Syphilis Total Ab 1 placa - 96 72530 5 placas - 480 72531 - Bio-Rad

Syphilis Total Ab
1 placa - 96
5 placas - 480
72530
72531
KITS PARA DETEÇÃO QUALITATIVA DE ANTICORPOS DE TREPONEMA
PALLIDUM EM SORO OU PLASMA HUMANOS, UTILIZANDO UMA TÉCNICA DE
IMUNOENSAIO ENZIMÁTICO
883679 - 2014/11
ÍNDICE
1.
APLICAÇÃO ............................................................................................. 2
2.
RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE....................................................... 2
3.
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO ........................................................... 2
4.
REAGENTES ........................................................................................... 3
5.
AVISOS E PRECAUÇÕES ........................................................................ 4
6.
AMOSTRAS ............................................................................................. 6
7.
PROCEDIMENTO ..................................................................................... 6
8.
LIMITAÇÃO DO TESTE ............................................................................ 9
9.
CARATERÍSTICAS DE DESEMPENHO ................................................... 10
10.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ......................................................... 12
1. APLICAÇÃO
Estes kits devem ser utilizados por pessoal devidamente formado e qualificado para deteção
qualitativa de anticorpos de Treponema pallidum em soro e plasma humano. O produto poderá ser
utilizado para rastreio de dadores de sangue e para auxiliar no diagnóstico de pacientes com suspeita
de infeção por sífilis.
2. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE
A sífilis é uma infeção crónica que progride por diferentes fases de infeção: primária, secundária,
latente e tardia. Estas fases produzem sintomas clínicos diversos, produzindo, habitualmente, úlceras
iniciais, conhecidas como cancros. Em seguida surge uma erupção cutânea sifilítica, seguida por
longos períodos sem sintomas. A infeção não tratada poderá eventualmente resultar em problemas
cardiovasculares e neurossífilis.
A infeção é causada pela espiroqueta Treponema pallidum e adquire-se habitualmente por contacto
sexual, embora a doença possa também ser transmitida por uma transfusão de sangue infetado.
Pode ocorrer também uma infeção intrauterina. Comprovou-se que é praticamente impossível que o
organismo se desenvolva em meios artificiais e o diagnóstico da infeção depende habitualmente da
demonstração de anticorpos no sangue, que aparece pouco depois da infeção inicial e podem
persistir por muitos anos.
Os testes para deteção de sífilis encaixam em quatro categorias: exame microscópico direto, testes
de anticorpos treponémicos, testes de anticorpos não treponémicos e testes de antigénios diretos.
Devido aos longos períodos sem sintomas e à natureza não específica dos testes não treponémico,
os métodos que detetam anticorpos não treponémico específicos em amostras de sangue tornaramse cada vez mais populares para o rastreio. O Syphilis Total Ab é um desses testes.
3. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O Syphilis Total Ab utiliza três antigénios recombinantes num ensaio de tipo sandwich. Os antigénios
detetarão IgG, IgM e IgA específicas de T. pallidum, permitindo que o teste detete anticorpos durante
todas as fases da infeção.
As cavidades são revestidas por uma mistura de antigénios recombinantes de T. pallidum 15Kd, 17Kd
e 47Kd. Os anticorpos específicos em amostras de soro ou combinam-se com estes antigénios e com
os mesmos antigénicos conjugados com peroxídase de rábano-silvestre quando é adicionado
conjugado a uma cavidade onde a amostra tenha incubada. Após a remoção do material não reagido
através de lavagem, é revelada a presença enzima ligada, indicando a presença de anticorpos
específicos na amostra, através de uma alteração de cor na mistura de substrato/cromogéneo. A
intensidade da cor é comparada com a cor presente em cavidades de controlo, para determinar a
presença ou ausência de anticorpos específicos.
[PT] 2
4. REAGENTES
4.1. Descrição
Identificação no
rótulo
Descrição
Microplaca
12 tiras de 8 cavidades cada,
revestidas com
antigénios recombinantes T.
pallidum (rAg)
Número ID específico = 97
Solução de lavagem concentrada
(20x)
Tampão Tris NaCl pH 7,4
Conservante: ProClin™ 300 (0,04%)
Apresentação/
Preparação
72530
Apresentação/
Preparação
72531
1 placa
Pronto a ser
utilizado
5 placas
Pronto a ser
utilizado
1 frasco
70 ml
Para diluição
1 frasco
235 ml
Para diluição
R1
Microplate
R2
Concentrated
Washing
Solution
(20X)
R3
Negative
control
Controlo negativo
Tampão Tris com BSA (albumina de
soro bovino)
Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)
1 frasco
2,1 ml
Pronto a ser
utilizado
1 frasco
2,1 ml
Pronto a ser
utilizado
Positive
control
Controlo positivo (humano)
Soro humano contendo anticorpos
de T.pallidum negativo para HIV1/2,
HBs Ag e HCV diluído em tampão
Tris contendo BSA (albumina de
soro bovino)
Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)
1 frasco
1,6 ml
Pronto a ser
utilizado
1 frasco
1,6 ml
Pronto a ser
utilizado
R6
Conjugate
Conjugado
T.pallidum rAg/Peroxídase
Conservante: ProClin™ 300 (0,05%)
1 frasco
8 ml
Pronto a ser
utilizado
1 frasco
30 ml
Pronto a ser
utilizado
R8
Substrate
buffer
Tampão de substrato
Solução de ácido cítrico e acetato
de sódio, pH 4,0, com H2O2
(0,015%) e DMSO (4%)
1 frasco
60 ml
Para
reconstituição
1 frasco
60 ml
Para
reconstituição
R9
Chromogen:
TMB solution
(11X)
Cromogéneo: Solução TMB (corde-rosa)
Solução contendo 3,3’, 5,5’
tetrametilobenzeno (TMB)
1 frasco
5 ml
Para diluição
1 frasco
5 ml
Para diluição
R10
Stopping
solution
Solução de paragem
Solução de ácido sulfúrico (H2SO4
1N)
1 frasco
28 ml
Pronto a ser
utilizado
1 frasco
28 ml
Pronto a ser
utilizado
R4
4.2. Requisitos de armazenamento e manuseamento
Este kit deve ser armazenado a pelo menos +2-8 °C. Cada item do kit preservado a +2-8 °C pode ser
usado até à data de validade indicada na embalagem (salvo indicação em contrário).
Após a abertura e na ausência de contaminação, os reagentes R3, R4, R6, R8, R9 e R10
conservados a +2-8 °C podem ser utilizados até a data de validade indicada na etiqueta.
[PT] 3
Identificação
R1
R2
R8+R9
Conservação
Após a abertura do saco selado a vácuo, as tiras de microcavidades
armazenadas a +2-8 °C podem ser utilizadas durante 1 mês no respetivo
saco original selado novamente com cuidado.
A solução de lavagem diluída pode ser armazenada a +2-30 °C durante 2
semanas. A solução de lavagem concentrada (R2) pode ser armazenada a
+2-30 °C.
Após a reconstituição, os reagentes armazenados num local escuro podem
ser utilizados durante 6 horas à temperatura ambiente (18-30 °C).
5. AVISOS E PRECAUÇÕES
Para utilização em diagnóstico in vitro. Para utilização por profissionais de saúde.
5.1. Precauções de saúde e segurança:
Este kit de teste apenas deve ser manuseado por pessoal qualificado, com formação em
procedimentos laboratoriais e familiarizado com os respetivos potenciais perigos. Use
vestuário de proteção adequado, luvas e proteção ocular/facial e manuseie de forma
adequada de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais exigidas.
O kit de teste contém componentes de sangue humano. O material de origem humana
usado na preparação de reagentes foi testado e considerado não reativo para o antigénio de
superfície da hepatite B (HBs Ag), anticorpos contra vírus da imunodeficiência humana
(HIV-1 e HIV-2 Ab) e anticorpos contra o vírus da hepatite C (HCV). Nenhum método de
teste conhecido pode oferecer total garantia da ausência de agentes infeciosos. Por
conseguinte, todos os derivados de sangue humano, reagentes e amostras humanas devem
ser manuseados como meios capazes de transmissão de doença infeciosa, cumprindo as
Precauções Universais recomendadas para agentes patogénicos transmissíveis pelo
sangue, conforme definido pelos regulamentos locais, regionais e nacionais.
Salpicos biológicos: Os salpicos de material de origem humana devem ser tratados como
potencialmente infeciosos.
Os salpicos que não contenham ácido devem ser imediatamente descontaminados,
incluindo a área salpicada, os materiais e quaisquer superfícies ou equipamento
contaminados, com um desinfetante químico apropriado eficaz para resíduos biológicos
potencialmente perigosos das amostras envolvidas (normalmente, uma diluição de 1:10 de
lixívia de uso doméstico, 70-80% de etanol ou isopropanol e iodofor como Wescodyne™
Plus a 0,5% etc.), devendo ser secos com um pano.
Salpicos que contenham ácido devem ser absorvidos adequadamente (limpos com um
pano) ou neutralizados e a área deve ser enxaguada e limpa com um pano até ficar seca;
poderá ser necessário eliminar os materiais utilizados para limpar os salpicos como
resíduos biologicamente perigosos. Em seguida, a área deverá ser descontaminada com
um dos desinfetantes químicos.
NOTA: Não coloque soluções que contenham lixívia na autoclave!
Elimine todas as amostras e materiais utilizados para realizar o teste como se estes
contivessem um agente infecioso. Os resíduos laboratoriais, químicos ou biológicos
perigosos devem ser manuseados e eliminados em conformidade com todos os
regulamentos locais, regionais e nacionais.
Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns
componentes químicos neste kit de teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as
informações fornecidas no final das instruções de utilização.
A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com.
[PT] 4
5.2. Precauções relacionadas com o procedimento
5.2.1. Preparativos
A fiabilidade dos resultados depende da implementação correta das Boas Práticas Laboratoriais que
seguintes
Práticas:
• Não utilize reagentes expirados.
• Não misture nem associe reagentes de diferentes lotes num único teste.
• Antes da utilização, aguarde 30 minutos até que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente
(18-30 °C).
• O nome do teste, bem como um número de identificação específico para o teste, é indicado na
estrutura de cada microplaca. O número de identificação específico é indicado também em cada tira.
Syphilis Total Ab: Número ID específico = 97
Verifique o número de identificação específico antes da utilização. Se o número de identificação
estiver em falta ou for diferente do número indicado correspondente ao ensaio a testar, a tira não
deve ser utilizada.
OBSERVAÇÃO: Para a solução de lavagem (R2, identificação da etiqueta: 20X coloração verde),
tampão de substrato peroxídase (R8, identificação da etiqueta: tampão TMB, coloração azul),
cromogéneo (R9, identificação da etiqueta: TMB 11X, coloração púrpura) e solução de paragem
(R10, identificação da etiqueta: 1N coloração vermelha), é possível utilizar outros lotes para além
daqueles incluídos no kit, desde que o mesmo lote seja utilizado na execução de um determinado
teste. Estes reagentes podem ser utilizados com alguns dos outros produtos da nossa empresa.
Contacte o nosso serviço técnico para obter informações detalhadas.
• Reconstitua cuidadosamente os reagentes, evitando qualquer contaminação.
• Utilize vidros de laboratório minuciosamente lavados e enxaguados com água desionizada ou, de
preferência, material descartável.
• Não deixe que a microplaca seque entre o final da operação de lavagem e a distribuição de
reagente.
• A reação enzimática é muito sensível a iões metálicos. Por conseguinte, não permita que qualquer
elemento metálico entre em contacto com as várias soluções de conjugado ou de substrato.
• A solução de desenvolvimento (tampão de substrato + cromogéneo) deve ter coloração cor-de-rosa.
A modificação desta coloração cor-de-rosa no intervalo de alguns minutos após a reconstituição
indica que o reagente não pode ser utilizado e deve ser substituído.
A preparação da solução de desenvolvimento pode ser realizada numa bandeja de plástico limpa,
descartável e de utilização única ou num recipiente de vidro que primeiramente tenha sido pré-lavado
com 1N HCl, enxaguado minuciosamente com água destilada e seco. Este reagente deve ser
armazenado num local escuro.
• Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento.
5.2.2.
Processamento
• Não altere o procedimento de ensaio.
• Não realize o teste na presença de vapores reativos (vapores ácidos, alcalinos ou aldeídicos) ou de
poeiras que possam alterar a atividade enzimática do conjugado.
• Utilize uma ponta de distribuição nova para cada amostra.
• A lavagem da cavidade é um passo crítico neste procedimento: respeite o número de ciclos de
lavagem recomendado, certificando-se de que todas as cavidades estão completamente cheias e, em
seguida, são completamente esvaziadas. Uma lavagem incorreta pode levar a um resultado incorreto.
• Siga cuidadosamente os procedimentos de lavagem descritos de modo a obter o máximo
desempenho do teste. Com alguns instrumentos, poderá ser necessário otimizar o procedimento de
lavagem (aumentar o número do ciclo da fase de lavagem e/ou o volume do tampão de lavagem para
cada ciclo) para obter um nível aceitável de fundo DO para a amostra negativa.
• Contacte a nossa empresa para obter informações sobre adaptações e procedimentos especiais.
[PT] 5
6. AMOSTRAS
Recolha as amostras de sangue de acordo com as práticas correntes.
Os testes devem ser realizados em soro não diluído ou plasma (recolhido em EDTA, citrato de sódio,
heparina de sódio ou ACD)
As amostras que contêm agregados devem ser clarificadas por centrifugação, antes do teste. As
amostras devem ser armazenadas a +2-8 °C se o teste for realizado num prazo de 7 dias ou
armazenado a -20 °C para um período mais longo. Não repita mais de 5 ciclos de
congelação/descongelação. Foram utilizadas amostras com um tratamento térmico a 56 °C durante
1/2 hora.
As amostras que contenham até 120 g/l de albumina, 200 mg/l de bilirrubina, 33 g/l de trioleína ou 2
g/l de hemoglobina não afetam os resultados. Contudo, não é recomendada a utilização de soro ou
plasma hiperlipémico ou hiperhemolisado.
As amostras devem ser descongeladas e bem misturadas antes de testar.
Se as amostras se destinam a ser transportadas, devem ser acondicionadas em conformidade com
as regulamentações em vigor relativamente ao transporte de agentes etiológicos e de preferência
transportadas congeladas.
7. PROCEDIMENTO
7.1. Materiais necessários, mas não fornecidos
• Água destilada.
• Hipoclorito de sódio (lixívia de uso doméstico) e bicarbonato de sódio.
• Papel absorvente.
• Luvas descartáveis.
• Óculos de segurança.
• Tubos descartáveis.
• Pipetas ou multipipetas ajustáveis ou predefinidas, automáticas ou semiautomáticas, para medir e
dispensar 50 μl, 1 ml e 10 ml.
• Cilindros graduados com uma capacidade de 100 ml e 1 L.
• Sistema lavador de microplacas automático, semiautomático ou manual (*).
• Incubador de microplacas com termóstato ajustado para 37 °C ± 1 °C (*).
• Recipiente para resíduos biologicamente perigosos.
• Leitor de microplacas equipado com filtros de 450, 490 nm e 620-700 nm (*).
(*) Contacte-nos para informação detalhada sobre o equipamento recomendado pelo nosso
departamento técnico.
7.2. Preparação dos reagentes
7.2.1. Reagentes prontos a utilizar
Reagente 1 (R1): Microplaca
Cada estrutura de apoio contendo 12 tiras é envolta numa bolsa de alumínio selada. Corte a bolsa
usando uma tesoura ou um bisturi 0,5 a 1 cm acima do selo. Abra a bolsa e retire a estrutura.
Coloque as tiras não utilizadas na bolsa. Feche a bolsa cuidadosamente e volte a armazená-la a +2-8
°C.
Reagente 3 (R3): Controlo negativo
Reagente 4 (R4): Controlo positivo
Reagente 6 (R6): Conjugado
Homogeneíze invertendo antes da utilização.
Reagente 10 (R10): Solução de paragem
[PT] 6
7.2.2. Reagente para reconstituir
Reagente 2 (R2): Solução de Lavagem concentrada (20x)
Dilua 1:20 em água destilada para obter a solução de lavagem pronta a utilizar.
Prepare 800 ml para uma placa de 12 tiras.
Reagente 8 (R8) + Reagente 9 (R9): Solução de desenvolvimento de enzimas
Dilua a 1:11 o cromogéneo (R9) no Tampão de Substrato (por ex.: 1 ml de reagente R9 + 10 ml de
reagente R8) visto que 10 ml são a quantidade necessária e suficiente para tratar 12 tiras.
Homogeneíze.
7.3. Procedimento de ensaio
Siga rigorosamente o procedimento.
Utilize soros de controlo negativos e positivos para cada teste de modo a validar a qualidade do teste.
Siga as Boas Práticas Laboratoriais que se seguem:
1) Estabeleça cuidadosamente o plano de identificação e distribuição de amostras.
2) Prepare a solução de lavagem R2 diluída
3) Retire a estrutura de apoio da embalagem de proteção e o número necessário de tiras (R1).
Volte a colocar as tiras não utilizadas na embalagem. Feche a embalagem e volte a colocá-la
a +2-8 °C.
4) Distribua na cavidade pela seguinte ordem (distribuição de placa recomendável):
• 50 μl de controlo negativo (R3) em A1, B1, C1
• 50 μl de controlo positivo (R4) na cavidade D1, E1
• 50 µl de amostra não diluída em cada cavidade, F1, G1, etc
• 50 μl de conjugado (R6) em cada cavidade
Dependendo do sistema utilizado, é possível modificar a posição dos controlos ou a ordem de
distribuição.
Homogeneíze a mistura de reação com pelo menos 3 aspirações ou com um agitador de
microplacas durante 5 segundos.
OBSERVAÇÃO:
A distribuição de amostras e controlos pode ser controlada visualmente neste passo da
manipulação, existe uma diferença de coloração entre a cavidade vazia e a cavidade que contém
a amostra.
Dispense conjugado num prazo de 5 minutos após a distribuição de amostra. Existe uma clara
diferença de coloração entre uma cavidade vazia e uma cavidade que contém a solução de
conjugado vermelho (R6) (consulte § 7.7)
5) Quando possível, cubra a placa com fita adesiva nova.
6) Incube a microplaca durante 30 a 35 minutos a 37 °C ± 1 °C.
7) Se necessário, retire a fita adesiva. Aspire o conteúdo de todas as cavidades para um
recipiente de líquido evacuado e adicione, pelo menos, 370 µl de solução de lavagem em
cada cavidade. Aspire novamente e repita a lavagem, no mínimo, 4 vezes (5 ciclos de
lavagem efetuados no total). O volume residual deve ser inferior a 10 μl (se necessário,
seque as tiras virando-as ao contrário em papel absorvente).
Caso possua um sistema de lavagem automático, siga o mesmo ciclo operacional.
OBSERVAÇÃO: Prossiga para o passo de lavagem num espaço de 20 minutos.
8) Prepare a solução de desenvolvimento (reagente R8 + R9).
9) Distribua rapidamente em cada cavidade 50 μl da solução de desenvolvimento (R8+R9),
preparada imediatamente antes da utilização. Deixe que a reação se desenvolva no escuro
durante 25 a 35 minutos à temperatura ambiente (18-30 ºC). Não aplique fita adesiva durante
esta incubação.
OBSERVAÇÃO: A distribuição da solução de desenvolvimento, com coloração cor-de-rosa, pode
ser controlada visualmente nesta fase da manipulação. Existe uma clara diferença de coloração
entre a cavidade vazia e a cavidade que contém a solução de substrato cor-de-rosa. (Consulte
§ 7.7).
[PT] 7
10) Adicione 50 μl da solução de paragem (R10) utilizando a mesma sequência e razão de
distribuição utilizadas para a solução de substrato. Homogeneíze a mistura de reação.
OBSERVAÇÃO: A distribuição da solução de paragem incolor pode ser controlada visualmente
nesta fase de manuseamento. A cor do substrato, cor-de-rosa (para amostras negativas) ou azul
(para amostras positivas), desvanece das cavidades, que se tornam incolores (para amostras
negativas) ou amarelas (para amostras positivas) após a adição da solução de paragem.
11) Limpe cuidadosamente o fundo de cada placa. Aguarde pelo menos 4 minutos após a adição
da solução de paragem e no espaço de 30 após a paragem da reação, leia a densidade ótica
a 450/620-690 nm usando um leitor de placas.
12) Verifique a conformidade entre as leituras do espectrofotómetro e as leituras visuais e
compare com distribuição da placa e da amostra e o plano de identificação.
7.4. Controlo de qualidade
Utilize os controlos negativos (R3) e positivos (R4) para cada execução, para validar os resultados
dos testes. (Consulte §7.5).
7.5. Critérios de validação do teste
Este teste é validado se as condições abaixo forem respeitadas:
1) Para o controlo negativo R3:
DO R3 ≤ 0,080
Se um valor de controlo estiver acima deste valor, elimine-o e efetue o cálculo com os dois valores de
controlo negativos restantes.
2) Para o controlo positivo R4:
DO R4 ≤ 0,700
7.6. Cálculo/interpretação dos resultados
O corte é determinado com o controlo negativo R3:
Calcule o valor de absorvância médio medido para o controlo negativo R3 e calcule o valor de corte
(COV) da seguinte forma:
COV = DO R3 média + 0,100
Amostras com DO inferior a COV são consideradas negativas pelo Syphilis Total Ab.
Os resultados que fiquem imediatamente abaixo do valor de corte (COV -10% <DO <COV) devem,
contudo, ser interpretados com cuidado. É aconselhável voltar a testar as amostras correspondentes
em duplicado quando os sistemas e os procedimentos laboratoriais o permitirem.
As amostras com DO superior ou igual ou a COV são consideradas positivas pelo Syphilis Total Ab e
devem ser testadas novamente em duplicado antes da interpretação final.
As amostras testadas novamente que se encontrem acima de COV em pelo menos um duplicado são
consideradas positivas e devem ser investigadas. As amostras que se encontrem abaixo do corte em
ambos os duplicados são consideradas negativas.
Em caso de densidade ótica muito reduzida para amostras testadas (DO negativa) e quando a
presença de amostras e de reagentes for controlada, os resultados podem ser interpretados como
negativos.
É recomendado que confirme as amostras positivas seguindo os algoritmos e recomendações
nacionais atuais.
[PT] 8
7.7. Verificação espetrofotométrica da amostra e pipetagem do conjugado
(opcional)
Amostras e controlos
A presença de amostras e controlos na cavidade pode ser verificada através de leitura automática a
450/620 nm.
Uma cavidade com amostra adicionada terá uma DO entre 0,050 e 1,100.
Conjugado
O conjugado tem coloração vermelha.
A presença de conjugado nas cavidades pode ser controlada através de leitura automática a 450/620
nm. Uma cavidade com amostra e conjugado terá uma DO ≥1,200.
Verificação da pipetagem da solução de desenvolvimento
É possível verificar a presença de solução de desenvolvimento cor-de-rosa na cavidade através de
leitura automática a 492 nm.
Uma cavidade com solução de desenvolvimento deve ter uma densidade ótica superior >0,100 (uma
DO inferior indica uma dispensa insuficiente da solução de desenvolvimento).
8. LIMITAÇÃO DO TESTE
Tal como nos testes serológicos para sífilis, a interpretação de resultados obtidos com o ensaio EIA
Syphilis Total Ab EIA deve ser utilizada em conjunto com os sintomas clínicos, com o histórico médico
e com outras conclusões laboratoriais do paciente, para produzir um diagnóstico clínico geral.
Não está disponível um único teste único nem um único padrão de referência definitivo para cada
fase da doença. Assim, o diagnóstico da sífilis baseia-se essencialmente em testes serológicas,
necessitando dos resultados de métodos treponémicos e de métodos não treponémicos.
Nenhum teste de diagnóstico oferece total garantia de que uma amostra não contém níveis baixos de
anticorpos de T. pallidum, como os que se encontram presentes numa fase muito inicial da infeção.
Por esse motivo, um resultado negativo num determinado momento não exclui a possibilidade de
exposição a uma infeção por sífilis.
Qualquer técnica ELISA pode produzir falsas reações positivas. É recomendável verificar a
especificidade da reação de qualquer amostra que se considere um positivo reproduzível, de acordo
com os critérios de interpretação do kit Syphilis Total Ab, utilizando um método adequado: Teste de
hemoaglutinação para Treponema pallidum.
Todos os resultados de testes treponémicos tendem a permanecer reativos no seguimento da infeção
treponémica, por isso não devem ser utilizados para avaliar a resposta à terapia. Devido à
persistência da reatividade, em geral, para a vida do paciente, os testes treponémicos não têm
qualquer valor na determinação de recidiva ou reinfeção num paciente com um resultado reativo.
Neste caso, recomenda-se que utilize outros ensaios: Syphilis IgM EIA, RPR e TPHA.
O método do espectrofotómetro para verificação da amostra, a deposição da solução de
desenvolvimento do conjugado não permite verificar a precisão do volume de amostras e conjugado
dispensado. Este método só mostra a presença da amostra e do conjugado. A taxa de erro com este
método está intimamente ligada à precisão do sistema utilizado (um coeficiente acumulado de
variação de dispensa e leitura acima de 10% o que diminui de forma significativa a qualidade deste
passo.)
[PT] 9
9. CARATERÍSTICAS DE DESEMPENHO
9.1. Medição Precisa
A reprodutibilidade e precisão intermédia foram determinadas utilizando amostras com diferentes
concentrações de anticorpos de Sífilis. As amostras foram testadas 30 vezes durante a mesma série
de testes para determinar a repetibilidade.
As amostras foram também testadas em duplicado durante 20 dias a uma taxa de 2 testes por dia.
As médias de rácios, os desvios padrão e os coeficientes de variação (CV) foram calculados.
9.1.1. Repetibilidade:
N
Média de
rácios
Desvio padrão
CV%
Negativa fraca
30
0,14
0,014
9,5%
Negativa alta
30
0,68
0,051
7,5%
Syphilis ab positiva
fraca
30
1,90
0,070
3,7%
Syphilis ab positiva
30
3,76
0,130
3,5%
Amostras
Os CV obtidos nas amostras positivas são inferiores a 10%.
9.1.2. Precisão intermédia
Amostras
N
Média
de
rácio
Intra-análise
Interanálise/operador
Interdia
Reprodutibilidade
total
DP
CV%
DP
CV%
DP
CV%
DP
CV%
Negativa fraca
80
0,15
0,035
22,5%
0,023
14,7%
0,017
10,9%
0,045
29,0%
Negativa alta
80
0,74
0,038
5,1%
0,074
10,0%
0,006
0,8%
0,084
11,2%
80
2,30
0,112
4,9%
0,312
13,5%
0,099
4,3%
0,346
15,0%
80
4,13
0,180
4,3%
0,543
13,1%
0,195
4,7%
0,604
14,6%
Syphilis ab
positiva fraca
Syphilis ab
positiva
Os CV obtidos nas amostras positivas são iguais ou inferiores a 15%.
9.2. Desempenho clínico
O desempenho clínico do ensaio Syphilis Total Ab foi determinado testando amostras de estudos
prospetivos e retrospetivos:
Estudo prospetivo:
- 5195 amostras de dadores de sangue aleatório;
- 460 amostras de pacientes em quem havia suspeita de Sífilis
Estudo retrospetivo:
- 350 positivas de pacientes com DST.
Os estudos foram realizados em 2 bancos de sangue, num centro para DST (Doenças Sexualmente
Transmissíveis) e na Bio-Rad.
[PT] 10
9.2.1. Especificidade do diagnóstico
O estudo foi realizado em amostras de soro e plasma EDTA colhidas em 2 bancos de sangue em
doadores aleatórios, em França.
Também foi realizado um estudo de especificidade em amostras provenientes de pacientes.
Todos os resultados foram comparados com os resultados obtidos com outros testes de Sífilis com
marcação CE.
Tabela 1: Teste de especificidade (IR = inicialmente reativa; RR= Repetitivamente reativa)
População
Dadores
de sangue
Pacientes
Local
#1 + #2
#3
Número
total de
amostras
Inicialment
e reativa
(IR)
Repetitiva
mente
reativa
(RR)
Especificid
ade de RR
(%)
Soro SST
3127
2
2*
3125/3125
Plasma EDTA K2
2068
2
2*
2066/2066
Total
5195
4
4*
Soro
351
1
1
Tipo de amostra
100%
5191/5191
99,72%
350/351
95% CI (%)
99,93% 100%
98,42 –
100%
*Amostras repetitivamente reativas consideradas positivas com outro EIA com marcação CE Ensaio de
Sífilis foi excluído do cálculo de especificidade do diagnóstico
9.2.2. Sensibilidade do diagnóstico
Estudo retrospetivo:
O estudo foi realizado em 350 amostras congeladas, das quais 2 amostras foram declaradas
negativas e 348 foram confirmadas positivas com ensaios de Sífilis com CE.
Entre estas 348 amostras positivas, 7 amostras eram de pacientes numa fase inicial da infeção.
Todas as 348 amostras foram consideradas positivas com o ensaio Syphilis Total Ab da Bio-Rad.
Estudo prospetivo:
Um total de 460 amostras novas foi avaliado com o ensaio Syphilis Total Ab da Bio-Rad e comparado
com testes de Sífilis com marcação CE.
348 foram consideradas negativas com os testes de referência e com os testes da Bio-Rad (com
duas amostras classificadas como falsos positivos com referência a testes EIA)
109 foram consideradas positivas com ambos os testes do ensaio.
3 amostras apresentaram resultados discrepantes (depois de testar novamente com o ensaio da BioRad):
• 1 amostra positiva com o ensaio da Bio-Rad e negativa alta com os testes de referência. Esta
amostra com baixa taxa de sífilis encontrava-se no valor de corte limite para ambos os testes
EIA:
• 1 amostra positiva com testes de referência, negativa com o ensaio da Bio-Rad (de 1 paciente
sem sinais)
• 1 amostra positiva com os testes de referência, IR negativa e positiva e novos testes com o
ensaio da Bio-Rad,
Estudos retrospetivos e prospetivos:
A sensibilidade de diagnóstico global é igual a 99,56% (457/459) com um intervalo de confiança
situado em 95% de [98,44%- 99,95%].
Sensibilidade Clínica
A sensibilidade clínica também foi estudada em 3 painéis comerciais e 1 painel de seroconversão. O
ensaio Syphilis Total Ab da Bio-Rad foi comparado com ensaios de sífilis com marcação CE. A
deteção de cada amostra dos painéis é equivalente entre o ensaio da Bio-Rad e o ensaio de
referência da sífilis.
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9.3. Sensibilidade analítica
A sensibilidade analítica foi avaliada em 2 normas NIBSC e calculada com o valor de corte utilizando
uma regressão:
1. O limite de deteção para IgG/IgM foi avaliado em 3 lotes do ensaio Syphilis Total Ab e
estimado em 0,53 mIU/ml com CI 95% [0,10 mIU/ml – 1,30 mIU/ml] utilizando a norma da
OMS de IgM/IgG (código NIBSC: 05/132).
2. O limite de deteção para IgG foi avaliado em 1 lote do ensaio Syphilis Total Ab e estimado em
0,11 mIU/ml com CI 95% [0,02 mIU/ml – 0,27 mIU/ml] utilizando a norma da OMS de IgG
(código NIBSC: 05/122).
9.4. Especificidade analítica/Estudo transversal da reatividade
Foi testado um total de 125 amostras potencialmente interferentes contendo anticorpos contra
agentes patogénicos que poderiam levar a doenças infeciosas (Lyme, Toxoplasmose, EBV,
Leptospirose, SLE (lúpus), Anticorpo de Hepatite A, Anticorpo de Hepatite B, Anticorpo de Hepatite C,
HTLV I/II e HIV), amostras de pacientes em grupos de risco (mulheres grávidas e mulheres
multíparas) ou amostras de pacientes com distúrbios do sistema imunitário (fatores reumatoides) com
o ensaio Syphilis Total Ab.
Entre as 125 amostras testadas, 1 amostra foi considerada positiva reproduzível com o ensaio
Syphilis Total Ab; esta amostra foi verificada como sendo um verdadeiro positivo com outros ensaios
de confirmação e Syphilis EIA CE.
A especificidade observada nesta população-alvo é igual a 100% (124/124) com um intervalo de
confiança de 95% de [97,1% - 100,0%].
9.5. Efeito de "hook"
A existência de um possível efeito de "hook" foi estudada através do teste a 6 amostras positivas de
Sífilis com elevadas titulações em diferentes diluições. A equivalência de resultados observada entre
amostras não diluídas e amostras diluídas indica a ausência do efeito de "hook" nas amostras
testadas.
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference.
J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992.
2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural,
functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57.
3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for
syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1–21.
4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for
screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar;
33(3):525–7.
5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and
some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187–209.
6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem
Lab Med. 2009. 47:596-606.
7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300–309.
8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization.
2009
9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, ‘It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening
Tests for Diagnosis of Syphilis’, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6.
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