annealingtemperaturen (z. B. 36 °C) angewendet
werden und mit zufällig im Genom verteilten, homologen Sequenzen hybridisieren. Balairas
Couto et al. (1995) konnten mit der Methode zwischen einigen für Verderbnis relevanten
Hefearten wie z. B. Z. bailii, Z. rouxii und S. cerevisiae differenzieren und Xufre et al. (2000)
konnten sie zur Differenzierung von Saccharomyces sp. in einer Winzerei anwenden. Das
PCR-Fingerprinting ist im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit robuster als die RAPD-PCR,
da höhere Annealingtemperaturen verwendet werden (van der Vossen und Hofstra 1996).
Diese Methode konnte unter Verwendung von Mikrosatelliten-Primern wie z. B. (GTG)5,
(GAC)5, (GACA)4, der M13 Sequenz (GAGGGTGGCGGTTCT) und anderen sich wiederholenden DNA-Sequenzen zur Identifizierung von Hefen bis zur Spezies- oder Subspeziesebene verwendet werden (Baleiras Couto et al. 1996a,b, de Barros Lopes et al. 1998, Hierro et
al. 2004, Lavallee et al. 1994, Lieckfieldt et al. 1993, Meyer et al. 1993).
Bei der Kombination aus PCR und RFLP werden die PCR-Produkte mit Restriktionsendonucleasen geschnitten, um ein charakteristisches Restriktionsmuster zu erhalten. Diese Methode wurde besonders auf rDNA und deren ITS-Regionen angewendet, um Differenzierungen auf Subspezies oder Stammebene zu ermöglichen (Baleiras Couto et al. 1995, Molina et
al. 1993, Niesters et al. 1993, Vilgalys und Hester 1990). Mit einer PCR-RFLP, die die Regi-
15
1 Einleitung
on zwischen den 5 S und 26 S rRNA Genen als Target hatte, war eine Differenzierung zwischen Brauereihefen und Fremdhefen sogar zu sehr nah verwandten Stämmen wie S. cerevisiae var. diastaticus möglich (Yamagishi et al. 1999).
Eine weitere DNA-Fingerprinting Methode ist die AFLP- („amplified fragment length polymorphism“) Technik, bei der Restriktionsfragmente der gesamten, genomischen DNA nach
einem Ligationsschritt selektiv mit Primern amplifiziert werden, die am 3´-Ende spezifisch für
die Restriktionsschnittstelle sind (Vos et al. 1995). Diese Methode konnte erfolgreich zur Unterscheidung von Hefestämmen und zur Artidentifizierung von Hefeisolaten eingesetzt werden (de Barros Lopes et al. 1999, Perpète et al. 2001).
Eine PCR-Technik, die potentiell zum Nachweis und zur Differenzierung zwischen lebenden
und toten Zellen geeignet ist, ist die Umkehrtranskriptions-PCR oder Reverse TranskriptasePCR (RT-PCR). Das Targetmolekül ist hierbei mRNA, die in einem ersten Schritt mit einer
Reverse Transkriptase (RTase) in DNA umgeschrieben und in einem zweiten Schritt durch
eine PCR amplifiziert wird. Die Differenzierung zwischen lebensfähigen, lebensfähigen aber
nicht kultivierbaren („viable but nonculturable“, VBNC) und toten Zellen erfolgt unter der Annahme, dass die Halbwertszeit der mRNA sehr kurz ist und daher nach dem Tod einer Zelle
sehr schnell nicht mehr nachzuweisen ist (Sheridan et al. 1998). Von Vaitilingom et al. 1998
wurde eine RT-PCR zur Detektion von lebensfähigen Bakterien, Schimmelpilzen und Hefen
in pasteurisierter Milch mit Primern entwickelt, die spezifisch für Gene der Elongationsfaktoren EF-Tu und EF-1α sind.
Bei allen bisher erwähnten PCR-Methoden erfolgt nach der Amplifikation eine elektrophoretische Auftrennung der Amplifikate der Länge nach in Agarose- oder Polyacrylamidgelen. Der
Nachweis der Amplifikate kann dann in einem letzten Schritt mit unterschiedlichen Methoden
detektiert werden, wobei hier nur die Möglichkeiten der Bindung von unspezifischen Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. Ethidiumbromid), die Markierung der in der PCR eingesetzten Oligonucleotide mit radioaktiven/fluoreszierenden Nucleotiden oder die Hybridisierung der Amplifikate mit radioaktiven/fluoreszierenden Oligonucleotiden (Southern Blot) genannt werden
sollen. Auch der colorimetrische Nachweis von PCR-Produkten der ITS-Regionen von hefeartigen Pilzen über Enzym-Immunoassays wurde erfolgreich zur Identifizierung verwendet
(Lindsley et al. 2001).
16
1 Einleitung
1.2.6
Real-Time PCR-Methoden
Trotz der wesentlichen Erleichterungen in der täglichen Laborarbeit, die die verhältnismäßig
leicht zu automatisierende Methode der PCR mit sich gebracht hat, bedeutet der sensitive,
reproduzierbare und spezifische Nachweis der PCR-Produkte noch immer einen hohen Zeitund Arbeitsaufwand. Um das Automatisierungsniveau der PCR zu erhöhen und nicht nur
qualitative sondern auch quantitative Aussagen zu ermöglichen, wurde ein so genanntes
homogenes Assay entwickelt, bei dem die Amplifikation und der Nachweis des PCRProduktes simultan in einem Reaktionsgefäß möglich ist. Dies gelang erstmals 1993 durch
die Weiterentwicklung des 1991 von Holland et al. beschriebenen 5´-Nuclease PCR-Assays
unter Ausnutzung der 5´-Exonukleaseaktivität der Taq DNA-Polymerase und Einbeziehung
von fluorogenen Sonden zur Detektion der Amplifikation (Lee et al. 1993). Die fluorogenen
Sonden dieses so genannten TaqMan™ PCR-Systems sind am 5´-Ende mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff und am 3´-Ende mit einem Quencher-Farbstoff markiert. Der
Quencher-Farbstoff nimmt zunächst über einen Fluoreszenz- (oder Förster-) ResonanzEnergie-Transfer (FRET) die Absorptionsenergie des Reporter-Farbstoffs auf und unterdrückt damit dessen Fluoreszenz. Während der PCR hybridisiert die Sonde zusammen mit
den Primern an den Amplifikaten und in der Extensionsphase wird die Sonde durch die 5´-3´Exonuklease Aktivität der Taq DNA-Polymerase hydrolysiert. Dadurch werden die räumliche
Nähe und damit auch der FRET zwischen Reporter und Quencher unterbrochen. Entsprechend der Akkumulation von PCR-Produkten steigt die Fluoreszenz durch freie Reportermoleküle mit jedem PCR-Zyklus an und kann mit einem geeigneten Detektionssystem während
der Amplifikation gemessen werden.
Neben dem TaqMan™-System existieren eine Reihe von weiteren Varianten der so genannten Real-Time PCR wie das Molecular-Beacons-System, das Scorpions™-System und das
Hybridisierungssonden-System, die alle auf unterschiedliche Weise den FRET zwischen
Fluoreszenzfarbstoffen ausnutzen, die sich in ihren Spektren überlagern (Caplin et al. 1999,
Tyagi und Kramer 1996, Whitcombe et al. 1999). Für das Nachweissystem mit Hybridisierungssonden sind zwei fluoreszenzmarkierte Sonden notwendig, die zusammen mit den
Primern an die Amplifikate hybridisieren und dadurch in räumliche Nähe gebracht werden.
Nach Anregung des so genannten Donator-Farbstoffes der einen Sonde mit Licht einer bestimmten Wellenlänge kann diese Energie über einen FRET auf den Reporter-Farbstoff der
anderen Sonde übertragen werden. Der Repoter-Farbstoff emittiert dann die übertragene
Energie als Licht einer bestimmten Wellenlänge, die zur Online-Verfolgung der Amplifikation
gemessen wird.
Eine sequenzunabhängige Detektion von Amplifikaten ist mit Fluoreszenzfarbstoffen wie
SYBR®-Green I möglich, die unspezifisch besonders bei doppelsträngiger DNA zwischen
17
1 Einleitung
benachbarten Basen eines Strangs interkalieren. In diesem Zustand absorbieren diese Farbstoffe Licht einer bestimmten Wellenlänge und strahlen diese aufgenommene Energie wieder
als Licht mit einer längeren Wellenlänge ab. Für die praktische Anwendung in der Getränkeindustrie wurden bereits zwei artspezifische, quantitative Real-Time PCR-Systeme im
SYBR®-Green-Format für die Hefeart Dekkera/Brettanomyces bruxellensis entwickelt (Delaherche et al. 2004, Phister und Mills 2003).
1.3
Ziele der Arbeit
In dieser Arbeit sollten Real-Time PCR Nachweissysteme auf Basis der LightCycler® Technologie entwickelt werden, die für eine Anwendung in der Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung der Getränkeindustrie geeignet sind. Ein System sollte die obligat bierschädliche
Hefe Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus spezifisch und sensitiv in unterschiedlichen
Probenmatrices wie der Anstellhefe, dem Jungbier und dem Endprodukt nachweisen. Für die
Sterilitätskontrolle und die betriebliche Hygieneüberwachung sollte eine weitere Real-Time
Consensus-PCR für alle getränkerelevanten Hefen entwickelt werden.
Zunächst sollten spezifische Genregionen gesucht und falls notwendig Sequenzinformationen für diese Regionen neu generiert werden. In einem weiteren Schritt sollten von den Sequenzen und Sequenzalignments spezifische Oligonucleotide wie Primer und Sonden abgeleitet werden. Die Spezifität der Systeme sollte sowohl mit einer möglichst großen Anzahl an
Targetorganismen als auch mit Mikroorganismen, die als Begleitflora eine Rolle spielen können, getestet werden. Für die praktische Anwendung der Real-Time PCR-Systeme sollte
außerdem die Konstruktion und Implementierung von internen Amplifikationskontrollen erfolgen, um negative Ergebnisse aufgrund von Inhibitionen der PCR erkennen zu können. Die
kompletten Real-Time PCR-Systeme in Kombination mit geeigneten Probenaufarbeitungsmethoden sollten abschließend mit möglichst praxisnahen Proben auf ihre Sensitivität getestet werden. Damit wären schnelle, selektive und sensitive Werkzeuge für die mikrobiologische Kontrolle von Getränken verfügbar.
18
2 Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1
Mikroorganismen
Zusätzlich zu den in der Tabelle 2.1 aufgeführten und taxonomisch bestimmten Hefestämmen wurden nicht näher bestimmte Fremdhefen von den Brauereien A (12 Isolate), B (8 Isolate) und D (34 Isolate) bezogen und ebenfalls in den Spezifitäts- und Sensitivitätstests eingesetzt.
Tab. 2.1:
Hefestämme
Spezies
Bullera dendrophila
Candida albicans
Candida boidinii
Candida boidinii
Candida boidinii
Candida boidinii
Candida cariosilignicola
Candida catenulata
Candida chilensis
Candida diddensiae
Candida ernobii
Candida ethanolica
Candida freyschussii
Candida friedrichii
Candida fructus
Candida glabrata
Candida glaebosa
Candida haemulonii
Candida inconspicua
Candida intermedia
Candida krusei
Candida magnoliae
Candida maltosa
Candida multigemmis
Candida norvegica
Candida palmae
Candida parapsilosis
Candida parapsilosis
Candida pseudointermedia
Candida quercitrusa
Candida rhagii
Candida rugosa
Candida sake
Candida sake
Candida salmanticensis
Candida santamariae
Candida santamariae
Candida solani
Candida succiphila
Candida tenuis
Stamm/Herkunft
DSM 70745
ATCC 10231
DSM 70024
DSM 70033
DSM 70034
Brauerei F
DSM 2148
DSM 70136
ATCC 22076
DSM 70042
DSM 70858
Brauerei F
DSM 70047
DSM 70050
CBS 6381
BCD 8932
CBS 5691
DSM 70624
MUCL 27868
BCD 685
BCD 689
DSM 70638
BCD 806
DSM 70862
DSM 70863
Brauerei F
ATCC 20384
Brauerei F
Brauerei F
Brauerei F
CBS 4237
BCD 814
CBS 2920
BCD 1054
ATCC 16042
CBS 4515
CBS 4261
BCD 818
DSM 2149
BCD 819
Spezies
Pichia membranaefaciens
Pichia methanolica
Pichia minuta
Pichia ohmeri
Pichia pini
Pichia trehalophila
Pichia stripitis
Rhodotorula sp.
Rhodotorula glutinis
Rhodotorula minuta
Rhodotorula rubra
Saccharomyces bayanus
Saccharomyces bayanus
Saccharomyces bayanus
Saccharomyces bayanus
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
S. carlsbergensis
(=S. pastorianus)
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. carlsbergensis
(=S. pastorianus)
S. carlsbergensis
(=S. pastorianus)
S. carlsbergensis
(=S. pastorianus)
S. carlsbergensis
(=S. pastorianus)
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae var. diastaticus
19
Stamm/Herkunft
Brauerei F
DSM 2147
DSM 70718
BCD 862
DSM 70385
DSM 70391
CBS 5773
ATCC 20254
BCD 3530
DSM 70408
BCD 4081
BCD 1256
BCD 1392
DSM 70412
Brauerei F
DSM 1333
DSM 70416
BCD 728
ATCC 44075
CBS 6503
ATCC 42296
BCD 1257
BCD 1432
BCD 1433
BCD 1499
BCD 1501
BCD 2573
BCD 2574
BCD 2581
ATCC 9080
ATCC 12341
ATCC 18790
ATCC 28383
DSM 70452
BCD 13974
2 Material und Methoden
Tab. 2.1:
Fortsetzung
Spezies
Candida tropicalis
Candida tropicalis
Candida versatilis
Candida vini
Candida viswanathii
Candida zeylanoides
Citeromyces matritensis
Citeromyces matritensis
Clavispora lusitaniae
Clavispora lusitaniae
Cryptococcus albidus
Cryptococcus curvatus
Cryptococcus curvatus
Cryptococcus flavus
Cryptococcus flavescens
Cryptococcus humicola
Cryptococcus laurentii
Cryptococcus neoformans
Debaryomyces etchellsii
Debaryomyces hansenii
Debaryomyces hansenii
Debaryomyces marama
Debaryomyces vanrijiae
Dekkera anomala
Dekkera anomala
Dekkera bruxellensis
Dekkera bruxellensis
Dekkera custersiana
Endomyces fibuliger
Endomyces fibuliger
Filobasidium capsuligenum
Guilliermondella selenospora
Hanseniaspora guilliermondii
Hanseniaspora uvarum
Hanseniaspora uvarum
Hanseniaspora vineae
Hyphopichia burtonii
Hyphopichia burtonii
Issatchenkia orientalis
Kazachstania unispora
Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces lactis
Lachancea thermotolerans
Lachancea thermotolerans
Lodderomyces elongisporus
Metschnikowia lunata
Metschnikowia pulcherrima
Stamm/Herkunft
ATCC 20247
ATCC 20326
DSM 6956
DSM 70184
ATCC 20385
BCD 690
DSM 70187
BCD 1062
DSM 70102
Brauerei F
DSM 70197
DSM 70022
BCD 2578
BCD 823
Brauerei F
DSM 70067
BCD 824
BCD 3511
ATCC 20126
BCD 589
BCD 3512
ATCC 11627
DSM 70252
DSM 70727
DSM 70732
DSM 3429
DSM 70726
DSM 70736
BCD 3514
DSM 70554
DSM 70253
DSM 3431
DSM 70285
BCD 3526
ATCC 9774
DSM 70283
BCD 859
DSM 3505
CBS 5147
BCD 877
DSM 70106
BCD 811
DSM 70792
BCD 2563
BCD 5186
DSM 70807
CBS 6340
CBS 137
DSM 70320
CBS 5946
DSM 70321
Spezies
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces castellii
Saccharomyces exiguus
Saccharomyces exiguus
Saccharomyces exiguus
Saccharomyces kluyveri
Saccharomyces pastorianus
Saccharomyces pastorianus
Saccharomycopsis fibuligera
Schizosaccharomyces
octosporus
Schizosaccharomyces
octosporus
Schizosaccharomyces pombe
Schizosaccharomyces pombe
Sporidiobolus johnsonii
Sporidiobolus johnsonii
Sporidiobolus johnsonii
Stephanoascus ciferrii
Torulaspora delbrueckii
Torulaspora delbrueckii
Torulaspora delbrueckii
Trichosporon cutaneum
Willipsis saturnus
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica
20
Stamm/Herkunft
BCD 13980
DSM 70487
VTT C-68059
VTT C-70060
VTT C-82101
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei E
Brauerei E
Brauerei C
Brauerei C
Brauerei D
Brauerei D
Brauerei D
Brauerei D
Brauerei B
Brauerei B
Brauerei F
Brauerei F
Brauerei F
Brauerei F
BCD 1491
BCD 1493
MUCL 29838
DSM 70517
NCYC 73
DSM 6580
ATCC 9947
BCD 14122
DSM 70573
DSM 70572
BCD 773
BCD 778
BCD 4982
DSM 70847
DSM 70749
CBS 5636
CBS 6339
DSM 70607
DSM 70684
DSM 70388
ATCC 20225
ATCC 20226
BCD 2003
BCD 2556
2 Material und Methoden
Tab. 2.1:
Fortsetzung
Spezies
Metschnikowia reukaufii
Pichia angusta
Pichia anomala
Pichia anomala
Pichia anomala
Pichia anomala
Pichia canadensis
Pichia carsonii
Pichia farinosa
Pichia fermentans
Pichia fermentans
Pichia guilliermondii
Pichia membranaefaciens
Tab. 2.2:
Stamm/Herkunft
DSM 70337
DSM 70277
BCD 1082
DSM 70783
Brauerei F
Brauerei F
CBS 601
DSM 70392
BCD 861
DSM 70090
BCD 711
BCD 804
DSM 70178
Spezies
Zygosaccharomyces bailii
Zygosaccharomyces bailii
Zygosaccharomyces bisporus
Zygosaccharomyces cidri
Zygosaccharomyces
fermentati
Zygosaccharomyces
florentinus
Zygosaccharomyces lentus
Zygosaccharomyces
microellipsoides
Zygosaccharomyces rouxii
Zygosaccharomyces rouxii
Stamm/Herkunft
BCD 1424
MUCL 28823
DSM 70415
MUCL 31280
MUCL 27824
DSM 70506
CBS 8516
DSM 6959
DSM 70835
ATCC 48230
Bakterienstämme
Spezies
Acetobacter pasteurianus
Achromobacter xylosoxidans
Acinetobacter baumanii
Acinetobacter calcoaceticus
Aeromonas hydrophila
Bacillus alcalophilus
Bacillus badius
Bacillus cereus
Bacillus firmus
Bacillus stearothermophilus
Brevundimonas vesicularis
Brochotrix campestis
Brochotrix thermospacta
Carnobacterium piscicola
Citrobacter freundii
Clostridium perfringens
Corynebacterium glutamicum
Delftia acidovorans
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakazakii
Enterococcus faecalis
Erysipelothrix rhusiopathiae
Escherichia coli
E. coli Serovar O157:H7
Jonesia denitrificans
Klebsiella oxytoca
Klebsiella pneumoniae
Kurthia zopfii
Lactobacillus brevis
Lactobacillus casei
Lactobacillus collinoides
Lactobacillus coryniformis
Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus hilgardii
Stamm/Herkunft
DSM 3509
DSM 30026
BCD 10388
DSM 1139
DSM 30188
DSM 485
BCD 2929
DSM 508
DSM 1530
DSM 456
DSM 7226
DSM 4712
DSM 20171
DSM 20730
DSM 30040
BCD 8800
DSM 20300
DSM 39
DSM 30054
DSM 4485
DSM 2570
DSM 5055
DSM 30083
BCD 5579
DSM 20603
DSM 5175
ATCC 13883
DSM 20580
DSM 20054
DSM 20011
DSM 20515
DSM 20001
DSM 20072
DSM 20051
Spezies
Lactobacillus perolens
Lactobacillus sakei
Lactococcus lactis
subsp. lactis
Leuconostoc citreus
Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides
Macrococcus caseolyticus
Megasphaera cerevisiae
Micrococcus luteus
Moraxella catarrhalis
Pantoea agglomerans
Pectinatus cerevisiiphilus
Pectinatus frisingensis
Pediococcus damnosus
Pediococcus inopinatus
Pediococcus parvulus
Pediococcus claussenii
Pediococcus pentosaceus
Planococcus kocurii
Plesiomonas shigelloides
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella enterica subsp.
enterica Serovar Enteritidis
Salmonella senftenberg
Serratia marcescens
Shewanella putrefaciens
Shigella boydii
Shigella sonnei
Sporosarcina urea
Staphylococcus aureus
subsp. aureus
21
Stamm/Herkunft
DSM 12744
DSM 20494
DSM 20729
DSM 20188
DSM 20241
DSM 20597
DSM 20462
BCD 3906
DSM 9143
DSM 3493
DSM 20467
DSM 6306
DSM 20331
DSM 20285
DSM 20332
DSM 14800
DSM 20336
DSM 3493
DSM 8224
DSM 788
DSM 2140
DSM 288
BCD 14151
BCD 6173
DSM 1636
DSM 6067
DSM 7532
BCD 4301
DSM 2281
DSM 20231
2 Material und Methoden
Tab. 2.2:
Fortsetzung
Spezies
Lactobacillus kefiri
Lactobacillus lindneri
Lactobacillus parabuchneri
Lactobacillus plantarum
Tab. 2.3:
Spezies
Streptococcus uberis
Weissella confusa
Yersinia enterocolitica subsp.
enterocolitica
Stamm/Herkunft
DSM 20569
DSM 20196
DSM 4780
Spezies
Hyalodendron lignicola
Monilia sp.
Mucor circinelloides
Paecilomyces variotii
Penicillium crustosum
Penicillium funiculosum
Phialophora hoffmannii
Phomopsis phaseoli
Phytophthera infestans
Rhizopus nigricans
Syncephalastrum racemosum
Talaromyces flavus
Trichoderma viride
Verticillium sp.
Wallemia sebi
Stamm/Herkunft
DSM 1877
BCD 8535
BCD 6069
CBS 62866
BCD 6994
DSM 1960
DSM 2693
CBS 42250
MUCL 43045
BCD 3506
BCD 162
BCD 12179
BCD 352
BCD 13586
DSM 5329
Schimmelpilzstämme
Spezies
Absidia sinosa
Alternaria alternata
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus parasiticus
Aureobasidium pullulans
Botrytis cinerea
Cephalosporium aphidicola
Claviceps purpurea
Diaporthe citri
Eremascus albulus
Fusarium oxysporum
Fusarium cerealis
Fusarium culmorum
Geomyces pannorum
2.2
Stamm/Herkunft
DSM 20588
DSM 20690
DSM 5707
DSM 20174
Stamm/Herkunft
BCD 3485
BCD 12263
ATCC 9643
DSM 819
DSM 2038
DSM 3042
DSM 4709
ATCC 28300
DSM 714
DSM 1159
BCD 12125
BCD 14059
BCD 14058
DSM 62184
DSM 2689
Nährmedien
Für die Nährmedienherstellung wurden nur Chemikalien und Nährmedienzusätze der Firmen
Merck, Roth und Sigma-Aldrich verwendet, die vom Hersteller für den Gebrauch in der Mikrobiologie ausgewiesen waren. Die Nährmedien wurden bei 121 °C für 15 Minuten autoklaviert.
Tab. 2.4:
YM-Medium (yeast extract-malt extract broth)
3,0 g/l
3,0 g/l
5,0 g/l
10,0 g/l
15,0 g/l
Hefeextrakt
Malzextrakt
Pepton
D(+)-Glucose
Agar-Agar
Die Zugabe von Agar-Agar wurde optional je nach Verwendung vorgenommen.
Tab. 2.5:
CASO-Bouillon
17,0 g/l
3,0 g/l
2,5 g/l
5,0 g/l
2,5 g/l
7,3 ± 0,2
Pepton aus Casein
Pepton aus Sojamehl
D(+)-Glucose
NaCl
K2HPO4
pH-Wert bei 25 °C
22
2 Material und Methoden
Tab. 2.6:
Peptonwasser (gepuffert)
10,0 g/l
5,0 g/l
3,5 g/l
1,5 g/l
7,0 ± 0,2
Tab. 2.7:
MRS-Bouillon
10,0 g/l
8,0 g/l
4,0 g/l
20,0 g/l
2,0 g/l
1,0 g/l
2,0 g/l
5,0 g/l
0,2 g/l
0,04 g/l
5,7 ± 0,2
Tab. 2.8:
Pepton aus Casein
NaCl
Na2HPO4
KH2PO4
pH-Wert bei 25 °C
Pepton aus Casein
Fleischextrakt
Hefeextrakt
D(+)-Glucose
K2HPO4
Tween® 80
Di-Ammoniumhydrogencitrat
Natriumacetat
MgSO4
MnSO4
pH-Wert bei 25 °C
LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) (Sambrook et al. 1989)
10,0 g/l
5,0 g/l
5,0 g/l
0,1 g/l
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
Ampicillin
Die Zugabe von Ampicillin erfolgte erst kurz vor der Verwendung des Mediums.
Tab. 2.9:
LB-Agarplatten
10,0 g/l
5,0 g/l
5,0 g/l
0,1 g/l
0,08 g/l
0,5 mM
15,0 g/l
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
Ampicillin
X-Gal
IPTG
Agar-Agar
Die Zugabe von Ampicillin erfolgte, nachdem das autoklavierte Medium auf ca. 50 °C abgekühlt war.
Tab. 2.10: SOC-Medium
0,2 g/l
0,05 g/l
10,0 mM
2,5 mM
2,0 mM
10,0 mM
10,0 mM
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
KCl
Glucose
MgCl2 • 6 H2O
MgSO4 • 7 H2O
Die Herstellung erfolgte gemäß den Angaben, die in der Vorschrift für das pGEM®-T Vektor
Kit [Promega] gemacht werden.
23
2 Material und Methoden
2.3
Oligonucleotide
Die verwendeten Oligonucleotide wurden von den Firmen Thermo Electron Corporation
(Primer), MWG-Biotech (Primer) und Metabion (Hybridisierungssonden) bezogen.
Die Nomenklatur der Basen in den Nucleinsäuresequenzen entspricht den Vorgaben der
NC-IUB (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry): A= Adenin;
C= Cytosin; G= Guanin; T= Thymin; I= Inosin; N= A/C/G/T; Y= C/T; R= A/G; M= A/C; K=
G/T; S= C/G; W= A/T; D= A/G/T; B= C/G/T
Tab. 2.11: Primer für die DNA-Kontrolle
Bezeichnung
ITS1
ITS4
Sequenz 5´-3´
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
TCCTCCGCTTATTGATATGC
Zielregion
18S rDNA
26S rDNA
Referenz
White et al. 1990
White et al. 1990
Tab. 2.12: Primer zur Amplifikation von PCR-Fragmenten des EF-3 Gens
Bezeichnung
HS03
HS04
HS09
HS10
HS12/IV
HS12/V
HS12/VI
HS12/VII
HS12/VIII
HS12/IX
HS14/III
HS14/IV
HS14/V
HS14/VI
HS14/VII
HS14/VIII
HSwb1
HSabc3
Sequenz 5´-3´
GAATTYTCTYTKGCWTAYGG
TGACTYCTTCARACCYS
ACARTGYTBYTCDATYTC
ATGGMGITWCCANWCYGGTGA
TGGCGATACCAAACCGGTGAAG
TGGCGGTTCCATACCGGTGAGG
TGGCGATACCAGACTGGTGAGG
TGGCGATACCAGACCGGTGAGG
TGGAGATACCAGACCGGTGAGG
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGG
CCATGACTTTCTTTTCGAAACCTC
CGAGAATCTTCTTCTCGAAACCAC
CAAGAACCTTCTTTTCGAAACCTC
CCATAACCTTCTTCTCGAAACCAC
CGAGGACCTTCTTCTCGAAACCAC
CGAGGACCTTCTTCTCGAACCCAC
ITIITIITIGAYGARCCIACYAACCATYTNG
CIAIIACIAIYTTIACYTTYTGRCCACCNG
Zielregion
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
Referenz
Uritani et al. 1999
Uritani et al. 1999
Tab. 2.13: Primer für Real-Time PCR Nachweissysteme
Bezeichnung
HS11/I
HS11/II
HS11/III
HS11/IV
Ha1f
Ha2f
Ha3f
Ha4f
Ha5f
Hb1f
Hb2f
Hb3f
Hb4f
Hb5f
Hb6f
Hb7f
Ha1r
Ha2r
Ha3r
Sequenz 5´-3´
GGTGAGGATAGAGAAACCATGG
GGTGAGGATAGAGAAACTATGG
GGTGAGGATAGAGAGACCATGG
GGTGAGGATAGAGAGACTATGG
WCTGGTGAAGATTTGGARGCTATGG
CYGGTGARGAYMGWGAAACCATGG
WCYGGTGAAGATMGWGAAACTATGG
GGTGARGAYMGWGAGACCATGG
CYGGTGARGAYMGWGAGACTATGG
GAGGCCGAGCTTGCCAAGATG
CCGATGCCGAAAAGGAGAAGATG
SYGAGGAGGAGRAGAAGAAGATG
TGACCGARGAAGAGAWRCAAAAGATG
GCCGAGGAAGAGGCCAAGATG
ACCGGTGARGAYTTGGARGARMTG
ACNGGTGAGGAYMTYGARGA
CTCTTCAARGCYTCAGCACGGTC
CGKWGGCAAGWGCTTCCTTCATATC
CCRGADGCYAAWGCTTCCTTCATATC
24
Zielregion
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
2 Material und Methoden
Tab. 2.13: Fortsetzung
Bezeichnung
Ha4r
Ha5r
Ha6r
Ha7r
Ha8r
Hb1r
Hb2r
Hb3r
HT1r
HT2r
HT3r
HT4r
HT5r
HT6r
Yfa1
Yfa2
Yfs1
SD1f
SD1r
Sequenz 5´-3´
GACCDGADGCYAAAGCTTCTTTCATATC
GARGCMARRGCCTCCTTCATGTC
CRGAWGCMARAGCCTCCTTCATATC
GACCWGAWGCTAAGGCTTCTTTCATATC
CGGAAGCCAAAGCTTCCTTCATGTC
CAAGTTCMAKRACYTTCTTTTCGAAACCTC
CTCSAKRAYCTTCTTCTCGAAACCAC
GAGGACCTTCTTCTCGAASCCAC
GCYARWGCTTCCTTCATATC
GADGCYAARGCTTCTTTCATATC
GCMARRGCYTCCTTCATRTC
CAARGCYTCAGCACGGTC
GACCTTCTTCTCGAASCCAC
RAYYTTCTTYTCGAAACCWC
GTGARGAYMGWGARACCATG
GGTGARGAYMGWGARACTATG
GGTGAAGATTTGGARGCTATG
TTGCGAATACACTACTGAAGC
CGTATACCACTGTCCCATTCAT
Zielregion
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
STA1-3 Gen
STA1-3 Gen
Tab. 2.14: Mutageneseprimer zur Herstellung von internen Amplifikationskontrollen
und Positivkontrollen
Bezeichnung
SDip1r
SDip1f
SDpo3f
SDpo3r
Yip1r
Yip1f
Sequenz 5´-3´
TGGCACTGGAAGAACGTATCGGATAATGATACATAGGTGGTTG
GTACAG
CATTATCCGATACGTTCTTCCAGTGCCATCAAAGCTGCGGCGG
TG
CACAACAAAGGCTGTACCAACCACCTATGT
ACATAGGTGGTTGGTACAGCCTTTGTTGTG
TGGCACTGGAAGAACGTATCGGATAATGTGTTCTTGAACTTTCT
TCTG
CATTATCCGATACGTTCTTCCAGTGCCAATTGGTATGAAATCTG
AAAG
Zielregion
STA1-3 Gen
STA1-3 Gen
STA1-3 Gen
STA1-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
Die Veränderungen in der Sequenz gegenüber dem Wildtyp wurden unterstrichen.
Tab. 2.15: Hybridisierungssonden für die Real-Time PCR-Assays
Bezeichnung
SDR1f
SDF1f
LMRST1
Yff1
Yff2
Yff3
Yff4
Yff5
Yff6
Yff8
Yfr1
Yfr2
Yfr3
Sequenz 5´-3´
LCRed-640-TTGACTTTGGCAAGGGCATTCTCGA-Pho
CACAACAAAGTCTGTACCAACCACCTATGT-Fluo
LCRed-705-CATTATCCGATACGTTCTTCCAGTGCCA-Pho
GAGTTGCTGGTRTICAYKCIAGAAGAAAGTTYAAGAAC-Fluo
GAGTTAAAGAAATTITGGCYAGAAGAAARTTYAARAAT-Fluo
GAGTTCAAGARATTCAYGCIAGAAGRAARTTCAAGAAC-Fluo
GAGTTCAAGGTATTCAYGCTMGAMGIAAGTTYAAGAAC-Fluo
GACGAGCTTGTIGSCMGIAAGAAGYTSAAGCARTC-Fluo
GATTTTGGGTATYCACAGCCGTMGIAAGCTYAARAAC-Fluo
GTGTGAACGARGTTCTGTCCCGCCGTAARTTYAARAAC-Fluo
LCRed-640-CTTAYGARTAYGARGTTTCTTGGITITTGGGTGA
GAAC-Pho
LCRed-640-CTTAYGAATATGAAATTGGITGGTAYTTRGKTGA
GAAC-Pho
LCRed-640-CYTAYGARTAYGAITGTTCTTTCACTTTGGGTGA
GAAC-Pho
25
Zielregion
STA1-3 Gen
STA1-3 Gen
IAK
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
2 Material und Methoden
Tab. 2.15: Fortsetzung
Bezeichnung
Yfr4
Yfr5
Yfr7
Yfr8
Sequenz 5´-3´
LCRed-640-CYTAYGARTAYGARTGTTCTTTCTTGTTIGGTGA
GAAC-Pho
LCRed-640-TACGARTACGAARTITCITTCAARGGTCTWTCWT
CTGC-Pho
LCRed-640-TWCGAGTACGAGGTIWCSTTCAAGGSIMTGT
CGTC-Pho
LCRed-640-CTTAYGARTAYGARGTCTCGTACCTGCTCGGAGA
CAAC-Pho
Zielregion
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
EF-3 Gen
LCRed-640 oder 705: LightCycler®-Red-640 oder 705 Fluorophor, Pho: Phosphat, Fluo: Fluorescein
2.4
Probenmatrices
Tab. 2.16: Getränkeproben
Getränk
Alkoholfreies Bier (Jever Fun)
Alkoholfreies Bier
Apfelsaft (naturtrüb, Direktsaft)
Apfelsaft (klar)
Biermixgetränk (Bibop)
Coca-Cola
Eistee (Tropical Mango)
Gatorade
Light Bier
Orangensaft
Pils
Pils
Radler
Rotwein (Chianti)
Schwarzbier (Köstritzer)
Traubensaft
Weißwein (Riesling)
Hersteller
Jever
Bitburger
Dietz
Kaufland
Bitburger
Coca-Cola
Nestle
Pepsi-Cola
Bitburger
Kaufland
Oettinger
Bitburger
Oettinger
Italien
Bitburger
Kaufland
Deutschland
Tab. 2.17: Nährmedien
Medium
SSL-Bouillon
SSL-Bouillon/alkoholfreies Bier (50/50 v/v)
NBB-Bouillon
MRSF-Bouillon (MRS-Bouillon mit 1 % Fructose und 1/3 Anteil alkoholfreies Pils)
Tab. 2.18: Prozessproben von Brauerei A
Probe
Vorwürze
Würze (Pfanne voll)
Würze (Plattenkühler-Auslauf)
Retourwasser/ Vorspülwasser Gär- und Lagerkeller
Desinfektionsmittelwanne
Jungbier (Lagerkeller)
Wasser aus Kastenwäscher
26
Hersteller
Döhler
Brauerei D
Brauerei D
Brauerei D
2 Material und Methoden
2.5
Anzucht von Mikroorganismen
Die Hefen wurden bei 25 bis 28 °C in 20 ml YM-Medium auf einem Schüttler (150 U/min) für
48 Stunden angezogen. Die Schimmelpilze wurden bei 25 bis 28 °C auf YM-Agarplatten für
sieben Tage kultiviert. Die Bakterien wurden je nach Spezies in CASO-Bouillon oder MRSBouillon bei Temperaturen zwischen 30 und 37 °C für 24 Stunden angereichert.
2.6
Extraktion von Nucleinsäuren
2.6.1
Mechanisch/thermische DNA-Extraktion
1 ml einer Flüssiganreicherung oder Probe wurden in einem Reaktionsgefäß zusammen mit
Zirkonium/Glas-Kügelchen [Roth] 1 min bei 8000 x g (Hefen und Schimmelpilze) oder 5 min
bei 10000 x g (Bakterien) zentrifugiert. Für Bakterienkulturen wurden 150 mg Zirkonium/Glas-Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 mm und für Hefe- und Schimmelpilzkulturen 500 mg Zirkonium/Glas-Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,5 mm verwendet.
Die sedimentierten Zellen wurden mit 200 µl einer 5 %-igen (w/w) Chelex® 100 [Bio-Rad]
Lösung resuspendiert und 10 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend erfolgte der mechanische Aufschluss mit dem MagNA Lyser Instrument [Roche Diagnostics] für 1 min bei 6500
Einheiten oder alternativ mit dem Disruptor Genie Instrument [Scientific Industries] für
10 min. Abschließend wurden die Zelllysate 15 min bei 95 °C inkubiert und 5 min bei
13000 x g zentrifugiert. Die Proben wurden direkt in der PCR eingesetzt, bei -20 °C gelagert
oder wie unter 2.6.2 beschrieben weiter aufgereinigt.
2.6.2
Extraktion quantifizierbarer und RNA-freier DNA
Quantifizierbare/RNA-freie DNA wurde präpariert, indem sich an die unter 2.6.1 beschriebene Methode eine Aufreinigung mit dem „High Pure PCR Template Preparation Kit“ [Roche
Diagnostics] anschloss, wobei die in dem Protokoll für die Zelllyse und den Proteinase K
Verdau vorgesehenen Schritte ausgelassen wurden. Nach dieser Aufreinigung wurden die in
50 µl eluierten Nucleinsäuren mit 1 µl RNase A (10 mg/ml) [Sigma-Aldrich] 10 min bei 37 °C
inkubiert. Die RNase A wurde aus den Proben durch eine erneute Aufreinigung mit dem
„High Pure PCR Template Preparation Kit“ entfernt. Das endgültige Elutionsvolumen betrug
50 µl. Verdünnungen der DNA wurden für PCR Experimente mit Heringssperma-TE-Puffer
(10,0 µg/ml Heringssperma DNA [Roche Diagnostics], 0,5 mM EDTA [Sigma-Aldrich],
1,0 mM Tris-HCl [Sigma-Aldrich], pH=7,6) hergestellt.
2.6.3
Erweiterte, mechanisch/thermische DNA-Extraktion
Die unter 2.6.1 beschriebene Methode wurde für komplexe Probenmatrices erweitert, wobei
bis auf Isopropanol (absolut) [Roth] alle eingesetzten Komponenten aus dem „High Pure
PCR Template Preparation Kit“ [Roche Diagnostics] stammten. Die sedimentierten Proben
wurden zusätzlich zu den 200 µl der 5 %-igen (w/w) Chelex® 100 Suspension mit 200 µl Bindepuffer und 40 µl Proteinase K versetzt, resuspendiert und 10 min bei 72 °C inkubiert. Anschließend wurde wie unter 2.6.1 beschrieben verfahren. Die abschließende Aufreinigung
erfolgte nach Zugabe von 100 µl Isopropanol mit dem „High Pure PCR Template Preparation
Kit“ den Herstellerangaben entsprechend. Das Elutionsvolumen betrug 50 µl.
27
2 Material und Methoden
2.7
Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen
2.7.1
Fluorometrische Bestimmung
Die Konzentration von RNA-freien DNA-Lösungen wurde fluorometrisch mit dem „PicoGreen® dsDNA Quantification Kit“ [Molecular Probes] und dem LightCycler® 2.0 Instrument
[Roche Diagnostics] bestimmt. Das „PicoGreen dsDNA quantification reagent“ wurde für die
Messung 1:50 mit 1 x TE-Puffer verdünnt und je 15 µl in eine LightCycler® Kapillare [Roche
Diagnostics] pipettiert. Nach Zugabe von 5 µl der DNA-Probe oder 5 µl der dekadisch verdünnten Lambda Standard DNA (Konzentrationsbereich: 10 ng–10 pg) wurden die Proben
mit dem LightCycler® 2.0 Instrument gemessen. Die Messung erfolgte bei 530 nm mit folgendem Programm:
Analysis Mode Cycles
None
1
Quantification 20
None
1
Target Temperature
Incubation
40 °C
Fluorescence Measuring 40 °C
Ending
40 °C
Segment
Ramp
Rate
20 °C/s
20 °C/s
20 °C/s
Hold
Time
10 s
1s
30 s
Acquisition
Mode
None
Single
None
Alle weiteren Einstellungen wurden auf 0 gesetzt.
Die Auswertung erfolgte mit der Analysenmethode „Nucleic Acid Quantification“ der LightCycler® Software 4.0. Die Standardgerade wurde mit der als Standard eingesetzten Lambda
DNA berechnet. Die Konzentration der DNA-Proben musste zur Berechnung innerhalb des
Bereichs der Standardgeraden liegen.
2.7.2
Konzentrationsbestimmung über Absorptionsspektrometrie
Die Konzentrationsbestimmung über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm wurde bei gereinigter Plasmid-DNA und zur Kontrolle von Oligonucleotiden angewendet. Die Messungen erfolgten mit dem Ultrospec 4000 Photometer UV/Visible
Spectrophotometer der Firma Pharmacia Biotech. Ein OD-Wert von 1 entspricht bei einer
Wellenlänge von 260 nm einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml.
2.8
Agarosegelelektrophorese
PCR-Fragmente, DNA-Extraktionen, gereinigte und linearisierte Plasmide wurden je nach
Größe zur Kontrolle in 1 bis 2 %-igen (w/v) Agarosegelen [Biozym] der Größe nach bei einer
angelegten Spannung zwischen 100 und 120 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proben
wurden zum Auftragen mit 1/5 (v/v) Ladepuffer (0,25 % (w/w) Bromphenolblau [Merck],
0,25 % (w/w) Xylencyanol FF [Sigma-Aldrich], 30,0 % (w/w) Glycerin [Roth]) versetzt. 1 x
TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2,0 mM EDTA, pH=8,3 bei 25 °C) [Merck] wurde als Elektrophoresepuffer und der DNA-Längenstandard VI (154, 220, 234, 298, 394, 453, 517,
653, 1033, 1230, 1766 und 2176 bp) [Roche Diagnostics] zur Größenbestimmung verwendet. Die DNA-Banden wurden durch Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (0,3 µg/ml) [Merck] und Bestrahlung bei 312 nm mit dem Gel-Dokumentationssystem
E.A.S.Y Win32 [Herolab] sichtbar gemacht und dokumentiert.
28
2 Material und Methoden
2.9
Klonierung von PCR-Fragmenten
2.9.1
Erzeugung von PCR-Fragmenten für die Klonierung
PCR-Fragmente für die Klonierung wurden mit dem Themocycler GeneAmp 9700 [Perkin
Elmer] erzeugt. Eingesetzt wurden entweder die Super Taq DNA-Polymerase [HT Biotechnology], die FastStart Taq DNA-Polymerase [Roche Diagnostics] oder die Taq DNAPolymerase [Biomaster] inklusive des jeweiligen 10 x PCR-Puffers. Die Aktivität der eingesetzten Super Taq DNA-Polymerase [HT Biotechnology] wurde vor der Zugabe zum MasterMix (alle Komponenten ohne DNA) mit dem TaqStart® Antikörper [Clontech Laboratories]
den Herstellerangaben folgend blockiert. Die Aktivierung der Taq DNA-Polymerase erfolgte
durch einen einleitenden Temperaturschritt bei 95 °C für 5 min. Die Nucleotide (dATP, dCTP,
dGTP und dTTP) stammten von der Firma Roche Diagnostics und das MgCl2 wurde von der
Firma Sigma-Aldrich bezogen.
2.9.1.1
EF-3-Gen Fragmente
Die Amplifizierbarkeit der DNA-Proben wurde mit dem universalen Primerpaar ITS1/ITS4
getestet. Sequenzabschnitte des EF-3-Gens wurden für die Sequenzierung mit fünf Primerkombinationen amplifiziert. Von Hefen aus der Unterabteilung Ascomycota wurde ein PCRProdukt entweder direkt mit einem der Primerpaare HS10/HS09 und HS10/HS04 oder in
einer Nested- oder Semi-Nested-PCR generiert, indem zunächst in einer separaten, vorgeschalteten PCR ein Amplifikat mit dem Primerpaar HS03/HS04 erzeugt wurde. Mit den Primerpaar HSwb1/Hsabc3 und dem Primermix HS12IV-IX/HS14/III-VIII wurde von Hefen der
Unterabteilung Basidiomycota ein Amplifikat erzeugt. Das folgende PCR-Programm wurde je
nach verwendeten Primern (Tab. 2.11 und Tab. 2.12) mit der geeigneten Annealingtemperatur eingesetzt:
Schritt
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Finale Elongation
Anzahl Zyklen
1
35
1
Temperatur [°C]
95
95
45
50
50
52
58
62
72
72
Zeit [min]
5,0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
1,0
10,0
verwendete Primer
HSwb1/HSabc3
HS03/HS04
HS10/HS04
HS10/HS09
ITS1/ITS4
HS12IV-IX/HS14/III-VIII
Die Reaktionsbedingungen der PCR waren bis auf die eingesetzten Primer und Primerkonzentrationen identisch:
Komponente
10 x PCR-Puffer
MgCl2 (50 mM)
dNTP-Mix (je 10 mM)
Primer (je 100 µM)
Taq DNA-Polymerase (5/6 U/µl)
Template
H2O
Volumen
2,5 µl
1,5 µl
0,5 µl
0,6 µl
2,0 µl
2,0 µl
2,0 µl
0,6 µl
1,2 µl
variabel
ad. 25 µl
Endkonzentration
1x
3,0 mM
0,2 mM (je Nucleotid)
1,2 µM (je Primer)
4,0 µM (je Primer)
4,0 µM (je Primer)
4,0 µM (je Primer)
0,2 µM (je Primer)
1,0 U/Reaktion
29
Primerpaar
HSwb1/HSabc3
HS03/HS04
HS10/HS09
HS10/HS04
HS12IV-IX/HS14/III-VIII
2 Material und Methoden
2.9.1.2
Interne Amplifikationskontrolle und Positivkontrolle
Die PCR-Fragmente für die Herstellung der internen Amplifikationskontrolle und der Positivkontrollen (IAK und PK) der beiden Real-Time PCR Nachweissysteme, die auf einer Detektion mit Hybridisierungssonden beruhten, wurden über PCR-Mutagenese, wie bei Higuchi et
al. (1988) beschrieben, hergestellt. Für die Herstellung der Kontrollen wurden jeweils zwei
komplementäre Mutageneseprimer (Tab. 2.14) verwendet, die entweder eine Basenfehlpaarung in die Sondenbindungsregion einfügten (PK) oder die komplette Sequenz einer Sonde
durch eine neue Sequenz substituierten (IAK).
Dabei wurden alle PCR-Ansätze mit dem folgenden PCR-Programm durchgeführt:
Schritt
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Finale Elongation
Anzahl Zyklen
1
35
1
Temperatur [°C]
95
95
50
72
72
Zeit [min]
5,0
0,5
0,5
1,0
10,0
Mit zwei PCR-Reaktionen wurden zunächst für jede Kontrolle zwei überlappende PCRFragmente hergestellt, die die gewünschte Veränderung gegenüber der natürlichen Sequenz
am 3´- (Fragment A) bzw. am 5´-Ende (Fragment B) aufwiesen. Die Primerkombinationen für
die Kontrollen waren wie folgt:
Real-Time PCR-Nachweissystem
Kontrolle
S. cerevisiae var. diastaticus
IAK
PK
IAK
Hefen Gesamtnachweis
PCR-Fragment A
5´-Primer
3´-Primer
SD1f
SDip1r
SD1f
SDpo3r
HS10
Yip1r
PCR-Fragment B
5´-Primer 3´-Primer
SDip1f
SD1r
SDpo3f
SD1r
Yip1f
HS09
Die Reaktionsbedingungen bei der Amplifikation der PCR-Fragmente A und B mit den Mutageneseprimern waren die folgenden:
Komponente
10 x PCR-Puffer
MgCl2 (50 mM)
dNTP-Mix (je 10 mM)
Primer (je 10 µM)
FastStart Taq DNA Polymerase (5 U/µl)
S. c. var. diastaticus (DSM 70487) DNA
H2O
Volumen
2,5 µl
1,5 µl
0,5 µl
5,0 µl
0,5 µl
1,0 µl
ad. 25 µl
Endkonzentration
1x
3,0 mM
0,2 mM (je Nucleotid)
1,0 µM (je Primer)
2,5 U/Reaktion
1,0 ng/Reaktion
Die PCR-Fragmente A und B wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit oder dem QIAquick Gel Extraction Kit [Qiagen] gereinigt, bevor sie in der abschließenden PCR eingesetzt
wurden. Die PCR, bei der durch Annealing der beiden PCR-Fragmente A und B im Bereich
der Mutageneseprimer, anschließender Elongation zu einem doppelsträngigen Gesamtfragment und abschließender Amplifikation mit den im Gesamtfragment außen liegenden Primern (SD1f/SD1r oder HS10/09) das PCR-Fragment C hergestellt wurde, wurde unter den
folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt:
Komponente
10 x PCR-Puffer
MgCl2 (50 mM)
dNTP-Mix (je 10 mM)
Primer (je 10 µM)
Biomaster Taq (5 U/µl)
PCR-Fragment A und B
H2O
Volumen
2,5 µl
1,5 µl
0,5 µl
5,0 µl
0,25 µl
2,0 µl
ad. 25 µl
30
Endkonzentration
1x
3,0 mM
0,2 mM (je Nucleotid)
1,0 µM (je Primer)
1,25 U/Reaktion
2 Material und Methoden
2.9.2
Reinigung von PCR-Fragmenten für die Klonierung
Die Kontrolle der Amplifikate erfolgte über Agarosegelelektrophorese (Kap. 2.8). Die PCRProdukte wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt. Amplifikate, die nach der
Auftrennung im Agarosegel mit einem Skalpell bei Bestrahlung mit UV-Licht (365 nm) ausgeschnitten wurden, wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit [Qiagen] gereinigt.
2.9.3
Ligation von gereinigten DNA-Fragmenten
PCR-Produkte wurden mit dem pGEM®-T Vector Kit [Promega] den Herstellerangaben entsprechend ligiert. Die Ligationsansätze (5 µl 2 x Puffer, 0,4 µl pGEM-T Vector, 0,8 µl T4 DNA
Ligase und 3,8 µl PCR-Produkt) wurden bei 4 °C für 16 Stunden inkubiert.
2.9.4
Transformation von E. coli Zellen
2.9.4.1
Herstellung kompetenter E. coli Zellen
Kompetente E. coli XL-1 Blue Zellen [Stratagene] wurden mit der Magnesium-/Calciumchlorid Methode hergestellt. Aus einer E. coli XL-1 Blue Vorkultur, die über
Nacht bei 37 °C in LB-Medium (Tab. 2.8) angezogen wurde, wurden 0,5 ml in 50 ml LBMedium überimpft und mit 150 U/min bis zum Erreichen einer OD550 nm von ca. 0,5 bei 37 °C
inkubiert. Alle folgenden Schritte erfolgten bei 4 °C und mit auf 4 °C gekühlten Lösungen. Die
Zellen wurden nach einer Inkubation von 15 min auf Eis zentrifugiert (5000 x g, 10 min), in
20 ml 0,1 M MgCl2 resuspendiert und erneut zentrifugiert (5000 x g, 10 min). Das Zellpellet
wurde in 10 ml 0,1 M CaCl2 resuspendiert, 20 min auf Eis inkubiert und erneut zentrifugiert
(5000 x g, 10 min). Anschließend wurden die Zellen in 1,0 ml 0,1 M CaCl2 resuspendiert,
250 µl 87 % (v/v) Glycerin zugegeben und nach einer Inkubation von 5 min auf Eis wurden
Aliquots von je 100 µl bei -80 °C eingefroren.
2.9.4.2
Transformationsansatz
100 µl kompetente E. coli XL-1 Blue Zellen wurden mit 5 µl Ligationsansatz vorsichtig gemischt und 20 min auf Eis inkubiert. Der nachfolgende Hitzeschock erfolgte bei 42 °C im
Wasserbad für 2 min. Nach einer weiteren Inkubation für 10 min auf Eis wurden 500 µl SOCMedium (Tab. 2.10) zugegeben und die Ansätze 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. 100 µl des
Transformationsansatzes wurden anschließend auf LB-Platten (Tab. 2.9) ausgestrichen und
24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach einer Inkubation der Platten für 2 Stunden bei 4 °C
wurden die gewünschten Klone aufgrund der Blau-Weiß-Selektion ausgewählt. Da die PCRFragmente alle kleiner als 1 kbp waren, wurden neben weißen auch blaue Kolonien für die
Testung ausgewählt.
2.9.4.3
Kontrolle der Transformation
Der Erfolg der Klonierungen wurde mit der PCR kontrolliert, wobei die Bedingungen wie bei
der Herstellung der PCR-Produkte gewählt wurden (Kap. 2.9.1). Von weißen und blauen
Kolonien wurden 2,0 ml Flüssigkulturen mit LB-Medium (Tab. 2.8) mit Ampicillin (100 µg/ml)
angesetzt und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. 100 µl der Flüssigkulturen wurden 10 min bei
95 °C inkubiert und anschließend bei 13000 x g für 5 min zentrifugiert. 1 µl des Überstandes
wurde in der PCR eingesetzt und das Ergebnis über Agarosegelelektrophorese (Kap. 2.8)
ausgewertet. Die Lagerung der positiven Klone erfolgte bei -80 °C in 80 % (v/v) Glycerin.
31
2 Material und Methoden
2.9.5
Präparation von Plasmid-DNA
Für Sequenzierungen wurden 4 ml einer Flüssigkultur (LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin,
24 Stunden, 37 °C) mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit [Qiagen] den Herstellerangaben folgend präpariert. Die Plasmid-DNA wurde in 100 µl Elutionspuffer aufgenommen.
Plasmid-DNA für die interne Amplifikationskontrolle (IAK) oder die Positivkontrollen (PK) wurden aus 50 ml Flüssigkultur (LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin, 24 Stunden, 37 °C) mit
dem QIAprep Spin Midiprep Kit [Qiagen] den Herstellerangaben folgend präpariert.
2.9.6
Restriktionsverdau von Plasmid-DNA
Die internen Amplifikationskontrollen (IAK) und die Positivkontrollen (PK) wurden nach der
Reinigung mit der Restriktionsendonuclease Sac I oder Sca I [New England BioLabs] linearisiert. 170 µl der gereinigten Plasmid-DNA wurden mit 10 µl Enzym (10 U/µl), 20 µl NE-Puffer
1 (Sac I) oder 20 µl H-Puffer (Sca I) und 2 µl BSA versetzt, 2 Stunden bei 37 °C und abschließend 20 min bei 65 °C inkubiert. Der Erfolg der Linearisierung wurde über Agarosegelelektrophorese kontrolliert (Kap. 2.8).
Verdünnungen der Kontrollen wurden für den späteren Gebrauch mit Heringssperma-TEPuffer (10,0 µg/ml Heringssperma DNA [Roche Diagnostics], 0,5 mM EDTA [Sigma-Aldrich],
1,0 mM Tris-HCl [Sigma-Aldrich], pH=7,6) hergestellt und bei -20 °C gelagert.
2.10
Sequenzierung
Gereinigte Plasmid-DNA mit einem Sequenzabschnitt des EF-3 Gens und die über PCRMutagenese hergestellten Kontrollen (IAK und PK) wurden von der Firma GATC Biotech mit
den Standardprimern M13-forw und M13-rev sequenziert.
2.11
Sequenzanalyse
Distanz Matrices und Alignments von bekannten und selbst erzeugten Sequenzen wurden
mit dem Align X Programm aus dem Programmpaket Vector NTI® Suite 7.0 [InforMax] erstellt. Das Programm nutzt einen modifizierten CLUSTAL W Algorithmus (Needleman und
Wunsch 1970, Thompson et al. 1994) und erstellt Stammbäume über die Neighbour-Joining
Methode (Saitou und Nei 1987).
Die Schmelztemperatur von Oligonucleotiden wurde mit der MeltCalcPro Software (Professional Edition, Version 2.06) berechnet (Schütz und von Ahsen 1999, von Ahsen et al. 1999).
2.12
Zellzahlbestimmung
Zellzahlen von Hefekulturen wurden licht-mikroskopisch mit einer Neubauer Zählkammer
bestimmt. Von einer dekadischen Verdünnungsreihe, die mit gepuffertem Peptonwasser
(Tab. 2.6) hergestellt wurde, wurde die Verdünnungsstufe ausgezählt, bei der zwischen 50
und 200 Zellen in einem Großquadrat lagen. Die Zellzahl der Hefekultur ergab sich indem die
vier Großquadrate ausgezählt, der Mittelwert gebildet wurde und dieser Wert mit 104 und der
Verdünnungsstufe multipliziert wurde.
Zusätzlich zu der Zellzahl wurden die Koloniebildenden Einheiten (KBE) mit YM-Agar Platten
(Tab. 2.4) durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungsstufen ermittelt.
32
2 Material und Methoden
2.13
Real-Time LightCycler® PCR
Alle Real-Time LightCycler® PCR Versuche wurden mit einem LightCycler® 1.2 Instrument
oder einem LightCycler® 2.0 Instrument in 20 µl LightCycler® Kapillaren durchgeführt und mit
der LightCycler® Software 3.5 oder 4.0 ausgewertet [Roche Diagnostics]. Die spezifische
Amplifikation der Target-DNA oder der Positivkontrolle wurde bei den auf dem Einsatz von
Hybridisierungssonden basierenden Real-Time LightCycler® PCR-Systemen im Fluoreszenzkanal 640/Back 530 bzw. F2/Back F1 analysiert. Die spezifische Amplifikation der internen Amplifikationskontrolle wurde im Fluoreszenzkanal 705/Back 530 bzw. F3/Back F1 detektiert. Real-Time PCR-Reaktionen, die mit SYBR®-Green I [Molecular Probes] durchgeführt
wurden, wurden im Fluoreszenzkanal 530 bzw. F1 ausgewertet. Die eingesetzte FastStart
Taq DNA Polymerase [Roche Diagnostics] inklusive des 10 x PCR-Puffers, die Nucleotide
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP und dUTP) und BSA (bovine serum albumin) stammten von der
Firma Roche Diagnostics. Eine 1 M MgCl2-Stammlösung wurde von der Firma Sigma-Aldrich
bezogen.
2.13.1
Real-Time LightCycler® PCR-Programme
2.13.1.1
S. cerevisiae var. diastaticus Nachweis mit Hybridisierungssonden
Das PCR-Programm zum Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus mit Hybridisierungssonden bestand aus folgenden vier Teilprogrammen:
Teilprogramm
UNG Inkubation und initiale Denaturierung
Amplifikation
Schmelzkurven-Analyse
Kühlen
Anzahl Zyklen
1
45
1
1
Analysis Mode
None
Quantification
Melting Curves
None
Die Teilprogramme hatten folgende Temperaturprofile:
UNG Inkubation und initiale Denaturierung
Target
Hold
Ramp Rate
[°C]
[hh:mm:ss]
[°C/s]
37
00:02:00
20
95
00:15:00
20
Sec. Target
[°C]
0
0
Amplifikation
Target
[°C]
95
64
72
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:02
00:00:30
00:00:15
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
20
Sec. Target
[°C]
0
50
0
Schmelzkurven-Analyse
Target
Hold
[°C]
[hh:mm:ss]
95
00:00:00
38
00:01:00
80
00:00:00
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
0.1
Sec. Target
[°C]
0
0
0
Kühlung
Target
[°C]
40
Ramp Rate
[°C/s]
20
Sec. Target
[°C]
0
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:30
33
Step Size
[°C]
0
0
Step Size
[°C]
0
0.5
0
Step Size
[°C]
0
0
0
Step Size
[°C]
0
Step Delay
[cycles]
0
0
Acquisition
Mode
None
None
Step Delay
[cycles]
0
5
0
Acquisition
Mode
None
Single
None
Step Delay
[cycles]
0
0
0
Acquisition
Mode
None
None
Continuous
Step Delay
[cycles]
0
Acquisition
Mode
None
2 Material und Methoden
2.13.1.2
Hefegesamtnachweis mit Hybridisierungssonden
Das PCR-Programm zum Nachweis von Hefen mit Hybridisierungssonden bestand aus folgenden vier Teilprogrammen:
Teilprogramm
UNG Inkubation und initiale Denaturierung
Amplifikation
Schmelzkurven-Analyse
Kühlen
Anzahl Zyklen
1
45
1
1
Analysis Mode
None
Quantification
Melting Curves
None
Die Teilprogramme hatten folgende Temperaturprofile:
UNG Inkubation und initiale Denaturierung
Target
Hold
Ramp Rate
[°C]
[hh:mm:ss]
[°C/s]
37
00:02:00
20
95
00:15:00
20
Sec. Target
[°C]
0
0
Amplifikation
Target
[°C]
95
60
72
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:05
00:01:00
00:00:15
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
20
Sec. Target
[°C]
0
40
0
Schmelzkurven-Analyse
Target
Hold
[°C]
[hh:mm:ss]
95
00:00:00
40
00:01:00
75
00:00:00
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
0.1
Sec. Target
[°C]
0
0
0
Kühlung
Target
[°C]
40
Ramp Rate
[°C/s]
20
Sec. Target
[°C]
0
2.13.1.3
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:30
Step Size
[°C]
0
0
Step Size
[°C]
0
0.5
0
Step Size
[°C]
0
0
0
Step Size
[°C]
0
Step Delay
[cycles]
0
0
Acquisition
Mode
None
None
Step Delay
[cycles]
0
0
0
Acquisition
Mode
None
Single
None
Step Delay
[cycles]
0
0
0
Acquisition
Mode
None
None
Continuous
Step Delay
[cycles]
0
Acquisition
Mode
None
Hefegesamtnachweis mit SYBR®-Green I
Das PCR-Programm zum Nachweis von Hefen mit SYBR®-Green I [Molecular Probes] bestand aus den gleichen vier Teilprogrammen wie der Nachweis mit Hybridisierungssonden.
Einige Einstellungen in den Teilprogrammen Amplifikation und Schmelzkurven-Analyse wurden jedoch angepasst:
Amplifikation
Target
[°C]
95
62
72
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:05
00:00:30
00:00:15
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
20
Sec. Target
[°C]
0
0
0
Schmelzkurven-Analyse
Target
Hold
[°C]
[hh:mm:ss]
95
00:00:00
70
00:00:30
95
00:00:00
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
0.05
Sec. Target
[°C]
0
0
0
34
Step Size
[°C]
0
0
0
Step Size
[°C]
0
0
0
Step Delay
[cycles]
0
0
0
Acquisition
Mode
None
None
Single
Step Delay
[cycles]
0
0
0
Acquisition
Mode
None
None
Continuous
2 Material und Methoden
2.13.2
Real-Time PCR-Ansätze
Bei der Amplifikation der STA1-3 Gen-Fragmente wurde statt dTTP dUTP verwendet und bei
der Amplifikation des EF-3 Gen-Fragments wurden dTTP und dUTP zu gleichen Teilen (je
0,1 mM) eingesetzt, um den Einsatz von Uracil-N-Glycosylase (UNG) (hitze-instabil, 1 U/µl)
[Roche Diagnostics] zum Abbau von PCR-Produkten aus vorangegangenen PCR-Ansätzen
zu ermöglichen, die versehentlich in die Reaktionen verschleppt wurden.
2.13.2.1
S. cerevisiae var. diastaticus Nachweis mit Hybridisierungssonden
Komponente
10 x PCR-Puffer
MgCl2 (100 mM)
dNTP-Mix (je 10 mM)
BSA (30 µg/µl)
3´-Primer SD1f (10 µM)
5´-Primer SD1r (10 µM)
LC-Fluorescein Sonde SDF1f (10 µM)
LC-Red-640 Sonde SDR1f (10 µM)
LC-Red-705 Sonde LMRST1 (10 µM)
Taq DNA Polymerase (5 U/µl)
Uracil-DNA-Glycosylase (1 U/µl)
IAK (0,2 fg/µl)
Probe
H2O
2.13.2.2
Volumen
2,0 µl
0,5 µl
0,4 µl
1,5 µl
1,2 µl
1,2 µl
0,1 µl
0,6 µl
0,4 µl
0,4 µl
0,1 µl
1,0 µl
5,0 µl
ad. 20 µl
Endkonzentration
1x
2,5 mM
0,2 mM (je Nucleotid)
2,25 µg/µl
0,8 µM
0,8 µM
0,05 µM
0,3 µM
0,2 µM
2,0 U/Reaktion
0,1 U/Reaktion
0,2 fg/Reaktion
Hefegesamtnachweis mit Hybridisierungssonden
Komponente
10 x PCR-Puffer
MgCl2 (100 mM)
dATP, dCTP, dGTP (je 10 mM)
dTTP, dUTP (je 10mM)
BSA (30 µg/µl)
3´-Primer-Mix Yfa1-2, HS11/I-IV, Hb6f-7f (je 10 µM)
3´-Primer Yfs1 (10µM)
5´-Primer-Mix HT1r-3r, HT5r-6r (10 µM)
5´-Primer HT4r (10 µM)
LC-Fluorecein Sonden-Mix Yff1-4, 6 (je 10 µM)
LC-Fluorecein Sonde Yff5 (10 µM)
LC-Fluorecein Sonde Yff8 (10 µM)
LC-Red-640 Sonden-Mix Yfr1-4 (je 10 µM)
LC-Red-640 Sonden-Mix Yfr5, 7 (je 10 µM)
LC-Red-640 Sonde Yfr8 (10 µM)
LC-Red-705 Sonde LMRST1 (10 µM)
Taq DNA Polymerase (5 U/µl)
Uracil-DNA-Glycosylase (1 U/µl)
IAK (0,5 fg/µl)
Probe
H2O
35
Volumen
2,0 µl
0,8 µl
1,2 µl
0,2 µl
0,5 µl
0,4 µl
0,2 µl
0,4 µl
0,2 µl
0,15 µl
0,2 µl
0,1 µl
0,3 µl
0,4 µl
0,15 µl
0,4 µl
0,4 µl
0,1 µl
1,0 µl
5,0 µl
ad. 20 µl
Endkonzentration
1x
4,0 mM
0,2 mM (je Nucleotid)
0,1 mM (je Nucleotid)
0,75 µg/µl
0,2 µM (je Primer)
0,1 µM
0,2 µM (je Primer)
0,1 µM
0,075 µM (je Sonde)
0,1 µM
0,05 µM
0,15 µM (je Sonde)
0,2 µM (je Sonde)
0,075 µM
0,2 µM
2,0 U/Reaktion
0,1 U/Reaktion
0,5 fg/Reaktion
2 Material und Methoden
2.13.2.3
Hefegesamtnachweis mit SYBR®-Green I
Komponente
10 x PCR-Puffer
MgCl2 (100 mM)
dATP, dCTP, dGTP (je 10 mM)
dTTP, dUTP (je 10mM)
BSA (30 µg/µl)
3´-Primer-Mix Ha1f-5f, Hb1f-5f (je 10 µM)
5´-Primer-Mix Ha1r-8r (10 µM)
5´-Primer-Mix Hb1r-3r (10 µM)
SYBR®-Green I (100-fach)
Taq DNA Polymerase (5 U/µl)
Uracil-DNA-Glycosylase (1 U/µl)
Probe
H2O
2.14
Volumen
2,0 µl
0,7 µl
1,2 µl
0,2 µl
0,5 µl
0,4 µl
0,4 µl
0,4 µl
0,05 µl
0,4 µl
0,1 µl
5,0 µl
ad. 20 µl
Endkonzentration
1x
3,5 mM
0,2 mM (je Nucleotid)
0,1 mM (je Nucleotid)
0,75 µg/µl
0,2 µM (je Primer)
0,2 µM (je Primer)
0,2 µM (je Primer)
0,25-fach
2,0 U/Reaktion
0,1 U/Reaktion
Spezifitätstestung der Real-Time LightCycler® PCR
Die PCR-Systeme wurden mit DNA von Zielorganismen und Nicht-Zielorganismen, die mit
den im Kap. 2.6.1 und Kap. 2.6.2 beschriebenen Methoden gewonnen wurde, getestet. Zusätzlich wurden die im Kap. 2.4 aufgeführten Probenmatrices, mit den DNAExtraktionsmethoden, die im Kap. 2.6.1 und Kap. 2.6.3 beschrieben wurden, getestet.
2.15
Sensitivitätstestung der Real-Time LightCycler® PCR
2.15.1
Sensitivität ermittelt mit quantifizierter, RNA-freier DNA
Die Sensitivität der PCR-Systeme wurde mit quantifizierter (Kap. 2.7.1), RNA-freier DNA
(Kap. 2.6.2) von Hefen bestimmt. Die Umrechnung der quantifizierten DNA-Mengen auf Genomäquivalente (GÄ) erfolgte mit den bekannten Genomgrößen von S. cerevisiae
(12,1 Mbp), Schizosaccharomyces pombe (13,8 Mbp) und Cryptococcus neoformans
(21,0 Mbp).
2.15.2
Sensitivität ermittelt mit dotierten Probenmatrices
10 ml Probenmatrix wurden 1:10 mit YM-Medium verdünnt und 48 Stunden bei 28 ± 2 °C auf
einem Schüttler bei 150 U/min inkubiert. Die Dotierung mit ausgezählten Hefekulturen erfolgte entweder vor oder nach der Anreicherung, um die Nachweisgrenze und die Detektionszeit
der PCR-Systeme zu ermitteln. Die Probenaufarbeitungen wurden mit den mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsmethoden (Kap. 2.6.1 und Kap. 2.6.3) durchgeführt.
2.15.3
Sensitivität ermittelt bei einer hohen Begleitflora
Die PCR-Systeme wurden mit Aufarbeitungen von dotierten Proben getestet, die neben den
Zielorganismen eine sehr hohe Begleitflora an S. cerevisiae (DSM 1333) Zellen (S. cerevisiae var. diastaticus Nachweissystem) oder E. coli (DSM 30083) Zellen (Hefegesamtnachweissystem) aufwiesen. 1 ml einer S. cerevisiae Kultur (YM-Medium) mit 1 x 108 Zellen/ml
oder 1 ml einer E. coli Kultur (Peptonwasser) mit 1 x 1010 KBE/ml wurden mit unterschiedlichen Zellzahlen der jeweiligen Zielorganismen inokuliert und mit einer der mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsmethoden (Kap. 2.6.1 und Kap. 2.6.3) aufgearbeitet. Die
Zellzahlen der Hefekulturen wurden wie im Kap. 2.12 beschrieben ermittelt. Die Zellzahl der
E. coli Kultur wurde als KBE/ml mit Caso-Agar bestimmt.
36
2 Material und Methoden
2.16
Praxisnahe Testung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var.
diastaticus
Das komplette S. cerevisiae var. diastaticus Real-Time PCR-System wurde von vier Brauereien (A-D) in Kombination mit der mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsmethode (Kap.
2.6.1) getestet. Von jeder Brauerei wurden undotierte Probenmatrices aus unterschiedlichen
Bereichen des Brauprozesses in zwei Probenvolumina (1,0 ml und 0,1 ml) getestet (Versuchsteil 1). Außerdem untersuchte jede Brauerei S. cerevisiae var. diastaticus Reinkulturen,
die aus dem eigenen Prozess isoliert wurden oder von Kulturstammsammlungen bezogen
wurden (Versuchsteil 2). Mit 4 bis 5 unterschiedlichen Probenmatrices wurde die Sensitivität
des PCR-Systems nach Dotierung mit 102, 103 oder 104 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus getestet (Versuchsteil 3). Zum Einsatz kamen sowohl LightCycler® 1.2 Instrumente
(Brauerei A, B und D) als auch LightCycler® 2.0 Instrumente (Brauerei B und C) [Roche Diagnostics]. Die mechanisch/thermische Probenaufarbeitung wurde bei zwei Brauereien (A
und B) mit dem Disruptor Genie [Scientific Industries] und bei den beiden anderen Brauereien mit dem MagNA Lyser Instrument [Roche Diagnostics] durchgeführt. Die Brauerei A testete das PCR-System außerdem beim Versuchsteil 1 in Kombination mit Proben, die mit dem
MagNA Pure DNA Isolation Kit III [Roche Diagnostics] aufgearbeitet wurden.
37
3 Ergebnisse
3
Ergebnisse
3.1
Entwicklung einer Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
3.1.1
Auswahl der STA1-3 Gene als Zielregionen
Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Stämme besitzen als physiologisches Unterscheidungsmerkmal zu anderen Stämmen der gleichen Art die Fähigkeit Stärke zu Glucose,
Maltose und Dextrinen abzubauen (Andrews und Gilliland 1952). Die hierfür verantwortliche
extrazelluläre Glucoamylase (1,4-α-Glucosidase, EC 3.2.1.3) wird von einem von drei unabhängigen Genen der Multigen-Familie STA kodiert, die auf den Chromosomen IV (STA1), II
(STA2) und XIV (STA3) im Genom angeordnet sind (Tamaki 1978, Erratt und Stewart 1978,
Pretorius und Marmur 1988, Bignell und Evans 1990). Der größte Teil der codierenden Sequenz der STA Gene ist identisch mit dem Gen SGA1 (Chromosom IX), das bei allen S. cerevisiae Stämmen vorkommt und eine intrazelluläre, sporulations-spezifische Glucoamylase
kodiert (Pretorius und Marmur 1988).
S. cerevisiae
SGA1
5´
MUC1
3´
S2
5´
1530 bp
2538 bp
S. cerevisiae var.
diastaticus
5´
S1
909 bp
STA
2538 bp
S2
3´
129 bp
780 bp
S1
1530 bp
3´
SGA1
Abb. 3.1: Anordnung der identischen Sequenzabschnitte der Gene SGA1 und MUC1
in der STA Multigen-Familie
Die Gene SGA1 und MUC1, die in allen S. cerevisiae Stämmen vorkommen, beinhalten jeweils Sequenzabschnitte, die in einer veränderten Anordnung auch in den Genen STA1-3 vorkommen. Die
STA Multigen-Familie ist im Gegensatz zu den Genen SGA1 und MUC1 nur in S. cerevisiae var. diastaticus zu finden. Eine direkte Sequenzwiederholung im S1 Sequenzabschnitt von 129 bp Länge ist
nicht in den STA Genen enthalten. In der Konfiguration der STA Gene kodiert die SGA1 Sequenz die
katalytische Domäne und die S2-S1 Sequenzen bilden den Promotor, ein hydrophobes, membrangängiges Leaderpeptid und einen Threonin/Serin-reichen Bereich (Abbildung verändert nach Vivier et
al. 1997).
38
3 Ergebnisse
Die STA Gene unterscheiden sich jedoch von dem SGA1 Gen in zwei zusätzlichen Sequenzabschnitten (S1 und S2), die ein hydrophobes, membrangängiges Leaderpeptid und
einen Threonin/Serin-reichen Bereich kodieren (Yamashita et al. 1985b, 1987). Diese Sequenzabschnitte S1 und S2, die in den STA Genen in der 5´-Region nebeneinander vorliegen, sind ebenfalls bei allen S. cerevisiae Stämmen im Gen MUC1 (=Flo11) (Chromosom IX)
vorhanden und sind dort ca. 2,5 kbp getrennt von einander angeordnet (Lambrechts et al.
1995, 1996). Die genaue Anordnung der Genabschnitte verdeutlicht die Abbildung 3.1.
3.1.2
Anordnung der Primer und Hybridisierungssonden im STA Gen
Die Sequenzen der Gene STA1 und STA2 (GenBank Acc. No. X02649.1 und X13857.1)
dienten als Grundlage für die Konstruktion der Primer und Hybridisierungssonden. Der 5´Primer SD1f wurde im S1 Bereich (Position 848-868) und der 3´-Primer SD1r im SGA Bereich (Position 1086-1107) platziert, da diese Bereiche nur in den STA Genen nebeneinander angeordnet sind. Das resultierende Amplifikat hatte eine Länge von 260 bp. Die Sonden
SDF1f (Position 962-991) und SDR1f (Position 994-1018) wurden so konstruiert, dass sie im
Übergangsbereich zwischen den Sequenzabschnitten S1 und SGA hybridisieren. Das mit
Fluorescein markierte 3´-Ende der Donator-Sonde SDF1f schloss mit dem Ende des S1 Sequenzabschnitts ab. Der Targetbereich der Akzeptor-Sonde SDR1f, die mit dem LightCycler®-Red 640 Fluorochrom am 5´-Ende markiert wurde, begann zwei Basen nach Beginn des
SGA Sequenzabschnitts (Abb. 3.2).
841------------SD1f--------------------------------------------900
CTGGTACTGG CGAATACACT ACTGAAGCTA CCGCCCCTGT TACAACAGCT GTCACAACCA
901------------------------------------------------------------960
CCGTTGTTAC CACTGAATCC TCTACGGGTA CTAACTCCGC TGGTAAGACG ACAACTAGTT
961-----------SDF1f----------------------------SDR1f----------1020
ACACAACAAA GTCTGTACCA ACCACCTATG TATTTGACTT TGGCAAGGGC ATTCTCGATC
1021----------------------------------------------------------1080
AAAGCTGCGG CGGTGTATTT TCAAACAACG GCTCTTCGCA AGTGCAGCTG CGGGATGTAG
1081-----------SD1r----------1110
TCTTGATGAA TGGGACAGTG GTATACGATT
Abb. 3.2: Anordnung der Primer und Hybridisierungssonden im STA1 Gen
Dargestellt ist der Sequenzabschnitt des STA1 Gens (5´ - 3´ Orientierung, GenBank Acc. No.
X02649.1), der bei der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus mit dem 5´-Primer SD1f und
dem 3´-Primer SD1r amplifiziert wurde. Die Primer lagen im S1 (SD1f) bzw. SGA (SD1r) Sequenzbereich. Die Detektion der Amplifikate erfolgte mit den Hybridisierungssonden SDF1f und SDR1f, die im
Übergangsbereich der S1 und SGA Sequenzabschnitte hybridisierten.
39
3 Ergebnisse
3.1.3
Konstruktion der internen Amplifikationskontrolle und der Positivkontrolle
Falsch-negative Ergebnisse, die durch Inhibition von PCR-Reaktionen auftreten können,
wurden durch den Einsatz einer linearisierten Plasmid-DNA, die in jeder PCR-Reaktion konkurrierend eingesetzt wurde, ausgeschlossen. Der Nachweis der Amplifikation dieser internen Amplifikationskontrolle (IAK), deren Sequenz bis auf den Austausch der Zielregion der
Hybridisierungssonde SDR1f durch Einbau eines komplett neuen Sequenzabschnittes identisch mit der Sequenz des Wildtyps war, erfolgte mit der LightCycler®-Red 705 markierten
Akzeptor-Sonde LMRST1. Konstruiert wurde die interne Amplifikationskontrolle über PCRMutagenese mit den Primern SDip1f und SDip1r (Kap. 2.9.1.2). Nach Ligation der PCRProdukte in den Vektor pGEM®-T (Kap. 2.9.3), Transformation in E. coli XL-1 Blue Zellen
(Kap. 2.9.4.2), Kontrolle der Klone über PCR (Kap. 2.9.4.3) und Linearisierung der gereinigten Plasmide mit der Restriktionsendonuclease Sca I (Kap. 2.9.6) wurde der Erfolg der Herstellung durch Sequenzierung (Kap. 2.10) und Alignment (Kap.2.11) mit der Sequenz des
STA1 Gens bestätigt (Abb. 3.3). Bei allen weiteren Versuchen wurde von der IAK je Reaktion
0,2 fg eingesetzt.
IAK
STA1
841-----------SD1f----------------------------------------900
-------TGGCGAATACACTACTGAAGCTACCGCCCCTGTTACAACAGCTGTCACAACCA
CTGGTACTGGCGAATACACTACTGAAGCTACCGCCCCTGTTACAACAGCTGTCACAACCA
IAK
STA1
901-------------------------------------------------------960
CCGTTGTTACCACTGAATCCTCTACGGGTACTAACTCCGCTGGTAAGACGACAACTAGTT
CCGTTGTTACCACTGAATCCTCTACGGGTACTAACTCCGCTGGTAAGACGACAACTAGTT
IAK
STA1
961----------SDF1f-----------------------SDR1f-LMRST1----1020
ACACAACAAAGTCTGTACCAACCACCTATGTATCATTATCCGATACGTTCTTCCAGTGCC
ACACAACAAAGTCTGTACCAACCACCTATGTATTTGACTTTGGCAAGGGCATTCT---CG
IAK
STA1
1021-----------------------------------------------------1080
ATCAAAGCTGCGGCGGTGTATTTTCAAACAACGGCTCTTCGCAAGTGCAGCTGCGGGATG
ATCAAAGCTGCGGCGGTGTATTTTCAAACAACGGCTCTTCGCAAGTGCAGCTGCGGGATG
IAK
STA1
1081-----------SD1r----------------------------1130
TAGTCTTGATGAATGGGACAGTGGTATACG-------------------TAGTCTTGATGAATGGGACAGTGGTATACGATTCAAACGGCGCTTGGGAC
Abb. 3.3: Sequenzvergleich der IAK mit dem STA1 Gen
Das Alignment zeigt die Sequenzen der IAK des Real-Time PCR Nachweissystems für S. cerevisiae
var. diastaticus und die Wildtyp Sequenz des STA1 Gens (GenBank Acc. No. X02649.1). Die Primer
SD1f und SD1r sowie die Hybridisierungssonde SDF1f waren für beide Sequenzen spezifisch. Die
Hybridisierungssonde SDR1f war für die Wildtyp-Sequenz und die Sonde LMRST1 für die IAKSequenz spezifisch. Die Markierung der Sonden SDR1f und LMRST1 mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen ermöglichte eine Unterscheidung zwischen IAK und Wildtyp Amplifikaten in der PCR.
40
3 Ergebnisse
Mit dem Einsatz einer Positivkontrolle (PK) können die eingesetzten Reagenzien und die
Herstellung des PCR-Mixes kontrolliert werden. Die PK wurde auf die gleiche Weise wie die
IAK hergestellt (Kap. 2.9.1.2), jedoch wurde nicht die gesamte Zielsequenz einer Sonde
ausgetauscht, sondern im Targetbereich der Sonde SDF1f eine Punktmutation eingefügt
(Abb. 3.4). Durch diese Punktmutation war eine Differenzierung zwischen der PK und positiven Ergebnissen über die Schmelzkurven-Analyse im Kanal 640/Back 530 möglich. Diese
Differenzierung war notwendig, um ein positives Ergebnis, das durch Verschleppung von
Plasmid-DNA der PK in den Reaktionsansatz zustande kommen könnten, sicher ausschließen zu können. Die Hybridisierungsonde SDF1 schmolz ca. 4 °C früher vom Amplifikat der
PK ab als beim Wildtyp (Abb. 3.5). Die PK war über den Schmelzhöchstwert (Maximum der
negativen ersten Ableitung der Fluoreszenz, aufgenommen über die Temperatur, -(d/dT)) bei
ca. 58 °C deutlich von positiven Proben zu unterscheiden, bei denen die Sonde SDF1f ab 62
°C abschmolz. In der Real-Time PCR wurden 5 fg je Reaktion eingesetzt.
PK
STA1
841-----------SD1f----------------------------------------900
-------TGGCGAATACACTACTGAAGCTACCGCCCCTGTTACAACAGCTGTCACAACCA
CTGGTACTGGCGAATACACTACTGAAGCTACCGCCCCTGTTACAACAGCTGTCACAACCA
PK
STA1
901-------------------------------------------------------960
CCGTTGTTACCACTGAATCCTCTACGGGTACTAACTCCGCTGGTAAGACGACAACTAGTT
CCGTTGTTACCACTGAATCCTCTACGGGTACTAACTCCGCTGGTAAGACGACAACTAGTT
PK
STA1
961----------SDF1f-------------------------SDR1f---------1020
ACACAACAAAGGCTGTACCAACCACCTATGTATTTGACTTTGGCAAGGGCATTCTCGATC
ACACAACAAAGTCTGTACCAACCACCTATGTATTTGACTTTGGCAAGGGCATTCTCGATC
PK
STA1
1021-----------------------------------------------------1080
AAAGCTGCGGCGGTGTATTTTCAAACAACGGCTCTTCGCAAGTGCAGCTGCGGGATGTAG
AAAGCTGCGGCGGTGTATTTTCAAACAACGGCTCTTCGCAAGTGCAGCTGCGGGATGTAG
PK
STA1
1081----------SD1r-----------------------------1130
TCTTGATGAATGGGACAGTGGTATACG----------------------TCTTGATGAATGGGACAGTGGTATACGATTCAAACGGCGCTTGGGACAGT
Abb. 3.4: Sequenzvergleich der PK mit dem STA1 Gen
Das Alignment zeigt die Sequenzen der PK des Real-Time PCR Nachweissystems für S. cerevisiae
var. diastaticus und die Wildtyp Sequenz des STA1 Gens (GenBank Acc. No. X02649.1). Die Primer
SD1f und SD1r sowie die Hybridisierungssonde SDR1f waren für beide Sequenzen spezifisch. Die
Hybridisierungssonde SDF1f war für die Wildtyp Sequenz 100-%ig spezifisch. Bei der PK bestannt im
Bereich der Bindungsstelle der Sonde SDF1f die Nucleotidfehlbindung T:C. Bei der SchmelzkurvenAnalyse verminderte diese Fehlbindung zwischen den Amplifikaten der PK und der Sonde SDF1f die
Schmelztemperatur gegenüber dem Wildtyp um ca. 4 °C, sodass eine klare Abtrennung zwischen
positiven Proben und der PK möglich war.
41
3 Ergebnisse
Abb. 3.5: Differenzierung zwischen der PK und positiven Proben bei der Real-Time
PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
Dargestellt ist die Schmelzkurven-Analyse im Kanal 640/Back 530, die bei der Real-Time PCR für S.
cerevisiae var. diastaticus eine Differenzierung zwischen der PK und positiven Proben zuließ. Die
Real-Time PCR wurde mit 2500 GÄ (blaue Linie), 1000 GÄ (grüne Linie), 100 GÄ (rote Linie) und 10
GÄ (blaue Punkte) quantifizierter, RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) von S. cerevisiae var. diastaticus
(DSM 70487) durchgeführt. Von der PK wurden 5 fg (schwarze Linie) eingesetzt und als Negativkontrolle wurde PCR-H2O (rote Punkte) verwendet.
3.1.4
Spezifität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
Die Spezifität der Real-Time PCR wurde mit 25 S. cerevisiae var. diastaticus Stämmen, 24
weiteren Saccharomyces Stämmen, 32 anderen, brauereirelevanten Hefearten und 18 Bakterienarten getestet. Nur die 25 S. cerevisiae var. diastaticus Stämme wurden nach mechanisch/thermischer DNA-Extraktion (Kap. 2.6.1) mit dem System qualitativ nachgewiesen
(Tab. 3.1 und Abb. 3.6). Die Cp-Werte der Isolate lagen zwischen 15 und 25, da nicht quantifizierte DNA eingesetzt wurde. Detaillierte Angaben zu den getesteten Stämmen zeigt die
Tabelle 6.1 im Anhang. Die IAK wurde in allen Reaktionsansätzen, die negativ im Kanal
640/Back 530 waren, amplifiziert und wurde demnach nicht durch eine konkurrierende Bildung unspezifischer Amplifikate unterdrückt. Die Schmelzkurven-Analyse zeigte, dass bei
allen Stämmen die Sonden ihren Schmelzhöchstwert, bei der die Fluoreszenzabnahme ein
Maximum erreichte, bei ca. 62 °C hatten (Abb. 3.6).
42
3 Ergebnisse
Tab. 3.1:
Spezifität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
Getestete Gruppen
Anteil positiv getesteter Stämme
S. cerevisiae var. diastaticus
25/25
nicht-diastaticus Saccharomyces sp.
0/24
weitere Hefearten
0/32
Bakterienarten
0/18
Die Testung erfolgte mit DNA-Proben, die mit der mechanisch/thermischen Extraktionsmethode gewonnen wurden (Kap. 2.6.1). Angegeben wurde die Anzahl an Stämmen, die mit der Real-Time PCR
für S. cerevisiae var. diastaticus nachgewiesen wurden, an der Gesamtheit der getesteten Stämme.
Abb. 3.6: Amplifikation und Schmelzkurven-Analyse des STA Genfragments von S.
cerevisiae. var. diastaticus Stämmen
Die Real-Time PCR wurde mit DNA von 25 S. cerevisiae var. diastaticus Stämmen (blaue Linien) getestet. Die DNA-Extraktion erfolgte mit der mechanisch/thermischen Methode (Kap. 2.6.1), nachdem
die S. c. var. diastaticus Stämme 48 Stunden in YM-Medium angezogen wurden. Zur Kontrolle der
PCR wurden 5 fg der PK (schwarze Linie) eingesetzt. Als Negativkontrolle (rote Linie) wurde undotiertes YM-Medium zusammen mit den Hefestämmen aufgearbeitet und in der PCR eingesetzt.
Die Versuche zur Spezifität wurden auch ohne IAK durchgeführt und anschließend über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, um die Länge der gebildeten Amplifikate zu kontrollieren
und mögliche unspezifische PCR-Produkte zu detektieren. Die IAK wurde bei diesen Versuchen nicht eingesetzt, da das gebildete Fragment mit 263 bp fast die gleiche Länge wie das
beim Wildtyp gebildete Amplifikat hatte und demnach über Agarosegelelektrophorese nicht
von diesem zu unterscheiden gewesen wäre. Die mit DNA von S. cerevisiae var. diastaticus
amplifizierten PCR-Produkte hatten alle eine Länge von 260 bp. Bei den getesteten „Nicht“Targetorganismen wurde keine Amplifikation beobachtet. Die Abbildung 3.7 zeigt Agarosegelelektrophorese Ergebnisse nach Real-Time PCR mit DNA einiger S. cerevisiae var. diastaticus Stämme (Typstämme und Brauereiisolate) und nahe verwandter Saccharomyces
sp..
43
3 Ergebnisse
Abb. 3.7: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time PCR mit dem S. cerevisiae var.
diastaticus System
Die Real-Time PCR wurde ohne IAK und mit DNA-Proben, die mit der mechanisch/thermischen Extraktionsmethode gewonnen wurden (Kap. 2.6.1), durchgeführt. Die Agarosegelelektrophorese wurde
mit je 5 µl der Reaktionsansätze in einem 2-%igen Gel durchgeführt (Kap. 2.8).
A.:
1: Molekulargewichtsmarker VI
2: Saccharomyces cerevisiae (DSM 1333)
3: S. cerevisiae var. diastaticus (BCD 1257)
4: Saccharomyces exiguus (BCD 1491)
5: Saccharomyces exiguus (BCD 1493)
6: S. cerevisiae var. diastaticus (VTT C-68059)
7: S. cerevisiae var. diastaticus (VTT C-70060)
8: S. cerevisiae var. diastaticus (VTT C-82101)
9: Saccharomyces pastorianus (DSM 6580)
10: Saccharomyces bayanus (DSM 70412)
11: S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487)
12: Negativkontrolle
B.:
1: Molekulargewichtsmarker VI
2: S. cerevisiae (Brauerei D, Brauhefe)
3: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei D)
4: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei D)
5: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei B)
6: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei B)
7: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A)
8: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A)
9: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A)
10: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A)
11: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A)
12: S. cerevisiae var. diastaticus (Brauerei A)
13: S. cerevisiae var. diastaticus (BCD 1257)
14: Negativkontrolle
44
3 Ergebnisse
Die Anwendbarkeit des Enzyms Uracil-N-Glycosylase (UNG), das zum Abbau von Amplifikaten aus vorherigen Reaktionen bei jeder PCR-Reaktion eingesetzt wurde, wurde mit aufgereinigten (Kap. 2.9.2) und quantifizierten Amplifikaten (Kap. 2.7.2) von S. c. var. diastaticus
(DSM 70487) getestet. Amplifikatmengen zwischen 103 und 107 Amplifikaten je Reaktion
wurden mit der UNG vollständig abgebaut und die Kontrollen ohne UNG wurden alle amplifiziert (Tab. 3.2).
Tab. 3.2:
Abbaubarkeit von Amplifikaten des STA Gens mit dem Enzym UNG
Amplifikatmenge
[Kopien/Reaktion]
103
104
105
106
107
Cp-Werte im Kanal 640/Back 530
ohne UNG
mit UNG
28,13
negativ
25,05
negativ
20,70
negativ
17,96
negativ
14,97
negativ
Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit bzw. ohne 0,1 U/Reaktion UNG mit
unterschiedlichen Mengen an Amplifikaten des STA Gens von S. cerevisiae var. diastaticus durchgeführt. Die Amplifikate wurden zuvor aufgereinigt und quantifiziert (Kap. 2.9.2 und 2.7.2).
3.1.5
Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
Die Sensitivität der Real-Time PCR wurde mit fluorometrisch quantifizierter, RNA- und Protein-freier DNA (Kap. 2.6.2 und Kap. 2.7.1) der S. cerevisiae var. diastaticus Stämme DSM
70487 und VTT C-82101 getestet. Außerdem wurde das System unter Einbeziehung der
mechanisch/thermischen DNA-Extraktion mit dotiertem YM-Medium evaluiert. Das YMMedium wurde mit 102, 103 oder 104 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487)
und zusätzlich mit 108 Zellen/ml S. cerevisiae (DSM 1333) dotiert (Kap. 2.15.3). Mit den S.
cerevisiae Zellen als Begleitflora wurde getestet, ob sich eine lineare Amplifikation aufgrund
der auch bei S. cerevisiae vorhandenen Bindungssequenzen der Primer SD1f und SD1r in
den Genen SGA1 und MUC1 störend auf das PCR-System auswirkt. Beide Instrumente für
den mechanischen Zellaufschluss (MagNA Lyser und Disruptor Genie) wurden getestet.
Die mit quantifizierter DNA ermittelte Nachweisempfindlichkeit des PCR-Systems lag zwischen 5 (96 % positive Proben) und 10 (100 % positive Proben) Genomäquivalenten pro
Reaktionsansatz (Tab. 3.3 und Abb. 3.8). 1 GÄ wurde noch in 11 von 24 getesteten Proben
nachgewiesen. Bei einer angenommenen Genomgröße von S. cerevisiae von 12,2 Mbp
(GenBank) entsprach 1 GÄ 13,3 fg DNA. Unterschiede zwischen den ermittelten CpMittelwerten der beiden untersuchten S. cerevisiae var. diastaticus Stämme wurden nicht
festgestellt.
45
3 Ergebnisse
Tab. 3.3:
Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
S. c. var. diastaticus Stamm
DSM 70487
VTT C-82101
DNA Konzentration Anteil positiver
[GÄ/Reaktion]
Proben
Cp-Mittelwerte
(640/Back 530)
1000
100
50
25
10
5
1
1000
100
50
25
10
5
1
27,59 ± 0,17
30,64 ± 0,16
31,49 ± 0,28
32,19 ± 0,31
32,85 ± 0,44
32,95 ± 0,34
33,29 ± 0,79
27,81 ± 0,28
30,87 ± 0,22
31,63 ± 0,24
32,35 ± 0,40
32,99 ± 0,58
33,04 ± 0,35
33,31 ± 0,98
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
6/12 = 50 %
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
12/12 = 100 %
11/12 = 92 %
5/12 = 42 %
Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit quantifizierter, RNA-freier DNA (Kap.
2.6.2) von zwei S. cerevisiae var. diastaticus Stämmen (DSM 70487 und VTT C-82101) getestet.
Abb. 3.8: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
Dargestellt sind die Amplifikationskurven im Kanal 640/Back 530, die mit der Real-Time PCR für S.
cerevisiae var. diastaticus mit 1000 GÄ (schwarze Linie), 100 GÄ (rote Linie), 50 GÄ (grüne Linie), 25
GÄ (baue Linie), 10 GÄ (schwarze Punkte), 5 GÄ (rote Punkte) und 1 GÄ (grüne Punkte) quantifizierter, RNA-freier DNA (Kap. 2.6.2) von S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) generiert wurden. Als
Negativkontrolle wurde PCR-H2O (blaue Punkte) verwendet.
46
3 Ergebnisse
Die Sensitivität des Real-Time PCR-Systems unter Einbeziehung der Probenaufarbeitung
und bei einem Hintergrund von 108 Zellen/ml S. cerevisiae lag zwischen 102 und 103 Zellen/ml (Tab. 3.4 und Abb. 3.9). Umgerechnet auf das in der PCR eingesetzte Probenvolumen
von 5 µl entsprach dies ca. 2,5 bis 25 GÄ pro Reaktionsansatz, wenn eine 100-%ige DNAExtraktion vorausgesetzt wird. Durch die mechanisch/thermische DNA-Extraktion oder die
Begleitflora entstanden demnach keine Sensitivitätsverluste. Beide Instrumente waren für
den mechanischen Zellaufschluss (MagNA Lyser oder Disruptor Genie) geeignet. Über die
Schmelzkurven-Analyse waren positive Proben von der PK zu unterscheiden (Abb. 3.9).
Tab. 3.4:
Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei einer
hohen Begleitflora
Instrument
MagNA Lyser
Disruptor Genie
S. c. var. diastaticus
[Zellen/ml]
104
103
102
104
103
102
Anteil positiver
Proben
6/6 = 100 %
6/6 = 100 %
4/6 = 67 %
6/6 = 100 %
6/6 = 100 %
3/6 = 50 %
Cp-Mittelwerte
(640/Back 530)
31,13 ± 0,40
33,05 ± 0,19
33,82 ± 0,30
30,58 ± 0,63
33,43 ± 0,99
34,52 ± 0,75
Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit dotierten Proben, die mechanisch/thermisch mit dem MagNA Lyser oder Disruptor Genie Instrument aufgearbeitet wurden, getestet (Kap. 2.6.1). Hierfür wurde YM-Medium mit 108 Zellen/ml S. cerevisiae (DSM 1333) und der jeweiligen Konzentration an S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert.
Abb. 3.9: Sensitivität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus bei einer
hohen Begleitflora
Dargestellt sind die Amplifikationskurven (links) und die Schmelzkurven-Analyse (rechts), die mit der
Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus und mechanisch/thermisch aufgearbeiteten, dotierten
Proben (Kap. 2.6.1) generiert wurden. Die Proben (YM-Medium) waren mit 104 Zellen/ml (grüne Linie),
103 Zellen/ml (rote Linie), 102 Zellen/ml (blaue Linie) S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert. Alle Proben waren zusätzlich mit 108 Zellen/ml S. cerevisiae (DSM 1333) dotiert. Als Kontrollen
wurden eine undotierte Probe (grüne Punkte) und die PK (schwarze Linie) mitgeführt.
47
3 Ergebnisse
Die Amplifikation der internen Amplifikationskontrolle wurde in Proben, die nur mit 108 Zellen/ml S. cerevisiae dotiert wurden, nicht negativ beeinflusst (Tab. 3.5).
Tab. 3.5:
Amplifikation der IAK der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
bei einer hohen Begleitflora
Instrument
S. cerevisiae
[Zellen/ml]
Anteil positiver
Proben
Cp-Mittelwerte
(705/Back 530)
MagNA Lyser
108
8/8 = 100 %
33,90 ± 0,80
8
8/8 = 100 %
34,29 ± 0,52
Disruptor Genie
10
Die IAK der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit Proben (YM-Medium), die mit
108 Zellen/ml S. cerevisiae (DSM 1333) dotiert und mechanisch/thermisch mit dem MagNA Lyser oder
Disruptor Genie Instrument aufgearbeitet wurden, getestet (Kap. 2.6.1).
3.1.6
Kompatibilität der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
mit unterschiedlichen Probenmatrices
Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus wurde mit 16 unterschiedlichen Anreicherungsmedien, Prozessproben und Endprodukten getestet (Herkunft siehe Kap. 2.4). Dotiert wurden je 1 ml Probe mit 103 oder 104 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus (DSM
70487). Die mechanisch/thermische Aufarbeitung der Proben erfolgte zum Vergleich mit dem
MagNA Lyser und Disruptor Genie Instrument.
104 Zellen/ml wurden in allen Probenmatrices unabhängig vom verwendeten Probenaufarbeitungsinstrument 100-%ig nachgewiesen (Tab. 3.6). 103 Zellen/ml waren in den Proben SSL
Bouillon, Desinfektionsmittelwanne, Pils (Bitburger), Biermixgetränk (Bibop) im Gegensatz zu
den restlichen Probenmatrices nicht 100-%ig nachweisbar.
Tab. 3.6:
Eignung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus in Kombination mit der mechanisch/thermischen Aufarbeitung für unterschiedliche Probenmatrices
Probenmatrix
SSL-Bouillon
SSL-Bouillon/alkoholfreies
Bier (50/50 v/v)
NBB-Bouillon
MRSF-Bouillon
Vorwürze
Würze (Pfanne voll)
Instrument
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
48
Anteil positiver Proben im Kanal
640/Back 530
104 Zellen/ml
103 Zellen/ml
3/3 = 100 %
0/3 = 0 %
3/3 = 100 %
2/3 = 67 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3 Ergebnisse
Tab. 3.6:
Fortsetzung
Probenmatrix
Instrument
Würze (PlattenkühlerAuslauf)
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
MagNA Lyser
Disruptor Genie
Retourwasser
Desinfektionsmittelwanne
Jungbier
Wasser aus Kastenwäscher
Pils (Bitburger)
Light Bier (Drive)
Biermixgetränk (Bibop)
Schwarzbier (Köstritzer)
Alkoholfreier Bier
Anteil positiver Proben im Kanal
640/Back 530
103 Zellen/ml
104 Zellen/ml
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
1/3 = 33 %
3/3 = 100 %
0/3 = 0 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
2/3 = 67 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
2/3 = 67 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
3/3 = 100 %
1ml der jeweiligen Probenmatrix wurden mit 103 bzw. 104 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus
(DSM 70487) dotiert, mechanisch/thermisch aufgearbeitet (Kap. 2.6.1) und je 5 µl in der Real-Time
PCR eingesetzt. Alle undotierten Proben und alle dotierten Proben, die im Kanal 640/Back 530 negativ waren, waren im für die IAK spezifischen Kanal 705/Back 530 positiv.
3.1.7
Anwendbarkeit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus
in der Praxis
Die Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus und die mechanisch/thermische Aufarbeitungsmethode wurde von vier Brauereien getestet. Die Testung gliederte sich in drei Versuchsteile. Im ersten Versuchsteil wurden Proben aus der Routine getestet, um die Robustheit des Systems in Bezug auf die interne Amplifikationskontrolle zu testen. Der zweite Versuchsteil umfasste den Test von S. cerevisiae var. diastaticus Reinkulturen (Typstämme oder Eigenisolate der Brauereien). Die Sensitivität des Systems wurde in einem dritten Teil mit
Verdünnungsreihen von unterschiedlichen, dotierten Probenmaterialien getestet (Kap. 2.16).
3.1.7.1
Versuchsteil 1: Robustheit
Je Probenart wurden zwei Probenvolumina aufgearbeitet und mit dem PCR-System im Duplikat getestet (Tab. 3.7). Bis auf eine Probe (Hygieneabstrich, Brauerei D) wies keine Probe
eine Kontamination mit S. cerevisiae var. diastaticus auf. Die IAK wurde nur bei den Probenmatrices Presshefe (Brauerei C), Hefe-Lagertank (Brauerei C) und Laugetank (Brauerei
B) inhibiert. Die Reduktion des Probevolumens von 1,0 ml auf 0,1 ml beseitigte die Inhibition
49
3 Ergebnisse
bei den Probematrices Presshefe und Hefe-Lagertank jedoch nicht bei der Probenmatrix
Laugetank. Eine Reduktion des Probevolumens verbesserte auch bei den Proben Sauergut 3, Hefetank, Säuretank (Brauerei B) und Sirup (Brauerei D) die Amplifikation der IAK. Die
drei eingesetzten Methoden zur Probenaufarbeitung (MagNA Pure DNA Isolation Kit III
[Brauerei A], mechanisch/thermischer Aufschluss mit MagNA Lyser [Brauerei C und D] oder
Disruptor Genie [Brauerei B]) waren für die Anwendung bei unterschiedlichen Probenmatrices geeignet.
Tab. 3.7:
Ergebnisse des Versuchsteils 1: Robustheit
Brauerei Probe
A
B
C
Würze
Erntehefe
Pallanlage = Hefebiergewinnung
Hefereinzucht
Filtereinlauf + Kieselgur
Recycling-Wasser mit Desinfektionsmittel
Kronenkorken 3 Tage in Pils
Spülwasserflasche mit Ringerlösung ausgespült
Abstrich verkeimte Zapfanlage mit Fremdhefe
Lactobacillus lindneri in betriebseigenem Medium
0,5 l Dose Schwarzbier vor der Pasteurisierung
0,33 l Dose Pils aus der Abfüllung
Sauergut 2
Sauergut 3
Jungbierkühler
Hefetank
Säuretank
Laugetank
Seperator-Unfiltrat
Puffertank Unfiltrat
KG-Filter
ZHF-Filter
Spülwasser
Alkoholfreies Bier
Presshefe
Hefe-Lagertank
Anzuchttank
Würzekühler
Standwasser
Fermentationstank (Tag 0)
Fermentationstank (Tag 3)
Fermentationstank (RUH)
Lagerbiertank
Filtration
Helles Bier
Flasche vor der Pasteurisation
Flasche nach der Pasteurisation
Würze
50
Cp-Werte F3/BackF1 oder
705/Back530 je Probenvolumen
1,0 ml
0,1 ml
35,48
34,32
33,62
33,43
34,01
34,12
33,32
34,27
33,91
34,05
34,42
34,49
34,40
33,60
34,06
33,92
34,15
34,23
34,02
33,80
34,47
34,16
34,28
33,80
33,72
34,52
33,63
34,48
33,63
34,00
34,10
33,73
33,60
34,09
33,93
34,31
34,65
33,79
33,73
34,18
34,51
33,97
33,89
34,07
34,11
33,79
33,93
34,61
34,22
33,97
34,56
32,94
40,28
34,69
35,13
33,91
34,27
33,18
35,22
34,59
39,25
36,41
35,17
33,62
34,46
> 40
35,93
32,61
35,18
34,10
35,07
33,55
35,15
34,06
34,54
34,17
36,25
33,30
35,25
34,47
34,30
33,83
35,26
34,00
35,29
35,12
33,25
33,87
32,97
33,47
33,57
34,51
34,63
34,55
34,04
35,68
33,69
34,10
33,23
32,82
33,09
32,88
33,08
33,60
33,11
32,48
32,32
32,72
33,12
34,06
33,30
32,50
34,64
34,54
33,16
32,74
33,63
33,18
33,08
33,11
32,26
32,86
32,21
32,68
32,86
32,76
32,90
33,49
33,06
32,62
33,18
33,22
32,91
32,81
32,84
33,07
32,25
32,70
32,94
32,93
33,30
32,51
32,50
33,03
3 Ergebnisse
Tab. 3.7:
Fortsetzung
Brauerei Probe
D
Pils
Pils+NBB-C Bouillon
MRSF Bouillon (Charge 1)
MRSF Bouillon (Charge 2)
Kieselgur Einlauf
Reinzuchthefe
Jungbier
Hefebier
Anstellwürze
MRS Bouillon
Hygieneabstrich in SSL Bouillon*
Sirup (für die Herstellung von Biermixgetränken)
Cp-Werte F3/BackF1 oder
705/Back530 je Probenvolumen
1,0 ml
0,1 ml
34,28
33,78
33,76
33,66
35,01
34,51
33,87
35,10
34,30
34,15
34,61
33,56
34,43
33,49
34,53
34,27
33,87
33,75
33,77
33,80
33,96
34,01
34,24
33,99
34,33
33,99
33,89
34,55
34,01
34,09
33,68
34,06
33,51
35,02
33,84
34,49
34,18
33,82
33,70
34,14
32,23
31,86
32,34
32,87
35,02
38,02
33,81
34,02
Alle Proben der Brauereien B, C und D wurden mit der mechanisch/thermischen DNAExtraktionsmethode (Kap. 2.6.1) behandelt und 5 µl des Eluats in der Real-Time PCR für S. cerevisiae
var. diastaticus eingesetzt. Die Proben der Brauerei A wurden mit dem MagNA Pure DNA Isolation Kit
III behandelt. Die Amplifikation der IAK wurde im Kanal F3/Back F1 bzw. 640/Back 530 detektiert.
*: Probe war positiv im Kanal F2/Back F1 (1,0 ml: Cp-Werte 32,09 und 31,71; 0,1 ml: Cp-Werte 32,17,
32,71).
3.1.7.2
Versuchsteil 2: Spezifität
Alle 19 Reinkulturen (Eigenisolate oder Stämme aus Stammsammlungen) wurden bei den
Brauereien mit dem Real-Time PCR-System als S. cerevisiae var. diastaticus identifiziert
(Tab. 3.8). Bei der Schmelzkurven-Analyse waren die Proben mit einem Schmelzhöchstwert
oberhalb von 62 °C eindeutig von der PK mit einem Schmelzhöchstwert von ca. 58 °C zu
unterscheiden.
Tab. 3.8:
Ergebnisse des Versuchsteils 2: Spezifität
Brauerei
A
B
C
D
S. c. var. diastaticus Stämme
4 Eigenisolate
DSM 70487
5 Eigenisolate
2 Eigenisolate
DSM 70487
VTT C-82101
5 Eigenisolate
Ergebnis
positiv
positiv
positiv
positiv
positiv
positiv
positiv
Die Proben der Hefestämme wurden mit dem mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsverfahren
aufgearbeitet (Kap. 2.6.1) und mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus getestet.
3.1.7.3
Versuchsteil 3: Sensitivität
Unabhängig von der Probenaufarbeitung und den Probenmatrices war bei 17 von 19 Probenmatrices ein Kontaminationslevel von 102 Zellen/ml mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus nachweisbar (Tab. 3.9 und Abb. 3.10). Nur bei den Probenmatrices
Reinzuchthefe und SSL-Bouillon lag der nachweisbare Level bei 103 Zellen/ml.
51
3 Ergebnisse
Tab. 3.9:
Brauerei
A
B
C
D
Ergebnisse des Versuchsteils 3: Sensitivität
Probenmatrix
Jungbier
Stabibier
Pils
Würze
MRS Bouillon
Würze
NBB Bouillon
Dunkles Bier
Biermixgetränk
Hefe-Lagertank
Fermentationstank
Biertank (hell)
Lagerbiertank
Flaschenbier
filtriertes Pils
Jungbier
Reinzuchthefe
SSL-Bouillon
MRSF Bouillon
104
29,28
29,70
31,53
30,43
27,74
26,94
26,18
27,50
27,93
29,63
29,62
29,52
29,66
29,74
30,90
30,54
31,51
31,30
30,76
Cp-Wert (640/Back530 bzw. F2/BackF1)
je Zellzahl [Zellen/ml]
103
102
undotiert
32,98
33,17
32,34
33,88
33,12
34,05
32,96
34,54
30,88
32,14
30,47
33,92
30,47
33,92
30,52
32,61
29,14
32,55
31,44
33,60
32,86
33,98
32,70
32,50
32,11
32,84
32,62
33,81
33,16
33,65
33,44
34,12
33,56
33,87
33,32
33,56
-
Die Proben wurden bei den Brauereien dotiert und undotiert mechanisch/thermisch aufgearbeitet
(Kap. 2.6.1) und mit der Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus untersucht.
Abb. 3.10: Real-Time PCR Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus in Flaschenbier
Flaschenbier wurde bei der Brauerei C mit 104 Zellen/ml (schwarze Linie), 103 Zellen/ml (rote Linie)
bzw. 102 Zellen/ml (blaue Linie) dotiert, mechanisch/thermisch aufgearbeitet (Kap. 2.6.1) und mit der
Real-Time PCR für S. cerevisiae var. diastaticus untersucht. Die Auswertung der Amplifikation erfolgte
im Kanal 640/Back 530. Als Negativkontrolle wurde eine undotierte Probe (grüne Linie) mitgeführt.
52
3 Ergebnisse
3.2
Entwicklung einer Real-Time Consensus-PCR für Hefen
3.2.1
Auswahl des EF-3 Gens als Zielregion
Das EF-3 Gen wurde bisher teilweise oder vollständig von den Hefen S. cerevisiae, C. albicans, C. maltosa, C. melibiosica, C. zeylanoides, Cr. neoformans, K. lactis, P. pastoris, Sch.
pombe und Y. lipolytica sequenziert (Blakely 2001, Di Domenico et al. 1992, Mita et al. 1997,
Myers et al. 1992, Qin et al. 1990, Sandbaken et al. 1990a,b, Uritani et al. 1999). Aus dem
Reich der Eukaryoten liegen außerdem von dem humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (Acc. No. XM 743850) und der hefeähnlichen Art Pneumocystis carinii Sequenzen dieses Gens vor (Ypma-Wong et al. 1992). Der Elongationsfaktor 3 wurde als essentielles Protein der Elongationsphase bei der Translation von mRNA zum Protein beschrieben und bisher wurde kein entsprechendes Gegenstück bei Prokaryoten oder anderen
Eukaryoten als bei Hefen und Schimmelpilzen entdeckt (Dasmahapatra und Chakraburtty
1981, Hutchison et al. 1984, Sandbaken et al. 1990a,b, Skogerson und Wakatama 1976).
Bei dem Chlorella Virus CVK2 und E. coli wurden zwar je ein Gen mit teilweiser Sequenzhomologie zum EF-3 Gen entdeckt, (Belfield et al. 1995, Kiel et al. 1999, Yamada et al.
1993) die ausgewählte Sequenzregion zwischen den beiden Walker Signaturen der zweiten
ATP-Bindekassette wurde jedoch als spezifisch für das EF-3 Gen beschrieben (Abb. 3.11)
(Uritani et al. 1999).
EF-3 spezifische Sequenz 768-873
Walker A
Walker B
Walker A
Walker B
NH
COOH
1
1044
HS04 960-965
HSwb1 565-575
HS03 435-441
HS10 758-764
HS12/IV-IX 758-765
HSabc3 898-908
HS09 874-879
HS14/III-VIII 848-856
Abb. 3.11: Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz des Elongationsfaktors
3 von Hefen
Der Elongationsfaktor 3 besitzt zwei ATP-Bindungskassetten mit je einer Walker A und B Signatur
(schwarz). Innerhalb der zweiten ATP-Bindungsstelle liegt der für den Elongationsfaktor 3 spezifische
Sequenzbereich (grau), der als Target für die Real-Time Condsensus-PCR für Hefen ausgewählt wurde. Die 5´-Primer (rot) und 3´-Primer (blau), mit denen zur Sequenzierung Abschnitte des EF-3 Gens
von unterschiedlichen Hefearten amplifiziert wurden, wurden mit Angaben zu deren Position dargestellt.
53
3 Ergebnisse
3.2.2
Sequenzierung und Alignment des EF-3 Genbereichs
Aufbauend auf einem Alignment der bereits bekannten EF-3 Gen Sequenzen von C. albicans (Acc. No. AF038153), C. maltosa (Acc. No. AB018532), C. melibiosica (Acc. No.
AB018533), C. zeylanoides (Acc. No. AB018534), Cr. neoformans (Acc. No. AF316889), K.
lactis (Acc. No. AB018535), P. pastoris (Acc. No. AB018536), Sch. pombe (Acc. No.
AB018538) und Y. lipolytica (Acc. No. AB018537) wurden Primer entwickelt, um den EF-3
spezifischen Sequenzbereich einer größeren Anzahl an Hefen zu amplifizieren und anschließend zu sequenzieren (Kap. 2.9 und 2.10) (Abb. 3.11). Außerdem wurde ein von Uritani et al. (1999) beschriebenes Primerpaar (HS03/04) verwendet. Die Primer HS10 und HS09
wurden am 5´-Ende um ein Nucleotid mit der Base Adenin verlängert, um die Ligationseffizienz der PCR-Produkte in den Vektor pGEM®-T zu erhöhen.
Mit dem Primerpaar HS10/09 wurde mit der DNA folgender 49 Hefestämme direkt oder über
eine Nested-PCR ein ca. 367 bp großes Fragment amplifiziert und sequenziert. Bei der
Nested-PCR wurde zunächst ein 1,6 kbp großes PCR-Produkt mit dem Primerpaar
HS03/HS04 amplifiziert und anschließend 1:1000-verdünnt eingesetzt.
C. albicans (ATCC 10231)
C. krusei (BCD 689)
C. rugosa (BCD 814)
C. tenuis (BCD 819)
C. zeylanoides (BCD 690)
Deb. etchelsii (ATCC 20126)
Deb. marama (ATCC 11627)
Hyp. burtonii (BCD 859)
K. marxianus (BCD 2563)
K. marxianus (DSM 70106)
L. elongisporus (DSM 70320)
P. angusta (DSM 70277)
P. fermentans (DSM 70090)
S. bayanus (BCD 1256)
S. c. var. diastaticus (BCD 1257)
Z. bailii (BCD 1424)
Tr. cutaneum (DSM 70684)
C. glaebosa (CBS 5691)
C. maltosa (BCD 806)
C. sake (BCD 1054)
C. tropicalis (ATCC 20326)
Ci. matritensis (BCD 1062)
Deb. hansenii (BCD 3512)
En. fibuliger (BCD 3514)
Hyp. burtonii (DSM 3505)
K. marxianus (BCD 5186)
K. marxianus (DSM 70792)
La. thermotolerans (CBS 6340)
P. farinosa (BCD 861)
P. guilliermondii (BCD 804)
S. bayanus (BCD 1392)
S. pastorianus (BCD 728)
Z. rouxii (ATCC 48230)
C. intermedia (BCD 685)
C. parapsilosis (ATCC 20384)
C. santamariae (CBS 4261)
C. vini (DSM 70184)
Cl. lusitaniae (DSM 70102)
Deb. hansenii (BCD 589)
G. selenospora (DSM 3431)
I. orientalis (CBS 5147)
K. marxianus (BCD 811)
Ka. unispora (BCD 877)
M. pulcherrima (DSM 70321)
P. fermentans (BCD 711)
P. ohmeri (BCD 862)
S. cerevisiae (DSM 1333)
T. delbrueckii (DSM 70607)
Sch. pombe (BCD 773)
Mit dem Primerpaar HS10/04 wurde mit der DNA folgender 32 Hefestämme direkt oder in
einer Semi-Nested PCR ein ca. 624 bp großes Fragment amplifiziert und sequenziert. Bei
der Semi-Nested PCR wurde zunächst ein 1,6 kbp großes PCR-Produkt mit dem Primerpaar
HS03/HS04 amplifiziert und anschließend 1:1000-verdünnt eingesetzt.
C. boidinii (DSM 70034)
C. ernobii (DSM70858)
C. multigemmis (DSM 70862)
D. bruxellensis (DSM 3429)
En. fibuliger (DSM 70554)
H. uvarum (BCD 3526)
P. anomala (DSM 70783)
P. membranaefaciens (DSM
70178)
Sch. octosporus (DSM 70573)
Z. bisporus (DSM 70415)
C. catenulata (DSM 70136)
C. glabrata (BCD 8932)
C. solani (BCD 818)
D. bruxellensis (DSM 70726)
H. guilliermondii (DSM 70285)
H. vineae (DSM 70283)
P. canadensis (CBS 601)
S. bayanus (DSM 70412)
S. exiguus (MUCL 29838)
Y. lipolytica (BCD 2556)
Z. florentinus (DSM 70506)
54
C. diddensiae (DSM 70042)
C. haemulonii (DSM 70624)
C. versatilis (DSM 6956)
D. custersiana (DSM 70736)
H. uvarum (ATCC 9774)
P. anomala (BCD 1082)
P. carsonii (DSM 70392)
S. c. var. diastaticus (DSM 70487)
S. pastorianus (DSM 6580)
Y. lipolytica (BCD 2003)
Z. microellipsoides (DSM 6959)
3 Ergebnisse
Kein spezifisches PCR-Produkt wurde mit den Primerpaaren HS03/04, HS10/04 oder
HS10/09 mit Ausnahme von Tr. cutaneum von Hefen der Unterabteilung Basidiomycota
amplifiziert. Daher wurde das degenerierte Primerpaar HSwb1/abc3 aufgrund der Sequenzinformationen, die über die Walker B Sequenzbereiche vorlagen, konstruiert. Ein ca. 1032 bp
großes PCR Produkt wurde von folgenden Hefen amplifiziert und sequenziert:
Bul. dendrophila (DSM 70745)
R. minuta (DSM 70408)
Cr. curvatus (BCD 2578)
Cr. laurentii (BCD 824)
Ein ca. 263 bp langes PCR Fragment wurde von folgenden Hefen mit dem Primermix aus
den 5´-Primern HS12/IV-IX und den 3´-Primern HS14/III-VIII, die aufgrund der Sequenzinformationen der zuvor sequenzierten Hefen der Unterabteilung der Basidiomycota konstruiert
wurden, amplifiziert und anschließend sequenziert:
Cr. albidus (DSM 70197)
Cr. humicola (DSM 70067)
Sp. johnsonii (BCD 778)
Cr. curvatus (DSM 70022)
R. glutinis (BCD 3530)
Sp. johnsonii (DSM 70847)
Cr. flavus (BCD 823)
Sp. johnsonii (BCD 4982)
Die Abbildung 6.1 im Anhang zeigt das vollständige Alignment (Kap. 2.11) der sequenzierten
Nucleinsäuresequenzen des EF-3 Gen Abschnitts von der Position 2272 bis 2637 (Aminosäureposition 758 bis 879, S. cerevisiae Sequenz) unter Einbeziehung der bereits bekannten
Sequenzen.
3.2.3
Sequenzvergleich des EF-3 Genbereichs
Die Unterabteilungen der Ascomycota und der Basidiomycota waren aufgrund der Sequenzinformation des EF-3 Genabschnitts deutlich von einander zu unterscheiden. Die Übereinstimmung der Aminosäuresequenz lag zwischen den Vertretern der beiden Unterabteilungen
unter 35 % (Tab. 6.3). Die prozentuale Übereinstimmung innerhalb der Unterabteilung der
Basidiomycota betrug mindestens 67 % (Tab. 6.3). Hefen aus der Klasse der Hemiascomycetes (Ordnung Saccharomycetales) wiesen untereinander eine Übereinstimmung in der
Aminosäuresequenz von mindestens 68 % auf (Tab. 6.2). Die Gattung Schizosaccharomyces als einziger Vertreter der Klasse der Archiascomycetes sowie die Gattung Dekkera hoben sich als monophyletische Einheiten deutlich von den restlichen Hefen der Klasse der
Hemiascomycetes ab (Abb. 3.12). Weitere monophyletische Gattungen waren in dem Dendogramm (Abb. 3.12) nicht zu erkennen. Die Gattung Saccharomyces wies große sequenzielle Übereinstimmung mit den Gattungen Kluyveromyces, Zygosaccharomyces und Torulaspora auf. Variationen der Aminosäuresequenz waren auch unter Stämmen der gleichen
Art vorhanden, da z. B. die Arten S. pastorianus und S. bayanus keine monophyletischen
Gruppen bildeten. Aufgrund dieser Sequenzvergleiche wurden drei Bereiche der Aminosäuresequenz ausgewählt, die als Basis für ein Primer- und Sondendesign dienten.
55
3 Ergebnisse
56
3 Ergebnisse
Abb. 3.12: Dendrographische Auswertung der EF-3 Gensequenzen
Der Baum basiert auf den sequenzierten EF-3 Genabschnitten von Hefen der Unterabteilung der Ascomycota (App. 6.1 im Anhang) und wurde unter Verwendung der Neighbour-Joining Methode (Saitou
und Nei 1987) konstruiert (Kap. 2.11). Alle nicht in dieser Arbeit generierten Sequenzen sind mit ihren
GenBank Zugangsnummern angegeben. Die genauen prozentualen Übereinstimmungen der Aminosäuresequenzen sind in der Tabelle 6.2 im Anhang angegeben.
3.2.4
Anordnung der Primer und Hybridisierungssonden im EF-3 Gen
Für zwei Real-Time LightCycler® PCR-Systeme, die sich in der Art der Detektion der gebildeten Amplifikate unterschieden, wurden Primer und Hybridisierungssonden von dem Nucleinsäurealignment des EF-3 Genabschnitts (Abb. 6.1) abgeleitet. Die Detektion der gebildeten
PCR-Fragmente erfolgte bei dem einen System durch den Fluoreszensfarbstoff SYBR®Green I, mit dem die doppelsträngige DNA unspezifisch durch Interkalation und die damit
verbundene Fluoreszenserhöhung nachgewiesen wurde. Bei dem anderen System erfolgte
57
3 Ergebnisse
der Nachweis durch spezifische Hybridisierung von zwei Sonden an das gebildete Amplifikat
und die damit verbundene Fluoreszenserhöhung über den „fluorescence resonance energy
transfer“ (FRET). Die genaue Lage aller Primer und Hybridisierungssonden ist in dem Nucleinsäurealignment der EF-3 Genabschnitte (Abb. 6.1) angegeben.
3.2.4.1
Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I
Aufgrund der Heterogenität der Sequenzen mussten grundlegend unterschiedliche, degenerierte Primer für Hefen der Unterabteilung Ascomycota und Hefen der Unterabteilung Basidiomycota entworfen werden. Das für die Gattung Schizosaccharomyces spezifische Primerpaar Ha1f/Ha1r und ein für die weiteren Hefen der Unterabteilung Ascomycota spezifischer
Mix aus den 5´-Primern Ha2f-5f und den 3´-Primern Ha2r-8r wurden für die Amplifikation
eines ca. 315 bp großen DNA-Fragments eingesetzt. Für die Amplifikation eines ca. 213 bp
großen Fragments von Hefen der Unterabteilung der Basidiomycota wurden die 5´-Primer
Hb1f-5f und die 3´-Primer Hb1r-3r ausgewählt.
3.2.4.2
Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden
Auch für die Real-Time Consensus-PCR mit Hybridisierungssonden mussten wie bei dem
System mit SYBR®-Green I zwei grundlegend unterschiedliche Teilsysteme für die Ascomyceten auf der einen Seite und die Basidiomyceten auf der anderen Seite entwickelt werden.
Das für die Gattung Schizosaccharomyces spezifische Primerpaar Yfs1/HT4r und ein für die
weiteren Hefen der Unterabteilung Ascomycota spezifischer Mix aus den 5´-Primern Yfa1,
Yfa2, HS11/I-IV und den 3´-Primern HT1r-3r wurde für die Amplifikation eines ca. 305 bp
großen DNA-Fragments eingesetzt. Für die Amplifikation eines ca. 246 bp großen Fragments von Hefen der Unterabteilung der Basidiomycota wurden die 5´-Primer Hb6f-7f und
die 3´-Primer HT5r-6r ausgewählt.
Die Hybridisierungssonden mussten wie die Primer aufgrund der hohen Heterogenität der
Zielsequenzen degeneriert werden. Hierbei wurde nicht jede Sequenzvariation, die das Nucleinsäurealignment (Abb. 6.1) vorgab, oder jede durch die Aminosäuresequenz mögliche
Variation berücksichtigt. Die Sonden wurden bis zu 32-fach degeneriert und außerdem bis zu
zwei Basen durch Inosin substituiert. Außerdem wurden die Sonden möglichst lang konstruiert, um trotz möglicher Nucleotidfehlpaarungen eine ausreichend hohe Schmelztemperatur für die Detektion durch Hybridisierung zu erreichen. Die Abbildung 3.13 verdeutlicht die
Vorgehensweise bei der Konstruktion der Hybridisierungssonden am Beispiel der Sonde
Yff3. Degenerierungen wurden bevorzugt dort vorgenommen, wo aufgrund der Aminosäuresequenz die Variation auf zwei Basen reduziert werden konnte. Ikuta et al. (1987) zeigten,
dass die Nucleotidfehlpaarungen G:A, G:T und G:G nur leicht, die Nucleotidfehlpaarungen
58
3 Ergebnisse
A:A, T:T, C:T und C:A dagegen signifikant destabilisierend wirken. Daher wurden Degenerierungen auch vorgenommen, um ungünstige Nucleotidfehlpaarungen zu vermeiden.
H.
H.
H.
S.
T.
C.
C.
P.
P.
guilliermondii (DSM 70285)GAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC
uvarum (BCD 3526)
GAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC
uvarum (ATCC 9774)
GAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC
bayanus (BCD 1392)
GAATCCAAGAGATTCACGCCAGAAGAAAGTTCAAGAAC
delbrueckii (DSM 70607)
GAATCCAAGAGATTCACGCCAGAAGAAAGTTCAAGAAC
glabrata (BCD 8932)
GAGTTCAAGAAATCCATGCCAGAAGAAAATTCAAGAAC
solani (BCD 818)
GTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGGAAATTCAAGAAC
anomala (BCD 1082)
GTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC
anomala (DSM 70783)
GTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGAAAATTCAAGAAC
Hybridisierungssonde Yff3
GAGTTCAAGARATTCAYGCIAGAAGRAARTTCAAGAAC
Abb. 3.13: Konstruktion der Hybridisierungssonde Yff3 für das EF-3 Genfragment
Bei dem Design der Hybridisierungssonden für die Real-Time Consensus-PCR für Hefen wurden Nucleinsäurefehlpaarungen (grau) und Degenerierungen (Rahmung) mit einkalkuliert. Dargestellt sind die
Sequenz der Hybridisierungssonde Yff3 und die Sequenzen der Targetorganismen in 5´-3´ Orientierung.
Für Ascomyceten wurden sechs mit Fluorescein am 3´-Ende markierte Donator-Sonden
(Yff1-4, Yff6 und Yff8) und fünf am 5´-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff LightCycler®-Red
640 markierte Akzeptor-Sonden (Yfr1-4 und Yfr8) entwickelt. Die Sonde Yff6 wurde für Hefen
der Gattung Schizosaccharomyces und das Sondenpaar Yff8/Yfr8 für die Art C. magnoliae
designt. Für Basidiomyceten wurden eine mit Fluorescein am 3´-Ende markierte DonatorSonde (Yff5) und zwei am 5´-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff LightCycler®-Red 640 markierte Akzeptor-Sonden (Yfr5 und Yfr7) entwickelt. Alle Hybridisierungssonden wurden im
EF-3 Gen in 5´-3´-Richtung orientiert.
Das PCR-Profil wurde den niedrigen Schmelztemperaturen der Sonden angepasst, indem
eine „Touchdown-PCR“ gewählt wurde, bei der die Annealingtemperatur je PCR-Zyklus kontinuierlich um 0,5 °C von 60 auf 40 °C abnimmt. Dieses Profil ermöglichte eine spezifische
Amplifikation der Targetsequenzen durch die Primer zu Beginn der PCR und die später im
Zyklusprofil erfolgende Detektion mit den Hybridisierungssonden.
3.2.5
Konstruktion der internen Amplifikationskontrolle und der Positivkontrolle
Wie im Kap. 3.1.3 für das S. cerevisiae var. diastaticus Nachweissystem beschrieben, wurden auch für die Real-Time Consensus-PCR mit Hybridisierungssonden eine interne Amplifikationskontrolle (IAK) konstruiert. Die Sequenz der IAK entsprach bis auf den Austausch der
Zielregion der LightCycler®-Red 640 markierten Sonde Yfr4 durch Einbau eines Sequenzabschnittes, der komplementär zu der Sequenz der LightCycler®-Red 705 markierten Sonde
LMRST1 war, der Sequenz des EF-3 Genabschnitts von S. c. var. diastaticus (DSM 70487).
59
3 Ergebnisse
Konstruiert wurde die interne Amplifikationskontrolle über die PCR-Mutagenese mit den Primern Yip1f und Yip1r (Kap. 2.9.1.2).
1--------Yfa1----------------------------------------------60
S.dia. GTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG
IAK
GTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG
61------------------------------------------Yff1----------120
S.dia. CTATGAACAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCA
IAK
CTATGAACAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCA
121---------------------------Yfr4-----LMRST1-------------180
S.dia. GAAGAAAGTTCAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTGGGTGAAAACATTG
IAK
GAAGAAAGTTCAAGAACACATT--A-TCCGA---TACGTTCTTCCAGTGCCA----TTTT
181-------------------------------------------------------240
S.dia. GTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCAATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAG
IAK
GTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCAATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAG
241---------------------------------------------HT1r------301
S.dia. GTGAATTGGTTGAATCTCACTCTAAGATGGTTGCTGAAGTTGATATGAAGGAAGCTTTGGC
IAK
GTGAATTGGTTGAATCTCACTCTAAGATGGTTGCTGAAGTTGATATGAAGGAAGCTTTGGC
Abb. 3.14: Sequenzvergleich der IAK mit dem EF-3 Gen von S. cerevisiae var. diastaticus
Das Alignment zeigt die Sequenzen der IAK der Real-Time Consensus-PCR für Hefen und die Wildtyp
Sequenz des EF-3 Gens von S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487). Die Primer Yfa1 und HT1r
sowie die Hybridisierungssonde Yff1 waren für beide Sequenzen spezifisch. Die Hybridisierungssonde
Yfr4 war für die Wildtyp Sequenz und die Sonde LMRST1 für die IAK Sequenz spezifisch. Die Markierung der Sonden Yfr4 und LMRST1 mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen ermöglichte eine
Unterscheidung zwischen IAK und Wildtyp Amplifikaten in der PCR.
Nach Ligation der PCR-Produkte in den Vektor pGEM®-T (Kap. 2.9.3), Transformation in E.
coli XL-1 Blue Zellen (Kap. 2.9.4) und Linearisierung der gereinigten Plasmide (Kap. 2.9.5)
mit der Restriktionsendonuclease Sac I (Kap. 2.9.6) wurde der Erfolg der Herstellung durch
Sequenzierung (Kap. 2.10) und Alignment (Kap. 2.11) mit der Sequenz des EF-3 Genabschnitts von S. cerevisiae var. diastaticus bestätigt (Abb. 3.14). In allen folgenden Versuchen wurden von der IAK je PCR-Reaktion 0,5 fg eingesetzt.
Bei der Herstellung der PK wurden keine Sequenzveränderungen vorgenommen, sondern
eine klonierte E. coli XL-1 Blue Kultur verwendet, die für die Sequenzierung des EF-3 Sequenzabschnitts von C. haemulonii (DSM 70624) hergestellt worden war. Dieses Vorgehen
wurde gewählt, da eine eindeutige Unterscheidung zwischen der PK und positiven Proben
über Schmelzkurven-Analyse aufgrund der Vielzahl an degenerierten Sonden von vornherein
auszuschließen war. Das gereinigte Plasmid (Kap. 2.9.5) wurde mit der Restriktionsendonuclease Sac I linearisiert (Kap. 2.9.6) und 5 fg in der PCR verwendet.
60
3 Ergebnisse
3.2.6
Spezifität und Auswahl des Detektionssystems
3.2.6.1
Spezifität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I
Von allen Hefen, von denen die Sequenzinformationen vorlagen (Kap. 3.2.2), wurde mit der
Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I das gewünschte PCR-Produkt mit
einer Länge von ca. 313 (Ascomycota) bzw. 213 bp (Basidiomycota) amplifiziert (Abb. 3.15).
Abb. 3.15: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time PCR mit SYBR®-Green I
Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I wurde mit je 250 pg RNA-freier DNA
(Kap. 2.6.2) getestet. Die Agarosegelelektrophorese wurde mit 5 µl der Reaktionsansätze in einem
2-%igen Gel durchgeführt (Kap. 2.8). PD=Primerdimere.
1: Molekulargewichtsmarker VI
2: Schizosaccharomyces octosporus (DSM 70573)
3: Candida albicans (ATCC 10321)
4: Candida catenulata (DSM 70136)
5: Citeromyces matritensis (BCD 1062)
6: Dekkera custersiana (DSM 70736)
7: Pichia angusta (DSM 70277)
8: Candida boidinii (DSM 70034)
9: Debaryomyces hansenii (BCD 3512)
10: Guilliermondella selenospora (DSM 3431)
11: Candida haemulonii (DSM 70624)
12: Candida rugosa (BCD 814)
13: Candida zeylanoides (BCD 690)
14: Lachancea thermotolerans (CBS 6340)
61
15: Molekulargewichtsmarker VI
16: Pichia ohmeri (BCD 862)
17: Yarrowia lipolytica (BCD 2556)
18: Candida diddensiae (DSM 70042)
19: Candida versatilis (DSM 6956)
20: Dekkera bruxellensis (DSM 3429)
21: Pichia farinosa (BCD 861)
22: Saccharomyces pastorianus (DSM 6850)
23: Pichia membranaefaciens (DSM 70178)
24: Candida glaebosa (CBS 5691)
25: Pichia carsonii (DSM 70392)
26: Filobasidium capsuligenum (DSM 70253)
27: Rhodotorula minuta (DSM 70408)
28: Cryptococcus curvatus (DSM 70022)
3 Ergebnisse
Die Primerkonzentrationen und die PCR-Bedingungen konnten jedoch nicht so eingestellt
werden, dass eine ausreichend hohe Stringenz erreicht wurde, um in jeder Hinsicht eindeutige, spezifsche Ergebnisse zu liefern. Die Bildung von Primerdimeren, die mit SYBR®-Green I
ebenfalls detektiert wurden, und unspezifische Amplifikate mit Bakterien-DNA ließen eine
eindeutige Abtrennung zwischen negativen und positiven Proben nicht zu. Die spezifischen
Amplifikate hatten Schmelzhöchstwerte zwischen ca. 81 und 91 °C, die sich an ihrer unteren
Grenze mit den Schmelzhöchstwerten der Primerdimere, die in den Negativkontrollen gebildet wurden, überlagerten (Abb. 3.16). Die unspezifische Amplifikation von Bakterien-DNA
verhinderte ebenfalls eine Differenzierung zwischen positiven und negativen Proben bei der
Schmelzkurven-Analyse (Abb. 3.17).
Abb. 3.16: Schmelzkurven-Analyse von spezifischen Amplifikaten und Primerdimeren
Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I wurde mit je 250 pg RNA-freier DNA
(Kap. 2.6.2) (schwarze Linien) von 1: Guilliermondella selenospora (DSM 3431), 2: Pichia carsonii
(DSM 70392), 3: Pichia angusta (DSM 70277), 4: Cryptococcus albidus (DSM 70197), 5: Yarrowia
lipolytica (BCD 2556) und 6: Rhodotorula glutinis (BCD 3530) durchgeführt. Die Negativkontrolle bestand aus PCR-H2O (rote Linie). Die Schmelzkurven-Analyse erfolgte im Kanal 530.
62
3 Ergebnisse
Abb. 3.17: Schmelzkurven-Analyse von unspezifisch amplifizierter Bakterien-DNA
Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit SYBR®-Green I wurde mit 250 pg RNA-freier DNA (Kap.
2.6.2) von S. cerevisiae var. diastaticus (schwarze Linie) und Bakterien DNA (blaue Linien) nach mechanisch/thermischer Extraktion (Kap. 2.6.1) von Lactobacillus hilgardii, (DSM 20051), Lactobacillus
kefiri (DSM 20588), Pantoea agglomerans (DSM 3493), Proteus vulgaris (DSM 2140), Salmonella
enterica (BCD 14151), Shigella sonnei (BCD 4301), Sporosarcina urea (DSM 2281) durchgeführt. Als
Negativkontrolle (rote Linie) wurde PCR-H2O eingesetzt. Die Auswertung der Schmelzkurven-Analyse
erfolgte im Kanal 530.
3.2.6.2
Spezifität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden
Alle 198 in der Tabelle 2.1 aufgeführten Hefestämme und die 54 nicht genauer identifizierten
Fremdhefen von den Brauereien A, B und D konnten mit dem System nachgewiesen werden. Eine Identifizierung über die Schmelzkurven-Analyse war aufgrund der Vielzahl an degenerierten Sonden, die bei unterschiedlichen Temperaturen abschmolzen, nicht möglich.
Einzelne, reproduzierbare Schmelzhöchstwerte, die klar einer Art oder einer Gattung zuzuordnen waren, wurden nicht erhalten (Abb. 3.18).
Alle getesteten Bakterien (Tab. 2.2) waren negativ und die Amplifikation der IAK wurde durch
DNA dieser Mikroorganismen nicht beeinträchtigt. Die Abgrenzung zu den Schimmelpilzen
war nicht vollständig möglich. Von den getesteten Schimmelpilzen (Tab. 2.3) wurden positive
Ergebnisse mit DNA von Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus,
Cephalosporium aphidicola, Diaporthe citri, Eremascus albulus, Fusarium oxysporum, Fusarium cerealis, Fusarium culmorum, Hyalodendron lignicola, Penicillium funiculosum, Trichoderma viride und Wallemia sebi erzielt. Die Amplifikation der IAK wurde durch die DNA von
63
3 Ergebnisse
Schimmelpilzen, die im Kanal 640/Back 530 nicht nachgewiesen wurden, nicht beeinträchtigt.
Abb. 3.18: Schmelzkurven-Analyse unterschiedlicher Hefearten
Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden wurde mit je 250 pg RNA-freier
DNA (Kap. 2.6.2) von den Hefen Torulaspora delbrueckii (schwarze Linie), Saccharomycopsis fibuligera (schwarze Punkte), Clavispora lusitaniae (blaue Linie), Candida haemulonii (blaue Punkte), Zygosaccharomyces cidri (rote Linie) und Saccharomyces exiguus (rote Punkte) getestet. Die Schmelzkurven-Analyse wurde im Kanal 640/Back 530 ausgewertet.
3.2.7
Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden
3.2.7.1
Sensitivitätstestung mit quantifizierter, RNA-freier DNA
Die Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen wurde mit quantifizierter, RNAfreier DNA von 36 unterschiedlichen Hefearten getestet (Tab. 3.10). Mit der Multiplex-PCR
wurden
unterschiedliche
Sensitivitäten
erreicht.
Die
höchste
Nachweisgrenze
mit
250 GÄ/Reaktion wurde mit DNA von Issatchenkia orientalis ermittelt. Alle weiteren untersuchten Hefearten wurden mit einer Sensitivität zwischen 10 und 100 GÄ/Reaktion nachgewiesen (Tab. 3.10). Die Umrechnung auf Genomäquivalente erfolgte mit den von S. cerevisiae (12,1 Mbp), Schizosaccharomyces pombe (13,8 Mbp) und Cryptococcus neoformans
(21,0 Mbp) bekannten Genomgrößen und stellte demnach für einige Arten einen Näherungswert dar. Die Abbildung 3.19 zeigt die Amplifikationskurven der Sensitivitätstestung mit
DNA von S. exiguus (MUCL 29838).
64
3 Ergebnisse
Tab. 3.10: Sensitivitätstestung mit quantifizierter, RNA-freier DNA
Hefestamm
1000
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Bullera dendrophila (DSM 70745)
Candida albicans (ATCC 10231)
Candida parapsilosis (ATCC 20384)
Candida tropicalis (ATCC 20247)
Citeromyces matritensis (BCD 1062)
Clavispora lusitaniae (DSM 70102)
Cryptococcus flavus (BCD 823)
Debaryomyces hansenii (BCD 589)
Dekkera bruxellensis (DSM 70726)
Dekkera custersiana (DSM 70736)
Endomyces fibuliger (DSM 70554)
Filobasidium capsuligenum (DSM 70253)
Guilliermondella selenospora (DSM 3431)
Hanseniaspora guilliermondii (DSM 70285)
Hyphopichia burtonii (BCD 859)
Issatchenkia orientalis (CBS 5147)
Kazachstania unispora (BCD 877)
Kluyveromyces marxianus (DSM 70792)
Lachancea thermotolerans (CBS 6340)
Lodderomyces elongisporus (DSM 70320)
Metschnikowia pulcherrima (DSM 70321)
Pichia anomala (BCD 1082)
Pichia membranaefaciens (DSM 70178)
Rhodotorula minuta (DSM 70408)
Saccharomyces bayanus (DSM 70412)
S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487)
Saccharomyces exiguus (MUCL 29838)
Saccharomyces pastorianus (DSM 6850)
Schizosaccharomyces pombe (BCD 773)
Sporidiobolus johnsonii (DSM 70847)
Torulaspora delbrueckii (CBS 6339)
Trichosporon cutaneum (DSM 70684)
Yarrowia lipolytica (ATCC 20225)
Zygosaccharomyces bailii (MUCL 28823)
Zygosaccharomyces lentus (CBS 8516)
Zygosaccharomyces rouxii (DSM 70835)
+: Probe positiv
- : Probe negativ
Genomäquivalente/Reaktion
250
100
25
10
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Für die Sensitivitätstestung der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit Hybridisierungssonden wurde die RNA-freie DNA (Kap. 2.6.2) fluorometrisch quantifiziert (Kap. 2.7.1) und auf Genomäquivalente
(GÄ) umgerechnet (Kap. 2.15.1).
65
3 Ergebnisse
Abb. 3.19: Sensitivität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen
Die Real-Time PCR wurde mit 1000 GÄ (schwarze Linie), 250 GÄ (blaue Linie), 100 GÄ (rote Linie),
25 GÄ (schwarze Punkte), 10 GÄ (blaue Punkte) von S. exiguus (MUCL 29838) durchgeführt. Die
Auswertung der Amplifikation erfolgte im Kanal 640/Back 530. Als Negativkontrolle (rote Punkte) wurde PCR-H2O eingesetzt.
3.2.7.2
Sensitivität in Kombination mit der mechanisch/thermischen DNAExtraktion
Die Nachweisgrenze in Abhängigkeit von der Hefeart, der Zellzahl pro Aufarbeitung und dem
mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsverfahren wurde mit vorangereicherten Getränkeproben (1:10-verdünnt mit YM-Medium, 48 Stunden, bei 28 °C) getestet. Nach Dotierung der
Anreicherungen mit 103, 104 oder 105 Hefezellen/ml wurden je Dotierungslevel 1 ml im Duplikat mechanisch/thermisch aufgearbeitet.
In den trübstofffreien Getränken Pils, alkoholfreies Bier, Coca-Cola, Eistee, Radler, Apfelsaft
(klar) und Gatorade wurden zwischen 103 und 104 Zellen/ml der Hefearten D. bruxellensis
(DSM 70726), S. cerevisiae (DSM 1333), S. pombe (BCD 773), Z. bailii (MUCL 28823), C.
tropicalis (ATCC 20247) und H. vineae (ATCC 20247) nachgewiesen. Die gleichen Arten
wurden in den teilweise trübstoffreichen Getränken Apfelsaft (naturtrüb), Traubensaft, Rotund Weißwein mit einem um eine Zehnerpotenz höheren Nachweislevel zwischen 104 und
66
3 Ergebnisse
105 Zellen/ml detektiert (Tab. 3.11). Alle undotierten, vorangereicherten Getränkeproben waren negativ in der PCR im Kanal 640/Back 530 und bei der Kultivierung auf YM-Agar.
Tab. 3.11: Eignung der Real-Time Consensus-PCR für Hefen in Kombination mit der
mechanisch/thermischen Aufarbeitung für unterschiedliche Probenmatrices und Hefearten
Dotierungslevel
A:
[Zellen/ml]
5
B:
C:
1,0 x 10
1,0 x 104
1,0 x 103
undotiert
6,9 x 104
6,9 x 103
6,9 x 102
-
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
1,0 x 105
1,0 x 104
1,0 x 103
undotiert
6,4 x 104
6,4 x 103
6,4 x 102
-
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
5
D:
1,0 x 10
1,0 x 104
1,0 x 103
undotiert
3,2 x 105
3,2 x 104
3,2 x 103
-
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
5
E:
1,0 x 10
1,0 x 104
1,0 x 103
undotiert
1,0 x 105
1,0 x 104
1,0 x 103
-
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
5
F:
[KBE/ml]
1,0 x 10
1,0 x 104
1,0 x 103
undotiert
9,4 x 104
9,4 x 103
9,4 x 102
-
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
1,0 x 105
1,0 x 104
1,0 x 103
undotiert
1,1 x 105
1,1 x 104
1,1 x 103
-
Cp-Werte im Kanal 640/Back 530 je Probenmatrix
Apfelsaft
YMRotwein
Pils
Gatorade
(naturtrüb)
Medium
31,89/32,2
-/33,25
29,06/29,2 29,45/30,1
27,79
-/-/31,27/30,9 31,95/31,9
n.b.
-/-/32,05/32,1 32,68/32,6
n.b.
-/-/-/-/Apfelsaft
YMRotwein
Pils
Gatorade
(naturtrüb)
Medium
31,21/30,6 31,30/31,3 28,42/28,5 29,02/28,8
27,52
-/-/30,58/30,4 30,93/31,0
n.b.
-/-/30,42/-/n.b.
-/-/-/-/Bier (alTraubenYMEistee
Weißwein
koholfrei)
saft
Medium
24,81/25,0 26,63/26,6 30,46/30,4 27,11/27,6
23,14
28,62/28,3 29,95/29,8 31,67/29,2 30,37/30,3
n.b.
31,68/31,0
31,36/-/-/n.b.
-/-/-/-/Bier (alTraubenYMEistee
Weißwein
koholfrei)
saft
Medium
29,66/29,9 39,91/28,7 28,97/30,5 31,05/30,9
28,90
31,64/31,4 33,85/31,7
-/-/n.b.
-/-/-/-/n.b.
-/-/-/-/YMApfelsaft
Radler
Weißwein
Coca-Cola
(naturtrüb)
Medium
30,69/30,6 28,84/28,8 29,02/29,0 30,57/30,4
28,35
-/31,27/31,0 31,49/31,7 31,83/31,7
n.b.
-/-/-/-/n.b.
-/-/-/-/Apfelsaft
YMCoca-Cola
Radler
Weißwein
(klar)
Medium
29,72/29,8 28,49/28,5 28,56/28,8 30,23/29,7
28,19
31,15/31,7 31,03/30,8 30,84/30,9 31,36/31,3
n.b.
-/-/-/-/n.b.
-/-/-/-/-
Die Probenmatrices wurden vor der mechanisch/thermischen Aufarbeitung (Kap. 2.6.1) mit A: D. bruxellensis (DSM 70726), B: S. cerevisiae (DSM 1333), C: Sch. pombe (BCD 773), D: Z. bailii (MUCL
28823), E: C. tropicalis (ATCC 20247) oder F: H. vineae (DSM 70283) Zellen dotiert. Die Zellzahlen
bzw. KBE wurden mikroskopisch und nach Kultivierung auf YM-Agar bestimmt (Kap. 2.12).
n.b.: nicht bestimmt; -: negative Proben.
67
3 Ergebnisse
3.2.7.3
Sensitivität in Kombination mit der erweiterten, mechanisch/thermischen
DNA-Extraktion
Für einige Probenmatrices wie trübstoffreiche Getränke und Weine wurde die DNAExtraktion erweitert, um die Qualität des in der PCR eingesetzten Probenmaterials und damit
die Sensitivität des Nachweissystems zu erhöhen. Die Erweiterung bestand in einem zusätzlichen Proteinase K Verdau und einer Reinigung über Säulenmaterial (Kap. 2.6.3).
Mit dieser Erweiterung wurde die Nachweisgrenze für die Probenmatrices Apfelsaft (naturtrüb), Rotwein, Eistee und Traubensaft auf 103 bis 104 Zellen/ml S. cerevisiae gesenkt
(Tab. 3.12). Alle undotierten, vorangereicherten Getränkeproben waren negativ in der PCR
im Kanal 640/Back 530 und bei der Kultivierung auf YM-Agar.
Tab. 3.12: Eignung des Real-Time Consensus-PCR für Hefen in Kombination mit der
erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbeitung für unterschiedliche
Probenmatrices
Dotierungslevel
Cp-Werte je Probenmatrix
Apfelsaft
(naturtrüb)
28,85/29,07
Rotwein
Eistee
Traubensaft
YM-Medium
27,37/27,26
26,55/26,92
29,99/26,95
24,79
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
1,0 x 105
9,6 x 104
1,0 x 10
4
9,6 x 10
3
30,95/30,79
29,71/29,84
29,25/29,28
29,90/29,94
n.b.
1,0 x 10
3
9,6 x 10
2
-/-
-/-
30,05/30,65
27,73/31,46
n.b.
-/-
-/-
-/-
-/-
-
undotiert
-
Die Probenmatrices wurden vor der erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbeitung (Kap. 2.6.3)
mit S. cerevisiae (DSM 1333) Zellen dotiert. Die Zellzahlen bzw. KBE wurden mikroskopisch und nach
Kultivierung auf YM-Agar bestimmt (Kap. 2.12).
n.b.: nicht bestimmt; -: negative Proben.
3.2.7.4
Detektionszeit für unterschiedliche Hefearten
Die Detektionszeit eines Nachweissystems wird in diesem Zusammenhang als die Zeit definiert, die für einen Mikroorganismus benötigt wird, damit dieser über Kultivierung eine Konzentration erreicht, die im Nachweisbereich des Systems liegt. Diese Zeit ist abhängig von
der Ausgangskonzentration, der Verdoppelungszeit und der Lag-Phase (Adaptionsphase)
des Mikroorganismus in einem bestimmten Medium. Für einen Organismus oder eine Population in einem Medium vergrößert sich die Detektionszeit je geringer die Ausgangskonzentration ist. Um diese Detektionszeit zu ermitteln wurden Getränkeproben mit 1, 10 oder 100
Hefezellen/ml beimpft und in YM-Medium angereichert (1:10-verdünnt, 28 °C, 150 U/min).
Die Anreicherungen wurden im Duplikat angesetzt und je Anreicherung zwei 1 ml Proben
nach 24 und 48 Stunden aufgearbeitet.
Mit den langsam wachsenden Hefearten D. bruxellensis und besonders Sch. pombe (Generationszeiten von bis zu 4 Stunden) und den schwierigen Probenmatrices Orangensaft bzw.
68
3 Ergebnisse
Apfelsaft (naturtrüb) wurde das Nachweissystem in Kombination mit der erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbeitung getestet (Tab. 3.13).
Tab. 3.13: Detektionszeit für langsam wachsende Hefen
Dotierungslevel
A:
B:
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
1,0 x 102
1,0 x 101
1,0 x 100
undotiert
1,0 x 102
1,0 x 101
1,0 x 100
undotiert
1,0 x 102
1,0 x 101
1,0 x 100
4,1 x 102
4,1 x 101
4,1 x 100
-
nach 24 Stunden
Anreicherung
Anreicherung
1
2
+/+
+/+
-/-/-/-/-/-/-/-/-/-/-/-/-/-/-
nach 48 Stunden
Anreicherung
Anreicherung
1
2
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
-/-/+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
-/-/-/-
Die Probenmatrices A: Orangensaft bzw. B: Apfelsaft (naturtrüb) wurden vor der Anreicherung mit
YM-Medium mit A: D. bruxellensis (DSM 70726) oder B: Sch. pombe (BCD 773) Zellen dotiert. Die
Zellzahlen bzw. KBE wurden mikroskopisch und nach Kultivierung auf YM-Agar bestimmt (Kap. 2.12).
Nach 24 bzw. 48 Stunden Anreicherung wurden Proben entnommen, die nach Aufarbeitung mit der
erweiterten, mechanisch/thermischen Methode mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen getestet
wurden (Kap. 2.15.2).
-: Probe negativ; +: Probe positiv.
Abb. 3.20: Real-Time PCR Nachweis von D. bruxellensis in Orangensaft
Nach 48 Stunden Anreicherung mit YM-Medium wurde der vor der Anreicherung mit 102 Zellen/ml
(schwarze Linie), 101 Zellen/ml (blaue Linie) oder 100 Zellen/ml (rote Linie) D. bruxellensis (DSM
70726) dotierte Orangensaft mit der erweiterten, mechanisch/thermischen DNA-Extraktionsmethode
aufgearbeitet. Die Proben wurden anschließend mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen getestet. Als Negativkontrolle wurde eine undotierte Anreicherung (grüne Linie) verwendet.
69
3 Ergebnisse
Der unterste Dotierungslevel von einer Zelle/ml Orangensaft wurde bei D. bruxellensis nach
48 Stunden Anreicherung nachgewiesen (Tab. 3.13 und Abb. 3.20). Das Wachstum von Sch.
pombe in einer Anreicherung mit Apfelsaft (naturtrüb) war dagegen bei der geringsten Ausgangskontamination von einer Zelle/ml (4,1 KBE/ml) nach 48 Stunden in nur einer Anreicherung nachweisbar (Tab. 3.13). Alle undotierten, vorangereicherten Getränkeproben waren
negativ in der PCR im Kanal 640/Back 530 und bei der Kultivierung auf YM-Agar.
Tab. 3.14: Detektionszeit in Abhängigkeit von der Hefeart und der Probenaufarbeitung
Dotierungslevel
A:
B:
C:
D:
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
1,0 x 102
1,1 x 102
1,0 x 101
1,1 x 101
1,0 x 100
1,1 x 100
undotiert
-
1,0 x 102
6,3 x 101
1,0 x 101
6,3 x 100
1,0 x 100
6,3 x 10-1
undotiert
-
1,0 x 102
7,5 x 101
1,0 x 101
7,5 x 100
1,0 x 100
7,5 x 10-1
undotiert
-
1,0 x 102
4,1 x 101
1,0 x 101
4,1 x 100
1,0 x 100
4,1 x 10-1
undotiert
-
nach 24 Stunden
Anreicherung
Anreicherung
1
2
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
-/- (b)
-/- (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
-/+ (a)
-/+ (b)
+/+ (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
-/- (a)
-/+ (a)
-/+ (b)
-/- (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
nach 48 Stunden
Anreicherung
Anreicherung
1
2
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
+/+ (a)
+/+ (a)
+/+ (b)
+/+ (b)
-/- (a)
-/- (a)
-/- (b)
-/- (b)
Die Probenmatrices Coca-Cola (A und B) bzw. Radler (C und D) wurden vor der Anreicherung mit
YM-Medium mit A: P. membranaefaciens (DSM 70178), B: Z. bailii (MUCL 70178), C: C. tropicalis
(ATCC 20247) oder D: H. vineae (DSM 70283) Zellen dotiert. Die Zellzahlen bzw. KBE wurden mikroskopisch und nach Kultivierung auf YM-Agar bestimmt (Kap. 2.12). Nach 24 bzw. 48 Stunden Anreicherung wurden Proben entnommen, die nach Aufarbeitung mit der erweiterten, mechanisch/thermischen (a) oder (b) der mechanisch/thermischen Methode mit der Real-Time ConsensusPCR für Hefen getestet wurden (Kap. 2.15.2). Jede Anreicherung wurde im Duplikat angesetzt und je
Extraktionsmethode im Duplikat getestet.
-: Probe negativ; +: Probe positiv.
70
3 Ergebnisse
Die Detektionszeit in Abhängigkeit von den Hefearten P. membranaefaciens (DSM 70178),
Z. bailii (MUCL 70178), C. tropicalis (ATCC 20247) und H. vineae (DSM 70283) wurde mit
Anreicherungen mit Coca-Cola und Radler im direkten Vergleich mit der mechanisch/thermischen und der erweiterten, mechanisch/thermischen Aufarbeitungsmethode getestet (Tab. 3.14).
Unabhängig von der Hefeart, der Probenmatrix und der eingesetzten Probenaufarbeitung
wurde nach 48 Stunden Anreicherung der niedrigste Dotierungslevel mit 1 Zelle/ml detektiert.
3.2.7.5
Sensitivität bei einer hohen Begleitflora
Die Auswirkung einer sehr hohen Begleitflora auf die Nachweisgrenzen und die Aufarbeitungsmethoden wurde am Beispiel einer Flüssigkultur (Peptonwasser) mit 1010 KBE/ml E.
coli (DSM 30083) getestet. Die beiden Hefearten S. cerevisiae und Z. bailii wurden mit drei
Verdünnungsstufen (103, 104 und 105 Zellen/ml), sowohl mit als auch ohne Begleitflora und
mit beiden mechanisch/thermischen Probenaufarbeitungsmethoden jeweils im Duplikat getestet.
Die Hefearten S. cerevisiae und Z. bailii wurden auch bei einer hohen Begleitflora eines
Nicht-Zielorganismus ohne Sensitivitätseinbußen nachgewiesen (Tab. 3.15 und Abb. 3.21).
Tab. 3.15: Sensitivität bei einer hohen Begleitflora
Dotierungslevel
A:
B:
Cp-Werte (640/Back530)
10
[Zellen/ml]
[KBE/ml]
mit 10 KBE/ml E. coli
ohne E. coli
1,0 x 105
2,9 x 104
1,0 x 104
2,9 x 103
1,0 x 103
2,9 x 102
undotiert
-
1,0 x 105
1,6 x 104
1,0 x 104
1,6 x 103
1,0 x 103
1,6 x 102
undotiert
-
25,46/25,44 (a)
27,63/27,64 (b)
28,15/28,10 (a)
29,76/29,72 (b)
29,80/30,19 (a)
30,43/30,00 (b)
- (a)
- (b)
25,80/25,84 (a)
28,74/28,67 (b)
28,23/28,45 (a)
30,29/30,48 (b)
26,14/27,46 (a)
30,01/27,01 (b)
- (a)
- (b)
26,00/25,90 (a)
28,09/28,26 (b)
28,97/29,27 (a)
30,25/30,67 (b)
30,52/30,78 (a)
31,20/32,56 (b)
- (a)
- (b)
26,05/26,76 (a)
29,63/29,60 (b)
28,90/29,15 (a)
31,08/31,52 (b)
31,03/31,14 (a)
30,11/33,70 (b)
- (a)
- (b)
Peptonwasser mit oder ohne 1010 KBE/ml E. coli (DSM 30083) wurde mit A: S. cerevisiae (DSM 1333)
oder B: Z. bailii (MUCL 28823) Zellen dotiert, und nach Aufarbeitung mit der erweiterten, mechanisch/thermischen (a) (Kap. 2.6.3) oder mit der mechanisch/thermischen Extraktionsmethode (b) (Kap.
2.6.1) mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen getestet. Die Zellzahlen bzw. KBE wurden mikroskopisch und nach Kultivierung auf YM- bzw. Caso-Agar bestimmt (Kap. 2.12). Alle Aufarbeitungen
wurden im Duplikat durchgeführt.
71
3 Ergebnisse
Abb. 3.21: Sensitivität bei Anwesenheit einer hohen Begleitflora
Das Real-Time Consensus-PCR für Hefen wurde mit Proben (Peptonwasser) getestet, die mit (durchgezogene Linien) oder ohne (Punkte) 1010 KBE/ml E. coli und mit 105 Zellen/ml (schwarz), 104 Zellen/ml (blau) oder 103 Zellen/ml (rot) S. cerevisiae (DSM 1333) dotiert wurden. Die Proben wurden mit
der mechanisch/thermischen Methode aufgearbeitet. Als Negativkontrolle wurde eine undotierte Probe
verwendet (grüne Linie).
72
4 Diskussion
4
Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Real-Time PCR-Systeme zum Nachweis von getränkerelevanten Hefen auf Basis der LightCycler® Technologie mit Hybridisierungssonden entwickelt. Für beide Systeme wurden interne Amplifikationskontrollen und Positivkontrollen
hergestellt und zwei DNA-Extraktionssysteme bereitgestellt.
Ein hoch spezifischer und sensitiver Einzelnachweis für die wichtigste, bierschädliche Saccharomyces Fremdhefe, S. cerevisiae var. diastaticus, wurde entwickelt, indem die sequenziellen Unterschiede zwischen den Glucoamylase kodierenden Genen von S. cerevisiae var.
diastaticus (STA1-3) und S. cerevisiae (SGA1) ausgenutzt wurden. Die hohe Nachweisempfindlichkeit des PCR-Systems von 5 bis 10 GÄ pro Reaktion ermöglichte in Kombination mit
einer schnellen, mechanisch/thermischen Probenaufarbeitung den Nachweis von 102 bis 103
S. cerevisiae var. diastaticus Zellen/ml bei einer Hintergrundpopulation von 108 Zellen/ml
S. cerevisiae. Die Robustheit des Systems wurde durch Testung von 66 unterschiedlichen
Probenmatrices gezeigt und die Praxistauglichkeit direkt bei vier Brauereien verifiziert.
Die Sequenzierung eines Abschnitts des EF-3 Gens von 93 Hefestämmen lieferte die Grundlage für die Entwicklung einer Real-Time Consensus-PCR zum Nachweis von getränkerelevanten Hefen. Der Nachweis von allen 252 getesteten Hefestämmen wurde bei dem Assay
durch degenerierte Primer und Hybridisierungssonden ermöglicht, ohne dass mit der DNA
von einer der 71 getesteten Bakterien falsch-positive Ergebnisse auftraten. Der Nachweis
konnte nicht zur Identifizierung der Hefearten oder -gattungen eingesetzt werden und die
Abgrenzung zu den Schimmelpilzen, die ebenfalls das EF-3 Gen enthalten, ließ sich nicht zu
100 % erreichen. Die Sensitivität des Systems lag in Abhängigkeit von der Hefeart zwischen
10 und 250 GÄ pro Reaktion und in Kombination mit einer Erweiterung der mechanisch/thermischen Probenaufarbeitung bei 103 bis 104 Zellen/ml. Bei sehr niedrig kontaminierten Getränkeproben mit 1 bis 100 Zellen/ml war ein Nachweis nach zwei bis drei Tagen
Flüssiganreicherung in YM-Medium möglich.
4.1
Beurteilung der STA1-3 und EF-3 Gene als Targetmoleküle
Die Schädlichkeit und Gefährlichkeit der Hefe S. cerevisiae var. diastaticus für die Bierindustrie beruht auf der Produktion einer extrazellulären Glucoamylase und der ansonsten physiologischen Ähnlichkeit zu den Brauhefen der gleichen Art. Die Glucoamylase (1,4-α-DGlucanglucohydrolase, EC 3.2.1.3) befähigt diese Varietät, sowohl als Primärkontamination
im Brauprozess für Geschmacks- und Geruchsveränderungen zu sorgen, als auch als Sekundärkontamination im fertigen Bier die Restnährstoffe aus Stärke und Dextrinen zu Glucose abzubauen und eine Übervergärung mit den negativen Folgen der Nachtrübung, Ge-
73
4 Diskussion
schmacks-/Geruchsveränderung und Bodensatzbildung hervorzurufen. Ihre physiologische
Ähnlichkeit zu den Brauhefen erschwert zudem die einfache und schnelle Detektion mit konventionellen, kultivierungsabhängigen Methoden besonders innerhalb des Brauprozesses,
bei Anwesenheit der Brauhefe. Die Glucoamylase kodierenden Gene STA1-3 sind demnach
die idealen Targets für die Entwicklung einer molekularbiologischen Schnellmethode, um
S. cerevisiae var. diastaticus nachzuweisen und von S. cerevisiae unterscheiden zu können.
Seit der Entdeckung der Glucoamylase Genfamilie STA1-3 durch Tamaki et al. (1978) und
Erratt und Stewart (1978) in S. cerevisiae var. diastaticus ist diese Gegenstand umfangreicher Untersuchungen gewesen, nicht nur wegen ihres bierschädlichen Potentials sondern
auch aus Interesse an einer biotechnologischen Nutzung zur Gewinnung von Ethanol aus
Stärke und der ungewöhnlichen Länge und Komplexität des Promotors (Erratt und Nasim
1986, Laluce und Mattoon 1984, Laluce et al. 1988, Lambrechts et al. 1991, 1994, Vivier et
al. 1999). Molekulare Charakterisierungen der Gene zeigten, dass sie auf den Chromosomen II (STA2), IV (STA1) und XIV (STA3) lokalisiert sind und nahezu identische Sequenzen
haben (Bignell und Evans 1990, Lambrechts et al. 1991, Pretorius und Marmur 1988, Yamashita et al. 1985a,b). Außerdem zeigte sich, dass die Gene zwar nur bei S. c. var. diastaticus
Stämmen vorhanden sind, die einzelnen funktionalen Bereiche der Gene jedoch bei allen
untersuchten S. cerevisiae Stämmen als Bestandteil der Gene MUC1 (FLO11) und SGA1
vorkommen. Der 5´-Bereich der STA Gene wird durch die zwei Sequenzabschnitte S1 und
S2 gebildet, die beide auch im Gen MUC1 (FLO11) vorliegen, das ein membrangebundenes,
mucin-ähnliches Protein kodiert (Lambrechts et al. 1996, Pretorius et al. 1986, Yamashita et
al. 1987). Die S2 Sequenz bildet in den STA Genen den Promotor und kodiert die ersten
96 Nucleotide des anschließenden offenen Leserasters, wohingegen die folgende S1 Sequenz einen Serin/Threonin-reichen Bereich kodiert (Yamashita et al. 1985b). Die Sequenzen in der Mitte und dem 3´-Ende der STA Gene kodieren die katalytische Domäne der Proteine, die identisch ist mit einem Bereich im Gen SGA1, das auf dem Chromosom IX lokalisiert ist und eine sporulationsabhängige, intrazelluläre Glucoamylase kodiert (Pretorius und
Marmur 1988, Vivier et al. 1997, Yamashita und Fukui 1985, Yamashita et al. 1987). Die
Gene STA1-3 sind sehr wahrscheinlich aufgrund ihrer Homologie zu den Genen MUC1
(FLO11) und SGA1 aus einer Rekombination derselben mit anschließender Sequenzvervielfältigung hervorgegangen (Yamashita et al. 1987). Unterstützt wird diese These nicht nur
durch die Sequenzübereinstimmungen sondern auch durch drei weitere Argumente. Erstens
sind die STA Gene im Bereich der Telomere positioniert, wohingegen die Gene MUC1
(FLO11) und SGA1 eine zentrale Position im Chromosom IX einnehmen. Zweitens sind die
STA Gene in nur einigen S. cerevisiae Stämmen vorhanden, die Gene MUC1 (FLO11) und
SGA1 liegen jedoch in allen S. cerevisiae Stämmen vor. Drittens existieren übereinstimmen-
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4 Diskussion
de, sich wiederholende Sequenzen an beiden Seiten der propagierten Junktionen (Lambrechts et al. 1995, Yamashita et al. 1985b, 1987).
Diese nur in S. c. var. diastaticus vorkommende Anordnung der Sequenzabschnitte in den
STA Genen in der Reihenfolge S2-S1-SGA (Abb. 3.1) wurde erfolgreich für die Entwicklung
des spezifischen PCR Nachweises ausgenutzt. Ein ähnliches Primerdesign mit einem
5´-Primer aufbauend auf der S1 Sequenz und einem 3´-Primers aufbauend auf der SGA Sequenz wurde bereits von Yamauchi et al. (1998) erfolgreich zur Entwicklung eines spezifischen PCR-Systems zum Nachweis von S. c. var. diastaticus verwendet. Die Detektion eines spezifischen 868 bp langen PCR-Produkts erfolgte hierbei nach Amplifikation mit einem
konventionellen Thermocycler über Agarosegelelektrophorese.
Für die Entwicklung einer Consensus-PCR zum Nachweis aller getränkerelevanten Hefen
wurde ein Target gesucht, das in allen Hefen vorkommt, eine grundlegende Funktion erfüllt
und konservierte, spezifische Sequenzabschnitte aufweist. Da die Möglichkeit einer Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen über RT-PCR nicht ausgeschlossen werden
sollte, wurde außerdem nach einem mRNA kodierenden Gen gesucht.
Der Translationsprozess ist bei Hefen ein komplexes Zusammenspiel aus Initiation, Elongation und Termination, das durch eine Vielzahl an Proteinen gesteuert wird (Merrick 1992).
Bei der Elongation benötigen Hefen und Schimmelpilze den Elongationsfaktor 3 (EF-3), der
bisher nur bei diesen Eukaryoten nachgewiesen wurde, essentiell für das vegetative Wachstum ist und für den bei Prokaryoten kein funktionsgleiches Gegenstück existiert (Dasmahapatra und Chakraburtty 1981, Hutchison et al. 1984, Sandbaken et al. 1990a,b, Skogerson
und Wakatama 1976).
Diese überraschende Einzigartigkeit des Elongationsfaktors 3 bei Hefen und Schimmelpilzen
innerhalb eines ansonsten hoch konservierten, biochemischen Prozesses scheint jedoch
nicht uneingeschränkt gültig zu sein. Bei dem Chlorella Virus CVK2 konnte ein mutmaßlich
EF-3 kodierendes Gen isoliert werden, dem jedoch eine funktionale Domäne fehlt (Belfield et
al. 1995, Yamada et al. 1993). Eine ribosomale ATPase (RbbA) konnte außerdem bei E. coli
identifiziert werden, die in der C-terminalen Hälfte der Aminosäuresequenz 40 % Ähnlichkeit
mit dem EF-3 Protein von S. cerevisiae aufweist (Kiel et al. 1999). Das 1044 Aminosäuren
lange Protein EF-3 wird durch ein „single-copy“ Gen (EF-3) kodiert (Chromosom XII bei S.
cerevisiae) und enthält strukturelle Motive, die aufgrund ihrer Homologie zu Proteinen mit
bekannten Funktionen auf eine Interaktion des Proteins mit tRNA, rRNA und ATP hinweisen
(Qin et al. 1990). Ein 200 Aminosäure langes Motiv am N-terminalen Ende weist 30 % Homologie zu dem ribosomalen Protein S5 von E. coli auf und interagiert mit der 18 S rRNA
und den 80 S Ribosomen (Gontarek et al. 1998, Kovalchuke und Chakraburtty 1995). Das
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4 Diskussion
Vorhandensein von zwei ATP-Bindekassetten (oder Walker Boxen), von der die Erste eine
intrinsische und die Zweite eine ribosomen-abhängige ATPase Aktivität aufweist, ist ein weiteres Merkmal des Elongationsfaktors 3 (Qin et al. 1990). Außerdem existiert zwischen den
beiden Walker Signaturen der zweiten ATP-Bindekassette, die mit 188 Aminosäuren ungewöhnlich weit auseinander liegen, eine hoch konservierte Sequenz (ELVES), die in tRNAbindenden Proteinen zu finden ist (Belfield und Tuite 1993, Belfield et al. 1995, Colthurst et
al. 1991a). Diese strukturellen Motive korrelieren mit der etablierten Funktion von EF-3, die in
der ATP-abhängigen Stimulation der Bindung des ternären Komplexes aus EF-1α, GTP und
Aminoacyl-tRNA an die ribosomale A-Stelle durch Entfernen der deacylierten tRNA von der
E-Stelle besteht (Kamath und Chakraburtty 1989, Triana-Alonso et al. 1995, Uritani und Miyazaki 1988).
Als Target für die Entwicklung einer Consensus-PCR wurde der 106 Aminosäuren (bzw. 107
Aminosäuren bei Sch. pombe) lange Bereich zwischen den beiden Walker Signaturen der
zweiten ATP-Bindekassette ausgewählt, der nicht in anderen Proteinen mit ATPBindekassetten vorkommt und große sequenzielle Übereinstimmung unter den von Hefen
bekannten Sequenzen aufweist (Belfield et al. 1995). Bisher waren Sequenzen dieses Bereichs von 9 Ascomyceten (S. cerevisiae, C. albicans, C. maltosa, C. melibiosica, C. zeylanoides, K. lactis, P. pastoris, S. pombe und Y. lipolytica) und von einer Hefe der Unterabteilung der Basidiomycota (C. neoformans) bekannt (Blakely 2001, Di Domenico et al. 1992,
Mita et al. 1997, Myers et al. 1992, Qin et al. 1990, Sandbaken et al. 1990a,b, Uritani et al.
1999). Die Übereinstimmung der Aminosäuresequenz des Teilstücks liegt innerhalb dieser
Ascomyceten bei mindestens 74 % und ein deutlicher Sequenzunterschied besteht zwischen
den Ascomyceten und der Sequenz von C. neoformans (33 % Sequenzähnlichkeit zu S. cerevisiae). Die Sequenzierungen dieses Bereiches von 93 Hefestämmen, von denen zum
größten Teil bisher noch keine Informationen vorlagen, und die phylogenetische Untersuchung bestätigten die starke Sequenzhomologie unter den Ascomyceten und gleichzeitig die
Distanz zu den Basidiomyceten. Im Gegensatz hierzu ist die Sequenzhomologie zwischen
den beiden Unterabteilungen bei dem Elongationsfaktor 1α, der in allen Eukaryoten vorkommt, viel größer, da z. B. S. cerevisiae und C. neoformans eine Sequenzidentität von
84,7 % aufweisen (Thornewell et al. 1997). Die Ergebnisse bestätigen die vermutete, größere evolutionäre Drift des Elongationsfaktors 3 innerhalb des Reichs der Pilze. Außerdem
zeigten die neu hinzugekommenen Sequenzen von weiteren Hefen der Unterabteilung der
Basidiomyceten, dass die Sequenzübereinstimmung innerhalb dieser Unterabteilung (mindestens 67 %) ähnlich hoch ist wie bei den Ascomyceten (mindestens 68 %).
Die phylogenetische Distanz zwischen den Unterabteilungen der Ascomycota und Basidiomycota aufgrund der EF-3 Sequenzen korreliert mit der phylogenetischen Ordnung der He-
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4 Diskussion
fen, die auf Sequenzen der 26 S ribosomalen RNA basiert (Fell et al. 2000, Kurtzman 1994,
Kurtzman und Robnett 1998). Weitere Parallelen können zwischen den phylogenetischen
Stammbäumen, die mit den EF-3 oder den 18 S rDNA Sequenzen erstellt wurden, in Bezug
auf die Gattung Saccharomyces gezogen werden (James et al. 1997). Die Gattung musste
aufgrund beider Analysen als polyphyletisch eingestuft werden, da sie mit Arten der Gattungen Zygosaccharomyces, Kluyveromyces und Torulaspora vermischt ist (Abb. 3.12). Viele
der zurzeit akzeptierten Hefegattungen wurden nach einem umfangreichen Vergleich der
D1/D2 Domäne der 26 S rDNA von Kurtzman und Robnett (1998) als nicht monophyletisch
eingestuft. Monophyletische Gruppen bildeten, wie bei dem über die D1/D2 Sequenzen der
26 S rDNA ermittelten Stammbaum, nur die Gattungen Dekkera und Schizosaccharomyces,
wobei die Letztere auch zu einer anderen Klasse (Archiascomycetes) als die sonstigen untersuchten Ascomyceten (Hemiascomycetes) gehörte (Kurtzman und Robnett 1998). Der
sequenzierte Bereich des EF-3 Gens ist jedoch zu klein, um detaillierte Aussagen über die
phylogenetische Verwandtschaft der einzelnen Gattungen und Arten machen zu können.
Das EF-3 Gen wurde jedoch von einigen Autoren als möglicher taxonomischer Marker für
das Phylum Fungi genannt und für die Identifizierung von Sauerteighefen über RFLP-PCR
eingesetzt (Belfield und Tuite 1993, Colthurst et al. 1991b, Mäntynen et al. 1999). Diese
RFLP-PCR Analyse von Mäntynen et al. (1999) konnte nicht auf die Hefearten Candida geochares, Cryptococcus laurentii, Rhodosporidium toruloides und Schizosaccharomyces pombe angewendet werden, da keine PCR-Produkte mit den Primern, die über die Sequenzinformationen von S. cerevisiae und C. albicans entwickelt wurden, generiert werden konnten.
Der Mikrosatelliten-DNA Polymorphismus in der Promotor Region des EF-3 Gens wurde außerdem als Target zur Typisierung von C. albicans verwendet. (Bretagne et al. 1997, Dalle et
al. 2000).
Aber auch wenn das EF-3 Gen in seiner Gesamtheit für phylogenetische Analysen geeignet
ist, sollte immer davon ausgegangen werden, dass phylogenetische Stammbäume aufbauend auf unterschiedlichen Genen zur Lösung von taxonomischen Problemen auch unterschiedliche Topologien aufweisen können (McCarroll et al. 1983, Seifert et al. 1995). Polyphasische Untersuchungen mit unterschiedlichen, unabhängigen Genen und weitere
Merkmale wie z. B. die Morphologie sollten daher zur Bestätigung der Stammbäume herangezogen werden (Valente et al. 1999).
Der Elongationsfaktor 1α (EF-1 α) wurde bereits als Target für den Nachweis einiger Hefe(S. cerevisiae, C. albicans) und Schimmelpilzarten (Mucor racemosus, Aureobasidium pullulans) über RT-PCR in Milch, Bier und Joghurt verwendet (Vaitilingom et al. 1998). Versuche,
das Consensus-PCR System für Hefen ebenfalls zu einer RT-PCR weiterzuentwickeln, waren nicht erfolgreich, da das Gesamtsystem aufgrund der großen Anzahl an Primern und
77
4 Diskussion
Sonden zu komplex war. Durch diese große Anzahl an Primern und Sonden setzte sehr
wahrscheinlich schon während der RT-Reaktion eine zu starke Primerdimerbildung ein, die
die nachfolgende PCR unmöglich machte. Mit einer reduzierten Anzahl an Primern und nur
einem Hybridisierungssondenpaar konnte jedoch die mRNA des EF-3 Gens von S. cerevisiae var. diastaticus in einer Real-Time RT-PCR spezifisch detektiert werden. Die Daten zu
diesem Experiment werden im Kapitel 6.3 im Anhang präsentiert.
Für die Entwicklung der Real-Time Consensus-PCR für Hefen lieferten die Sequenzergebnisse zwei Notwendigkeiten, zum einen mussten degenerierte Oligonucleotide verwendet
werden und zum anderen mussten drei unabhängige PCR-Assays für die Hemiascomyceten,
die Gattung Schizosaccharomyces und die Basidiomyceten zu einer Multiplex-PCR kombiniert werden. Diese Kombination machte eine Identifizierung von Arten oder Gattungen mit
diesem System unmöglich.
4.2
Spezifität und Sensitivität der Real-Time PCR-Assays
Die Spezifität von Real-Time PCR-Assays mit Hybridisierungssonden beruht zum einen wie
bei herkömmlichen PCR-Systemen auf den Primern, aber zum anderen auch auf der gleichzeitigen, spezifischen Hybridisierung von zwei fluoreszenzmarkierten Sonden, um die Amplifikate zu detektieren. Bei dem Nachweissystem für S. cerevisiae var. diastaticus konnte
durch die Anordnung der vier Oligonucleotide sowohl die PCR als auch die Detektion der
PCR-Amplifikate 100-%ig spezifisch gestaltet werden. Dieses Ergebnis stimmt mit Ergebnissen von Yamauchi et al. (1998) überein, die mit einer konventionellen PCR ebenfalls eine
100-%ige Spezifität erreichten.
Dagegen konnte das Nachweissystem für alle Hefen durch die Verwendung von degenerierten und vielen unterschiedlichen Primern auf der Ebene der PCR nicht 100-%ig spezifisch
gestaltet werden. Die Spezifität wurde jedoch durch die Verwendung von Hybridisierungssonden so weit erhöht, dass keine falsch-positiven Ergebnisse durch bakterielle DNA verursacht wurden. Alle getesteten Hefen waren positiv, aber auch 13 Schimmelpilzarten wurden
positiv getestet. Dieses Ergebnis war aufgrund der Heterogenität der EF-3 Zielsequenzen zu
erwarten, da die degenerierten Oligonucleotide auch aufgrund der mit berücksichtigten Redundanz des genetischen Codes eine große Sequenzvariabilität abdeckten. Die Unspezifität
in Bezug auf einige Schimmelpilze kann jedoch auch als ein Vorteil angesehen werden. Die
gemeinsame Erfassung von Hefen und Schimmelpilzen kann von Nutzen sein, da Schimmelpilze ebenfalls zum Verderb von Getränken führen und durch die Bildung von Mycotoxinen gefährlich für die menschliche Gesundheit sein können. Die Ergebnisse zeigten an, dass
durch die Sequenzierung des EF-3 Genabschnitts von getränkerelevanten Schimmelpilzen
der Assay zu einem Gesamtnachweis für Hefen und Schimmelpilzen erweitert werden könn-
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4 Diskussion
te, wie zurzeit durch die kultivierungsabhängigen Standardmethoden vorgegeben (Anonymus 1987). Auch wenn die ascosporogenen Hefen mit Ausnahme der Gattung Schizosaccharomyces aufgrund der rDNA eine monophyletische Gruppe (Hemiascomycetes) bilden,
die sich von filamentösen Arten der Euascomycetes unterscheidet, könnte demnach ein
Consensus-System für Hefen und Schimmelpilze möglich sein (Kurtzman 1994).
Die Unterschiede in der Komplexität der beiden Assays zeigten sich auch in den Sensitivitätstestungen mit Protein- und RNA-freier, quantifizierter DNA. Die Real-Time PCR für S. c.
var. diastaticus ist mit einer Nachweisgrenze zwischen 5 und 10 GÄ pro Probenvolumen von
5 µl sehr sensitiv. Teilweise wurde auch 1 GÄ pro Reaktion nachgewiesen, was einer eingesetzten DNA-Menge von 13,3 fg entspricht. Die theoretisch erreichbare Empfindlichkeit des
PCR-Systems konnte demnach auch praktisch realisiert werden, wenn von maximal drei
STA Gensequenzen pro Chromosomensatz auszugehen ist und zudem eine Konkurrenz zu
der Amplifikation der internen Amplifikationskontrolle besteht. Die Sequenzen der Gene
STA1 und STA2 sind bekannt und bis auf eine Base identisch, außerdem besitzen alle STA
Gene die gleiche Restriktionskarte, so dass höchstwahrscheinlich auch das noch nicht sequenzierte STA3 Gen ein Target für die PCR darstellt (Lambrechts et al. 1991, Pardo et al.
1986 und Yamashita et al. 1985a,b).
Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen konnte dagegen nicht so weit optimiert werden,
dass die theoretisch mögliche Nachweisgrenze erreicht wurde. Die Empfindlichkeit lag zwischen 10 und 250 GÄ pro Reaktion und war abhängig von der jeweiligen Hefeart. Diese
verminderte Sensitivität lässt sich mit der Komplexität der Multiplex-PCR und den notwendigen Degenerierungen der Oligonucleotide erklären. Die Optimierung der Multiplex-PCR wurde besonders durch die sehr unterschiedlichen GC-Gehalte im Target Bereich erschwert, die
sich zum einen auf das Design der Primer und zum anderen auf die Annealingtemperatur
auswirkten. Beim Einsatz von degenerierten Primern ist es nicht zu vermeiden, dass sehr
viele unterschiedliche Primer mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen im Reaktionsansatz vorliegen. Die Bildung von Primerdimeren und unspezifischen Amplifikaten mit bakterieller DNA, die den Einsatz von SYBR®-Green I zur Detektion der Amplifikate unmöglich machte, könnte durch den Einsatz dieser degenerierten Primer verstärkt worden sein. Das Primerdesign, für das einige Computerprogramme entwickelt wurden, wird als wichtiger Punkt
zur Vermeidung von Primerdimeren angesehen (Abd-Elsalam 2003). Diese Programme und
Regeln für das Primerdesign wie z. B. die Vermeidung von Sequenzen, die zu einem Annealing der Primer untereinander oder innerhalb der eigenen Sequenz führen können, sind bei
degenerierten Primern schwer anzuwenden. Eine weitere Strategie zur Vermeidung von
Primerdimeren, die bei den entwickelten PCR-Systemen zum Einsatz kam, ist die Anwen-
79
4 Diskussion
dung einer so genannten „Hot Start“ DNA-Polymerase. Diese Polymerasen können reversibel chemisch wie in der vorliegenden Arbeit, mit Aptameren oder enzymatisch modifiziert
sein, sodass sie erst durch den einleitenden Denaturierungschritt bei 95 °C aktiviert werden
(Dang und Jayasena 1996, Sharkey et al. 1994). Beim Ansetzen der PCR-Reagenzien besteht daher nicht die Gefahr, dass die Polymerase schon bei niedrigen Temperaturen geringfügig aktiv ist und dadurch unspezifische Amplifikate und Primerdimere bildet.
Die unterschiedlichen Sensitivitäten der Real-Time Consensus-PCR für Hefen können zum
einen durch die unterschiedliche Effizienz der Primerpaare, aber zum anderen auch durch
die unterschiedlichen Effizienzen bei der Synthese der degenerierten Primer entstehen. Bei
der normalen Synthese von degenerierten Primern wird nicht jedes Nucleotid mit gleicher
Effizienz eingebaut, daher bestehen degenerierte Primer in der Regel nicht zu gleichen Teilen aus allen möglichen Primervarianten, sodass die Primer in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen können. Ein weiterer Punkt, der die PCR-Effizienz herabgesetzt haben könnte, war die notwendige Verringerung der Annealingtemperatur während der Touchdown-PCR auf einen mit 40 °C sehr niedrigen Wert, der für die PCR ungünstig war und normalerweise nur bei der RAPD-PCR eingesetzt wird. Der Einbau von LNA®- („locked nucleic
acid“) Nucleotiden in die Sonden, die deren Schelztemperatur erhöhen würden, könnte hier
eine Verbesserung darstellen. LNA®-Nucleotide stellen eine neuen, bizyklischen Typ an
DNA/RNA-Analoga dar, die eine Methylierung zwischen dem 2´-Sauerstoffatom und dem 4´Kohlenstoffatom der Ribose enthalten und dadurch einem LNA/DNA-Duplex eine höhere
Stabilität geben (Koshkin et al. 1998). Die Sonden könnten mit dieser Modifikation kürzer und
mit einer höheren Schmelztemperatur konstruiert werden, wodurch die PCR unter stringenteren Bedingungen mit höheren Annealingtemperaturen durchgeführt werden könnte.
Das EF-3 Gen kommt einzeln im Genom von S. cerevisiae vor und ist auf dem Chromosom
XII lokalisiert (Qin et al. 1990). Im vollständig sequenzierten Genom von S. cerevisiae konnte
jedoch eine zu EF-3 homologe Sequenz im Chromosom XIV nachgewiesen werden, die
75 % DNA-Übereinstimmung und 84 % Aminosäure-Übereinstimmung im kodierenden Bereich aufweist. Da dieser Bereich aufgrund fehlender Promotorsequenzen nicht exprimiert
werden kann, scheint er nicht essentiell für das vegetative Wachstum zu sein (Sarthy et al.
1998). Für die Sensitivität bedeutet dies, dass maximal zwei Targetsequenzen je haploider
Zelle vorliegen.
Real-Time PCR Techniken bieten gegenüber konventionellen PCR Methoden nicht nur einen
Vorteil in Bezug auf Zeit- und Arbeitsaufwand, sondern auch in Bezug auf die erreichbare
Sensitivität. Casey und Dobson (2004) konnten in einem direkten Vergleich zeigen, dass
eine Real-Time PCR zum Nachweis des Citratsynthase Gens (cs 1) von C. krusei um zwei
80
4 Diskussion
Zehnerpotenzen sensitiver ist als eine konventionelle PCR. Die Sensitivität dieses Systems,
das mit SYBR®-Green I zur Detektion der Amplifikate arbeitete, war mit 10 Kopien aufgereinigter Amplifikate oder 120 pg genomischer DNA je Reaktion jedoch nicht im optimalen Bereich.
Vergleichbare Systeme für den Nachweis von Hefen über Real-Time PCR beruhen zum
größten Teil auf Sequenzen der ribosomalen DNA und deren ITS-Regionen als Target und
sind für klinisch relevante Hefen (Candida sp. und Cryptococcus neoformans) entwickelt
worden (Bialek et al. 2002, Bu et al. 2005, Hsu et al. 2003, Loeffler et al. 2000, Maaroufi et
al. 2003, White et al. 2003). Die Nutzung von rDNA als Target bietet Sensitivitätsvorteile, da
je Genom 100 bis 200 Kopien des rDNA Gen-Clusters vorliegen (Kurtzman 1994).
4.3
Anwendbarkeit der Real-Time PCR in Kombination mit der Probenaufarbeitung
Ein PCR-basierendes Nachweissystem kann nur Teil eines Qualitätskontrollkonzeptes sein,
wenn einige, grundlegende Voraussetzungen erfüllt sind. Hierzu zählen nicht nur die Spezifität und Sensitivität des PCR-Systems, sondern auch eine leichte und sichere Handhabung,
die unter anderem eine leichte Interpretation der Ergebnisse beinhaltet, und ein hohes Maß
an Robustheit in Bezug auf das eingesetzte Probenmaterial bietet. Das Gesamtkonzept
muss außerdem durch eine geeignete Probenvorbehandlung (z. B. Voranreicherung, Membranfiltration) und eine DNA-Extraktionsmethode ergänzt werden. Gegenüber den herkömmlichen Methoden sollten sich möglichst Vorteile zeigen wie z. B. geringerer Zeit- und Arbeitsaufwand. Außerdem sollte die Methode genau und zuverlässig sein, indem das Auftreten von falsch-positiven und falsch-negativen Resultaten möglichst vermieden wird.
Mit der optischen Vorrichtung des LightCycler® Gerätes können Fluoreszenzen mit unterschiedlichen Wellenlängen simultan in einer Probe gemessen werden. Dies erlaubt es in
jeder Probe eine interne Amplifikationskontrolle (IAK) mitzuführen, deren Amplifikation über
eine andere Wellenlänge als bei den positiven Proben und der Positivkontrolle gemessen
wird. Für beide Real-Time PCR-Assays wurde eine interne Amplifikationskontrolle durch
PCR-Mutagenese entwickelt, die mit der LightCycler®-Red 705 markierten Sonde LMRST1
statt mit den LightCycler®-Red 640 markierten Sonden, die die Wildtypen detektieren, nachgewiesen wurde. Eine IAK sollte idealerweise, um äquivalente Amplifikationseigenschaften
aufzuweisen, so wenig Unterschiede zu der eigentlichen Zielsequenz aufweisen wie möglich.
Bei den hergestellten internen Amplifikationskontrollen wurde daher nur der Bereich einer
Sonde ausgetauscht, die restliche Sequenz entsprach dem Wildtyp. Zu beachten ist jedoch,
dass bei der Real-Time Consensus-PCR für Hefen mit vielen, unterschiedlichen Zielsequenzen und den entsprechenden, unterschiedlichen Primern und Sonden die Ähnlichkeit zu der
81
4 Diskussion
IAK nicht einheitlich hoch sein konnte. Das Mitführen der internen Amplifikationskontrolle
(IAK) bei jeder Reaktion ist für die Anwendung des Systems in der Praxis essentiell, da die
PCR durch eine Vielzahl an Substanzen inhibiert werden kann und ohne Kontrolle falschnegative Ergebnisse liefern kann (Rosenstraus et al. 1998). Die IAK wurde bei den beiden
Systemen in Form von Plasmid-DNA in einer Konzentration zugegeben, die dem unteren
Detektionslimit entspricht, um auch geringe Inhibitionen und Störungen zu detektieren. Ein
positives Signal für die Amplifikation der IAK validierte somit negative Ergebnisse bei der
Amplifikation des primeren Targets und zeigte, dass auch sehr geringe DNA Mengen in den
Proben amplifiziert werden können.
Technische Probleme, fehlerhafte Reagenzien oder Fehler beim Handling können durch Mitführen einer Positivkontrolle erkannt werden. Wenn diese Probe negativ ist muss das gesamte Experiment wiederholt werden und mögliche Fehler behoben werden (Burkardt 2000).
Für die beiden Systeme wurde je eine Positivkontrolle hergestellt, die sich bei der Real-Time
PCR für S. cerevisiae var. diastaticus durch Einfügen einer Punktmutation im Sondenbereich
auch von positiven Proben über Schmelzkurvenanalyse unterscheiden ließ, um falschpositive Ergebnisse durch Kontaminationen ausschließen zu können. Für das ConsensusSystem konnte diese zusätzliche Möglichkeit aufgrund der Verwendung von degenerierten
Sonden nicht angewendet werden.
Falsch-positive Ergebnisse durch Verschleppungen von Amplifikaten in neue Reaktionsansätze können mit der LightCycler® Technologie zum einen vermieden werden, da ein Öffnen
der Glaskapillaren für weitere Untersuchungen der Amplifikate nicht notwendig ist, und zum
anderen durch den Einsatz eines weiteren Enzyms, der Uracil-N-Glycosylase, gänzlich ausgeschlossen werden (Longo et al. 1990). Die Basis für den Einsatz dieses Enzyms ist eine
während der PCR durchgeführte Markierung der generierten Amplifikate, sodass sie sich von
der Target-DNA unterscheiden. Dieser Unterschied wird durch die vollständige oder teilweise
Substitution der Pyrimidin Base Thymin durch Uracil während der PCR bewerkstelligt. Wenn
solche Amplifikate in eine folgende PCR-Reaktion gelangen, werden sie von dem Enzym
UNG durch Spaltung der N-glycosidischen Bindung zwischen Uracil und der Desoxyribose
abgebaut und können nicht als Vorlage für die PCR dienen. Für die Real-Time PCR für S. c.
var. diastaticus wurde der Abbau von zugegebenen Amplifikaten durch die UNG während
der einleitenden Inkubation bei 37 °C und die anschließende Inaktivierung des Enzyms durch
die folgende Inkubation bei 95 °C erfolgreich getestet.
Die Anwendbarkeit und die Robustheit der PCR-Assays wurden mit unterschiedlichen Probenmatrices
in
Kombination
mit
der
schnellen,
82
mechanisch/thermischen
DNA-
4 Diskussion
Extraktionsmethode getestet. Diese Testung war wichtig, da ein Nachteil von PCR-Methoden
in der Inhibition der DNA-Polymerase durch Substanzen liegen kann, die in der Probe vorhanden sind (Rossen et al. 1992). Der Real-Time PCR-Assay zum Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus stellte sich dabei als ein sehr robustes System dar, da sich nur eine
Probenmatrix („Laugetank“) von 66 untersuchten Proben als gänzlich ungeeignet herausstellte und auch nach Verdünnung die Amplifikation der IAK inhibierte. Die Probenmatrix
„Laugetank“ inhibiert sehr wahrscheinlich die DNA-Polymerase durch die Erhöhung des pHWertes im Reaktionsansatz.
Das in den PCR-Ansätzen als Blocking-Reagenz enthaltene BSA und das während der
DNA-Extraktion verwendete Chelex® 100 sind bekannt für ihre positive Eigenschaft, PCRInhibitionen zu vermindern, und könnten zu der hohen Stabilität des Systems beigetragen
haben (Al-Soud und Radström 2000, de Lamballerie et al. 1992, Kreader 1996, Mättö et al.
1998, Walsh et al. 1991).
Auch eine sehr hohe Hintergrundkonzentration von 108 Zellen/ml S. cerevisiae, die allein
aufgrund der großen DNA-Menge oder den auch bei S. cerevisiae vorhandenen Zielsequenzen von Primern und Sonden zur Inhibition der IAK hätten führen können, bereitete keine
Probleme. Die Stabilität des PCR-Systems könnte möglicherweise den gänzlichen Verzicht
auf eine DNA-Extraktion für einige Proben ermöglichen. Ibeas et al. (1996) konnten z. B. auf
eine DNA-Extraktion verzichten, da der Denaturierungsschritt zu Beginn der PCR bei 95 °C
ausreichte, um die Zellen zu lysieren und die DNA freizusetzen.
Die Real-Time Consensus- PCR für Hefen ist ebenfalls als ein robustes System anzusehen,
jedoch führten trübstoffhaltige Säfte und besonders Rotwein zu einer verminderten Sensitivität des Systems, sodass teilweise keine Detektion bei Zellzahlen von weniger als
105 Zellen/ml möglich war. Die Anwendung einer Flüssiganreicherung könnte in diesem Zusammenhang zur Erhöhung der Zellzahlen führen und gleichzeitig auch zur Verdünnung der
inhibierenden Substanzen dienen (Hofstra 1994, Swaminathan und Feng 1994). Besonders
Rotwein ist bekannt für die inhibierende Wirkung einiger Inhaltsstoffe wie z. B. Polysaccharide, Tannin und Polyphenole (Wilson 1997). Die Inhaltsstoffe des Rotweins könnten möglicherweise als organische Liganden Komplexe mit den Magnesiumionen, die essentiell für die
Aktivität der DNA-Polymerase sind, bilden und die PCR dadurch inhibieren. Vergleichbare
Verschlechterungen der Sensitivität durch die Probenmatrix Wein konnten bei PCRSystemen beobachtet werden, die für Dekkera/Brettanomyces sp. entwickelt wurden. Ibeas
et al. (1996) konnten mit einer konventionellen Nested-PCR ein Detektionslimit von
10 Zellen/Reaktion erreichen, wenn steriles Wasser als Probenmatrix verwendet wurde und
die Proben direkt ohne Extraktion in die PCR eingesetzt wurden. Sherrywein inhibierte dagegen die PCR, sodass nur 104 Zellen/ml nachweisbar waren. Eine Zentrifugation der Proben
83
4 Diskussion
und die anschließende Aufnahme der sedimentierten Zellen in sterilem Wasser eliminierte
die Inhibition. Eine Nested-PCR ist jedoch für die Anwendung in der Praxis nicht nur eine zu
umständliche und arbeitsaufwendige Methode, sondern auch aufgrund ihrer hohen Anfälligkeit für falsch-positive Ergebnisse durch Kontaminationen ungeeignet (Burkardt 2000). Jedes
erneute Öffnen von Reaktionsgefäßen oder Pipettieren von hohen Amplifikatmengen stellt
bei der sehr empfindlichen PCR-Diagnostik ein zu vermeidendes Kontaminationsrisiko dar.
Von Cocolin et al. 2004 wurde ebenfalls ein PCR-System zum Nachweis von Dekkera/Brettanomyces bruxellensis und Dekkera/Brettanomyces anomalus entwickelt, das die
D1/D2 Domäne der 26S rDNA als Target nutzte. Das System hatte trotz der Verwendung
eines „multicopy“ Gens ein hohes Detektionslimit von 104 bis 105 Zellen/ml, wenn DNA oder
RNA direkt aus Wein isoliert wurde. Bei einer Konzentration von 105 KBE/ml oder höher
macht sich die für Brettanomyces sp. typische und unerwünschte Geschmacksveränderung
im Wein bereits bemerkbar (Chatonnet et al. 1992).
Quantitative Real-Time PCR-Systeme für Dekkera/Brettanomyces bruxellensis konnten von
Delaherche et al. (2004) und Phister und Mills (2003) mit SYBR®-Green I entwickelt werden.
Bei Delaherche et al. (2004) wurde ein Detektionslimit von 104 KBE/ml in Wein ermittelt, das
gut mit den Ergebnissen der konventionellen Methoden korrelierte. Phister und Mills (2003)
konnten dagegen ein für die schwierige Probenmatrix Wein und die Detektion mit SYBR®Green I sehr sensitives System entwickeln, das nach einer 1:10-Verdünnung der Proben ein
Detektionslimit von 10 KBE/ml hatte. Diese beiden Einzelnachweise, die nur ein Primerpaar
enthielten, sind jedoch nicht direkt mit der entwickelten Real-Time PCR für Hefen zu vergleichen.
Die
für
diese
beiden
PCR-Systeme
verwendeten,
kommerziellen
DNA-
Extraktionsmethoden entsprechen eher der erweiterten, mechanisch/thermischen Methode,
mit der wie bei Delaherche et al. (2004) 104 Zellen/ml S. cerevisiae in Rotwein detektiert
wurden. Die hohe Sensitivität des Nachweises von Phister und Mills (2003) ist sicher auch
auf die Verwendung eines „multi-copy“ Gens (26 S rRNA Gen) zurückzuführen.
Die Erweiterung der mechanisch/thermischen Extraktionsmethode um einen enzymatischen
Schritt mit Proteinase K und einen Aufreinigungsschritt mit Säulen führte zu einer Verbesserung der Sensitivität. Magnetische Separationstechniken, die zur Trennung von Nucleinsäuren von der Probenmatrix angewendet werden, wie z. B. das MagNA Pure System, das bei
einer der Brauereien mit dem S. c. var. diastaticus System erfolgreich getestet wurde, könnten ebenfalls zur Minderung von Inhibitionen bei problematischen Probenmatrices angewendet werden (Loeffler et al. 2002, Safarík et al. 1995). Die Real-Time Consensus-PCR für Hefen unterscheidet sich außerdem von dem Einzelnachweis für S. cerevisiae var. diastaticus
in der auf 750 ng/µl verminderten BSA-Konzentration. Diese Reduktion war durch den Ein-
84
4 Diskussion
satz einer höheren MgCl2-Konzentration (4,0 mM) bei diesem System notwendig. BSA wird
während der PCR durch die wiederholten 95 °C Schritte denaturiert und bildet dann besonders in Gegenwart von bivalenten Ionen wie Mg2+ unlösliche Niederschläge (Teo et al. 2002).
Die von Teo et al. (2002) als thermostabile Alternative zu BSA vorgeschlagene Verwendung
von RNase A wurde getestet und die Anwendung war für dieses System möglich, jedoch
konnten die inhibitionsmindernden Eigenschaften des BSA durch dieses Enzym bei mechanisch/thermisch aufgearbeiteten Proben nicht erreicht werden. (Die Daten hierzu wurden in
dieser Arbeit nicht vorgestellt.)
Neben Inhibitionen ist die Effizienz des Zellaufschlusses durch die mechanisch/thermischen
DNA-Extraktionsmethoden ein weiterer wichtiger Aspekt, der die Sensitivität der Nachweise
beeinflusst. Der mechanische Zellaufschluss von Hefen und Schimmelpilzen unter Einbeziehung von Glaskügelchen und einem geeignetem Gerät wurde oft als effiziente, schnelle und
günstige Methode beschrieben (Haugland et al. 1999, Müller et al. 1998, van Burik et al.
1998). Eine ähnlich aufgebaute schnelle Extraktionsmethode wie in der vorliegenden Arbeit,
die aus der Kombination eines thermischen Schritts mit einem Lysis-Puffer und einem mechanischen Schritt mit Glaskügelchen bestand, wurde von Kuske et al. (1998) zur Extraktion
von DNA aus sehr unterschiedlichen Zelltypen (vegetative Bakterien, bakterielle Endosporen
und Konidien) und Bodenproben erfolgreich verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde
eine 5-%ige Chelex 100 Lösung als Lysis-Puffer verwendet, die durch die Chelatierung von
polyvalenten Metallionen und ihre hohe Alkalinität in Kombination mit hohen Temperaturen
zur Destabilisierung und Zerstörung der Zellemembranen führt und vermutlich gleichzeitig
eine stabilisierende Wirkung auf die DNA hat (de Lamballerie et al. 1992, Walsh et al. 1991).
Die Ergebnisse der Sensitivitätstestung des Einzelnachweises für S. c. var. diastaticus zeigten, dass die mechanisch/thermische DNA-Extraktionsmethode sehr effizient war. Eine Ausgangskontamination zwischen 102 und 103 Zellen/ml war nachweisbar, was theoretisch 2,5
bis 25 GÄ pro PCR-Reaktion entspricht. Mit der Real-Time Consensus-PCR für Hefen konnten in Kombination mit der mechanisch/thermischen DNA Extraktionsmethode in trübstofffreien Getränken zwischen 103 und 104 Zellen/ml nachgewiesen werden. Bei der Handhabbarkeit der DNA-Extraktionsmethode wurde außerdem auf die Vermeidung von gesundheitsgefährdenden Stoffen wie Chloroform oder Phenol geachtet.
Bei Kontaminationsleveln, die unterhalb des ermittelten Detektionslimits lagen, zeigte sich
ein Nachteil von PCR-basierten Methoden, der von van der Vossen und Hofstra (1996) angesprochen wurde und in dem geringen einsetzbaren Probenvolumen von maximal 10 µl bei
einem Reaktionsvolumen von 20 µl liegt. Die Sensitivität ist daher auch bei dem sehr empfindlichen PCR-Assay für S. c. var. diastaticus mit einem optimalen Probenvolumen von 5 µl
85
4 Diskussion
durch die Probenaufarbeitung limitiert. Die Sensitivität der Nachweise könnte bei filtrierbaren
Proben über eine geeignete Membranfiltration erhöht werden, die jedoch auch einen wesentlich höheren Arbeitsaufwand darstellt. Größere Volumina könnten auch nach Zentrifugation
und anschließender Aufnahme der sedimentierten Zellen im Lysispuffer aufkonzentriert werden. Anreicherungen stellen wie mit dem Gesamtnachweis für Hefen gezeigt ebenfalls eine
Möglichkeit dar, um auch Spurenkontaminationen von weinigen Zellen/ml zu erfassen.
Ein Vorteil der Flüssiganreicherung liegt in der Ermittlung signifikant höherer Zellzahlen als
bei der direkten Anwendung von Oberflächen- oder Plattenguss-Verfahren, da gestresste
Zellen besser wiederbelebt werden (Deák, 1991). Die Kombination aus unspezifischer Flüssiganreicherung mit YM-Medium und anschließender Consensus-PCR stellt einen unselektiven Nachweis für Hefen dar, der Aussagen über die An- und Abwesenheit von Hefen liefert.
Ein solcher Nachweis kann z. B. in Brauereien als Indikator für die allgemeine Betriebshygiene und als Endkontrolle dienen. Ein unselektives Medium wurde hierbei zu Gunsten einer
hohen Wachstumsgeschwindigkeit ausgewählt, da jedes selektive Reagenz oder jede selektive Bedingung auch Einfluss auf die nachzuweisenden Organismen hat. Die Inhibition einer
Begleitflora wie z. B. der Kulturhefe und das Wachstum von Fremdhefen wird unter selektiven Bedingungen von den physiologischen Voraussetzungen der Hefen, der Zellkonzentration und den Inkubationsbedingungen beeinflusst (Fernández et al. 1989). Makdesi und Beuchat (1996) zeigten, dass gegen Benzoat resistente Zygosaccharomyces bailii Stämme nach
einem Hitzestress mit pH-neutralem YM-Agar besser als mit saurem YM-Agar (pH 3,8)
nachzuweisen waren. Diese Ergebnisse sind besonders interessant im Bereich der nicht
karbonathaltigen Getränke, die heiß abgefüllt oder vor dem Abfüllen pasteurisiert werden.
Ein weiterer positiver Aspekt des unselektiven YM-Mediums ist die mit 10 g/l niedrige Glucosekonzentration, da hitzegestresste Hefezellen eine erhöhte Sensitivität gegenüber hohen
Zuckerkonzentrationen aufweisen können (Golden und Beuchat 1990, Stecchini und Beuchat 1985). Das YM-Medium, das nach den Bestandteilen im Bereich der Brauereien auch
MYGP-Medium genannt wird, wurde außerdem ausgewählt, da es als Grundmedium für einige selektive Medien zum Nachweis von Fremdhefen in Brauereien angewandt wird
(Jespersen und Jakobsen 1996). Bei einem Vergleichstest unterschiedlicher Medien für den
Nachweis von Fremdhefen von van der Aa Kühle und Jespersen (1998) konnten die besten
Ergebnisse mit YM-Agar mit dem Zusatz von CuSO4 erzielt werden. Die Anwendung des
MYGP-Mediums mit 200 ppm CuSO4 wird außerdem von der American Society of Brewing
Chemists empfohlen (Anonymus 1992).
86
4 Diskussion
Wie in Brauereien kann es auch in anderen Bereichen der Getränkeindustrie sinnvoll sein
nur die relevanten, obligaten Verderbniserreger (z. B. Zygosaccharomyces sp., Dekkera sp.
oder Saccharomyces sp.) oder einzelne Gruppen von Hefen (z. B. gärfähige Hefen) nachzuweisen. Eine solche Selektion kann über die Bedingungen der Flüssiganreicherung und die
dabei verwendeten Medien erfolgen. Das SSL-Verfahren verbessert z. B. den Nachweis von
osmophilen und gärfähigen Hefen in Rohstoffen und Konzentraten, indem zunächst eine
Flüssiganreicherung mit SSL-Bouillon für 36 bis 48 Stunden vorgenommen wird, die zur Verkürzung der Lag-Phase führt (Back 1999). Danach werden zwischen 2 und 5 ml der Flüssigkultur im Plattengussverfahren mit Orangenfruchtsaftagar ausgewertet. Das gesamte Verfahren dauert 4 bis 5 Tage und kann sehr geringe Keimzahlen nachweisen. Eine Verkürzung
der Detektionszeit um 2 bis 3 Tage, die zur Kultivierung im Orangenfruchtsaftagar nötig sind,
könnte durch die Verwendung der wesentlich schnelleren PCR erreicht werden.
Quantitative Aussagen über die Grundbelastung können nach einer Flüssiganreicherung
nicht gemacht werden. Da es sich hierbei um einen Spurennachweis handelt, ist jedoch die
Kenntnis der genauen Keimzahl zweitrangig. Der Nachweis solcher Spurenkontaminationen
kann je nach Probe und beteiligtem Mikroorganismus sehr relevant sein. In fruchtfleischhaltigen Säften kann z. B. schon eine Hefezelle pro 10 ml problematisch sein, bei klaren Säften
wird dagegen teilweise eine Hefezelle/ml toleriert (Weidenbörner 1998). Für einige Organismen wie z. B. Zygosaccharomyces sp. muss das Qualitätskontrollsystem so ausgelegt werden, dass im Endprodukt keine Zelle vorhanden ist, da auch ein sehr geringer Kontaminationslevel zu Problemen führt (van der Vossen und Hofstra 1996). Die entwickelte Real-Time
Consensus-PCR für Hefen in Kombination mit einer Flüssiganreicherung könnte für solche
Proben eine Aussage über die An- oder Abwesenheit dieser obligaten Schädlinge in 2 bis 3
Tagen liefern.
Die Experimente zur Ermittlung der Detektionszeit zeigten, dass die Anreicherungszeit für
langsam wachsende Hefen wie z. B. Brettanomyces sp. oder Schizosaccharomyces pombe
entsprechend verlängert werden muss. Falls diese Arten relevant für das Untersuchungsmaterial sind und deren Auftreten zu erwarten ist, muss dies entsprechend berücksichtigt werden. Außerdem sollte auch für geschädigte Zellen, die durch Methoden der Produktstabilisierung nicht vollständig abgetötet wurden, eine verlängerte Anreicherungszeit berücksichtigt
werden. Versuche, bei denen vor einer Anreicherung mit Hefezellen dotiert wurde, wurden
auch von García et al. (2004) durchgeführt. Die konventionelle PCR mit Nachweis der Amplifikate über Gelelektrophorese hatte ein Detektionslimit für K. marxianus in Milch von
105 KBE/ml. Dieses Detektionslimit konnte bei einer initialen Kontamination von 10 KBE/ml
nach 16 Stunden Anreicherung ohne zusätzliches Nährmedium erreicht werden.
87
4 Diskussion
Der Nachweis von Hefen über eine Flüssiganreicherung und anschließende Detektion über
PCR ist vergleichbar mit der direkten oder indirekten Messung der Leitfähigkeit. Der Detektionsgrenzwert liegt bei der indirekten Messung der Leitfähigkeit zwischen 104 und
105 Zellen/ml (Deák 1995). Wie bei der Messung der Leitfähigkeit könnte auch die Real-Time
Consensus-PCR für Hefen in Kombination mit einer Flüssiganreicherung über die Detektionszeit, die von Beginn der Inkubation verstreicht bis eine messbare Veränderung auftritt,
gegen eine konventionelle Zellzahlbestimmung kalibriert werden, um Aussagen über die
Ausgangspopulation machen zu können. Größere Ausgangspopulationen würden dementsprechend kürzere Detektionszeiten ergeben, die jedoch nicht unabhängig von den unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten der Hefearten sind.
Im Gegensatz zu dem Gesamtnachweis für Hefen konnten bei dem Einzelnachweis für S. c.
var. diastaticus die gesamten Vorteile der Real-Time PCR ausgenutzt werden, da das System zur sensitiven Detektion und spezifischen Identifikation genutzt werden kann. Ein Vorteil
der Real-Time PCR gegenüber anderen PCR-basierten, molekularbiologischen Methoden
liegt in der Bündelung der PCR und der Amplifikatdetektion in einem Schritt und der einfachen und objektiven Auswertung der Ergebnisse z. B. mit der LightCycler® Software 4. Besonders wenn sehr geringe Amplifikatmengen detektiert werden müssen, bietet ein numerischer Wert oder eine klare positive oder negative Aussage weniger Interpretationsmöglichkeiten als eine schwache Bande in einem Agarosegel. Damit wird diese Technik nicht nur zu
einer schnellen, sondern auch zu einer leicht handhabbaren Methode, wie durch die Testung
des S. c. var. diastaticus Nachweises bei vier Brauereien gezeigt wurde. Eine RFLP-PCR
von Yamagishi et al. (1999), mit der S. c. var. diastaticus von Brauhefen unterschieden wurde, bestand im Gegensatz dazu aus der PCR mit 5 S rDNA und 26 S rDNA spezifischen
Primern, einem anschließendem Restriktionsverdau und einer abschließenden Auftrennung
im Agarosegel. Neben dem Nachteil des höheren Arbeitsaufwandes besteht ein weiterer
Unterschied dahingehend, dass diese Methode nur zu Identifizierung von Reinkulturen verwendet werden kann. Die gleichen Nachteile und Einschränkungen gelten für einen RAPDPCR-Assay von Tompkins et al. (1996), der ebenfalls zur Unterscheidung von S. cerevisiae
var. diastaticus von Brauhefen geeignet war und auch zur Identifizierung von bierschädlichen
Bakterien diente. Gegenüber immunologischen Tests besitzt ein Nachweissystem über Nucleinsäuren den Vorteil, dass nicht erst eine phänotypische Expression der Zielantigene stattfinden muss. Sie sind demnach auch weniger abhängig von Wachstumsbedingungen und
äußeren Einflüssen.
88
4 Diskussion
Der wichtigste Maßstab für die Anwendbarkeit einer auf der Real-Time PCR-basierten Methode besteht jedoch im Vergleich mit den klassischen, mikrobiologischen Methoden. Die
Detektion von Fremdhefen wie S. c. var. diastaticus bereitet besonders durch ihre biochemische und physiologische Ähnlichkeit zu den Brauhefen Probleme (Jespersen und Jakobsen
1996), daher ist der Real-Time PCR-Nachweis über das entscheidende, genetische Identifikationsmerkmal von S. c. var. cerevisiae für die Anwendung sehr sinnvoll. Ein weiterer Vorteil des Real-Time LightCycler® Systems zum Nachweis von S. cerevisiae var. diastaticus
liegt in der Möglichkeit, geringe Zellzahlen bei einer großen Hintergrundpopulation an S. cerevisiae nachzuweisen. Mit dem System können zwischen 102 und 103 Zellen/ml S. c. var.
diastaticus bei einem Hintergrund von 108 Zellen/ml S. cerevisiae identifiziert werden, obwohl
die Zielsequenzen in anderer Konstellation auch in der Brauhefe S. cerevisiae vorliegen.
Diese Sensitivität entspricht der von Detektionssystemen im Bereich der Brauereien geforderten Nachweisempfindlichkeit von einem verderbniserregenden Organismus in 106 Kulturhefen (Jespersen und Jakobsen 1996). Das System ist demnach geeignet, um S. c. var. diastaticus in schwierigen Proben wie der Anstellhefe und anderen hefehaltigen Proben aus
dem gesamten Produktionsbereich nachzuweisen.
Der klassische Nachweis von S. c. var. diastaticus und anderen Saccharomyces Fremdhefen
kann über Kultivierung mit einer Reihe von unterschiedlichen Medien erfolgen, wobei die
Auswahl von der verwendeten Kulturhefe abhängt (Jespersen und Jakobsen 1996). Powell
und Smart (2003) verglichen drei unterschiedliche Medien (MYGP mit CuSO4, Lysin und
CLEN) mit zwei konventionellen PCR-Methoden (spezifische PCR und RAPD-PCR). Die
Ergebnisse zeigten, dass eine Kombination der drei Medien für den Nachweis von
103 Zellen/ml Fremdhefen in Kulturhefen geeignet war und die PCR-basierten Methoden
dagegen zur Identifizierung von Hefen geeignet waren. Bei der Verwendung von selektiven
Medien besteht jedoch immer die Gefahr, dass auch mögliche Fremdhefen, die sich in einem
physiologisch schlechten Zustand bedingt durch z. B. Hitzebehandlung befinden, ebenfalls
inhibiert werden und somit unentdeckt bleiben (Jespersen und Jakobsen 1996). Kultivierungsmethoden haben den Nachteil, dass aktive Prozesskontrollen und zeitnahe Qualitätskontrollen der Produkte schwierig sind, da Tage oder sogar Wochen vergehen bis mögliche
Kontaminationen erkannt werden. Die Anwendung einer schnellen Methode wie der RealTime PCR zum Nachweis von S. c. var. diastaticus kann hier dazu beitragen, dass Endprodukte schneller ausgeliefert werden können, da die Ergebnisse der Qualitätskontrolle schnell
vorliegen. Je schneller eine Methode zum Nachweis von verderbniserregenden Mikroorganismen ist, desto weniger Lagerzeit ist notwendig und somit reduziert sich auch die benötigte
Lagerfläche. Die Gesamtzeit, die für die DNA-Extraktion von 30 Proben mit der mecha-
89
4 Diskussion
nisch/thermischen Methode und die Durchführung der Real-Time PCR benötigt wird, beträgt
für den Einzelnachweis von S. c. var. diastaticus nur 2,5 Stunden.
Probleme bei der Anwendung von PCR-Methoden können durch falsch-positive Ergebnisse
entstehen, die durch Amplifikation von freier DNA oder DNA von toten Mikroorganismen,
deren Zellmembranen noch intakt sind, verursacht werden (van der Vossen und Hofstra
1996). Im Bereich der Getränkeindustrie ist nur der Nachweis von lebenden und damit potentiell schädlichen Mikroorganismen relevant. Für pathogene Bakterien wurde von einigen Autoren gezeigt, dass die DNA von abgetöteten Zellen noch viele Tage als Vorlage für die PCR
dienen konnte (Allmann et al. 1995, Josephson et al. 1993, Masters et al. 1994). Bleve et al.
(2003) konnte für S. cerevisiae zeigen, dass nach einer Abtötung der Zellen bei 60 °C für
20 min die DNA auch 24 Stunden später nach einer Inkubation bei 25 °C noch amplifiziert
werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurde keine undotierte Probe mit oder ohne Anreicherung falsch-positiv getestet. Die bei dem Consensus-System angewandte Voranreicherung könnte bei Untersuchungen von z. B. Säften, bei denen durchaus auch „non-viable“
Targetorganismen zu erwarten wären, die zwar nicht lebensfähig sind, deren DNA aber intakt ist, zur Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen genutzt werden. Rückstellproben, die kühl gelagert wurden, müssten dann bei positiven Ergebnissen ebenfalls getestet
werden, um das Ergebnis aufgrund von lebensfähigen Hefen als positiv zu verifizieren. Der
Nachweis von Organismen über mRNA als Target kann unter der Voraussetzung, dass die
ausgewählte RNA nach dem Tod der Zelle schnell abgebaut wird und eine essentielle Funktion für den Organismus hat, zur Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen eingesetzt werden. Die Anwendbarkeit dieser Methode für Hefen in Lebensmitteln wurde von einigen Autoren für unterschiedliche Targets wie z. B. EF-1α und Actin mRNA gezeigt (Bleve et
al. 2003, Vaitilingom et al. 1998). Die Komplexität der Real-Time Consensus-PCR für Hefen
verhinderte deren Umstellung zu einer RT-PCR, obwohl Versuche mit einem reduzierten
System die Nutzbarkeit der mRNA des EF-3 Proteins anzeigten. Die Daten zu diesem Experiment werden im Anhang im Kapitel 6.3 präsentiert.
Für die Anwendbarkeit in der Praxis stellen sich jedoch Fragen, die die Komplexität und damit die Handhabbarkeit der Methode betreffen. Ein zusätzlicher DNase-Verdau mit entsprechenden Kontrollen und möglicherweise einer getrennten Reversen Transkription könnten zu
einem erhöhten Arbeitsaufwand führen. Die Inaktivierung der DNase vor der RT-PCR und
die Vermeidung von Ribonucleasen sind ebenfalls kritische Punkte, die eine Anwendung als
Routineuntersuchung erschweren. Eine Behandlung von Proben, die für eine PCR verwendet werden sollen, mit DNase vor einer DNA-Extraktion könnte auch zur Eliminierung von
freier DNA und DNA von toten Zellen verwendet werden (Lyon 2001, Nogva et al. 2000).
90
4 Diskussion
Bleve et al. (2003) stellten außerdem nach der Hitzeinaktivierung von S. cerevisiae Zellen
ausgehend von einer hohen Zellzahl von 108 Zellen fest, dass die mRNA auch noch nach
24 Stunden Inkubation über RT-PCR nachzuweisen war, da ein Teil der Zellen in ein VBNCStadium übergegangen war.
Hefen können wie Bakterien ein so genanntes VBNC-Stadium (viable but nonculturable state) einnehmen, in dem die Zellen zwar metabolisch aktiv sind, aber keine Zellteilung zum
Wachstum in flüssigem oder festem Nährmedium durchführen (Oliver 1993). Ausgelöst wird
der Übergang in dieses Stadium durch Stressfaktoren wie z. B. Nährstoffmangel oder ungünstige Temperaturen, die neben der Veränderung der Zellmembranen zu einer Verkleinerung der Zellgröße führen (McDougald et al. 1998, Oliver et al. 1995). Divol und LonvaudFunel (2005) konnten den Übergang in ein VBNC-Stadium bei S. cerevisiae, C. stellata und
Z. bailii in durch Botrytis cinerea beeinflusstem Wein nach der Zugabe von SO2 beobachten,
während dessen keine Kultivierung auf festem Nährmedium möglich war. Nach Verdünnung
des Weins und der damit verbundenen Herabsetzung der Stressfaktoren SO2-Konzentration
und osmotischer Druck gelangten die Hefen wieder in ein kultivierbares Stadium. Die Detektion von Organismen, die sich in dem VBNC-Stadium befinden, kann besonders dann sinnvoll sein, wenn ein Produkt wie z. B. Wein zur Reifung lange gelagert wird. Das Phänomen
einer erneuten Fermentation von in Fässern reifendem oder abgefülltem Wein, in dem zum
Zeitpunkt der Einlagerung oder Abfüllung über Kultivierung keine Mikroorganismen nachzuweisen waren, könnte durch z. B Brettanomyces sp. im VBNC-Stadium verursacht werden.
Nur direkte Techniken, die keine Kultivierung benötigen, können zur Detektion von Hefen in
diesem Stadium angewandt werden. Neben Methoden wie der Durchflusszytometrie und der
DEF-Technik (direct epifluorescent filter technique) bietet auch die Real-Time PCR die Möglichkeit, diese Organismen nachzuweisen (Divol und Lonvaud-Funel 2005, Lowder et al.
2000).
91
4 Diskussion
4.4
Ausblick
Die entwickelten Real-Time PCR-Assays sind in ihrer jetzigen Form zusammen mit den Probenaufarbeitungsmethoden für den Einsatz in der Getränkeindustrie geeignet. Bei beiden
Systemen besteht das Potential, sie durch Einbeziehung weiterer Targetorganismen zu erweitern. Der Einzelnachweis für S. cerevisiae var. diastaticus könnte durch den gleichzeitigen Nachweis von weiteren obligat bierschädlichen Hefen wie z. B. S. bayanus, S. pastorianus und D. bruxellensis ergänzt werden. Der Gesamtnachweis für Hefen könnte nach Generierung von weiteren Sequenzen zu einem Nachweis für Hefen und Schimmelpilze ausgeweitet werden.
Der Erweiterung der Komplexität von Real-Time PCR-Assays sind jedoch durch die Anzahl
der einsetzbaren Fluoreszenzfarbstoffe Grenzen gesetzt, wenn eine größere Anzahl unterschiedlicher Arten oder Stämme gleichzeitig detektiert und identifiziert werden soll. Die Anwendung der Multiplex-PCR mit anschließender Detektion über Microarrays, die ein hohes
Potential zur Differenzierung bieten, wird in Zukunft sicher bei geeigneter Automatisierung für
solche Fragestellungen zum Einsatz kommen, um ausgehend von einem einzelnen Assay
sehr viele unterschiedliche Targets zu identifizieren. Die Menge an produzierten Daten wird
durch die Anwendung solcher immer umfangreicheren Identifizierungsmethoden ansteigen
und die Ansprüche an die Auswertungssysteme erhöhen. Jedoch wird auf Einzelnachweise
im Real-Time PCR Maßstab für sehr relevante Mikroorganismen, deren An- bzw. Abwesenheit in einer Probe getestet werden muss, nicht verzichtet werden, da die Sensitivität von
Multiplex-PCR-Systemen durch Konkurrenzreaktionen herabgesetzt wird.
Mit zunehmender Vollautomatisierung im Bereich der Probenaufarbeitung und der anschließenden Detektion wird auch die Möglichkeit der Online-Datenübertragung zwischen unterschiedlichen Produktionsstandorten und der Datenbündelung zur zentralen Auswertung
möglich.
92
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6 Anhang
6
Anhang
6.1
Getestete Mikroorganismen
Tab. 6.1:
Stämme für die Spezifitätstestung der Real-Time PCR für S. cerevisiae var.
diastaticus
Spezies
Candida boidinii
Candida magnoliae
Candida sake
Candida tropicalis
Cryptococcus albidus
Debaryomyces hansenii
Dekkera anomala
Dekkera anomala
Dekkera bruxellensis
Dekkera bruxellensis
Dekkera custersiana
E. coli
E. coli Serovar O157:H7
Hanseniaspora uvarum
Issatchenkia orientalis
Kazachstania unispora
Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces marxianus
Lactobacillus brevis
Lactobacillus casei
Lactobacillus collinoides
Lactobacillus coryniformis
Lactobacillus lindneri
Lactobacillus parabuchneri
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus perolens
Megasphaera cerevisiae
Pectinatus cerevisiiphilus
Pectinatus frisingensis
Pediococcus damnosus
Pediococcus inopinatus
Pediococcus parvulus
Pediococcus claussenii
Pediococcus pentosaceus
Pichia anomala
Pichia anomala
Pichia membranaefaciens
Rhodotorula sp.
Rhodotorula glutinis
Rhodotorula rubra
S. bayanus
S. bayanus
S. bayanus
S. carlsbergensis (=S. past.)
S. carlsbergensis (=S. past.)
S. carlsbergensis (=S. past.)
S. carlsbergensis (=S. past.)
S. carlsbergensis (=S. past.)
S. pastorianus
S. pastorianus
Stamm/Herkunft
DSM 70024
DSM 70638
CBS 2920
ATCC 20247
DSM 70197
BCD 3512
DSM 70727
DSM 70732
DSM 3429
DSM 70726
DSM 70736
DSM 30083
BCD 5579
ATCC 9774
CBS 5147
BCD 877
DSM 70106
BCD 5186
DSM 20054
DSM 20011
DSM 20515
DSM 20001
DSM 20690
DSM 5707
DSM 20174
DSM 12744
DSM 20462
DSM 20467
DSM 6306
DSM 20331
DSM 20285
DSM 20332
DSM 14800
DSM 20336
BCD 1082
DSM 70783
DSM 70178
ATCC 20254
BCD 3530
BCD 4081
BCD 1256
BCD 1392
DSM 70412
BCD 2573
BCD 2574
BCD 2581
ATCC 9080
BCD 728
NCYC 73
DSM 6580
Spezies
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. cerevisiae var. diastaticus
S. exiguus
S. exiguus
S. exiguus
S. kluyveri
Saccharomycopsis fibuligera
Schizosaccharomyces pombe
Torulaspora delbrueckii
Z. bailii
Z. bisporus
Z. cidri
Z. fermentati
Z. lentus
Z. rouxii
Z. rouxii
110
Stamm/Herkunft
ATCC 44075
CBS 6503
ATCC 12341
ATCC 18790
ATCC 28383
DSM 70452
DSM 1333
DSM 70416
Brauerei E
Brauerei D
BCD 1257
BCD 1432
BCD 1433
BCD 1499
BCD 1501
BCD 13974
BCD 13980
DSM 70487
VTT C-68059
VTT C-70060
VTT C-82101
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei A
Brauerei B
Brauerei B
Brauerei C
Brauerei C
Brauerei D
Brauerei D
Brauerei D
Brauerei E
BCD 1491
BCD 1493
MUCL 29838
DSM 70517
ATCC 9947
BCD 773
CBS 5636
MUCL 28823
DSM 70415
MUCL 31280
MUCL 27824
CBS 8516
DSM 70835
ATCC 48230
6 Anhang
6.2
Sequenzauswertung
Abb. 6.1: Alignment der Nucleinsäuresequenzen des EF-3 Sequenzabschnitts (Position 2272-2637) mit Angabe der Primerpositionen.
HS10
HS11/I-IV
Ha1f-5f
Yfa1-2,Yfs1
Ca AF038153
Ca ATCC 10231
Cb DSM 70034
Cc DSM 70136
Cd DSM 70042
Ce DSM70858
Cg BCD 8932
Cglae CBS 5691
Ch DSM 70624
Cim BCD 1062
Cint BCD 685
Ck BCD 689
Cll DSM 70102
Cm DSM 70638
Cmal AB018532
Cmal BCD 806
Cmel AB018533
Cmu DSM 70862
Cp ATCC 20384
Cr BCD 814
Cs BCD 1054
Csan CBS 4261
Cso BCD 818
Ct BCD 819
Ctr ATCC 20326
Cv DSM 6956
Cvi DSM 70184
Cz AB018534
Cz BCD 690
De ATCC 20126
Dekb DSM 3429
Dekb DSM 70726
Dekc DSM 70736
Dh BCD 3512
Dh BCD 589
Dm ATCC 11627
Ef BCD 3514
Ef DSM 70554
Gs DSM 3431
Hb BCD 859
Hb DSM 3505
Hg DSM 70285
Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
Hv DSM 70283
Io CBS 5147
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Km BCD 811
Km DSM 70106
Km DSM 70792
Ku BCD 877
Le DSM 70320
Lt CBS 6340
Mp DSM 70321
Pa DSM 70277
Pan BCD 1082
Pan DSM 70783
Pc CBS 601
Pcar DSM 70392
Pf BCD 861
Pfe BCD 711
Pfe DSM 70090
Pg BCD 804
Pm DSM 70178
1
10
20
30
40
50
60
70
75
|--------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|----||-------------------|
|--------------------|
|-----------------------|
|-------------------|
TGGAGATTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCCTCTAGACAAATCAATGAAGAAGATGAACAAA
TGGAGGTTCCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTTCTAGACAAATCAATGAAGAAGATGAACAAA
TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATCGTGAAACTATGGGTAGGGCTTCTAGACAAATTAACGAAAATGATGAAGAAG
TGGAGGTTCCAGACTGGTGAGGACAGAGAAACCATGGACCGTGCTTCCAGACAGGTTACCGAGGAAGACGAGAACA
TGGAGGTACCAAACTGGTGAAGATCGAGAGACTATGGATCGAGCCAATCGACAGATCGATGAAAATGATGAGGAAG
--------------------AGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCAAGACAAATCAATGAAAATGATGAAGAAA
TGGAGGTACCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAGATGATGAAGCTG
TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCCAACAGACAAGTTACTGAAAAGGATGAAGAAA
TGGCGGTACCACACTGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCAACAGACAGATCAACGAAGCTGATGAGAACG
TGGCGGTACCAGACCGGTGAGGATCGTGAAACCATGGACCGTGCCTCTCGTCAAATCAACGAGGACGATGAAACCT
TGGAGGTTCCATACCGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCAACAGACAGATTAACGAGGACGATGAGAACG
TGGAGGTACCAGACCGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAGAGCGATGAGAACG
TGGCGGTTCCAGACCGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCAACAGACAAATCAACGAGGATGACGAGAACG
--------------------GATATGAGAGACCATGGACCGTGCTAGCCGCCAGATCGACGAGAACGACGAGCAGG
TGGAGATTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAGAAGATGAACAAA
TGGCGGTTCCAATCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGATTCCACACTGGTGAAGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCTCTAGACAAATCAACGAGAGTGATGAGAACG
TGGCGGTACCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTTCAAGACAAATTAACGAACAAGATGAACAAT
TGGAGGTTCCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATTAACGAAGAAGATGAACAAA
TGGCGGTACCAGTCTGGTGAGGACCGTGAGACCATGGACCGTGCCAACCGTCAGATCGATGAGAACGATGAGGCTG
TGGCGGTACCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAAACGATGAAAACG
TGGAGGTTCCACACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATTAACGAAAACGATGAAAACG
TGGAGGTACCAATTCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGTTCGTGCTTCAAGACAAATTAATGAAAATGATGAAGAAG
TGGCGGTTCCACACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAGATCAACGAAGATGATGAAAAGG
TGGAGGTTCCACACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAGAAGATGAACAAA
TGGCGGTTCCAGTCTGGTGAGGACCGTGAGACTATGGACCGTGCCAACCGTCAAATCGATGAGAATGACGAGAAGG
TGGCGATACCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATAGAGCTTCTAGACAAATTAACGAAAATGATGAACAGG
TGGAGATTCCACACTGGTGAAGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCTCTAGACAAATCAACGAGAGTGACGAGAACG
TGGAGGTTCCACACTGGTGAAGACAGAGAGACAATGGACAGAGCCTCTAGACAAATCAACGAGAGTGACGAGAACG
TGGAGGTACCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATAGAGCATCTAGACAAATCAACGAAGATGATGAGAATG
TGGAGGTACCAATCCGGTGAAGATCGTGAGACTATGGACCGTGCTAACAGGAAGATTAACGAAGAGGACAAGCAGG
TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATCGTGAGACTATGGACCGTGCTAACAGGAAGATTAACGAAGAGGACAAGCAGG
TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATCGTGAAACCATGGACCGTGCCAACAGAAAGATCAATGAATCTGATAAGCAGG
TGGAGGTACCAATCTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCCTCCAGACAAATCAACGAAGATGATGAAACTT
TGGAGGTACCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCCTCCAGACAAATCAACGAAGATGATGAAACTT
TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAGATGATGAAACTT
TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTTCTAGACAAGTTAACGAACAAGATGAAAACT
TGGAGGTACCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAATGAAAGTGATGAAGAAG
TGGAGGTTCCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCTTCCAGACAAATCAACGAAAATGATGAACAAG
TGGCGGTACCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCCAGACAAGTTAACGAACAAGATGAAAACT
TGGCGGTACCAATCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTTCTAGACAAGTTAACGAACAAGATGAAAACT
TGGCGGTTCCATTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAGATGATGAAGCTG
TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAGATGATGAAGCTG
-GAAGGTTCCATTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAGATGATGAAGCTG
TGGAGGTTCCACACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCCAACAGACAAATCAACGAAGATGATGCTCAAG
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATAGAGCTTCCAGACAAATCAACGAAAACGATGAACAAG
TGGAGATTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAGATGATGCTGAAG
TGGCGGTTCCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTACCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGGGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGCGGTTCCATACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTACCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTAACAGACAAATTAATGAAAATGATGCTGAAG
TGGCGGTTCCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCAAGACAAATCAACGAGGCTGATGAGCAAA
TGGAGGTTCCAGTCTGGTGAAGACAGAGAGACCATGGACAGAGCCAACAGAGTCATCAACGAGGAGGATGCTGAGT
TGGCGGTTCCAGTCTGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCTAACAGAGTCATCAACGAGGGCGATGAGAATG
TGGAGGTACCAAACCGGTGAAGACAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAGAACGATGAGCAGG
TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATCGTGCTTCAAGACAAATTAATGAAAATGATGAAGAAG
TGGCGGTTCCACACTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGATCGTGCTTCAAGACAAATTAATGAAAATGATGAAGAAG
TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATCGTGCTTCCAGACAAATCAATGAAAATGATGAACAAG
TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCATCTAGACAAATCAACGAAGATGATCAAAAAG
TGGCGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAGACTATGGATAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAGGAGGACGAGAGTG
TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAAAACGATGAAGAAG
TGGAGGTTCCAATCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCCAGACAAATTAACGAAAACGATGAACAAG
TGGAGGTACCAGACTGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCTTCTAGACAAATCAACGAGAGCGATGAGAACG
TGGAGGTTCCACTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTTCCAGACAAATCAACGAAAATGATGAAGAAG
111
6 Anhang
Po BCD 862
Pp AB018536
Sb BCD 1256
Sb BCD 1392
Sb DSM 70412
Sc AB018539
Sc DSM 1333
Sd BCD 1257
Sd DSM 70487
Se MUCL 29838
Sp DSM 6580
Sp BCD 728
Td DSM 70607
Yl AB018537
Yl BCD 2003
Yl BCD 2556
Zb BCD 1424
Zbi DSM 70415
Zf DSM 70506
Zm DSM 6959
Zr ATCC 48230
Scho DSM 70573
Schp AB018538
Schp BCD 773
HS12/IV-IX
Hb1f-5f
Hb6f
Hb7f
Bd DSM 70745
Cra DSM 70197
Crc BCD 2578
Crc DSM 70022
Crf BCD 823
Crh DSM 70067
Crl BCD 824
Fn AF316889
Rg BCD 3530
Rm DSM 70408
Spj BCD 4982
Spj BCD 778
Spj DSM 70847
Trc DSM 70684
TGGAGGTTCCAGACTGGTGAGGACAGAGGGACCATGGACAGAGCTTCCAGACAGGTCACCGAGGAGGACGAGCAGA
TGGAGATTCCAAACCGGTGAGGACCGTGAGACCATGGACCGTGCATCTAGACAAATCAACGAGAACGATGAGGAGG
TGGAGGTTCCAAACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATTAACGAAGACGATGCTCAAG
TGGCGGTTCCATACCGGTGAAGACAGAAAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAGATGATGCTGAAG
TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATTAACGAAGACGATGCTCAAG
TGGAGATTCCAAACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTTCCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAATGATGCTGAAG
TGGCGGTACCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTTCCAGTCCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAAGATAGAGAAACCATGGATAGAGCTAATAGGCAAATAAATGAAAATGATGCGGAAG
TGGAGGTACCAGTCTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATTAATGAAGACGATGCTCAAG
TGGAGGTACCAGACCGGTGAAGACAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGAGTTATCAACGAAGATGATGCTGAAG
TGGCGATTCCAGACCGGTGAGGATCGAGAGACCATGGACCGAGCCAACCGACAGATCACCGACTCCGATGAGGCTG
TGGCGGTACCAGACTGGTGAAGATCGAGAGACTATGGATCGAGCCAATCGACAGATCGATGAAAATGATGAGGAAG
TGGCGGTACCAGACCGGTGAGGATCGAGAGACCATGGACCGAGCCAACCGACAGATCACCGACTCCGATGAGGCTG
TGGCGGTACCAGACCGGTGAGGACAGAGAGACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAGAGTGATGAGCGGG
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAAGACAGAGAAACCATGGATAGAGCTAACAGACAGATTAATGAGAGTGACGAACAGG
TGGCGGTTCCAGTCTGGTGAAGACAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATCAACGAAAACGATGCTGAAG
TGGAGGTTCCATACTGGTGAAGATAGAGAAACTATGGACAGAGCCAACAGACAAATCAACGAAGATGATGCTCAAG
TGGAGGTTCCAGACTGGTGAAGATAGAGAAACCATGGACAGAGCTAACAGACAAATTAACGAAGATGATGCTCAAG
TGGCGGTTCCACTCTGGTGAAGATTTGGAAGCTATGGACAAGGCCTCTCGTGTCATTAACGAAGCTGATGAGGAAG
TGGCGTTTCCAATCTGGTGAAGATTTGGAGGCTATGGATAAGGCTTCTCGTGTCATCAGCGAGGCTGATGAGGAGG
TGGCGGTACCACACTGGTGAAGATTTGGAGGCTATGGATAAGGCTTCTCGTGTCATCAGCGAGGCTGATGAGGAGG
|--------------------|
|-------------------|----------------------|
|------------------|
TGGCGATACCAAACCGGTGAAGATTTGGAAGAAATGAACAAAGCTACCCGAGTCATGACCGAAGAAGAGAAACAAA
TGGCGATACCAGACCGGTGAGGATTTGGAGGAACTGCAAAAGGCGAACCGACAGTTGACCGAGGAAGAGATGCAAA
TGGCGGTTCCATACCGGTGAGGACATTGAGGAGCTCTCCAAGGCCAACCGTGTCCTCTCCGAGGAGGAGAAGAAGA
TGGCGATACCAGACGGGTGAGGACCTCGAGGAGCTCAACAAGGCCAACCGTGTCATGTCCGAGGAGGAGAAGAAGA
TGGCGATACCAGACCGGTGAGGATCTCGAGGAGATGCACAAGGCCAACCGAGTCATGACCGAGGAGGAGAAGAAGA
TGGCGATACCAGACCGGTGAGGACCTCGAGGAGGTGAACAAGGCCACCCGTGTCATGACCGAGGAGGAGAAGAAGA
TGGCGATACCAGACTGGTGAGGATCTTGAGGAACTACACAAGGCCAACCGAACCATGTCTGCCGAGGAAGAGGCCA
TGGCGATACCAGACCGGTGAGGACTTGGAGGAAATGCACAAGGCTAACCGGGTCATGACCGAGGCCGAGCTTGCCA
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGGACATTGAGGAGCTCGCCAAGGCCAACCGCAAGCTCAGCGAGGAGGAGGAGAAGA
TGGAGATACCAGACCGGTGAGGATCTCGAGGAGCTCAACAAGGAAGGCCGACAGATCACCGATGCCGAAAAGGAGA
TGGCGATAC-AGACTGGTGAGGACCTCGAAGAGCTCGCGAAGGCCAACCGCACCCTCTCTGAGGAGGAGGAGAAGA
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGGACATTGAGGAGCTCCACAAGGCCAACCGTGTCCTGTCCGAGGAGGAGGAGAAGA
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGGACATTGAGGAGCTCCACAAGGCCAACCGTGTCCTGTCCGAGGAGGAGGAGAAGA
TGGAGGTTCCAGACCGGTGAGGACCTCGAGGAGCTGAACAAGGCTACTCGTGTCCTTACCGAGGAGGAGAAGAAGA
77 80
| |
Yff1-4,6,8
Ca AF038153
Ca ATCC 10231
Cb DSM 70034
Cc DSM 70136
Cd DSM 70042
Ce DSM70858
Cg BCD 8932
Cglae CBS 5691
Ch DSM 70624
Cim BCD 1062
Cint BCD 685
Ck BCD 689
Cll DSM 70102
Cm DSM 70638
Cmal AB018532
Cmal BCD 806
Cmel AB018533
Cmu DSM 70862
Cp ATCC 20384
Cr BCD 814
Cs BCD1054
Csan CBS 4261
Cso BCD 818
Ct BCD 819
Ctr ATCC 20326
Cv DSM 6956
Cvi DSM 70184
Cz AB018534
Cz BCD 690
De ATCC 20126
Dekb DSM 3429
90
|
100
|
110
|
130
140
150
|
|
|
|-----------------------------ACATGAA------CAAGATTTTCAAAATTGAAGGTACACCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT
ACATGAA------CAAGATTTTCAAAATTGAAGGTACACCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT
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ACATGAA------CAAGATCTTCAAGGTTGAGGGTTCCGAGCGTAGAATTGCCGGTACCCACGCCAGAAGAAAGTT
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GTATGAA------GAAGATTTTCGAAATTGAAAACACTCCAAGAAGAGTTCAAGAAATCCATGCCAGAAGAAAATT
ACATGAA------CAAGGTTTTCAAGATCGAAGGTACTCCAAGAAGAGTCCAAGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGGTCGAGGGTACCCCAAGAAGAGTTGCTGGTGTCCACTCTAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAAATCTTCAAGATTGAGGGTACCCCAAGAAGAATTCAAGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAGGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCAAGAAGAGTTGCTGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGGTAGAAGAAAGTT
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ACATGAA------CAAAATCTTCAAAGTTGAAGGTACTCCAAGAAGAGTTGCTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT
CTGTGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACTCCCAGAAGAATCCAAGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCTCAGTTGAAGGATCACCAAGAAAGATTGCTGGTATTCACTCTAGAAGAAAATT
ATATGAA------CAAGATTTTCAAGATTGAAGGTACCCCAAGAAGAGTTGTTGGTATCCATTCTAGAAGAAAGTT
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CTATGAA------CAAGATTTTCAAGGTTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCCAAGGTATCCATGCTAGAAGAAAGTT
GTATGAA------GAAAATCTTCAAAATTGAAGGTACTCCAAGACGTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGGAAATT
GAATGGA------AAAGATCTTCAAGATTGAAGGTTCTCCAAGAAGAGTTGCTGGCATTCACGCTAGAAGAAAATT
ACATGAA------CAAGATCTTCAAAGTTGAAGGTACACCAAGAAGAGTTGCTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTACAAGATCGAAGGTACTGAGCGTCGTGTGCAAGGTGTTCACTCTCGCCGGAAGTT
CTATGAA------CAAAATTTTCAAGATTGAAGGCACTCCAAGAAGAATTCAAGGTATTCATTCTAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACTCCCAGAAGAATCCAAGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATTTTCAAGATCGAGGGTACTCCCAGAAGAATTCAAGGTATTCACGCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAAATCTTCAAGATTGAGGGTACCCCAAGAAGAGTCGCTGGTATCCATGCCAGAAGAAAGTT
GTATGAA------CAAGATTTTCCACATTGAAGGTACCTCAAGGAGAATTGCCGGTATCCACTCTAGAAGAAAGTT
112
120
|
6 Anhang
Dekb DSM 70726
Dekc DSM 70736
Dh BCD 3512
Dh BCD 589
Dm ATCC 11627
Ef BCD 3514
Ef DSM 70554
Gs DSM 3431
Hb BCD 859
Hb DSM 3505
Hg DSM 70285
Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
Hv DSM 70283
Io CBS 5147
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Km BCD 811
Km DSM 70106
Km DSM 70792
Ku BCD 877
Le DSM 70320
Lt CBS 6340
Mp DSM 70321
Pa DSM 70277
Pan BCD 1082
Pan DSM 70783
Pc CBS 601
Pcar DSM 70392
Pf BCD 861
Pfe BCD 711
Pfe DSM 70090
Pg BCD 804
Pm DSM 70178
Po BCD 862
Pp AB018536
Sb BCD 1256
Sb BCD 1392
Sb DSM 70412
Sc AB018539
Sc DSM 1333
Sd BCD 1257
Sd DSM 70487
Se MUCL 29838
Sp DSM 6580
Sp BCD 728
Td DSM 70607
Yl AB018537
Yl BCD 2003
Yl BCD 2556
Zb BCD 1424
Zbi DSM 70415
Zf DSM 70506
Zm DSM 6959
Zr ATCC 48230
Scho DSM 70573
Schp AB018538
Schp BCD 773
Hb1f-5f
Yff5
Bd DSM70745
Cra DSM70197
Crc BCD 2578
Crc DSM 70022
Crf BCD 823
Crh DSM 70067
Crl BCD 824
Fn AF316889
Rg BCD 3530
Rm DSM 70408
Spj BCD 4982
Spj BCD 778
Spj DSM 70847
Trc DSM 70684
GTATGAA------CAAGATTTTCCACATTGAAGGTACTTCAAGGAGAATTGCCGGTATCCACTCTAGAAGAAAGTT
GTATGAA------TAAGATTTTCCATATTGAAGGTACTCCAAGAAGGATTGCTTCTATCAACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------AAAGATTTTCAATGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAATTGCCGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT
GTATGAA------GAAACTTTTCAAGGTTGAAGGTACCGCTAGAAGAATTAAGGAAATCTTGGCTAGAAGAAAGTT
GTATGAA------GAAGATCTTCAAGGTTGATTCTACTACCAGAAGAGTTAAAGAAATTTAGCCCAGAAGAAAATT
CTATGAA------GAAGATTTTCACTGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------AAAGATTTTCAATGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAATTGCCGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT
GTATGAA------GAAGATCTTCGAAATTGAAAACACTCCAAGAAGAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATT
GTATGAA------GAAGATCTTTGAAATTGAAAACACTCCAAGAAGAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATT
GTATGAA------GAAGATCTTCGAAATTGAAAACACTCCAAGAAGAATTCAAGAAATTCACGCTAGAAGAAAATT
GTATGCA------AAAAATTTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCAACGAAATTTTGGCCAGAAGAAAATT
CTATGAA------CAAGATTTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCAGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGACGGTACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAGTCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAGGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT
TTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTCAAGAAATTTTAGCTAGAAGAAAGTT
ACATGAA------CAAGATCTTCAAGGTTGAAGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACGCAAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACCCCAAGAAGAATTCAGGGCATCCACGCCAGAAGAAAGTT
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CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGATGGTACCCCAAGAAGAATTCAAGGTATTCACGCTAGACGGAAGTT
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GTATGAA------GAAAATCTTCAAAATTGAAGGTACTCCAAGACGTATTCATGAAATTCATGCTAGAAGAAAATT
CTATGAA------CAAAATTTTCAAGATTGAAGGTACCCCAAGACGTATTGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAATT
ATATGAA------TAAGATTTTCAAGGTTGAGGGTACCGAAAGAAGAATTGCCGGAATTCATGCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTATAAGATCGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCAGGTATTCACGCTAGACGGAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAGGATTGAAGGTTCTCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCAAGAAGAGTTGCTGGTATTCACGCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTATAAGATCGAAGGTACCCCAAGAAGAATTAATGGTATTCACGCTAGACGGAAGTT
ACATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAGGGTACCCCAAGAAGAGTTGTTGGTATCCACGCCAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGAGATTCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACTCCAAGAAGAATCCAAGAGATTCACGCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACCCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGAAGGTACCCCTAGAAGAATTGCCGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CCATGAA------CAAAATCTTCAAAATCGAAGGAACTCCACGAAGGATTGCAGGAGTTCACTCAAGAAGAAAATT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGAAGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGGAGGTACTCCAAGAAGAATCCAAGAGATTCACGCCAGAAGAAAGTT
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CCATGAA------CAAGATATATAAGATTGGAGGCACTCAGCGACGTGTGGCCGGTGTTCATGCTCGAAGGAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTGCAAGATCGAGGGCGCCCCCCGACGAGTTGCTGGTGTTCACGCCCGACGAAAGTT
CCATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACTCCAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGACGGTACTCCAAGAAGAATCGCTGGTATCCACTCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATTGACGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACGCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAAATCTTCAAGATTGAAGGTACTCCAAGAAGAATTGCTGGTATTCACTCTAGAAGAAAGTT
CTATGAA------CAAGATCTTCAAGATCGATGGTACCCCAAGAAGAATTGCTGGTATCCACTCCAGAAGAAAGTT
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CTATGAAGAA---CAAGATCTTCAAGATTGAGGGAACTCAACGTAAGATTTTGGGTATCCACAGCCGTCGTAAGCT
----|
|------------------------AGATGAAGGAAGGTGCCGTCGTTGTCAAAGAAGGTGTCAAACGATTGATAGACGAACTTGTTGCCAGAAAGAAATT
AGATGAAGGAAGGAGGCAACGTCATCATTGAAGGTGCCAAGCGAGTCATTGACGAACTTGTCGCCCGAAAGAAGCT
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113
6 Anhang
Yff1-4,6,8
Yfr1-4,8
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Cmal BCD 806
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Cs BCD1054
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Cso BCD 818
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Cz AB018534
Cz BCD 690
De ATCC 20126
Dekb DSM 3429
Dekb DSM 70726
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Dh BCD 3512
Dh BCD 589
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Ef BCD 3514
Ef DSM 70554
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Hb DSM 3505
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Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
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Io CBS 5147
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Km BCD 811
Km DSM 70106
Km DSM 70792
Ku BCD 877
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Pa DSM 70277
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Pan DSM 70783
Pc CBS 601
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Pfe BCD 711
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Pm DSM 70178
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Sb BCD 1392
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Sc AB018539
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153
160
170
180
190
200
210
220
228
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------|
|------------------------------------|
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CAAAAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCACTTTAGGTGAAAACATTGGTATGAAGAATGGAAGATGGGTTCCA
TAAAAACTCTTACGAATATGAAATCTCCTGGATGTTGGGAGAAAACATTGGTATGAAGAATGAAAGATGGGTTGCA
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CAAGAACACCTACGAATATGGATGTTCTTTCCTTTTGGGTGACAACATCGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCT
CAAGAACTCTTACGAGTACGAATGTTCTTGGCTCTTGGGTGAGAACATTGGCATGAAGAACGAGAGATGGGTTCCT
CAAGAACACTTACGAGTATGAATGTTCTTTCTTCTTAGGTGAAAACATTGGTATGAAGTCTGAAAGATGGGTTCCA
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114
6 Anhang
Sd DSM 70487
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Sp BCD 728
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Yl AB018537
Yl BCD 2003
Yl BCD 2556
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Zr ATCC 48230
Scho DSM 70573
Schp AB018538
Schp BCD 773
Yff5
Yfr5,7
Bd DSM70745
Cra DSM70197
Crc BCD 2578
Crc DSM 70022
Crf BCD 823
Crh DSM 70067
Crl BCD 824
Fn AF316889
Rg BCD 3530
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CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA
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CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCATGTTGGGTGAAAACATTGGTATGAAATCTGAAAGATGGGTTCCA
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CAAGAACTCTTATGAATACGAATGTTCATTCTTGCTTGGTGAAAACCTTGGCATGAAATCTGAGCGATGGATTCAA
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CAAGAACACTTACGAGTACGAATGTTCCTTCTTGCTAGGTGAGAACATCGGTATGAAATCCGAGAGATGGGTTCCA
CAAGAACACTTACGAATATGAATGTTCTTTCTTATTAGGTGAAAACATCGGCATGAAATCAGAAAGATGGGTTCCA
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TAAGAACTCTTACGAGTATGAATGTTCTTTCACTGTTGGTGAGAACATTGGTATGAAGAGTGAACGCTGGGTTCCC
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--------|
|-----------------------GAAGCAATCGTACGAGTACGAAGTTTCATTC------------------------------AA-----AGGT---CAAGCAGTCGTACGAGTACGAAATCTCGTTC------------------------------AA-----GGGC---CAAGCAGTCTTACGAGTACGAGGTCTCGTTC------------------------------AA-----GGGC---CAAGCAGTCGTACGAGTACGAGGTGTCCTTC------------------------------AA-----GGGC---GAAGCAATCTTACGAGTACGAGGTTTCGTTC------------------------------AA-----GGGA---GAAGCAGTCTTACGAGTACGAGGTCTCGTTC------------------------------AA-----GGGC---CAAGCAGTCTTACGAATACGAAATCTCTTTC------------------------------AA-----GGGT---CAAGCAGTCCTACGAGTACGAGGTATCCTTC------------------------------AA-----GGGT---CAAGCAGTCGTTCGAGTACGAGGTCACCTTC------------------------------AA-----GGGC---GAAGCAATCTTACGAGTACGAGCTATCCTTC------------------------------AA-----GGCT---CAAGCAGTCGTTCGAGTACGAGGTCTCGTTC------------------------------AA-----GGGT---CAAGCAGTCGTTCGAGTACGAGACTACCTTC------------------------------AA-----GGGT---CAAGCAGTCGTTCGAGTACGAGACTACCTTC------------------------------AA-----GGGT---CAAGCAGTCTTACGAGTACGAGGTTTCGTTC------------------------------AA-----GGGC----
Ca AF038153
Ca ATCC 10231
Cb DSM 70034
Cc DSM 70136
Cd DSM 70042
Ce DSM70858
Cg BCD 8932
Cglae CBS 5691
Ch DSM 70624
Cim BCD 1062
Cint BCD 685
Ck BCD 689
Cll DSM 70102
Cm DSM 70638
Cmal AB018532
Cmal BCD 806
Cmel AB018533
Cmu DSM 70862
Cp ATCC 20384
Cr BCD 814
Cs BCD1054
Csan CBS 4261
Cso BCD 818
Ct BCD 819
Ctr ATCC 20326
Cv DSM 6956
Cvi DSM 70184
Cz AB018534
Cz BCD 690
De ATCC 20126
Dekb DSM 3429
Dekb DSM 70726
Dekc DSM 70736
Dh BCD 3512
Dh BCD 589
Dm ATCC 11627
Ef BCD 3514
Ef DSM 70554
Gs DSM 3431
Hb BCD 859
Hb DSM 3505
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229
240
250
260
270
280
290
300 304
|----------|---------|---------|---------|---------|---------|---------|---|
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ATGATGTCTGCTGATAACACATGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTTGAAACTCACTCC---AAGATGGTTAGTGAAG
ATGTCTTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAAGTGAATTAGTTGAATCTCATGCT---AAGTTGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTCGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACCCACGCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACACCTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATCGAGACTCACTCC---AAGTTGGTCGCTGAGG
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ATGATGTCCGTCGACAACACTTGGTTGCCAAGAAGTGAGTTGATGGAGACCCACTCC---AAGTTGGTTGCTGAGG
ATGATGTCAGTTGACAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACACCTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACTCATGCT---AAATTGGTTGCTGAAG
ATGTCCTCTGTCGACAACGCATGGATTCCTCGTTCTGAGCTTGTTGAGTCTCATGCC---AAGCTGGTTGCTGTGG
ATGATGTCTGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTAATGGAAACCCACTCT---AAGTTGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCT---AAGTTAGTCGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCATTCC---AAATTGGTTGCTGAAG
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ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAAATCATGGAAACTCACTCC---AAGTTAGTCGCCGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAAATCATGGAAACTCACTCC---AAGTTAGTCGCCGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAAATTATGGAATCTCACTCC---AAGTTGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATGACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCCGTCGACAACACCTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTTGAAACTCACTCT---AAATTAGTCGCCGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTAATGGAAACTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACACTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAATGGAAGCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGTCCTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAAGTGAATTAGTTGACTCCCACTCT---AAGTTAGTTGCTGAAG
115
6 Anhang
Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
Hv DSM 70283
Io CBS 5147
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Km BCD 811
Km DSM 70106
Km DSM 70792
Ku BCD 877
Le DSM 70320
Lt CBS 6340
Mp DSM 70321
Pa DSM 70277
Pan BCD 1082
Pan DSM 70783
Pc CBS 601
Pcar DSM 70392
Pf BCD 861
Pfe BCD 711
Pfe DSM 70090
Pg BCD 804
Pm DSM 70178
Po BCD 862
Pp AB018536
Sb BCD 1256
Sb BCD 1392
Sb DSM 70412
Sc AB018539
Sc DSM 1333
Sd BCD 1257
Sd DSM 70487
Se MUCL 29838
Sp DSM 6580
Sp BCD 728
Td DSM 70607
Yl AB018537
Yl BCD 2003
Yl BCD 2556
Zb BCD 1424
Zbi DSM 70415
Zf DSM 70506
Zm DSM 6959
Zr ATCC 48230
Scho DSM 70573
Schp AB018538
Schp BCD 773
HS14/III-VIII
Hb1r-3r
HT5r-6r
Yfr5,7
Bd DSM70745
Cra DSM70197
Crc BCD 2578
Crc DSM 70022
Crf BCD 823
Crh DSM 70067
Crl BCD 824
Fn AF316889
Rg BCD 3530
Rm DSM 70408
Spj BCD 4982
Spj BCD 778
Spj DSM 70847
Trc DSM 70684
ATGTCTTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAAGTGAATTAGTTGACTCCCACTCT---AAGTTAGTTGCTGAAG
ATGTCCTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAAGTGAATTAGTTGACTCCCACTCT---AAGTTAGTTGCTGAAG
ATGTCCTCTGTTGACAACGCCTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCACTCC---AAACTGGTTGCTGAAG
ATGTTATCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGGTCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAATGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTAGTTGAATCTCATTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCCGTTGACAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAGACTCATGCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCCGTTGACAACGCCTGGATTCCAAGAGGTGAGTTGGTCGAGTCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAGG
ATGATGTCCGTTGACAACGCCTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATCGAGTCTCACGGT---AAGATGGTCGCCGAGG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGCTCATTGAATCCCACGCT---AAGATGGTTGCTGAGG
ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCATTCC---AAATTGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAAACTCATTCC---AAATTGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAGTGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCATTCT---AAATTGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACACTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAAACCCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCCGTTGACAACGCCTGGTTGCCAAGAGGTGAGCTTATGGCAAGTCACGCC---AAGATGGTCTCTGAAG
ATGTTGTCTGTCGATAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATTGAATCCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGTTATCCGTCGACAATGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGATGGAGACCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAGG
ATGTTGTCTGTTGATAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAAGTGATTGAATCCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACACCTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGATGGAGACCCACGCC---AAGATGGTTGCCGAGA
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGAGAGTTGGTAGAGTCCCACTCC---AAGATGGTTGCTGAGG
ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCCCACTCC---AAGATGGTCGCTGAAG
ATGATGTCTGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAGTCTCACGCC---AAGATGGTCGCTGAAG
ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCCCACTCC---AAGATGGTCGCTGAAG
ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGATAACGCTTGGCTACCAAGAGGCGAACTAATTGAATCGCACACT---AAACTCGTTGCAGAAG
ATGATGTCCGTCAACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCC---AAGATGGTCGCTGAAG
ATGATGTCCGTCGACAACGCTTGGATTCCAAGAGGTGAATTGGTTGAATCTCACGCC---AAGATGGTCGCTGAAG
ATGGGCTCCGTCGACAACGCCTGGATCCCCCGATCCGAGCTCATGGAGTCTCACTCC---AAGCAGGTTGCCGAGG
ATGTCCTCTGTTGACAATGCATGGATTTCGCGATCTGAGTTGGTTGAATCTCACGCC---AAGTTGGTTGCTGAGG
ATGGGTTCCGTCGACAACGCCTGGATCCCCCGATCCGAGCTCATGGAGTCCCACTCC---AAGCTGGTTGCTGAGG
ATGATGTCTGTGGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAATTGGCCGAATCTCACTCT---AAGATGGTTGCCGAGG
ATGATGTCGGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAGTTGGCCGAGTCCCACTCT---AAGATGGTCGCCGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTGGTCGAATCTCACTCC---AAATTGGTGGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAATGCTTGGTTACCAAGAGGTGAATTAGTCGAATCTCACGCT---AAAATGGTCGCTGAAG
ATGATGTCTGTTGACAACGCTTGGTTGCCAAGAGGTGAAGTTATTGAATCTCACGGT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTTCCGACAACGCTTGGTTGCCTCGTGGTGAGCTTATGGAAAGCCACGCC---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTTCCGACAATGCTTGGTTACCTCGTGGTGAACTTATGGAGACTCACGCT---AAGATGGTTGCTGAAG
ATGATGTCTTCCGACAATGCTTGGTTACCTCGTGGTGAACTTATGGAGACTCACGCT---AAGATGGTTGCTGAAG
|-----------------------|
|-------------------------|------------------|
----------|
CTTTCATCCGCTGAAAACATGTGGTTATCAAGAGATGAATTGGTTGCCAGAGGTTTCGAAAAGAAAGTCATGGAAC
ATGTCCTCGACCGAGAACATCTGGATGTCCCGAGACGAGTTGATCAGCCGAGGTTTCGAAAAGAAGGTTCTTG--CAGTCTTCCGCCGACAACATCTGGATGTCGCGTGACGAGCTCGTCACCCGTGGTTTCGAGAAGAAGATTCTCGAGC
CAGTCCTCTGCCGAGAACATCTGGATGTCCCGTGACGAGCTCATCACCCGTGGGTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--ATGTCCTCCGCCGAGAACGTCTGGATCTCCCGAGACGAGCCCATCACCCGTGGGTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--ATGTCGTCTGCCGAGAACGTCTGGCTCTCGCGTGACGAGCTCATTGCCCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--CTATCTTCTGCCGAAAACATGTGGATGTCCCGAGACGAGCTCATTACTCGAGGTTTCGAAAAGAAGGTTCTTGAAC
ATGTCCTCTGCCGAAAACATCTGGATTTCTCGAGACGAACTTGTTGCCCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTTATGGAGC
CTCTCGTCGTCCGAGAACATGTGGCTCCCGCGTGACGAGCTCGTCCGCCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--CTCTCATCATCTGAAAACATCTGGATGTCTCGAGATGAGCTCATCTCACGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCGAGG
CTTTCTTCGTCGGAGAACCTCTGGATTCCGCGTGACGAGCTCATCCGTCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--CTCTCGTCGTCTGAGAACATGTGGCTCCCGCGTGACGAGCTCATCCGTCGTGGGTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--CTCTCGTCGTCTGAGAACATGTGGCTCCCGCGTGACGAGCTCATCCGTCGTGGTTTCGAGAAGAAGGTCCTCG--CAGTCGTCGGCCGAGAACATCTGGATGTCGCGTGACGAGCTTATCTCGCGTGGCTTCGAGAAGAAGGTCCTCGAGC
116
6 Anhang
HS09
Ha1r-8r
HT1r-4r
Ca AF038153
Ca ATCC 10231
Cb DSM 70034
Cc DSM 70136
Cd DSM 70042
Ce DSM70858
Cg BCD 8932
Cglae CBS 5691
Ch DSM 70624
Cim BCD 1062
Cint BCD 685
Ck BCD 689
Cll DSM 70102
Cm DSM 70638
Cmal AB018532
Cmal BCD 806
Cmel AB018533
Cmu DSM 70862
Cp ATCC 20384
Cr BCD 814
Cs BCD1054
Csan CBS 4261
Cso BCD 818
Ct BCD 819
Ctr ATCC 20326
Cv DSM 6956
Cvi DSM 70184
Cz AB018534
Cz BCD 690
De ATCC 20126
Dekb DSM 3429
Dekb DSM 70726
Dekc DSM 70736
Dh BCD 3512
Dh BCD 589
Dm ATCC 11627
Ef BCD 3514
Ef DSM 70554
Gs DSM 3431
Hb BCD 859
Hb DSM 3505
Hg DSM 70285
Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
Hv DSM 70283
Io CBS 5147
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Km BCD 811
Km DSM 70106
Km DSM 70792
Ku BCD 877
Le DSM 70320
Lt CBS 6340
Mp DSM 70321
Pa DSM 70277
Pan BCD 1082
Pan DSM 70783
Pc CBS 601
Pcar DSM 70392
Pf BCD 861
Pfe BCD 711
Pfe DSM 70090
Pg BCD 804
Pm DSM 70178
Po BCD 862
Pp AB018536
Sb BCD 1256
Sb BCD 1392
Sb DSM 70412
Sc AB018539
Sc DSM 1333
305 310
320
330
340
350
360
370
376
|----|---------|---------|---------|---------|---------|---------|----|
|---------------|
|--------------------------|
|---------------------|
TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAAATTGAAGCTCATTG
TCGACATGAAGGAGGCTCTTGCTTCCGGTCAGTTCCGTGCCCTTACCAGAAAGGAGATTGAGGAGCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCATCTGGACAGTTCCGACCTTTGACCAGAAAGGAAATTGAAGCCCACTG
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TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATTGAATCTCATTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCCTCCGGTCAATTCAGACCATTGACTAGAAAAGAAATCGAACAACACTG
TTGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCAGACCATTGACCAGAAAGGAGATCGAGGACCACTG
TTGATATGAAGGAGGCTCTTGCATCCGGTCAATTCCGTCCTCTTACCCGTAAGGAGATCGAGAAGCACTG
TTGACATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCAGACCATTGACCAGAAAGGAGATCGAGAAACACTG
TTGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCTGGACAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATTGAGCAGCACTG
TCGACATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTGACCAGAAAGGAGATCGAACAACACTG
TTGACATGAAGGAAGCTCTCGCCTCACC-----------------------------------------TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAGAACATTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAAATCGAACAACACTG
TTGACATGAAGGAGGCCTTGGCTTCTGGTCAATTTAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATTGAGGAGCATTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCATCTGGTCAATTCAGACCTTTAACTAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCAGGTCAATTCAGACCATTGACTAGAAAGGAAATCGAGAAACACTG
TCGATATGAAGGAGGCTCTTGCTTCTGGTCAGTTCCGTCCTCTTACCCGTAAGGAGATAGAACAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAAATTGAAGAACACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCCTCAGGTCAATTCCGTGCTTTAACCAGAAAAGAAATTGAATCTCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCTTTAACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAGAGAAATCGAACAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCATTGGCTTCTGGTCAGTTCCGCCCTCTTACCAGAAAGGAGATTGAGCAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTTAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAGAACACTG
TTGACATGAAGGAGGCCTTGGCTTCTGGTCAATTTAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATTGAGGAGCATTG
TTGACATGAAGGAGGCCTTGGCTTCTGGTCAATTTAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATAGAGAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCATCTGGTCAATTCAGACCATTAACTAGAAAGGAGATCGAGAAGCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTCTTGCCAACGGTCAGTATAGAGCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAGGCGCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTCTTGCCAACGGTCAGTATAGAGCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAGGCCCATTG
TCGATATGAAGGAAGCTCTTGCCAACGGTCAGTACAGACCATTGACTAGAAAGAACATCGAAGAGCACTG
TCGATATGAAGGAAGCTTTAGCCTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAGATCGAACAACACTG
TCGATATGAAGGAAGCTTTAGCCTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCCTCTGGTCAATTTAGACCATTAACCAGAAAGGAAATCGAAGAACACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTGACCAGAAAAGAAATCGAAGATCATTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATAGAAAAGCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAACTCAGACCTTTAACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCCGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATTGAATCCCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATTGAATCCCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTAACCAGAAAGGAAATTGAATCCCACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGAGCTTTGACCAGAAAAGAAATTGAATCTCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTGACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCTTTGACTAGAAAGGAAATCGAAGAGCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAACAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTCGACCAGAAAGGAAATCGAACAGCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCAGGTCAATTCAGACCATTGACCAGAAAGGAAATCGAGCAACACTG
TTGACATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCCGTCCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAGGAGCACTG
TTGACATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCAGACCATTGACCAGGAAGGAGATCGAAAAGCACTG
TTGACATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCAGACCTTTGACTAGAAAGGAGATCGAGCAGCACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCAGGTCAATTCCGTGCTTTAACCAGAAAAGAAATTGAATCTCACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCAGGTCAATTCCGTGCTTTAACCAGAAAAGAAATTGAATCTCACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTAGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAAATTGAACAACATTG
TGGATATGAAAGAAGCCTTAGCATCTGGTCAATTTAGACCATTAACTAGAAAGGAAATTGAAGAACATTG
TCGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCTTTGACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCATCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAGATCGAAAAGCACTG
TTGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCTGGACAATTCAGACCTTTGACCAGAAAGGAGATCGAAAAGCATTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTAGCATCTGGTCAATTCAGACCATTAACCAGAAAGGAAATCGAAGACCATTG
TCGACATGAAGGAGGCTCTTGCCTCTGGTCAGTTTAGACCATTGACCAGAAAGGAGATCGAACAACACTG
TCGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCTTTGACCAGAAAAGAAATCGAGGAGCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTAACTAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TCGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTGACCAGAAAGGAAATAGAAAAGCACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAGGAAATTGAAGAACATTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAGATCGAAAAACACTG
117
6 Anhang
Sd BCD 1257
Sd DSM 70487
Se MUCL 29838
Sp DSM 6580
Sp BCD 728
Td DSM 70607
Yl AB018537
Yl BCD 2003
Yl BCD 2556
Zb BCD 1424
Zbi DSM 70415
Zf DSM 70506
Zm DSM 6959
Zr ATCC 48230
Scho DSM 70573
Schp AB018538
Schp BCD 773
Hb1r-3r
Bd DSM70745
Cra DSM70197
Crc BCD 2578
Crc DSM 70022
Crf BCD 823
Crh DSM 70067
Crl BCD 824
Fn AF316889
Rg BCD 3530
Rm DSM 70408
Spj BCD 4982
Spj BCD 778
Spj DSM 70847
Trc DSM 70684
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCGGAAAAGAAATTGAAGAACATTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAACTCCGTCCATTAACCAGAAAAGAAATTGAAGAACATTG
TTGATATGAGGGAAGCACTTGCCTCCGGTCAATTTAGAGCCTTAACTAGAAAAGAGATTGAGTCTCATTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAGGAGATCGAAAAAC---TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TTGATATGAAGGAGGCTCTTGCTTCCGGACAGTTCCGACCTCTTACCAAGAAGGAGATTGAGCAGCATTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCATCTGGACAGTTCCGACCTTTGACCAGAAAGGAAATTGAAGCCCACTG
TTGATATGAAGGAGGCCCTTGCTTCCGGACAGTTCCGACCTCTTACCAAGAAGGAGATTGAGGCCCACTG
TTGACATGAAGGAGGCCTTGGCTTCCGGTCAGTTCCGTGCGTTGACCAGAAAGGAAATCGAAAAACACTG
TCGACATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAGTTCCGTGCGTTGACTAGAAAGGAGATTGAAGAGCACTG
TTGATATGAAGGAGGCTTTGGCTTCTGGTCAATTCCGTCCATTAACCAGAAAGGAAATCGAAGAACACTG
TTGATATGAAAGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCTCTAACCAGAAAGGAAATCGAAGAACACTG
TTGATATGAAGGAAGCTTTGGCTTCCGGTCAATTCCGTCCATTGACCAGAAAGGAAATAGAAGAGCACTG
TTGACCGTGCTGAAGCTTTGAAGAGTGGTCAATTCCGTCCCTTGGTCCGTAAGGAAATTGAAGAACACTG
TTGACCGTGCTGAGGCCTTGAAGAGTGGTCAATTCCGTCCCTTGGTCCGTAAGGAGATTGAGGAGCACTG
TTGACCGTGCTGAGGCCTTGAAGAGTGGTCAATTCCGTCCCTTGGTCCGTAAGGAGATCGAAAAGCACTG
--|
TTGATACCCGAGAAGCTCAACGATTAGGTTTAATGAGACCTTTAGTCCGAAGAGAAATCGAAAAACATTT
---------------------------------------------------------------------TCGACACCCGTGAGGCCCAGCGTCTTGGTCTCATGCGCCCCCTTGTCCGTCGCGAGATCGAAAAACACTG
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TCGACACCAAGGAGGCTCAGCGATTGGGTCTCATGCGACCTTTGGTTCGACGAGAAATCGAAAAGCACTT
TCGACACCAGGGAGGCTCAGCGATTGGGTCTCATGAGGCCCTTGGTCAGGAGGGAAATCGAAAAGCACTT
---------------------------------------------------------------------TTGATACTCGTGAAGCTCAACGTCTTGGTTTAATGAGACCTCTAGTCCGAAAGGAAATCGAGAAGCACAT
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TCGACACCCGTGAGGCTCAGCGTCTTGGTCTCATGCGCCCCCTCGTCCGTCGCGAGATCGAAAAGCACTG
Bd: Bullera dendrophila; Ca: Candida albicans; Cb: Candida boidinii; Cc: Candida catenulata; Cd:
Candida diddensiae; Ce: Candida ernobii; Cg: Candida glabrata; Cglae: Candida glaebosa; Ch: Candida haemulonii; Cim: Citeromyces matritensis; Cint: Candida intermedia; Ck: Candida krusei; Cll:
Clavispora lusitaniae; Cm: Candida magnoliae; Cmal: Candida maltosa; Cmel: Candida melibiosica;
Cmu: Candida multigemmis; Cp: Candida parapsilosis; Cr: Candida rugosa; Cra: Cryptococcus albidus; Crc: Cryptococcus curvatus; Crf: Cryptococcus flavus; Crh: Cryptococcus humicola; Crl: Cryptococcus laurentii; Cs: Candida sake; Csan: Candida santamariae; Cso: Candida solani; Ct: Candida
tenuis; Ctr: Candida tropicalis; Cv: Candida versatilis; Cvi: Candida vini; Cz: Candida zeylanoides;
De: Debaryomyces etchelsii; Dekb: Dekkera bruxellensis; Dekc: Dekkera custersiana; Dh: Debaryomyces hansenii; Dm: Debaryomyces marama; Ef: Endomyces fibuliger; Fn: Filobasidiella neoformans;
Gs: Guilliermondella selenospora; Hb: Hyphopichia burtonii; Hg: Hanseniaspora guilliermondii; Hu:
Hanseniaspora uvarum; Hv: Hanseniaspora vineae; Io: Issatchenkia orientalis; Kl: Kluyveromyces
lactis; Km: Kluyveromyces marxianus; Ku: Kazachstania unispora; Le: Lodderomyces elongisporus;
Lt: Lachancea thermotolerans; Mp: Metschnikowia pulcherrima; Pa: Pichia angusta; Pan: Pichia anomala; Pc: Pichia canadensis; Pcar: Pichia carsonii; Pf: Pichia farinosa; Pfe: Pichia fermentans; Pg:
Pichia guilliermondii; Pm: Pichia membranaefaciens; Po: Pichia ohmeri; Pp: Pichia pastoris; Rg: Rhodotorula glutinis; Rm: Rhodotorula minuta; Sb: Saccharomyces bayanus; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Scho: Schizosaccharomyces octosporus; Schp: Schizosaccharomyces pombe; Sd: Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus; Se: Saccharomyces exiguus; Sp: Saccharomyces pastorianus; Spj:
Sporidiobolus johnsonii; Td: Torulaspora delbrueckii; Trc: Trichosporon cutaneum; Yl: Yarrowia lipolytica; Zb: Zygosaccharomyces bailii; Zbi: Zygosaccharomyces bisporus; Zf: Zygosaccharomyces florentinus; Zm: Zygosaccharomyces microellipsoides; Zr: Zygosaccharomyces rouxii
118
6 Anhang
Hg DSM 70285
Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
Hv DSM 70283
Csan CBS 4261
Hb DSM 3505
94
94
88
87
79
84
82
85
90
90
94
95
91
64
92
85
99
87
91
80
97
97
94
94
89
86
80
83
83
84
89
91
94
96
92
64
91
86
98
86
90
81
96
96
92
92
90
84
80
83
82
85
92
90
93
97
94
65
93
88
94
86
90
81
94
93
78
78
84
75
79
70
82
74
77
80
81
80
84
62
77
84
76
76
78
78
75
75
78
78
84
75
79
70
82
74
77
80
81
80
84
62
77
84
76
76
78
78
75
75
76
76
79
70
74
69
76
72
76
78
80
79
82
58
75
79
75
74
76
74
74
74
94
94
88
85
79
82
82
83
87
94
94
94
91
63
91
85
94
87
89
80
93
93
94
94
88
85
79
82
82
83
87
94
94
94
91
63
91
85
94
87
89
80
93
93
92
92
89
84
80
81
83
82
86
94
93
93
90
64
90
86
92
85
88
81
91
91
87
87
83
85
72
82
75
84
85
82
84
88
85
63
88
79
86
90
86
72
87
87
84
84
80
79
71
84
75
81
80
79
81
84
81
63
84
77
84
82
81
69
84
84
83
83
77
79
71
81
78
75
81
75
79
81
78
62
84
75
81
78
83
70
84
83
87
87
84
87
72
81
75
85
84
82
84
86
84
64
86
79
86
92
85
72
87
87
87
87
84
85
73
82
76
84
85
83
84
88
85
64
88
80
86
90
86
73
87
87
80
80
83
75
82
74
97
75
77
83
85
82
84
64
79
83
84
75
77
84
81
81
80
80
83
75
82
74
97
75
77
83
85
82
84
64
79
83
84
75
77
84
81
81
80
80
83
75
82
74
97
75
77
83
85
82
84
64
79
83
84
75
77
84
81
81
84
84
84
78
80
77
89
77
80
83
88
84
86
66
82
84
84
78
81
81
83
83
Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den Abkürzungen in der Abbildung 6.1.
119
80
80
83
75
93
72
86
76
80
79
84
83
83
71
81
83
81
74
78
100
Cs BCD 1054
Hb BCD 859
86
86
96
79
82
80
84
81
85
91
90
89
92
67
84
91
88
84
85
83
88
88
84
84
93
77
83
78
82
80
84
87
89
88
92
63
83
100
Cr BCD 814
Gs DSM 3431
Cp ATCC 20384
Ef DSM 70554
Cmu DSM 70862
Ef BCD 3514
Cmel AB018533
Dm ATCC 11627
78
78
81
77
89
70
83
78
79
78
81
80
79
72
78
78
81
73
81
90
81
79
92
92
90
84
82
83
83
85
90
89
94
100
Cmal BCD 806
Dh BCD 589
Cmal AB018532
Dh BCD 3512
Cm DSM 70638
Dekc DSM 70736
Cll DSM 70102
Dekb DSM 70726
95
95
83
88
78
84
80
85
88
84
87
91
85
67
98
81
89
86
93
79
92
90
91
91
91
84
83
81
84
83
91
90
100
Ck BCD 689
Dekb DSM 3429
87
87
87
84
79
79
82
84
84
85
89
92
87
62
87
84
87
85
86
79
88
86
Cint BCD 685
De ATCC 20126
Cim BCD 1062
Cz BCD 690
Ch DSM 70624
Ce DSM 70858
Cz AB018534
Cglae CBS 5691
Cd DSM 70042
Cvi DSM 70184
85
85
86
81
78
82
84
79
81
84
87
87
86
62
84
84
86
78
84
77
86
86
Cg BCD 8932
Cc DSM 70136
94
94
84
87
78
82
80
87
89
84
87
90
85
67
94
80
90
85
100
Cv DSM 6956
89
89
84
85
73
81
74
83
84
83
84
86
84
64
88
80
86
100
Ca AF038153
Ca ATCC 10231
Cb DSM 70034
Cc DSM 70136
Cd DSM 70042
Ce DSM 70858
Cg BCD 8932
Cglae CBS 5691
Ch DSM 70624
Cim BCD 1062
Cint BCD 685
Ck BCD 689
Cll DSM 70102
Cm DSM 70638
Cmal AB018532
Cmal BCD 806
Cmel AB018533
Cmu DSM 70862
Cp ATCC 20384
Cr BCD 814
Cs BCD 1054
Csan CBS 4261
Ca AF038153
Cb DSM 70034
94
94
87
86
80
83
83
84
89
89
93
94
90
64
91
84
100
84
84
81
78
73
100
Ctr ATCC 20326
97
97
84
90
80
84
82
87
90
85
89
93
87
68
100
79
79
83
76
100
87
87
81
86
77
78
78
100
88
88
90
80
78
79
83
81
84
100
65
65
65
64
69
59
66
64
66
62
63
66
63
100
100 100 86 91
100 86 91
100 80
100
81
81
82
76
84
74
100
88
88
86
84
79
80
78
82
100
88
88
93
81
82
81
84
82
90
91
95
94
100
Ca AF038153
Ca ATCC 10231
Cb DSM 70034
Cc DSM 70136
Cd DSM 70042
Ce DSM 70858
Cg BCD 8932
Cglae CBS 5691
Ch DSM 70624
Cim BCD 1062
Cint BCD 685
Ck BCD 689
Cll DSM 70102
Cm DSM 70638
Cmal AB018532
Cmal BCD 806
Cmel AB018533
Cmu DSM 70862
Cp ATCC 20384
Cr BCD 814
Cs BCD 1054
Csan CBS 4261
Ct BCD 819
Ca ATCC 10231
Distanz-Matrix: Prozentuale Übereinstimmung der EF-3 Aminosäuresequenzen innerhalb der Unterabteilung der Ascomycota
Cso BCD 818
Tab. 6.2:
93
93
87
87
80
84
82
85
92
88
92
94
89
67
94
84
96
87
91
81
100
93
93
87
87
79
85
80
84
90
88
92
93
89
65
92
84
96
89
89
79
98
100
6 Anhang
Io CBS 5147
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Km BCD 811
Km DSM 70106
Km DSM 70792
Ku BCD 877
Le DSM 70320
Lt CBS 6340
Mp DSM 70321
Pa DSM 70277
Pan BCD 1082
Pan DSM 70783
Pc CBS 601
Pc DSM 70392
Pf BCD 861
Pfe BCD 711
Pfe DSM 70090
Pg BCD 804
Pm DSM 70178
Po BCD 862
Pp AB018536
Ca AF038153
Ca ATCC 10231
Cb DSM 70034
Cc DSM 70136
Cd DSM 70042
Ce DSM 70858
Cg BCD 8932
Cglae CBS 5691
Ch DSM 70624
Cim BCD 1062
Cint BCD 685
Ck BCD 689
Cll DSM 70102
Cm DSM 70638
Cmal AB018532
Cmal BCD 806
Cmel AB018533
Cmu DSM 70862
Cp ATCC 20384
Cr BCD 814
Cs BCD 1054
Csan CBS 4261
87
87
96
80
84
80
84
80
86
90
90
91
94
68
86
93
87
85
85
84
87
87
84
84
93
78
83
78
84
81
84
89
91
89
94
62
84
98
85
81
81
83
84
84
84
84
93
78
83
78
82
81
85
88
91
89
92
63
84
98
85
81
81
83
85
85
84
84
92
77
84
78
84
82
84
86
89
90
91
64
84
97
84
80
82
84
86
84
85
85
94
79
84
80
84
82
85
89
91
90
94
64
84
98
86
82
82
84
86
86
83
83
91
76
81
76
80
79
84
86
89
87
90
62
82
96
84
79
79
81
84
84
84
84
93
78
83
78
82
81
85
88
91
89
92
63
84
98
85
81
81
83
85
85
83
83
91
76
82
80
85
81
82
88
87
85
89
65
81
92
84
79
80
82
84
84
95
95
86
90
77
85
78
88
88
86
89
91
87
65
95
83
90
89
93
77
91
91
85
85
90
79
84
79
86
83
82
89
89
88
90
64
84
94
86
82
83
84
85
85
85
85
90
78
81
77
80
79
86
88
93
89
91
62
84
88
86
82
84
80
85
86
87
87
92
82
83
78
84
84
84
91
89
89
90
66
86
92
87
82
86
83
87
87
87
87
88
83
81
84
87
81
83
86
90
89
89
64
86
86
88
80
86
80
88
88
87
87
88
83
81
84
87
81
83
86
90
89
89
64
86
86
88
80
86
80
88
88
89
89
94
80
82
80
82
78
86
90
93
90
92
64
87
90
89
82
85
83
89
89
92
92
84
87
75
84
76
83
86
86
88
90
87
63
91
83
90
90
86
74
91
93
91
91
88
83
80
81
81
82
84
88
89
93
89
64
90
86
89
83
87
81
88
88
86
86
94
80
85
80
83
81
85
90
91
91
92
67
85
93
87
83
83
85
87
87
84
84
93
78
80
76
81
78
83
86
86
87
90
66
83
89
84
86
82
81
84
84
92
92
90
84
82
83
83
85
90
89
94
100
94
66
93
88
94
86
90
83
94
93
84
84
93
78
83
79
81
80
84
90
89
88
89
66
83
90
86
81
82
83
86
86
91
91
81
85
75
81
76
87
84
83
84
88
83
64
91
78
86
83
92
75
87
86
86
86
95
80
84
82
84
81
84
88
90
91
92
68
85
94
87
84
84
84
87
87
Sb BCD 1392
Sb DSM 70412
Sc AB018539
Sp BCD 728
Sc DSM 1333
Scho DSM 70573
Schp AB018538
Schp BCD 773
Sd BCD 1257
Sd DSM 70487
Se MUCL 29838
Sp DSM 6580
Td DSM 70607
Yl AB018537
Yl BCD 2003
Yl BCD 2556
Zb BCD 1424
Zbi DSM 70415
Zf DSM 70506
Zm DSM 6959
Zr ATCC 48230
Fortsetzung
Sb BCD 1256
Tab. 6.2:
Ca AF038153
Ca ATCC 10231
Cb DSM 70034
Cc DSM 70136
Cd DSM 70042
Ce DSM 70858
Cg BCD 8932
Cglae CBS 5691
Ch DSM 70624
Cim BCD 1062
Cint BCD 685
Ck BCD 689
Cll DSM 70102
Cm DSM 70638
Cmal AB018532
Cmal BCD 806
Cmel AB018533
Cmu DSM 70862
Cp ATCC 20384
Cr BCD 814
Cs BCD 1054
Csan CBS 4261
87
87
94
80
82
78
84
81
87
91
92
89
94
64
84
94
87
85
84
83
86
86
83
83
89
76
83
76
87
81
81
88
87
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86
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74
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76
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73
76
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75
99
72
84
76
78
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82
81
81
68
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83
79
72
77
92
79
78
78
78
80
76
86
69
82
76
79
77
83
84
81
64
79
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82
74
77
87
80
78
84
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93
80
81
76
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80
86
88
90
90
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64
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93
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84
85
85
93
80
81
76
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80
86
88
90
90
93
65
84
93
86
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84
82
84
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86
86
94
80
85
79
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86
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93
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97
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81
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94
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77
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82
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91
89
94
66
86
94
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84
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84
85
85
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64
84
92
84
83
84
82
84
84
Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den Abkürzungen in der Abbildung 6.1.
120
6 Anhang
85
86
84
82
98
88
89
91
87
87
82
88
88
89
84
79
78
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84
84
84
84
85
84
85
82
78
91
86
87
90
85
85
80
87
87
88
80
78
75
80
81
84
84
84
86
84
84
82
79
91
86
87
89
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84
81
86
86
87
80
77
75
80
81
83
83
83
84
84
85
83
80
90
85
86
89
84
84
78
85
85
86
79
77
77
79
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83
83
84
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85
83
80
93
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86
81
87
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79
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84
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84
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84
84
85
78
75
74
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79
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81
81
83
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84
82
79
91
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87
89
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86
86
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77
75
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83
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83
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83
79
81
91
85
86
85
84
84
80
84
84
85
77
82
77
78
78
86
86
86
90
84
88
94
77
86
91
90
91
78
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77
90
90
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90
85
83
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90
77
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84
84
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90
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88
86
86
86
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79
74
81
82
87
87
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84
82
79
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81
81
80
86
86
87
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76
74
81
83
80
80
80
81
85
85
84
83
94
88
89
89
84
84
81
86
86
87
82
78
78
82
83
83
83
83
83
97
86
84
78
87
89
90
87
82
82
78
89
89
88
84
85
85
83
84
88
88
88
89
97
86
84
78
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89
90
87
82
82
78
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89
88
84
85
85
83
84
88
88
88
89
86
85
85
79
94
90
91
90
82
82
77
90
90
91
82
79
79
80
82
83
83
83
84
82
87
89
75
84
91
90
91
76
76
74
91
91
89
87
84
81
87
87
77
77
77
81
84
86
88
80
87
90
91
91
79
79
75
90
90
91
84
79
75
82
84
81
81
81
80
85
86
84
82
94
88
89
91
84
84
80
88
88
89
82
79
75
82
83
84
84
84
84
82
84
81
78
94
84
85
87
84
84
79
84
84
85
83
77
74
83
84
82
82
82
82
87
92
91
80
89
95
96
97
80
80
79
94
94
93
88
84
81
86
88
82
82
82
84
84
84
81
81
94
87
88
88
81
81
77
87
87
89
79
78
74
80
80
82
82
82
84
79
84
89
74
82
87
86
88
73
73
71
85
85
84
83
78
77
82
83
74
74
74
77
88
86
84
81
94
88
89
89
84
84
79
88
88
89
84
82
81
84
84
85
85
85
85
121
85
81
77
80
84
83
84
81
83
83
76
83
83
84
76
76
77
76
77
100
100
100
Hv DSM 70283
Pp AB018536
Hu BCD 3526
Po BCD 862
Hu ATCC 9774
Pm DSM 70178
Cso BCD 818
Ct BCD 819
Ctr ATCC 20326
Cv DSM 6956
Cvi DSM 70184
Cz AB018534
Cz BCD 690
De ATCC 20126
Dekb DSM 3429
Dekb DSM 70726
Dekc DSM 70736
Dh BCD 3512
Dh BCD 589
Dm ATCC 11627
Ef BCD 3514
Ef DSM 70554
Gs DSM 3431
Hb BCD 859
Hb DSM 3505
Hg DSM 70285
Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
Hv DSM 70283
Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den Abkürzungen in der Abbildung 6.1.
83
84
86
74
83
87
86
88
77
77
74
86
86
86
98
84
80
95
100
Hg DSM 70285
Pg BCD 804
81
84
84
74
83
87
86
86
77
77
74
86
86
84
95
84
79
100
Hb DSM 3505
Pfe DSM 70090
Hb BCD 859
Pfe BCD 711
Gs DSM 3431
Pf BCD 861
Ef DSM 70554
Pc DSM 70392
Ef BCD 3514
Pc CBS 601
Dm ATCC 11627
Pan DSM 70783
Dh BCD 589
Pan BCD 1082
Dh BCD 3512
Pa DSM 70277
Dekc DSM 70736
Mp DSM 70321
Dekb DSM 70726
Lt CBS 6340
Dekb DSM 3429
Le DSM 70320
Cz BCD 690
Cz AB018534
Cvi DSM 70184
De ATCC 20126
83
84
86
73
82
87
86
88
76
76
74
86
86
85
100
85
81
77
80
84
83
84
81
83
83
76
83
83
84
76
76
77
76
77
100
100
Ku BCD 877
86
89
88
79
88
93
94
92
79
79
75
98
98
100
85
81
77
80
84
83
84
81
83
83
76
83
83
84
76
76
77
76
77
100
Km DSM 70792
87
90
89
78
87
94
95
93
78
78
76
100
100
84
79
83
71
78
82
81
81
72
72
68
80
80
79
80
88
100
Km DSM 70106
87
90
89
78
87
94
95
93
78
78
76
100
84
81
82
69
79
84
84
83
72
72
71
82
82
81
84
100
Km BCD 811
Cv DSM 6956
Ctr ATCC 20326
75
75
74
74
80
76
77
78
90
90
100
Km BCD 5186
88
89
89
81
90
99
100
79
78
75
79
85
77
78
80
100
100
Km BCD 2563
87
88
90
80
89
100
79
78
75
79
85
77
78
80
100
100 84 83 75
100 85 78
100 76
100
Kl AB018535
84
86
83
83
100
85
91
91
78
89
94
94
100
Cso BCD 818
Ct BCD 819
Ctr ATCC 20326
Cv DSM 6956
Cvi DSM 70184
Cz AB018534
Cz BCD 690
De ATCC 20126
Dekb DSM 3429
Dekb DSM 70726
Dekc DSM 70736
Dh BCD 3512
Dh BCD 589
Dm ATCC 11627
Ef BCD 3514
Ef DSM 70554
Gs DSM 3431
Hb BCD 859
Hb DSM 3505
Hg DSM 70285
Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
Hv DSM 70283
Io CBS 5147
Ct BCD 819
Fortsetzung
Cso BCD 818
Tab. 6.2:
86
84
80
78
85
84
85
83
84
84
80
85
85
85
76
80
80
77
76
90
90
90
100
6 Anhang
Zf DSM 70506
Zm DSM 6959
Zr ATCC 48230
84
84
82
80
92
87
88
89
86
86
81
86
86
87
82
77
77
82
83
84
84
84
84
84
84
83
80
93
87
88
89
87
87
82
86
86
87
82
77
78
82
83
84
84
84
85
86
84
84
81
92
88
89
89
84
84
79
88
88
89
80
78
78
80
81
85
85
85
87
83
85
84
82
94
86
87
90
87
87
83
87
87
88
82
77
75
82
83
84
84
84
87
81
84
83
80
90
85
86
87
84
84
82
87
87
88
81
75
75
81
82
83
83
83
85
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Io CBS 5147
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Km BCD 811
Km DSM 70106
Km DSM 70792
Ku BCD 877
Le DSM 70320
Lt CBS 6340
Mp DSM 70321
Pa DSM 70277
Pan BCD 1082
Pan DSM 70783
Pc CBS 601
Pc DSM 70392
Pf BCD 861
Pfe BCD 711
Pfe DSM 70090
Pg BCD 804
Pm DSM 70178
Po BCD 862
Pp AB018536
100 93 93 92
100 98 97
100 97
100
94
98
98
97
100
91
96
98
95
96
100
93
98
100
97
98
98
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90
92
92
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94
90
92
100
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84
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84
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84
82
100
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94
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94
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94
94
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89
89
90
88
90
88
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84
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88
100
94
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94
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92
92
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88
89
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100
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86
86
86
88
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100
88
86
86
86
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87
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100
94
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90
89
92
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88
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90
91
89
89
100
84
84
84
83
84
82
84
82
92
84
84
83
84
84
84
100
89
87
87
86
88
85
87
84
89
87
87
89
85
85
88
86
100
96
93
94
92
94
93
94
90
85
90
88
94
88
88
92
84
89
100
Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den Abkürzungen in der Abbildung 6.1.
122
96
89
89
88
91
87
89
86
83
86
85
90
84
84
90
81
85
93
100
91
89
89
90
90
87
89
85
91
88
89
89
89
89
90
90
93
91
87
100
94
90
92
89
92
90
92
89
84
88
86
92
86
86
90
83
86
97
90
88
100
82
79
79
80
80
77
79
78
89
81
81
83
81
81
82
85
85
81
78
88
80
100
Pp AB018536
Zbi DSM 70415
75
80
77
84
80
81
82
81
76
76
74
80
80
81
73
70
69
73
74
81
81
81
78
Po BCD 862
Zb BCD 1424
77
78
77
88
81
78
79
79
78
78
73
78
78
79
71
70
71
71
72
81
81
81
79
Pm DSM 70178
Yl BCD 2556
76
80
76
84
80
80
81
81
76
76
75
79
79
80
73
71
69
73
74
82
82
82
79
Pg BCD 804
Yl BCD 2003
83
82
80
80
89
84
85
86
84
84
80
84
84
84
76
77
74
76
77
86
86
86
87
Pfe DSM 70090
Yl AB018537
83
81
80
82
89
84
85
84
83
83
78
84
84
86
77
74
74
78
78
82
82
82
85
Pfe BCD 711
Td DSM 70607
84
84
81
82
93
85
86
88
88
88
83
85
85
86
81
77
74
83
82
84
84
84
86
Pf BCD 861
Sp DSM 6580
84
84
81
82
93
85
86
88
87
87
82
85
85
86
81
77
74
81
82
84
84
84
86
Pc DSM 70392
Se MUCL 29838
84
84
82
83
94
86
87
89
88
88
83
86
86
87
82
78
75
82
83
85
85
85
87
Pc CBS 601
Sd DSM 70487
74
74
73
70
77
76
77
76
69
69
66
75
75
74
73
69
65
73
73
70
70
70
71
Pan DSM 70783
Sd BCD 1257
74
74
73
70
77
76
77
76
69
69
66
75
75
74
73
69
65
73
73
70
70
70
71
Pan BCD 1082
Schp BCD 773
74
76
73
71
81
77
78
76
70
70
66
76
76
77
73
69
65
74
74
72
72
72
72
Pa DSM 70277
Schp AB018538
84
84
82
83
94
86
87
89
88
88
83
86
86
87
82
78
75
82
83
85
85
85
87
Mp DSM 70321
Scho DSM 70573
82
85
82
80
94
87
88
89
86
86
81
88
88
88
81
77
75
83
82
84
84
84
87
Lt CBS 6340
Sc DSM 1333
84
84
82
83
94
86
87
89
88
88
83
86
86
87
82
78
75
82
83
85
85
85
87
Le DSM 70320
Sp BCD 728
83
86
83
81
94
88
89
90
87
87
82
89
89
89
82
78
76
84
83
84
84
84
88
Ku BCD 877
Sc AB018539
83
82
80
80
89
84
85
86
84
84
80
84
84
84
76
77
73
76
77
86
86
86
87
Km DSM 70792
Sb DSM 70412
83
86
83
81
94
88
89
90
87
87
82
89
89
89
82
78
76
84
83
84
84
84
88
Km DSM 70106
Sb BCD 1392
Cso BCD 818
Ct BCD 819
Ctr ATCC 20326
Cv DSM 6956
Cvi DSM 70184
Cz AB018534
Cz BCD 690
De ATCC 20126
Dekb DSM 3429
Dekb DSM 70726
Dekc DSM 70736
Dh BCD 3512
Dh BCD 589
Dm ATCC 11627
Ef BCD 3514
Ef DSM 70554
Gs DSM 3431
Hb BCD 859
Hb DSM 3505
Hg DSM 70285
Hu ATCC 9774
Hu BCD 3526
Hv DSM 70283
Km BCD 811
Sb BCD 1256
Fortsetzung
Io CBS 5147
Tab. 6.2:
95
94
94
94
94
92
94
91
85
91
89
93
91
91
91
84
89
94
92
91
91
81
100
6 Anhang
Sb BCD 1392
Sb DSM 70412
Sc AB018539
Sp BCD 728
Sc DSM 1333
Scho DSM 70573
Schp AB018538
Schp BCD 773
Sd BCD 1257
Sd DSM 70487
Se MUCL 29838
Sp DSM 6580
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Yl BCD 2556
Zb BCD 1424
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Zf DSM 70506
Zm DSM 6959
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95
95
94
93
95
92
94
92
85
92
90
91
85
85
92
86
87
92
92
89
90
81
93
89
94
93
92
94
91
93
94
82
94
86
90
85
85
86
81
85
89
85
85
87
79
90
95
95
94
93
95
92
94
92
85
92
90
91
85
85
92
86
87
92
92
89
90
81
93
95
95
95
94
97
94
95
94
84
94
89
91
87
87
91
84
87
94
92
89
91
79
94
94
94
93
92
94
91
93
91
84
91
89
90
84
84
91
85
86
91
91
88
89
80
92
95
95
95
94
97
94
95
94
84
94
89
91
87
87
91
84
87
94
92
89
91
79
94
80
79
79
78
80
77
79
75
77
79
80
79
76
76
77
73
78
79
76
78
78
72
81
78
77
77
76
78
75
77
73
75
77
76
77
76
76
74
73
76
77
74
78
75
72
79
78
77
77
76
78
75
77
73
75
77
76
77
76
76
74
73
76
77
74
78
75
72
79
95
95
95
94
97
94
95
94
84
94
89
91
87
87
91
84
87
94
92
89
91
79
94
94
94
94
94
96
93
94
94
83
94
88
90
86
86
90
83
86
93
91
88
90
78
94
94
94
94
94
96
93
94
94
83
94
88
90
86
86
90
83
86
93
91
88
90
78
94
90
90
92
89
92
90
92
88
81
87
87
88
85
85
88
80
84
90
86
84
89
76
89
89
95
94
93
94
92
94
94
82
94
86
91
85
85
86
81
85
89
85
85
87
78
91
82
81
81
82
82
79
81
81
76
82
78
80
79
79
79
74
79
84
78
84
81
74
83
83
83
83
84
84
81
83
81
76
83
80
83
80
80
81
74
79
84
79
81
82
74
84
82
81
81
82
82
79
81
79
76
82
78
80
78
78
80
74
79
83
79
84
80
74
81
94
94
94
92
93
92
94
88
84
89
89
92
86
86
89
83
87
92
90
90
89
79
94
94
94
94
92
93
92
94
88
84
89
89
93
86
86
90
83
87
92
91
90
89
80
94
94
97
97
96
97
95
97
93
84
93
87
93
89
89
93
84
87
94
90
89
91
79
94
95
95
94
93
95
92
94
91
86
92
90
93
85
85
91
84
89
92
92
89
89
82
93
92
94
94
92
92
92
94
87
84
90
91
92
84
84
87
84
87
90
88
88
89
80
93
Sb BCD 1392
Sb DSM 70412
Sc AB018539
Sp BCD 728
Sc DSM 1333
Scho DSM 70573
Schp AB018538
Schp BCD 773
Sd BCD 1257
Sd DSM 70487
Se MUCL 29838
Sp DSM 6580
Td DSM 70607
Yl AB018537
Yl BCD 2003
Yl BCD 2556
Zb BCD 1424
Zbi DSM 70415
Zf DSM 70506
Zm DSM 6959
Zr ATCC 48230
Io CBS 5147
Kl AB018535
Km BCD 2563
Km BCD 5186
Km BCD 811
Km DSM 70106
Km DSM 70792
Ku BCD 877
Le DSM 70320
Lt CBS 6340
Mp DSM 70321
Pa DSM 70277
Pan BCD 1082
Pan DSM 70783
Pc CBS 601
Pc DSM 70392
Pf BCD 861
Pfe BCD 711
Pfe DSM 70090
Pg BCD 804
Pm DSM 70178
Po BCD 862
Pp AB018536
Sb BCD 1256
Fortsetzung
Sb BCD 1256
Tab. 6.2:
Sb BCD 1256
100 92 100 96 99 96 79 76 76 96 95 95 92 92 81 81 81 94 94 94 98 94
Sb BCD 1392
100 92 94 91 94 78 76 76 94 93 93 87 98 81 82 79 88 88 92 94 89
Sb DSM 70412
100 96 99 96 79 76 76 96 95 95 92 92 81 81 81 94 94 94 98 94
Sc AB018539
100 95 100 79 77 77 100 99 99 93 94 83 84 83 94 94 96 96 93
Sp BCD 728
100 95 78 75 75 95 94 94 91 91 80 80 80 93 94 94 97 94
Sc DSM 1333
100 79 77 77 100 99 99 93 94 83 84 83 94 94 96 96 93
Scho DSM 70573
100 96 96 79 78 78 77 78 68 69 68 78 78 77 80 78
Schp AB018538
100 100 77 76 76 74 76 67 70 67 76 76 75 78 76
Schp BCD 773
100 77 76 76 74 76 67 70 67 76 76 75 78 76
Sd BCD 1257
100 99 99 93 94 83 84 83 94 94 96 96 93
Sd DSM 70487
100 98 92 93 83 84 83 93 93 95 95 92
Se MUCL 29838
100 92 93 82 84 82 93 93 95 95 92
Sp DSM 6580
100 87 79 82 80 91 91 93 92 90
Td DSM 70607
100 81 84 79 89 89 93 94 90
Yl AB018537
100 86 95 82 82 82 81 80
Yl BCD 2003
100 85 81 81 85 83 81
Yl BCD 2556
100 82 82 83 81 80
Zb BCD 1424
100 99 94 94 93
Zbi DSM 70415
100 94 94 94
Zf DSM 70506
100 94 93
Zm DSM 6959
100 95
Zr ATCC 48230
100
Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den Abkürzungen in der Abbildung 6.1.
123
6 Anhang
73
73
76
74
73
73
77
71
82
69
100
75
71
78
74
74
74
78
71
88
69
87
100
75
71
78
74
74
74
78
71
88
69
88
99
100
87
82
88
90
83
88
80
81
74
76
76
76
76
100
Sc AB018539
Trc DSM 70684
74
75
71
74
70
73
73
71
67
100
Spj DSM 70847
75
70
77
73
69
69
74
69
100
Spj BCD 778
86
78
81
86
86
83
82
100
Spj BCD 4982
81
81
80
87
80
77
100
Rm DSM 70408
Rg BCD 3530
88
75
82
86
89
100
Fn AF316889
82
75
82
86
100
Crh DSM 70067
Crf BCD 823
Crc DSM 70022
Crc BCD 2578
100 77 81 83
100 77 81
100 89
100
Crl BCD 824
Bd DSM 70745
Cra DSM 70197
Crc BCD 2578
Crc DSM 70022
Crf BCD 823
Crh DSM 70067
Crl BCD 824
Fn AF316889
Rg BCD 3530
Rm DSM 70408
Spj BCD 4982
Spj BCD 778
Spj DSM 70847
Trc DSM 70684
Sc AB018539
Cra DSM 70197
Distanz-Matrix: Prozentuale Übereinstimmung der EF-3 Aminosäuresequenzen innerhalb der Unterabteilung der Basidiomycota
Bd DSM 70745
Tab. 6.3:
31
33
32
28
34
31
28
33
31
31
31
31
30
30
100
Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den Abkürzungen in der Abbildung 6.1.
6.3
Real-Time RT-PCR
6.3.1
RNA-Extraktion
RNA wurde wie im Kap. 2.6.1 beschrieben extrahiert und die Eluate anschließend mit DNase I [Sigma-Aldrich] behandelt. Hierzu wurden 35 µl des Eluats mit 4 µl 10 x Reaktionspuffer
[Sigma-Aldrich] und 1 µl Amplification Grade DNase I [Sigma-Aldrich] versetzt und 30 min bei
37 °C inkubiert. Die Deaktivierung der DNase I erfolgte durch Zugabe von 4 µl Stop Solution
[Sigma-Aldrich] und Inkubation bei 70 °C für 20 min. Die Proben wurden direkt in der RTPCR eingesetzt oder bei -20 °C gelagert.
6.3.2
Real-Time One-Step RT-PCR
Alle Real-Time One-Step RT-PCR Versuche wurden mit einem LightCycler® 2.0 Instrument
in 20 µl LightCycler® Kapillaren durchgeführt und mit der LightCycler® Software 4.0 ausgewertet [Roche Diagnostics]. Die spezifische Amplifikation der Target-cDNA wurde bei dem
Einsatz von Hybridisierungssonden im Fluoreszenzkanal 640/Back 530 analysiert. Real-Time
PCR-Reaktionen zur Kontrolle des DNase-Verdaus wurden mit SYBR®-Green I [Molecular
Probes] durchgeführt und im Fluoreszenzkanal 530 ausgewertet. Die Real-Time RT-PCR
Versuche wurden mit dem LightCycler® RNA Master HybProbe Kit [Roche Diagnostics]
durchgeführt. Die Real-Time PCR-Reaktionen zur Kontrolle des DNase-Verdaus wurden mit
den gleichen Reagenzien, wie im Kap. 2.13 beschrieben, durchgeführt.
124
6 Anhang
6.3.3
Real-Time One-Step RT-PCR-Programm
Das One-Step RT-PCR-Programm mit Hybridisierungssonden bestand aus folgenden fünf
Teilprogrammen:
Teilprogramm
RT Reaktion
Denaturierung der cDNA
Amplifikation
Schmelzkurven-Analyse
Kühlen
Anzahl Zyklen
1
1
45
1
1
Analysis Mode
None
None
Quantification
Melting Curves
None
Die Teilprogramme hatten folgende Temperaturprofile:
RT Reaktion
Target
Hold
[°C]
[hh:mm:ss]
61
00:20:00
Ramp Rate
[°C/s]
20
Sec. Target
[°C]
0
Denaturierung der cDNA
Target
Hold
[°C]
[hh:mm:ss]
95
00:00:30
Ramp Rate
[°C/s]
20
Sec. Target
[°C]
0
Amplifikation
Target
[°C]
95
55
72
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:01
00:00:30
00:00:15
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
20
Sec. Target
[°C]
0
45
0
Schmelzkurven-Analyse
Target
Hold
[°C]
[hh:mm:ss]
95
00:00:00
40
00:01:00
70
00:00:00
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
0.1
Sec. Target
[°C]
0
0
0
Kühlung
Target
[°C]
40
Ramp Rate
[°C/s]
20
Sec. Target
[°C]
0
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:30
Step Size
[°C]
0
Step Size
[°C]
0
Step Size
[°C]
0
0.5
0
Step Size
[°C]
0
0
0
Step Size
[°C]
0
Step Delay
[cycles]
0
Acquisition
Mode
None
Step Delay
[cycles]
0
Acquisition
Mode
None
Step Delay
[cycles]
0
10
0
Acquisition
Mode
None
Single
None
Step Delay
[cycles]
0
0
0
Acquisition
Mode
None
None
Continuous
Step Delay
[cycles]
0
Acquisition
Mode
None
Das PCR-Programm mit SYBR®-Green I [Molecular Probes] zur Kontrolle des DNaseVerdaus bestand aus den folgenden vier Teilprogrammen:
Teilprogramm
Initiale Denaturierung
Amplifikation
Schmelzkurven-Analyse
Kühlen
Anzahl Zyklen
1
45
1
1
125
Analysis Mode
None
Quantification
Melting Curves
None
6 Anhang
Die Teilprogramme hatten folgende Temperaturprofile:
Initiale Denaturierung der cDNA
Target
Hold
Ramp Rate
[°C]
[hh:mm:ss]
[°C/s]
95
00:15:00
20
Sec. Target
[°C]
0
Amplifikation
Target
[°C]
95
55
72
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:01
00:00:30
00:00:15
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
20
Sec. Target
[°C]
0
45
0
Schmelzkurven-Analyse
Target
Hold
[°C]
[hh:mm:ss]
95
00:00:00
50
00:01:00
95
00:00:00
Ramp Rate
[°C/s]
20
20
0.1
Sec. Target
[°C]
0
0
0
Kühlung
Target
[°C]
40
Ramp Rate
[°C/s]
20
Sec. Target
[°C]
0
6.3.4
Hold
[hh:mm:ss]
00:00:30
Step Size
[°C]
0
Step Size
[°C]
0
0.5
0
Step Size
[°C]
0
0
0
Step Size
[°C]
0
Step Delay
[cycles]
0
Acquisition
Mode
None
Step Delay
[cycles]
0
10
0
Acquisition
Mode
None
None
Single
Step Delay
[cycles]
0
0
0
Acquisition
Mode
None
None
Continuous
Step Delay
[cycles]
0
Acquisition
Mode
None
Real-Time One-Step RT-PCR-Ansätze
Die One-Step RT-PCR wurde mit den Hybridisierungssonden und Primern für den Hefegesamtnachweis durchgeführt. Die Versuche wurden mit allen Sonden und Primern oder nur
mit den in der folgenden Tabelle aufgeführten Sonden und Primern durchgeführt.
Komponente
LightCycler RNA Master HybProbe (2,7-fach)
Mn(OAc)2 (50 mM)
3´-Primer-Mix HS11/I-IV (je 10 µM)
5´-Primer-Mix HT1r-3r (10 µM)
LC-Fluorecein Sonde Yff1 (10 µM)
LC-Red-640 Sonde Yfr4 (10 µM)
Probe
H2O
Volumen
7,5 µl
1,3 µl
0,4 µl
0,8 µl
0,1 µl
0,4 µl
5,0 µl
ad. 20 µl
Endkonzentration
1x
3,25 mM
0,2 µM (je Primer)
0,4 µM (je Primer)
0,05 µM
0,2 µM
Der Kontrollansatz mit SYBR®-Green I setzte sich wie folgt zusammen:
Komponente
10 x PCR-Puffer
MgCl2 (100 mM)
dNTP-Mix (je 10 mM)
BSA (30 µg/µl)
3´-Primer-Mix HS11/I-IV (je 10 µM)
5´-Primer-Mix HT1r-3r (10 µM)
SYBR®-Green I (100-fach)
Taq DNA Polymerase (5 U/µl)
Probe
H2O
Volumen
2,0 µl
0,6 µl
0,4 µl
1,0 µl
0,4 µl
0,8 µl
0,1 µl
0,4 µl
5,0 µl
ad. 20 µl
126
Endkonzentration
1x
3,0 mM
0,2 mM (je Nucleotid)
1,5 µg/µl
0,2 µM (je Primer)
0,4 µM (je Primer)
0,5-fach
2,0 U/Reaktion
6 Anhang
6.3.5
Ergebnisse der Real-Time One-Step RT-PCR
Die Eignung der Primer und Hybridisierungssonden des Real-Time PCR Hefegesamtnachweissystems in der Real-Time One-Step RT-PCR wurde mit aufgearbeitetem YM-Medium
(Kap. 6.3.1), das mit S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert wurde getestet. Bei
diesen Experimenten zeigte sich, dass beim Einsatz aller Komponenten (Primer und Sonden) keine One-Step RT-PCR möglich war. In den Reaktionsansätzen wurden ausschließlich
Primerdimere gebildet.
Nach Reduktion der verwendeten Primer- und Sondenanzahl (siehe Kap. 6.3.4) konnten bis
zu 102 Zellen/ml S. cerevisiae var. diastaticus mit der Real-Time One-Step RT-PCR nachgewiesen werden (Abb. 6.2). Nach Agarosegelelektrophorese wurden Amplifikate der gewünschten Länge detektiert (Abb. 6.3). Die Real-Time PCR mit SYBR®-Green zur Kontrolle
der DNase Behandlung zeigte, dass keine DNA in den Proben vorhanden war (Abb. 6.4). Die
mRNA des EF-3 Gens war demnach mit einem reduzierten System über Real-Time OneStep RT-PCR nachweisbar.
Abb. 6.2: Real-Time One-Step RT-PCR
Die Real-Time One-Step RT-PCR mit dem reduzierten Hefegesamtnachweissystem wurde mit aufgearbeitetem YM-Medium (Kap. 6.3.1) durchgeführt, das mit 106 Zellen/ml (grüne Linie), 105 Zellen/ml
(rote Linie), 104 Zellen/ml (schwarze Linie), 103 Zellen/ml (blaue Linie) oder 102 Zellen/ml (rote Punkte)
S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotiert war. Als Negativkontrolle (blaue Punkte) wurde
undotiertes YM-Medium verwendet.
127
6 Anhang
Abb. 6.3: Agarosegelelektrophorese nach Real-Time One-Step RT-PCR
Die Real-Time One-Step RT-PCR mit dem reduzierten Hefegesamtnachweissystem wurde mit aufgearbeitetem YM-Medium (Kap. 6.3.1) durchgeführt, das mit S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487)
dotiert war. Die Agarosegelelektrophorese wurde anschließend mit 5 µl der Reaktionsansätze in einem 2-%igen Gel durchgeführt (Kap. 2.8).
1: Molekulargewichtsmarker VI
2: undotiertes YM-Medium
3: 106 Zellen/ml S. c. var. diastaticus
4: 105 Zellen/ml S. c. var. diastaticus
5: 104 Zellen/ml S. c. var. diastaticus
6: 103 Zellen/ml S. c. var. diastaticus
7: 102 Zellen/ml S. c. var. diastaticus
Abb. 6.4: Schmelzkurven-Analyse zur Kontrolle des DNA Abbaus
Der vollständige Abbau der DNA in den Proben für die Real-Time One-Step RT-PCR mit dem reduzierten Hefegesamtnachweissystem wurde mit einer Real-Time PCR mit SYBR®-Geen I überprüft. Mit
S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) dotierte Proben: 106 Zellen/ml (grüne Linie), 105 Zellen/ml
(rote Linie), 104 Zellen/ml (schwarze Linie), 103 Zellen/ml (blaue Linie) oder 102 Zellen/ml (rote Punkte); Negativkontrolle: undotierte Probe (blaue Punkte); Positivkontrolle: 250 pg S. cerevisiae var. diastaticus (DSM 70487) DNA (schwarze Punkte).
128