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Einführung:
Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Einführung: I. Die Fischer-Projektion: 2-epi-Glucose = Mannose Glucose CHO OH HO OH OH OH H HO H H CHO CHO OH HO H HO OH OH OH OH OH OH R = D-Glucose II. Stereoisomere: 4 chirale Zentren, kein Symmetrieelement. → 24 = 16 Aldohexosen-Stereoisomere. → 8 diastereore Paare von Enantiomeren. III. D/L-Nomenklatur: Die D/L-Nomenklatur für Monosaccharide definiert die absolute Konfiguration am höchst nummerierten chiralen Zentrum. R → D-Zucker S → L-Zucker Nützliche Links: Kohlenhydratstrukturen;http://scholle.oc.uni-kiel.de/lind/iteach/kh_struct_home.htm; http://chem.berkeley.edu/people/faculty/bertozzi/bertozzi.html; 1 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Monosaccharide – Aldosen Fischer-Projektion in der D-Serie der Aldosen. E. Fischer: Bestimmung der relativen Konfiguration aller Hexosen. CHO OH D-Glycerinaldehyd OH CHO CHO OH Erythrose OH OH CHO OH OH OH OH Ribose CHO OH OH OH OH OH Allose HO OH OH CHO CHO OH HO OH OH OH Arabinose CHO CHO OH HO OH OH OH OH Altrose HO Threose CHO OH HO HO OH OH Xylose CHO OH OH CHO HO HO HO OH OH OH OH OH OH Glucose Mannose OH OH Lyxose HO OH HO OH OH Gulose CHO OH CHO OH OH Idose HO HO OH OH Galactose CHO HO HO HO OH OH Talose 2 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate In Säugetieren häufig vorkommende Zucker. OH R HO O HO HO OH HO2C HO HO OH OH D-Glucoronsäure HO R HO OH NHAc N-Acetyl-D-Galactosamin HO HO OH O HO OH O O OH D-Galactose O R R HO OH D-Glucose OH OH R O OH S HO O O HO HO HO2C OH OH L-Idouronsäure OH OH R O HO HO OH D-Xylose HO L-Fucose NH S! D-Mannose OH OH OH R OH O HO HO OH NHAc N-Acetyl-D-Glucosamin CO2H OH O OH HO Sialinsäure 3 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Monosaccharide – Ketosen Fischer-Projektion in der D-Serie der Ketosen. OH O Erythrulose OH OH OH O OH O OH OH OH Ribulose OH O OH OH OH OH Psicose HO OH OH Xylulose OH O OH O OH HO OH OH OH Fructose HO OH OH Sorbose OH O HO HO OH OH Tagatose 4 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Mutarotation: Einstellung eines Gleichgewichtes der Anomeren über eine offenkettigen Zwischenstufe. Allgemeine Säuren-Basen-Katalyse. OH HB OH O H O OH OH B OH OH O OH OH OH OH OH OH HB O H OH O OH OH OH OH H O O H HB OH OH OH OH OH OH 5 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Glycosid-Synthese via Austausch am anomeren Sauerstoffatom R O H O O OR C2-Steuerung O Z R O H O Y SN1-Typ O H R SN2-Typ Glycosil-Donor Z = BnO, N3 Z OR R O H O Z hauptsächlich α-Glycoside O Z X Z = OAc, OBz, NHAc Z Z hauptsächlich 1,2-trans-Produkt Inversion O OR X Z = BnO, N3 Z Glycosil-Akzeptor Lösungsmitteleinflüsse beim SN1-Mechanismus O O O Z O OEt2 OR Z kinetischer Lösungsmittelkomplex mit CH3CN N Z N thermodynamischer Lösungsmittelkomplex mit Et2O Z O R H OR 6 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Fischer-Glycosidierung HO HO OH MeOH, HCl Rückfluss, 12h O HO HO HO OH OH O O HO HO HO OH HO OMe 58% D-Galactopyranose Thermodynamische Bedingungen (12h): hauptsächlich Pyranosen. Kinetische Bedingungen (6h): >50% β-D-Galactofuranoside. HO OH HO 20% O OH H OMe OMe OH HO HO H 6% OMe O 16% OH Die Fischer-Glycosidierung läuft über die anfängliche Bildung der Furanoside. OH OH OH O O HO OH HO OH OH MeOH OH HO OH HO OH HO HO O OH OMe schnell HO OMe OH OH OH OH O langsam HO HO OMe OH 7 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate in situ Anomerisierung Y = R4NBr, Hg(CN)2, HgBr2; Y = AgClO4, AgOTf BnO BnO BnO BnO OBn OR O 1,2-trans α-D-Mannose (einfach) R = Bn, Bz, Ac O A OBn OR O α-D-Mannose Die Koenigs-Knorr-Reaktion Br O A Y H heterogene Bedingungen Y = Ag2O, Ag-Silikat/Al2O3 BnO BnO OBn OR O 1,2-cis O A β-D-Mannose (anspruchsvoll) R = Bn Glycosyl-Donor RO Promotor OR O RO N3 R: Bn>Bz=Ac X: I>Br>Cl X Glycosyl-Akzeptor Et4NBr HO OH Hg(CN)2 O Hg(CN)2/HgBr2 HgBr2 HO OH AgClO4 OR AgOTf HO-Me>>HO-CH2R>6-OH 6-OH>>3-OH>2-OH>4-OH Eine Optimierung von Ausbeute und Selektivität verlangt nach einer genauen Einstellung der drei Parameter. 1) Reaktivität des Glycosyl-Halogenids - Abhängig von Schutzgruppen. 2) Reaktivität des Glycosyl-Akzeptors - Abhängig von Schutzgruppen und räumlichen Anspruch. 3) Aktivität des Promoters - Stark variierender Aktivitätsbereich. 8 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Stereochemie der Trichloracetimidat-Bildung Der kinetische anomere Effekt β-Glycosyloxid-Anionen sind aufgrund des kinetischen anomeren Effektes stärker nucleophil als α-Glycosyloxid-Anionen. 1. ß-Glycoside sind sterisch leichter zugänglich (mehr „Platz“ in der äquatorialen Position). 2. Wechselwirkungen zwischen Dipolen und freien Ionenpaaren destabilisieren das β-Glycosyloxid-Anion. O O O O O O O O 9 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate 1. 2. Kinetische Bedingungen: β-Trichloracetimidat (kinetischer anomerer Effekt) Thermodynamische Bedingungen: α-Trichloracetimidat (anomerer Effekt) OAc OAc Thermodynamisch AcO AcO K2CO3, Cl3CN, CH2Cl2, 48h, r.t. O AcO OH AcO AcO O AcO 98% NH O CCl3 Kinetisch OAc OAc AcO AcO K2CO3, Cl3CN, CH2Cl2, 2h, r.t. O AcO OH AcO AcO BnO BnO NH CCl3 OBn K2CO3, Cl3CN, CH2Cl2, 48h, r.t. O BnO O AcO 78% OBn Thermodynamisch O OH BnO BnO O BnO 78% O NH CCl3 OBn OBn Kinetisch BnO BnO K2CO3, Cl3CN, CH2Cl2, 2h, r.t. O BnO OH 90% BnO BnO O O BnO NH CCl3 10 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Die Trichloracetimidat-Methode OR OR K2CO3, Cl3CN, CH2Cl2, 48h, r.t. O RO RO RO OH OR O RO RO RO 98% H O A A-OH, BF3 RO NH O OR RO RO K2CO3, Cl3CN, CH2Cl2, 2h, r.t. O RO OH 78% RO RO O A BF3 CCl3 OR O RO RO OR O O RO NH A-OH, BF3 CCl3 A BF3 RO RO O RO O A O H Kontrolle über das anomere Zentrum durch: 1. Nachbargruppen-Effekte (R = OAc, OBz, NHAc: 1,2-trans-Konfiguration. 2. Keine Nachbargruppen-Effekte (R = OBn) a) Milde Lewis-Säure (BF3) und tiefe Temperatur: Inversion an C1. b) Starke Lewis-Säure (TMSOTf): Bildung der thermodynamischen Glycoside. c) Lösungsmittel-Effekte: Et2O begünstigt die α-Konfiguration; MeCN begünstigt die β-Konfiguration. 11 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Die Nachbargruppen-Beteiligung an C2 bietet Kontrolle über das anomere Zentrum Y O Y = Promoter X O H O O R O O O H O OR β-Glycosid O O Hauptprodukt Gluco-Serie O O O O O O O O O Y = Promoter X Y Manno-Serie α-Glycosid OR H H O R Hauptprodukt 12 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Häufig verwendete Glycosyl-Donatoren O X Glycosyl-Halogenide (X = Br, Cl) Aktivierung durch: R4NBr; Hg(CN)2, AgClO4, AgOTf O O SR Thio-Glycoside (R = Alkyl, Aryl) Aktivierung durch: NIS/TfOH; DMTST NH O CCl3 Trichloacetimidate Aktivierung durch: BF3xOEt2, TMSOTf O F Glycosyl-Fluoride Aktivierung durch: SnCl2/AgClO4; HfCp2Cl2,(AgOTf) Weitere Glycosyl-Donatoren O O O SeAr O Epoxide Aktivierung durch: ZnCl2 Seleoglycoside Aktivierung durch: AgOTf/K2CO3 O S N Pyridylthioglycoside Hg(NO3)2, AgOTf O O N Anomere Ester Cu(OTf)2, Sn(OTf)2 13 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Die biologische Bedeutung der Oligo- und Polysaccharide Struktur-gebende Eigenschaften: - Zellulose: Zellwände der Pflanzen, Baumwolle, ... - Agar: Zellwandmaterial von Seegras. - Chitin: Skelett der Insekten, ... Energiespeicher: -Glycogen: Energiespeicher in Säugetieren. - Stärke (Mischung aus Amylose und Amylopektin), Energiespeicher der Pflanzen. Träger der biologischen Information: - Zell-Zell-Kontakte/Erkennung, Wachstumskontrolle, Entwicklung des Nervengewebes. - Antigen-Antikörper-Wechselwirkung. - Glycokonjugate: Oligosaccharide (Glycan) verknüpft an Biopolymere (Protein oder Lipid). A: Lineare Polysaccharide: Cellulose, Amylose (Stärke) B: Branched Polysaccharides: Amylopectin, Glycogen (Stärke) Polysaccharidstrukturen C: Alternierende Kohlenhydrat-Einheiten: Agarose D: Oligosaccharid-Blöcke: Alginat E: Komplexe Lineare Kohlenhydrat-Einheiten: Gellan 14 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Cellulose: β-(1→4)-verknüpfte Glucose-Einheiten: OH 4 O 1 HO OH OH O OH HO 1 O 4 HO 4 O O HO 1 O HO OH OH HO 1 O 4 Chitin: β-(1→4)-verknüpfte N-Acetylglucosamin-Einheiten (GlcNAc): OH 4 HO O 1 NHAc Amylose (eine Komponente von Stärke): α-(1→4)-verknüpfte Glucose-Einheiten. O HO 4 HO HO HO OH O OH O 4 Agarose (aus Algen): Hauptsächlich Galactose/Anhydrogalactose-Einheiten. OH OH O 1 OH AcHN O NHAc HO O O HO OH O HO OH O OH 4 NHAc 1 O HO O OH O O OH OH O O O O 15 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Glycokonjugate als Träger der biologischen Information Glycokonjugate = Glycan + Protein/Lipid Glycoproteine: N-verknüpfte Glycoproteine O HN OH O HO O NHAc GlcNAc -Verknüpfung des Glycans (GlcNAc) mit der Amid-Gruppe von Asparagin. - Das Pentasaccharid besitzt immer die selbe Oligomannose-Struktur. - Beispiele: Serumproteine (Amylase), Plasmaproteine (Fibrinogen), Immunogluboline, Hormone, Membran-Glycoproteine. N H H N O Asn 1 α 2 2 α 6 6 1 α 1 α 1 β 1 β 2 2 4 4 1 β 1 β 1 α 6 3 α 1 3 6 α 1 1 α 2 1 2 α α 1 β 2 1 1 β α 3 6 3 1 6 α 1 1 α α 2 NeuAc Gal 2 1 α 1 3 Fuc α 6 1 β 1 β 1 β 4 4 4 1 β 1 β 1 β 4 4 4 1 β 1 β 1 β Asn Asn Asn Man GlcNAc 6 1 α 16 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate O-verknüpfte Glycoproteine NH OH H N OH O HO AcHN GalNAc O HO HO O OH (H, CH3) H N HN O O Ser Xylose O Ser/Thr Gal 1 β 1 β 3 4 1 β 1 3 Die Strukturen der O-Glycoproteine sind Vielfältiger als die der N-Glycoproteine. Weit verbreitet ist das erste Motif. Beispiele: Serum- und Membran-GlycoProteine (Blutgruppen-Glycoproteine); Heparin. 6 1 β 3 β GlcNAc GalNAc 1 β 1 β 4 4 1 β 1 3 1 β 3 4 1 β 1 β Ser/Thr β 1 6 1 β 3 Xyl 3 1 β 1 3 α Ser/Thr β 1 β 1 β 1 β 4 4 4 1 β 3 6 α Ser/Thr β 1 β 1 3 1 β 3 β 1 β 4 6 α Ser/Thr β Ser 17 Naturstoffchemie - Kohlenhydrate Glycosphingolipide: Glycosylierte Sphingosin-Derivate (hauptsächlich Ceramide) Cerebroside: Eine Kohlenhydrateinheit (oft Glucose oder Galactose) Komplexe Glycosphingolide: Verzweigte und unverzeigte Oligosaccharide (≤ 20 Monomere) Ganglioside: Glycosphingolipide mit Sialinsäure Sulfatide: sulfonylierte Glycoshingolipide. HO HO O OH O HO HN 3-Sulfogalactosylceramid OH HO Biologische Funktion: Zell-Adhäsion, Zell-Zell-Interaktionen, Zell-Erkennung, Zell-Differenzierung, Bildung interneuraler HO Verbindungen, Zell-Differenzierung bei der Embryo-Entwicklung, Blutgruppen-Antigene. O O HO OH OH O OH CO2H OH AcHN OH O Cer OH OH Galactosylceramid (Galactocerebrosid) Vorkommen: Zellmembran, Nervensystem O HO3SO O OH OH OH O OH OH O OH O HO O O Cer OH O Gangliosid GM1 NHAc 18 Die Biosynthese von N-Acetyl-Neuraminsäure O HO HO HO HN O ManNAc N-Acetyl-Mannose NeuAc OH CTP Zellkern ATP ManNAc-Kinase ADP O - O3PO HO HO HN O ManNAc-6-P NH2 OH OH Golgi PEP NeuAc-9-P-Synthase HO AcHN O3PO AcHN O HO O O P O COO- O O N O HO CMP-NeuAc OH OH OH COO- O OH ADP - CMP-NeuAc-Synthase PPi CMP-NeuAc HO OH Glycan N-Acetyl-Neuraminsäure N-Acetyl-9-Phosphat Neuraminsäure CMP PEP NeuAc-9-P-Phosphatase ADP OH OH HO AcHN HO HO AcHN OH O COO OH - N-Acetyl-Neuraminsäure COO- OH O O-Zucker(Glycan) HO Sialylkonjugate mit N-Acetyl-Neuraminsäure 19 Cytosol HO COO- OH OH AcHN O O Zucker HO COO- HO OH HO AcHN O O HO Zucker 20 Die Entdeckung von Prof. Reutter (FU-Berlin) O HO HO HO HN O ManNAc N-Acetyl-Mannose NeuNBu OH CTP Zellkern ATP ADP O - O3PO HO HO HN O ManNAc-6-P NH2 OH OH Golgi PEP HO O OH OH O3PO HN HO COO - O O N O HO HO OH N-Acetyl-Neuraminsäure CMP ADP OH HO OH OH O O Glycan NeuAc-9-P-Phosphatase HN O N-Acetyl-9-Phosphat Neuraminsäure PEP HO O P O CMP-NeuAc OH O COO- O OH H N NeuAc-9-P-Synthase ADP - CMP-NeuAc-Synthase PPi CMP-NeuNBu ManNAc-Kinase O HO HN OH COO - N-Acetyl-Neuraminsäure COO- OH O O-Zucker(Glycan) HO O Sialylkonjugate mit N-Acetyl-Neuraminsäure 21 Die folgenden 5 Folien sind eine freundliches Geschenk von Prof. Bertozzi Ich habe sowohl die Graphiken als auch den Text von Ihrer homepage übernommen. Wenn Sie daher von „we“ lesen, ist die Bertozzi-Gruppe gemeint und nicht die von MK. Anwendungen von Prof. Bertozzi Comparisons have revealed that the human genome is not much larger than those of lower organisms, but vastly more abundant in posttranslational machinery, accounting for numerous complex functions found only in mammals. O HO HN O HO HO Ketone Cell HO H N O O OH O ManLev Agent Agent O OH O N HO H N O NH2 OH O HO OH OH O CO2 – O Cell HO SiaLev Agent fashioned with an aminooxy, hydrazide or thiosemicarbazide group CO2 – O Cell 22 Other biological applications of the Staudinger ligation The Staudinger ligation has unique properties that make it well-suited for covalent modification of biomolecules within a complex, highly functionalized environment. The azide and modified triaryl phosphine are both stable in water, but react with each other in a highly chemoselective fashion and are not diverted by any functional groups found in cells or tissues. These qualities have prompted us to expand applications of Staudinger ligation chemistry to include protein tagging within a cellular environment. Azids can be incorporated into proteins via unnatural amino acids and targeted the proteins for covalent modification within cellular lysates. 23 Figure 4. Incorporation of azides into proteins via protein expression in the presence of azidohomoalanine and selective protein modification with a pro-fluorescent dye activated by the Staudinger ligation. 24 Tumor vaccine therapy Their close association with malignancy has prompted consideration of tumor-associated oligosaccharides as components of anti-tumor vaccines. However, tumor oligosaccharides themselves usually fail to stimulate an immune response due to immune self-tolerance. We are exploring an approach to tumor immunotherapy that circumvents self-tolerance by creating unnatural modifications to tumor-associated oligosaccharides, rendering them "foreign" and immunogenic. An immune response to an unnatural variant of a tumor oligosaccharide is engendered by vaccination using a synthetic version of the molecule. The same unnatural modification is induced on tumor cell surfaces by feeding the organism an unnatural metabolic substrate. Once the unnatural epitope is expressed on cells, the immune response is triggered to kill them. The approach is under investigation using the tumor-specific sialyl Tn antigen as a vaccine target. A OH HO H N O OH CO2 – O Immunize animal O HO O Antibodies specific for unnatural sialylated carbohydrate Synthetic vaccine comprising: (a) the unnatural sialic acid SiaLev within a tumor-specific oligosaccharide (b) carrier protein to serve as T-cell epitope Immune response against tumor cells O B AcO HN O AcO AcO OH HO H N OH O CO2 – O O OAc Feed animal ManLev HO O Tumor cell bearing sialylated tumor-specific oligosaccharide: Non-immunogenic due to self-tolerance OH O HO H N O OH O CO2 – O Cell HO Tumor cell bearing unnatural sialylated tumor-specific oligosaccharide: Immunogenic in vaccinated animal Figure: A strategy for tumor vaccine therapy that breaks oligosaccharide self-tolerance through unnatural sialic acid biosynthesis. A. The animal is vaccinated with a synthetic glycoconjugate comprising an unnatural sialylated tumor-specific oligosaccharide bound to an antigenic carrier protein. The unnatural sugar structure circumvents self-tolerance, leading to a vigorous antibody response. B. A tumor cell bearing a natural oligosaccharide is not normally recognized by the immune system due to self-tolerance. But, exposure to the unnatural metabolic substrate ManLev induces the unnatural modification that renders the oligosaccharide immunogenic in the vaccinated animal. The tumor is then destroyed by the immune system. 25 Metabolic disruption of poly-a-2,8-sialic acid, an oligosaccharide associated with metastasis Finally, we use metabolic processes to reversibly inhibit the cell surface expression of interesting polysaccharide structures. We have focused initially on polysialic acid (PSA), a polymer uniquely found attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). This epitope is found in the normal adult brain in regions of neuronal plasticity, and on numerous tumors where it appears to promote metastasis. The molecular underpinnings of these biological roles are not known. We discovered that unnatural sialic acids generated in cells by metabolism of synthetic precursors are incorporated into the PSA chain where they act as chain terminators during polymer extension. N-Butanoylmannosamine (ManBut), for example, serves as a reversible switch for the expression of PSA on both neurons and tumors, and we are now using this chemical tool to study the effects of PSA expression on cell-cell interactions in vitro and in vivo. Other metabolic interference projects in the laboratory focus on altering core structures on cell surface glycoconjugates. The salvage pathway for N-acetylgalactosamine (GalNAc), for example, can be intercepted with unnatural GalNAc analogs thereby changing the structures and perhaps functions of O-linked glycoproteins and chondroitin sulfate proteoglycans. HO HO CO2 – OH O AcHN HO HO O O CO2 – HO OH HO n O O AcHN (n = 10-200) HO AcHN PSA CO2 – OH O Neuron or tumor cell HO HO OH BuHN O HO HN O HO HO CO2 – O O HO OH ManBut Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM) Figure: ManBut is a small molecule switch for polysialic acid expression on tumors and neurons. 26