Anais do III Simpósio Satélite Minitub de Reprodução de Suínos
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Anais do III Simpósio Satélite Minitub de Reprodução de Suínos
Benchmarking, Standards and Production Procedures in European Boar Studs 1 1 2 M Schulze , K Ruediger , M Grobbel , M Jung 1 1 Institute for Reproduction of Farm Animals, Schoenow, Germany Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research, Berlin, Germany 2 Abstract The present systematic data summarize microbiological, spermatological, and semen production results of a continuous audit in 24 European boar studs. Overall, semen samples of 344 boars were analyzed. In 26% of the 2 5 diluted ejaculates, bacterial live cell count was 10 to 10 CFU/mL after 48 h storage at 16 °C. Gram-negative bacteria amounted to 58% (Enterobacteriaceae 53%, pseudomonads 29%). Most frequently isolated Gram-positive bacteria were Leifsonia aquatica (20%). In six boar studs, no gentamicin-resistant bacteria were detected. Microbiological investigations revealed different hygiene-related weak points: heating cabinets (46%), wash-basins (42%), ejaculate transfer (29%), manual operating elements (29%), inner face of dilution tank lids (17%), lab surfaces (13%), dyes (8%), extenders (8%), and ultrapure water treatment plants (4%). Spermatological evaluation showed that more than three quarters of the investigated ejaculates (77%) contained more than 75% of morphologically intact sperm. Surprisingly, the two boar semen production procedures encountered in the studs showed a significant influence on semen viability, motility (CASA), acrosome integrity, and mitochondrial status, being the single-step boar semen dilution significantly superior over the multi-step boar semen dilution (P < 0.001, Mann Whitney U test). Altogether, 29% of boar studs used single step dilution. Comparison of daily AI stud production protocols demonstrated major differences in sperm output based on influencing factors such as precollection pens, design of collection dummy/area, and work management. Feed composition (n = 10) showed remarkable differences between boar studs in nutritional values (protein, fat, and fiber) and vitamin supplementation (A, D, and C). More research on stimulating and stabilizing boar semen production is needed in order to satisfy the ever increasing demand for semen of top-genetic boars. Introduction Quality assurance is an essential part of any diagnostic system and is a foundation pillar of modern ISO-based facilities [1]. One of the basic rules is that boars should be housed in strictly protected semen collection centres [2]. This includes specific means of monitoring, assessment of semen and testing for microbiology. Thus, regular internal and external boar stud monitoring for microbiological and spermatological quality is an important component in an AI boar stud control program [3]. The use of lower doses and the need for longer semen shelf life requires that AI boar studs should supply only semen of high quality also with reference to hygienic quality [4]. It is well known that bacteriospermia is detrimental to spermatozoa quality [5]. Good laboratory practice standards that contain international quality control procedures are becoming more and more established [6]. Especially, regularly performed external quality control is useful for barn and lab personnel training, providing a theoretical background, and focused on practical aspects [7]. Furthermore, with growing expansion of semen trade, inter-station comparability of boar stud efficiency is of increasing importance. Generally, evaluation of the quality of extended semen, randomly taken samples from routine production should be analyzed continuously in external reference laboratories. Semen evaluation (motility, morphology, sperm concentration, and sperm functions) in a semen production audit should be the basis for detecting weak points on AI stations. Identification of weak points may be useful for discussing which management tools are practical for advancing boar semen production in the future. This review describes the most important results of a regular semen production audit in 24 European boar studs. Microbiological results Bacteriological and spermatological screenings (n = 344) were made over a 2-yr period (2010 to 2011) at 24 3 5 European boar studs. Total aerobic bacterial count in neat boar ejaculates averaged 10 to 10 bacteria/mL. In some boar studs, there was a high hygienic sperm quality and it seems to be possible to collect boar semen without bacterial contamination. Indisputable, bacterial load affects concentration-dependent in vitro quality and longevity of stored boar semen [8]. Mostly, there are multifactorial reasons for bacterial contamination in neat boar ejaculates. Common sources of contamination are hygienic requirements, boar genital tract, type and area of semen collection, personnel, fecal contaminants or environmental bacteria (Table 1). Sources can be simply classified into animal or non-animal origin [9]. Discarding of the preliminary ejaculate phase is one of the most important measures. *Correspondence: IFN Schoenow e. V., Bernauer Allee 10, 16321 Bernau, Germany phone: 0049 3338-709822 • fax: 0049 3338-709810 • e-mail: [email protected] 2 5 In 26% of diluted ejaculates, bacterial live cell count was 10 to 10 bacteria/mL after 48 h storage at 16 °C. Aerobic culture yielded a variety of bacteria from different genera (Table 1). Gram-negative bacteria amounted to 58% (Enterobacteriaceae 53%, pseudomonads 29%). Most frequently isolated Gram-positive bacteria were Leifsonia aquatica (20%). In six boar studs, no gentamicin-resistant bacteria were detected. The contaminant bacteria resistant to gentamicin were found with variable patterns of resistance to the other 14 antibiotics evaluated (Table 2). Aminoglycosides belong to the most popular European antimicrobials used in boar semen extenders. Different sources of contamination were identified based on the boar stud inspection by microbiological sampling of critical points of semen production. Microbiological sampling identified different hygiene-related weak points (Table 3): heating cabinets (46%), wash-basins (42%), ejaculate transfer (29%), manual operating elements (29%), inner face of dilution tank lids (17%), lab surfaces (13%), dyes (8%), extenders (8%), and ultrapure water treatment plants (4%). Standardized audit protocols provide a basis for evaluating hygienic environment and objectifying sample data. Only objectification of production data permits the comparison of different AI boar studs under different conditions and the implementation of standard and individual sanitation protocols. In all cases, a visit of the facility is essential to locate the sources of contamination. Strict individual hygiene, good general sanitation, and regular internal and external monitoring can collaborate greatly in controlling bacterial load and optimizing sperm quality. It should be a component of a quality control program. Spermatological results & production data For comparative purposes, spermatological results from various AI boar studs can help to serve as a point of reference and benchmarking. Spermatological evaluation showed that more than three quarters of the investigated ejaculates (77%) contained more than 75% of morphologically intact sperm. Surprisingly, the two boar semen production procedures encountered in the studs showed a significant influence on semen viability, motility (CASA), acrosome integrity, and mitochondrial status, being the single-step boar semen dilution significantly superior over the multi-step boar semen dilution (P < 0.001, Mann Whitney U test). Altogether, 29% of boar studs used one-phase dilution. Comparison of daily AI stud production protocols demonstrated major differences in sperm output. Several boar studs achieved high sperm output based on influencing factors such as pre-collection pens (Figure 3), design of collection dummy/area, and work management. The average number of sperm produced per collection (sperm-output) was 75 (56 to 95) billion (Figure 4). Values are expressed as median and interquartile range. The average number of doses produced per ejaculate was 32 (25 to 41). Collection occurred mainly on Monday. Boars were rested 2-5 days between collections. The average age of boars at time of training was 7-8 months. Nearly half of the studs trained boars during quarantine. The predominant age of boars was 1-2.5 years with 50% boar replacement rates on average. Primary reasons for culling were genetic progress, leg issues, semen quality, and libido. Sperm concentration was estimated predominantly by photometer, with few labs using other methods. Ejaculates are discarded for reasons like poor motility (<70%), abnormal sperm 6 count (>25%), low concentration of sperm (<0.15x10 µL), low volume (<100 mL) and bacteria. Most studs retained samples (1.5 mL, 10 mL or whole tubes) for quality control during 1-3 days post production. Ejaculate pooling was routinely performed in 30% of the studs, using 3-6 ejaculates. Doses of semen contained 1.8-3 billion sperms and were packaged as doses in tubes (only few in bags) with 80-95 mL. For final sperm cell numbers most studs adjusted total cells in the dose based on motile sperm, including an additional safety margin. The majority of studs used commercial BTS extenders. Feed composition Reproductive traits of boars are highly variable. Fluctuations in sperm production can easily amount to 25-30%. Several factors such as breed, age of boar, season, heat stress and social environment were found to influence semen quality and quantity [10]. Two further important factors which influence the reproductive system are semen collection frequency and feeding [11]. Analysis of feed composition was carried out to investigate current differences in AI boar studs. Crude nutrient contents were calculated on the basis of ten protocols. Definitely, variations of true analytical values were possible. Boar feeding is carried out by automated or manual systems. Generally, daily amount of feed is determined by body condition, boar size, or fixed. Feed composition showed remarkable differences between boar studs in nutritional values (protein, fat, and fiber) and vitaminisation (A, D, and C). In combination with daily feeding of young and mature boars substantial randomized protein differences reached more than 100%. In most cases, nutrient supply was adequate or increased slightly. Probably, spermatogenetic potency was not affected. Frequently, specific additives like biotin, L-carnitine, fish or vegetable oils, brewer’s or baker’s yeast become more and more interesting (Table 4). Outlook (A) The great demand for semen of top-genetic boars requires to intensify the research on stimulating and stabilizing boar semen production. Follow-up studies will be conducted to determine the distribution and transmission of helminth eggs in AI boar studs in Europe. The expected results may lead to new recommendations for deworming boars. The number of helminth species and their infection levels are strongly influenced by the different deworming systems. Finally, control measures, hygiene, management, and recent anthelminthic strategies will be discussed in the future. (B) In addition to classical methods of semen evaluation, a whole range of new and enhanced methods for evaluating sperm function is being developed and will provide additional information about sperm quality. Up to now a founded assortment of significant in vitro tests as well as a recapitulatory appraisement of those parameters in regard to sperm quality and therewith to fertility of boars is missing. Thus, future studies will create an in-vitro-index “SpermQuality” in order to combine all potential and relevant parameters. (C) Sperm cells from boars are sensitive to storage at low temperatures. However, we demonstrated that semen from single individual boars tolerate low temperatures and maintain their motility during storage at 4 °C for up to three days. Sperm preservation at “refrigerator” temperature (4 to 6 °C) would simplify storage technology for boar semen and reduce the necessity of antibiotics. Preliminary results of a lipid analysis of special membrane domains of 4 boars showed an enrichment of particular phosphatidylcholines in the cold-sensitive sperm. Further studies will analyze differences in lipid and protein patterns in more detail. Summary of guideline data for catalog of measures and key aspects of external semen production audits Key aspects Pen Boar handling? Clean boars and dummies? Collection efficiency? Collection hygiene? Collection technique? Ejaculate downtime? Ejaculate transfer? Other activities? Hygienic feed (feeding trough)? Separated semen collection area and design (short distances)? State of the collection area and pen design? Storage of collection equipment? Temperature control? Usage of heating cabinets? Usage of semen vessels, bags, filters (tempering)? Work management and safety (first impressions)? Lab & Logistic Dilution: single step- or multistep? Disposal: Extenders? Ejaculates? Equilibration and cooling time? Final check? Motility analysis (volume & magnification)? Pass-through or pneumatic tube? Pipettes? Processing of extender? Production line (wash-basins & crossing of people)? Semen concentration analysis? Semen dyes? Storing of equipment and material? Temperature control? Usage of single-use disposable products? Water path - chemical & microbiological quality? General Calculation of sperm number/dose? Collection schedule? Compartmentalization of the AI boar stud (Black – Grey – White) Effective cleaning/disinfection – hygienic concept? Personal movement or fluctuation? Protocol of temperature profile? Resources in estimation of sperm motility (%)? Retained samples? Self-monitoring (volume, sperm concentration, microbiology)? Table 1. Type and frequency of bacterial and fungal contaminants isolated from neat boar ejaculates and from extended boar semen in 24 different AI boar studs (n = 344) Bacterial isolate Frequency of isolation (n) Neat boar ejaculates Extended boar semen Gram-negative nonfermenters Acinetobacter sp. 42 - Achromobacter sp. - 3 aerobic sporformers 55 - Alcaligenes sp. 2 - Chryseobacterium sp. 6 - Empedobacter brevis 10 - Moraxella sp. 7 - Myroides sp. - 1 38 5 Ralstonia pickettii - 10 Rhizobium radiobacter 2 1 Shewanella sp. 1 - Sphingobacterium sp. 1 - Sphingomonas sp. 2 1 Stenotrophomonas maltophila - 1 Pseudomonas sp. Weeksella sp. 3 - Not typable 14 1 Citrobacter sp. 16 - Escherichia coli 23 - Edwardsiella sp. 1 - Enterobacter sp. 4 13 Klebsiella sp. 6 7 Morganella morganii 1 - Enterobacteriaceae Pantoea sp. 3 - Proteus sp. 10 5 Providencia sp. 6 - Serratia sp. 1 2 Aeromonas sp. 1 1 Pasteurella sp. 5 - Vibrio parahaemolyticus 1 - Leifsonia aquatica - 18 Rhodococcus sp. - 4 179 3 Enterococcus sp. 23 7 Lactobacillus sp. 22 - Other Gram-negatives Coryne-shaped rods Not typable Other Gram-positives Micrococcus sp. 6 - Staphylococcus sp. 143 4 Streptococcus sp. 76 2 Fungi Moulds 3 - Yeasts 21 5 Table 2. Antibiotic sensitivities of bacteria isolated from extended porcine semen (n = 344) CTX30 CN10 N30 AK30 SH10 TE30 DA2 TY30 ENR5 PB300 R R R R R R R S R R S S I R Aeromonas hydrophila (n = 1) R R S R R R R R R R R R S R Coryne-shaped rods (n = 3) R R R R S S R I R R R S I R Enterobacter aerogenes (n = 1) R R S R R R R S R R R R S S Enterobacter cloacae (n = 12) R R S R R R R R R R R R S S Enterococcus sp. (n = 7) S S I R R R R R R R R S I R Gram-negative nonfermenter (n = 1) R R R R R S R R R R R S S R Klebsiella oxytoca (n = 7) R R S R R R R S R R R R S S Leifsonia aquatica (n = 18) S S R R R R R R R S R R R R Myroides sp. (n = 1) R R R R R R R R S R S S S R Proteus mirabilis (n = 5) R R S R R S R R R R R R S R Pseudomonas fluorescens (n = 5) R R R R R S R R R R R R S S Ralstonia pickettii (n = 10) R R S R R R R S R R R S S R Rhizobium radiobacter (n = 1) S R S R R R R S R R S S S S Rhodococcus sp. (n = 4) R R R R R S R R R R R R S S Serratia marcescens (n = 2) R R S R R R R R R R R R S S Sphingomonas paucimobilis (n = 1) S S S R S S S S S R S S S R Staphylococcus epidermidis (n = 2) S R S R S I R R R R S S S R Staphylococcus spp. (n = 2) R R S R S S R R R S S S S S Streptococcus faecalis (n = 2) S S R R R R R S R R R S S R Streptococcus sp.(n = 2) S S S R R R R R R I S S I I SXT25 PG10 Achromobacter sp. (n = 3) RL25 Bacteria (n = number of isolates) AMP10 Antibiotic (disk concentration) S = Sensitive; R = Resistent; I = Intermediate; AMP10 = Ampicillin; PG10 = Penicillin; CTX30 = Cefotaxim; CN10 = Gentamicin; N30 = Neomycin; AK30 = Amikacin; SH10 = Spectinomycin; TE30 = Tetracyclin; DA2 = Clindamycin; TY30 = Tylosin; RL25 = Sulfonamid; SXT25 = Trimethoprim/Sulfonamid; ENR5 = Enrofloxacin; PB300 = Polymyxin B; n = samples from which the bacteria were isolated. Susceptibility testing was performed via agar disc diffusion following the standards and breakpoints given by the CLSI [12]. Table 3. Analysis of hygienic weak points in 24 different AI boar studs Boar stud Weak points A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Mean ±S D Dyes - 5 1 5 1 4 1 3 - - - - - 1 1 - 1 - 1 1 1 1 3 1 1.9 1.5 Ejaculate transfer (pneumatic tube/passthrough) 5 4 2 6 4 4 5 2 5 3 6 - 2 4 4 5 2 4 2 5 3 3 4 4 3.8 1.3 Extender 2 5 1 3 1 3 1 1 3 3 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 2 1 1 3 1.8 1.1 Heating cabinets 5 - 2 - 5 5 5 6 1 4 - 4 4 5 5 - 5 3 5 5 4 3 4 5 4.3 1.2 Hoses/Dispensers 2 1 1 - 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 3 1.2 0.5 Inner face of dilution tank lids 5 1 1 2 1 1 1 2 2 5 2 1 1 2 1 4 1 1 1 1 2 1 5 5 2.0 1.3 Lab surfaces 4 4 1 4 5 4 3 2 2 2 3 1 2 1 3 5 1 6 4 4 1 1 3 3 2.9 1.5 Manual operating elements (keyboard) 6 4 3 5 4 4 5 3 4 3 3 4 4 2 4 5 2 4 4 4 3 3 4 5 3.8 1.0 Ultrapure water treatment plants 3 5 1 3 1 3 1 3 4 2 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1.8 1.2 Washbasins 6 5 3 2 5 4 4 5 2 2 6 4 1 2 4 5 3 6 3 5 6 3 5 2 3.9 1.5 Mean 4.2 3.8 1.6 3.8 2.8 3.3 2.7 2.8 2.7 2.8 3.3 2.1 1.9 2.0 2.5 3.4 2.0 3.0 2.3 2.8 2.4 1.9 3.1 3.2 ±SD 1.6 1.6 0.8 1.5 1.9 1.3 1.9 1.6 1.4 1.2 1.8 1.6 1.3 1.4 1.6 2.0 1.3 2.1 1.6 1.9 1.6 1.0 1.6 1.5 Valuation code: 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 1 = 10 CFU/ml or 1 CFU/cm ; 2 = 10 CFU/ml or 5 CFU/cm ; 3 = 10 CFU/ml or 45 CFU/cm ; 4 = 10 CFU/ml or 80 CFU/cm ; 5 = 10 CFU/ml or 100 CFU/cm ; 6 = 10 CFU or 2 >100 CFU/cm Table 4. Content and composition of ten analyzed diets Content & Composition Gross Energy, MJ kg Ash, % Crude protein, % Crude fat, % Crude fibre, % Lysine, % Methionine, % Ca, % P, % Na, % -1 Mg, g kg -1 Cu, mg kg -1 Zn, mg kg -1 Mn, mg kg -1 Fe, mg kg -1 Se, mg kg -1 Co, mg kg -1 J, mg kg -1 Vitamin A, IE kg -1 Vitamin D3, IE kg -1 Vitamin E, mg kg -1 Vitamin C, mg kg -1 L-carnitine, mg kg -1 Biotin, mg kg Phytase, FTU -1 Percentile minimum value 25% median 75% maximum value 11.4 4.9 15.5 2.5 4.5 0.8 0.3 0.75 0.46 0.15 1.5 10.0 65 68 75 0.3 0.15 0.4 14000 1600 80 300 20 2.15 400 11.9 6.0 16.5 3.0 6.0 1.0 0.3 0.8 0.6 0.2 1.6 13.5 100 73 135 0.4 0.2 0.8 15000 2000 120 650 24 2.2 500 12.1 6.5 17.3 3.3 6.5 1.1 0.4 0.9 0.7 0.3 1.6 15.0 128 80 203 0.4 0.3 2.0 16000 2000 150 1000 28 2.3 625 12.3 6.5 18.4 4.3 7.0 1.2 0.5 1.0 0.8 0.3 1.7 20.0 132 83 244 0.5 0.7 3.0 22000 2000 200 1100 35 2.4 770 13.0 7.6 19.0 4.6 9.0 1.35 0.65 1.2 0.8 0.3 1.7 27 149 138 385 0.5 0.8 4.0 25000 3000 250 1200 50 2.5 830 GfE* 11.4-12.6 max 6.0 16.5 min 5.0 5.0-6.0 0.8-0.85 0.65 0.8 0.6 0.25 0.4 8.0 50 25 80 0.15 0.5 20000 2000 25 500 60 0.28 500 * Ausschuss für Bedarfsnormen der deutschen Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (Empfehlungen für die Energie und Nährstoffversorgung von Schweinen, 2006, DLG-Verlag, Frankfurt am Main, Germany) Figure 1. Proportion of progressively motile sperm after 48-hr storage and thermo resistance test (n = 344). Results are represented as box-plot highest, respectively lowest values (Whisker), as interquartiles between quartiles 1 and 3 (box), and as median value. White boxes represent one-phase (n = 7) and grey boxes multi-phase (n = 17) boar semen preservation in 24 different AI boar studs. * Significant difference compared to multi-phase boar semen preservation (P < 0.001). Figure 2. Proportion of membrane-intact sperm after 168-hr storage (n = 344). Results are represented as box-plot highest, respectively lowest values (Whisker), as inter-quartiles between quartiles 1 and 3 (box), and as median value. White boxes represent one-phase (n = 7) and grey boxes multi-phase (n = 16) boar semen preservation in 23 different AI boar studs. * Significant difference compared to multi-phase boar semen preservation (P < 0.001). Figure 3. Pre-collection pen (“warming-up” area) Schulze 2011 Figure 4. Sperm numbers per ejaculate produced daily in 22 different AI boar studs (n = 1320). Results are represented as box-plot highest, respectively lowest values (Whisker), as inter-quartiles between quartiles 1 and 3 (box), and as median value. Acknowledgement Studies underlying this report were supported by the Development Association for Biotechnology Research (FBF, Bonn, Gemany). References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Pacey AA. Is quality assurance in semen analysis still really necessary? A view from the andrology laboratory. Hum Reprod 2006; 21: 1105-1109. Thibier M, Guerin B. Hygienic aspects of storage and use of semen for artificial insemination. Anim Reprod Sci 2000; 62: 233-251. Knox R, Levis D, Safranski T, Singleton W. An update on North American boar stud practices. Theriogenology 2008; 70: 1202-1208. Waberski D, Petrunkina AM, Topfer-Petersen E. Can external quality control improve pig AI efficiency? Theriogenology 2008; 70: 1346-1351. 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Responsabilidade do veterinário no uso de antibióticos no sêmen KF Weitze & Dagmar Waberski Universidade de Medicina Veterinária Hannover, Alemanha Responsabilidade do veterinário no uso de antibióticos no semen KF Weitze & Dagmar Waberski Universidade de Medicina Veterinária Hannover, Fundação Simposio Minitube 15.05.2012 Porto Alegre Responsabilidade do Veterinário: Definição: O código europeu de conduta etica-profissional do veterinário dice, que todas as atuações devem ser dirigidas a …manter o bem estar animal, …assegurar uma manutenção adequada e …..manter o bem estar público… (bem estar público = saude pública ) Desafio para a saude pública: A saude pública do mundo esta atualmente ameaçada por falta de possibilidades de combater infecções causadas de germes multi-resistêntes a antibióticos Hospitalismo humano USA: ~ 70% das infecções hospitalares são resistêntes contra 1 antibiótico pelo menos !!! frequentemente cepas multi-resistentes Estimação : 2 milhões infecções adquiridas no hospital = 90.000 mortos (2004) Europa: 3 milhões infectados = 100.000 mortos (2005) Alemanha: 500.000 infecções hospitalares /ano 50.000 mortos Problema principal: Bactérias multiresistêntes Causas: Uso indiscriminado de antibióticos na medicina, medicina veterinária e produção animal Dimensões na produção animal : dados de 1996 / 1998 Uso de antibióticos na agricultura: criar um reservatório de genes de resistência ? Tipo de antibiótico Animal (1996) Beta-Lactam-Antibióticos 121.603 kg (penicillinas, cefalospor.) Tetraciclinas Humano (1997/98) 314.498 kg 323.151 kg 47.500 kg Aminoglicosideos 37.058 kg 5.409 kg Macrolideos (p.e. eritromicina) 71.222 kg 47.696 kg J. Harvey and L. Mason (1998): Use and Misuse of Antibiotics in Agriculture, Part 1, Current Usage; published by Soil Association Pontos de ataque de antibióticos na celula bacteriana Uso de antibióticos na Medicína Veterinária; Alemanha (em toneladas) ,, , Problema principal: Bactérias multiresistêntes Aspecto a considerar: Uso indiscrimado na conservação de semen suino Problemática no campo… : Numa serie de centrais existe um problema de contaminação do semen principalmente causado por falta de higiene nos diferentes passos de produção (da coleta ate a confecção no laboratorio) Resultado: Na tentativa de dominar a situação… …se aplica cada vez mais antibioticos no diluente, com cambios frequentes dos antibióticos usados… Agravado pelo fato que se usa mesclas de antibióticos (não declarados?) para aplicar no vaso de coleta… Os chamados „Cocktails de antibióticos „ „Cocktails de antibioticos“ no mercado aplicado no vaso de coleta, para combater uma possivel contaminação ja desde o inicio… tecnologia ofrecida como solução para o problema higiénico, existente em algunas centrais Risco dos „Cocktails de antibióticos“ Aparte do risco sanitário local existe um aspecto muito mais grave… criação / propagação de resistência contra antibióticos que tem grande importáncia para a Saude pública humana O que é resistência? Uma çepa bacteriana é resistente contra um antibiótico, quando alta dosagem não consegue parar o crescimento O antibiótico queda sem efeito Resisténcia natural (primária) Insensibilidade genética contra um antibiótico (vácuo efectivo) (Cephalosporinas sem efeito contra Enteroccus, Ampicillina sem efeito contra Pseudomonas) Resisténcia adquirida (secundária) Perda do efeito Mutação: deactivação da DNA-polimerase (lectura de correcção deactivada „proof reading“) Transferéncia: plasmidos,transposons/integrons transmitem informação genética Outras vias: proteinas alternativas, proteinas inactivadas, modificação posttranslacional (força de ligação reduzida), difusão reducida, bomba de efluxo, superprodução do proteina inactivado, metabolismo alternativo, biofilmes, entrada a celulas do corpo etc.) Repetimos… Uso contínuo de antibióticos e desinfectantes causa resisténcia! Resistências são transmissiveis dentro e entre çepas bactérianas e são hereditáriamente transmitidas a gerações siguentes Especies diagosticadas Gram Burkholderia Escherichia Coli Pseudomonas aerug. Proteus Klepsiella Enterobacter Stenotrophomonas Citrobacter Enterococcos Bacillus subtilis Morganella Aeromonas Streptococcus Acinetobacter Corynebacterium Alcaligenes xylosantes Serratia marcescens Staphylococcus aureus Weyand Althouse 2005 n=52 2008 n=256 -ä + + + + 33,3 % 9,8 9,8 9,8 9,8 7,8 5,9 3,9 3,9 sing sing sing sing sing sing 0 0 0 6,4 % 6,4 6,4 1,9 13,3 1,18 6,6 0 20,5 2,73 0 sing 0 2,3 5,5 13,3 10,3 6,6 1. As especies marcadas em vermelho são completamente ou parcialmente resistêntes 2. As marcadas em azul mostram grande variação regional Serratia marcescens: Bacterias ubiquitarias em solo, agua, animais, plantas. Formam um pigmento roxo. Causam no humano Inflamações urinarias, Septicaemia, Pneumonia, Endocardite, Meningite, Osteomielite. Letais para corais (desaguas humanas). Resistente contra antibioticos do tipo β-lactam (Penicillinas, Cefalosporinas). Problemas na Medicina Veterinaria: Otite interna nos canidos, abscessos na pele, enterite, mastite, vaginite, endometrite,abortos (vaca, egua), endocardite traumatica no bovino, infecções Pdo olho no equino, pneumonia necroticapurulenta, inflamações da mucosa bucal e abscessos e infecções gerais nos reptiles . Em centrais provocam contaminações desastrosas do semen, causando danos espermátologicos gravissimos. Combate quasi impossivel. www.gefor.4t.com/.../serratia01.jpg www.sciencephoto.com/image/121591/large/C0058. Pseudomonas aeruginosa: resistências múltiplas contra antibióticos; representa mais que 10% dos germes de „hospitalismo“ na Europa. Germe de solo e agua (meio humedo). Sobrevive tambem em agua destilada e certos desinfectantes e cresce, quando rastros minimos de substâncias orgánicas estão presentes. microscopic image of ''Pseudomonas aeruginosa'' (ATCC 27853). {{GFDL}} http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei: P-aeruginosa_pigment.jpg&filetimestamp=20080503160055 Estafilococcus aureus: representa mundialmente aprox. 25% dos germes de „hospitalismo“; resistênte contra chinolonas, tetraciclinas, aminoglicosidios, eritromicina, sulfonamideos. Parcialmente resistente contra Vancomicina, Oxacillina. MRSA = Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus MRE = Multi-resistente Erreger ORSA = Oxacillin-resistenter Staphylococcus aureus VISA = Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus VRSA = Vancomycin-resistenter Staphylococcus aureus aber auch MRSA = Multi-resistenter Staphylococcus aureus[4] Estratégia para o problema higiénico: Em vez de intensificar o uso de antibióticos… com consequências a longo prazo desastrosas… Planificar / organizar / realizar um sistema de higiene para reduzir significatívamente a contaminação Porque higiene é tão importante? • Semen puro quasi sempre contem bacterias • Plasma seminal e diluente são meios perfeitos de crescimento • Semen porcino é preservado a temperaturas relativamente altas • Crescimento bacteriano acontece rapido, em forma exponencial • Muitos tipos diferentes de bacterias estão presentes • Antibióticos adicionados ao diluente tem eficiência limitada • Bacterias podem desenvolver resistência contra antibióticos • Bacterias se adaptam facilmente e podem sobreviver no laboratorio tambem em condições precárias • Resistência contra antibióticos pode ser criada no laboratorio ! Situação nas centrais: A presença simultânea de reservatórios de germes e antibióticos / desinfectantes favorece resistência. Esta situação surge facilmente nas centrais (semen diluido com bactérias e antibióticos). Resistência surge especificamente no lab „Hospitalísmo“ „germes de hospitalísmo“: - resistência múltipla contra antibióticos - crescimento tambem em agua e desinfectante - dificilmente combativel p.ex. Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Serratia marcescens O que podemos fazer ?? Solução do problema: Reduzir a contaminação Estratégias: coleta de ejaculados pouco contaminados preparação higiênica do semen - Eliminação de reservatórios de germes, especialmente quando se usa antibióticos - plano de controle higiênico A produção de semen suino livre de contaminação é possivel ! A situação de higiene depende da central de semen lembramos-nos… Número bacteriano no semen suino pode ser diminuido! Desenvolvimento de bacterias multi-resistêntes Amplo contacto entre semen e antibióticos provoca resistência antimicrobial Problemas: • Reservatório de semen no laboratório • Desenvolvimento de biofilmes • Uso de „antibiotic cocktails“ • Cambio de antibióticos, quando surge um problema bacteriológico Reservatório de semen no laboratório „Lagoas de semen“ nas bacias Trapos… forma excellente de distribuir bacterias (plus antibióticos) atravez de todo laboratório Reservatório de semen no laboratório Esgotos no laboratório … lugar perfeito para crescimento bacteriano e criação de resistência anti-microbiana Desenvolvimento de biofilmes Adhesão de microorganismos flutuantes Fixação via estruturas de adhesão celular Colonização via Liberação de divisão celular e microorganismos recrutamento; desenvolvimento de resistência antibiotica http://en.wikipedia.org/wiki/File:Biofilm.jpg Medidas de higiene • Conhecer as fontes de contaminação • Desenho de construções e espaços • Mobiliario e material • Estabelecer guias sanitarias para coleta e processamento de semen • Criar e treinar pessoal consciente das necessidades de higiene • Monitoreamento de pontos criticos de control Higiene no procesamento de semen • Fluxo de trabalho „em linea“ • só equipo e material necessario no laboratorio • Preferir produtos de uso único ou esterilizados • Usar só trapos e toalhas de uso único • Evitar armazenar diluente ate o proximo dia ou mais • Evitar uso de corantes de semen • Restos de semen não nas pias / esgotos no laboratório Laboratório: „fluxo de trabalho em linea“ Exame de Semen Diluição Envase Armezenar Bancos de trabalho em linea, distâncias cortas „Fluxo de trabalho cruzado“ Exame de semen Envase Armazenar Diluição Muitos cantos, muitas vias cruzadas: Risco maior de contaminação Guias sanitárias • O que dever ser limpado e desinfectado? • Quais quimicos e equipamento usar? • Qual é o metodo de limpeza/desinfecção? • Que roupa protetiva se leva e que precauções são consideradas? • Quando se deve limpar/desinfectar? • Quem executa limpeza/desinfecção? • Quais são as medidas de monitoreamento? Monitoramento de crescimento bacteriano A) Controle rotinário: - semen diluido finalmente depois de 48 h: mensual: 1 % das coletas totais mensuais ou: 4 amostras/semana (ou mais) (Althouse et al. 2003) B) Quando se detecta contaminação bacteriana: - monitorar todos passos do procesamento de semen Monitoramento de contaminação bacteriana: Um caso da prática de IA: Spermatologia: A 72 h de idade do semen : - Agglutinações - Perda de motilidade - Dano da membrana Microbiologia: - Serratia especies - Klebsiella oxytoca resistênte a antibióticos comuns Monitoramento de contaminação bacteriana Agua Serratia/ Klebsiella ̶ ̶ Caldeira,Tampa, Tubos Diluente (pólvora) ̶ Diluente (liquido) + Semen diluido + A solução: Pequenos furos no remo usado para misturar o diluente Remo em uso - diluente entra no cabo oco Furos Remo depois limpeza, posição de secagem Diluente, incubado a temp. ambiental Mensagem de levar a casa 1. Identificar problemas bacterianas 2. Verificar a fonte de contaminação, em vez de cambiar o antibiótico Cambio de antibióticos não resolve os problemas! Esta creando novos problemas, i.e. resistência, se a fonte de contaminação não é identificada! Conclusões • Semen diluido porcino é susceptivel a bacterias • Regras principais: Coleta de semen com conteudo bacteriano baixo Processamento de semen sem contaminação adicional Prevenção de crescimento de bacterias no armazenamento • Medidas higienicas devem incluir: Guias sanitarias eficientes Consciência profunda higiénica do pessoal da central Sistema eficiente de monitoramento para identificar a presença e a origem da contaminação bacteriana Voltando aos „cocktails de antibióticos“: Consequências do uso rotinario ● Resistência bacteriana pre-programada ● Antibióticos não são declarados ● Cepas bacterianas e susceptibilidade variam muito ● Uso indiscriminado em todas centrais é irresponsável ● Responsabilidade para saude pública comprometida Recomendação: • não usar o „cocktail“; realizar antibiograma e • estabelecer programa de monitoramento higiénico • aplicar regras internacionais de bioseguridade ja definidas • aplicar programas de emergência só em casos agudos Obrigado pela atenção ! Cachaço Charlie, idade atual 15 anos Novos conceitos na diluição do ejaculado suíno: como as células espermáticas respondem aos desafios impostos? Prof.Dr.Dr.h.c Karl Fritz Weitze Escola Superior de Medicina Veterinária de Hannover, Alemanha Podemos distinguir desafios fisiológicos aos espermatozoides (SPZ) que existem na monta natural como na Inseminação artificial (IA). Outro desafio surge quando queremos preservar o sêmen através de diluição e refrigeração. Devido à situação fisio-anatômica da porca, os SPZ devem superar uma distância enorme entre o lugar da deposição do sêmen no canal cervical da fêmea e o lugar da fertilização no oviduto. Na fêmea adulta, isso significa aproximadamente 2 m de cada lado, devido ao comprimento dos cornos uterinos. Apesar de este caminho ser percorrido passivamente pelos SPZ, pois os cornos transportam o líquido seminal ao longo do órgão, este transporte resulta numa perda enorme numérica devido à eliminação por fagocitose e transporte retrógrado durante as primeiras horas depois da inseminação. No suíno, esta perda numérica significativa é compensada pelo alto número de SPZ aplicados durante a inseminação, que pode alcançar 50 bilhões ou mais na monta natural e entre 2 e 3 bilhões na IA. Em comparação ao bovino, no suíno trata-sede uma inseminação intracervical com transporte imediato do líquido seminal a cavidade uterina, ou seja, de fato é uma inseminação intrauterina, enquanto no bovino o sêmen é depositado fisiologicamente em forma intravaginal e os espermatozoides devem subir ativamente pelo canal cervical ao útero. O volume do ejaculado do touro é, em comparação ao suíno, muito reduzido e compreende 6 até 8 ml no meio, enquanto o ejaculado do cachaço alcança facilmente 500 ml ou mais. Estas diferenças fisiológicas entre bovino e suíno tem importância considerável para a preservação e devem ser consideradas nas técnicas aplicadas. O segundo desafio surge quando os SPZ, que se encontram nas pontas dos cornos uterinos, estão entrando nos ovidutos. Esta entrada é um processo ativo, em que as células têm que subir pelas pregas da união úterotubárica que desembocam em pregas longitudinais do istmo. Esta barreira resulta numa redução numérica considerável, uma vez que apenas alguns mil de SPZ alcançam o lúmen do oviduto. O terceiro desafio representa atividades ainda pouco investigadas das células espermáticas, pois elas perdem a atividade, ligando-se ativamente ao epitélio do istmo. Os sinais para esta ligação e para a posterior separação e reanimação são apenas parcialmente conhecidos, mas o que se sabe é que o cálcio está implicado neste processo, que é caracterizado por uma concentração elevado de bicarbonato no meio. Esta subpopulação de SPZ, considerada competente para a fertilização, irá posteriormente competir pela penetração da zona pelúcida e a fertilização propriamente dita. Considerando as metas da preservação do ejaculado, em que o número de SPZ por dose é reduzida enormemente, o número de SPZ competentes para fertilizar por dose alcança apenas algumas centenas de células. Visando o temário desta apresentação, temos que considerar outros desafios ligados a preservação, que dificultam manter a fertilidade das células preservadas. Podemos distinguir três maiores desafios existentes na preservação do sêmen líquido suíno. Devido ao alto número de SPZ ainda necessário por dose de IA, o ejaculado na rotina das centrais é diluído apenas em forma reduzida, resultando num número limitado de doses por ejaculado. Para cumprir as exigências de uma genética moderna, existe a necessidade de aumentar o número produzido por ejaculado, com a consequência de aumentar a cada ano o grau de diluição dos ejaculados de cachaços de alta genética. Com o aumento gradual de diluição, ocorre uma eliminação gradual do plasma seminal, chegando à uma situação, em que o plasma seminal restante é muito pequeno, alcançando facilmente menos de 5 % do original, correspondendo a um grau de diluição de 1 : 20 ou um número de SPZ por doses inferior a 1 bilhão. Esta eliminação, resultado de uma aplicação brusca de alto volume de diluente, causa transtornos imediatos para o metabolismo e equilíbrio osmótico das células espermáticas. Estes transtornos são às vezes associados a choque térmico brusco, quando o diluente adicionado não corresponde à temperatura do ejaculado. Então a alta sensibilidade térmica dos SPZ do suíno ainda aumenta consideravelmente o estresse causado pela eliminação do plasma seminal. Choque de diluição e choque térmico são então dois desafios ainda não resolvidos na preservação do sêmen líquido. Considerando a necessidade de prolongar o tempo de sobrevivência das doses, para inseminar com sêmen do mesmo ejaculado quando o estro das fêmeas está mais prolongado, surge o desafio do envelhecimento das células durante o armazenamento. As estratégias de uma preservação moderna de sêmen líquido devem considerar diferentes fatores como: diluentes, agentes específicos de proteção nos diluentes, o plasma seminal e sua eventual substituição por agentes semelhantes, e finalmente a variação fisiológica entre os ejaculados dos cachaços, além do número de SPZ e o volume de plasma seminal (ejaculados “ricos” e “pobres” em SPZ e plasma seminal). Em experimentos espermatológicos foram testados altos graus de diluição entre 1 : 3 e 1 : 140, produzindo assim doses com um número de SPZ entre 2,5 bilhões e 0,5 bilhão. Fig.1 Efeito de altos graus de diluição ( 2,5; 1 e 0,5 bilhões) e meio de conservação (BTS vs AndrostarPlus) sobre a motilidade progressiva, n=6, +16°C 100 90 80 70 BTS 2,5 60 AstarPlus 2,5 BTS 1 50 AstarPlus 1 40 BTS 0,5 30 AstarPlus0,5 20 10 0 2,5 2,5 1 1 0,5 0,5 2,5 2,5 d0 1 1 0,5 0,5 2,5 2,5 d3 1 1 0,5 0,5 d5 Fig. 2 Efeito de altos graus de diluição ( 2,5; 1 e 0,5 bilhões) e meio de conservação (BTS vs AndrostarPlus) sobre morfologia acrossomal, n=6, +16°C 25 20 BTS 2,5 AstarPlus 2,5 15 BTS 1 AstarPlus 1 10 BTS 0,5 AstarPlus0,5 5 0 2,5 2,5 1 1 d0 0,5 0,5 2,5 2,5 1 d3 1 0,5 0,5 2,5 2,5 1 1 0,5 0,5 d5 Independente do efeito dos diluente usados nos experimentos, o aumento da diluição de 2,5 a 1 bilhão de SPZ por dose mostrou uma redução significativa da motilidade e do aumento de acrossomas defeituosos, que depois da diluição a 0,5 bilhões de SPZ por dose foi mais acentuado ainda (Fig. 1 e 2). Este efeito foi verificado usando diferentes diluentes como BTS, AndrostarPlus e AndrohepPlus (Fig. 3 e 4), verificando um efeito protetor adicional significativo dos diluentes. Fig.3 Altas taxas de diluição (2,5; 1,5, 1 bilhão) e efeito de diluentes (AndrohepPlus vs AndrostarPlus), Motilidade 100 90 80 70 AhepPl 2,5 60 AstarPl 2,5 AhepPl 1,5 50 AstarPl 1,5 40 AhepPl 1,0 30 AstarPl 1,0 20 10 0 2,5 2,5 1,5 1,5 1 d0 d3 d5 1 d7 Fig.4 Altas taxas de diluição (2,5; 1,5, 1 bilhão) e efeito de diluentes (AndrohepPlus vs AndrostarPlus), Acrossomas defeitas 14 12 10 AhepPl 2,5 AstarPl 2,5 8 AhepPl 1,5 AstarPl 1,5 6 AhepPl 1,0 4 AstarPl 1,0 2 0 2,5 2,5 1,5 1,5 1 d0 d3 d5 1 d7 Para compensar a perda de plasma seminal depois de altas diluições, realizou-se experimentos de substituição de plasma seminal por 10% e 20% em sêmen preservado em BTS, AndrostarPlus e AndrohepPlus com 1 e 0,5 bilhões de SPZ por dose. Independente do diluente usado, a adição de 10 ou 20% de plasma seminal resultou num aumento significativo de motilidade e diminuição de acrossomas defeituosos, mantendo o efeito protetor dos diluentes anteriormente usados (Fig. 5, 6, 7, 8, 9, 10). Fig.5 BTS V 03 2008 Seminal-Plasma MOT progr.: 1 u. 0,5 / 0, 10, 20 % Seminalplasma; 16°C, n=4 Motilidade: 0%,BTS:10%, 20 %Mrd.plasma seminal 120 1bilhão 100 0% 10% 0,5 bilhões 20% 0% 10% 20% BTS 1,0 MOT progr % 80 BTS 1,0 10 BTS 1,0 20 60 BTS 0,5 BTS 0,5 10 40 BTS 0,5 20 20 0 d0 d5 BTS 1,0 91,6 66 BTS 1,0 10 94,2 82,7 BTS 1,0 20 94,5 89,7 BTS 0,5 88,6 27 BTS 0,5 10 90,6 63,8 BTS 0,5 20 93,9 76,1 Lagerzeit d Fig.6 BTS V 03 2008 defeitas; Seminalplasma BTS:0%, Defekte Akrosome: u. 0,5 Mrd.,plasma 0, 10, 20 % Seminalplasma, 16°C, n=4 Acrossomas 10%, 120% seminal 1bilhão 10 0% 10% 9 0,5 bilhões 20% 0% 10% 20% Defekte Akrosome % 8 7 BTS 1,0 BTS 1,0 10 6 BTS 1,0 20 5 BTS 0,5 4 BTS 0,5 10 3 BTS 0,5 20 2 1 0 d0 d5 BTS 1,0 3,8 6,8 BTS 1,0 10 2,3 5,3 BTS 1,0 20 1,8 4,5 6 7,9 BTS 0,5 10 3,5 7,2 BTS 0,5 20 2,3 BTS 0,5 6,3 Lagerzeit d Fig. 7 AndrostarPlus V 4 2008 MOT progr (n=5): Zusatz von Seminalplasma(10 u. 20%) bei hoher Verdünnung (1,0 und 0,5 Mrd. pro 100 AndrostarPlus vs AndrostarPlus +10% vs AndrostarPlus + 20%, 16°C Motilidade: 0%,ml);10%, 20% plasma seminal 1bilhão 100 0% 10% 90 0,5 bilhões 20% 0% 10% 20% MOT progr 80 70 AstPl 1,0 60 AstPl 1 10 AstPl 1 20 50 AstPl 0,5 40 AstPl 0,5 10 30 AstPl 0,5 20 20 10 0 d0 d5 AstPl 1,0 89,5 81,8 AstPl 1 10 92,9 92,1 AstPl 1 20 94 93,9 AstPl 0,5 88,4 50,3 AstPl 0,5 10 93,7 78,8 AstPl 0,5 20 94,8 88,8 Lagerzeit Tage Fig. 8 AndrostarPlus V 4 2008 GAR (n=5): Zusatz von Seminalplasma ( 10 u. 20%) bei hohen Verdünnungsraten (1,0 u. 0,5 Mrd. pro 100 Acrossomas defeitas; 10%, plasma seminal ml) (n=5): AndrostarPlus vs 05; AndrostarPlus +10%20% vs Androstarplus +20 %, 16 °C 1bilhão 6 0% 10% 0,5 bilhões 20% 0% 10% 20% 5 AstPl 1,0 4 GAR % AstPl 1,0 10 AstPl 1,0 20 3 AstPl 0,5 AstPl 0,5 10 2 AstPl 0,5 20 1 0 d0 d5 AstPl 1,0 2,6 3,9 AstPl 1,0 10 1,4 2,7 AstPl 1,0 20 1,2 2,3 AstPl 0,5 2,6 5,3 AstPl 0,5 10 1,8 3,7 AstPl 0,5 20 1,6 2,9 Lagerzeit Tage Fig. 9 AndrohepPlus V 5 2008 MOT progr (n=6): Seminalplasmazusatz ( 10 u. 20 %) bei hohen Verdünnungsgraden (1,0 u. 0,5 Mrd. pro 100 ml), AndrohepPlus (Verdü.Mi. D); 16°C Motilidade; 0%, 10%, 20% plasma seminal 1bilhão 0,5 bilhões 100 0% 10% 20% 0% 10% 20% 90 MOT progr % 80 AhepPl 1 AhepPl 1 10 70 AhepPl 1 20 AhepPl0,5 60 AhepPl0,5 10 AhepPl0,5 20 50 40 30 d0 d5 AhepPl 1 91,1 85,6 AhepPl 1 10 93,5 88,9 AhepPl 1 20 94,3 89,9 AhepPl0,5 88,7 77,8 AhepPl0,5 10 91,7 83,1 AhepPl0,5 20 92,7 84,9 Lagerzeit Tage Fig. 10 AndrohepPlus V 5 2008 GAR %, Seminalplasmazusatz (10 u. 20%) bei hohen Verdünnungsgraden (1,0 u. 0,5 Mrd. pro 100 ml), (Verdü.mischung 16°C Acrossomas defeitas;AndrohepPlus 0%, 10%, 20%D) (n=6) plasma seminal 1bilhão 10 0% 10% 9 0,5 bilhões 20% 0% 10% 20% GAR % 8 7 AhepPl 1 6 AhepPl 1 10 AhepPl 1 20 5 AhepPl0,5 4 AhepPl0,5 10 3 AhepPl0,5 20 2 1 0 d0 d5 2,7 6 AhepPl 1 10 2 4,7 AhepPl 1 20 1,5 3,8 AhepPl0,5 2,8 7,3 AhepPl0,5 10 2,5 5,8 AhepPl0,5 20 2,3 AhepPl 1 4,8 Lagerzeit Tage Para diminuir o efeito do choque pelo frio durante e depois da diluição se realizou experimentos usando uma pré-incubação do sêmen diluído em forma isotérmica a 32°C , facilitando assim aos SPZ de adaptar se a nova situação antes de baixar a temperatura a +17°C e +10°C. Os experimentos foram realizados usando AndrostarPlus e BTS como meios de diluição. Uma pré-incubação a 25°C por 24 horas do sêmen altamente diluído mostrou um efeito claramente significativo em comparação a doses sem pré-incubação. Um armazenamento do sêmen a 25°C até o dia 7 resultou uma perda significativa de motilidade e aumento de acrossomas com defeito em comparação a préincubação curta. Os diluentes mostraram um efeito protetor diferente, como já verificado nos experimentos anteriores (Fig. 11 e 12). Para investigar mais detalhadamente o efeito da temperatura do diluente no momento da primeira diluição se realizou uma diluição isotérmica a 32 °C comparando com um tratamento bitérmico, em que o sêmen foi diluído 1 : 1 com diluente isotérmico, seguido por aplicação do resto do diluente com 22 °C (diluição bitérmica). Os resultados dos tratamentos 3 e 4 (isotérmico vs bitérmico) mostrou um efeito protetor da diluição isotérmica, indicando que as células precisam ser adaptados lentamente à descida de temperatura. Os efeitos dos diluentes mostraram diferenças significativas como nos experimentos anteriores. Fig. 11 V 12 2010 Eber; MOT progr: AndrostarPlus vs BTS; Var 1: 25-10-17; Var2: 25-10; Var3: 17; Var 4: Vorverd. m it 32°,Nachverd. 22°, dann 17°. n=6 Diluição isotermica vs bitermica 100,0 90,0 AstPl 1 AstPl 2 MOT progr % 80,0 AstPl 3 70,0 AstPl 4 60,0 BTS1 BTS2 50,0 BTS3 BTS4 40,0 30,0 2h 72 h 168 h AstPl 1 88,6 89,6 86,2 AstPl 2 87,4 87,7 86,9 AstPl 3 88,1 89,7 88,1 AstPl 4 87,5 87,8 86,5 BTS1 86,0 82,7 76,7 BTS2 86,0 81,0 75,9 BTS3 85,1 86,7 83,9 BTS4 84,2 85,4 80,5 Lagerzeit h Fig. 12 V 12 2010 Eber, Defekte Akrosom e: AndrostarPlus vs BTS; Var. 1: 25-10-17°; Diluição isotermica bitermica 17°; 4:Vorverd. vs bei 32°, Nachverd. m it 22°, dann 17°; n=6 2: 25-10°; 3: 30,0 Defkte Akrosome % 25,0 AstPl 1 = Isotermica (32°) vs bitermica (32/22°) AstPl 2 20,0 AstPl 3 AstPl 4 15,0 BTS1 BTS2 10,0 BTS3 BTS4 5,0 0,0 2h 72 h 168 h AstPl 1 1,8 4,3 8,1 AstPl 2 1,8 5,5 9,6 AstPl 3 2,3 3,8 6,5 AstPl 4 1,8 4,5 7,5 BTS1 2,5 10,8 16,7 BTS2 2,7 12,2 21,2 BTS3 2,7 6,4 10,7 BTS4 3,0 8,0 12,8 Lagerzeit h Para avaliar mais detalhadamente a duração da pré-incubação, as amostras foram pré-incubadas por 3 vs 24 horas a 25°C, antes de reduzir a temperatura a 10°C. Os resultados de motilidade e morfologia dos acrossomas mostraram um efeito protetor da pré-incubação mais prolongada de 24 horas, com diferenças significativas a favor do diluente AndrostarPlus vs BTS. (Fig. 13, 14) Fig. 13 Preincubação a +25 °, 3 vs 24 horas depois a +10°C Fig. 14 Preincubação a +25 °, 3 vs 24 horas depois a +10°C ++ Experimentos paralelos investigando o efeito da refrigeração sobre o aumento de Ca intracelular como indicador de primeiros passos a estimulação de capacitação e posterior reação acrossomal mostraram um aumento ++ significativo de Ca intracelular e uma redução da reatividade específica a sinais de capacitação quando a temperatura foi reduzida de 17°C a 10°C e 5 °C gradualmente com diferença significativa entre os diluentes BTS vs AndrostarPlus.( Fig. 15, 16, 17). Fig. 15 Posiveis causas da refrigeração: Aumento de [Ca2+]i devido a refrigeração Refrigeração aumenta [Ca2+]i concentração (Green and Watson 1981, Simpson and White 1987, Robertson et al., 1988, 1990) Refrigeração leva a absorbção de Ca2+ extracelular e liberação de reservas internas (Bailey and Buhr 1990) Fig. 16 Aumento inicial [Ca2+]i em semen refrigerado % High Ca2+ live sperm, 3min Idade de semen: 24 h, n = 7) 25 * 20 c * 15 b 10 BTS a,b b Androstar Plus a a 5 * Significant differences between extenders 0 17°C 10°C 5°C P<0.05 Aumento de [Ca2+]i em SPZ vivos depende de temperatura de armazenamento e diluente Fig. 17 Reactividade especifica a sinais de Capacitação em SPZ refrigerados Specific reactivity (%) 60 50 (idade de semen : 24 h, n = 7) a a * a b b 40 BTS 30 c Androstar Plus 20 10 * Significant differences between extenders 0 P<0.05 17°C 10°C 5°C Decida de reactividade especifica depende de temperatura de armazenamento e diluente ++ Os resultados da ativação de Ca em dependência à temperatura de armazenamento e do diluente usado indicam claramente o papel da temperatura e de meios de diluição sobre a sobrevivência dos SPTZ. A conclusão geral dos experimentos é que altas taxas de diluição entre 1 e 0,5 bilhões de SPZ por dose resultam numa diminuição significativa da motilidade em forma imediata e um aumento de danos acrossomais a partir do dia 3 de armazenamento. Os diluentes usados nos experimentos mostram um efeito protetor especifico do fator crioprotetor usado nos diluentes AndrostarPlus e AndrohepPlus. Vale mencionar que a adição de plasma seminal em casos de altas diluições diminui o efeito negativo em forma significativa, indicando que o fator nocivo de altos graus de diluição é a falta de um meio ambiental protetor, devido a alterações profundas do metabolismo, especialmente em relação a estimulação de primeiros passos de capacitação e reação acrossomal como início de degradação das membranas celulares. Em relação aos experimentos de pré-incubaçã o com temperaturas elevadas antes de reduzir a temperatura a valores abaixo de 15 °C, vale mencionar que uma pré-incubação a 25°C por 24 horas aumenta a resistência das células contra o choque de frio. Os diluentes usados no experimento mostraram efeitos específicos de proteção adicional. Experiência e resultados da aplicação do sistema computadorizado de análise espermática (Sperm Vision) em um programa de inseminação artificial em suínos. Rafael Kummer Master Agroindustrial, Videira - SC Experiência e resultados da aplicação do sistema computadorizado de análise espermática (Sperm Vision) em um programa de inseminação artificial em suínos. Rafael Kummer, PhD Introdução - Estrutura Master Agroindustrial; - Importância estratégica da Central de Produção Semen; - Utilização C.A.S.A. e avanços tecnológicos; - Considerações finais. Master Agroindustrial • Fundação: 29 abril 1994. • Negócio: produção e processamento de suínos, em sistema de parceria com Agroindústrias e Produtores Rurais. • 600 funcionários • 30.000 fêmeas próprias • 21.000 Agroceres – PIC • 8.000 Db – Danbred • 1.000 Genetiporc • Alvo para 2012 (UP) – 830.000 desmamados (28 D/F/A) Desmamados por ano – unidades próprias 900.000 830.000 800.000 700.000 600.000 560.978 500.000 587.853 442.153 382.939 398.894 400.000 300.000 241.880 271.877 200.000 114.000 100.000 24.000 0 1995 2002 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Desmamados por ano – unidades próprias 900.000 830.000 800.000 700.000 600.000 560.978 500.000 587.853 442.153 382.939 398.894 400.000 300.000 241.880 271.877 200.000 114.000 100.000 24.000 0 1995 2002 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Estrutura de produção atual - Granjas Rio Verde – GO (PIC) Iomere - SC (DB) São Roque - SC (PIC) Agua Doce – SC (Genetiporc) Carijos e Arroio Fundo Papanduva – SC (PIC) Curitibanos – SC (DB) 2012 Estrutura de produção atual – CPS CPS – Master Carijos 12.000 fêmeas CPS – Master Curitibanos 8.000 fêmeas Estrutura de produção atual – CPS CPS – Master Carijos Genética - Agroceres PIC 12.000 fêmeas – 55 machos 4 linhagens genéticas CPS – Master Curitibanos Genética DB - Danbred 8.000 fêmeas – 40 machos 2 linhagens genéticas CPS – importância estratégica 1 - Atender demanda de doses, sem risco sanitário; 2 – Produzir sêmen com alto potencial fecundante; _ Número de sptz na dose _ Motilidade _ Morfologia _ Contaminação _ Capacidade fecundante macho 3 – Produzir sêmen com custo baixo; 4 – Disseminação de gens; 5 – Processos simples com pessoas responsáveis; CPS – importância estratégica Tecnologia x Mentalidade Knox, 2008 CPS – importância estratégica Nascidos totais na linha pura (L02) conforme índice genético da mãe; L02 - EBV <31 31 a 40 41 a 50 51 a 60 61 a 70 >70 Média Nascidos Totais 10,0 11,5 12,4 12,8 13,5 14,8 12,1 # Partos 743 674 811 622 407 261 3518 CPS – importância estratégica Retorno econômico esperado com melhoramento de 10 pontos de índice genético - PIC Line R$/animal 337 1,35 327 1,34 415 1,24 1010 – Camb 1,71 1020 - Camb 0,57 18 – Avó 0,34 CPS – importância estratégica • Realidade 2009: – 1 bi de sptz por leitão • (3,5 doses * 3 bi/dose) • Desafio: – 0,3 bi de sptz por leitão; • Melhorar >50% utilização dos melhores gens; • Manter resultado zootécnico; Etapas de agregação do conhecimento Fonte: Vicente Falconi, O Verdadeiro Poder. Desafio – melhoria >50% utilização genética – Rever protocolo/método de inseminação artificial – Garantir qualidade da dose - concentração – Garantir fertilidade dos macho Desafio – principais pontos – Rever protocolo/método de inseminação artificial • Protocolo 24 hs – intervalo entre doses? • Método de IA pós cervical? • Utilização estratégica de machos geneticamente superiores? • Protocolo leitoas/primíparas? • Necessidade 4a dose? • IATF? Desafio – principais pontos – Garantia da qualidade da dose/concentração • Morfologia/contaminação; • Método de avaliação da concentração – C.A.S.A system; • Utilização estratégica de diluentes; Desafio – garantir fertilidade do macho Baseado em dados atuais pode ser experado de 10 a 15% de machos sub-férteis em uma central de inseminação artificial George Foxcroft, 2009. Fertilidade de machos – fêmeas DB Macho A B C D E F G H I J K L M N Média N 76 81 89 88 87 59 75 82 92 83 78 79 82 80 1131 Taxa de Parto 96,1% 97,5% 93,3% 98,9% 90,8% 98,3% 96,0% 100,0% 93,5% 91,6% 93,6% 91,1% 90,2% 77,5% 93,4% NT 16,3 16,2 16,1 15,9 15,6 15,5 15,5 15,5 15,3 15,0 14,7 14,5 12,7 10,7 15,0 %MOT 10D 57 53 48 45 50 56 37 54 48 55 46 37 25 20 45 Problema de morfologia (%) 16 22 15 25 12 17 37 20 20 12 21 22 43 68 25 Aline Kummer – UFRGS (dados não publicados) Fertilidade de machos – fêmeas Ag-PIC MACHO N TX Parto NT MOT 240hs 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 MÉDIA 67 67 68 67 68 70 69 68 66 67 68 68 67 68 948 98.5% 97.0% 92.6% 89.5% 92.6% 94.3% 91.3% 89.7% 92.4% 97.0% 97.0% 94.1% 95.5% 89.7% 93.4% 14.3 14.0 13.5 13.3 13.3 13.2 13.1 13.1 13.0 12.8 12.7 12.6 12.5 12.0 13.1 69.9% 60.6% 69.2% 74.5% 69.6% 62.5% 83.0% 63.2% 46.4% 72.7% 79.2% 67.1% 63.2% 40.3% 65.5% Problema de Morfologia (%) 8.6% 12.4% 11.2% 11.4% 17.0% 15.4% 9.8% 10.5% 15.4% 10.7% 6.6% 18.8% 14.0% 7.5% 12.0% Aline Kummer – UFRGS (dados não publicados) Inseminação artificial pós cervical (1 bi sptz por dose) Situação atual – 10.000 fêmeas com inseminação pós cervical (0,3 bi por leitão nascido); – 20 machos para 6.000 fêmeas (1:300) – Controle da dose e qualidade dos machos essencial; – Necessidade de equipamento para garantia do processo; Considerações finais O diferencial sempre serão as pessoas. Redução do número de espermatozóides na dose: principais cuidados e controles desde a produção até a inseminação. Alexandre Marchetti e Ana Paula Mellagi Minitub do Brasil Ltda, Porto Alegre - RS Redução do número de espermatozóides na dose: principais cuidados e controles desde a produção até a inseminação. Alexandre Marchetti [email protected] Ana Paula Mellagi [email protected] Redução sptz/dose: aplicações • Planos de contingência • Aumento do plantel de matrizes • Redução plantel machos • redução custos diretos • Testes de fertilidade dos machos • Otimização de machos geneticamente superiores • Ganhos na qualidade da carcaça Revisão literatura • Weitze (1991) - 1,5 x 2,5 bilhões sptz • Colenbrander (1993) - 3 bilhões sptz • Steverink et al. (1997) - 1 x 3 x 6 bilhões sptz • Park et al. (1999) - 1,5 x 2,0 x 2,5 x 3 bilhões sptz • Marchetti (2001) - 2 x 3 x 4 bilhões sptz • Bennemann et al. (2005) - 1,5 bilhões sptz Revisão literatura • Watson & Behan (2002) - 1 x 2 x 3 bilhões sptz • Williams (2002) - 1 x 1,5 x 3 bilhões sptz • Dallanora et al. (2004) - 1,5 x 3 bilhões sptz • Mezzalira et al. (2005) - 0,25 x 0,5 x 1 bilhão sptz • Mozo-Martín & Gil (2011) - 1,5 x 0,75 bilhões sptz Revisão literatura Kummer (2012) Busca de reprodutores sub férteis 2,0 bilhões sptz Taxa parto & Nascidos Totais X Avaliação espermática Na prática das centrais: - 3 a 4 bilhões sptz/dose - Avaliação subjetiva motilidade - Avaliação morfológica ?? - Efeito macho (subfertilidade) Homospermia x heterospermia - Perdas armazenamento & transporte - Manejo matrizes: diagnóstico estro e IA - Mão-de-obra - Retorno dos dados de produção ? » 1,8 a 2 bilhões sptz/dose Fatores a serem considerados Coleta Técnica IA Avaliação Número sptz dose Diagnóstico Estro & Protocolo IA Diluição & Fracionamento Transporte & Armazenamento Central de IA – uma visão industrial... EFICIÊNCIA = QUALIDADE + PROCESSOS CORRETOS MAS EXECUTADOS INCORRETAMENTE PROCESSOS CORRETOS EXECUTADOS CORRETAMENTE - + EFICÁCIA = RESULTADO PROCESSOS INCORRETOS EXECUTADOS CORRETAMENTE PROCESSOS INCORRETOS E EXECUTADOS INCORRETAMENTE ONDE ESTÁ NOSSA CENTRAL ?? Coleta de sêmen: higiene Absoluto cuidado higiênico Sem crescimento até 48h após a semeadura! Bennemann et al., 2000 Goldberg, 2009 Coleta de sêmen: higiene Coleta de sêmen: higiene Coleta de sêmen: higiene Coleta de sêmen: higiene Coleta de sêmen: higiene Coleta de sêmen: higiene Avaliação do ejaculado Sistema CASA SpermVision Avaliação do ejaculado: concentração Avaliação do ejaculado: concentração Brasil 5 centrais 1.500.000 doses/ano Sistema CASA SpermVision Avaliação do ejaculado: concentração • Broekhuijse et al. (2012) - 110.186 ejaculados avaliados - 7429 reprodutores - Número sptz/dose: 2,7 ± 1,5 bilhões » 1,2 a 4,2 bilhões sptz • Amostras recebidas para análise Minitub Brasil - Variação de ± 30% no número de sptz/dose, » 3 bilhões Avaliação: preparo da amostra 2,0 a 4,0 bilhões Avaliação: preparo da amostra Avaliação: preparo da amostra Avaliação: preparo da amostra Ação centrífuga: Sptz em direção às laterais Amostra retirada do centro: Redução no número de células Resultado: Maior número de sptz nas doses Avaliação: preparo da amostra Avaliação: preparo da amostra Avaliação: preparo da amostra Avaliação: preparo da amostra Avaliação: morfologia básica ? Avaliação: morfologia básica Avaliação: morfologia “completa” Avaliação: morfologia Laudos: ferramenta de apoio Diluentes: função & importância Proteção das células, manutenção motilidade e viabilidade até o momento da fecundação Diluentes: função & importância Qualidade da água: purificação e armazenamento Qualidade da água: purificação e armazenamento Qualidade da água: purificação e armazenamento Qualidade da água: purificação e armazenamento Qualidade da água: purificação e armazenamento Controle microbiológico: ferramenta de apoio Fracionamento: homogeneização Avaliação: avaliação das doses produzidas Transporte & Armazenamento Transporte & Armazenamento Diagnóstico de estro e Protocolos de IA Diagnóstico de estro e Protocolos de IA n TRE % TP % TL IA estro 268 6,34 93,4 11,36 IA Metaestro 60 21,67 77,9 10,13 Marchetti et al., 2000 A cada 100 fêmeas cobertas: 272 leitões a menos Técnica de IA propriamente dita Técnica de IA propriamente dita: cervical x pós cervical 20cm 1,5m Técnica de IA propriamente dita: refluxo de sêmen • Flores (2004) - IA tradicional e Auto IA (100 ml) 120 min 65 a 73% do volume 28 a 32% das células • Mezalira et al. (2005) - IA pós cervical (20 ml) 60 min 64 a 68% do volume 12 a 15% das células •Fagocitose •Passagem cav. abdominal Técnica de IA propriamente dita: cervical x pós cervical INFERIOR Williams, 2002 Leyun Izco, 2004 Rozeboom et al., 2004 Roberts et al., 205 Panzardi et al., 2010 IGUAL Gil, 2002 Watson & behan, 2002 Valladares, 2003 Dallanora et al., 2003 Padilla-Mota et al., 2004 Cuevas et al., 2005 Llanes-Chalé et al., 2007 Fitzgerald et al., 2008 Dimitrov et al., 2009 SUPERIOR Williams, 2005 Stancic et al., 2006 Gil et al., 2006 Leyun Izco, 2008 H. Caravaca et al., 2009 Adaptado de Carmen de Alba, 2010 Europa: crise econômica 2008 Espanha e França Considerações Finais • Número de células reduzidas: - Novos parâmetros: células viáveis/dose Avaliação objetiva Uso de diluentes que garantam a viabilidade das células Maximização da produção Qualidade & quantidade • OTIMIZAÇÃO DOS REPRODUTORES - % de machos ativos - Perda de um ejaculado passa a ser muito representativa Eficiência x Eficácia da central Não há margens para erro! Considerações Finais 3 bilhões sptz/dose Tx Reposição 50% 1500 doses/macho/ano 3000 doses /vida útil 3 doses x 2,4 partos/ano 416 matrizes 28 terminados/matriz/ano 11.648 leitões 110 kg ao abate 1.281.280 kg de carne Considerações Finais 3 bilhões sptz/dose 2 bilhões sptz/dose Tx Reposição 50% Tx Reposição 50% 1500 doses/macho/ano 15% 1750 doses/macho/ano 3000 doses /vida útil 3500 doses /vida útil 3 doses x 2,4 partos/ano 2 doses x 2,4 partos/ano 75% 416 matrizes 730 matrizes 28 terminados/matriz/ano 11.648 leitões 20.440 leitões 110 kg ao abate 1.281.280 kg de carne 28 terminados/matriz/ano 110 kg ao abate 75% 2.248.400 kg de carne Considerações Finais TECNOLOGIAS BANCO DE DADOS INFORMAÇÃO TOMADA DE DECISÕES Considerações Finais TECNOLOGIAS Não resolvem problemas mas proporcionam uma melhor identificação e geração de um BANCO DE DADOS que deve ser analisado e transformado em INFORMAÇÃO que resultará na correta TOMADA DE DECISÕES Muito Obrigado ! Tecnologia para todos!