Schnelle Chromatographie – Trends in der (U)HPLC

Schnelle Chromatographie –
Trends in der (U)HPLC
FF DS Business Review
Company Confidential
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1
Einfluss Säulenlänge
2
HPLC - Grundsituation - Trennung von zwei Peaks
w½
A B
t0
tR1
tR2
w
t‘R1
t‘R2
3
HPLC Parameter I
t0
Totzeit, Durchbruchszeit
Totvolumen [mL]
V 0 = t0 * f
f
Fluß [mL/min]
lineare Fließgeschwindigkeit [mm/sec]
u=
Säulenlänge [mm]
L
tR 1
Retentionszeit
Nettoretentionszeit
Kapazitätsfaktor - Retentionsfaktor
L
t0
t ′R 1
k1 =
tR 1 − t 0
t0
4
HPLC Parameter II
relative Retention, Trennfaktor
Bodenzahl pro Säule
Bodenzahl pro m
Bodenhöhe, HETP
Asymmetrie
Auflösung
α=
k2
k1
2
 tR1 
 tR1 
N = 16 *   oder N = 554
. *

 w1 
 w½ 1
2
2
 tR1  1000
N = 5.54 * 
 *
L
 w½1 
h=
L
N
As =
R = 1198
,
*
b
a
tR 2 − tR1
w½ 1 + w½ 2
5
Darstellung der Auflösung
6
Auflösung
Auflösung R für Peaks mit ähnlichen k‘-Werten
k ' +k '
k= 1 2
2
k
R = (α − 1) N
1+ k
1
4
Seite 7
7
Darstellung der Auflösung
Ausgangssituation
R ist zu klein
1. Möglichkeit
Retentionsfaktor erhöhen:
höherer Wasseranteil
k↑
→ tR ↑ , h ↓
2. Möglichkeit
Bodenzahl erhöhen:
Kleinere Korngröße
dp ↓
→ N ↑, h ↑, tR=
const.
3. Möglichkeit
Selektivität erhöhen:
bessere Phase, pH-Wert,
Mobile Phase
α↑
→ N , h , tR≈
const.
N = const.
8
Retention Faktor k
• Stationäre Phase:
%C↑ - k↑
Å↑ - k↓
• Mobile Phase:
%B ↑ - k↓
• pH-Wert:
Basen: pH↑ - k↑
Säuren: pH↓ - k↑
9
Einfluss des k-Wertes auf die Auflösung
002
002
001
Auflösung R
001
001
001
001
000
000
000
0
2
4
6
8
10
12
k-Wert
10
Bodenzahl - Einflussfaktoren
• Partikelgröße: dp ↓ - N↑, P↑
• Säulenlänge: L ↑ - N↑, P↑, tR↑
• Flussrate - Van Deemter Gleichung
• Systemkonfiguration
11
Erhöhung des Flusses
• bei doppeltem Fluss halbe Zeit
• dabei reduziert sich die
Bodenzahl i. d. R. nur um 10 - 30%
• Die Auswirkung auf die Auflösung ist aber
nur
N
⇒ sehr effektives Mittel zum Zeitgewinn
12
Selektivität α - Einflussfaktoren
• Stationäre Phase
• pH-Wert
• Mobile Phase
- organischer Modifier
- Puffer: Art und Konzentration
13
Notwendige Bodenzahl für versch. α: für R=1,5
6000,0
5000,0
Bodenzahl
4000,0
3000,0
2000,0
1000,0
,0
1
1,2
1,4
1,6
Selektivität α
1,8
2
2,2
14
Zusammenhang Chromatographischer Kenngrößen
Länge
100
100
100
100
Korngröße
10
5
3
1,5
N/m
40000
80000
133333
266667
Bodenzahl
4000
8000
13333
26667
Druck
10
40
111
444
Auflösung (rel)
63
89
115
163
700
Länge
100
100
100
100
Korngröße
100
50
30
15
N/m
100
200
333
667
Bodenzahl
100
200
333
667
Druck
100
400
1111
4444
Auflösung (rel)
100
141
183
258
5000
4500
600
4000
500
3500
Länge
400
Länge
3000
Korngröße
Korngröße
N/m
300
Bodenzahl
N/m
2500
Bodenzahl
2000
Druck
Auflösung (rel)
Auflösung (rel)
1500
200
1000
100
500
0
0
1
2
3
4
1
2
3
4
15
Core Competency in Silica Manufacturing
! For over 80 years Grace has been at the forefront of silica
technology.
! Today Grace is one of the largest silica manufacturers in the
world.
Silica Materials
+
Surface Science
Enhance Performance
CH3
Cx
=
Markets & Products
Drug Discovery
Analytical
Drug Production
SI
O
CH3
SI
SI
SiO2
CH3 Cx
SI
O
CH3
Preparative
CH3
Cx
O SI
SI
CH3
Process
116
6
VisionHT Media Platform
Different Systems, Different Applications,
One Media Platform.
See a path to greater productivity with a media
platform that delivers performance and speed on
any LC system
! Seamless media available in 1.5um to 10um
! High throughput column technologies
! Unique and widely varied phase chemistries
High performance particle technology solves the challenges of modern laboratories
17
Product Line Scope and Definition
VisionHT High Purity Silica
Identical silica particle in 1.5, 3, 5, 10um
Apply to six phase Chemistries
Six Phase Chemistries
C18 Polar
C18 Basic
C18 High Load
C18 Classic
Silica
HILIC
Pack in multiple column formats
UHPLC
Rocket
Expedite
Analytical
Prep
Meets the needs of fast LC, standard analytical, and preparative chromatography
18
Broad Selectivity Options
19
Six factors control RP selectivity
! Choose Phases based on interactions with key sample components.
Snyder/Carr/Dolan Coefficients
Snyder Average 94 phases
Vision C18HL
Vision C18
Vision C18B
Vision C18P
2
Ionic Activity
@ pH7
1.5
Hydrophobicity
1
Ionic Activity
@ pH2
H-bonding
Base
0.5
H-bonding
Acids
Steric
Resistance
0
H
Sr
A
B
C2.8
C7
-0.5
Most Reversed Phases have the same selectivity. VisionHT Phases are different.
20
Improved Peak Identification
Competitive columns need higher organic concentrations to accomplish
assays in the same time frames as VisionHT™ series columns. Higher initial
organic concentrations can result in some of the more polar impurities being
eluted into the void volume.
21
Unique Approach to Phase Chemistries
! Most Commercial reversed phase columns thoroughly cover silica
surface to minimize interaction
! VisionHT Controlled Silica Exposure gives unique mixed-mode
Separations
1. Procaine
2. Lidocaine
3. Tetracaine
4. Diphenhydramine
1. GY (238 Da)
2. VYV (379 Da)
3. Met Enkephalin
(YGGFM, 573 Da)
4. Leu Enkephalin
(YGGFL, 555 Da)
5. Angiotensin II
(DRVYIHPF, 1045 Da)
VisionHT C18 Polar separates highly
polar pharmaceuticals,
VisionHT C18 Basic resolves complex
peptide mixtures quickly
VisionHT Phases Works always !
22
Säulenauswahl
Column:
Grom-Sil 120 ODS-4 HE, 10 µm, 50 x 4,6 mm
ACN/Wasser = 58/42; 3 mL/min
23
Sationäre Phasen - Eigenschaften?
Charakterisierung von Stationären Phasen:
• Basismaterial:
Silica, PS/DVB, Zirkoniumdioxid, Hybridmaterialien
• Porengröße:
60, 80, 100, 120, 150, 200, 300 Å
• Oberfläche:
500 bis 50 m2/g
• Belegung:
C30, C18, C8, Phenyl, C4, CN, Diol, Amino, TMS
AQ/HE Type, EPS, embedded, shielded
monomer, dimer / polymer
• Reinheit: Fremdmetalle wie Eisen, Aluminium, …
• Belegungsdichte
24
Vergleich Fused Core / Total Porös
Quelle: http://fortis-technologies.com/UHPLC.html, 20.10.2013
25
3 u. 5 µm bei hohen Flussraten
Dr. Stefan Lamotte,
HPLC-Tage 2012
Seite 26
26
Einfluß der Porengröße
Lorazepam:
Naphtalin
Quelle: MZ-Analysentechnik: Halo Prospekt
Quelle: Wikipedia
27
Übersicht Fused Core
Oberfläche Porengröße
Dichte
Oberfläche
V0
tR für k=10
pro Säule
für 100 x 4.6 mm
bei 1mL/min
m2/g
A
g/mL
m2
mL
min
2
-
2,0
7
0,65
7,15
Fused Core
100
90
0,7
116
0,90
9,90
TPS
320
100
0,5
266
1,20
13,20
NPS
28
Einflußfaktoren Gradient:
Steigung: % / min
Wird festgelegt über:
Start- und Endkonzentrationen, Zeit
Gradientenvolumen: ml
Wird festgelegt über:
Flussrate, Zeit
29
Gradient - Vorgehensweisen
Anpassen von vorhandenen Gradienten
Lineare Anpassung: die Zeit wird im gleichen Verhältnis
angepasst, wie sich die Säulenlänge verändert:
halbe Säulenlänge = halbe Gradientenzeiten
Konstantes Gradientenvolumen: die Zeit wird im gleichen
Verhältnis angepasst, wie sich die Säulenlänge verändert und
gleichzeitig die Flussrate so verändert, dass immer gleichviel
Eluent durch die Säule fließt
halbe Säulenlänge = halbe Gradientenzeiten + doppelte Flußrate
Siehe Excelsheet: jmr up/down scaling
30
Gradient - Vorgehensweisen
Neue Gradienten
Steigung / Zeiten: Bei unbekannten Substanzen - Screeninggradient
5% - 95% B
Pro cm Säulenlänge 1 – 2 min
→ 5 cm Säulenlänge = 5 – 10 min Gradientenlänge
→ 2 verschiedene Steigungen testen
Gradientenvolumen:
wird über die Flußrate angepaßt
→ Standardfluß +50% und –50% testen
31
Gradientenelution: Optimierung über das Gradientenvolumen (VGr)
VGr = F ⋅ tGr
Gradientenelution
N K 140
120
N K = Anzahl der theoretisch
trennbaren Komponenten
100
VGr = Gradientenvolumen
80
60
40
20
0
0
© Kromidas
100
200
300
400
500
600
VGr / mL
32
Gradientenelution: Optimierung über das Gradientenvolumen (2)
(...zwischen 2 und 20 Säulenvolumina)
Einige Beispiele für „optimale“ Gradientenvolumina abhängig von der Fragestellung
VK: Säulenvolumen z.B. für 125 x 4mm = t0 x F ~ 1,0 ml
Übliche Problematik
VGr: 5 < VK < 15
MultikomponentenMischung
VGr: >15 VK
d.h. > 20 ml
Spurenbereich
VGr: < 5 VK
d.h. < 6 ml
Grenze
VGr: ≈ 2 VK0
d.h.
© Kromidas
d.h. ≈ 6 ml – 19 ml
2,5 ml
33
Gradienten - Test - 2
34
Alternativen zu Acetonitril
Umrechnung der Eluentenzusammensetzung
mit dem Löslichkeitsparameter δ
Acetonitril
δA
23,9
δ = Löslichkeitsparameter
Wasser
δW
47,8
φ = Volumenanteil
Methanol
δM
29,4
Mischung
δm
35,85
δm = Σi φi δi
35
Alternativen zu Acetonitril: Methanol
100
90
Methanol (%V/V)
80
70
60
50
40
30
20
10
00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Acetonitril (%V/V)
36
Alternativen zu Acetonitril: THF
100
90
80
THF (%V/V)
70
60
50
40
30
20
10
00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ACN (%V/V)
37
Alternativen zu Acetonitril: Methanol
Säulentestmix:
Standardeluent:
Uracil
ACN : Wasser = 58 : 42
Phenol
N,N-Diethyl-M-Toluamid
Berechnet:
Toluol
MeOH : Wasser = 75 : 25
Angepasst:
MeOH : Wasser = 65 : 35
38
Alternativen zu Acetonitril: Methanol
Alltima C18, 3 µm;
ACN : Wasser = 58 : 42
100 x 2 mm
MeOH : Wasser = 75 : 25
Standard C18
MeOH : Wasser = 65 : 35
39
Alternativen zu Acetonitril: Methanol
ACN : Wasser = 58 : 42
Platinum C18, 3 µm;
100 x 2 mm
MeOH : Wasser = 75 : 25
Polare C18 Phase
MeOH : Wasser = 65 : 35
40
Alternativen zu Acetonitril: Methanol
ACN : Wasser = 58 : 42
Genesis Phenyl, 4 µm;
100 x 2 mm
MeOH : Wasser = 75 : 25
MeOH : Wasser = 65 : 35
41
Einfluss: Säulen ID
(Peakfläche / Säuleninnendurchmesser)
Breyer, M.; Twele, M.; Schmeer, K.; Földi, P.
area
16000000
peak area (pentyl benzoate), found
theoretical value of peak area
14000000
Stationäre Phase:
GROM Saphir 110 C18 - 5 µm
12000000
Säulendimension:
125 mm x 0,05 mm - 4,6 mm ID
6000 0
10000000
4000 0
8000000
Eluent: 20% H2O, 80% ACN (v/v)
2000 0
Fluß (lin. vel.): 0,80 mm/s,
6000000
Temperatur: R, Detektor: 254 nm
0
800 µ m
4000000
1 mm
2 mm
3 mm
4 mm
4, 6 mm
Flusszelle: 0,2mm, 50nl
Injektion: 30 nl
2000000
Probe: Alkylbenzoate (20-75mg/ml)
0
50 µm
100 µm
200 µm
300 µm
500 µm
800 µm
1 mm
2 mm
3 mm
4 mm
4,6 mm
column id
42
Säulenofen / Temperatur
• hohe Temperatur = niederere Viskosität
⇒ geringerer Druck
• oft besserer Stoffaustausch
Vorsicht: auch Änderung der Selektivität!
43
Detektoren für die HPLC
Selektivität, Empfindlichkeit, Verfügbarkeit
• UV (multi Channel, Fast scan, Diodenarray)
• Mass Spectrometer
• Light Scattering Detektor
• Fluoreszenz Detektor (Laser)
• NMR
• RI-Detektor
• Leitfähigkeitsdetektor
• ECD - Electro chemischer Detektor
• Polarimeter
• Radioactivität
44
How Does ELS Detection Work?
Step 1: Nebulization
! Column effluent mixes with gas flow to form a dispersion of
droplets
Step 2: Mobile Phase Evaporation
! Mobile phase evaporates from around sample particle
leaving dried particles in solvent vapor
Step 3: Detection
! Sample particles pass through laser light in a flow cell. The
particles scatter light that is collected by a photodiode
Benefits of ELS Detection In Flash Chromatography
! Allows purification of non-chromophoric molecules
! Allows you to see impurities not seen by UV
! Gives a more accurate indication of relative quantities than UV
! Give you the freedom to choose UV absorbing solvents
ELSD detects any compound less volatile than mobile phase
45
ELS Detection Detects all of the Components in a Sample
Nonchromophores
NOT VISIBLE
UV
! HPLC analysis of 4
compounds
! With equivalent
amounts of each
Nonionized compounds
NOT VISIBLE
MS
Detects all
NONVOLATILES
Even NMR misses
impurities such as
salts
ELS Detection
Detecting all components eliminates guesswork and wasted time
46
Detektoren für die HPLC
Detector
UV, single, dual, ..
DAD
Fluorescenz
Ri
Light Scattering
MS
NMR
ECD
Conductivity
Polarimeter
Radioactivity
Detection Limit
5 – 10–10 g/mL
5 – 10–10 g/mL
10–12 – 10–13 g/mL
10–7 – 10–8 g/mL
10–8 – 10–9 g/mL
10–9 – 10–15 g/mL
10–12 – 10–13 g/mL
10–7 – 10–8 g/mL
10–7 – 10–8 g/mL
10–10 g/mL
Sensivity Selectivity
+
+
+
+(+)
++
++
+
++
++(+)
+
+++
++
++
+
+
++
+
++
47
Einfluss: Flow Cell -Radiodetection
intensity [cps]
Breyer, M.; Twele, M.; Schmeer, K.; Földi, P.
13
11
a)
9
7
8 µ L c e ll
5
3
1
5
7
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
t [m in ]
b)
6
5
4
3 µ L c e ll
3
2
1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
t [m in ]
S t a t io n ä r e P h a s e : N u c lo e s il 1 0 0 C 1 8 H D , S ä u le n d im . : 1 2 5 x 1 m m 3 µ m , F lu ß r a t e : 3 7 .5 µ L /
m in , E lu e n t : A : 1 0 m M N H 4 A c p H 3 .0 , B : A C N , F lu ß z e lle : a ) 8 µ L ,
b ) 3 µ L , P ro b e :
D ru g +
M e ta b o lite , I n je k t io n : 4 0 µ L
48
Grenzwerte für High Speed und Micro LC
1. Gradientendelayvolumen
= Volumen: Ventil – T-Stück / Mischkammer – Pumpe – Injektor
Dieses Volumen muß in < 1,0 min durchgespült werden !
2. Flow Cell Volumen
Dieses Volumen muß < 1/20 des Peakvolumens des 1. Peaks sein!
(Gute Kapillarverbindungen vorausgesetzt)
3. Data sampling rate/ rise time
Der Standardwert des Systems muß um 5 - 10x erhöht werden!
( rise time: 0.1 sec)
49
Einfluss Peakbreite / Bodenzahl
Partikelgröße
Bodenzahl
für 100 x 4.6
mm
tR für k=5
Peakbreite
für k = 5
min
0,288
0,258
0,223
0,212
0,182
0,168
0,158
10x
25x
50x
29
26
22
21
18
17
16
11,5
10,3
8,9
8,5
7,3
6,7
6,3
5,8
5,2
4,5
4,2
3,6
3,4
3,2
0,199
0,178
0,146
0,116
0,102
20
18
15
12
10
8,0
7,1
5,9
4,6
4,1
4,0
3,6
2,9
2,3
2,0
TPS
TPS
TPS
TPS
TPS
TPS
TPS
µm
5
4
3
2,7
2
1,7
1,5
10.000
12.500
16.667
18.519
25.000
29.412
33.333
bei 1mL/min
min
7,20
7,20
7,20
7,20
7,20
7,20
7,20
Fused Core
Fused Core
Fused Core
Fused Core
Fused Core
5
4
2,7
1,7
1,3
11.765
14.706
21.786
34.602
45.249
5,40
5,40
5,40
5,40
5,40
empf. Messzellenvolumnen [µL]
50
Einfluss Peakbreite / Bodenzahl
Partikelgröße
TPS
TPS
TPS
TPS
TPS
TPS
TPS
µm
5
4
3
2,7
2
1,7
1,5
Fused Core
Fused Core
Fused Core
Fused Core
Fused Core
5
4
2,7
1,7
1,3
Bodenzahl
tR für k=5
Peakbreite
für 100 x 2 mm bei 189 µL/min für k = 5
min
min
10.000
7,20
0,288
12.500
7,20
0,258
16.667
7,20
0,223
18.519
7,20
0,212
25.000
7,20
0,182
29.412
7,20
0,168
33.333
7,20
0,158
11.765
14.706
21.786
34.602
45.249
5,40
5,40
5,40
5,40
5,40
0,199
0,178
0,146
0,116
0,102
empf. Messzellenvolumnen [µL]
10x
25x
50x
5
5
4
4
3
3
3
2,2
1,9
1,7
1,6
1,4
1,3
1,2
1,09
0,97
0,84
0,80
0,69
0,63
0,60
20
18
15
12
10
1,5
1,3
1,1
0,9
0,8
0,75
0,67
0,55
0,44
0,38
51
Data sampling rate / rise time
300000,00
250000,00
200000,00
10/sec
5/sec
2,5/sec
1,25/sec
150000,00
100000,00
50000,00
0,00
3,9000
4,0000
4,1000
4,2000
4,3000
4,4000
52
Systemvergleich mit Säule: 50 x 4.6 mm
0 min
5% B
2 min
5% B
8 min 60% B
10 min 60% B
11 min 5% B
14 min 5% B
A: Wasser mit TFA auf pH 2,5
B: ACN
Säule 50 x 4.6 mm, 5 µm
1 mL / min
53
Systemvergleich mit Säule: 50 x 4.6 mm
04020401 #8 [modified by LabEAHPLC_01]
mAU
Testmischung
UV_VIS_1
WVL:230 nm
6,91 min
120
100
7,63 min
7,47 min
6,76 min
7,83 min
5,91 min
20
7,31 min
1,28 min
40
6,43 min
5,72 min
60
6,17 min
1,00 min
80
min
-10
0,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
04020402 #7 [modified by LabEAHPLC_01]
mAU
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
12,0
13,0
Testmischung (1 : 1 verdünnt mit H/0072/04)
14,0
UV_VIS_1
W VL:230 nm
7,08 min
5,22 min
20
6,68 min
6,54 min
1,68 min
40
5,66 min
5,37 min
5,04 min
60
5,98 min
80
6,86 min
6,29 min
100
1,0
0
min
-20
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
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10,0
11,0
12,0
13,0
14,0
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