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Forschungsbericht Förderkennzeichen 02WS181A
MAL GmbH
Schlussbericht
Forschungsprojekt
Verbundvorhaben: Labor- und halbtechnische
Untersuchungen zur Entwicklung eines Algenreaktors für
die Anreicherung von Methan in Biogasen der anaeroben
Klärschlammfaulung, Teil I
Förderkennzeichen 02WS181A
Ausführende Stelle:
MAL
Mikrobiologisch-analytisches Labor GmbH
Jahnsdorfer Straße 7
09366 Stollberg
Projektleiter:
Dr. Dr. sc. K. Trommler
Telefon:
Fax:
E-Mail:
Projektdauer:
037296 16111
037296 16165
[email protected]
01. Aug. 2001 bis 31. Juli 2003,
verlängert bis 30. Juni 2005
___________
Ort, Datum
__________________________
Dr. Dr. sc. K. Trommler
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MAL GmbH
Das diesem Bericht zugrunde liegende Vorhaben wurde mit Mitteln des Bundesministeriums für
Bildung und Forschung unter dem Förderkennzeichen 02WS181A gefördert. Die Verantwortung für
den Inhalt dieser Veröffentlichung liegt beim Autor.
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MAL GmbH
Inhaltsverzeichnis
1
2
3
4
4.1
4.2
5
6
6.1
6.1.1
6.1.2
6.1.3
6.1.4
6.2
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.3
6.3.1
6.3.2
6.3.3
6.3.4
6.4
6.4.1
6.4.1.1
6.4.1.2
6.4.1.3
6.4.1.3.1
6.4.1.3.2
6.4.1.3.3
6.4.1.3.4
6.4.1.4
6.4.1.4.1
6.4.1.4.2
6.4.1.4.3
6.4.1.5
6.4.1.5.1
6.4.1.5.2
6.4.1.5.3
6.4.1.6
6.4.1.7
6.4.2
Aufgabenstellung ............................................................................................................ 5
Voraussetzungen, unter denen das Vorhaben durchgeführt wurde............................ 6
Planung und Ablauf des Vorhabens .............................................................................. 6
Wissenschaftlicher und technischer Stand, an den angeknüpft wurde ...................... 6
Bekannte Verfahren und Schutzrechte, die für die Durchführung des Vorhabens benutzt
wurden .............................................................................................................................. 6
Verwendete Fachliteratur................................................................................................... 7
Zusammenarbeit mit anderen Stellen ............................................................................ 8
Ergebnisse und Verwertbarkeit der Ergebnisse............................................................ 9
Schaffung eines funktionstüchtigen Reaktorsystems zur Prüfung der Verwertbarkeit von
Biogas für die Mikroalgenproduktion.................................................................................. 9
Prinzip ............................................................................................................................... 9
Getestete Röhrenreaktorsysteme ...................................................................................... 9
Aufbau eines speziellen Blasenreaktorsystems ............................................................... 11
Verwertung...................................................................................................................... 11
Auswahl geeigneter Mikroalgenspezies für die Anzucht unter Verwendung von Biogas .. 12
Vorstellung der getesteten Mikroalgenspezies................................................................. 12
Ermittlung der optimalen Kultivierungsbedingungen ........................................................ 15
Untersuchungen zum Vergleich der CO2-Verwertung durch verschiedene Algenspezies 18
Auswahl der geeigneten Spezies..................................................................................... 19
Anzucht der ausgewählten Mikroalgenspezies unter Verwendung von Biogas im
speziellen Blasenreaktorsystem ...................................................................................... 20
Eingesetzte Gase ............................................................................................................ 20
Aufbau eines Testsystems zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Abfallgasen............ 21
Anzucht von Chlorella vulgaris......................................................................................... 24
Anzucht von Chlamydomonas reinhardtii......................................................................... 29
Möglichkeiten zur Verwertung der Biomasse................................................................... 31
Analytik der untersuchten Mikroalgen hinsichtlich verwertbarer Inhaltsstoffe................... 31
Einleitung ........................................................................................................................ 31
Photometrische Bestimmung des Pigmentgehaltes in der Flüssigkultur .......................... 31
Analytik der Carotinoide .................................................................................................. 33
Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Astaxanthin .................... 33
Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Lutein und -Carotin....... 38
Entwicklung einer In-Prozess-Kontrolle (IPC) für die Akkumulation von Astaxanthin ....... 39
Carotinoid-Gehalte in Haematococcus pluvialis............................................................... 40
Analyse des Proteingehaltes ........................................................................................... 42
Methoden ........................................................................................................................ 42
Ergebnisse der Ermittlung des Proteingehaltes über den Gesamtstickstoff-Gehalt.......... 42
Ergebnisse der Bestimmung des Proteingehaltes nach LOWRY ....................................... 42
Identifizierung und Quantifizierung von Fettsäuren.......................................................... 43
Methode .......................................................................................................................... 43
Fettsäurespektren in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer........................................ 43
Fettsäurezusammensetzung der Mikroalgen ................................................................... 44
HPLC-Analytik von Vitaminen und deren Zersetzungsprodukten..................................... 45
Zusammenfassung.......................................................................................................... 47
Nutzung als Düngemittel.................................................................................................. 47
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6.4.3
6.4.3.1
6.4.3.2
6.4.3.3
6.4.4
6.4.5
6.5
6.5.1
6.5.2
6.5.2.1
6.5.2.2
6.5.2.3
6.5.2.4
6.5.3
6.6
6.7
7
8
MAL GmbH
Rückgewinnung von Phosphat ........................................................................................ 50
Anzucht von Mikroalgen unter Verwendung von Abwasser ............................................. 50
Eliminierung von Phosphat aus Abwässern durch Mikroalgen und dessen biologische
Akkumluation................................................................................................................... 50
Vergärung der Algenbiomasse ........................................................................................ 52
Verwertung...................................................................................................................... 53
Möglichkeiten zur Verwertung des gereinigten Gases ..................................................... 54
Eignung des gereinigten Gases für den Antrieb von Motoren .......................................... 54
Eignung des gereinigten Gases für die Anzucht methanverwertender Bakterien ............. 55
Einleitung ........................................................................................................................ 55
Wachstumsversuche zum Vergleich der Eignung verschiedener Gase ........................... 57
Methanverbrauch zum Aufbau von Biomasse.................................................................. 58
Weitere Verwertungsmöglichkeiten ................................................................................. 59
Fugataufbereitung und Nutzung als Nährstoffe................................................................ 59
Bemessungsparameter für ein scale-up .......................................................................... 60
Bekannt gewordener Fortschritt auf dem Gebiet des Vorhabens.............................. 62
Erfolgte oder geplante Veröffentlichungen ................................................................. 62
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MAL GmbH
Teil I – Formales
1
Aufgabenstellung
Aus dem ursprünglichen Projektantrag der energy of nature Projektgesellschaft für umwelttechnische Anlagensysteme Leipzig mbh (EON) gingen die im Folgenden genannten
Zielstellungen hervor:
Entwicklung eines Verfahrens auf der Grundlage eines Patents [1] von EON im
labortechnischen Maßstab und einer Anlage zur biologischen Trennung von Biogas in Methan
und Kohlendioxid mit dem Ziel der Annäherung des Brennwertes und der Qualität des
Biogases an die von Erdgas sowie die Nutzung des CO2 zum photosynthetischen Aufbau
energiereicher Algenbiomasse
Untersuchung der Eignung des gereinigten Biogases für den Betrieb von Erdgasmotoren in
Kfz, die Einspeisung in Gasleitungen oder für Erdgas-BHKWs
Untersuchung des Effektes der „biologischen Gaswäsche“ auf die Reduzierung von
Siliciumverbindungen und die weitergehende H2S-Reduzierung im Biogas
Untersuchung der Verwertungsalternativen der produzierten Biomasse
-
Rückführung der Biomasse in die Faulungsanlage zur Erhöhung des Inputs
-
Verwertung als Futtermittel/Dünger
-
Extraktion von algenbürtigen Wertstoffen
Gewinnung der für den Aufbau der Algenbiomasse benötigten Nährstoffe aus dem bei der
Entwässerung des Gärrückstandes anfallenden Fugat
Prüfung der rechtlichen und technischen Lage für die stoffliche Verwertung der Algenbiomasse
Verfahrensentwicklung im labor- und halbtechnischen Maßstab mit folgenden Zielen
-
grundsätzlicher Nachweis des Verfahrensablaufes
-
Ermittlung der optimalen Randbedingungen
-
Bemessungsparameter und Auslegung für eine Pilotanlage
Von der MAL GmbH wurden die Aufgaben im Verlauf der Bearbeitung folgendermaßen präzisiert:
Entwicklung eines kommerziell verwertbaren Verfahren-/Anlagensystems zur Produktion von
Biomasse unter Verwertung von Biogas im Labormaßstab
Erzeugung von höherwertigerer Biomasse aus Biogas
Entwicklung von Produkten bzw. Prüfung der Verwertbarkeit in den Bereichen funktionelle
Lebens-/Futtermittel bzw. Grundstoffe für die Pharmaindustrie
Biogasreinigung mittels Mikroalgen zur Erzeugung eines direkt verwertbaren Biogases
Umwandlung von Sonnenenergie in elektrische Energie und Wärmeenergie über die
Zwischenschritte Biogas und Biomasse
Rückführung der Abfallbiomasse in den Biogaskreislauf
Reduzierung der unmittelbaren Kohlendioxidemission
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2
MAL GmbH
Voraussetzungen, unter denen das Vorhaben durchgeführt wurde
Wie bereits im Abschnitt 1 erwähnt, wurde das Vorhaben ursprünglich von der energy of nature
Projektgesellschaft für umwelttechnische Anlagensysteme Leipzig mbh (EON) beantragt. Nach der
Insolvenz des genannten Unternehmens wurden alle Rechte und Pflichten des anfänglichen
Zuwendungsempfängers EON von der MAL Mikrobiologisch-analytisches Labor GmbH
übernommen.
3
Planung und Ablauf des Vorhabens
Für das Vorhaben war ursprünglich eine Laufzeit vom 01. Aug. 2001 bis zum 31. Juli 2003
vorgesehen. Vom Projektträger wurde eine Verlängerung des Bewilligungszeitraumes über den
31. Juli 2003 hinaus bis zum 31. Dez. 2004 bzw. bis zum 30. Juni 2005 genehmigt. In dem
genannten Zeitraum wurden die vorgestellten Aufgabenstellungen zielgerichtet verfolgt.
4
Wissenschaftlicher und technischer Stand, an den angeknüpft wurde
4.1
Bekannte Verfahren und Schutzrechte, die für die Durchführung des Vorhabens
benutzt wurden
Die Durchführung des Vorhabens erfolgte auf der Grundlage einer Patentschrift [1] des
ursprünglichen Antragstellers EON. Darin wurde ein Verfahren zur photobiologischen Trennung
von kohlendioxid- und methanhaltigen Gasgemischen beschrieben. Das Verfahren beinhaltet „eine
Vorrichtung, die aus einem mit einer Lichtquelle versehenen und an die Gasleitung des
Biogasreaktors angeschlossenen Assimilator, in dem Algenbiomasse Kohlendioxid aus einem
Gemisch brennbarer Gase aufnimmt, einem gegen Lichteinwirkung abgeschirmten Dissimilator, in
dem die Algenbiomasse das Kohlendioxid wieder abgibt, und einem Photosynthesereaktor
besteht, der mit dem Kohlendioxid versorgt wird, wobei Assimilator und Dissimilator durch
Rohrleitungen, die dem Transport der Algenbiomasse dienen, verbunden sind und der Dissimilator
mit dem Photosynthesereaktor durch eine Rohrleitung zur Entnahme von Algenbiomasse
verbunden ist“. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ergab sich aus der
vermuteten Eigenschaft von Algen, unter Stressbedingungen Kohlendioxid gasförmig
aufzunehmen, in der Zelle zu speichern und unter veränderten Bedingungen gasförmig wieder
freizusetzen. Im Laufe der Projektbearbeitung durch die MAL GmbH wurde festgestellt, dass diese
Annahme experimentell nicht realisierbar war. In Abstimmung mit dem Projektträger wurden
jedoch weitere, ebenfalls in der Patentschrift genannte Ansatzpunkte untersucht:
photobiologische Trennung von kohlendioxid- und methanhaltigen Gasgemischen, indem das
Kohlendioxid aus dem Gasgemisch von Algenkulturen in geschlossenen Systemen unter
Lichteinwirkung aufgenommen und durch Photosynthese in Algenbiomasse und Sauerstoff
umgewandelt wird
wenigstens teilweise Zuführung des Gasgemisches nach Abtrennung von Kohlendioxid zu
einem Verbrennungsprozess
wenigstens teilweise Nutzung des Gasgemisches nach Abtrennung von Kohlendioxid zur
Kultivierung von methanotrophen Mikroorganismen
Verwendung der photosynthetisch aufgebauten Algenbiomasse zur
- Ernährung von nicht photosynthetisch aktiven Organismen
- Extraktion von Wertstoffen und anaerobe Vergärung der Extraktionsrückstände
- Vergärung zwecks Umsetzung zu Biogas
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MAL GmbH
4.2
Verwendete Fachliteratur
[1]
Patentanmeldung 197 21 280.8-43
Verfahren und Vorrichtung zur photobiologischen Trennung von Kohlendioxid- und
methanhaltigen Gasgemischen, 1997
[2]
Streble, H., Krauter, D.: Das Leben im Wassertropfen, 9. Auflage, Franckh-Kosmos
Verlag-GmbH & Co, Stuttgart, 2002
[3]
Borowitzka, M., Borowitzka, L.: Microalgal biotechnology, Univsity Press, Cambridge,
1988
[4]
Jander, F.: Massenkultur von Mikroalgen mit pharmazeutisch nutzbaren Inhaltsstoffen
unter Verwendung von CO2 und NaHCO3 gewonnen aus den Abgasen eines
Blockheizkraftwerkes, Dissertation, Christian-Albrechts-Universität Kiel, 2001
[5]
Boussiba, S., Bing, W., Yuan, J.-P., Zarka, A., Chen, F.: Changes in pigment profile in
the green alga Haematococcus pluvialis exposed to environmental stresses,
Biotechnology Letters 21 (1999) 601-604
[6]
Campbell, N. A. (Dt. Übers. hrsg. von Markl, J.): Biologie, Spektrum Akademischer
Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1997
[7]
www.expasy.org/cgi-bin, verfügbar im Dezember 2004
[8]
IGV GmbH: Jahresbericht 1997/98; www.igv-gmbh.de, verfügbar Juni 2004
[9]
Kohl, J. G., Nicklisch, A.: Ökophysiologie der Algen; Akademieverlag Berlin, 1988
[10]
Die Photosynthese und ihre Umweltfaktoren; verfügbar im Dezember 2005
http://www.vobs.at/bio/botanik/b-photosynthese-2.htm
[11]
Bericht zum AiF-Projekt FKV 0374103J8 Algenverwertung, August 2001
[12]
Schulze, C.: Gewinnung und Identifizierung von nutzbaren Verbindungen aus den
Nährlösungen und Biomassen von Mikroalgen, Dissertation, Christian-AlbrechtsUniversität Kiel, 2000
[13]
Margie Thomason Cyanotech Corporation BioAstin/NatuRoseTM Technical Bulletin:
HPLC and spectrophotometric analysis of carotenoids from Haematococcus algae
powder
[14]
Kromidas, S.: Handbuch Validierung in der Analytik, Verlag Wiley-VCH, Weinheim, 2000
[15]
Gong, X., Chen, F.: Optimization of culture medium for growth Haematococcus pluvialis,
Journal of Applied Phycology 9 (1997) 437-444
[16]
Norm EN 25663:1993: Bestimmung des KJELDAHL–Stickstoffs (Verfahren nach
Aufschluss mit Selen), Stand: September 1993
[17]
Bitterlich, C.: Diplomarbeit; TU Bergakademie Freiberg, 2004
[18]
Lottspeich, F., Zorbas, H.: Bioanalytik, Spektrum-Verlag, Berlin Heidelberg, 1998
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MAL GmbH
[19]
Schlee, D. , Kleber, H.-P.: Wörterbücher der Biologie – Biotechnologie, Gustav Fischer
Verlag Jena, 1991
[20]
Tokusoglu, Ö., Ünal, M.K.: Biomass Nutrient Profiles of three Microalgae: Spirulina
platensis, Chlorella vulgaris and Isochrysis galbana, Journal of Food Science 68 [4] 2003
[21]
www.wegbegleiter.menetekel.de, verfügbar Juni 2004
[22]
www.wellness-paket.de, verfügbar Juli 2004
[23]
www.mlur.brandenburg.de, verfügbar im Januar 2005
[24]
Schlegel, H.G.: Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag Stuttgart, 1992
[25]
Wise, M.G., McArthur, J.V., Shimkets, L.J.: Methylosarcina fibrata gen. nov., sp. nov. and
Methylosarcina quisquillarum sp. nov., novel type I methanotrophs, International Journal
of Systematic and Evolutionary Microbiology 51 (2001) 611-621
[26]
Whittenbury, R., Phillips, K.C., Wilkinson, J.F.: Enrichment, isolation and some
properties of methane-utilizing bacteria, J. Gen. Microb. 61 (1970b) 205-218
[27]
www.ukncc.co.uk, verfügbar im Oktober 2004
[28]
Bowman, J.P., Sly, L.I., Nichols, P.D., Hayward, A.C.: Revised taxonomy of the
methanotrophs: description of Methylobacter gen. nov., emendation of Methylococcus,
validation of Methylosinus and Methylocystis species, and a proposal that the family
Methylococcaceae includes only the group I methanotrophs, International Journal of
systematic Bacteriology 43 [4] (1993) 735-753
[29]
Woitas, K.: Diplomarbeit, Friedrich-Schiller-Universität Jena, 2005
[30]
Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (Hrsg.): Biogasgewinnung und -nutzung,
Leipzig, 2004
[31]
Krieg, A., Fischer, T.: Verbesserung der Rentabilität von landwirtschaftlichen Betrieben
durch die energetische Nutzung von Biogas, verfügbar im Dezember 2005
[30] Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (Hrsg.): Biogasgewinnung und nutzung, Leipzig, 2004
5
Zusammenarbeit mit anderen Stellen
Das Projekt wurde in Kooperation mit der TU Dresden, Institut für Siedlungs- und
Industriewasserwirtschaft bearbeitet.
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MAL GmbH
Teil II – Ergebnisse
6
Ergebnisse und Verwertbarkeit der Ergebnisse
6.1
Schaffung eines funktionstüchtigen Reaktorsystems zur Prüfung der
Verwertbarkeit von Biogas für die Mikroalgenproduktion
6.1.1
Prinzip
Das Grundprinzip des Systems beruht auf der Verstoffwechslung des im Biogas enthaltenen
Kohlendioxids durch die Algen unter Aufbau von Biomasse. Das gereinigte Gas enthält einen stark
reduzierten CO2- und einen vergleichsweise erhöhten Methananteil. Die Abbildung 1 verdeutlicht
dieses Prinzip.
Algenanlage
Nährstoff e
Biogas
(50-60 % Methan,
30 -40 % Kohlendioxid)
Licht
Algenbiomasse
Lichtreaktion:
Speicherung der Lichtenergie
Bildung v on energiereichen
Stoffen (ATP, NADP)
Entstehung v on Sauerstoff
Dunkelreaktion:
Reduktion v on Kohlendioxid
Bildung v on Glucose
(Biomasse)
Ergebnis der CO2-Elimination:
2-6% CO2 im Abgasstrom
-
Abbildung 1: Prinzip des Systems zur Prüfung der Verwertbarkeit von Biogas für die Mikroalgenproduktion
6.1.2
Getestete Röhrenreaktorsysteme
Es wurden verschiedene Reaktorbasissysteme getestet. Bei den Röhrenreaktorsystemen handelte
es sich um offene Systeme ohne Gaskreislauf. Die Abbildungen 2 und 3 zeigen beispielhaft einen
Anlagentyp mit senkrechten Röhren und doppelter Gasreinigung sowie die dazu gehörigen
anlagenspezifischen Daten. Die Abbildung 4 zeigt ein Reaktorsystem mit waagerechten Röhren.
Weitere Angaben zum Aufbau der getesteten Röhrenreaktorsysteme werden im Folgenden
zusammengefasst.
Beleuchtung
In jedem Anlagentyp betrug die erzielte Beleuchtungsstärke an den Glasröhren ca.
100 µmol/(m2*s).
Messsysteme
Die Anlagen enthielten Sensoren zur Überwachung des pH-Wertes, der CO2-, CH4- und O2Gehalte, der elektrischen Leitfähigkeit und der Temperatur.
Vorrichtung zur Abtrennung der Algen
Die erzeugte Biomasse wurde mittels eines Separators, der als Bypass in Form eines
Sedimentationstrichters mit Ablasseinrichtung an der unteren Seite und mit regelbarem Zufluss
geschalten war, abgetrennt.
Gasspeicher
Als Gasspeicher wurde ein Gasbeutel verwendet.
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MAL GmbH
Glasröhren
Gaszufuhr, Entgasung
Gaszufuhr
Separator
Pumpe
Volumen 16 l
Durchflussgeschwindigkeit: Schläuche 1,7 m/s; Glasröhren 0,2 m/s
Beleuchtung: 3 x Osram Fluora 30 W; 2x Osram Basic 30 W
Abbildung 2: Schema einer getesteten Versuchsanlage und anlagenspezifische Daten
Abbildung 3: Fotografie der getesteten Versuchsanlage mit senkrechten Röhren
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Leuchtstoffröhren
Senkrechte Röhren, doppelte Gasreinigung
MAL GmbH
Abbildung 4: Fotografie einer getesteten Versuchsanlage mit waagerechten Röhren
6.1.3
Aufbau eines speziellen Blasenreaktorsystems
Bei einem Vergleich der Reaktorsysteme Röhren- und Blasenreaktor wurde deutlich, dass im
Blasenreaktor höhere maximale Zellzahlen erzielt werden konnten. Dieses Reaktorsystem wurde
daher weiter ausgebaut.
Da die Inhalte dieses Abschnitts vertraulich sind, kann hier nicht auf Einzelheiten eingegangen
werden. Dem Projektträger liegt ein Schlussbericht mit allen Details vor.
6.1.4
Verwertung
An dem im Rahmen des Projektes entwickelten speziellen Blasenreaktorsystem besteht Interesse
von Seiten der IGV Institut für Getreideverarbeitung GmbH.
Unter der Voraussetzung, dass sich mit diesem Reaktorsystem ein Gas mit einem Methangehalt
von ca. 96 Vol.-% erzielen lässt, besteht ebenfalls Interesse durch die Schmack Biogas AG.
Die BiLaCon Institut für Biotechnologie, Laboranalytik und Consulting GmbH hat Interesse an der
Verwertung der Ergebnisse unter energetischen Gesichtspunkten. Aktuelle Gespräche mit einem
Energieunternehmen finden diesbezüglich statt.
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MAL GmbH
6.2
Auswahl geeigneter Mikroalgenspezies für die Anzucht unter Verwendung von
Biogas
6.2.1
Vorstellung der getesteten Mikroalgenspezies
In die Projektarbeit wurde eine Reihe von Mikroalgenspezies einbezogen, welche aufgrund ihrer
einfachen Kultivierbarkeit oder wegen interessanter Zellinhaltsstoffe ausgewählt wurden. Diese
Spezies sollen im Folgenden kurz vorgestellt werden.
Chlorella vulgaris
Chlorella vulgaris ist eine einzellige, unbewegliche Mikroalge. Sie gehört der Klasse der
Chlorophyceae und der Ordnung der Volvocales an. Ihr Zelldurchmesser variiert zwischen 5 und
10 µm. Charakteristische Baumerkmale sind der glockenförmige Chloroplast, die großen
exzentrischen Vakuolen, die differenzierte Zellwand und die dünne Plasmamembran [2].
Diese Grünalge vermehrt sich asexuell mithilfe von Autosporen. Unter optimalen
Wachstumsbedingungen dauert die einfache Reproduktion 16-20 Stunden.
Chlorella vulgaris ist durch ihren hohen Chlorophyll- und Proteingehalt besonders interessant [3].
Außerdem wurde ihre Anzucht unter Nutzung von CO2 aus den Abgasen eines
Blockheizkraftwerkes als Kohlenstoffquelle beschrieben [4].
Chlorella vulgaris ist sehr robust und zeigt hohe Wachstumsleistungen bei einfachen
Kultivierungsbedingungen.
Abbildung 5: Lichtmikroskopische Aufnahme von Chlorella vulgaris (Maßstab 1:600)
Haematococcus pluvialis
Die einzellige Grünalge Haematococcus pluvialis gehört der Klasse der Chlorophyceae und der
Ordnung der Volvocales an. Die vegetativen Haematococcus-Zellen sind in der Regel begeißelt
und haben einen Zelldurchmesser von 5 bis 10 µm. Haematococcus pluvialis kann jedoch als
geißellose Zyste ungünstige Lebensbedingungen (Stickstoffmangelmedium, Lichtstressbedingungen oder extreme hohe Temperaturen) überdauern. Während dieser Zeit nimmt das
Volumen der Zellen zu und es kommt zur Anreicherung größerer Mengen Astaxanthin. Dieses
Ketocarotinoid ist wegen seiner antioxidativen Eigenschaften Gegenstand der medizinischen
Forschung und somit auch von großem wirtschaftlichen Interesse. Die Astaxanthinproduktion wird
als Schutzmechanismus vor zu hohen Lichtintensitäten und freien Sauerstoffradikalen angesehen.
Der Farbstoff Astaxanthin ist für die Pigmentierung wild lebender und gezüchteter mariner Tiere
wie Lachse, Krabben und Hummer verantwortlich. Er kann jedoch von ihnen nicht selbst
synthetisiert werden, sondern wird über die Nahrung, wie z. B. Mikroalgen, aufgenommen, dabei
gilt Haematococcus pluvialis als wichtigste natürliche Astaxanthinquelle [5].
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MAL GmbH
Abbildung 6: Zellen von Haematococcus pluvialis im vegetativen Stadium (links) sind grün gefärbt, zu Beginn der
Stressphase (rechts) ist in Folge der Astaxanthinproduktion eine beginnende Rotfärbung zu erkennen.
Anabaena variabilis
Anabaena variabilis gehört zur Klasse der Cyanophyceae oder Blaualgen, der Ordnung
Ocsillatoriales und bildet zusammen mit den Bakterien einen Teil der Prokaryonten. Sie besiedelt
Süßwasser. Diese Blaualge bildet lange Ketten unterschiedlicher Größe aus 50 bis 2000
Einzelzellen (Durchmesser einer Einzelzelle ca. 2 µm). Diese Verkettung ermöglicht sogar eine
Arbeitsteilung zwischen spezialisierten Zellen (z. B. Heterocysten zur Stickstofffixierung). Da
Geißeln fehlen, erfolgt die Fortbewegung gleitend [6].
Abbildung 7: Lichtmikroskopische Aufnahme von Anabaena variabilis (Maßstab 1:200)
Chlamydomonas reinhardtii
Chlamydomonas reinhardtii lebt im Süßwasser und zählt zu den einfachsten Vertretern der
Chlorophyten. Ihre Zellen sind fast kugelig und bis zu 20 µm groß. Die zweigeißeligen
(biflagellaten) Einzeller zeigen sowohl eine asexuelle Reproduktion als auch eine sexuelle (vor
allem bei Stressbedingungen: Nahrungsmangel, Trockenheit usw.) [6]. Diese einzellige Grünalge
besitzt einen ausgeprägten photosynthetischen Apparat, der dem höherer Pflanzen ähnelt.
Chlamydomonas reinhardtii dient häufig als Modell-Organismus zum Studium des
Stärkehaushaltes von photosynthetisch aktiven Organismen [7]. Im Gegensatz zu den höheren
Pflanzen scheint der Stärke-Stoffwechsel weniger komplex zu sein. Auch hier ist die Algenanzucht
einfach und unter geeigneten Bedingungen können sich hohe Wachstumsraten einstellen.
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Abbildung 8: Lichtmikroskopische Aufnahme von Chlamydomonas reinhardtii (Maßstab 1:400)
Isochrysis spec.
Die marine Mikroalge Isochrysis spec. gehört zur Klasse der Haptophyceae (den „Goldalgen“nahe
stehend) und ist 4-8 µm groß. Isochrysis-Arten sind aufgrund ihres außerordentlich hohen
Gehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von Interesse. Besonders den -3-Fettsäuren, wie
Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) werden günstige biologische
Wirkungen zugeschrieben. Sie sind Bausteine bedeutender lokaler Botenstoffe, z. B.
Prostaglandine, Leukotriene und Thromboxane. Diese Substanzen haben eine Herz-Kreislauf
stabilisierende, cholesterinsenkende und entzündungshemmende Wirkung [8].
Abbildung 9: Lichtmikroskopische Aufnahme von Isochrysis spec. (Maßstab 1:400)
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6.2.2
MAL GmbH
Ermittlung der optimalen Kultivierungsbedingungen
Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Anabaena variabilis und Isochrysis spec.
Um einen optimalen Biomassezuwachs der Spezies Chlorella vulgaris, Chlamydomonas
reinhardtii, Anabaena variabilis und Isochrysis spec. zu gewährleisten, wurden die von ihnen
geforderten optimalen Kultivierungsbedingungen ermittelt. Die getesteten Bedingungen umfassten
das Nährmedium, die Lichtintensität einschließlich Hell-Dunkel-Rhythmen und den bevorzugten
pH-Bereich. Versuche bezüglich der Temperatur wurden nicht gesondert durchgeführt, da in
diversen Literaturstellen 20 bis 30 °C (Mesophilie) für die genannten Spezies als
Temperaturoptimum empfohlen werden und diese Temperaturen bei jedem Versuch im Labor
bedingt durch die Raumtemperatur gewährleistet waren. Nur bei Kultivierungsversuchen im Freien
unterlagen die Algensuspensionen größeren Temperaturschwankungen bedingt durch den
natürlichen Tagesrhythmus.
Die im Rahmen der Untersuchungen als günstig ermittelten Kultivierungsbedingungen fasst die
Tabelle 1 zusammen. Die Tabelle 2 zeigt die Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien.
Spezies
Chlorella vulgaris
Chlamydomonas
reinhardtii
Anabaena
variabilis
Isochrysis spec.
SWES
(SeewasserErdextrakt-Salze)
8 (Einstellung
nicht notwendig)
25 °C (wächst
auch bei 8 °C)
ChlorellaNährlösung
KUHL
KUHL
pH-Wert
6 bis 7
Einstellung nicht
notwendig
Einstellung nicht
notwendig
Temperatur
25 °C
25 °C
25 °C
180 bis 250
µmol/(m2*s)
Dauerlicht bzw.
16 h/8 h
180 µmol/(m2*s)
180 bis 250
µmol/(m2*s)
60 µmol/(m2*s)
Dauerlicht bzw.
16 h/8 h
Dauerlicht
12 h/12 h (bei 120
µmol/(m2*s))
Nährmedium
Lichtintensität
(bei Dauerlicht)
Hell-DunkelRhythmus
Tabelle 1:
Ermittelte Kultivierungsbedingungen der Spezies Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii,
Anabaena variabilis und Isochrysis spec.
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Verbindungen
Makronährstoffe
KNO3
NaH2PO4*H2O
Na2HPO4*2H2O
MgSO4*7H2O
CaCl2*2H2O
KH2PO4
FeSO4
Harnstoff (CH4N2O)
NaCl
K2HPO4
Meersalz
Bodenextrakt
Mikronährstoffe
H3BO3
MnCl2*4H2O
MnSO4*H2O
MoO3
ZnSO4*7H2O
CuSO4*5H2O
Co(NO3)2*6H2O
Na2MoO4*2H2O
(NH4)6Mo7O24*4H2O
CoSO4*7H2O
MgSO4*4H2O
EDTA
KOH
Citronensäure
Tabelle 2:
MAL GmbH
Chlorella-Nährlösung
KUHL-Nährlösung1
½ SWES-Medium1
0,500 g/l
1,011 g/l
0,621 g/l
0,089 g/l
0,247 g/l
0,015 g/l
0,200 g/l
0,069 g/l
0,0035 g/l
0,500 g/l
0,340 g/l
0,014 g/l
0,020 g/l
0,020 g/l
15,925 g/l
30 ml
0,057 mg/l
0,061 mg/l
0,05 mg/l
0,169 mg/l
0,01 mg/l
0,740 mg/l
0,236 mg/l
0,287 mg/l
0,0025 mg/l
0,005 mg/l
0,025 µg/l
0,005 mg/l
0,005 mg/l
0,092 mg/l
0,238 mg/l
4,100 mg/l
0,0124 mg/l
4 mg/l
Zusammensetzung der eingesetzten Nährmedien
Heamatococcus pluvialis
Die Kultivierung der Mikroalge Haematococcus pluvialis erfolgte in zwei Phasen in
2,5-l-Blasenreaktoren. Während der ersten Phase, der Anzuchtphase, wurde der pH-Wert des
Mediums automatisch über die CO2-Regelstation konstant auf pH = 7 gehalten. Die Temperatur
des Ansatzes sollte nicht über 18 bis 20 °C liegen, optimal aber bei weniger als 14 °C. Die
Beleuchtungsstärke wird mit 60 bis 100 µmol/(m2*s) (400-700 nm) empfohlen.
Zur Überwachung des Wachstums wurde täglich unter sterilen Bedingungen eine repräsentative
Probe entnommen und mikroskopisch mittels einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer die Zellzahl
ermittelt.
Nach dem Erreichen der stationären Phase (nach ca. 10 Tagen bzw. bei einer Zellzahl von
ca. 5 bis 7*105 Zellen/ml) wurde die Stressphase bzw. der Reifeprozess eingeleitet. Hierzu wurde
die im Anzuchtreaktor erzeugte Algenmasse aufkonzentriert, von der stickstoffhaltigen Nährlösung
getrennt und dann für die Beimpfung des Stressreaktors verwendet. Das Stressmedium ist
stickstoffarm. Der pH-Wert wurde weiterhin automatisch über die CO2-Regelstation konstant auf
pH = 7 gehalten.
1
Nährlösung ist zu autoklavieren
Seite 16 von 62
MAL GmbH
Die Temperatur des Ansatzes sollte in der Stressphase zwischen 25 und 30 °C liegen, was mit
dem Einbau eines Heizers realisiert wurde. Die Beleuchtungsstärke wurde durch Installation
zweier Spezialleuchten auf ca. 250 µmol/m2s erhöht.
Nach etwa zweitägigem Zellwachstum beginnt die Phase, in der die Algenzellen Astaxanthin
akkumulieren.
Die Zusammensetzungen der verwendeten Nährmedien zeigen die Tabellen 3 bis 5.
Stammlösung
Nährstoff
Hauptelemente
1
2
3
4
5
6
7
Spurenelemente
8
EDTA-KOHLösung
9
Eisen-Lösung
10
Harnstoff (CH4ON2)
MgSO4 * 7 H2O
H3BO3
NaCl
CaCl2 * 2 H2O
K2HPO4 * 3 H2O
KH2PO4
Co(NO3)2*6 H2O
ZnSO4 * 7 H2O
MnCl2 * 4 H2O
MoO3
CuSO4 * 5 H2O
EDTA
KOH
FeSO4 * 7 H2O
Citronensäure
Tabelle 3:
Stammlösung
[g/l]
36
15
11,42
5
5
19,6
35
0,49
8,82
1,44
0,71
1,57
50
31
5
5
Gebrauchslösung
[ml/l]
5
5
1
5
5
5
5
1
1
1
Zusammensetzung des Mediums zur Kultivierung von Haematococcus pluvialis
Das Nährmedium wird aus 10 Stammlösungen (Zusammensetzung siehe Tabelle 3) hergestellt.
Der pH-Wert der einzelnen Stammlösungen muss vor dem Autoklavieren (120 °C, 15 min) auf
pH = 7 eingestellt werden.
Zur Aufbewahrung der Stammlösungen wird eine Temperatur von 4 °C bei Dunkelheit
vorgeschrieben. Die Haltbarkeit dieser Stammlösungen beträgt 6 Monate.
Zur Herstellung der zu verwendenden Nährstofflösung werden die in der Tabellenspalte
Gebrauchslösung aufgeführten Mengen der einzelnen Stammlösungen in einen 1000-mlMaßkolben pipettiert und mit Reinstwasser aufgefüllt. Anschließend wird die fertige Nährlösung bei
120 °C autoklaviert.
Hauptelemente
Spurenelemente
Tabelle 4:
Stammlösung
Nährstoff
1
2
3
K2HPO4
MgSO4 * 7H2O
Mikronährstofflösung
Stammlösung
[g/100 ml]
0,1
0,1
Zusammensetzung des Mediums zur Stressung von Haematococcus pluvialis
Seite 17 von 62
Gebrauchslösung
[ml/250ml]
20
20
5
Destilliertes Wasser
Lösung 12
ZnSO4 * 7H2O
MnSO4 * 4H2O
H3BO3
Na2 MoO4 * 2H2O
CuSO4 * 5H2O
Lösung 23
FeSO4 * 7H2O
Tabelle 5:
6.2.3
MAL GmbH
Stammlösung [g/100 ml]
Gebrauchslösung
986 ml
0,1
0,1
0,2
0,02
0,0005
1 ml
2 ml
5 ml
5 ml
1 ml
0,7 g
Zusammensetzung der Mikronährstofflösung des Mediums zur Stressung von Haematococcus pluvialis.
Die Lösungen 1 und 2 sind getrennt herzustellen, zu autoklavieren und anschließend zu vereinigen.
Untersuchungen zum Vergleich der CO2-Verwertung durch verschiedene Algenspezies
Die für den Großteil der Experimente im Rahmen des Projektes eingesetzte Mikroalge Chlorella
vulgaris sollte hinsichtlich ihrer CO2-Verwertung mit weiteren Algenspezies verglichen werden.
Dazu wurden die Grünalge Chlamydomonas reinhardtii und das Cyanobakterium Anabaena
variabilis ausgewählt, denen laut Literatur [9] eine besonders gute CO2-Verwertung bescheinigt
wird.
Der Versuchsaufbau wurde so realisiert, dass in einen kleinen Blasenreaktor eine
Algensuspension definierten Volumens und definierter Zellzahl (ca. 2,2*106 Zellen/ml) eingebracht
wurde. Das System wurde luftdicht verschlossen, die ständige Durchmischung der
Algensuspension erfolgte durch Schütteln. Eine definierte Menge an CO2 wurde mit einer Spritze
von unten in den Reaktor eingebracht. Vor dem Einbringen des Gases in das System wurden
jeweils die aktuelle Zellzahl/ml von Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii bzw. die
Extinktion von Anabaena variabilis bestimmt und der pH-Wert und die Uhrzeit notiert. Nach der
Zugabe von CO2 wurden die Veränderung des pH-Wertes registriert und die Zeit bis zum
Erreichen des entsprechenden Ausgangs-pH-Wertes. Danach erfolgte erneut die Bestimmung der
Zellzahl/ml bzw. die Messung der Extinktion. Dieses Vorgehen wurde mehrmals wiederholt.
Die Kultivierungsbedingungen waren für alle Spezies gleich. Die Abbildung 10 zeigt die
Wachstumskurven der drei Mikroalgen bezogen auf das verbrauchte CO2 in ml/h.
Ausgehend von der Abbildung 10 ist sehr deutlich zu erkennen, dass Chlorella vulgaris das
dargebotene CO2 am effektivsten mittels Photosynthese in Biomasse umwandelte. Trotz der etwas
ungewöhnlichen Kultivierungsbedingungen (Schütteln) erreichte diese Mikroalge eine
vergleichsweise hohe Zellzahl von 3,4*107 Zellen/ml nach nur fünf Tagen. Mit zunehmender
Zellzahl in der exponentiellen Phase stieg zudem der Verbrauch an CO2 durch Chlorella vulgaris
pro Zeiteinheit. Das Experiment wurde nach 5 Tagen beendet, da die Zellen abstarben.
Das Cyanobakterium Anabaena variabilis erreichte nach 5 Tagen eine Extinktion von E620 = 0,4,
das entspricht einer Zellzahl in der Größenordnung von 2,5*107 Zellen/ml. Dabei verbrauchte
Anabaena variabilis vor allem gegen Ende des Versuchszeitraumes deutlich mehr CO2 pro
Zeiteinheit als Chlorella vulgaris.
Chlamydomonas reinhardtii wies unter den gegebenen Bedingungen einen vergleichsweise hohen
CO2-Verbrauch auf, akkumulierte dabei aber kaum Biomasse. Das Biomassewachstum war jedoch
– ausgehend von einer ähnlichen Startzellzahl – dem aus anderen Versuchen vergleichbar. Der
Versuch lief hier nur über 3 Tage, da die Zellen dann bereits abstarben. Es ist noch nicht bekannt,
was mit dem verbrauchten CO2 passiert, wenn es offensichtlich nicht zum Aufbau von Biomasse
verwertet wird. Es ist denkbar, dass diese Mikroalge einen Teil des CO2 speichert ohne es zu
verstoffwechseln.
2
3
886 ml Wasser + angegebene Nährsalze
100 ml Wasser + angegebene Nährsalze
Seite 18 von 62
MAL GmbH
4,00E+07
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
Zellzahl/ml
3,50E+07
3,00E+07
2,50E+07
2,00E+07
1,50E+07
1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00
0
1
2
3
4
Extinktion (620 nm)
Dies würde einem Gedanken aus dem ursprünglichen Antrag für dieses Projekt der energy of
nature Projektgesellschaft für umwelttechnische Anlagensysteme Leipzig bmH entsprechen. Darin
wurde von der Fähigkeit von Algen, unter Stressbedingungen CO2 in den Zellen einzulagern und
bei Änderung der Bedingungen gasförmig wieder abzugeben, ausgegangen.
5
CO2-Verbrauch [ml/h]
Chlorella vulgaris
Anabaena variabilis
Abbildung 10: Vergleich des Biomassewachstums der einzelnen Mikroalgenspezies in Bezug zur CO2-Verwertung
Zusammenfassend zeigte dieses orientierende Experiment, dass Chlorella vulgaris das
dargebotene CO2 am besten in Biomasse umsetzte. Für Untersuchungen, die sowohl auf eine
Verwertung von CO2 durch Mikroalgen als auch auf die Bildung von verwertbarer Biomasse
abzielen, ist Chlorella vulgaris somit am besten geeignet. Anabaena variabilis und
Chlamydomonas reinhardtii verwerteten vergleichsweise mehr CO2 als Chlorella vulgaris, dabei
akkumulierte aber vor allem Chlamydomonas reinhardtii deutlich weniger Biomasse. Im Hinblick
auf die CO2-Elimination ohne das Ziel einer hohen Biomasseausbeute wären somit
Chlamydomonas reinhardtii oder Anabaena variabilis zu bevorzugen.
6.2.4
Auswahl der geeigneten Spezies
Abgeleitet aus den vorgestellten Daten und Erkenntnissen wurden für die Prüfung der
Verwertbarkeit von Biogas für die Mikroalgenproduktion in einem speziellen Blasenreaktorsystem
die Spezies Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii ausgewählt. Beide Mikroalgen
lassen sich einfach kultivieren, zudem erwies sich vor allem Chlorella vulgaris als robust
gegenüber schwankenden Kultivierungsbedingungen und ist wegen seiner in der Literatur
beschriebenen ausgewogenen Zusammensetzung an Nährstoffen interessant. Bezüglich einer
möglichen Verwertung der Biomasse bzw. eines wertvollen Inhaltsstoffes wurde die Grünalge
Haematococcus pluvialis in die Untersuchungen einbezogen. Die Kultivierung dieser Mikroalge
erfolgte bisher nicht im speziellen Blasenreaktor unter Verwendung von Biogas, sondern in einem
herkömmlichen Blasenreaktorsystem unter Nutzung von reinem CO2. Ein Prinzipnachweis der
Kultivierbarkeit von Haematococcus pluvialis mit (entschwefeltem) Biogas wurde erbracht. Dabei
wurden maximale Zellzahlen von ca. 6,3*105 Zellen/ml erreicht.
Seite 19 von 62
MAL GmbH
6.3
Anzucht der ausgewählten Mikroalgenspezies unter Verwendung von Biogas im
speziellen Blasenreaktorsystem
6.3.1
Eingesetzte Gase
Natürliches Biogas (Biogasreaktor MAL GmbH)
Das im laboreigenen Faulgasreaktor produzierte Biogas wird in Gasbeuteln aufgefangen oder
direkt dem Blasenreaktorsystem zugeführt. Täglich wird dem Faulgasreaktor ein definiertes
Volumen an Primärschlamm (Gülle) inklusive einer kleinen Menge Altbrot zugefüttert, wobei dem
Reaktor dieselbe Menge an Volumen wieder entzogen wird. Zur Kontrolle werden der pH-Wert und
der Trockengehalt dieses Faulschlamms gemessen, da bestimmte Milieubedingungen gegeben
sein müssen. Die Temperatur sollte bei ca. 37 °C liegen. Weiterhin benötigen methanbildende
Bakterien einen pH-neutralen Bereich von ca. 6,8.
Synthetisches Biogas (Gasflasche)
Aufgrund des hohen Aufwandes zur Gewinnung von natürlichem Biogas in Bezug zur benötigten
Menge für verschiedene Versuche, wurde als „Ersatz“synthetisches Biogas in einer Gasflasche
erworben. Der Vorteil dieses Gases liegt darin, dass während einer längeren Versuchsdauer
immer die gleiche Zusammensetzung an Inhaltsstoffen gewährleistet werden kann.
Die Zusammensetzung der eingesetzten Gase wird in der Tabelle 6 zusammengefasst.
Komponente
CH4
CO2
O2
N2
H2S
H2
H2O
Tabelle 6:
Gehalt [Vol.-%]
in natürlichem Biogas
57
35
1
3
0,025
n.a.4
n.a.
Gehalt [Vol.-%]
in synthetischem Biogas
55
32
2
5
1
n.a.
n.a.
Vergleich der eingesetzten Biogase
Wie aus der Tabelle 6 hervor geht, weist das synthetische Biogas einen vergleichsweise hohen
H2S-Gehalt auf. Schwefelwasserstoff erwies sich für die Anzucht von Algen als
wachstumshemmende Komponente (s. Abschnitt 6.3.2) und wurde durch das Vorschalten einer
Gasreinigungsmasse aus dem Gas entfernt. Diese bereits großtechnisch erprobte, pelletierte
Gasreinigungsmasse FerroSorp® S basiert auf Eisenhydroxid, welches den Schwefelwasserstoff
chemisch bindet und auf diese Weise aus dem Gas entfernt. Das im eigenen Labor produzierte
Biogas schwankte hinsichtlich seiner Zusammensetzung wie die Abbildung 11 zeigt.
4
nicht analysiert
Seite 20 von 62
MAL GmbH
60,0
55,0
Vol-%
50,0
Biogasreaktor für
Biomassenachschub
geöff net
45,0
Biogasreaktor für
Biomassenachschub
geöff net
40,0
35,0
30,0
25,0
10.01.2005
00:00
10.01.2005
12:00
11.01.2005
00:00
11.01.2005
12:00
12.01.2005
00:00
12.01.2005
12:00
13.01.2005
00:00
13.01.2005
12:00
Messzeitpunkt [Datum , Uhrzeit]
Methan
Kohlendioxid
Abbildung 11: Methan- und Kohlendioxid-Gehalte in natürlichem Biogas aus dem laboreigenen Faulgasreaktor
6.3.2
Aufbau eines Testsystems zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Abfallgasen
Prinzip des Testsystems
Zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von drei Abfallgasen (synthetisches Biogas, entschwefeltes
synthetisches Biogas und natürliches Biogas aus dem Faulgasreaktor im MAL-Labor) durch
Mikroalgen wurde ein Testsystem aufgebaut. Das Ziel der Untersuchungen bestand zum einen
darin, die Verwertung des in den Gasen enthaltenen CO2 im Vergleich zu reinem CO2 im Hinblick
auf den Biomassezuwachs zu testen. Dabei ist derzeit nicht bekannt, ob neben dem CO2-Dargebot
weitere limitierende Faktoren für das Algenwachstum in diesem Versuchsaufbau existieren und
das Ergebnis beeinflussen. Zum anderen soll das System als Grundlage für ein ökotoxikologisches
Testsystem zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Gasen dienen. Ein solches Testsystem
erweitert das Dienstleistungsangebot der MAL GmbH.
Da der konkrete Aufbau dieses Testsystems vertraulich ist, kann hier nicht auf Einzelheiten
eingegangen werden. Dem Projektträger liegt ein Schlussbericht mit allen Details vor.
Seite 21 von 62
MAL GmbH
Ergebnisse der Versuche zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Abfallgasen
Zur Durchführung der Versuche wurden folgende Mikroalgen als Testorganismen eingesetzt:
Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Anabaena variabilis und Isochrysis spec.
Wie die Abbildung 12 zeigt, war Chlorella vulgaris in der Lage das CO2 aus dem natürlichen und
dem entschwefelten synthetischen Biogas nahezu genau so gut zu verwerten wie reines CO2. Die
Wachstumskurven der drei genannten Begasungsarten ähneln sich, wobei die maximal erreichte
Zellzahl von 7,3*107 Zellen/ml an Tag 12 bei Begasung mit reinem CO2 um nur 6 % höher lag als
bei der Kultivierung mit Biogas aus dem Faulschlammreaktor (6,9*107 Zellen/ml). Ein deutliches
Wachstumsdefizit verzeichnete die Kultivierung mittels synthetischem Biogas mit einer erreichten
Zellzahl von 1,2*107 Zellen/ml. Ursache hierfür kann der erhöhte Anteil an Schwefelwasserstoff im
Gasgemisch sein, da nach Entfernung des H2S ein Biomassewachstum ähnlich dem mit reinem
CO2 erreicht wurde. Trotz des im synthetischen Biogas enthaltenen CO2 hemmte also der
vorhandene Schwefelwasserstoff das Algenwachstum. Dieses Phänomen wurde auch bei den
anderen untersuchten Mikroalgenspezies beobachtet.
8,00E+07
7,00E+07
Zellzahl/ml
6,00E+07
5,00E+07
4,00E+07
3,00E+07
2,00E+07
1,00E+07
0,00E+00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13
Zeit [d]
nat. Biogas
synth. Biogas
CO2
H2S-freies synth. Biogas
Abbildung 12: Wachstumskurven von Chlorella vulgaris bei der Kultivierung mit verschiedenen CO2-haltigen Gasen
Bei der Kultivierung von Chlamydomonas reinhardtii mit verschiedenen Gasen wurde das beste
Ergebnis mit natürlichem Biogas erreicht (Abbildung 13). Die maximal erzielte Zellzahl lag bei
1,8*107 Zellen/ml. Bei der Anzucht mit reinem CO2 wurden ca. 1,4*107 Zellen/ml erreicht. Der
negative Einfluss des Schwefelwasserstoffanteils im synthetischen Biogas war auch auf das
Wachstum von Chlamydomonas reinhardtii anhand der erreichten Zellzahlen deutlich erkennbar.
Die maximale Zellzahl lag bei nur 8*106 Zellen/ml.
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MAL GmbH
Zellzahl/ml
2,00E+07
1,50E+07
1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
Zeit [d]
nat. Biogas
synth. Biogas
CO2
Abbildung 13: Wachstumskurven von Chlamydomonas reinhardtii bei der Kultivierung mit verschiedenen CO2-haltigen
Gasen
Das Cyanobakterium Anabaena variabilis konnte das in natürlichem und entschwefeltem
synthetischen Biogas enthaltene CO2 ebenso gut verwerten wie reines CO2 (Abbildung 14). Der
Verlauf des Wachstums wurde in diesem Fall nicht über die Bestimmung der Zellzahl durchgeführt,
da Anabaena variabilis in langen Zellketten vorkommt, die inhomogen in der Kultivierungslösung
verteilt sind. Der Biomassezuwachs wurde über die Bestimmung der Extinktion (620 nm) verfolgt.
Die maximale Extinktion wurde bei der Kultivierung von Anabaena variabilis mit reinem CO2 erzielt,
wobei ein Wert von E620 = 0,61 erreicht wurde.
Auch bei diesem Kultivierungsversuch war die Verträglichkeit gegenüber schwefelwasserstoffhaltigem Gas nicht gegeben. Die maximal erreichbare Zelldichte konnte durch eine
gemessene Extinktion von E620 = 0,37 wiedergegeben werden, wobei der negative Effekt des
Schwefelwasserstoffs nicht so deutlich ausfällt wie bei der Kultivierung von Chlorella vulgaris bzw.
Chlamydomonas reinhardtii.
Extinktion (620 nm)
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Zeit [d]
nat. Biogas
synth. Biogas
CO2
Abbildung 14: Wachstumskurven von Anabaena variabilis bei der Kultivierung mit verschiedenen CO2-haltigen Gasen
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MAL GmbH
Für die marine Mikroalge Isochrysis spec. wurde festgestellt, dass reines CO2 und CO2 aus
natürlichem Biogas am besten verwertet werden (Abbildung 15). Für diese beiden Gase konnten
Zellzahlen von 5*107 Zellen/ml erzielt werden.
Ein ähnliches Ergebnis ist auch für die Kultivierung mit entschwefeltem synthetischen Biogas
anzunehmen. Bis zum Kultivierungstag 19, an welchem dieses Reaktorsystem wegen eines
technischen Problems ausfiel, entsprach der Kurvenverlauf jenem von CO2 und natürlichem
Biogas. Aus diesem Grund wurde auf einen ähnlichen weiteren Verlauf bei unveränderten
Reaktionsbedingungen geschlossen. Erstaunlich war die Verträglichkeit von Isochrysis spec.
gegenüber der Zufuhr von ungereinigtem synthetischen Biogas aus der Gasflasche mit erhöhtem
Schwefelwasserstoffanteil. Diese Mikroalge zeigte im Gegensatz zu den drei anderen Spezies hier
ein vergleichsweise gutes Wachstum und es konnte eine maximale Zellzahl von 4*107 Zellen/ml
erzielt werden.
6,00E+07
Zellzahl/ml
5,00E+07
4,00E+07
3,00E+07
2,00E+07
1,00E+07
0,00E+00
0
5
10
15
20
25
Zeit [d]
nat. Biogas
synth. Biogas
CO2
Abbildung 15: Wachstumskurven von Isochrysis spec. bei der Kultivierung mit verschiedenen CO2-haltigen Gasen
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die untersuchten Mikroalgen in der Lage waren das
CO2 aus den getesteten Abfallgasen zu verwerten. Dabei wurden z. T. sogar im Vergleich zu
reinem CO2 höhere Zellzahlen erreicht. Es wurde aber auch erkannt, dass Abfallgase
Komponenten enthalten können, die das Algenwachstum hemmen, obwohl CO2 dargeboten wird.
Im konkreten Fall war Schwefelwasserstoff eine das Algenwachstum negativ beeinflussende
Komponente. Nach dessen vorheriger Abtrennung erwies sich das Gas für die Kultivierung als
geeignet. Daraus abgeleitet ist es möglich, den Versuchsaufbau als Grundlage für den Aufbau
eines ökotoxikologischen Testsystems zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Gasen zu nutzen.
6.3.3
Anzucht von Chlorella vulgaris
Die folgenden Kenndaten wurden im Rahmen der Anzucht von Chlorella vulgaris im speziellen
Blasenreaktorsystem gewonnen.
Seite 24 von 62
MAL GmbH
Gasqualität
Die Tabelle 7 zeigt die Zusammensetzung von entschwefeltem synthetischen Biogas nach der
Verwertung des CO2 durch die Mikroalge Chlorella vulgaris.
Komponente
CH4
CO2
O2
N2
H2S
H2
H2O
Tabelle 7:
Gehalt [Vol.-%] in gereinigtem synthetischen Biogas
53
2
30
10
n.a.
n.a.
n.a.
Zusammensetzung von gereinigtem synthetischen Biogas
Der CO2-Gehalt von ca. 35 % im Ausgangsgas (siehe Tabelle 4) verringerte sich durch die
Gasreinigung im Photobioreaktor auf etwa 2 %. Infolge der Photosyntheseaktivität der Mikroalgen
wurde Sauerstoff gebildet. Der Methangehalt ist im Vergleich zum Ausgangsgas nahezu
unverändert. Der Stickstoffgehalt hat sich um Vergleich zum Ausgangsgas etwas erhöht, wobei
nicht auszuschließen ist, dass der Eintrag während der Probenahme erfolgte. Die CO2Eliminierung konnte im Vergleich zum Röhrenreaktorsystem verbessert werden. Dort wurde nach
einfacher Gasreinigung eine Abnahme des Ausgangs-CO2-Gehaltes von 36 % auf 10 bis 15 %
ermittelt, nach doppelter Gasreinigung wurden im Abgasstrom CO2-Gehalte von 2 bis 6 % erzielt.
CO2-Verwertung und resultierendes Algenwachstum und Biomasseertrag
In den Tabellen 8 und 9 sind wichtige Kenndaten des speziellen Reaktorsystems
zusammengestellt. Die ermittelten Daten beziehen sich jeweils auf die angegebene
Kultivierungsdauer.
Basisdaten
Kultivierungsdauer [d]
Biogasverbrauch [l]
7
8,5
Anteil CO2 Input [%]
36
Anteil CO2 Output [%]
Zellzuwachs [Zellen/ml]
Anlagenvolumen [ml]
Biomasse theoretisch [g]5
Tabelle 8:
5
3
5,86*107
2500
6,31
Ausbeuteberechnung 1
Masse einer Zelle [g]
Biomassezuwachs [g]
Biomasseausbeute bezogen auf
Theorie [%]
Trockenmasse [g/l]
Biomassezuwachs [g]
Theorie [%]
3,65*10-11
5,35
85
1,6
4
63
Reaktorkenndaten bei Verwendung von synthetischem Biogas
berechnet auf der Basis der Reaktionsgleichung der Photosynthese und unter der Annahme, dass zwischen dem
infolge Photosynthese gebildeten Kohlenstoff und der Gesamtmenge der gebildeten organischen Stoffe ein Faktor von
1,8 besteht [10] sowie unter Verwendung des tatsächlichen CO2-Verbrauchs
Seite 25 von 62
Basisdaten
Biogasverbrauch [l]
Anlagenvolumen [ml]
Biomasse theoretisch [g]
Tabelle 9:
10
13,9
32
3
6,81*107
2500
9,06
MAL GmbH
Biomassezuwachs [g]
Theorie [%]
Trockenmasse [g/l]
Biomassezuwachs [g]
Theorie [%]
3,65*10-11
6,21
66
2,2
5,5
61
Reaktorkenndaten bei Verwendung von natürlichem Biogas
Aus den Tabellen 8 und 9 ist ersichtlich, dass im speziellen Blasenreaktorsystem - unter
Berücksichtigung von möglichen Ungenauigkeiten bei der ermittelten Masse einer Zelle bzw. der
bestimmten Trockenmasse - Biomasseausbeuten im Bereich von 60 bis 85 % bezogen auf die
theoretische Ausbeute erzielt wurden. Bei einem Vergleich der mit den getesteten Gasen erzielten
Ausbeuten konnte nur bei der Ausbeuteberechnung unter Zugrundelegung der Zellmassen ein
Unterschied festgestellt werden. Dabei wurde unter Verwendung des synthetischen Biogases eine
höhere Ausbeute ermittelt. Nach Ermittlung der Ausbeuten unter Nutzung der bestimmten
Trockenmassen wurde kein gravierender Unterschied zwischen den verwendeten Gasen
festgestellt. Nach seiner Entschwefelung eignete sich das synthetische Biogas – wie bereits im
Kapitel 6.3.2 beschrieben – somit ebenso gut wie natürliches Biogas zur Anzucht von Mikroalgen.
Es wurden für beide untersuchte Biogase maximale Zellzahlen von 1,0*108 Zellen/ml im Reaktor
erzielt. Das stellt im Vergleich zum Röhrenreaktorsystem eine deutliche Verbesserung dar. Dort
wurden für Chlorella vulgaris in einem ähnlichen Kultivierungszeitraum nur maximale Zellzahlen
von 2 bis 3*107 Zellen/ml erzielt.
Untersuchungen zur Bestimmung eines optimalen Erntezyklus für die Gewinnung von Biomasse
Der Schlüssel für eine optimale Biomasseproduktion ist die möglichst lange Aufrechterhaltung der
exponentiellen Wachstumsphase der Kultur. Die durchgeführten Untersuchungen speziellen
Blasenreaktorsystem zeigten zu Beginn eine exponentielle Wachstumsphase der Algenkultur in
einem Bereich von 3,0*107 Zellen/ml bis 8,0*107 Zellen/ml (siehe blaue Wachstumskurve in
Abbildung 16). Während der ersten Anzucht der Algen im Photobioreaktor benötigten diese eine
gewisse Zeit um sich an die Lebensbedingungen anzupassen, des Weiteren kam es durch
zwischenzeitlich vorgenommene Umbauarbeiten am Reaktor zu einem Absinken der Zellzahl
(Abbildung 16). Um eine hohe Produktivität in der Gewinnung von Biomasse zu erreichen und
einen stabilen Zyklus zu etablieren, wurde für die Ernten zunächst jeweils die Hälfte der
Algensuspension entnommen und durch Nährlösung ersetzt. Dabei kam es zu einer zunehmenden
Erhöhung der Zellzahl bei zunehmender Häufigkeit der Erntezyklen. Daraufhin wurde der
Erntezyklus umgestaltet. Es wurde jeweils soviel Algensuspension entnommen, dass immer
wieder eine Ausgangszellzahl von ca. 1,0*107 Zellen/ml resultierte (Abbildung 17).
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1,20E+08
Ernte
1,00E+08
Ernte
Ernte
Zellzahl/ml
Ernte
Entnahme
von 400 ml
8,00E+07
6,00E+07
Gasumstellung
4,00E+07
2,00E+07
0,00E+00
30.09.2004
00:00
10.10.2004
00:00
20.10.2004
00:00
30.10.2004
00:00
09.11.2004
00:00
19.11.2004
00:00
29.11.2004
00:00
09.12.2004
00:00
Messzeitpunkt [Datum, Uhrzeit]
Abbildung 16: Verlauf der Zellzahl im speziellen Blasenreaktorsystem und Markierung der Erntezeitpunkte der Biomasse
1,20E+08
1,00E+08
Ernte
Ernte
Ernte
Ernte
Zellzahl/ml
8,00E+07
6,00E+07
4,00E+07
2,00E+07
Gasumstellung
0,00E+00
29.11.2004 04.12.2004 09.12.2004 14.12.2004 19.12.2004 24.12.2004 29.12.2004 03.01.2005 08.01.2005
00:00
00:00
00:00
00:00
00:00
00:00
00:00
00:00
00:00
Messzeitpunkt [Datum, Uhrzeit]
Abbildung 17: Verlauf der Zellzahl im speziellen Blasenreaktorsystem und Markierung der Erntezeitpunkte der Biomasse
nach Umgestaltung des Erntezyklus
Aus der Abbildung 17 ist deutlich ein konstant schnelles Wachstum der Algenpopulation
ausgehend von einer Startzellzahl von ca. 1,0*107 Zellen/ml im Reaktorsystem festzustellen. Die
Ernte erfolgte jeweils dann, wenn das Erreichen der stationären Wachstumsphase erkannt wurde.
Die Kultivierungsdauer bis zum Erreichen der maximalen Zellzahl im Reaktor lag in der Mehrzahl
der Kultivierungen bei ca. 9 Tagen. Nach dieser Dauer konnten etwa 90 % des Reaktorinhalts für
eine Weiterverarbeitung geerntet werden. Durch die Umstellung des Erntezyklus konnte eine
Produktivitätssteigerung erreicht werden.
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In der Abbildung 18 wird die erreichte Produktivität der einzelnen Kultivierungen vergleichend
dargestellt. Aus den Abbildungen 16 und 17 ging bereits hervor, dass die Ernte der Biomasse nicht
immer zum Zeitpunkt der maximalen Zellzahl erfolgte, sondern z. T. erst nachdem die Bestimmung
der Zellzahl einen Abfall gegenüber dem Vortag ergab. Deshalb wurde in der Abbildung 18 neben
der tatsächlich erreichten Biomasseproduktion pro Tag auch die maximal erreichbare tägliche
Biomasseproduktion unter Annahme der Ernte am Tag der höchsten Zellzahl aufgezeigt. Noch
höhere Erträge hätten erzielt werden können, wenn durch die Ernte immer eine Verdünnung der
maximalen Zellzahl auf exakt 1,0*107 Zellen/ml gelungen wäre. Auch dies ist in der Abbildung 18
dargestellt.
1,400
Umstellung des Erntezyklus
geerntete Biomasse in g/d
1,200
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
1
2
3
4
5
6
7
8
Anzucht
geerntete Biomasse in g/d
Biomasse in g/d mit maximal erreichter Zellzahl
potenziell möglich bei maximaler Ausnutzung
Abbildung 18: Steigerung der Produktivität der Biomasseproduktion durch Umstellung des Erntezyklus
Die Steigerung der Ernteerträge durch die Umstellung des Erntezyklus wird noch einmal in der
Tabelle 10 verdeutlicht. Daraus ist ersichtlich, dass bezogen auf die durchschnittlich erreichte
Biomasse im 1. Erntezyklus eine Produktivitätssteigerung um ca. 150 % erreicht wurde.
Mittelwert
Tabelle 10:
Erntezyklus 1
(Entnahme eines konstanten Volumens)
Biomasse [g/d]
%
0,136
61
0,104
46
0,252
113
0,399
179
0,223
100
Erntezyklus 2
(Startzellzahl 1*107 Zellen/ml)
Biomasse [g/d]
%
0,279
125
0,561
252
0,607
271
0,791
355
0,560
252
Steigerung der Ernteerträge durch die Umstellung des Erntezyklus
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6.3.4
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Anzucht von Chlamydomonas reinhardtii
Gasqualität
Die Tabelle 11 stellt die Zusammensetzung von laboreigenem natürlichen Biogas vor und nach der
Verwertung des CO2 durch die Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii gegenüber.
Komponente
CH4
CO2
O2
N2
H2S
H2
H2O
Tabelle 11:
Gehalt [Vol.-%]
in natürlichem Biogas
45
37
3
14
nicht analysiert
nicht analysiert
nicht analysiert
Gehalt [Vol.-%]
in gereinigtem natürlichen Biogas
40
13
22
20
nicht analysiert
nicht analysiert
nicht analysiert
Zusammensetzung von natürlichem Biogas vor und nach der Reinigung durch die Mikroalge
Der CO2-Gehalt von ca. 37 % im Ausgangsgas verringerte sich durch die Gasreinigung im
Photobioreaktor auf etwa 13 %. Das ist im Vergleich zur Reinigung mit Chlorella vulgaris (etwa
2 %) ein deutlich schlechteres Ergebnis. Auffällig ist im Vergleich zu Tabelle 4 auch der hohe
Stickstoffgehalt im Ausgangsgas. Es wird nicht ausgeschlossen, dass dieser hohe Gehalt auf
einen Probenahmefehler zurückzuführen ist, der sich gleichermaßen im Stickstoffgehalt des
gereinigten Biogases widerspiegelt.
Im Gegensatz zur Biogasreinigung mit Chlorella vulgaris fiel auf, dass der CO2-Gehalt hier stetig
anstieg. Das unterschiedliche Verhalten von Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii in
Bezug auf die Verwertung von CO2 war bereits im Abschnitt 6.2.3 beobachtet worden.
CO2-Verwertung und resultierendes Algenwachstum und Biomasseertrag
In der Tabelle 12 sind wichtige Kenndaten des speziellen Blasenreaktorsystems
zusammengestellt. Die ermittelten Daten beziehen sich jeweils auf die angegebene
Kultivierungsdauer.
Basisdaten
Biogasverbrauch [l]
Anlagenvolumen [ml]
Biomasse theoretisch [g]
Tabelle 12:
7
14,0
37
13
1,07*107
2500
8,50
Biomassezuwachs [g]
Theorie [%]
Trockenmasse [g/l]
Biomassezuwachs [g]
Theorie [%]
Reaktorkenndaten bei Verwendung von natürlichem Biogas
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3,14*10-10
8,42
111
3,1
7,75
103
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Bezogen auf die theoretische Ausbeute wurde im speziellen Blasenreaktorsystem mit
Chlamydomonas reinhardtii die Tendenz einer höheren Biomasseausbeute im Vergleich zu
Chlorella vulgaris festgestellt. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von der Erkenntnis aus dem
Abschnitt 6.2.3, wonach Chlamydomonas reinhardtii das dargebotene CO2 schlechter als Chlorella
vulgaris in Biomasse umsetzt. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Versuche im Abschnitt
6.2.3 in einem anderen Reaktorsystem durchgeführt wurden. Die berechneten Ausbeuten von
knapp über 100 % sind unter Berücksichtigung der methodisch und verfahrensbedingten
Schwankungen zu sehen.
Es wurden für beide untersuchte Biogase maximale Zellzahlen von 2,0*107 Zellen/ml im Reaktor
erzielt.
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6.4
Möglichkeiten zur Verwertung der Biomasse
6.4.1
Analytik der untersuchten Mikroalgen hinsichtlich verwertbarer Inhaltsstoffe
6.4.1.1
Einleitung
Im Rahmen des Projektes wurde ein Programm erarbeitet und erprobt, das eine grundlegende
Analytik wichtiger Zellinhaltsstoffe ermöglicht. Wichtige Untersuchungsparameter waren dabei z. B.
der Chlorophyll- und der Proteingehalt sowie die Zusammensetzung des Fettsäurespektrums. Die
Änderung der Zusammensetzung in Abhängigkeit von der Kultivierung der Mikroalgen sollte
aufgezeigt werden. Darüber hinaus wurden auch Methoden zur Analytik von speziellen
Zellinhaltsstoffen entwickelt, die für einzelne Algenspezies spezifisch sind. Dabei stand im Rahmen
der Untersuchung der Mikroalge Haematococcus pluvialis die Astaxanthinanalytik im
Zusammenhang mit den Kultivierungsbedingungen (Anzucht, Wachstum, Milieuänderung, Ernte)
im Vordergrund. Sie umfasste die Entwicklung zum einen einer validen HPLC-Methode zur
Bestimmung des Astaxanthingehaltes und zum anderen einer prozessanalytischen
photometrischen Methode zur Überwachung der Akkumulation dieses Carotinoides während des
Reifeprozesses.
6.4.1.2
Photometrische Bestimmung des Pigmentgehaltes in der Flüssigkultur
Die photometrische Bestimmung des Pigmentgehaltes ist eine Summenmethode. In einem
Methodenvergleich wurde zunächst geprüft, welches Extraktionsverfahren zur Bestimmung des
Pigmentgehaltes zweckmäßig für die Algenmatrix ist. Dabei wurde festgestellt, dass der
Aufschluss mit siedendem Methanol die beste Methode zur Bestimmung des Pigmentgehaltes in
Algenlösungen ist. Die Vorgehensweise wird nachfolgend zusammengefasst.
Zur quantitativen Ermittlung des Pigmentgehaltes wird die Mikroalgenlösung in ein Reagenzglas
überführt und 10 min lang zentrifugiert. Der Rückstand (Pellet) wird in Methanol aufgenommen und
in siedendem Methanol extrahiert. Die Extinktion der zentrifugierten methanolischen
Pigmentfraktion wird bei 452 nm, 652 nm, 665 nm und 750 nm gegen Methanol gemessen [11].
Mithilfe der nachfolgenden Gleichungen werden der Chlorophyll- und der Carotinoidgehalt
berechnet.
Chl a [µg/ml methanolischer Extrakt]
Chl b [µg/ml methanolischer Extrakt]
Chl a+b [µg/ml methanolischer Extrakt]
Carotinoide [µg/ml methanolischer Extrakt]
= 16,29 (E665-E750) - 8,54 (E652-E750)
= 30,66 (E652-E750) - 13,68 (E665-E750)
= 22,12 (E652-E750) - 2,61 (E665-E750)
= 4,2 E452-0,0264 [Chl a] - 0,496 [Chl b]
Der Pigmentgehalt der Algensuspensionen ist von der Spezies selbst, der Zellgröße und von der
Zellzahl pro Milliliter abhängig. Aus diesem Grund werden bei den im Folgenden genannten
Pigmentgehalten stets die Zellzahlen angegeben um die Pigmentgehalte vergleichen zu können.
Die Pigmentgehalte wurden stets mehrfach bestimmt (Tabelle 13).
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7
Chlorella vulgaris
1,87*10 Zellen/ml
MW
STABW
VK [%]
Anteil [%]
Chl a [µg/ml]
4,94 6,13 4,94 5,37 5,57 5,76
5,45
0,47
8,6
55
Chl b [µg/ml]
2,30 2,63 2,31 2,87 2,66 2,60
2,56
0,22
8,6
26
Chl a+b [µg/ml]
7,24 8,76 7,25 8,24 8,23 8,36
8,01
0,63
7,9
-
Car [µg/ml]
1,78 1,90 1,82 1,85 1,80 1,83
1,83
0,04
2,2
19
MW
STABW
VK [%]
Anteil [%]
Pigment
6
Isochrysis spec.
9,5*10 Zellen/ml
9,84
Chl a [µg/ml]
3,00 3,16 3,13 3,23 3,61 3,63
3,29
0,26
7,9
55
Chl b [µg/ml]
0,16 0,12 0,14 0,16 0,11 0,15
0,14
0,02
14,3
2
Chl a+b [µg/ml]
3,16 3,28 3,27 3,38 3,73 3,78
3,43
0,26
7,6
-
Car [µg/ml]
2,49 2,45 2,45 2,65 2,75 2,82
2,60
0,16
6,2
43
MW
STABW
VK [%]
Anteil [%]
Pigment
4,25*106 Zellen/ml
6,03
Chl a [µg/ml]
5,74 5,40 5,61 5,59 6,07 4,83
5,54
0,41
7,4
58
Chl b [µg/ml]
2,51 2,75 2,62 2,68 2,74 2,29
2,60
0,17
6,5
27
Chl a+b [µg/ml]
8,25 8,15 8,23 8,27 8,82 7,12
8,14
0,55
6,8
-
Car [µg/ml]
1,23 1,18
1,35
0,17
12,6
14
1,3
1,41 1,65 1,33
Pigment
9,49
Anabaena variabilis
MW
STABW
VK [%]
Anteil [%]
Chl a [µg/ml]
10,00 8,44 7,41
8,62
1,30
15,1
71
Chl b [µg/ml]
10,48 0,52 0,54
0,51
0,03
5,9
4
Chl a+b [µg/ml]
10,48 8,96 6,87
8,77
1,81
20,6
-
Car [µg/ml]
2,97 2,15 3,97
3,03
0,91
30,0
25
Pigment
Tabelle 13:
12,16
Pigmentgehalte der Mikroalgen Chlorella vulgaris, Isochrysis spec., Chlamydomonas reinhardtii und
Anabaena variabilis
relativer Anteil [%]
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Chlorophyll a
Chlorophyll b
Carotinoide
Chlorella vulgaris
Isochrysis spec.
Anabaena variabilis
Abbildung 19: Relative Pigmentverteilung in den untersuchten Mikroalgen
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Die Chlorophyllgehalte (Chlorophyll a und b) der Chlorella vulgaris- und Chlamydomonas
reinhardtii-Suspensionen unterschieden sich kaum, es wurden jeweils etwa 8 µg/ml ermittelt, das
macht über 80 % des Gesamtpigmentgehaltes aus. Wie in der Abbildung 19 deutlich zu erkennen
ist, ähnelt sich die Zusammensetzung aus Chlorophyll a und b bei den beiden Algenarten sehr.
Unter Berücksichtigung der niedrigeren Zellzahlen bei ähnlichem Zellaufbau hat Chlamydomonas
reinhardtii den höheren absoluten Pigmentgehalt.
Isochrysis spec. hatte den niedrigsten Chlorophyllgehalt der untersuchten Mikroalgen.
Die Pigmentgehalte von Anabaena variabilis lassen sich nur mithilfe der relativen Anteile mit
anderen vergleichen, da aufgrund der langen Ketten keine Zellzahl pro Milliliter angegeben werden
kann, sondern das Wachstum durch photometrische Bestimmungen überwacht wird. Die
charakteristische Verteilung von Chlorophyll a und b in Cyanobakterien ist eindeutig gezeigt
(Abbildung 19). So ist Chlorophyll a in Blaualgen wie Anabaena variabilis das Hauptpigment,
während Grünalgen zusätzlich größere Anteile anderer Chlorophyllarten aufweisen [12].
Der relative Anteil an Carotinoiden (Abbildung 19) war in Isochrysis spec. am höchsten, während
Chlamydomonas reinhardtii den niedrigsten Carotinoidgehalt der untersuchten Algenarten aufwies.
Da es sich bei dieser photometrischen Methode um eine Summenmethode handelt, kann zwischen
den einzelnen Carotinoiden wie Lutein, Astaxanthin und ß-Carotin nicht differenziert werden. Somit
war die Entwicklung einer Methode (HPLC-Methode) erforderlich, die den Nachweis der einzelnen
Anteile ermöglicht.
6.4.1.3
Analytik der Carotinoide
6.4.1.3.1 Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Astaxanthin
Die quantitative Bestimmung des Carotinoides Astaxanthin erfolgte wie nachfolgend beschrieben.
Dabei waren auch hier zunächst Untersuchungen zur Ermittlung der geeigneten
Probenvorbereitung vorausgegangen.
Extraktion
Es wird getrocknete, homogene Algenbiomasse in ein Zentrifugengefäß eingewogen.
Anschließend werden DMSO und Glasperlen zugegeben.
Das Zentrifugengefäß wird in ein vorgeheiztes Wasserbad gestellt, während der Inkubation wird
mehrfach gevortext.
Es wird zentrifugiert, um das Zellmaterial abzutrennen. Das Zentrifugat wird abgenommen und in
einem Maßkolben gesammelt.
Der Rückstand (Pellet) wird in Aceton resuspendiert, gevortext und anschließend erneut
zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen.
Die Extraktion mit Aceton wird so oft wiederholt, bis die Extinktion des Überstandes bei 474 nm
gegen Aceton gemessen kleiner 0,1 ist.
Die gesammelten Zentrifugate werden vereinigt und mit Aceton aufgefüllt. Die carotinoidhaltige
Lösung wird erneut zentrifugiert, um mögliche Partikel vollständig abzutrennen.
Die Extinktion der partikelreinen Lösung wird gegen Aceton bei 474 nm gemessen. Wenn diese
zwischen 0,75 und 1,25 liegt, ist der Ansatz für die nachfolgende Hydrolyse verwendbar, sonst
sind weitere Verdünnungen notwendig. Typisch ist eine 1 : 5 Verdünnung mit Aceton.
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Hydrolyse (Aufspaltung der Carotinoidesterbindungen)
Für die anschließende HPLC-Analyse des Probenextraktes ist eine Hydrolyse erforderlich. In
einem verschließbaren Reagenzglas wird der Extrakt mit Tris-HCl-Puffer (pH = 7) versetzt und im
verschlossenen Reagenzglas in einem Wasserbad inkubiert.
Es
wird
Cholesterolesterase-Stammlösung
(Pseudomonas
flourescens)
[Fa. SIGMA]
zugegeben. Das Reagenzglas wird in ein temperiertes Wasserbad gestellt und mehrmals
vorsichtig geschwenkt.
Anschließend werden Na2SO4 und Petrolether zugegeben und gevortext, so dass die freien
Carotinoide in die Petroletherphase übergehen.
Dieser Ansatz wird zentrifugiert und die Petroletherphase in ein zum Abdampfen geeignetes Gefäß
abgetrennt. Die wässrige Phase wird mit Petrolether erschöpfend extrahiert. Alle
Petroletherphasen werden vereinigt und das Lösungsmittel wird mit Stickstoff abgeblasen.
Der Rückstand wird in mobiler Phase aufgenommen und unverdünnt mittels HPLC analysiert [13].
HPLC-Analytik
Die Prüfung der Algenbiomasse auf den Gehalt an Astaxanthin erfolgte mittels HPLC-Analyse. Die
HPLC-Apparatur besteht aus einer Knauer WellChrom Ministar Pumpe K-1001 mit einem
Autosampler K-3800 und einem KNAUER WellChrom DAD K-2800.
Die Extrakte werden über eine Trennsäule bei 25 °C getrennt. Die Detektion erfolgt bei einer
Wellenlänge von 474 nm. Der Astaxanthinpeak im Chromatogramm wird durch einen Vergleich der
Retentionszeit mit dem Astaxanthinstandard (Fa. SIGMA) identifiziert.
Kalibration
Zur Herstellung einer Astaxanthin-Stammlösung werden ca. 3,0 mg Astaxanthin (Fa. SIGMA) in
einen 10-ml-Maßkolben genau eingewogen, in Chloroform gelöst und mit Chloroform bis zur Marke
aufgefüllt. 1 ml der so erhaltenen Stammlösung wird in einen 10-ml-Maßkolben pipettiert und mit nHexan zur Marke aufgefüllt (verdünnte Stammlösung). Die Standardlösungen werden mit n-Hexan
aus der verdünnten Stammlösung wie nachfolgend beschrieben (Tabelle 14) arbeitstäglich frisch
hergestellt.
Standard 1
Standard 2
Standard 3
Standard 4
Standard 5
Standard 6
Standard 7
Standard 8
Tabelle 14:
Volumen der verdünnten Stammlösung Astaxanthin
[ml]
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Herstellung der Astaxanthin-Standardlösungen
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Gesamtvolumen
[ml]
10
10
10
10
10
10
10
10
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Die Extinktion jeder einzelnen Standardlösung wird bei einer Wellenlänge von 474 nm gegen nHexan gemessen. Aus diesen Messwerten werden die Konzentrationen an Astaxanthin in den
Standardlösungen nach Gleichung 1 berechnet. Aufgrund der unbekannten Stabilität des
Astaxanthin-Gehaltes in der Referenzsubstanz war die arbeitstägliche Berechnung der
Astaxanthin-Konzentration aus den ermittelten Extinktionen erforderlich.
cAstaxanthin
cAstaxanthin
E474
2100
10000
E 474 10000
2100
Astaxanthin-Konzentration in µg/ml
gemessene Extinktion der Astaxanthin-Standardlösung
Extinktionskoeffizient einer 1%igen Astaxanthin-Lösung in Hexan, gemessen
in einer Schichtdicke von 1 cm bei 474 nm
Verdünnungsfaktor
Gleichung 1: Emittlung der Astaxanthin-Konzentration [13]
Die Standardlösungen wurden mittels HPLC analysiert. Aus den Peakflächen von Astaxanthin im
Chromatogramm und den über die Extinktion E474 ermittelten Konzentrationen wurde eine
Kalibierkurve erstellt.
Der Gehalt an Astaxanthin in den Probenlösungen wurde aus der ermittelten Peakfläche von
Astaxanthin im Chromatogramm mithilfe der ermittelten Kalibrationsgleichung errechnet. Unter
Berücksichtigung der Einwaage und der Verdünnungen der Probenlösungen wurde der Gehalt an
Astaxanthin in der Algenbiomasse berechnet.
Prüfung der Validität
Die beschriebene HPLC-Methode zur Bestimmung des Astaxanthingehaltes in Algenbiomasse
wurde auf ihre Validität geprüft. Kriterien für die Prüfung der Validität der Methode waren die
Prüfung der Spezifität, der Linearität, der Präzision und der Richtigkeit.
Prüfung auf Eignung des Systems
Das System ist zur Bestimmung von Astaxanthin in Algenbiomasse geeignet, wenn
1. Astaxanthin im HPLC-Chromatogramm der Probenlösung zur gleichen Retentionszeit eluiert
wie der Astaxanthin-Standard,
2. neben einer ausreichenden Präzision der Messungen auch eine lineare Abhängigkeit zwischen
der Astaxanthin-Konzentration (Standard) und der HPLC-Peakfläche besteht.
Abbildung 20:
HPLC-Chromatogramm der Astaxanthin-Standardlösung
Abbildung 21:
HPLC-Chromatogramm der Probenlösung
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Abbildung 22: HPLC-Chromatogramm der mit Astaxanthin dotierten Probenlösung
Wie in den drei Chromatogrammen (Abbildungen 20 bis 22) deutlich erkennbar ist, eluiert
Astaxanthin stets zur selben Retentionszeit, somit sind Störungen, die durch Matrixbestandteile
verursacht werden könnten, ausgeschlossen.
Linearität/Präzision
Die Prüfung auf Linearität erfolgte mit den bereits beschriebenen Kalibrationsstandards. Diese
wurden mittels HPLC analysiert. Die bei 474 nm gemessenen Extinktionen, die daraus
berechneten Konzentrationen an Astaxanthin in den Standardlösungen und die gemessenen
HPLC-Peakflächen sind in der Tabelle 15 beispielhaft dargestellt.
Standard
1
2
3
4
5
6
7
8
Tabelle 15:
E474
0,0612
0,2008
0,2927
0,4615
Astaxanthin [µg/ml] berechnet
0,291
0,956
1,394
2,198
3,032
3,402
3,952
4,653
0,6368
0,7144
0,8299
0,9771
Peakfläche
116559
361235
544137
841632
1110129
1306103
1542485
1803413
Kalibrationsstandards zur Prüfung der Linearität der Methode
Die Abbildung 23 zeigt die lineare Abhängigkeit der Analysensignale (HPLC-Peakfläche) von der
Konzentration an Astaxanthin bei einer Wellenlänge von 474 nm.
2000000
Fläche
1500000
1000000
y = 386716x - 4865,1
R2 = 0,9992
500000
0
0,0
1,0
2,0
3,0
µg/ml Astaxantin
Abbildung 23: Kalibrationsfunktion des Astaxanthin-Standards
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4,0
5,0
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Statistische Daten:
(ermittelt mittels Rechenprogramm LABQUANT)
Reststandardabweichung (Sy):
Verfahrensstandardabweichung (Sxo):
Verfahrensvariationskoeffizient (Vxo):
Linearitätstest (nach MANDEL):
Nachweisgrenze:
Bestimmungsgrenze:
17756
0,046
1,84 %
Linearität bestätigt
0,17 µg/ml Astaxanthin
0,58 µg/ml Astaxanthin
Die Linearität der Abhängigkeit der Signalintensität (Peakfläche) von der AstaxanthinKonzentration konnte über den gesamten Bereich von 0,3 bis 4,7 µg/ml nachgewiesen werden.
Die Standardlösungen mit einer Astaxanthin-Konzentration von 3,03 µg/ml wurden zur Ermittlung
der Präzision sechsfach analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 16 dargestellt.
Standardlösung
Volumen
Stammlösung [ml]
Gesamtvolumen [ml]
Konzentration
Astaxanthin
[µg/ml]
HPLCPeakfläche
5a
1,0
10
3,03
1132648
5b
1,0
10
3,03
1114125
5c
1,0
10
3,03
1102939
5d
1,0
10
3,03
1103002
5e
1,0
10
3,03
1102449
5f
1,0
10
3,03
1105611
Mittelwert
Tabelle 16:
1110129
Standardabweichung
11874
Vertrauensbereich ( = 0,05)
12463
Variationskoeffizient [%]
1,07
Kalibrationsstandards zur Ermittlung der Präzision der Methode
Die gemessenen Peakflächen waren normalverteilt (Test nach DAVID) und ausreißerfrei (Test nach
GRUBBS). Nach KROMIDAS [14] sollte der Variationskoeffizient einer Analysenmethode, die zur
Gehaltsbestimmung im Spezifikationsbereich von 90 bis 110 % eingesetzt wird, maximal 6,25 %
betragen. Die Präzision der Methode zur Bestimmung der Fläche des Astaxanthin-Peaks mittels
HPLC war mit einem Variationskoeffizienten von 1,07 % ausreichend hoch.
Unter diesen Gesichtspunkten ist die HPLC-Methode zur Bestimmung von Astaxanthin in
Algenbiomasse geeignet.
Matrixbezogene Prüfung der Methode
Zusätzlich zu der beschriebenen Prüfung der Validität der HPLC-Analytik wurde die Methode zur
Bestimmung des Gehaltes an Astaxanthin einschließlich des Extraktionsverfahrens auf Linearität,
Präzision und Richtigkeit überprüft.
Die Bestimmung von Astaxanthin in Algenbiomasse sollte im Konzentrationsbereich von 70 bis
130 % der im Probenextrakt vorliegenden Astaxanthinkonzentration geprüft werden.
Dazu wurde die Linearität der Methode in zwei Schritten geprüft. Einerseits wurde die Einwaage
der Algenbiomasse im Bereich von 70 bis 130 % der Soll-Einwaage von 25 mg variiert,
andererseits wurde der Probenextrakt vor der Hydrolyse unterschiedlich verdünnt.
Seite 37 von 62
MAL GmbH
Die Präzision der Methode wurde aus den bei unterschiedlichen Einwaagen ermittelten
Astaxanthin-Gehalten berechnet. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:
Die berechneten Gehalte an Astaxanthin für die einzelnen Analysenlösungen waren jeweils
normalverteilt (Test nach DAVID), ausreißerfrei (Test nach GRUBBS) und wiesen keinen Trend
auf (Test nach NEUMANN).
Die Linearität der Methode konnte einerseits über den gesamten Arbeitsbereich von
70 bis 130 % der Solleinwaage an getrockneter Algenbiomasse (17,5 bis 32,5 mg) und
andererseits über den gesamten Bereich der unterschiedlichen Verdünnungen des Extraktes
vor der Hydrolyse nachgewiesen werden.
Nach KROMIDAS [14] sollte der Variationskoeffizient einer Analysenmethode, die zur
Gehaltsbestimmung im Spezifikationsbereich von 90 bis 110 % eingesetzt wird, maximal
6,25 % betragen. Die Präzision der Methode zur Bestimmung des Gehaltes an Astaxanthin
aus Algenbiomasse war demzufolge ausreichend hoch.
Des Weiteren wurden zur Prüfung der Richtigkeit der Methode Wiederfindungsversuche
durchgeführt, wobei eine durchschnittliche Wiederfindungsrate an Astaxanthin von 104,6 % des
Erwartungswertes ermittelt wurde.
In Zusammenfassung aller Ergebnisse lässt sich feststellen:
Der Zusammenhang zwischen dem Analysensignal (HPLC-Peakfläche) und der Konzentration
an Astaxanthin war im gesamten Arbeitsbereich linear.
Die durch Mehrfachbestimmung erhaltenen HPLC-Peakflächenwerte bzw. die AstaxanthinGehalte der getrockneten Algenbiomasse waren ausreichend präzise.
Die Winderfindungsrate lag im Bereich von 95 bis 105 % des Erwartungswertes.
Die hier beschriebene Analysenmethode ist für die Bestimmung des Astaxanthin-Gehaltes in
getrockneter Algenbiomasse geeignet.
6.4.1.3.2 Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Lutein und -Carotin
Neben Astaxanthin sind Lutein (Xanthophyll) und ß-Carotin als weitere Carotinoide von
besonderem Interesse. Sie wurden aufgrund ihrer biologischen Bedeutung ausgewählt. Ziel war
es, diese Verbindungen möglichst mit dem bereits beschriebenen HPLC-Trennverfahren qualitativ
und quantitativ zu bestimmen. Dabei wurden die Systemeignung, die Linearität und die Richtigkeit
(Elemente der Validitätsprüfung) geprüft.
Die Abbildung 24 zeigt beispielhaft ein HPLC-Chromatogramm eines Standard-Mix aus
Stammlösungen von Lutein, Astaxanthin und ß-Carotin. Zuerst eluiert ß-Carotin (RT = 2,1 min),
dann Astaxanthin (RT = 10,7 min) und schließlich Lutein (RT = 16,5 min). In diesem
Chromatogramm sind als x-Achse die Retentionszeit in Minuten, als y-Achse die Wellenlänge im
Bereich zwischen 400 und 500 nm und als z-Achse die Signalintensität in mAU aufgetragen.
Seite 38 von 62
Abbildung 24:
MAL GmbH
HPLC-Chromatogramm des Standard-Mix
Die Prüfung der Validität der Methode soll hier nicht detailliert dargestellt werden. Die Ergebnisse
dieser Prüfung lauten zusammengefasst wie folgt:
Die Standard-Substanzen wurden selektiv getrennt.
Der Zusammenhang zwischen dem Analysensignal (HPLC-Peakfläche) und der Konzentration
an Lutein und ß-Carotin war im gesamten Arbeitsbereich von 1,1 bis 8,0 µg/ml linear.
Die Winderfindungsrate lag im Bereich von 95 bis 105 % des Erwartungswertes. Die
Wiederfindungsrate an Lutein betrug 97,2 % und die an ß-Carotin 97,3 %.
6.4.1.3.3 Entwicklung einer In-Prozess-Kontrolle (IPC) für die Akkumulation von Astaxanthin
Das Ziel dieser Teilaufgabe war die Einführung einer photometrischen Schnellmethode zur
Analyse von Astaxanthin. Der Gehalt an Astaxanthin sollte in Abhängigkeit von der Zeit mit einer
schnell durchführbaren Methode analysiert werden können, um so den „richtigen Erntezeitpunkt“
zu erkennen.
Für die In-Prozess-Kontrolle der Akkumulation von Astaxanthin in Haematococcus pluvialis-Zellen
wird die im Abschnitt 6.4.1.3.1 beschriebene Methode der Extraktion mit DMSO und Aceton ohne
Hydrolyse verwendet. Nach Einleitung der Stressphase wird täglich eine repräsentative Probe von
10 ml Algenlösung entnommen und wie beschrieben aufgearbeitet. Charakteristisch für
Carotinoide (Astaxanthin, Lutein usw.) ist ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von
474 nm. Die Extinktion bei 670 nm spiegelt den Chlorophyllanteil wider. Die Extinktionen werden
gegen einen Blindwert DMSO/Aceton (1:5) gemessen. Zur Überprüfung dieser
prozessanalytischen Bestimmungsmethode wurde der Astaxantingehalt mittels HPLC bestimmt.
Zu berücksichtigen ist, dass der prozessanalytisch bestimmte Astaxanthigehalt nur der Kontrolle
dient, da bei einer Wellenlänge von 474 nm auch andere Carotinoide absorbieren.
Das Verhältnis der gemessenen Extinktionen bei 474 nm und 670 nm diente in der IPC-Methode
als Maß für den Astaxanthin-Gehalt. Dieses Verhältnis wurde in der Abbildung 25 mit den mittels
HPLC ermittelten Ergebnissen verglichen.
Seite 39 von 62
MAL GmbH
2,5
16
14
12
10
2
1,5
8
6
4
1
0,5
2
0
Astaxanthingehalt [%]
Verhältnis E 474/E670
18
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Stressdauer (Tage)
E(474 nm)/E(670 nm)
HPLC
Abbildung 25: Verlauf der Verhältnisse von E474 (Carotinoide) und E670 (Chlorophyll) in Abhängigkeit von der
Stressdauer. Vergleich mit den mittels HPLC ermittelten Astaxanthin-Gehalten
Unabhängig von der Analysenmethode ist in der Abbildung 25 der gleiche Verlauf erkennbar. Die
Messwerte steigen bis zum 6. Tag der Reifung kontinuierlich an und sinken erst ab dem 7. Tag
wieder ab. Somit konnte eine optimale Reifungszeit für die Astaxanthinproduktion von 5 bis 6
Tagen abgeleitet werden. Sobald diese Zeit überschritten ist, überwiegt das Zellsterben gegenüber
der Astaxanthinbildung.
Die in der Abbildung 26 gezeigten Extrakte verdeutlichen noch einmal visuell den Farbumschlag
von grünen vegetativen zu roten gestressten Haematococcus pluvialis-Zellen während des
Reifungsprozesses.
Abbildung 26: Farbverlauf der Algenextrakte in Abhängigkeit von der Reifungszeit (linker Extrakt = Tag 0, rechter Extrakt
= Tag 7)
6.4.1.3.4 Carotinoid-Gehalte in Haematococcus pluvialis
Astaxanthin
Es wurden je zwei Ansätze von drei verschiedenen Algenbiomassen wie im Abschnitt 6.4.1.3.1
beschrieben aufgearbeitet und mittels HPLC analysiert:
getrocknete, pulverisierte Algenbiomasse der Fa. TAGIS TROPICAL MARIN,
getrocknete, pulverisierte Algenbiomasse der Fa. SUBITEC und
getrocknete, pulverisierte Algenbiomasse der MAL GMBH.
Seite 40 von 62
Herkunft
TAGIS TROPICAL MARIN
SUBITEC
MAL GMBH
Tabelle 17:
MAL GmbH
Ermittelter
Astaxanthin-Gehalt [% TS]
1,4-1,5
4,2-4,3
2,2-2,6
Herstellerangabe des
Astaxanthin-Gehaltes [% TS]
1,5-2,0
3,08
-
Astaxanthin-Gehalte der Mikroalge Haematococcus pluvialis
Im Vergleich zur Literatur [15], in der Astaxanthin-Gehalte von ca. 2 % beschrieben sind, weisen
die bei der MAL GMBH gezüchteten Algen den entsprechenden Gehalt auf. Die Algenbiomasse der
Fa. TAGIS TROPICAL MARIN hat den geringsten Anteil an Astaxanthin von den drei untersuchten
Proben und liegt knapp unterhalb des vom Hersteller angegebenen Astaxanthin-Gehaltes.
Die höchsten Werte hinsichtlich des prozentualen Anteils an Astaxanthin in der Algenbiomasse
wurden mit einer von der Fa. SUBITEC bezogenen Algenbiomasse erzielt. Der ermittelte
Astaxanthin-Gehalt lag mit ca. 4,2 % deutlich über dem vom Hersteller ausgewiesenen Wert. Da
eine valide Methode zur Bestimmung des Astaxanthin-Gehaltes in Algenbiomasse eingesetzt
wurde, ist davon auszugehen, dass die ermittelten Gehalte an Astaxanthin richtig sind.
Die stark abweichenden Astaxanthin-Gehalte der verschiedenen untersuchten Algenbiomassen
der Mikroalge Haematococcus pluvialis sind wahrscheinlich auf unterschiedliche
Kultivierungsbedingungen zurückzuführen.
Lutein und -Carotin
Beispielhaft wurden vier aufkonzentrierte Ansätze einer Algenbiomasse der Fa. TAGIS TROPICAL
MARIN wie im Abschnitt 6.4.1.3.2 beschrieben aufgearbeitet und mittels HPLC analysiert.
In der Tabelle 18 sind die ermittelten Pigmentgehalte dargestellt.
Algen
Probe 1
Probe 2
Probe 3
Probe 4
Mittelwert
Standardabweichung
Vertrauensbereich
( = 0,05)
Tabelle 18:
Lutein
[% TS]
0,053
0,047
0,055
0,051
0,052
0,003
5,77
0,005
Mittelwert
Standardabweichung
Vertrauensbereich
( = 0,05)
ß-Carotin
[% TS]
0,050
0,044
0,048
0,045
0,047
0,003
6,38
0,005
Carotinoid-Gehalte in Haematococcus pluvialis
Der Lutein- bzw. ß-Carotin-Gehalt von Haemaotcoccus pluvialis liegt bei jeweils ca. 0,05 % TS. Im
Vergleich zu den ermittelten Astaxanthinwerten der Algenbiomasse der Fa. TAGIS TROPICAL MARIN
von etwa 1,4 bis 1,5 % spielen Lutein und ß-Carotin nur eine untergeordnete Rolle bei den
Carotinoiden in der Mikroalge Haematococcus pluvialis.
Entsprechend der Literatur [5] liegt der Astaxanthin-Gehalt in Haemaotcoccus pluvialis bei 99 %
des Gesamtcarotinoid-Gehaltes. Alle anderen Carotinoide sind nur in Kleinstmengen
(< 1 %) enthalten. Die ermittelten Lutein- bzw. ß-Carotin-Gehalte der Algenbiomasse der Fa. TAGIS
TROPICAL MARIN entsprechen ca. 3 % des gesamten Carotinoidgehaltes und bestätigen die in der
Literatur genannte Größenordnung.
Seite 41 von 62
6.4.1.4
MAL GmbH
Analyse des Proteingehaltes
6.4.1.4.1 Methoden
Bestimmung des Gesamtstickstoff-Gehaltes
Die Ermittlung des Gesamtstickstoff-Gehaltes erfolgte in Anlehnung an [16] und dient der
Bestimmung des Gesamtgehaltes an Stickstoff. Die Stickstoffverbindungen der Probe werden
durch säurehydrolytischen Aufschluss vollständig in Ammonium-Ionen überführt, die photometrisch
bestimmt werden. Die detaillierte Durchführung wurde in [17] beschrieben. Da der Stickstoffgehalt
von Proteinen ungefähr 16 % beträgt, kann durch Multiplikation des Stickstoffgehaltes mit dem
Faktor 6,25 die Proteinmenge rückgerechnet werden [18].
Proteinbestimmung nach LOWRY
Die Durchführung der Methode zur Bestimmung des Proteingehaltes nach LOWRY wurde in [17]
ausführlich beschrieben.
6.4.1.4.2 Ergebnisse der Ermittlung des Proteingehaltes über den Gesamtstickstoff-Gehalt
Es wurden jeweils mindestens zwei verschiedene Proben einer Algenart in Doppelbestimmung
untersucht. Die Proteingehalte der untersuchten Mikroalgen sind in der Tabelle 19 angegeben.
Mikroalge
Chlorella vulgaris
Haematococcus pluvialis
Anabaena variabilis
Isochrysis spec.
Tabelle 19:
Proteingehalt [%]
38,0
20,3
47,1
30,2
30,4
Literaturwerte [%]
45 bis 55 [19]
keine Angabe
55 bis 65 [19]
keine Angabe
27 [20]
Proteingehalte der untersuchten Mikroalgen
Die Proteingehalte von Anabaena variabilis (ca. 47 %) und Chlorella vulgaris (ca. 38 %) lagen
unter den in der Literatur beschriebenen Werten. Diese Unterschiede könnten auf verschiedene
Kultivierungsbedingungen zurückzuführen sein.
Der Literaturwert des Proteingehaltes in Isochrysis spec. (27 %) wurde bestätigt. Ein ähnlicher
Proteinanteil war auch in Chlamydomonas reinhardtii (ca. 30 %) enthalten. Den geringsten
Proteingehalt wies Haematococcus pluvialis mit lediglich 20 % auf.
6.4.1.4.3 Ergebnisse der Bestimmung des Proteingehaltes nach LOWRY
Aufgrund der Eigenfärbung der Untersuchungslösung wurden mit dieser Methode keine
auswertbaren Ergebnisse erzielt. Die Extinktionsdifferenz zwischen den grünen Ansätzen der
Algenbiomassen und den Standardlösungen aus Rinderserumalbumin bei einer Wellenlänge von
750 nm war zu gering. Eine Möglichkeit diese Methode trotzdem für die Untersuchung von
Proteingehalten in Algenbiomasse zugänglich zu machen, wäre das Standardadditionsverfahren.
Dieses Verfahren ist eine besondere Form der Kalibration und soll garantieren, dass
Matrixeinflüsse weitestgehend ausgeschaltet werden können. Die zu untersuchende Probe wird
mit definierten Konzentrationen an Protein aufgestockt und aus dem Messwert für die
ursprüngliche Probe und den Werten für die aufgestockten Proben kann dann die unbekannte
Proteinkonzentration ermittelt werden. Diese Variante wurde jedoch nicht weiter verfolgt, da mit der
Bestimmung des Proteingehaltes nach KJELDAHL (Gesamtstickstoff-Gehalt) eine geeignete
Methode vorhanden war.
Seite 42 von 62
6.4.1.5
MAL GmbH
Identifizierung und Quantifizierung von Fettsäuren
6.4.1.5.1 Methode
Die Fettsäuren werden aus der Algenbiomasse durch einen Säureaufschluss freigesetzt und
danach werden die durch Umesterung mit Trimethylsulfoniumhydroxid (TMSH) hergestellten
Fettsäuremethylester gaschromatographisch getrennt. Im Rahmen von Voruntersuchungen
wurden die Möglichkeiten zur Probenvorbereitung überprüft. Dabei wurden u. a. zwei
Extraktionsverfahren nach dem Säureaufschluss verglichen, die Stabilität der Fettsäuremethylester
untersucht und die mögliche Minimaleinwaage für die Analyse ermittelt.
Die Analysen wurden mit einem Gaschromatographen HP 5890 Series II durchgeführt. Zur
Trennung der Fettsäuremethylester wurde eine spezifische Kapillar-Säule verwendet. Das
Trägergas war Stickstoff und das Injektionsvolumen betrug 1 µl. Die Injektortemperatur betrug
250 °C. Der Detektor, ein Flammenionisationsdetektor (FID), hatte eine Temperatur von 290 °C.
Durch den Vergleich der Retentionszeiten der Fettsäuremethylester im Chromatogramm der Probe
mit denen der Standardsubstanzen werden die Fettsäuremethylester identifiziert. Die
Fettsäurezusammensetzung wird mithilfe der 100-%-Flächenmethode berechnet. Dazu werden
alle relevanten Peakflächen summiert und danach einzelne Peakflächen durch die
Peakflächensumme dividiert und mit 100 % multipziert.
6.4.1.5.2 Fettsäurespektren in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer
Untersuchungen zur Abhängigkeit des Fettsäurespektrums von der Kultivierungsdauer wurden an
den Spezies Isochrysis spec., Chlamydomonas reinhardtii und Anabaena variabilis durchgeführt.
In der Abbildung 27 sind drei Fettsäurespektren von Isochrysis spec. dargestellt. Die Mikroalgen
wurden zu verschiedenen Zeitpunkten (nach 21, 29 und 41 Tagen) geerntet.
Seite 43 von 62
MAL GmbH
% Flächenanteil
35
30
25
21 d
20
29 d
15
41 d
10
5
0
C 22:6
C 22:0
C 20:5
C 20:4
C 20:0
C 18:3
C 18:2
C 18:1
C 18:0
C 16:0
C 14:0
C 12:0
C 10:0
C 8:0
Fettsäuren
Abbildung 27: Fettsäurespektrum von Isochrysis spec. in Abhängigkeit vom Erntezeitpunkt
Wie in der Abbildung 27 zu erkennen ist, nahm der Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren
mit zunehmender Kultivierungsdauer zu. So stieg der Anteil an DHA (C22:6) innerhalb von 20
Tagen auf das Doppelte (17 %) an. Die Gehalte an Myristin- (C14:0), Palmitin- (C16:0), Stearin(C18:0) und Ölsäure (C18:1) sanken mit zunehmender Wachstumsdauer.
Im Falle von Chlamydomonas reinhardtii und Anabaena variabilis wurden Kulturen nach 4 Tagen
bzw. 10 Tagen bezüglich ihres Fettsäurespektrums untersucht. Am auffälligsten war dabei bei
beiden Spezies die Verdopplung der Summe der GC-Flächen nach 10 Tagen im Vergleich zu 4
Tagen. Die Verschiebung des Fettsäurespektrums hin zu langkettigen, mehrfach ungesättigten
Fettsäuren mit zunehmender Kultivierungsdauer war nicht so deutlich zu erkennen wie bei
Isochrysis spec. Lediglich der Gehalt an Linolsäure (C18:2) und Linolensäure (C18:3) nahm mit
der Kultivierungsdauer zu. In beiden untersuchten Mikroalgen stieg der Anteil von C18:2 von 9 auf
14 %. Der Gehalt von C18:3 nahm in Anabaena variabilis um 2 % zu, während er sich in
Chlamydomonas reinhardtii von 10 auf 20 % innerhalb von sechs Wachstumstagen verdoppelte.
Eine Ursache könnte die kürzere Kultivierungsdauer von 4 bzw. 10 Tagen im Vergleich zu
Isochrysis spec. (21-41 Tage) sein.
In der Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii betrug der Anteil an Palmitinsäure unabhängig von
der Wachstumsphase etwa 50 % der untersuchten Fettsäuren. Im Cyanobakterium Anabaena
variabilis lag der Anteil sogar über 65 %. im Vergleich dazu lag der Anteil an Palmitinsäure in
Isochrysis spec. in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer zwischen 17 und 22 %.
6.4.1.5.3 Fettsäurezusammensetzung der Mikroalgen
Bakterien können anhand ihrer Fettsäurezusammensetzung („Fingerprint“) identifiziert werden.
Auch Algen weisen ein typisches Fettsäurespektrum auf. Somit besteht die Möglichkeit anhand der
Spektren Veränderungen, z. B. Verunreinigungen (Bakterien) zu erkennen.
Die Mikroalge Isochrysis spec. ist aufgrund ihres hohen Gehaltes an -3-Fettsäuren (> 10 %), wie
Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), als Nahrungsadditiv im Gespräch.
Auch Haematococcus pluvialis zeichnet sich durch eine Reihe von langkettigen ungesättigten
Fettsäuren aus, deren prozentuale Anteile aber unter 10 % lagen.
Anabaena variabilis, Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii beinhalteten nur sehr
geringe Anteile an längerkettigen Fettsäuren (> C18).
Sehr auffällig war der hohe Anteil an Ölsäure (C18:1) in Chlorella vulgaris, mit 48 % lag er mehr
als doppelt so hoch wie in Isochrysis spec.
Die Abbildung 28 zeigt die Fettsäurespektren der untersuchten Mikroalgen im Vergleich.
Seite 44 von 62
MAL GmbH
% Flächenanteil
50
40
30
20
10
0
C 22:6
C 22:0
C 20:5
C 20:4
C 20:0
C 18:3
C 18:2
C 18:1
C 18:0
C 16:0
C 14:0
C 12:0
Anabaena variabilis
Chlamydononas reinhardtii
Chlorella vulgaris
Haemaotococcus pluvialis
Isochrysis spec.
Abbildung 28: Fettsäurespektren der Mikroalgen
Im menschlichen Körper kann durch Kettenverlängerung (Enzymeinwirkung) aus -Linolensäure
die EPA, welche eine wesentlich höhere biologische Wirksamkeit besitzt, gebildet werden, jedoch
ist diese Umwandlung außerordentlich verlustreich [21].
Das optimale Verhältnis von -6-Fettsäuren (Linol- und Arachidonsäure) zu -3-Fettsäuren (EPA,
DHA und Linolensäure) im Körper wäre 3:1, tatsächlich liegt es jedoch bei 20:1 [22].
Nahrungsergänzungsmittel aus Mikroalgen könnten somit dieses Verhältnis in die richtige Richtung
verschieben. Wie in Tabelle 20 deutlich wird, liegt das Verhältnis -6/ -3 in der Algenbiomasse bei
den fünf untersuchten Arten zwischen 0,2:1 und 4,3:1. Isochrysis spec. und Chlamydomonas
reinhardtii wären dabei im Hinblick auf die Fettsäurezusammensetzung der untersuchten
Mikroalgen am besten als Nahrungsadditiv geeignet. Chlorella vulgaris hat den geringsten Anteil
an ungesättigten Fettsäuren und weist außerdem ein Verhältnis über 3:1 auf. Somit ist Chlorella
vulgaris weniger wegen der Fettsäurezusammensetzung als wegen ihres sehr hohen Protein- und
Pigmentgehaltes interessant.
-6-Fettsäuren
-3-Fettsäuren
-6 und -3
-6/ -3
Tabelle 20:
6.4.1.6
Chlorella
vulgaris
17,7
4,1
21,8
4,3:1
Haematococcus
pluvialis
30,3
25,4
45,7
1,2:1
Isochrysis
spec.
6,7
29,3
36,0
0,2:1
Chlamydomonas
reinhardtii
10,0
44,8
44,8
0,2:1
Anabaena
variabilis
14,5
29,0
43,5
0,5:1
Anteile der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Mikroalgen
HPLC-Analytik von Vitaminen und deren Zersetzungsprodukten
Mikroalgen enthalten Vitamine in Konzentrationen, die für die menschliche Ernährung bedeutsam
sein könnten. Die MAL GmbH verfügt über valide Methoden zur quantitativen Bestimmung von
Vitaminen. Auf deren Basis und mithilfe einer Vitaminmischung wurde eine Methode zur
Bestimmung der Abbau- und Zersetzungsprodukte von Vitaminen erarbeitet und auf Validität
geprüft.
Die in der Literatur beschriebenen Abbau- und Zersetzungsprodukte der relevanten Vitamine
wurden in Voruntersuchungen hinsichtlich der kleinsten nachweisbaren Konzentrationen geprüft.
Seite 45 von 62
MAL GmbH
Es wurden die in der Tabelle 21 aufgeführten Abbau- und Zersetzungsprodukte für die Prüfung der
Validität der Methode ausgewählt.
Abbau- und
Zersetzungsprodukt
4-Methyl-5-thiazolethanol
Thiochrom
Furfural
Furan-2-carbonsäure
Nicotinsäure
Lumichrom
Lumiflavin
Tabelle 21:
Detektionswellenlänge
250 nm
375 nm
265 nm
250 nm
265 nm
250 nm
265 nm
Vitamin
Vitamin B1
Vitamin B1
Vitamin C
Vitamin C
Vitamin B3
Vitamin B2
Vitamin B2
Retentionszeit
14,0 min
15,2 min
17,5 min
16,9 min
5,3 min
27,3 min
26,6 min
Ausgewählte Abbau- und Zersetzungsprodukte zur Prüfung der Validität der Methode
Als Referenzsubstanzen der bekannten Abbau- und Zersetzungsprodukte wurden Substanzen der
Fa. ACROS ORGANICS und der Fa. SIGMA-ALDRICH verwendet.
Die Prüfung auf Validität wurde an einer Vitaminmischung, die 8 Vitamine in verschiedenen
Konzentrationen enthielt, durchgeführt.
Die Ergebnisse der Prüfung der Validität der Methode fasst die Tabelle 22 zusammen.
Verbindung
Nachweisgrenze
Nachweisgrenze
bezogen auf
Algenbiomasse
Bestimmungsgrenze
Linearität
Präzision
Wiederfindungsrate
4-Methyl-5thiazolethanol
0,34 µg/ml
3,4 ppm
1,20 µg/ml
bestätigt
2,88 %
100,1 %
Thiochrom
0,26 µg/ml
2,6 ppm
0,91 µg/ml
bestätigt
2,58 %
98,7 %
Furfural
0,41 µg/ml
4,1 ppm
1,43 µg/ml
bestätigt
1,49 %
99,5 %
Furan-2carbonsäure
1,13 µg/ml
11,3 ppm
3,82 µg/ml
bestätigt
4,75 %
98,4 %
Nicotinsäure
0,76 µg/ml
7,6 ppm
2,58 µg/ml
bestätigt
4,39 %
98,8 %
Lumichrom
0,37 µg/ml
3,7 ppm
1,28 µg/ml
bestätigt
3,72 %
99,6 %
Lumiflavin
0,24 µg/ml
2,4 ppm
0,83 µg/ml
bestätigt
2,37 %
98,8 %
Tabelle 22:
Übersicht der Ergebnisse zur Prüfung der Validität der Methode zur Bestimmung von Abbau- und
Zerfallsprodukten von Vitaminen
Zusätzlich zu der bereits vorhandenen Methode für die Analytik der Vitamine existiert somit nun
auch eine valide Methode für die Identifizierung und Quantifizierung von Abbau- und
Zersetzungsprodukten. Das ermöglicht weiterführende Untersuchungen zur Bestimmung von
Vitaminen und deren Abbauprodukten in Algenbiomasse, die bisher jedoch noch nicht
durchgeführt wurden.
Seite 46 von 62
6.4.1.7
MAL GmbH
Zusammenfassung
Mit dem Ziel interessante Wirkstoffe aus Mikroalgen zu identifizieren und zu quantifizieren wurden
im Rahmen des Projektes Methoden zur Analytik von Zellinhaltsstoffen entwickelt und bezüglich
ihrer Validität geprüft. Aufgrund der erzielten Ergebnisse kann die MAL GmbH zukünftig folgende
Untersuchungen zur Charakterisierung von Mikroalgen anbieten:
Chlorophylle lassen sich schnell und mit ausreichender Genauigkeit nach einer Extraktion in
siedendem Methanol photometrisch bestimmen.
Carotinoide, die als pharmazeutische Wirkstoffe zum Einsatz kommen können, sind
Astaxanthin, ß-Carotin und Lutein. Sie werden nach aufwändiger Probenvorbereitung mit einer
validen HPLC-Methode identifiziert und quantifiziert.
Zur Überwachung der Astaxanthin-Akkumulation in Haematococcus pluvialis wurde eine
Methode zur In-Prozess-Kontrolle entwickelt.
Die Proteinbestimmung erfolgt nach KJELDAHL, dabei wird der Gehalt an Stickstoff nach einem
säurehydrolytischen Aufschluss photometrisch bestimmt und daraus durch Multiplikation mit
einem Faktor (6,25) der Rohproteingehalt berechnet.
Die Fettsäureanalytik erfolgt gaschromatographisch nach einem säurehydrolytischen
Aufschluss.
Zur Analyse von Vitaminen und deren Abbau- und Zerfallsprodukten existiert eine valide
HPLC-Methode.
Anhand der zahlreichen Experimente ergaben sich folgende Gesichtspunkte hinsichtlich der
kommerziellen Nutzung von Algeninhaltsstoffen bezogen auf die untersuchten Algenspezies:
Chlorella vulgaris zeichnete sich sowohl durch einen sehr hohen Chlorophyll- (8 µg/ml) als
auch durch einen hohen Proteingehalt (ca. 40 % TS) aus. Aus diesen Gründen wird sie bereits
als Nahrungsadditiv verwendet.
Haematococcus pluvialis akkumuliert unter Stressbedingungen große Mengen Astaxanthin
(Kultivierung in der MAL GmbH: 2 bis 3 % TS). Aufgrund der antioxidativen Wirkung dieses
Ketocarotinoids wird ein Einsatz auf medizinischem Gebiet diskutiert.
Isochrysis spec. zeichnet sich durch ihr besonderes Fettsäurespektrum aus. Die biologisch
hochwirksamen -3-Fettsäuren DHA und EPA wiesen einen Anteil von fast 20 % des
gesamten Fettsäureanteils auf.
Die große biologische Variabilität, die bei der Analytik von Zellinhaltsstoffen beobachtet werden
konnte, ist zum großen Teil auf unterschiedliche Kultivierungsbedingungen zurückzuführen. Durch
gezielte Milieubedingungen, Wachstumsraten, Erntezeitpunkte usw. können verschiedene
Substanzen bevorzugt akkumuliert werden. Diese wirtschaftlich wichtigen technologischen
Produktionsbedingungen sollten weiter untersucht werden, da optimale Wachstumsbedingungen
Voraussetzung für qualitativ hochwertige Mikroalgen sind.
6.4.2
Nutzung als Düngemittel
Algenbiomasse ist reich an Mineralstoffen und sollte sich daher als Düngemittel eignen. Die
getrocknete Biomasse von Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii und Anabaena variabilis
wurde hinsichtlich ihrer düngemittelrelevanten Inhaltsstoffe sowie ihres Gehaltes an Schadstoffen
analysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 23 und 24 dargestellt. Dabei ist anhand der
Untersuchungsergebnisse von je 2 unterschiedlichen Kultivierungsansätzen der Algen zu
erkennen, dass die Zusammensetzung der Algenbiomassen schwanken kann. Im Vergleich zu
organischen Düngemitteln wiesen die untersuchten Algenbiomassen deutlich höhere
Nährstoffgehalte auf. Hinsichtlich der Gehalte an Schadstoffen erfüllten die Algenbiomassen die
gesetzlichen Anforderungen gemäß Bioabfallverordnung, welche u. a. die Aufbringung von
Bioabfällen auf Flächen regelt.
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MAL GmbH
Gehalt [mg/kg]
Gehalt
Gehalt [mg/kg]
Gehalt [mg/kg]
Chlamydomonas
[mg/kg]
Chlorella vulgaris
Anabaena variabilis
Nährstoff
reinhardtii
Wirtschafts6
dünger
1. Analyse 2. Analyse 1. Analyse 2. Analyse 1. Analyse 2. Analyse
P2O5
4.100
33.000
26.000
26.000
41.000
66.000
64.000
Gesamt6.100
33.000
36.000
25.000
28.000
41.000
43.000
Stickstoff
K2O
4.600
25.000
21.000
22.000
22.000
45.000
28.000
nicht
nicht
nicht
nicht
CaO
8.000
3.000
3.000
aufgeführt
analysiert
analysiert
analysiert
MgO
1.400
13.000
12.000
9.000
10.000
16.000
15.000
Tabelle 23:
Ergebnisse der Analyse von Algenbiomassen hinsichtlich düngemittelrelevanter Inhaltsstoffe
Schwermetall
Blei
Cadmium
Chrom
Kupfer
Nickel
Quecksilber
Zink
Tabelle 24:
Gehalt [mg/kg]
Chlorella
vulgaris
5
<0,5
0,6
34
4
<0,2
150
Gehalt [mg/kg]
Chlamydomonas
reinhardtii
7
<0,5
<0,5
6
<1
<0,2
41
Gehalt [mg/kg]
Anabaena
variabilis
<5
<0,5
12
6
9
<0,2
21
Grenzwert7
[mg/kg]
100
1
70
70
35
0,7
300
Ergebnisse der Schwermetallanalyse an Algenbiomassen
Nach der Bestimmung der Gehalte an düngemittelrelevanten Inhaltsstoffen wurden an den
Algenbiomassen Pflanzenverträglichkeitstests zur Ermittlung der Düngewirkung durchgeführt. Zum
Vergleich wurde ein handelsüblicher Volldünger („Blau“ Mineralischer NPK-Dünger mit
Magnesium, Beckmann & Brehm GmbH) mitgeführt. Die Angabe der Wachstumssteigerung erfolgt
in Bezug zu einer ungedüngten Kontrolle. Die Zugabemengen an Algenbiomassen bzw. Dünger zu
je 50 g Einheitserde mit je 20 Samen Sommergerste wurden zum einen auf der Grundlage einer
Düngeempfehlung auf die jeweiligen Nährstoffgehalte abgestimmt berechnet. Zum anderen
wurden je 3 gleiche Zugabemengen pro Biomasse bzw. Dünger gewählt. Die Ergebnisse der
Pflanzenverträglichkeitstests zeigen die Abbildungen 29 und 30.
Aus der Abbildung 29 geht hervor, dass der Volldünger unabhängig von der Zugabemenge die
größte Wachstumssteigerung hervorrief. Zusätzlich wurde beobachtet, dass nur beim Volldünger
mit steigender Zugabekonzentration auch eine deutlich zunehmende Wachstumssteigerung zu
verzeichnen ist. Die Algenbiomassen förderten bei der geringsten Zugabekonzentration
(0,1 g/50 g) das Pflanzenwachstum ähnlich gut wie der Volldünger. Die Erhöhung der
Zugabemengen (0,2 bzw. 0,3 g/50 g) führte im Vergleich zum Volldünger aber zu keiner auffallend
verbesserten Wachstumsförderung. Dabei ist zu berücksichtigen, dass der Volldünger eine
Mischung von Nährstoffen darstellt, während die Algenbiomassen neben den Nährstoffen weitere
Komponenten wie z. B. Kohlenstoff enthalten. Es wurden daher auch Versuche durchgeführt, in
denen die Zugabemengen an die Nährstoffgehalte angepasst wurden. Innerhalb der getesteten
Algenbiomassen zeigte Chlamydomonas reinhardtii die geringste Düngewirkung.
6
7
mittlere Nährstoffgehalte in organischen Düngemitteln [23]
laut Bioabfallverordnung
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Wachstum gegenüber der Kontrolle
[%]
MAL GmbH
350,0
300,0
250,0
200,0
150,0
100,0
50,0
0,0
0,1 g/50 g
0,2 g/50 g
0,3 g/50 g
Zugabekonzentration
Chlorella vulgaris
Anabaena variabilis
Volldünger
Abbildung 29: Abhängigkeit der Wachstumssteigerung gegenüber der Kontrolle von der Zugabekonzentration der
Algenbiomassen bzw. des Düngers
Beim Vergleich der Daten in der Abbildung 30 fällt auf, dass nach Abstimmung der Zugabemengen
auf den jeweiligen Nährstoffgehalt die Düngewirkung des Volldüngers denen der Algenbiomassen
nicht so deutlich überlegen ist. Dennoch führte auch hier der Volldünger zum besten Ergebnis und
benötigte dabei die geringste Zugabemenge. Unter den getesteten Algenbiomassen kam
Chlamydomonas reinhardtii dem Volldünger am nächsten, erforderte aber auch die höchste
Zugabemenge.
Wachstum gegenüber der Kontrolle [%]
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0,09 g/ 50 g
0,17 g/ 50 g
Volldünger
Anabaena
variabilis
0,26 g/ 50 g
0,33 g/ 50 g
Chlorella vulgaris Chlamydomonas
reinhardtii
Algenart mit der dazugehörigen Zugabemenge
Abbildung 30: Vergleich der Wachstumsförderung durch Algenbiomassen bzw. Volldünger mit Zugabemengen bezogen
auf eine Düngeempfehlung
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MAL GmbH
6.4.3
6.4.4
Rückgewinnung von Phosphat
6.4.4.1
Anzucht von Mikroalgen unter Verwendung von Abwasser
Für die Anzucht von Mikroalgen in Abwasser wurde mit der Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii
gearbeitet. Diese Spezies hatte sich bei Vorversuchen im Vergleich von drei ausgewählten
Mikroalgen (Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Anabaena variabilis) während der
Anzucht in künstlichem Abwasser als am robustesten erwiesen. Chlamydomonas reinhardtii wurde
daraufhin parallel unter Verwendung einer optimierten Nährlösung und eines kommunalen
Abwassers über unterschiedlich lange Zeiträume in Blasenreaktoren angezüchtet. Dabei wurde
neben dem „normalen“Abwasser ein mit zusätzlichem Phosphat dotiertes Abwasser verwendet.
Die Abbildung 31 zeigt den Verlauf der Zellzahl während der Kultivierung.
5,00E+06
4,50E+06
4,00E+06
Zellzahl/ml
3,50E+06
3,00E+06
Nährlösung
2,50E+06
Abwasser
Abwasser dot iert
2,00E+06
1,50E+06
1,00E+06
5,00E+05
0,00E+00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Abbildung 31: Verlauf der Zellzahl während der Kultivierung von Chlamydomonas reinhardtii unter
Verwendung einer optimierten Nährlösung, Abwasser und mit Phosphat dotiertem Abwasser
Die Darstellung zeigt, dass Chlamydomonas reinhardtii für eine Kultivierung unter Nutzung von
Abwasser als Nährstoffquelle geeignet ist. Im Vergleich zur Anzucht mit Nährlösung ist zwar eine
Adaptionsphase zu verzeichnen, jedoch ist der Unterschied als gering gegenüber dem Optimum
einzuschätzen. Da in diesem Zusammenhang die Produktion der größtmöglichen Menge an
Biomasse jedoch eher nicht im Vordergrund steht, sondern vielmehr die Eliminierung von
Phosphat aus der Lösung, ist dies nicht unbedingt ein Nachteil.
6.4.4.2
Eliminierung von Phosphat aus Abwässern durch Mikroalgen und dessen biologische
Akkumluation
Im Rahmen der oben beschriebenen Versuche zur Anzucht von Chlamydomonas reinhardtii in
Abwasser wurde die Phosphatelimination in den Kultivierungslösungen ermittelt. Die Phosphatgehalte in der Nährlösung und im Abwasser wurden jeweils zu Beginn und am Ende des
Kultivierungszeitraumes bestimmt. Die Ansätze wurden über unterschiedliche Zeiträume kultiviert.
Das Abwasser wurde zusätzlich mit Phosphat dotiert, wobei der Phosphatgehalt des dotierten
Abwassers etwa das 3fache des Gehaltes der Nährlösung sowie ca. das 80fache des Gehaltes
des nicht-dotierten Abwassers betrug. Ergebnisse dieser Experimente sind in den Abbildungen 32
und 33 dargestellt.
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MAL GmbH
400
Phosphataufnahme [mg/l]
350
300
250
200
150
100
50
0
Nährlösung 1
Abwasser 1
Nährlösung 2
Abwasser 2
Abwasser dot.
Abbildung 32: Phosphataufnahme durch Chlamydomonas reinhardtii während der Kultivierung in Blasenreaktoren
dargestellt als Phosphatelimination aus der Nährlösung bzw. dem Abwasser
90
80
Phosphataufnahme [%]
70
60
50
40
30
20
10
0
Nährlösung 1
Abwasser 1
Nährlösung 2
Abwasser 2
Abwasser dot.
Abbildung 33: Phosphataufnahme durch Chlamydomonas reinhardtii während der Kultivierung in Blasenreaktoren
dargestellt als prozentuale Phosphatelimination aus der Nährlösung bzw. dem Abwasser
Chlamydomonas reinhardtii ist in der Lage, hohe Phosphatwerte aufzunehmen. Bezogen auf die
Absolutwerte an Phosphat wurde der höchste Anteil aus dem dotierten Abwasser entfernt. Der
Phosphatgehalt des (nicht-dotierten) Abwassers sank auf ca. 80 % des Ausgangswertes.
Betrachtet man die Abnahme des Phosphatgehaltes prozentual, wurden somit im Abwasser die
besten Ergebnisse erzielt. Es ist jedoch auch der Biomassegehalt der Kultivierungslösungen zu
berücksichtigen. Für die Ansätze 2 wurden die Biomassegehalte experimentell ermittelt und die
Abnahme des Phosphatgehaltes im Zusammenhang dazu betrachtet. Die Ergebnisse zeigt die
Tabelle 25.
Seite 51 von 62
Biomassegehalt [g/l]
P-Aufnahme/Biomasse [mmol/g]
PO43--Aufnahme/Biomasse [mg/g]
Tabelle 25:
MAL GmbH
Nährlösung
0,39
2,2
205
Abwasser
0,36
0,4
38
Abwasser dotiert
1,80
2,1
197
Vergleich der P-Aufnahme bezogen auf die Biomasse in den Ansätzen
Es wird deutlich, dass die Verfahrensführung einen erheblichen Einfluss auf das
Phosphataufnahmeverhalten der Biomasse hat. Die Werte lassen eine Spanne von 38 mg/g
Biotrockenmasse bis 205 mg/g Biotrockenmasse erkennen. Es wurden somit Phosphatgehalte von
bis zu 20 % der Biotrockenmasse erzielt. Weitere Verbesserungen sind realistisch.
Bezogen auf die Biomasse war die P-Aufnahme in den Ansätzen mit den hohen Phosphatgehalten
(Nährlösung und dotiertes Abwasser) deutlich besser als im nicht-dotierten Abwasser. Der
Biomassegehalt im Abwasser war dem in der Nährlösung vergleichbar. Durch den viel geringeren
Phosphatgehalt im Abwasser erfolgte jedoch absolut betrachtet keine so hohe P-Verwertung wie in
der Nährlösung. Wie bereits weiter oben erwähnt, war die P-Reduktion im Abwasser prozentual
gesehen aber am höchsten.
Im Hinblick auf eine mögliche Nutzung von Mikroalgen zur Eliminierung und Rückgewinnung von
Phosphat aus Abwässern spielt die Freisetzung des im Klärschlamm vorliegenden Phosphats eine
wesentliche Rolle. Zu dieser Problematik wurden erste Untersuchungen angestellt.
6.4.4.3
Zusammenfassung
Bisherige Versuche bewiesen das Vorhandensein einer abwassertauglichen Algenpopulation in
der MAL GmbH und ihre Eignung für die Phosphatanreicherung bzw. Phosphatelimination bei
gleichzeitiger Schadstoffabtrennung sowie die Möglichkeit einer biokatalytischen Phosphatfreisetzung aus Klärschlamm. Es wurden bereits Phosphatgehalte von bis zu 20 % der Biomasse
erreicht.
Die Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Verwertungsmöglichkeit von Mikroalgen zur
Eliminierung und Rückgewinnung von Phosphat aus Abwässern. Dabei kann eine simultane
Reinigung von Abfallgasen erfolgen.
6.4.5
Vergärung der Algenbiomasse
Im Hinblick auf eine mögliche Rückführung der Algenbiomasse in den Biogaskreislauf wurden
orientierende Untersuchungen zur Bestimmung des Faulverhaltens gemäß DIN 38414 Teil 8
durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die Biomassen von Chlorella vulgaris bzw.
Chlamydomonas reinhardtii im Vergleich zu Primärschlamm ein fast drei Mal bzw. nahezu doppelt
so hohes Ergebnis der spezifischen Faulgasproduktion aufwiesen. Im Vergleich zu Brotmasse, die
im laboreigenen Biogasreaktor u. a. als Substrat eingesetzt wurde, lagen die Werte für die
spezifische Faulgasproduktion von Chlorella vulgaris etwa doppelt so hoch, im Falle von
Chlamydomonas reinhardtii waren sie nahezu gleich. Die Ergebnisse dieser orientierenden
Untersuchung unterscheiden sich tendenziell vom Befund des Projektpartners TU Dresden,
wonach für eine Algenbiomasse aus einer kommerziellen Algenproduktionsanlage im Vergleich zu
einem sogenannten Rücklaufschlamm etwas geringere Gasausbeuten ermittelt wurden. Zu
berücksichtigen ist dabei, dass die Bedingungen der Versuche in der MAL GmbH und der TU
Dresden nicht unmittelbar vergleichbar sind.
Seite 52 von 62
6.4.6
MAL GmbH
Verwertung
Abgeleitet aus der Kultivierung von Algenbiomasse unter Nutzung von Biogas und den erzielten
Untersuchungsergebnissen können folgende Verwertungsmöglichkeiten genannt werden:
Im Rahmen der Untersuchung der Mikroalgen hinsichtlich verwertbarer Inhaltsstoffe wurden
Methoden zur Analytik von Zellinhaltsstoffen entwickelt und bezüglich ihrer Validität geprüft.
Die MAL GmbH konnte damit ihr Dienstleistungsspektrum deutlich erweitern.
Die untersuchten Mikroalgen besitzen wertvolle Inhaltsstoffe. Besonders hervorzuheben ist
dabei das Carotinoid Astaxanthin in Haematococcus pluvialis. Die erfolgreiche Kultivierung
dieser Mikroalge ist mit dem Ergebnis von 2 bis 3 % Astaxanthin bezogen auf die
Algentrockenmasse gelungen.
In den untersuchten Mikroalgen wurden düngemittelrelevante Inhaltsstoffe nachgewiesen.
Zudem erfüllten die Algenbiomassen hinsichtlich der Gehalte an Schadstoffen die gesetzlichen
Anforderungen gemäß Bioabfallverordnung. Im Rahmen von Pflanzenverträglichkeitsstests
wurde gezeigt, dass die Algenbiomassen das Pflanzenwachstum ähnlich gut wie ein
Volldünger fördern konnten.
Die MAL GmbH verfügt über eine abwassertaugliche Algenpopulation mit der Eignung zur
Eliminierung und Rückgewinnung von Phosphat aus Abwässern.
Die Rückführung der Algenbiomasse in den Biogaskreislauf erscheint aufgrund der erzielten
orientierenden Ergebnisse möglich und sinnvoll.
Seite 53 von 62
MAL GmbH
6.5
Möglichkeiten zur Verwertung des gereinigten Gases
6.5.1
Eignung des gereinigten Gases für den Antrieb von Motoren
Biogas aus Klärschlämmen und anderen Substraten hat lediglich einen Methangehalt von ca.
60 %, eine hohe Feuchtigkeit, einen hohen CO2-Anteil (ca. 30 %) sowie Beimengungen von CO,
H2, H2S oder auch Siloxanen. Das Gas kann nicht ohne weitere Aufreinigung als Energieträger in
den denkbaren Systemen wie Gasmotor oder Brennstoffzelle eingesetzt werden. Eine Alternative
bietet der bereits im 19. Jahrhundert erfundene Stirling-Motor. Hierbei findet die Verbrennung
außerhalb der Arbeitskammer der Zylinderkolben statt. Durch die Verbrennung wird dem im
Zylinder enthaltenen Gasgemisch thermische Energie zugeführt. Aufgrund dieser Energie dehnt
sich das Gas aus und verrichtet am Kolben Arbeit. Das Gas wird nun abgekühlt und zieht sich
wieder zusammen. Der Kolben kann wieder in seine Ausgangsstellung zurückkehren. Der
elektrische Wirkungsgrad eines solchen Motors war in der Vergangenheit geringer als der von
herkömmlichen Gasmotoren, wenn beide mit Erdgas betrieben wurden. Neue technologische
Fortschritte ermöglichen zur Zeit vergleichbare Wirkungsgrade. Ein Nachteil von Gasmotoren ist
die Verringerung ihrer Standzeit auf 1/3 bei der Verwendung von Brenngasen mit Spuren von
Siloxan. Dies kann mittels Stirling-Motor umgangen werden.
Für die Untersuchungen wurde auf ein funktionsfähiges Modell eines Stirling-Motors
zurückgegriffen. Ein Bunsenbrenner wurde umgebaut, um eine Verbrennung der unterschiedlichen
Gase zu ermöglichen. Zusätzlich zu den aufbereiteten Biogasen wurden die Ausgangsgase sowie
Erdgas untersucht. Die Abbildung 34 zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchungen. Die durch die
Verbrennung von Erdgas erreichten Motordrehzahlen wurden auf 100 % normiert.
Motordrehzahl [%] bezogen auf Erdgas
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
0
1
2
3
4
5
6
Zeit [min]
Erdgas
synthetisches Biogas
natürliches Biogas
gereinigtes synthetisches Biogas
Abbildung 34: Untersuchungen zum Einsatz der Biogase zum Antrieb eines Stirling-Motors
Aus der Abbildung 34 geht hervor, dass keines der untersuchten Gase an das Erdgas heran
reichte. Synthetisches und natürliches Biogas erreichten etwa 70 % der mittels Erdgas erzielten
Drehzahlen. Noch schlechter schnitt das gereinigte synthetische Biogas ab, hierbei wurden nur ca.
50 % der entsprechenden Erdgas-Drehzahlen erreicht. In weiteren Versuchen konnte vorerst
bestätigt werden, dass das gereinigte Biogas am schlechtesten abschneidet.
Seite 54 von 62
MAL GmbH
Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass bei der aktuellen Versuchsanordnung durch den
Bunsenbrenner zusätzlich Luft aus der Umgebung angesaugt wird, welche das sauerstoffhaltige
gereinigte Biogas „verdünnt“.
6.5.2
Eignung des gereinigten Gases für die Anzucht methanverwertender Bakterien
6.5.2.1
Einleitung
Zur Prüfung der Eignung des gereinigten Gases zur Anzucht methanotropher Mikroorganismen
wurden die Spezies Methylosarcina quisquillarum und Methylomonas methanica auf der Basis
verschiedener Gase kultiviert. Die zu vergleichenden Gase waren
Erdgas
natürliches Biogas
entschwefeltes natürliches Biogas
entschwefeltes synthetisches Biogas und
gereinigtes Biogas (BiLaGas).
Anhand des Bakterienwachstums sollte eine Aussage über die Verträglichkeit der Gase getroffen
werden.
Die methanotrophen Mikroorganismen sind auf die Verwertung von C1-Verbindungen spezialisiert
und können keine längerkettigen Kohlenwasserstoffe abbauen [24]. Sie bilden zusammen mit den
Bakterien bzw. Hefen, die Methanol, methylierte Amine, Formaldehyd, Formiat und Dimethylether
verwerten können, die Gruppe der methylotrophen Mikroorganismen. Innerhalb der
methanotrophen Mikroorganismen, die aufgrund ihres Zellwandaufbaus den gramnegativen
Bakterien zugeordnet werden, werden verschiedene Gruppen unterschieden. Sie werden u.a.
anhand ihrer intrazellulären Membranstrukturen und ihrer Art der Formaldehydfixierung in Typ Iund Typ II-methanotrophe Bakterien gegliedert. Die methanotrophen Mikroorganismen vom Typ I,
zu denen auch die in dieser Arbeit untersuchten Spezies gehören, besitzen thylakoidartige
intrazelluläre
Membranstrukturen
und
fixieren
Formaldehyd
mit
Hilfe
des
Ribulose-Mono-Phosphat-Weges [25].
Methylosarcina quisquillarum wurde erstmals 1998 aus dem Boden des Athens-Clarke County
Municipal Landfill in Athens (Georgia, USA) isoliert. Bei der Kultivierung in Flüssigkultur neigt
dieser Mikroorganismus leicht zur Bildung von Aggregaten (sarcina-ähnliche Pakete), welche von
einer diffusen Schleimschicht umgeben werden. Als Sarcinen werden Zellformen bezeichnet, die
auftreten, wenn aus kugelförmigen Bakterien durch Zellteilungen platten- oder paketähnliche
Gebilde (Sarcinen) entstehen [24]. Die beobachtete Zellmorphologie variiert außerdem sehr stark
und wird als pleomorph bezeichnet. Nach entsprechend langer Kultivierung bilden sich
hitzesensitive Zysten aus. Einzelne Zellen, Tetraden oder Diplokokken besitzen ein polares
Flagellum (selten auch zwei) und sind sehr beweglich. Das Temperaturoptimum für das Wachstum
dieser Spezies liegt zwischen 22 und 32 °C. Der Mikroorganismus kann in einem pH-Bereich von
5,5 bis 9,0 kultiviert werden. Beim Wachstum auf NMS-Agar entstehen runde leicht bräunliche
Kolonien (Abbildung 35) [25].
Seite 55 von 62
MAL GmbH
Abbildung 35: Kolonien von M. quisquillarum, 400fache Vergrößerung
Methylomonas methanica ist wahrscheinlich der erste beschriebene methanotrophe
Mikroorganismus. Er wurde 1906 von Söhngen aus Pflanzenmaterial isoliert und als Bacillus
methanicus bezeichnet. 1909 wurde der Name von Orla-Jensen in Methanomonas methanica
geändert. Dworkin und Foster isolierten 1956 ein ähnliches Bakterium von der Wasserpflanze
Elodea spec. und nannten es Pseudomonas methanica. Whittenbury et al. [26] isolierten 1970
mehr als 100 verschiedene methanotrophe Spezies aus unterschiedlichsten Habitaten (Boden,
Wasser, Schlamm), teilten sie in fünf Genera ein und ordneten diese den Gruppen Typ I- oder Typ
II-methanotropher Mikroorganismen zu.
Die stäbchenförmigen, mitunter auch kokkoiden Zellen von Methylomonas methanica besitzen ein
polares Flagellum und bilden hitzesensitive Zysten aus. Die optimale Wachstumstemperatur liegt
zwischen 25 und 30 °C [27]. Das pH-Optimum befindet sich im Bereich zwischen 5,0 und 9,0. Die
Bakterien enthalten Poly-ß-Hydroxybuttersäure-Einschlüsse und Carotinoide. Bei der Kultivierung
auf NMS-Agar wachsen rosa-pigmentierte Kolonien (Abbildung 36) [28].
Abbildung 36: Kolonien von M. methanica, 400fache Vergrößerung
Seite 56 von 62
6.5.2.2
MAL GmbH
Wachstumsversuche zum Vergleich der Eignung verschiedener Gase
In den durchgeführten Versuchen sollte das Wachstum der methanotrophen Mikroorganismen
unter Verwendung verschiedener Gase und in Abhängigkeit von der Methankonzentration
untersucht werden. Die verwendeten Methankonzentrationen betrugen 10, 25 und 50 Vol.-%. Dass
dabei aufgrund der gasdicht verschlossenen Kultivierungsgefäße auch andere wichtige
Gaskomponenten (zum Beispiel der O2-Gehalt) in ihrer Konzentration beeinflusst wurden, wurde in
Kauf genommen. Mit BiLaGas konnte der Versuch mit 50 Vol.-% CH4 nicht durchgeführt werden,
da aufgrund des CH4-Gehaltes von <50 Vol.-% mehr Gas hätte injiziert werden müssen, als
überhaupt Atmosphäre im Kultivierungsgefäß zur Verfügung stand.
Die Abbildung 37 zeigt beispielhaft das Ergebnis eines Wachstumsversuches. Die Kurven
repräsentieren jeweils die Mittelwerte der gemessenen OD600 von 5fach-Ansätzen.
0,25
OD600
0,20
10 Vol.-% CH4
17 Vol.-% O2
0,15
0,10
25 Vol.-% CH4
12 Vol.-% O2
0,05
50 Vol.-% CH4
3 Vol.-% O2
0,00
1
6
11
16
21
Zeit (d)
Abbildung 37: Vergleich des Wachstums von Methylosarcina quisquillarum mit entschwefeltem natürlichen Biogas
In der Tabelle 26 wurden die Ergebnisse der Wachstumsversuche hinsichtlich der ermittelten
Tendenz des optimalen Methangehaltes zusammengefasst.
Gas
Erdgas
natürliches Biogas
entschwefeltes natürliches
Biogas
entschwefeltes synthetisches
Biogas
BiLaGas
Tabelle 26:
Tendenz bezüglich der optimalen CH4-Konzentration
Methylosarcina quisquillarum Methylomonas methanica
25 > 50 > 10
25 > 10 > 50
25 > 10 > 50
25 > 10 > 50
25 > 10 > 50
25 > 10 > 50
10 > 25 > 50
25 > 10 > 50
25 > 50 > 10
25 > 10 > 50
25 > 10
25 > 10
Auswertung der Wachstumsversuche bezüglich der optimalen Methankonzentration für die Kultivierung
von Methylosarcina quisquillarum und Methylomonas methanica
Aus der Tabelle 26 geht hervor, dass in nahezu allen Fällen eine Methankonzentration von 25 Vol.-%
am besten für das Wachstum von Methylosarcina quisquillarum und Methylomonas methanica
geeignet war. In den Ansätzen mit 10 Vol.-% bzw. 50 Vol.-% CH4 werden die zu geringe
Methankonzentration bzw. der vergleichsweise zu geringe Sauerstoffanteil als limitierende
Faktoren angesehen. Im Wachstumsversuch mit synthetischem Biogas und Methylosarcina
quisquillarum wurde eine Methankonzentration von 10 Vol.-% als günstig ermittelt.
Seite 57 von 62
MAL GmbH
Dieses Ergebnis wurde als Hinweis darauf gewertet, dass – wie bereits bei der Anzucht der
Mikroalgen beobachtet – der relativ hohe H2S-Anteil das Wachstum hemmt. Der Anteil an H2S war
im 25 Vol.-%-Ansatz doppelt und im 50 Vol.-%-Ansatz viermal so hoch wie im 10 Vol.-%-Ansatz.
Bei einem Vergleich der Biomasseausbeuten aus der Anzucht mit der jeweils als optimal
ermittelten Methankonzentration wurde festgestellt, dass beide Spezies bei der Kultivierung mit
dem entschwefelten Biogas höhere Biomasseausbeuten lieferten als mit dem unbehandelten Gas
(Abbildung 38).
Die Abbildung 38 zeigt einen Vergleich der Biomasseausbeuten beider Spezies aus der Anzucht
mit den jeweils als optimal ermittelten Methankonzentrationen aller untersuchten Gase. Der
Vergleich kann dabei immer nur innerhalb einer Spezies erfolgen. Methylosarcina quisquillarum
ließ sich dieser Graphik zufolge am besten mit Erdgas, entschwefeltem synthetischen Biogas und
BiLaGas kultivieren. Bei Methylomonas methanica führten BiLaGas, entschwefeltes synthetisches
Biogas und Erdgas zu den höchsten Biomasseausbeuten. Das Wachstum mit den
schwefelhaltigen Biogasen war bei beiden Mikroorganismen schlechter als mit den entschwefelten
Varianten.
0,30
0,25
Methylosarcina
quisquillarum
OD600
0,20
0,15
Methylomonas
m ethanica
0,10
0,05
BiLaGas
entschwefeltes
synthetisches
Biogas
synthetisches
Biogas
entschwefeltes
natürliches
Biogas
natürliches
Biogas
Erdgas
0,00
Abbildung 38: Zusammenfassung der in den Wachstumsversuchen erreichten maximalen Zelldichten
6.5.2.3
Methanverbrauch zum Aufbau von Biomasse
Die methanotrophen Mikroorganismen wurden hinsichtlich ihres relativen Methanverbrauchs in
einer definierten Zeitspanne untersucht. Anhand der Bakterientrockenmassen und der
Methangehalte am Beginn und am Ende des Kultivierungszeitraumes wurde der Methanverbrauch
zum Aufbau von 1 g Trockenmasse berechnet. Danach betrug der Verbrauch für Methylosarcina
quisquillarum
ca.
0,7 l CH4/g
Trockenmasse
und
für
Methylomonas
methanica
2 l CH4/g Trockenmasse. Diese ermittelten Werte lagen im Bereich der anhand der bekannten
Stoffwechselwege
von
methanotrophen
Mikroorganismen
theoretisch
errechneten
CH4-Verbrauchswerte von 0,56 l/g bis 3,2 l/g gebildeter Trockenmasse (die ermittelten
Vergleichswerte waren abhängig von der Vorgehensweise bei der Berechnung) [29].
Seite 58 von 62
MAL GmbH
Der CH4-Verbrauch von Methylomonas methanica für die Produktion von 1 g Trockenmasse war
somit zwei- bis dreimal höher ist als der von Methylosarcina quisquillarum. Bezüglich der
Verwertung von CH4 ohne das Ziel einer Gewinnung von speziellen Inhaltsstoffen wäre somit
Methylomonas methanica der Vorzug zu geben. Liegt das Hauptaugenmerk der Kultivierung
jedoch in der Gewinnung von Biomasse, Proteinen oder bestimmten Zellinhaltsstoffen, so wäre
Methylosarcina quisquillarum dafür besser geeignet.
6.5.2.4
Zusammenfassung
Das durch die Mikroalgen gereinigte Biogas (BiLaGas) eignete sich sehr gut zur Anzucht
methanverwertender Bakterien. Der Vorteil des BiLaGases bestand dabei vor allem darin, dass es
neben Methan auch Sauerstoff enthält, den die methanotrophen Organismen ebenfalls benötigen.
In Abhängigkeit vom Hauptziel der Kultivierung – Methanverwertung oder Produktion von
Biomasse – wäre entweder Methylomonas methanica oder Methylosarcina quisquillarum der
Vorzug zu geben.
6.5.3
Weitere Verwertungsmöglichkeiten
Zusätzlich zu den genannten Verwertungsmöglichkeiten ist der Einsatz von BiLaGas als Schweißund Brenngas denkbar. Bei der Verwendung als Schweißgas könnte die Zuführung von Sauerstoff
gespart werden, da das Gas bereits O2 enthält. Voraussetzung für diese Anwendung wäre die
Prüfung des Gases hinsichtlich seines Verhaltens unter Druck. Für den Einsatz von BiLaGas als
Schweißgas besteht Interesse von Seiten der COMPART Umwelttechnik GmbH.
6.6
Fugataufbereitung und Nutzung als Nährstoffe
Für die Nährstoffversorgung der Algenbiomasse sollte das bei der Entwässerung der
Gärrückstände anfallende Fugat geprüft werden. Dazu wurde dieses hinsichtlich seiner
Nährstoffzusammensetzung untersucht. Tabelle 27 zeigt eine Gegenüberstellung der für die
Anzucht von Chlorella vulgaris erforderlichen Nährstoffzusammensetzung und den
entsprechenden Gehalt im Fugat.
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Verbindungen
Nitrat-N
Ammonium-N
Kjeldahl-N
Sulfat
Phosphat
Bor
Eisen
Kalium
Kobalt
Kupfer
Magnesium
Mangan
Molybdän
Zink
Tabelle 27:
MAL GmbH
Soll-Konzentration
[mg/l]
69,23
0,006
168
237
0,010
2,813
291
0,050
0,060
49,87
1,085
0,043
0,168
Konzentration im Fugat
[mg/l]
<2
756
789
7,00
17,57
6,90
1,06
102
0,005
0,006
2,24
0,048
0,010
0,029
Vergleich der Gehalte der erforderlichen Nährstoffe für die Anzucht von Chlorella vulgaris im Medium und
im Fugat
Nahezu alle notwendigen Nährstoffe sind im Fugat in deutlich geringerer Konzentration als
erforderlich enthalten. Für die Stickstoffversorgung ist anstelle von Nitrat-N eine sehr hohe
Konzentration von Ammonium-N sowie ein hoher Gehalt an organisch gebundenem Stickstoff zu
verzeichnen. Das Fugat müsste vor seiner Verwendung als Nährlösung also zunächst um ca. das
zehnfache verdünnt werden und anschließend die übrigen Nährstoffe zudotiert werden. Dieser
Aufwand rechtfertigt die Verwendung von Fugat als Nährlösung nicht. In Voruntersuchungen
konnte außerdem festgestellt werden, dass bei Verwendung von Fugat als alleiniger
Nährstoffquelle bzw. in einer Verdünnung von 1:2 mit spezieller Algennährlösung eine Hemmung
des Algenwachstums von >100% verursacht wurde.
6.7
Bemessungsparameter für ein scale-up
Im Rahmen der experimentellen Arbeiten konnten für eine Kombination eines Biogasreaktors mit
dem speziellen Blasenreaktorsystem Kenndaten ermittelt werden, welche unter Berücksichtigung
bestimmter Parameter die Auslegung einer Anlage im Pilotmaßstab erlauben. Ein Parameter, der
für ein scale-up des Photobioreaktors eventuell gesondert betrachtet werden muss, ist die
Lichtverteilung in der Algenkultur.
Zur Veranschaulichung der Stoff- und Energiebilanzen wurde ein Auslegungsbeispiel für eine
Pilotanlage theoretisch bestimmt. Ausgehend von einer gegebenen Biogasproduktion von
800 m3/d und unter Berücksichtigung von experimentell ermittelten Kenndaten wurde die
Auslegung für einen an die Biogasanlage anzuschließenden Photobioreaktor berechnet.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 28 dargestellt.
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MAL GmbH
Kenndaten als Berechnungsgrundlage
VBiogasreaktor Labormaßstab [l]
VPhotobioreaktor Labormaßstab [l]
Vverbrauchtes Biogas [l/d]
Vumgewälztes Gas [l/min]
Anteil CH4 im Biogas [Vol.-%]
CO2-Reduktion im Biogas [%]
Biomassezuwachs im Photobioreaktor [g/l*d]
Biogasproduktion Algen [l/kg oTS]
Heizwert CH4 [kJ/mN3]
10
2,5
2,6
0,03
55
>90
0,5
330
35.790
Kenndaten Stromerzeugung mittels BHKW
Wirkungsgradelektrisch
WirkungsgradGesamt
0,35
0,85
Energiebedarfelektrisch Photobioreaktor8
Durchmischung [kWh/d]
Eindicker [kWh/d]
Transport [kWh/d]
ca. 1.230
ca. 26
ca. 0,5
Energiebedarf Biogasreaktor
elektrisch [kWh/d]
thermisch [kWh/d]
ca. 110
ca. 1.200
Berechnete Daten
Vproduziertes Biogas im Biogasreaktor [l/d]
mbenötigte Biomasse Biogasreaktor [g/d]
VPhotobioreaktor [l]
mproduzierte Algenbiomasse Photobioreaktor [g/d]
800.000
ca. 2.400.000
ca. 770.000
ca. 385.000
Energiebilanz
Bruttoenergie (bezogen auf das produzierte Biogas und unter
Berücksichtigung des CH4-Gehaltes und des Heizwertes) [kJ/d]
freigesetzte Energieelektrisch durch Verstromung [kWh/d]
Energiebedarfelektrisch Photobioreaktor [kWh/d]
Energiebedarfelektrisch Biogasreaktor [kWh/d]
frei nutzbare Energieelektrisch Gesamtsystem9 [kWh/d]
freigesetzte Energiethermisch durch Verstromung [kWh/d]
Energiebedarfthermisch Biogasreaktor [kWh/d]
frei nutzbare Energiethermisch Gesamtsystem [kWh/d]
Tabelle 28:
ca. 15.750.000
ca. 1.530
ca. 1.260
ca. 110
ca. 160
ca. 2.190
ca. 1.200
ca. 990
Beispiel für die Dimensionierung einer möglichen Pilotanlage
Ausgehend von den als Berechnungsgrundlage verwendeten Kenndaten und unter der Annahme
einer täglichen Biogasproduktion von 800 m3 wurde zunächst zur Erzeugung dieser Biogasmenge
eine Biomasse von ca. 2,4 t ermittelt. Für einen anzuschließenden Photobioreaktor wurde ein
benötigtes Volumen von ca. 770 m3 berechnet. Dieser Photobioreaktor produziert in Abhängigkeit
vom zugrundegelegten Biomassenzuwachs in diesem Berechnungsbeispiel eine Algenbiomasse
von etwa 0,39 t pro Tag.
8
9
bezogen auf eine tägliche Biogasproduktion im Biogasreaktor von 800 m³
das Gesamtsystem besteht aus dem Biogasreaktor und dem Photobioreaktor
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MAL GmbH
Unter der Annahme eines bestimmten Energiebedarfs für den Betrieb des Photobioreaktors und
des Biogasreaktors sowie der Verwertung des erzeugten und durch die Algen gereinigten Gases
durch Kraft-Wärme-Kopplung in einem Blockheizkraftwerk wurde eine Energiebilanz aufgestellt.
Vor allem in Abhängigkeit von den technischen Kenndaten der für den Betrieb des
Photobioreaktors benötigten Pumpe kann das Ergebnis dieser Energiebilanz stark schwanken.
Eine geeignete Pumpe wird benötigt, um die Algensuspension im Photobioreaktor in Bewegung zu
halten. Der Energiebedarf für einen Eindicker und für den Transport der Biomasse wurde in die
Betrachtungen mit einbezogen, da davon ausgegangen wird, dass die erzeugte Biomasse in den
Biogasreaktor zurückgeführt wird. Dazu ist die „Eindickung“der Algenbiomasse auf einen für die
Vergärung organischer Substrate in Fermentern üblichen Wert notwendig. Bei der Betrachtung
wurde des Weiteren davon ausgegangen, dass der Photobioreaktor unter Nutzung von Tageslicht
betrieben wird.
Hinsichtlich des Energiebedarfs des Biogasreaktors wurde zugrundegelegt, dass für den Betrieb
einer Biogasanlage Strom in einer Höhe von ca. 2,5 % des Heizwertes im Biogas benötigt wird,
während zum Erwärmen des Substrates sowie zum Ausgleich von Wärmeverlusten etwa 27 % des
Heizwertes notwendig sind [31].
Ausgehend von den genannten Überlegungen wurden unter den angenommenen Bedingungen
„Energieüberschüsse“von ca. 160 kWh/d bezogen auf elektrische Energie und etwa 990 kWh/d
bezogen auf thermische Energie erzielt.
7
Bekannt gewordener Fortschritt auf dem Gebiet des Vorhabens
Die Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR) förderte ein Projekt der Schmack Biogas
AG und der rent a scientist GmbH mit dem Teilziel der Reduzierung der hohen CO2-Anteile in
Biogas mit Hilfe von Mikroalgen. Dazu sollten die Algen in einem dem Fermenter der Biogasanlage
nachgeschalteten Photobioreaktor unter Ausnutzung von Sonnenenergie zur Fixierung von
Kohlendioxid genutzt werden.
Der Versuch einer Kontaktaufnahme mit der FNR hat durch uns stattgefunden. Seitens der FNR
war keine Aufgeschlossenheit zu spüren. Auf Initiative der rent a scientist GmbH kam es im
November 2005 zu einem Treffen zwischen rent a scientist, Schmack und MAL. Dabei wurden im
Rahmen dessen, was preisgegeben werden kann, bisherige Erfahrungen und Ergebnisse
ausgetauscht. Es wurde festgestellt, dass die Zielstellung und auch die Umsetzung innerhalb der
beiden Projekte verschieden waren. Die von der MAL GmbH erreichten Ergebnisse werden durch
das FNR-Projekt nicht beeinträchtigt. Eine künftige Zusammenarbeit zwischen den genannten
Firmen und der MAL GmbH soll auf den gemeinsamen Erfahrungen aufbauen und zu neuen
Erkenntnissen führen.
8
Erfolgte oder geplante Veröffentlichungen
Das im Abschnitt 6.1.3 vorgestellte gasdichte Blasenreaktorsystem wurde schutzrechtlich
gesichert. Darüber hinaus erfolgten bisher keine Veröffentlichungen zu den Ergebnissen des
Projektes.
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