Zellen und Zellenorganelle

Das Lichtmikroskop
Griechisch:
mikrôs – klein
skopein – betrachten
Geschichte des Lichtmikroskops
„Erfinder“: Hans & Zacharias Janssen um 1595
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Galileo Galilei
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Robert Hooke
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Antoni van Leeuwenhoek
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Mikroskope von Leeuwenhoek
- eigentlich ein Lupes
- Kristallinse im Metalrahmen
- Vergrösserung von 50X bis 300X
Auflösungsvermögen: 1/1000 mm
Die wichtigsten Entdeckungen von
Leeuwenhoek
Mikroorganismen
Chloroplasten
rote Blutkörperchen
Spermien
Das Licht
Licht: im engeren Sinne die für das menschliche Auge
sichtbare elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen
zwischen 380 und 780 nm (sichtbares Licht), im weiteren
Sinne der Wellenlängenbereich zwischen etwa 100 nm und 1
mm (optische Strahlung), der auch die Ultraviolett- und
Infrarotstrahlung umfasst.
Licht hat Eigenschaften von Teilchen (besteht sich aus
Photonen) wie auch von Wellen
Monochromatisches Licht: Licht mit Strahlen die eine
einzige, bestimmte Wellenlänge haben
Polychromatisches Licth: besteht sich aus einer Mischung
unterschiedlicher Farben, ein Gemisch aus vielen
Wellenlängen. Sichtbares Licht: 380-780 nm
Das Licht
Merkmale des Lichtes
Wellenlänge (λ): der kleinste
Abstand zweier Punkte gleicher
Phase einer Welle bezeichnet
(in nm).
Frequenz: die Anzahl von
Schwingungen pro Sekunde.
Die Einheit der Frequenz ist
das Hertz (1/s), kurz Hz
Amplitude (bzw.
Schwingungsweite): die
maximale Auslenkung
(Elongation) der
Schwingungswellen
Komponenten des sichtbaren Lichtes
Warum benutzt man Mikroskop
bei der Medizin?
Die häufigsten Untersuchungsobjekte am Mikroskop:
- Zellen
- Geweben
Proben können nativ oder gefärbt
untersucht werden.
Größenverhältnisse
Zellen
Organellen
Moleküle
mm – cm
makroskopisch sichtbar
0,2 mm
Auflösungsgrenze
des bloßen Auges
20 µm
2 µm
0,2 µm
20 nm
2 nm
0,2 nm
Atome
Auflösungsgrenze
des Lichtmikroskops
Auflösungsgrenze
des Elektronenmikroskops
Durchschnittsgrösse der Zellen
Prokaryotische Zelle: 2-4 µm
Eukaryotische Zelle: 10- 30 µm
Die funktionellen
Einheiten des
Lichtmikroskops
Weg des Lichtes im Mikroskop
Okular
Zwischenbild
Objektiv
Objekt
Kondensor
Schärferegulierung
Lichtquelle
Die Vergrösserung des Mikroskops
Die Vergrösserung des Mikroskops (Vm):
Vm = Vob X Vok
Vob: Vergrösserung des Objektivs
Vok: Vergrösserung des Okulars
Okular: 10-20 x
Vergrösserung
Marke der Farbekorrektion
Marke der Immersion
Objektiv:
4-100 x
Vergrösserung
Vergrösserung des Objektivs
mechanische Tubuslänge (mm)
Wert der numerischen Apertur
Empfohlene Deckglasdichte
Marke der speziellen
Bestimmung
Immersionsmarke
Frontlinse des Objektivs
Abbildungsfehler von optischen Linsen
Sphärische Aberration
Die sphärische Aberration ist ein sogenannter Zonenfehler, der bei sphärischen Linsen mit größerem Durchmesser und stärkerer Krümmung
auftritt. Randstrahlen werden stärker
als achsennahe Strahlen gebrochen
und bilden einen Brennpunkt näher
an der Linse. So entsteht eine
Abweichungskreis.
Chromatische Aberration
Entsteht wegen der Dispersion. Blaues
Licht wird stärker gebrochen als rotes
so daß sich die Brennweiten
unterscheiden. Mit weißem Licht
erzeugte Bilder bekommen dann
Farbsäume. Den Abstand zwischen
dem roten und dem blauen
Brennpunkt bezeichnet man als axiale
chromatische Aberration.
Brechzahl
An der Grenzfläche zweier Medien mit unterschiedlichem
Brechungsindex wird Licht gebrochen und reflektiert. Dabei nennt
man das Medium mit dem höheren Brechungsindex das optisch
dichtere.
Reflexion
Vakuum
Medium
c
cM
Brechung
Lichtgeschwindigkeit
bei 20º C
und 584 nm
Material
Vakuum
Luft (1 atm)
Wasser
Augenlinse
Ethylalkohol
Quarzglas
Flintglas
Zederöl
n
1
1,00027
1,333
1,34
1,361
1,459
1,613
1,510
c
absolute Brechzahl: n
cM
1
Trockenobjektiv
Immersionsobjektiv
Frontlinse
Immersionsflüssigkeit
Deckglas
Objektglas
Wir lassen eine Flüssigkeit zwischen dem Deckglas und der Frontlinse tropfen, welches eine Brechzahl höher als die Luft hat, und wir
lassen die Frontlinse ins Flüssigkeitropfen eintauchen. Solche Linsen
(meisstens 100X Vergrösserung) nennen wir Immersionslinsen.
Immersion=Eintauchen
Immersionsflüssigkeit:
Am häufigsten benutzen wir Zederöl. Die Ölobjektive nennen wir
dementsprechend Ölimmersions-, oder homogene Immersionsobjektive (HI).
Wenn auf dem Objektiv WI steht, dass heisst das wir destilliertes
Wasser zwischen dem Deckglas und der Frontlinse tropfen müssen.
Trockenobjektiv
Ölimmersionsobjektiv
Lichtstrahl 3 wird nach
dem Austritt aus dem
Deckglas so stark
gebrochen, dass er nicht
mehr in die Frontlinse
des Objektivs gelangt.
Die Brechzahl von Deckglas
und Immersionsöl sind fast
identisch. Lichtstrahl 3 wird
nach dem Austritt aus dem
Deckglas nicht merklich
gebrochen und gelangt in
die Frontlinse des Objektivs.
Auflösungsvermögen des Mikroskops
Das Auflösungsvermögen eines Objektivs ist davon
abhängig, wie viel Licht von einer Struktur des Präparates in
das Objektiv gelangt. Diese Lichtmenge ist nun wiederum
abhängig vom sogenannten Öffnungswinkel des
entsprechenden Objektivs.
Je größer der Öffnungswinkel ist, desto besser löst ein
Objektiv die Details eines Präparates auf.
Längenmessung am Mikroskop
Objektmikrometer:
Objektträger mit
Mikrometerteilung
Okularmikrometer:
Strichplatte ins Okular
eingelegt
Längenmessung am Mikroskop
Haare
Skala des Objektmikrometers
Skala des Okularmikrometers
Skala des
Okularmikrometers
Mikroskop in Forschung
video
Fortgeschrittene Mikroskopie
Fluoreszenz-Mikroskopie
Human Zellen
DNA microtubules F-actin
Foto eines Fluoreszenzmikroskops
Hier ist ein handelsübliches
Fluoreszenzmikroskop
abgebildet. Zu erkennen sind
die zwei Lichtquellen, eine für
Durchlicht- eine für
Fluoreszenzmikroskopie.
Die Objektive von
Fluoreszenzmikroskopen
müssen UV-gängig sein, wenn
Fluorochrome mit UVAnregung verwendet werden
sollen. Solche Objektive
tragen die Bezeichnung FLUO.
Die orangene Platte unterhalb
der Okulare schützt die Augen
vor UV-Licht.
Der Kasten rechts neben dem
Mikroskop ist das Netzgerät
für die
Epifluoreszenzbeleuchtung.
Grundlagen der
Fluoreszenzentstehung
Bei der Absorption von Licht einer bestimmten Wellenlänge (=Anregungslicht) ist bei
verschiedenen Molekülen eine gleichzeitige Emission von Licht mit größerer
Wellenlänge beobachtbar. Dieses Verhalten (Absorption von kurzwelligem Licht,
Emission von längerwelligem Licht) wird als Fluoreszenz bezeichnet.
Fluoreszenz ist die spontane Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten
Systems in einen Zustand niedrigerer Energie.
Grundlagen der
Fluoreszenzentstehung
Fluorochromen
Viele Fluorochrome haben aromatische Ringsysteme, deren delokalisierte
Elektronen in bindenden p-Orbitalen für die Entstehung von Fluoreszenz
wichtig sind. Chinin (quinine) war eine der ersten Substanzen, an denen
Fluoreszenz untersucht worden ist (Herschel, 1845). Chinin wird durch UVLicht angeregt und erzeugt eine schwache, bläuliche Fluoreszenz in Tonic
Water, das mit Chinin versetzt ist. Fluorescein und Rhodamin spielen eine
große Rolle bei der Fluoreszenz-Immunhistochemie. POPOP wird für
Szintillationszähler verwendet und Acridin-Orange eignet sich als DNAFarbstoff. Coumarin-Derivate werden in vielen Bereichen verwendet, zB für
ELISA-Tests.
Fluorochromen
Anregungslicht und Fluoreszenz-Filtrierung
Im herkömmlichen Mikroskop werden Fluoreszenz-Erscheinungen überstrahlt
und sind deshalb nicht erkennbar. Deshalb muss man durch eine geschickte
Auswahl von Filtern dafür sorgen, dass nur das Fluoreszenz-Licht an der
Bildentstehung teilnimmt.
Anregungsfilter haben eine möglichst hohe Transmission für die Wellenlängen,
welche die Fluoreszenz anregen - insbesondere längerwellige Strahlung
wird von diesen Filtern zurückgehalten und gelangt deshalb nicht zum
Präparat. Das Anregungsfilter befindet sich im beleuchtenden Strahlengang
vor dem Präparat.
Sperrfilter haben eine hohe Transmission für die energieärmeren (längeren)
Wellenlängen des Fluoreszenzlichts - das energiereiche Anregungslicht wird
möglichst vollständig eliminiert. Das Sperrfilter befindet sich im
abbildenden Strahlengang - also optisch nach dem Präparat.
Aufbau des Fluoreszenzmikroskops
Fluorochromen
Immunfluoreszenz Mikroskopie
Immunfluoreszenz Mikroskopie
Prinzip der konfokalen Mikroskopie
Beim konventionellen Lichtmikroskop wird das Lampenlicht durch die Kondensorlinse auf
das Objekt fokussiert, und das vom Objekt ausgehende Licht wird durch die Objektivlinse in
die Zwischenbildebene fokussiert. Das so entstehende Bild wird durch die Okularlinse
betrachtet. Nicht nur Licht aus der Brennebene des Objektivs (hier rot dargestellt) sondern
auch unfokussiertes Licht aus Bereichen außerhalb der Brennebene (hier blau und grün
dargestellt) erreicht bei diesem Mikroskop das Auge. Durch die Überlagerung von
fokussiertem und unfokussiertem Licht ist die räumliche Auflösung des konventionellen
Mikroskops eingeschränkt.
Prinzip der konfokalen Mikroskopie
Beim konfokalen Mikroskop wird Licht, das nicht aus der Brennebene des Objektivs kommt,
ausgeblendet. Die einfachste Konstruktion ist hier gezeigt: Die Kondensorlinse wird durch eine
Linse ersetzt, die der Objektivlinse identisch ist. Die Ausleuchtung des Objekts wird durch eine
Lochblende (A) beschränkt, die auf dem Objekt scharf abgebildet wird. Eine zweite Lochblende
(C) beschränkt das Sichtfeld auf einen Punkt. Durch den symmetrischen Aufbau dieses
Systems sind beide Blenden und ein Punkt des Objekts in der Brennebene der Linsen konfokal.
Der Durchmesser der Blenden wird so klein gewählt, daß Licht aus Bereichen des Objekts, die
nicht in der Brennebene liegen, nicht in die Apertur der Blende C fallen und damit ausgeblendet
werden (hier: grüne und blaue Strahlen). In den Photomultiplier (PMT) gelangt deshalb nur Licht
aus der Brennebene des Objekts.
Prinzip der konfokalen Mikroskopie
Im Unterschied zum konventionellen Mikroskop erzeugt das konfokale
Mikroskop also zunächst nur einen Bildpunkt, der allerdings genau
einen Punkt aus der Brennebene des Objektivs darstellt. Um eine
vollständiges Bild des Objekts zu erhalten, muß das Objekt Punkt für
Punkt gerastert (gescannt) werden. Bei der hier gezeigten Anordnung
geschieht das dadurch, daß das Objekt jeweils eine kleine Strecke
verschoben wird, bevor der nächste Punkt vom Photomultiplier
registriert wird ("stage scanning"). Die dabei gesammelten Bildpunkte
werden dann von einem Rechner zu einem vollständigen Bild
zusammengesetzt. Bei den meisten modernen Konfokalmikroskopen
wird nicht das Objekt bewegt, sondern ein Laserstrahl wird Punkt für
Punkt über das Objekt geführt, und das Bild entsteht durch digitale
Verarbeitung im Rechner: Laserscanning Konfokalmikroskop.
Am Beispiel einer Fluoreszenzdoppelfärbung ist hier der Vorteil der konfokalen Mikroskopie gezeigt.
Bei dieser Zelle, die sich in der Meta-/Anaphase der Zellteilung befindet, ist die Plasmamembran mit
einem rotfluoreszierenden Antikörper markiert, der Spindelapparat mit einem grünfluoreszierenden.
Links das Bild mit dem konventionellen Mikroskop: Am Rand der Zelle sieht man Membranfärbung, die
wie ein Schleier das ganze Bild überlagert. Die Darstellung der Spindelfasern ist unscharf, aber
besonder intensiv in der Kinetochor-Region. Rechts: Die selbe Zelle in konfokaler Optik. Die seitliche
Plasmamembran ist scharf dargestellt ("optischer Schnitt" durch Ausblenden unfokussierten Lichtes)
und die Fasern des Spindelapparates sind zu erkennen.
Mikroskopie in Forschung
Mikroskopie in Forschung
video
Mikroskopie in Forschung
video
Fluoreszenz- und konfokale
Mikroskopie
Vergleich des Konfokalen- und Fluoreszenzmikroskop
Pflanzenzellen:
Zwiebelepidermis
Präparation der Zwiebelschuppenepidermis von Allium
cepa
Legen Sie die Schuppenepidermis auf einen Objektträger, versehen Sie es mit
Wasser und Deckglas. Beobachten Sie die Probe. Lassen Sie 10%-ige
Essigsäure in die Probe diffundieren und beobachten Sie die erscheinenden,
fixierten Zellkerne.
Färbung der Probe:
Fixierung: 60% (V/V) Ethanol, 30% Chloroform, 10% Eisessigsäure, 20 Min.,
Waschen mit Hahnwasser.
Färbung: 0.5% Methylgrün gelöst in 0.1 M Acetat-Puffer, pH4, 10 Min., Waschen
mit 50% Ethanol, 5 Min.
Legen Sie die gefärbte Zwiebelschuppenepidermis auf einen Objektträger und
beobachten sie es im Mikroskop.