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TM
OSTASE®
37300
Finalidade do
teste
O teste Access Ostase é um imunoensaio quimioluminescente com partículas paramagnéticas a
ser usado com os Sistemas de Imunoensaio Access para a medição quantitativa da fosfatase
alcalina óssea (BAP), um indicador da actividade osteoblástica, no soro e no plasma humanos.
Este dispositivo tem a finalidade de ajudar no tratamento da osteoporose pós-menopáusica e
da doença de Paget.
Resumo e
explicação do
teste
O osso é um tecido dinâmico cuja formação óssea e remoção óssea (também denominada
reabsorção) continuam durante toda a vida num processo chamado remodelação. Este processo
é decorrente de interacções complexas entre os dois tipos de células ósseas: os osteoblastos para
a formação do osso e os osteoclastos para a reabsorção do osso.1,2,3 A formação e a reabsorção
óssea são processos interdependentes que, em circunstâncias normais, estão estreitamente
ligados.2,4 Esta relação de união é essencial para manter a competência bioquímica do
esqueleto, preservando, assim, a organização da estrutura, da forma e da força óssea.2,3,5
Acredita-se que os níveis séricos da BAP reflictam o estado metabólico dos osteoblastos.6,7 Para
determinar a gravidade da doença óssea metabólica e as respostas à terapia, é importante ter
uma avaliação precisa do metabolismo ósseo. A medição dos níveis séricos da BAP
demonstrou-se útil na avaliação de doentes com doença de Paget, osteomalacia,
hiperparatiroidismo primário, osteodistrofia renal, osteoporose e metástase óssea.6,7,8,9,10 As
determinações da fosfatase alcalina total tornaram-se o método aceite para o diagnóstico e a
monitorização de doentes com a doença de Paget.
A doença óssea de Paget é uma afecção esquelética comum na qual ocorre uma proliferação
focal dos componentes celulares normais do osso. A doença de Paget é mais prevalecente do
que se pensava antes, com taxa de incidência em certas populações de 3–4% nos pacientes de
meia-idade e de 10–15% nos mais idosos.11 Esta doença não afecta indivíduos jovens. A maioria
dos doentes com a doença de Paget não apresentam sintomas e, com frequência, passam sem
diagnóstico, a menos que não seja encontrado um raio X ou um nível de fosfatase alcalina sérica
anormal no decorrer duma avaliação médica por motivos não relacionados. As queixas mais
comuns nos doentes sintomáticos são dores e deformidade.
O risco de osteoporose, um outro distúrbio de remodelação óssea, depende em parte do
desenvolvimento esquelético, do alcance da massa óssea máxima e, na idade avançada, da
quantidade de perda óssea. No caso de crianças saudáveis, a formação óssea é maior que a
reabsorção, o que determina o desenvolvimento ósseo e o crescimento esquelético normal.3 Nos
adultos jovens saudáveis, a formação e a reabsorção óssea são equilibradas, não determinando
nem aumento nem diminuição evidentes da massa esquelética. Na idade avançada, homens e
mulheres sofrem um desequilíbrio da remodelação óssea na qual a reabsorção é ligeiramente
maior que a formação, dando origem a uma contínua perda da massa óssea com o passar do
tempo.1,2,4,12 Se este desequilíbrio persiste, a massa óssea pode diminuir até o esqueleto não ser
mais suficiente para suportar esforços mecânicos normais, tornando-se susceptível a fracturas
de maneira anormal. A perda excessiva de massa óssea com uma susceptibilidade maior a
fracturas é uma doença chamada osteoporose.5
A forma mais comum de osteoporose ocorre em mulheres na pós-menopausa e é o resultado da
deficiência de estrogénio.2,12,13 Uma perda óssea rápida acompanha a diminuição dos níveis de
estrogénio no início da menopausa ou como consequência da remoção dos ovários. A perda
óssea rápida ocorre como consequência dos efeitos combinados de um desequilíbrio na
© 2004 Beckman Coulter, Inc.
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remodelação óssea e um aumento no turnover ósseo.5,14,15,16 Nos Estados Unidos, a osteoporose
afecta cerca de 25 milhões de mulheres na pós-menopausa e é a causa de aproximadamente 1,5
milhões de fracturas por ano, incluindo aproximadamente 500.000 fracturas vertebrais por
esmagamento, 250.000 fracturas do fémur e 200.000 fracturas distais do rádio.2,5,17
A terapêutica de substituição hormonal é, hoje em dia, o tratamento mais receitado no mundo
para a prevenção de fracturas osteoporóticas nas mulheres na pós- menopausa.4,5,18,19,20
Todavia, muitas mulheres não podem ou não irão se valer da terapêutica de substituição
hormonal por causa do potencial aumento do risco de cancro e o reinício do sangramento
menstrual. Por este motivo, outros compostos tais como os bisfosfonatos, um tratamento
padrão da doença de Paget do osso, os moduladores selectivos do receptor de estrogénio
(SERMs) e a calcitonina foram desenvolvidos para tratar a osteoporose. As propriedades
anti-reabsorção dos bisfosfonatos, dos SERMs e da calcitonina reduzem a remodelação óssea,
diminuindo, por conseguinte, a perda óssea total.
Os marcadores bioquímicos são úteis na monitorização da doença óssea metabólica. A
hidroxiprolina urinária e a fosfatase alcalina sérica total têm sido usadas para monitorar o
tratamento da doença de Paget. A osteoporose, no entanto, representa uma modificação mais
subtil do processo de remodelação óssea, necessitando, portanto, de marcadores mais
específicos e sensíveis.
O ensaio Access Ostase é um dispositivo in vitro para a medição quantitativa da BAP no soro e
no plasma humanos. Modificações nos níveis da BAP demonstraram-se úteis para doentes
submetidos a tratamento por moléstias ósseas metabólicas.6,7,10,21,22
Princípios do
teste
O teste Access Ostase é um ensaio imunoenzimático de fase única. Um anticorpo monoclonal
de rato específico para a BAP é adicionado a um recipiente de reacção contendo partículas
paramagnéticas revestidas com anticorpo policlonal de cabra anti-rato.23 Os calibradores, os
controlos e as amostras contendo BAP são adicionados às partículas revestidas e ligam-se ao
anticorpo monoclonal anti-BAP. Após a formação dum complexo fase sólida/anticorpo de
captura/BAP, os materiais ligados à fase sólida são retidos num campo magnético, enquanto os
materiais não ligados são removidos por lavagem. De seguida, o substrato
quimioluminescente, Lumi-Phos* 530, é adicionado ao recipiente e a luz gerada pela reacção é
medida com um luminómetro. A produção de luz é directamente proporcional à concentração
de BAP na amostra. A quantidade de analito presente na amostra é determinada a partir duma
curva de calibração multiponto armazenada no sistema.
Informações
sobre o
produto
Kit de reagentes Access Ostase
Nº Cat. 37300: 100 determinações, 2 embalagens, 50 testes/embalagem
• Fornecido pronto para utilizar.
• Armazenar em posição vertical e refrigerar a 2–10°C.
• Manter refrigerado a 2–10°C por no mínimo duas horas antes de usar no aparelho.
• Estável até ao vencimento do prazo de validade marcado na etiqueta quando armazenado a
2–10°C.
• Estável a 2–10°C por 28 dias após utilização inicial.
• Uma possível degradação pode ser indicada pela ruptura da camada de elastómero da
embalagem ou por valores de controlo fora do intervalo de variação.
• Abrir a embalagem de reagente caso tenha sofrido prejuízos (p.ex. ruptura da camada
elastomérica).
• Todos os anti-soros são policlonais, excepto quando indicado em contrário.
Access Ostase
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R1a:
Partículas paramagnéticas revestidas com anticorpo policlonal de cabra
anti-rato suspenso em solução salina tamponada TRIS, com surfactante,
albumina sérica bovina (BSA), proteína (caprina), < 0,1% de azida sódica
e 0,1% de ProClin** 300.
R1b:
Anticorpo monoclonal de rato anti-BAP diluído em solução salina
tamponada TRIS, com surfactante, BSA, < 0,1% de azida sódica e 0,1%
de ProClin 300.
Avisos e
precauções
• Para utilização em diagnóstico in vitro.
• As amostras dos doentes e os produtos hemoderivados podem ser analisados rotineiramente
com riscos mínimos utilizando o procedimento descrito. Contudo, deve manusear estes
produtos como potencialmente infecciosos de acordo com as precauções gerais e os métodos
adequados de laboratórios clínicos, independentemente da origem, tratamento ou
certificação anterior. Usar um desinfectante apropriado para a descontaminação. Armazenar
e eliminar estes materiais e os respectivos contentores segundo o regulamento e as normas
locais.
• A azida sódica pode reagir com as canalizações de chumbo ou cobre formando azidas
metálicas altamente explosivas. Portanto, deixar fluir água em abundância nos tubos
durante a eliminação de líquidos para prevenir a acumulação de azidas.24
• O ProClin 300 pode causar sensibilização cutânea. Evitar entornar ou salpicar este reagente
sobre a pele ou as roupas. Em caso de contacto com este reagente, lavar com abundante água
e sabão.
• A Folha dos Dados de Segurança do Material (MSDS) está disponível a pedido.
Colheita e
preparação
da amostra
1. Soro e plasma (lítio heparina e sódio heparina) são as amostras recomendadas.
2. Seguir as recomendações abaixo para manusear, analisar e armazenar amostras de sangue:25
• Colher todas as amostras de sangue tomando as precauções habituais para a colheita
venosa.
• Deixar as amostras de soro coagularem completamente antes da centrifugação.
• Manter as provetas sempre fechadas.
3. Além disso, seguir as recomendações abaixo:
• Centrifugar as provetas de amostras de acordo com as indicações do fabricante.
• Imediatamente após a centrifugação, transferir no mínimo 500 µL de amostra isenta de
células para uma proveta de armazenamento. Tapar imediatamente a proveta com a
rolha, apertando bem.
• Se a amostra tiver de ser analisada dentro de 24–48 horas após a colheita, deverá ser
armazenada num frigorífico a 2-8°C.
• As amostras que tiverem de ser conservadas por períodos mais prolongados (até a 2
meses) devem ser congeladas a -70°C.
• Amostras turvas contendo partículas devem ser centrifugadas antes do ensaio.
4. Seguir as instruções abaixo para preparar as amostras:
• Certificar-se de que a fibrina e a matéria celular residuais tenham sido removidas antes da
análise.
• Para a centrifugação, seguir as instruções do fabricante das provetas de colheita de
sangue.
Cada laboratório deve determinar a aceitabilidade das próprias provetas de colheita de
sangue e dos produtos de separação do soro. Estes produtos podem variar entre fabricantes
diferentes e, às vezes, de um lote para o outro.
Materiais
fornecidos
R1
Kits de reagentes Access Ostase
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Materiais
necessários
mas não
fornecidos
1. Calibradores: Access Ostase Calibrators
Fornecido em zero e aproximadamente 7, 15, 30, 60 e 120 µg/L.
Nº Cat. 37305
2. Access Ostase QC ou outro material de controlo disponível no mercado.
Fornecido em aproximadamente 11 e 45 µg/L.
Nº Cat. 37309
3. Diluente de amostras A: Access Sample Diluent A
Nº Cat. 81908
4. Substrato: Access Substrate
Nº Cat. 81906
5. Tampão de lavagem: Access Wash Buffer
Nº Cat. 81907 (Access, Access 2, SYNCHRON LX®i)
Nº Cat. 8547197 (UniCel® DxI)
Comentários
sobre o
procedimento
1. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para uma descrição
específica da instalação, inicialização, princípios de funcionamento, características de
desempenho do sistema, instruções de funcionamento, procedimentos de calibração,
limitações operacionais e precauções, riscos, manutenção e solução de problemas.
2. Misturar o conteúdo das embalagens novas (vedadas) de reagentes invertendo
delicadamente a embalagem várias vezes antes de carregá-la no aparelho. Não inverter
embalagens abertas (perfuradas).
3. Usar vinte e cinco (25) µL de amostra para cada determinação além dos volumes mortos do
recipiente da amostra e do sistema. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o
sistema de Ajuda para o volume mínimo de amostra necessário.
4. A unidade de medida padrão do sistema para indicar os resultados das amostras é µg/L.
Procedimento
Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para obter informações
sobre a gestão das amostras, a configuração dos testes, a solicitação de testes e a visualização
dos resultados dos testes.
Detalhes de
calibração
Para todos os testes, é necessário ter uma curva de calibração activa. Para o ensaio Access
Ostase, a calibração é necessária a cada 42 dias. Consultar os respectivos manuais de sistema
e/ou o sistema de Ajuda para obter informações sobre os métodos de calibração, a configuração
de calibradores, a introdução de solicitações de testes dos calibradores e a visualização de
dados de calibração.
Controlo de
qualidade
Os materiais de controlo de qualidade simulam as características das amostras dos doentes e
são fundamentais para a monitorização do desempenho do sistema de análises imunoquímicas.
Dado que as amostras podem ser analisadas a qualquer momento utilizando um formato de
“acesso aleatório” em vez dum formato “por lote”, é aconselhável utilizar os materiais de
controlo de qualidade a cada 24 horas.26 Utilizar controlos de qualidade Access Ostase QC ou
outros materiais de controlo de qualidade disponíveis no mercado que cubram pelo menos dois
níveis de analito. Seguir as instruções do fabricante para a reconstituição e o armazenamento.
Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores médios e limites aceitáveis para
garantir um desempenho adequado dos testes. Os resultados do controlo de qualidade que não
estiverem dentro dos limites aceitáveis, podem indicar resultados de testes não válidos.
Examinar todos os resultados dos testes obtidos desde o último ponto de teste de controlo de
qualidade aceitável para este analito. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o
sistema de Ajuda para informações sobre como visualizar os resultados do controlo de
qualidade.
Resultados
Access Ostase
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Os resultados dos testes dos doentes são determinados automaticamente pelo software do
sistema utilizando um modelo matemático de curva ponderada com spline cúbica de
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atenuação. A quantidade de analito na amostra é determinada a partir da produção de luz
medida através dos dados de calibração armazenados no sistema. Os resultados dos testes dos
doentes podem ser visualizados através do ecrã apropriado. Consultar os respectivos manuais
de sistema e/ou o sistema de Ajuda para as instruções completas sobre como visualizar os
resultados das amostras.
Limitações do
procedimento
1. As amostras podem ser medidas com precisão no intervalo analítico compreendido entre o
limite inferior de detecção 0,1 µg/L e o valor do calibrador mais elevado (cerca de 120 µg/L).
• Se uma amostra contém uma quantidade menor que o limite mínimo de detecção para o
ensaio, registar os resultados como menores que aquele valor (por ex., < 0,1 µg/L).
• Se uma amostra contém uma quantidade maior que o valor estabelecido do calibrador
mais alto Access Ostase Calibrator (S5), registar os resultados como maiores que aquele
valor (por ex., > 120 µg/L). Alternativamente, diluir um volume de amostra com 2, 4 ou 9
volumes de diluente de amostras Access Sample Diluent A. Contudo, é preferível diluir
as amostras séricas contendo níveis de BAP maiores do que o calibrador mais elevado, de
maneira que a amostra diluída indique mais que 20 µg/L. Consultar os respectivos
manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para as instruções sobre a introdução duma
diluição de amostra numa solicitação de teste. O sistema mostra os resultados adaptados
à diluição.
2. Nos ensaios que utilizam anticorpos, existe a possibilidade de interferência dos anticorpos
heterófilos contidos na amostra do doente. Os doentes que estão regularmente em contacto
com animais ou que tenham sido submetidos a imunoterapia ou a técnicas de diagnóstico
que utilizam imunoglobulinas ou fragmentos de imunoglobulinas podem produzir
anticorpos, por ex. HAMA, que interferem com os imunoensaios. Para além disso, outros
anticorpos heterófilos, tais como os anticorpos humanos anti-cabra, podem estar presentes
nas amostras dos doentes.27,28
Tais anticorpos interferentes podem produzir resultados errados. Os resultados de doentes
suspeitos de ter estes anticorpos devem ser avaliados com cuidado.
3. Os resultados do Access Ostase devem ser interpretados baseando-se no quadro clínico geral
do doente, incluindo: os sintomas, a anamnese clínica, os dados de outros testes e outras
informações apropriadas.
4. A imunorreactividade da ALP hepática no soro foi determinada no ensaio Access Ostase:
100 U/L de actividade da ALP hepática forneceu um resultado de 2,5 a 5,8 µg/L no ensaio
Access Ostase. Amostras séricas com elevações significativas da actividade da ALP hepática
podem causar resultados elevados no ensaio Access Ostase.
5. Doentes com distúrbios ósseos metabólicos que apresentam níveis baixos da actividade da
doença podem ter níveis de BAP que entram nos valores esperados do teste Access Ostase.
6. Os resultados do teste Access Ostase devem ser usados apenas em conjunto com
informações disponíveis a partir da avaliação clínica do doente e outros procedimentos de
diagnóstico. Portanto, o ensaio Access Ostase não é recomendado para ser usado como um
procedimento de rastreio na detecção da presença de osteoporose na população em geral.
Outrossim, o ensaio Access Ostase não pode ser usado para avaliar a taxa de formação óssea
ou remodelação óssea.
Valores
esperados
1. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios intervalos de referência para garantir
uma representação adequada de populações específicas.
2. Um estudo clínico multicêntrico foi realizado para testar a eficácia da BAP como um auxílio
no tratamento da osteoporose pós-menopáusica e da doença de Paget. Embora os resultados
de BAP neste estudo tenham sido obtidos com o ensaio Tandem®-R Ostase, o ensaio Access
Ostase foi desenvolvido usando o mesmo anticorpo monoclonal em fase sólida empregue no
ensaio Tandem-R Ostase e foi padronizado para oferecer o mesmo desempenho clínico.
Ensaios para a medição da BAP que utilizam outros anticorpos monoclonais ou outros
métodos podem não fornecer o mesmo desempenho clínico.
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O ensaio Tandem-R Ostase foi avaliado em estudos do qual participaram adultos
aparentemente saudáveis (de 20 a 89 anos de idade) em seis centros de análise. A tabela
seguinte mostra a concentração média de BAP, o desvio padrão (DP), a mediana e o 95º
percentil para homens (n = 217), mulheres na pré-menopausa (n = 228) e mulheres na
pós-menopausa (n = 529).
Resumo das Concentrações de BAP em Adultos Aparentemente Saudáveis *
n
Média de BAP
(µg/L)
SD
Mediana de BAP
(µg/L)
95º percentil da BAP
(µg/L)
Homens
217
12,3
4,3
11,6
20,1
Mulheres na pré-menopausa
228
8,7
2,9
8,5
14,3
Mulheres na pós-menopausa
529
13,2
4,7
12,5
22,4
*Resultados obtidos com o ensaio imunorradiométrico Tandem-R Ostase.
Os resultados apresentados acima mostram que as concentrações médias de BAP numa
população de mulheres na pós-menopausa são mais elevadas que as concentrações médias de
BAP nas mulheres na pré-menopausa (p ≤ 0,0001). Este aumento na média de BAP reflecte o
aumento da remodelação óssea associada à deficiência de estrogénios numa população na
pós-menopausa em comparação com uma população na pré-menopausa.2,8,12,13 Contudo, existe
uma sobreposição considerável das concentrações de BAP nas populações mostradas na
distribuição abaixo.
Para cada uma das populações mostradas no diagrama: 1) As linhas horizontais em cada caixa
representam as concentrações medianas; 2) As margens superior e inferior de cada caixa
representam as amplitudes interquartis – isto é, a margem superior delimita 25% dos valores
acima da mediana enquanto a margem inferior delimita 25% dos valores abaixo da mediana; 3)
A extremidade de cada haste inferior representa o 5º percentil da concentração, enquanto a
extremidade de cada haste superior representa o 95º percentil da concentração.
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As amplitudes de observações referidas acima são representativas apenas deste estudo e não
reflectem necessariamente as amplitudes que serão observadas num laboratório clínico em
particular.
Estudos
Clínicos
Os estudos descritos na secção seguinte foram realizados utilizando o ensaio Tandem-R Ostase.
Doença de Paget
Estudos de correlação foram realizados para comparar as concentrações séricas de BAP obtidas
através do ensaio Tandem-R Ostase com os resultados obtidos através de dois métodos
electroforéticos normalmente comercializados e de dois ensaios da actividade enzimática para a
fosfatase alcalina total (TAP). Estes estudos foram efectuados em centros de investigação clínica
usando 100 amostras de doentes com a doença de Paget. O coeficiente de correlação (r) obtido
entre o ensaio Tandem-R Ostase e os métodos electroforéticos é 0,9418. O coeficiente de
correlação (r) obtido entre o ensaio Tandem-R Ostase e os ensaios da actividade enzimática da
fosfatase alcalina total é 0,9459.
Osteoporose Pós-menopáusica – Tratamento com Bisfosfonatos
A fim de demonstrar a capacidade do ensaio Tandem-R Ostase em reflectir alterações na
remodelação óssea em resposta à terapia na osteoporose pós-menopáusica, foi realizado um
estudo em doentes com osteoporose definida clinicamente que foram submetidas ao
tratamento com um bisfosfonato (alendronato de sódio). Este estudo era do tipo multicêntrico,
prospectivo, duplo-cego, controlado com placebo.29 Estão disponíveis os dados para as pessoas
que tomaram aleatoriamente placebo (N = 148) ou alendronato 10 mg (N = 74). Todas as
participantes tomaram diariamente 500 mg de cálcio suplementar. As medições da densidade
mineral óssea (DMO) foram feitas na espinha lombar usando a absorciometria de raio x de
dupla energia. As determinações da BAP em série foram feitas usando o ensaio Ostase.
As mudanças percentuais médias a partir da linha base e das barras de erros padrão para a
DMO nos grupos de placebo e tratados são marcadas em cada ponto temporal no diagrama
abaixo. Um aumento de 7,8% na DMO em relação à linha base é observado no grupo de
alendronato após 24 meses, indicando que a terapia com bisfosfonato teve um efeito positivo
para o osso. Como esperado, uma redução de 0,8% na DMO é observada no grupo de placebo
com suplemento de cálcio após 24 meses.
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Um resumo dos dados de dois anos consistindo em concentrações de BAP em série como
medidas pelo ensaio Ostase para os grupos de placebo e alendronato 10 mg é apresentado
abaixo. As reduções percentuais médias a partir da linha base e das barras de erros padrão (SE)
para a BAP para os grupos de placebo (linha base BAP = 17,7 µg/L ± 6,0) e tratados com
alendronato (linha base BAP = 17,0 µg/L ± 4,6) são marcadas em cada ponto temporal. Os
dados mostram uma diminuição ligada ao tempo nas concentrações de BAP para o grupo
tratado com alendronato, alcançando o ponto mínimo após 6 meses. Como esperado, uma
mudança pequena e transitória nos níveis do marcador é observada no grupo de placebo com
suplemento de cálcio.30,31 A redução e estabilização subsequente das mudanças de BAP no
grupo tratado com alendronato sugere a ocorrência de um novo estado estável na remodelação
óssea como resultado do tratamento com bisfosfonatos.32,33,34
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As reduções observadas nas concentrações de BAP para o grupo tratado com alendronato,
como medidas pelo ensaio Ostase, são diferentes da linha base de maneira significativa
(p ≤ 0,0001) logo após 3 meses e em todos os pontos temporais subsequentes (6, 12 e 24 meses).
Ao contrário, as concentrações de BAP diminuíram de 11% após 3 e 6 meses no grupo de
placebo e voltaram para a linha base após 24 meses.
As mudanças da BAP e da DMO neste estudo coincidem com o conhecimento actual da
remodelação óssea e o mecanismo de acção das terapêuticas anti-osteoporóticas.29 À luz destes
resultados, pode-se concluir que a diminuição nas concentrações de BAP, como medidas pelo
ensaio Ostase , nos indivíduos tratados com alendronato reflecte mudanças na remodelação
óssea decorrentes da terapêutica anti-osteoporótica.
Mudança Significativa Mínima
A mudança percentual entre os valores de dois marcadores séricos deve exceder quer a
variação biológica (intra-indivíduo) do marcador, quer a variação analítica do ensaio, para que
haja significância clinica.35 Este limiar é referido como a mudança percentual mínima. As
mudanças percentuais num marcador que excedem a mudança percentual mínima podem ser
atribuídas a uma modificação no estado clínico do indivíduo, como a resposta à terapia.35 A
mudança percentual mínima para um marcador bioquímico foi descrita por Soletormos 35 e
outros 36 com a fórmula:
Mudança percentual mínima =
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onde CVp é a variabilidade intra-indivíduo, CVa é a imprecisão do ensaio e Z é a estatística Z,
que depende da probabilidade seleccionada por significância e se a mudança esperada é
unidireccional (Z = 1,645) ou bidireccional (Z = 1,96).
A variabilidade intra-indivíduo do ensaio Ostase foi determinada a partir de amostras séricas
provenientes de 17 mulheres saudáveis na pós-menopausa colhidas todos os dias por um
período de cinco dias. O coeficiente de variação biológica médio foi calculado como 4,2%. A
variação analítica baseou-se nos dados de precisão inter-execução.
A mudança percentual mínima para a BAP, como medida pelo ensaio Ostase, foi calculada
como 25%. Por isso, mudanças nas concentrações de BAP em mulheres na pós-menopausa que
excedam 25% podem ser atribuídas a modificações na remodelação óssea.
Mudanças percentuais da BAP em relação à linha base para indivíduos separados são
apresentadas abaixo. Os dados são apresentados quer para os indivíduos de placebo, quer para
os tratados com alendronato 10 mg nos pontos temporais de 3 meses e 6 meses. A linha
horizontal no zero representa a linha base e a linha horizontal em -25% representa a mudança
percentual mínima para a BAP, como medida pelo ensaio Ostase. Para o grupo de alendronato
10 mg, 77,0% (57/74) dos indivíduos teve uma diminuição da BAP em relação à linha base
(tempo 0) de 25% ou mais após 3 meses e 85,1% (63/74) dos indivíduos tiveram uma
diminuição da BAP em relação à linha base de 25% ou mais no ponto mínimo (6 meses). Após
24 meses, 90,3% (65/72) teve uma diminuição na BAP de 25% ou mais. Para o grupo de placebo
com suplemento de cálcio, 75,7% (112/148) dos indivíduos teve uma diminuição da BAP em
relação à linha base (tempo 0) de menos de 25% (após 6 meses). Após 24 meses, 88,1% (126/143)
do grupo de placebo teve diminuições da BAP de menos de 25%. Estes dados são mais
resumidos na tabela fornecida abaixo. Esta tabela mostra o número de indivíduos tratados e de
placebo (e a percentagem de indivíduos) que teve diminuições de BAP a partir da linha base
< 25% ou > 25% (após 3 e 6 meses, respectivamente).
Resumo de Mudanças Percentuais Individuais da BAP a partir da
Linha Base para Indivíduos tratados com Alendronato 10 mg e Placebo
Número de Indivíduos /Número Total de Indivíduos
3 meses
6 meses
Valor de Cut-off da
Mudança percentual
da BAP
Placebo
Alendronato
Placebo
Alendronato
n = 148
n = 74
n = 148
n = 74
25% de diminuição
ou mais
33/148
57/74
36/148
63/74
(85,1%)
Menos de 25% de
diminuição
(22,3%)
(77,0%)
(24,3%)
115/148
17/74
112/148
11/74
(77,7%)
(23,0%)
(75,7%)
(14,9%)
No grupo de alendronato 10 mg, uma redução média da BAP de 45,7% a partir da linha base até
6 meses foi acompanhada por um aumento médio na DMO de 7,8% após 24 meses. Ao
contrário, a pequena mudança a partir da linha base para a BAP após 6 meses para o grupo de
placebo com suplemento de cálcio (-11,3%) foi acompanhada por uma pequena diminuição na
DMO de -0,8% após 24 meses.
Access Ostase
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Em resumo, demonstrou-se que:
1. As concentrações de BAP reflectem o aumento na remodelação óssea associada com
deficiência de estrogénios em mulheres na pós-menopausa aparente saudáveis.
2. As concentrações de BAP reflectem mudanças na remodelação óssea que ocorrem como
consequência de terapia anti-osteoporótica com alendronato nas mulheres na
pós-menopausa.
3. Diminuições clinicamente significativas das concentrações de BAP a 3 e 6 meses indicam
mudanças na remodelação óssea. A terapia efectiva com alendronato 10 mg em mulheres
com osteoporose pós-menopáusica é indicada por aumentos na DMO a 24 meses.
4. Uma diminuição na BAP de 25% ou mais da linha base, como medido pelo ensaio Ostase,
pode indicar mudanças na remodelação óssea consequente de terapia anti-osteoporótica.
As pessoas submetidas à terapia anti-osteoporótica com alendronato cujos níveis de BAP não
diminuem de 25% da linha base nos pontos temporais iniciais devem ser retestadas em pontos
temporais posteriores. Das 11 mulheres que demonstraram menos de 25% de diminuição da
386940B
Access Ostase
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BAP a partir da linha base após 6 meses, 9 delas demonstraram, no final, uma diminuição maior
que 25% na BAP a partir da linha base após 24 meses. Todas essas mulheres responderam ao
alendronato 10 mg como determinado por aumentos na DMO. As mulheres tratadas cujos
níveis de BAP não diminuíram de 25% da linha base devem ser avaliadas por outros métodos
clínicos para determinar a eficácia do tratamento.
Mulheres pós-menopáusicas – Terapêutica de Substituição Hormonal (TSH)
Além do estudo do bisfosfonato descrito acima, iniciaram-se outros estudos com o objectivo de
demonstrar a capacidade do ensaio Ostase de reflectir alterações na remodelação óssea em
resposta à terapia com estrogénios.34,37 Os dados de um dos estudos são apresentados abaixo.
Neste estudo, mulheres saudáveis na pós-menopausa não histerectomizadas (n = 12), com
65-75 anos de idade, receberam diariamente tratamento de estrogénio/progestina (Premarin
0,625 mg e Provera 2,5 mg) durante dois anos. Além disso, 6 mulheres saudáveis
histerectomizadas receberam apenas estrogénio por uma população total analisada de 18
pessoas.
A ALP óssea foi medida pelo ensaio Ostase na linha base e a 6, 12 e 24 meses. A DMO da
espinha lombar foi avaliada na linha base e a 24 meses.
As mudanças percentuais médias a partir da linha base e das barras de erros padrão para a BAP
(eixo y à esquerda) e para a DMO (eixo y à direita) são marcadas em cada ponto temporal no
gráfico abaixo. Um aumento de 6,6% na DMO da espinha lombar acima da linha base é
observado para as mulheres tratadas com estrogénio, indicando que a terapia com estrogénios
teve um efeito positivo para o osso. Os dados apresentados no gráfico abaixo também mostram
uma diminuição das concentrações da BAP ligada ao tempo para o grupo tratado, alcançando
um ponto mínimo a 12 meses. As diminuições observadas nas concentrações da BAP para o
grupo tratado com estrogénio, como medido pelo ensaio Ostase, são diferentes da linha base de
modo significativo (p ≤ 0,0001) a 6 meses e com todos os pontos temporais subsequentes (12 e
24 meses).
Access Ostase
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386940B
As mudanças da BAP e da DMO neste estudo coincidem com o conhecimento actual da
remodelação óssea e o mecanismo de acção das terapias anti-osteoporóticas.5,38 À luz destes
resultados, pode-se concluir que a diminuição nas concentrações de BAP, como medidas pelo
ensaio Ostase, em mulheres tratadas com estrogénio reflecte as mudanças no turnover ósseo
decorrente da terapia anti-osteoporótica.
Os resultados do teste Ostase devem ser usados somente em conjunto com informações
disponíveis a partir de avaliação clínica do doente e outros procedimentos de diagnóstico.
Embora os resultados Ostase neste estudo tenham sido obtidos com o ensaio Tandem-R Ostase,
uma correlação de r = 0,9895 foi demonstrada para o ensaio Access Ostase. A concentração de
BAP numa dada amostra determinada com diferentes ensaios pode variar por causa das
diferenças dos métodos de ensaio. É importante que, no decorrer da monitorização dum
doente, o método de ensaio utilizado permaneça o mesmo. Se for necessário trocar de métodos
de ensaio, poderá ser preciso realizar testes adicionais para confirmar os valores.
Características
específicas de
desempenho
Comparação de métodos
Foi realizada uma comparação entre os valores de BAP utilizando os ensaios Access Ostase e
Tandem-R Ostase. Foram utilizadas 172 amostas provenientes de doentes com osteoporose e
doença de Paget, quer sob tratamento, quer sem nenhuma terapia. Os resultados foram
analisados usando a regressão de Deming para determinar a correlação entre os dois ensaios
386940B
Access Ostase
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(n = 172; intervalo de variação = de 0,1 a 160 µg/L). O coeficiente de correlação (r) = 0,9895. A
inclinação foi de 0,9756 (intervalo de confiança a 95% = de 0,9544 a 0,9973). A intercepção y foi
de 0,5987 (intervalo de confiança a 95% = de -1,2585 a 0,0470). A diferença percentual média
entre os dois grupos de amostras está relacionada na tabela abaixo.
Diferenças % médias entre Access Ostase e Tandem-R Ostase
Populações
n
(# pares)
Diferença média %*
Desvio padrão
(%)
Osteoporose
88
-5,96
12,37
Doença de Paget
84
-7,01
14,25
* Diferença % média = [(Access – Tandem) / (Access + Tandem/2)] X 100
Recuperação da diluição (linearidade)
Dez amostras séricas contendo concentrações elevadas de BAP foram diluídas em série com o
diluente de amostras Sample Diluent A e testadas em quadruplicado com diluições múltiplas.
As concentrações de BAP observadas em relação às concentrações esperadas foram analisadas
por regressão linear. A recuperação média neste estudo foi de 92,2% (intervalo de variação =
78,1–106,1%).
Provas de recuperação
A adição de quatro níveis diferentes de BAP a três amostras de soro com valores baixos de BAP
forneceu os seguintes dados:
Amostra 1
BAP adicionada
(µg/L)
Concentração
esperada
(µg/L)
Concentração
determinada
(µg/L)
Pura
(endógena)
12,5
–
14,7
27,2
26,6
97,8
35,9
48,4
45,5
94,0
60,2
72,7
64,7
89,1
83,6
96,1
84,7
88,1
Amostra 2
BAP adicionada
(µg/L)
Concentração
esperada
(µg/L)
Concentração
determinada
(µg/L)
Recuperação
(%)
Pura
(endógena)
11,1
–
13,5
24,6
23,7
96,4
33,7
44,7
42,1
94,2
62,4
73,5
64,2
87,3
91,6
102,7
85,9
83,6
Amostra 3
BAP adicionada
(µg/L)
Concentração
esperada
(µg/L)
Concentração
determinada
(µg/L)
Recuperação
(%)
Pura
(endógena)
8,9
–
14,7
23,6
23,2
98,5
35,9
44,8
42,3
94,4
60,2
69,1
63,7
92,3
83,6
92,5
83,8
90,6
Recuperação
(%)
Imprecisão
A reprodutibilidade para os controlos de qualidade Ostase QC e três níveis de controlos com
base sérica foi determinada realizando medições em duplicado em dois ensaios por dia por 10
dias. Os dados, indicados a seguir, foram analisados através da análise de variância (ANOVA):
Access Ostase
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Controlo
Média geral (n=20)
(µg/L)
Intra-execução
(%CV)
Inter-execução
(%CV)
Imprecisão total
(%CV)
QC 1
10,0
1,9
4,4
4,8
QC 2
47,5
2,1
4,9
5,3
Controlo sérico A
7,9
1,7
3,4
3,8
Controlo sérico B
25,5
1,5
3,3
3,6
Controlo sérico C
86,9
2,6
5,9
6,4
Especificidade analítica / Interferências
Substâncias interferentes
As substâncias e as respectivas concentrações máximas testadas com o ensaio Access Ostase
estão relacionadas abaixo. A análise foi realizada consoante as Directrizes EP-7P do NCCLS no
que diz respeito à Análise de substâncias interferentes em testes clínicos.
• A Hemoglobina, testada com concentrações de até 500 mg/dL, não interfere com o ensaio
Access Ostase.
• A bilirrubina não conjugada e conjugada, testada com concentrações de até 40 mg/dL e
20 mg/dL, respectivamente, não interfere com o ensaio Access Ostase.
• Os triglicéridos, testados com concentrações de até 2000 mg/dL, não interferem com o
ensaio Access Ostase.
• A proteína total, testada com concentrações entre 3,0 e 15,6 g/dL, não interfere com o ensaio
Access Ostase.
• 100 U/L de actividade de ALP intestinal dá um resultado de 1,8 µg/L no ensaio Access
Ostase.
• 100 U/L de actividade da ALP placentária dá um resultado de 0,3 µg/L no ensaio Access
Ostase.
Reactividade da ALP hepática
A reactividade da ALP hepática no ensaio Access Ostase foi determinada usando amostras
séricas provenientes de doentes com doenças hepáticas e amostras séricas de doentes com a
doença de Paget. As amostras foram rastreadas por electroforese e demonstraram conter > 95%
de ALP hepática ou BAP.
A reactividade da ALP hepática foi avaliada através de dois métodos. O primeiro
procedimento, descrito por Moss e Whitby,39 empregou uma técnica de inactivação por calor
que minimiza a contribuição de BAP endógena nas amostras com níveis elevados de ALP
hepática. Com este método, 100 U/L de actividade da ALP hepática dá um resultado de 2,5 a
5,8 µg/L no ensaio Access Ostase.
O segundo procedimento, descrito por Price et al.,40 utilizou um método de inclinação (ensaio
Access Ostase comparado com TAP), onde não foi efectuado nenhum pré-tratamento da
amostra. Neste estudo, a determinação quantitativa das amostras de ALP hepática e de BAP
com o ensaio Access Ostase foi traçada no eixo y do gráfico, enquanto a actividade da TAP foi
traçada no eixo x, para cada amostra. A partir dos valores de inclinação das amostras de ALP
hepática e de BAP, foi determinado que:
• 100 U/L de actividade da ALP hepática dá um resultado de 5,5 µg/L no ensaio Access
Ostase; e
• 100 U/L de actividade de BAP dá um resultado de 37,5 µg/L no ensaio Access Ostase.
Interferência de medicamentos
Várias concentrações de medicamentos foram adicionadas a três pools séricos separados
contendo BAP e testadas em quadruplicado. Os medicamentos e as respectivas concentrações
máximas testadas estão relacionados abaixo. A análise foi realizada consoante as Directrizes
EP-7P do NCCLS no que diz respeito à Análise de substâncias interferentes em testes clínicos.
386940B
Access Ostase
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paracetamol
35 mg/dL
alendronato
8 mg/dL
aspirina
50 mg/dL
calcitonina de salmão
112 IU/dL
cálcio
40 mg/dL
estrogénio
10 mg/dL
etidronato
105 mg/dL
ibuprofeno
40 mg/dL
pamidronato
18 mg/dL
progesterona
25 mg/dL
residronato
6 mg/dL
raloxifeno
12 mg/dL
vitamina D
80.500 IU/dL
Estes medicamentos, testados com as concentrações máximas, não interferem com a
recuperação da BAP dos pools séricos no ensaio Access Ostase.
Sensibilidade analítica
O nível mínimo detectável de BAP distinguível de zero (calibrador Access Ostase Calibrator S0)
com 95% de confiança é 0,1 µg/L. Este valor é determinado através do processamento duma
curva de calibração completa de seis pontos, controlos e 20 replicados do calibrador zero em
testes múltiplos. O valor de sensibilidade analítica é interpolado a partir da curva no ponto que
representa dois desvios padrão do sinal médio medido no calibrador zero.
Access Ostase
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386940B
TM
OSTASE® CALIBRATORS
37305
Finalidade
do produto
Os calibradores Access Ostase Calibrators devem ser utilizados para calibrar o ensaio Access
Ostase para a determinação quantitativa dos níveis de fosfatase alcalina óssea (BAP) no soro e
no plasma humanos utilizando os sistemas de imunoensaio Access.
Resumo e
explicação
do produto
A calibração dum ensaio quantitativo é o processo pelo qual as amostras com concentrações
conhecidas de analito (por ex., calibradores de ensaio) são testadas como amostras de doentes a
fim de medir a sua resposta. A relação matemática entre as respostas medidas e as
concentrações conhecidas de analito define a curva de calibração. Esta relação matemática, ou
curva de calibração, é utilizada para converter as medições URL (Unidade Relativa de Luz) de
amostras de doentes em concentrações quantitativas específicas de analito.
Padronização
A substância a ser medida (analito) nos calibradores Access Ostase Calibrators tem como
referência os calibradores internos do fabricante. O processo de padronização baseia-se na
norma prEN ISO 17511.
Os valores atribuídos foram estabelecidos usando amostras representativas deste lote de
calibrador e são específicos para as metodologias de ensaio dos reagentes Access. Os valores
atribuídos por outras metodologias podem ser diferentes. Tais diferenças, se presentes, podem
ser causadas por desvios entre os métodos.
Informações
sobre o
produto
Access Ostase Calibrators
Nº Cat. 37305: S0–S5, 2,5 mL/recipiente
• Fornecidos prontos para utilizar.
• Misturar o conteúdo invertendo delicadamente antes da utilização. Evitar a formação de
bolhas.
2–10°C.
• Uma possível degradação pode ser indicada por valores de controlo fora do intervalo de
variação.
• Consultar o cartão de calibração ou as etiquetas dos recipientes para as concentrações
exactas.
.
S0:
Matriz de albumina sérica bovina (BSA) tamponada com surfactante,
< 0,1% de azida sódica e 0,5% de ProClin** 300. Contém 0,0 µg/L di
BAP.
S1, S2,S3, S4, BAP humana em níveis de aproximadamente 7, 15, 30, 60 e 120 µg/L,
S5:
respectivamente, em matriz de BSA tamponada com surfactante, < 0,1%
de azida sódica e 0,5% de ProClin 300.
Cartão de
calibração
Avisos e
precauções
1
• O material de origem humana utilizado na preparação do reagente foi testado e considerado
386940B
Access Ostase
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não reactivo ao antigénio de superfície da Hepatite B (HBs Ag), aos anticorpos do vírus da
Hepatite C (HCV) e aos anticorpos do vírus da Imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2).
Dado que nenhum método de ensaio conhecido pode oferecer a segurança completa da
ausência de agentes infecciosos, manusear os reagentes e as amostras dos doentes como
potencialmente infecciosos.41
• Xi. Irritante: 0,5% ProClin 300.
R 43: Pode causar sensibilização em contacto com a pele.
S 28-37: Após contacto com a pele, lavar imediata e abundantemente
com água e sabão. Usar luvas adequadas.
Procedimento
Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para obter informações
sobre os métodos de calibração, a configuração de calibradores, a introdução de solicitações de
testes dos calibradores e a visualização de dados de calibração.
Detalhes da
calibração
Os calibradores Access Ostase Calibrators são fornecidos em seis níveis - zero e
aproximadamente 7, 15, 30, 60 e 120 µg/L. Os dados de calibração do ensaio são válidos por 42
dias.
Os calibradores são analisados em duplicado.
Limitações do
procedimento
Access Ostase
Página 18
Se forem notados sinais de contaminação microbiana ou excesso de turvação num reagente,
rejeitar o recipiente.
386940B
TM
OSTASE® QC
37309
Finalidade do
produto
Os controlos de qualidade Access Ostase QC são utilizados para monitorizar o desempenho do
sistema do ensaio Access Ostase.
Resumo e
explicação
do produto
Os materiais dos controlos de qualidade simulam as características das amostras dos doentes e
são fundamentais para a monitorização do desempenho do sistema do imunoensaio Access
Ostase. Para além disso, estes são uma parte integral das boas práticas de
laboratório.26,42,43,44,45,46 Ao realizar ensaios com os reagentes Access para fosfatasi alcalina
ossea (BAP), utilizar materiais dos controlos de qualidade para validar a integridade dos
ensaios. Se o sistema de análise funciona correctamente, os valores testados devem estar dentro
dos intervalos de variação aceitáveis.
Informações
sobre o
produto
Access Ostase QC
Nº Cat. 37309: 4,0 mL/recipiente, 1 recipientes por nível
• Fornecidos prontos para utilizar.
• Misturar o conteúdo invertendo delicadamente antes da utilização. Evitar a formação de
bolhas.
2–10°C.
• Uma possível degradação pode ser indicada por valores de controlo fora do intervalo de
variação.
• Consultar o cartão de valores QC para os valores médios e os desvios padrão (DP).
.
Avisos e
precauções
QC 1:
BAP humana em um nível de aproximadamente 11 µg/L numa matriz
de albumina sérica bovina (BSA) tamponada com surfactante, < 0,1% de
azida sódica e 0,5% de ProClin** 300.
QC 2
BAP humana em um nível de aproximadamente 45 µg/L numa matriz
BSA com surfactante, < 0,1% de azida sódica e 0,5% de ProClin 300.
Cartão de
valores QC
1
• O material de origem humana utilizado na preparação do reagente foi testado e considerado
não reactivo ao antigénio de superfície da Hepatite B (HBs Ag), aos anticorpos do vírus da
Hepatite C (HCV) e aos anticorpos do vírus da Imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2).
Dado que nenhum método de ensaio conhecido pode oferecer a segurança completa da
ausência de agentes infecciosos, manusear os reagentes e as amostras dos doentes como
potencialmente infecciosos.41
386940B
Access Ostase
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Procedimento
Determinar a concentração de BAP nos materiais do controlo de qualidade Access Ostase QC
usando o Sistema de Imunoensaio Access da mesma forma utilizada para uma amostra do
doente. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para obter
informações sobre os métodos dos controlos de qualidade, a configuração de controlos, a
introdução de solicitações de testes de amostras de controlo de qualidade e a visualização dos
dados dos controlos de qualidade.
Limitações do
procedimento
Se forem notados sinais de contaminação microbiana ou excesso de turvação num reagente,
Valores
esperados
Access Ostase
Página 20
Para a atribuição dos valores do material de controlo de qualidade Access Ostase QC, são
seleccionadas e testadas numerosas amostras, representativas do inteiro lote, para fornecer uma
estimativa fiável do valor médio. Os valores médios e os desvios padrão estão relacionados no
cartão de valores QC. Variações, tais como as da técnica, do equipamento ou dos reagentes,
podem fornecer valores diferentes daqueles relacionados. Por isso, cada laboratório deve
estabelecer os seus próprios valores médios e desvios padrão (DP).
386940B
TM
SAMPLE DILUENT A
81908
Finalidade do
produto
Resumo e
explicação do
produto
Informações
sobre o
produto
O diluente de amostras A Access Sample Diluent A é utilizado juntamente com os ensaios
Access para diluir as amostras dos doentes contendo concentrações de analito maiores que o
calibrador S5 específico para aquele analito.
O nível de analito nas amostras dos doentes podem exceder os níveis do calibrador S5
específico. Se for necessário um valor quantitativo, será preciso diluir a amostras a fim de
determinar a concentração de analito.
Access Sample Diluent A
Nº Cat. 81908: 4 mL/recipiente
• Fornecido pronto para utilizar.
• Deixar o conteúdo repousar à temperatura ambiente por 10 minutos.
• Misturar invertendo delicadamente antes da utilização. Evitar a formação de bolhas.
• Estável até ao vencimento do prazo de validade marcado na etiqueta do recipiente quando
armazenado a 2–10°C.
.
Diluente:
Avisos e
precauções
Matriz BSA tamponada com surfactante, < 0,1% de azida sódica,
0,5% de ProClin** 300.
• As amostras dos doentes e os produtos hemoderivados podem ser analisados rotineiramente
com riscos mínimos utilizando o procedimento descrito. Contudo, deve manusear estes
produtos como potencialmente infecciosos de acordo com as precauções gerais e os métodos
adequados de laboratórios clínicos, independentemente da origem, tratamento ou
certificação anterior. Usar um desinfectante apropriado para a descontaminação. Armazenar
e eliminar estes materiais e os respectivos contentores segundo o regulamento e as normas
locais.
Procedimento
As amostras podem ser medidas com exactidão dentro do intervalo analítico compreendido
entre o limite mínimo de detecção e o valor do calibrador mais alto do ensaio específico. Se uma
amostra contém uma quantidade de analito maior que o valor estabelecido do calibrador S5,
diluir a amostra seguindo as instruções de diluição do ensaio específico contidas no folheto do
kit sob “Limitações do Procedimento” na secção reagentes. Consultar os respectivos manuais
386940B
Access Ostase
Página 21
de sistema e/ou o sistema de Ajuda para as instruções sobre a introdução duma diluição de
amostra numa solicitação de teste.
Limitações do
procedimento
Access Ostase
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Se forem notados sinais de contaminação microbiana ou excesso de turvação no reagente,
386940B
Referências
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Access, SYNCHRON LX, UniCel e o logotipo Beckman Coulter são marcas registadas da Beckman Coulter, Inc.
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**ProClin é uma marca registrada da Companhia Rohm e Haas ou de suas subsidiárias e filiais.
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Impresso nos Estados Unidos da América.
Fabricado nos Estados Unidos da América.
Revisado em Julho de 2004.
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