Anais do III Simpósio Satélite Minitub de Reprodução de Suínos

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Anais do III Simpósio Satélite Minitub de Reprodução de Suínos
Benchmarking, Standards and Production Procedures in European Boar Studs
1
1
2
M Schulze , K Ruediger , M Grobbel , M Jung
1
1
Institute for Reproduction of Farm Animals, Schoenow, Germany
Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research, Berlin, Germany
2
Abstract
The present systematic data summarize microbiological, spermatological, and semen production results of a
continuous audit in 24 European boar studs. Overall, semen samples of 344 boars were analyzed. In 26% of the
2
5
diluted ejaculates, bacterial live cell count was 10 to 10 CFU/mL after 48 h storage at 16 °C. Gram-negative bacteria
amounted to 58% (Enterobacteriaceae 53%, pseudomonads 29%). Most frequently isolated Gram-positive bacteria
were Leifsonia aquatica (20%). In six boar studs, no gentamicin-resistant bacteria were detected. Microbiological
investigations revealed different hygiene-related weak points: heating cabinets (46%), wash-basins (42%), ejaculate
transfer (29%), manual operating elements (29%), inner face of dilution tank lids (17%), lab surfaces (13%), dyes
(8%), extenders (8%), and ultrapure water treatment plants (4%).
Spermatological evaluation showed that more than three quarters of the investigated ejaculates (77%) contained
more than 75% of morphologically intact sperm. Surprisingly, the two boar semen production procedures encountered
in the studs showed a significant influence on semen viability, motility (CASA), acrosome integrity, and mitochondrial
status, being the single-step boar semen dilution significantly superior over the multi-step boar semen dilution (P <
0.001, Mann Whitney U test). Altogether, 29% of boar studs used single step dilution. Comparison of daily AI stud
production protocols demonstrated major differences in sperm output based on influencing factors such as precollection pens, design of collection dummy/area, and work management. Feed composition (n = 10) showed
remarkable differences between boar studs in nutritional values (protein, fat, and fiber) and vitamin supplementation
(A, D, and C). More research on stimulating and stabilizing boar semen production is needed in order to satisfy the
ever increasing demand for semen of top-genetic boars.
Introduction
Quality assurance is an essential part of any diagnostic system and is a foundation pillar of modern ISO-based
facilities [1]. One of the basic rules is that boars should be housed in strictly protected semen collection centres [2].
This includes specific means of monitoring, assessment of semen and testing for microbiology. Thus, regular internal
and external boar stud monitoring for microbiological and spermatological quality is an important component in an AI
boar stud control program [3]. The use of lower doses and the need for longer semen shelf life requires that AI boar
studs should supply only semen of high quality also with reference to hygienic quality [4]. It is well known that
bacteriospermia is detrimental to spermatozoa quality [5]. Good laboratory practice standards that contain
international quality control procedures are becoming more and more established [6]. Especially, regularly performed
external quality control is useful for barn and lab personnel training, providing a theoretical background, and focused
on practical aspects [7].
Furthermore, with growing expansion of semen trade, inter-station comparability of boar stud efficiency is of
increasing importance. Generally, evaluation of the quality of extended semen, randomly taken samples from routine
production should be analyzed continuously in external reference laboratories. Semen evaluation (motility,
morphology, sperm concentration, and sperm functions) in a semen production audit should be the basis for detecting
weak points on AI stations. Identification of weak points may be useful for discussing which management tools are
practical for advancing boar semen production in the future. This review describes the most important results of a
regular semen production audit in 24 European boar studs.
Microbiological results
Bacteriological and spermatological screenings (n = 344) were made over a 2-yr period (2010 to 2011) at 24
3
5
European boar studs. Total aerobic bacterial count in neat boar ejaculates averaged 10 to 10 bacteria/mL. In some
boar studs, there was a high hygienic sperm quality and it seems to be possible to collect boar semen without
bacterial contamination. Indisputable, bacterial load affects concentration-dependent in vitro quality and longevity of
stored boar semen [8]. Mostly, there are multifactorial reasons for bacterial contamination in neat boar ejaculates.
Common sources of contamination are hygienic requirements, boar genital tract, type and area of semen collection,
personnel, fecal contaminants or environmental bacteria (Table 1). Sources can be simply classified into animal or
non-animal origin [9]. Discarding of the preliminary ejaculate phase is one of the most important measures.
*Correspondence: IFN Schoenow e. V., Bernauer Allee 10, 16321 Bernau, Germany
phone: 0049 3338-709822 • fax: 0049 3338-709810 • e-mail: [email protected]
2
5
In 26% of diluted ejaculates, bacterial live cell count was 10 to 10 bacteria/mL after 48 h storage at 16 °C.
Aerobic culture yielded a variety of bacteria from different genera (Table 1). Gram-negative bacteria amounted to 58%
(Enterobacteriaceae 53%, pseudomonads 29%). Most frequently isolated Gram-positive bacteria were Leifsonia
aquatica (20%). In six boar studs, no gentamicin-resistant bacteria were detected. The contaminant bacteria resistant
to gentamicin were found with variable patterns of resistance to the other 14 antibiotics evaluated (Table 2).
Aminoglycosides belong to the most popular European antimicrobials used in boar semen extenders. Different
sources of contamination were identified based on the boar stud inspection by microbiological sampling of critical
points of semen production. Microbiological sampling identified different hygiene-related weak points (Table 3):
heating cabinets (46%), wash-basins (42%), ejaculate transfer (29%), manual operating elements (29%), inner face of
dilution tank lids (17%), lab surfaces (13%), dyes (8%), extenders (8%), and ultrapure water treatment plants (4%).
Standardized audit protocols provide a basis for evaluating hygienic environment and objectifying sample data.
Only objectification of production data permits the comparison of different AI boar studs under different conditions and
the implementation of standard and individual sanitation protocols. In all cases, a visit of the facility is essential to
locate the sources of contamination. Strict individual hygiene, good general sanitation, and regular internal and
external monitoring can collaborate greatly in controlling bacterial load and optimizing sperm quality. It should be a
component of a quality control program.
Spermatological results & production data
For comparative purposes, spermatological results from various AI boar studs can help to serve as a point of
reference and benchmarking. Spermatological evaluation showed that more than three quarters of the investigated
ejaculates (77%) contained more than 75% of morphologically intact sperm. Surprisingly, the two boar semen
production procedures encountered in the studs showed a significant influence on semen viability, motility (CASA),
acrosome integrity, and mitochondrial status, being the single-step boar semen dilution significantly superior over the
multi-step boar semen dilution (P < 0.001, Mann Whitney U test). Altogether, 29% of boar studs used one-phase
dilution.
Comparison of daily AI stud production protocols demonstrated major differences in sperm output. Several boar
studs achieved high sperm output based on influencing factors such as pre-collection pens (Figure 3), design of
collection dummy/area, and work management. The average number of sperm produced per collection (sperm-output)
was 75 (56 to 95) billion (Figure 4). Values are expressed as median and interquartile range. The average number of
doses produced per ejaculate was 32 (25 to 41).
Collection occurred mainly on Monday. Boars were rested 2-5 days between collections. The average age of boars
at time of training was 7-8 months. Nearly half of the studs trained boars during quarantine. The predominant age of
boars was 1-2.5 years with 50% boar replacement rates on average. Primary reasons for culling were genetic
progress, leg issues, semen quality, and libido. Sperm concentration was estimated predominantly by photometer,
with few labs using other methods. Ejaculates are discarded for reasons like poor motility (<70%), abnormal sperm
6
count (>25%), low concentration of sperm (<0.15x10 µL), low volume (<100 mL) and bacteria. Most studs retained
samples (1.5 mL, 10 mL or whole tubes) for quality control during 1-3 days post production. Ejaculate pooling was
routinely performed in 30% of the studs, using 3-6 ejaculates. Doses of semen contained 1.8-3 billion sperms and
were packaged as doses in tubes (only few in bags) with 80-95 mL. For final sperm cell numbers most studs adjusted
total cells in the dose based on motile sperm, including an additional safety margin. The majority of studs used
commercial BTS extenders.
Feed composition
Reproductive traits of boars are highly variable. Fluctuations in sperm production can easily amount to 25-30%.
Several factors such as breed, age of boar, season, heat stress and social environment were found to influence
semen quality and quantity [10]. Two further important factors which influence the reproductive system are semen
collection frequency and feeding [11]. Analysis of feed composition was carried out to investigate current differences
in AI boar studs. Crude nutrient contents were calculated on the basis of ten protocols. Definitely, variations of true
analytical values were possible. Boar feeding is carried out by automated or manual systems. Generally, daily amount
of feed is determined by body condition, boar size, or fixed.
Feed composition showed remarkable differences between boar studs in nutritional values (protein, fat, and fiber)
and vitaminisation (A, D, and C). In combination with daily feeding of young and mature boars substantial randomized
protein differences reached more than 100%. In most cases, nutrient supply was adequate or increased slightly.
Probably, spermatogenetic potency was not affected. Frequently, specific additives like biotin, L-carnitine, fish or
vegetable oils, brewer’s or baker’s yeast become more and more interesting (Table 4).
Outlook
(A) The great demand for semen of top-genetic boars requires to intensify the research on stimulating and
stabilizing boar semen production. Follow-up studies will be conducted to determine the distribution and transmission
of helminth eggs in AI boar studs in Europe. The expected results may lead to new recommendations for deworming
boars. The number of helminth species and their infection levels are strongly influenced by the different deworming
systems. Finally, control measures, hygiene, management, and recent anthelminthic strategies will be discussed in
the future.
(B) In addition to classical methods of semen evaluation, a whole range of new and enhanced methods for
evaluating sperm function is being developed and will provide additional information about sperm quality. Up to now a
founded assortment of significant in vitro tests as well as a recapitulatory appraisement of those parameters in regard
to sperm quality and therewith to fertility of boars is missing. Thus, future studies will create an in-vitro-index “SpermQuality” in order to combine all potential and relevant parameters.
(C) Sperm cells from boars are sensitive to storage at low temperatures. However, we demonstrated that semen
from single individual boars tolerate low temperatures and maintain their motility during storage at 4 °C for up to three
days. Sperm preservation at “refrigerator” temperature (4 to 6 °C) would simplify storage technology for boar semen
and reduce the necessity of antibiotics. Preliminary results of a lipid analysis of special membrane domains of 4 boars
showed an enrichment of particular phosphatidylcholines in the cold-sensitive sperm. Further studies will analyze
differences in lipid and protein patterns in more detail.
Summary of guideline data for catalog of measures and key aspects of external semen production audits
Key aspects
Pen
















Boar handling?
Clean boars and dummies?
Collection efficiency?
Collection hygiene?
Collection technique?
Ejaculate downtime?
Ejaculate transfer?
Other activities?
Hygienic feed (feeding
trough)?
Separated semen collection
area and design (short
distances)?
State of the collection area
and pen design?
Storage of collection
equipment?
Temperature control?
Usage of heating cabinets?
Usage of semen vessels,
bags, filters (tempering)?
Work management and safety
(first impressions)?
Lab & Logistic
 Dilution: single step- or multistep?
 Disposal: Extenders?
Ejaculates?
 Equilibration and cooling
time?
 Final check?
 Motility analysis (volume &
magnification)?
 Pass-through or pneumatic
tube?
 Pipettes?
 Processing of extender?
 Production line (wash-basins
& crossing of people)?
 Semen concentration
analysis?
 Semen dyes?
 Storing of equipment and
material?
 Temperature control?
 Usage of single-use
disposable products?
 Water path - chemical &
microbiological quality?
General
 Calculation of sperm
number/dose?
 Collection schedule?
 Compartmentalization of the
AI boar stud (Black – Grey –
White)
 Effective cleaning/disinfection
– hygienic concept?
 Personal movement or
fluctuation?
 Protocol of temperature
profile?
 Resources in estimation of
sperm motility (%)?
 Retained samples?
 Self-monitoring (volume,
sperm concentration,
microbiology)?
Table 1. Type and frequency of bacterial and fungal contaminants isolated from neat boar ejaculates
and from extended boar semen in 24 different AI boar studs (n = 344)
Bacterial isolate
Frequency of isolation (n)
Neat boar ejaculates
Extended boar semen
Gram-negative nonfermenters
Acinetobacter sp.
42
-
Achromobacter sp.
-
3
aerobic sporformers
55
-
Alcaligenes sp.
2
-
Chryseobacterium sp.
6
-
Empedobacter brevis
10
-
Moraxella sp.
7
-
Myroides sp.
-
1
38
5
Ralstonia pickettii
-
10
Rhizobium radiobacter
2
1
Shewanella sp.
1
-
Sphingobacterium sp.
1
-
Sphingomonas sp.
2
1
Stenotrophomonas maltophila
-
1
Pseudomonas sp.
Weeksella sp.
3
-
Not typable
14
1
Citrobacter sp.
16
-
Escherichia coli
23
-
Edwardsiella sp.
1
-
Enterobacter sp.
4
13
Klebsiella sp.
6
7
Morganella morganii
1
-
Enterobacteriaceae
Pantoea sp.
3
-
Proteus sp.
10
5
Providencia sp.
6
-
Serratia sp.
1
2
Aeromonas sp.
1
1
Pasteurella sp.
5
-
Vibrio parahaemolyticus
1
-
Leifsonia aquatica
-
18
Rhodococcus sp.
-
4
179
3
Enterococcus sp.
23
7
Lactobacillus sp.
22
-
Other Gram-negatives
Coryne-shaped rods
Not typable
Other Gram-positives
Micrococcus sp.
6
-
Staphylococcus sp.
143
4
Streptococcus sp.
76
2
Fungi
Moulds
3
-
Yeasts
21
5
Table 2. Antibiotic sensitivities of bacteria isolated from extended porcine semen (n = 344)
CTX30
CN10
N30
AK30
SH10
TE30
DA2
TY30
ENR5
PB300
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
S
S
I
R
Aeromonas hydrophila (n = 1)
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
Coryne-shaped rods (n = 3)
R
R
R
R
S
S
R
I
R
R
R
S
I
R
Enterobacter aerogenes (n = 1)
R
R
S
R
R
R
R
S
R
R
R
R
S
S
Enterobacter cloacae (n = 12)
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
Enterococcus sp. (n = 7)
S
S
I
R
R
R
R
R
R
R
R
S
I
R
Gram-negative nonfermenter (n = 1)
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
R
S
S
R
Klebsiella oxytoca (n = 7)
R
R
S
R
R
R
R
S
R
R
R
R
S
S
Leifsonia aquatica (n = 18)
S
S
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
Myroides sp. (n = 1)
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
S
S
S
R
Proteus mirabilis (n = 5)
R
R
S
R
R
S
R
R
R
R
R
R
S
R
Pseudomonas fluorescens (n = 5)
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
R
R
S
S
Ralstonia pickettii (n = 10)
R
R
S
R
R
R
R
S
R
R
R
S
S
R
Rhizobium radiobacter (n = 1)
S
R
S
R
R
R
R
S
R
R
S
S
S
S
Rhodococcus sp. (n = 4)
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
R
R
S
S
Serratia marcescens (n = 2)
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
Sphingomonas paucimobilis (n = 1)
S
S
S
R
S
S
S
S
S
R
S
S
S
R
Staphylococcus epidermidis (n = 2)
S
R
S
R
S
I
R
R
R
R
S
S
S
R
Staphylococcus spp. (n = 2)
R
R
S
R
S
S
R
R
R
S
S
S
S
S
Streptococcus faecalis (n = 2)
S
S
R
R
R
R
R
S
R
R
R
S
S
R
Streptococcus sp.(n = 2)
S
S
S
R
R
R
R
R
R
I
S
S
I
I
SXT25
PG10
Achromobacter sp. (n = 3)
RL25
Bacteria (n = number of isolates)
AMP10
Antibiotic (disk concentration)
S = Sensitive; R = Resistent; I = Intermediate; AMP10 = Ampicillin; PG10 = Penicillin; CTX30 = Cefotaxim; CN10 = Gentamicin; N30 = Neomycin; AK30 = Amikacin; SH10 =
Spectinomycin; TE30 = Tetracyclin; DA2 = Clindamycin; TY30 = Tylosin; RL25 = Sulfonamid; SXT25 = Trimethoprim/Sulfonamid; ENR5 = Enrofloxacin; PB300 = Polymyxin B; n =
samples from which the bacteria were isolated. Susceptibility testing was performed via agar disc diffusion following the standards and breakpoints given by the CLSI [12].
Table 3. Analysis of hygienic weak points in 24 different AI boar studs
Boar stud
Weak points
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
T
U
V
W
X
Mean
±S
D
Dyes
-
5
1
5
1
4
1
3
-
-
-
-
-
1
1
-
1
-
1
1
1
1
3
1
1.9
1.5
Ejaculate transfer (pneumatic tube/passthrough)
5
4
2
6
4
4
5
2
5
3
6
-
2
4
4
5
2
4
2
5
3
3
4
4
3.8
1.3
Extender
2
5
1
3
1
3
1
1
3
3
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
2
1
1
3
1.8
1.1
Heating cabinets
5
-
2
-
5
5
5
6
1
4
-
4
4
5
5
-
5
3
5
5
4
3
4
5
4.3
1.2
Hoses/Dispensers
2
1
1
-
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
3
1.2
0.5
Inner face of dilution tank lids
5
1
1
2
1
1
1
2
2
5
2
1
1
2
1
4
1
1
1
1
2
1
5
5
2.0
1.3
Lab surfaces
4
4
1
4
5
4
3
2
2
2
3
1
2
1
3
5
1
6
4
4
1
1
3
3
2.9
1.5
Manual operating elements (keyboard)
6
4
3
5
4
4
5
3
4
3
3
4
4
2
4
5
2
4
4
4
3
3
4
5
3.8
1.0
Ultrapure water treatment plants
3
5
1
3
1
3
1
3
4
2
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1.8
1.2
Washbasins
6
5
3
2
5
4
4
5
2
2
6
4
1
2
4
5
3
6
3
5
6
3
5
2
3.9
1.5
Mean
4.2 3.8 1.6 3.8 2.8 3.3 2.7 2.8 2.7 2.8 3.3 2.1 1.9 2.0 2.5 3.4 2.0 3.0 2.3 2.8 2.4 1.9 3.1 3.2
±SD
1.6 1.6 0.8 1.5 1.9 1.3 1.9 1.6 1.4 1.2 1.8 1.6 1.3 1.4 1.6 2.0 1.3 2.1 1.6 1.9 1.6 1.0 1.6 1.5
Valuation code:
1
2
2
2
3
2
4
2
5
2
6
1 = 10 CFU/ml or 1 CFU/cm ; 2 = 10 CFU/ml or 5 CFU/cm ; 3 = 10 CFU/ml or 45 CFU/cm ; 4 = 10 CFU/ml or 80 CFU/cm ; 5 = 10 CFU/ml or 100 CFU/cm ; 6 = 10 CFU or
2
>100 CFU/cm
Table 4. Content and composition of ten analyzed diets
Content & Composition
Gross Energy, MJ kg
Ash, %
Crude protein, %
Crude fat, %
Crude fibre, %
Lysine, %
Methionine, %
Ca, %
P, %
Na, %
-1
Mg, g kg
-1
Cu, mg kg
-1
Zn, mg kg
-1
Mn, mg kg
-1
Fe, mg kg
-1
Se, mg kg
-1
Co, mg kg
-1
J, mg kg
-1
Vitamin A, IE kg
-1
Vitamin D3, IE kg
-1
Vitamin E, mg kg
-1
Vitamin C, mg kg
-1
L-carnitine, mg kg
-1
Biotin, mg kg
Phytase, FTU
-1
Percentile
minimum value
25%
median
75%
maximum value
11.4
4.9
15.5
2.5
4.5
0.8
0.3
0.75
0.46
0.15
1.5
10.0
65
68
75
0.3
0.15
0.4
14000
1600
80
300
20
2.15
400
11.9
6.0
16.5
3.0
6.0
1.0
0.3
0.8
0.6
0.2
1.6
13.5
100
73
135
0.4
0.2
0.8
15000
2000
120
650
24
2.2
500
12.1
6.5
17.3
3.3
6.5
1.1
0.4
0.9
0.7
0.3
1.6
15.0
128
80
203
0.4
0.3
2.0
16000
2000
150
1000
28
2.3
625
12.3
6.5
18.4
4.3
7.0
1.2
0.5
1.0
0.8
0.3
1.7
20.0
132
83
244
0.5
0.7
3.0
22000
2000
200
1100
35
2.4
770
13.0
7.6
19.0
4.6
9.0
1.35
0.65
1.2
0.8
0.3
1.7
27
149
138
385
0.5
0.8
4.0
25000
3000
250
1200
50
2.5
830
GfE*
11.4-12.6
max 6.0
16.5
min 5.0
5.0-6.0
0.8-0.85
0.65
0.8
0.6
0.25
0.4
8.0
50
25
80
0.15
0.5
20000
2000
25
500
60
0.28
500
* Ausschuss für Bedarfsnormen der deutschen Gesellschaft für Ernährungsphysiologie
(Empfehlungen für die Energie und Nährstoffversorgung von Schweinen, 2006, DLG-Verlag, Frankfurt am Main,
Germany)
Figure 1. Proportion of progressively motile sperm after 48-hr storage and thermo resistance test (n =
344). Results are represented as box-plot highest, respectively lowest values (Whisker), as interquartiles between quartiles 1 and 3 (box), and as median value. White boxes represent one-phase (n
= 7) and grey boxes multi-phase (n = 17) boar semen preservation in 24 different AI boar studs. *
Significant difference compared to multi-phase boar semen preservation (P < 0.001).
Figure 2. Proportion of membrane-intact sperm after 168-hr storage (n = 344). Results are
represented as box-plot highest, respectively lowest values (Whisker), as inter-quartiles between
quartiles 1 and 3 (box), and as median value. White boxes represent one-phase (n = 7) and grey
boxes multi-phase (n = 16) boar semen preservation in 23 different AI boar studs. * Significant
difference compared to multi-phase boar semen preservation (P < 0.001).
Figure 3. Pre-collection pen (“warming-up” area)
Schulze 2011
Figure 4. Sperm numbers per ejaculate produced daily in 22 different AI boar studs (n = 1320). Results are
represented as box-plot highest, respectively lowest values (Whisker), as inter-quartiles between quartiles 1 and 3
(box), and as median value.
Acknowledgement
Studies underlying this report were supported by the Development Association for Biotechnology Research (FBF,
Bonn, Gemany).
References
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Responsabilidade do veterinário no uso de antibióticos no sêmen
KF Weitze & Dagmar Waberski
Universidade de Medicina Veterinária Hannover, Alemanha
Responsabilidade do veterinário no
uso de antibióticos no semen
KF Weitze & Dagmar Waberski
Universidade de Medicina Veterinária Hannover, Fundação
Simposio Minitube 15.05.2012 Porto Alegre
Responsabilidade do Veterinário:
Definição:
O código europeu de conduta etica-profissional do
veterinário dice, que todas as atuações devem ser
dirigidas a
…manter o bem estar animal, …assegurar uma
manutenção adequada e
…..manter o bem estar público…
(bem estar público = saude pública )
Desafio para a saude pública:
A saude pública do mundo esta atualmente
ameaçada por falta de possibilidades de combater
infecções causadas de germes multi-resistêntes a
antibióticos
Hospitalismo humano
USA: ~ 70% das infecções hospitalares são
resistêntes contra 1 antibiótico pelo menos !!!
frequentemente cepas multi-resistentes
Estimação : 2 milhões infecções adquiridas no
hospital = 90.000 mortos (2004)
Europa: 3 milhões infectados = 100.000 mortos
(2005)
Alemanha: 500.000 infecções hospitalares /ano
50.000 mortos
Problema principal:
Bactérias multiresistêntes
Causas:
Uso indiscriminado de antibióticos na medicina,
medicina veterinária e produção animal
Dimensões na produção animal :
dados de 1996 / 1998
Uso de antibióticos na agricultura: criar um
reservatório de genes de resistência ?
Tipo de antibiótico
Animal (1996)
Beta-Lactam-Antibióticos 121.603 kg
(penicillinas, cefalospor.)
Tetraciclinas
Humano (1997/98)
314.498 kg
323.151 kg
47.500 kg
Aminoglicosideos
37.058 kg
5.409 kg
Macrolideos (p.e.
eritromicina)
71.222 kg
47.696 kg
J. Harvey and L. Mason (1998): Use and Misuse of Antibiotics in
Agriculture, Part 1, Current Usage; published by Soil Association
Pontos de ataque de antibióticos na celula bacteriana
Uso de antibióticos na Medicína Veterinária; Alemanha (em toneladas)
,,
,
Problema principal:
Bactérias multiresistêntes
Aspecto a considerar:
Uso indiscrimado na conservação de semen
suino
Problemática no campo… :
Numa serie de centrais existe um problema de
contaminação do semen
principalmente causado por falta de higiene nos
diferentes passos de produção (da coleta ate a
confecção no laboratorio)
Resultado:
Na tentativa de dominar a situação…
…se aplica cada vez mais antibioticos no diluente,
com cambios frequentes dos antibióticos usados…
Agravado pelo fato que se usa mesclas de
antibióticos (não declarados?) para aplicar no vaso
de coleta…
Os chamados „Cocktails de antibióticos „
„Cocktails de antibioticos“ no mercado
aplicado no vaso de coleta, para combater uma
possivel contaminação ja desde o inicio…
tecnologia ofrecida como solução para o problema
higiénico, existente em algunas centrais
Risco dos „Cocktails de antibióticos“
Aparte do risco sanitário local existe um aspecto
muito mais grave…
criação / propagação de resistência
contra antibióticos
que tem grande importáncia para a
Saude pública humana
O que é resistência?
Uma çepa bacteriana é resistente contra um
antibiótico, quando alta dosagem não consegue
parar o crescimento
O antibiótico queda sem efeito
Resisténcia natural (primária)
Insensibilidade genética contra um
antibiótico (vácuo efectivo)
(Cephalosporinas sem efeito contra Enteroccus,
Ampicillina sem efeito contra Pseudomonas)
Resisténcia adquirida (secundária)
Perda do efeito
Mutação: deactivação da DNA-polimerase (lectura de correcção
deactivada „proof reading“)
Transferéncia: plasmidos,transposons/integrons transmitem
informação genética
Outras vias: proteinas alternativas, proteinas inactivadas,
modificação posttranslacional (força de ligação reduzida), difusão
reducida, bomba de efluxo, superprodução do proteina inactivado,
metabolismo alternativo, biofilmes, entrada a celulas do corpo etc.)
Repetimos…
Uso contínuo de antibióticos e desinfectantes
causa resisténcia!
Resistências são transmissiveis dentro e entre
çepas bactérianas e são hereditáriamente
transmitidas a gerações siguentes
Especies diagosticadas Gram
Burkholderia
Escherichia Coli
Pseudomonas aerug.
Proteus
Klepsiella
Enterobacter
Stenotrophomonas
Citrobacter
Enterococcos
Bacillus subtilis
Morganella
Aeromonas
Streptococcus
Acinetobacter
Corynebacterium
Alcaligenes xylosantes
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus
Weyand Althouse
2005 n=52 2008 n=256
-ä
+
+
+
+
33,3 %
9,8
9,8
9,8
9,8
7,8
5,9
3,9
3,9
sing
sing
sing
sing
sing
sing
0
0
0
6,4 %
6,4
6,4
1,9
13,3
1,18
6,6
0
20,5
2,73
0
sing
0
2,3
5,5
13,3
10,3
6,6
1. As especies
marcadas em
vermelho são
completamente
ou parcialmente
resistêntes
2. As marcadas em
azul mostram
grande variação
regional
Serratia marcescens:
Bacterias ubiquitarias em solo, agua, animais,
plantas. Formam um pigmento roxo. Causam no
humano Inflamações urinarias, Septicaemia,
Pneumonia, Endocardite, Meningite,
Osteomielite. Letais para corais (desaguas
humanas). Resistente contra antibioticos do tipo
β-lactam (Penicillinas, Cefalosporinas).
Problemas na Medicina Veterinaria:
Otite interna nos canidos, abscessos na pele,
enterite, mastite, vaginite, endometrite,abortos
(vaca, egua), endocardite traumatica no bovino,
infecções Pdo olho no equino, pneumonia necroticapurulenta, inflamações da mucosa bucal e
abscessos e infecções gerais nos reptiles .
Em centrais provocam contaminações
desastrosas do semen, causando
danos espermátologicos gravissimos.
Combate quasi impossivel.
www.gefor.4t.com/.../serratia01.jpg
www.sciencephoto.com/image/121591/large/C0058.
Pseudomonas aeruginosa:
resistências múltiplas contra antibióticos;
representa mais que 10% dos germes de
„hospitalismo“ na Europa. Germe de solo e
agua (meio humedo). Sobrevive tambem em
agua destilada e certos desinfectantes e
cresce, quando rastros minimos de
substâncias orgánicas estão presentes.
microscopic image of ''Pseudomonas aeruginosa''
(ATCC 27853). {{GFDL}}
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:
P-aeruginosa_pigment.jpg&filetimestamp=20080503160055
Estafilococcus aureus:
representa mundialmente aprox. 25%
dos germes de „hospitalismo“;
resistênte contra chinolonas,
tetraciclinas, aminoglicosidios,
eritromicina, sulfonamideos.
Parcialmente resistente contra
Vancomicina, Oxacillina.
MRSA = Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus
MRE = Multi-resistente Erreger
ORSA = Oxacillin-resistenter Staphylococcus aureus
VISA = Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus
VRSA = Vancomycin-resistenter Staphylococcus aureus
aber auch
MRSA = Multi-resistenter Staphylococcus aureus[4]
Estratégia para o problema higiénico:
Em vez de intensificar o uso de antibióticos… com
consequências a longo prazo desastrosas…
Planificar / organizar / realizar um
sistema de higiene
para reduzir significatívamente a contaminação
Porque higiene é tão importante?
• Semen puro quasi sempre contem bacterias
• Plasma seminal e diluente são meios perfeitos de crescimento
• Semen porcino é preservado a temperaturas relativamente altas
• Crescimento bacteriano acontece rapido, em forma exponencial
• Muitos tipos diferentes de bacterias estão presentes
• Antibióticos adicionados ao diluente tem eficiência limitada
• Bacterias podem desenvolver resistência contra antibióticos
• Bacterias se adaptam facilmente e podem sobreviver no laboratorio
tambem em condições precárias
• Resistência contra antibióticos pode ser criada no laboratorio !
Situação nas centrais:
A presença simultânea de reservatórios de germes
e antibióticos / desinfectantes favorece resistência.
Esta situação surge facilmente nas centrais
(semen diluido com bactérias e antibióticos).
Resistência surge especificamente no lab
„Hospitalísmo“
„germes de hospitalísmo“:
- resistência múltipla contra antibióticos
- crescimento tambem em agua e desinfectante
- dificilmente combativel
p.ex. Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia,
Stenotrophomonas maltophilia, Serratia marcescens
O que podemos
fazer ??
Solução do problema:
Reduzir a contaminação
Estratégias:
 coleta de ejaculados pouco contaminados
 preparação higiênica do semen
- Eliminação de reservatórios de germes,
especialmente quando se usa antibióticos
- plano de controle higiênico
A produção de semen suino livre de
contaminação é possivel !
A situação de higiene depende
da central de semen
lembramos-nos…
Número bacteriano no semen suino
pode ser diminuido!
Desenvolvimento de bacterias multi-resistêntes
Amplo contacto entre semen e antibióticos
provoca resistência antimicrobial
Problemas:
• Reservatório de semen no laboratório
• Desenvolvimento de biofilmes
• Uso de „antibiotic cocktails“
• Cambio de antibióticos, quando surge um
problema bacteriológico
Reservatório de semen no laboratório
„Lagoas de semen“ nas bacias
Trapos…
forma excellente de distribuir
bacterias (plus antibióticos)
atravez de todo laboratório
Reservatório de semen no laboratório
Esgotos no laboratório …
lugar perfeito para
crescimento bacteriano e
criação de resistência
anti-microbiana
Desenvolvimento de biofilmes
Adhesão de
microorganismos
flutuantes
Fixação via
estruturas de
adhesão celular
Colonização via
Liberação de
divisão celular e
microorganismos
recrutamento;
desenvolvimento de
resistência antibiotica
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Biofilm.jpg
Medidas de higiene
• Conhecer as fontes de contaminação
• Desenho de construções e espaços
• Mobiliario e material
• Estabelecer guias sanitarias para coleta
e processamento de semen
• Criar e treinar pessoal consciente das
necessidades de higiene
• Monitoreamento de pontos criticos de control
Higiene no procesamento de semen
• Fluxo de trabalho „em linea“
• só equipo e material necessario no laboratorio
• Preferir produtos de uso único ou esterilizados
• Usar só trapos e toalhas de uso único
• Evitar armazenar diluente ate o proximo dia ou mais
• Evitar uso de corantes de semen
• Restos de semen não nas pias / esgotos no laboratório
Laboratório:
„fluxo de trabalho em linea“
Exame de
Semen
Diluição
Envase
Armezenar
Bancos de trabalho em linea, distâncias cortas
„Fluxo de trabalho cruzado“
Exame
de semen
Envase
Armazenar
Diluição
Muitos cantos, muitas vias cruzadas:
Risco maior de contaminação
Guias sanitárias
• O que dever ser limpado e desinfectado?
• Quais quimicos e equipamento usar?
• Qual é o metodo de limpeza/desinfecção?
• Que roupa protetiva se leva e que
precauções são consideradas?
• Quando se deve limpar/desinfectar?
• Quem executa limpeza/desinfecção?
• Quais são as medidas de monitoreamento?
Monitoramento de crescimento bacteriano
A) Controle rotinário:
- semen diluido finalmente depois de 48 h:
mensual: 1 % das coletas totais mensuais ou:
4 amostras/semana (ou mais)
(Althouse et al. 2003)
B) Quando se detecta contaminação
bacteriana:
- monitorar todos passos do procesamento de
semen
Monitoramento de contaminação bacteriana:
Um caso da prática de IA:
Spermatologia:
A 72 h de idade do
semen :
- Agglutinações
- Perda de motilidade
- Dano da membrana
Microbiologia:
- Serratia especies
- Klebsiella oxytoca
resistênte a
antibióticos comuns
Monitoramento de contaminação bacteriana
Agua
Serratia/
Klebsiella
̶
̶
Caldeira,Tampa, Tubos
Diluente (pólvora)
̶
Diluente (liquido)
+
Semen diluido
+
A solução:
Pequenos furos no
remo usado para
misturar o diluente
Remo em uso - diluente
entra no cabo oco
Furos
Remo depois limpeza,
posição de secagem
Diluente,
incubado
a temp.
ambiental
Mensagem de levar a casa
1. Identificar problemas bacterianas
2. Verificar a fonte de contaminação,
em vez de cambiar o antibiótico
Cambio de antibióticos não resolve os problemas!
Esta creando novos problemas, i.e. resistência,
se a fonte de contaminação não é identificada!
Conclusões
• Semen diluido porcino é susceptivel a bacterias
• Regras principais:
 Coleta de semen com conteudo bacteriano baixo
 Processamento de semen sem contaminação adicional
 Prevenção de crescimento de bacterias no armazenamento
• Medidas higienicas devem incluir:
 Guias sanitarias eficientes
 Consciência profunda higiénica do pessoal da central
 Sistema eficiente de monitoramento para identificar a presença
e a origem da contaminação bacteriana
Voltando aos „cocktails de antibióticos“:
Consequências do uso rotinario
● Resistência bacteriana pre-programada
● Antibióticos não são declarados
● Cepas bacterianas e susceptibilidade variam muito
● Uso indiscriminado em todas centrais é irresponsável
● Responsabilidade para saude pública comprometida
Recomendação:
• não usar o „cocktail“; realizar antibiograma e
• estabelecer programa de monitoramento higiénico
• aplicar regras internacionais de bioseguridade ja
definidas
• aplicar programas de emergência só em casos
agudos
Obrigado pela
atenção !
Cachaço
Charlie, idade
atual 15 anos
Novos conceitos na diluição do ejaculado suíno: como as células espermáticas respondem aos
desafios impostos?
Prof.Dr.Dr.h.c Karl Fritz Weitze
Escola Superior de Medicina Veterinária de Hannover, Alemanha
Podemos distinguir desafios fisiológicos aos espermatozoides (SPZ) que existem na monta natural como na
Inseminação artificial (IA). Outro desafio surge quando queremos preservar o sêmen através de diluição e
refrigeração.
Devido à situação fisio-anatômica da porca, os SPZ devem superar uma distância enorme entre o lugar da
deposição do sêmen no canal cervical da fêmea e o lugar da fertilização no oviduto. Na fêmea adulta, isso significa
aproximadamente 2 m de cada lado, devido ao comprimento dos cornos uterinos. Apesar de este caminho ser
percorrido passivamente pelos SPZ, pois os cornos transportam o líquido seminal ao longo do órgão, este transporte
resulta numa perda enorme numérica devido à eliminação por fagocitose e transporte retrógrado durante as primeiras
horas depois da inseminação.
No suíno, esta perda numérica significativa é compensada pelo alto número de SPZ aplicados durante a
inseminação, que pode alcançar 50 bilhões ou mais na monta natural e entre 2 e 3 bilhões na IA. Em comparação ao
bovino, no suíno trata-sede uma inseminação intracervical com transporte imediato do líquido seminal a cavidade
uterina, ou seja, de fato é uma inseminação intrauterina, enquanto no bovino o sêmen é depositado fisiologicamente
em forma intravaginal e os espermatozoides devem subir ativamente pelo canal cervical ao útero. O volume do
ejaculado do touro é, em comparação ao suíno, muito reduzido e compreende 6 até 8 ml no meio, enquanto o
ejaculado do cachaço alcança facilmente 500 ml ou mais. Estas diferenças fisiológicas entre bovino e suíno tem
importância considerável para a preservação e devem ser consideradas nas técnicas aplicadas.
O segundo desafio surge quando os SPZ, que se encontram nas pontas dos cornos uterinos, estão entrando
nos ovidutos. Esta entrada é um processo ativo, em que as células têm que subir pelas pregas da união úterotubárica que desembocam em pregas longitudinais do istmo. Esta barreira resulta numa redução numérica
considerável, uma vez que apenas alguns mil de SPZ alcançam o lúmen do oviduto. O terceiro desafio representa
atividades ainda pouco investigadas das células espermáticas, pois elas perdem a atividade, ligando-se ativamente
ao epitélio do istmo. Os sinais para esta ligação e para a posterior separação e reanimação são apenas parcialmente
conhecidos, mas o que se sabe é que o cálcio está implicado neste processo, que é caracterizado por uma
concentração elevado de bicarbonato no meio. Esta subpopulação de SPZ, considerada competente para a
fertilização, irá posteriormente competir pela penetração da zona pelúcida e a fertilização propriamente dita.
Considerando as metas da preservação do ejaculado, em que o número de SPZ por dose é reduzida enormemente,
o número de SPZ competentes para fertilizar por dose alcança apenas algumas centenas de células.
Visando o temário desta apresentação, temos que considerar outros desafios ligados a preservação, que
dificultam manter a fertilidade das células preservadas.
Podemos distinguir três maiores desafios existentes na preservação do sêmen líquido suíno. Devido ao alto
número de SPZ ainda necessário por dose de IA, o ejaculado na rotina das centrais é diluído apenas em forma
reduzida, resultando num número limitado de doses por ejaculado. Para cumprir as exigências de uma genética
moderna, existe a necessidade de aumentar o número produzido por ejaculado, com a consequência de aumentar a
cada ano o grau de diluição dos ejaculados de cachaços de alta genética. Com o aumento gradual de diluição, ocorre
uma eliminação gradual do plasma seminal, chegando à uma situação, em que o plasma seminal restante é muito
pequeno, alcançando facilmente menos de 5 % do original, correspondendo a um grau de diluição de 1 : 20 ou um
número de SPZ por doses inferior a 1 bilhão. Esta eliminação, resultado de uma aplicação brusca de alto volume de
diluente, causa transtornos imediatos para o metabolismo e equilíbrio osmótico das células espermáticas. Estes
transtornos são às vezes associados a choque térmico brusco, quando o diluente adicionado não corresponde à
temperatura do ejaculado. Então a alta sensibilidade térmica dos SPZ do suíno ainda aumenta consideravelmente o
estresse causado pela eliminação do plasma seminal. Choque de diluição e choque térmico são então dois desafios
ainda não resolvidos na preservação do sêmen líquido. Considerando a necessidade de prolongar o tempo de
sobrevivência das doses, para inseminar com sêmen do mesmo ejaculado quando o estro das fêmeas está mais
prolongado, surge o desafio do envelhecimento das células durante o armazenamento.
As estratégias de uma preservação moderna de sêmen líquido devem considerar diferentes fatores como:
diluentes, agentes específicos de proteção nos diluentes, o plasma seminal e sua eventual substituição por agentes
semelhantes, e finalmente a variação fisiológica entre os ejaculados dos cachaços, além do número de SPZ e o
volume de plasma seminal (ejaculados “ricos” e “pobres” em SPZ e plasma seminal).
Em experimentos espermatológicos foram testados altos graus de diluição entre 1 : 3 e 1 : 140, produzindo
assim doses com um número de SPZ entre 2,5 bilhões e 0,5 bilhão.
Fig.1
Efeito de altos graus de diluição ( 2,5; 1 e 0,5 bilhões) e meio
de conservação (BTS vs AndrostarPlus) sobre a motilidade
progressiva, n=6, +16°C
100
90
80
70
BTS 2,5
60
AstarPlus 2,5
BTS 1
50
AstarPlus 1
40
BTS 0,5
30
AstarPlus0,5
20
10
0
2,5 2,5
1
1
0,5 0,5
2,5 2,5
d0
1
1
0,5 0,5
2,5 2,5
d3
1
1
0,5 0,5
d5
Fig. 2
Efeito de altos graus de diluição ( 2,5; 1 e 0,5 bilhões) e meio
de conservação (BTS vs AndrostarPlus) sobre morfologia
acrossomal, n=6, +16°C
25
20
BTS 2,5
AstarPlus 2,5
15
BTS 1
AstarPlus 1
10
BTS 0,5
AstarPlus0,5
5
0
2,5 2,5
1
1
d0
0,5 0,5
2,5 2,5
1
d3
1
0,5 0,5
2,5 2,5
1
1
0,5 0,5
d5
Independente do efeito dos diluente usados nos experimentos, o aumento da diluição de 2,5 a 1 bilhão de
SPZ por dose mostrou uma redução significativa da motilidade e do aumento de acrossomas defeituosos, que depois
da diluição a 0,5 bilhões de SPZ por dose foi mais acentuado ainda (Fig. 1 e 2). Este efeito foi verificado usando
diferentes diluentes como BTS, AndrostarPlus e AndrohepPlus (Fig. 3 e 4), verificando um efeito protetor adicional
significativo dos diluentes.
Fig.3
Altas taxas de diluição (2,5; 1,5, 1 bilhão) e efeito de
diluentes (AndrohepPlus vs AndrostarPlus), Motilidade
100
90
80
70
AhepPl 2,5
60
AstarPl 2,5
AhepPl 1,5
50
AstarPl 1,5
40
AhepPl 1,0
30
AstarPl 1,0
20
10
0
2,5 2,5 1,5 1,5 1
d0
d3
d5
1
d7
Fig.4
Altas taxas de diluição (2,5; 1,5, 1 bilhão) e efeito
de diluentes (AndrohepPlus vs AndrostarPlus),
Acrossomas defeitas
14
12
10
AhepPl 2,5
AstarPl 2,5
8
AhepPl 1,5
AstarPl 1,5
6
AhepPl 1,0
4
AstarPl 1,0
2
0
2,5 2,5 1,5 1,5 1
d0
d3
d5
1
d7
Para compensar a perda de plasma seminal depois de altas diluições, realizou-se experimentos de
substituição de plasma seminal por 10% e 20% em sêmen preservado em BTS, AndrostarPlus e AndrohepPlus com
1 e 0,5 bilhões de SPZ por dose. Independente do diluente usado, a adição de 10 ou 20% de plasma seminal
resultou num aumento significativo de motilidade e diminuição de acrossomas defeituosos, mantendo o efeito protetor
dos diluentes anteriormente usados (Fig. 5, 6, 7, 8, 9, 10).
Fig.5
BTS
V 03 2008 Seminal-Plasma
MOT progr.:
1 u. 0,5
/ 0, 10, 20 % Seminalplasma;
16°C, n=4
Motilidade:
0%,BTS:10%,
20
%Mrd.plasma
seminal
120
1bilhão
100
0% 10%
0,5 bilhões
20%
0% 10% 20%
BTS 1,0
MOT progr %
80
BTS 1,0 10
BTS 1,0 20
60
BTS 0,5
BTS 0,5 10
40
BTS 0,5 20
20
0
d0
d5
BTS 1,0
91,6
66
BTS 1,0 10
94,2
82,7
BTS 1,0 20
94,5
89,7
BTS 0,5
88,6
27
BTS 0,5 10
90,6
63,8
BTS 0,5 20
93,9
76,1
Lagerzeit d
Fig.6
BTS
V 03 2008 defeitas;
Seminalplasma BTS:0%,
Defekte Akrosome:
u. 0,5 Mrd.,plasma
0, 10, 20 % Seminalplasma,
16°C, n=4
Acrossomas
10%, 120%
seminal
1bilhão
10
0% 10%
9
0,5 bilhões
20%
0% 10% 20%
Defekte Akrosome %
8
7
BTS 1,0
BTS 1,0 10
6
BTS 1,0 20
5
BTS 0,5
4
BTS 0,5 10
3
BTS 0,5 20
2
1
0
d0
d5
BTS 1,0
3,8
6,8
BTS 1,0 10
2,3
5,3
BTS 1,0 20
1,8
4,5
6
7,9
BTS 0,5 10
3,5
7,2
BTS 0,5 20
2,3
BTS 0,5
6,3
Lagerzeit d
Fig. 7
AndrostarPlus
V 4 2008 MOT progr (n=5): Zusatz von Seminalplasma(10 u. 20%) bei hoher Verdünnung (1,0 und 0,5 Mrd. pro 100
AndrostarPlus
vs AndrostarPlus
+10% vs
AndrostarPlus + 20%, 16°C
Motilidade: 0%,ml);10%,
20%
plasma
seminal
1bilhão
100
0% 10%
90
0,5 bilhões
20% 0% 10% 20%
MOT progr
80
70
AstPl 1,0
60
AstPl 1 10
AstPl 1 20
50
AstPl 0,5
40
AstPl 0,5 10
30
AstPl 0,5 20
20
10
0
d0
d5
AstPl 1,0
89,5
81,8
AstPl 1 10
92,9
92,1
AstPl 1 20
94
93,9
AstPl 0,5
88,4
50,3
AstPl 0,5 10
93,7
78,8
AstPl 0,5 20
94,8
88,8
Lagerzeit Tage
Fig. 8
AndrostarPlus
V 4 2008 GAR (n=5): Zusatz von Seminalplasma ( 10 u. 20%) bei hohen Verdünnungsraten (1,0 u. 0,5 Mrd. pro 100
Acrossomas
defeitas;
10%,
plasma
seminal
ml) (n=5):
AndrostarPlus vs 05;
AndrostarPlus
+10%20%
vs Androstarplus
+20 %, 16 °C
1bilhão
6
0% 10%
0,5 bilhões
20%
0% 10% 20%
5
AstPl 1,0
4
GAR %
AstPl 1,0 10
AstPl 1,0 20
3
AstPl 0,5
AstPl 0,5 10
2
AstPl 0,5 20
1
0
d0
d5
AstPl 1,0
2,6
3,9
AstPl 1,0 10
1,4
2,7
AstPl 1,0 20
1,2
2,3
AstPl 0,5
2,6
5,3
AstPl 0,5 10
1,8
3,7
AstPl 0,5 20
1,6
2,9
Lagerzeit Tage
Fig. 9
AndrohepPlus
V 5 2008 MOT progr (n=6): Seminalplasmazusatz ( 10 u. 20 %) bei hohen Verdünnungsgraden (1,0 u. 0,5 Mrd. pro
100 ml), AndrohepPlus (Verdü.Mi. D); 16°C
Motilidade; 0%, 10%, 20% plasma seminal
1bilhão
0,5 bilhões
100
0% 10%
20%
0% 10% 20%
90
MOT progr %
80
AhepPl 1
AhepPl 1 10
70
AhepPl 1 20
AhepPl0,5
60
AhepPl0,5 10
AhepPl0,5 20
50
40
30
d0
d5
AhepPl 1
91,1
85,6
AhepPl 1 10
93,5
88,9
AhepPl 1 20
94,3
89,9
AhepPl0,5
88,7
77,8
AhepPl0,5 10
91,7
83,1
AhepPl0,5 20
92,7
84,9
Lagerzeit Tage
Fig. 10
AndrohepPlus
V 5 2008 GAR %, Seminalplasmazusatz (10 u. 20%) bei hohen Verdünnungsgraden (1,0 u. 0,5 Mrd. pro 100 ml),
(Verdü.mischung
16°C
Acrossomas defeitas;AndrohepPlus
0%, 10%,
20%D) (n=6)
plasma
seminal
1bilhão
10
0% 10%
9
0,5 bilhões
20%
0% 10% 20%
GAR %
8
7
AhepPl 1
6
AhepPl 1 10
AhepPl 1 20
5
AhepPl0,5
4
AhepPl0,5 10
3
AhepPl0,5 20
2
1
0
d0
d5
2,7
6
AhepPl 1 10
2
4,7
AhepPl 1 20
1,5
3,8
AhepPl0,5
2,8
7,3
AhepPl0,5 10
2,5
5,8
AhepPl0,5 20
2,3
AhepPl 1
4,8
Lagerzeit Tage
Para diminuir o efeito do choque pelo frio durante e depois da diluição se realizou experimentos usando uma
pré-incubação do sêmen diluído em forma isotérmica a 32°C , facilitando assim aos SPZ de adaptar se a nova
situação antes de baixar a temperatura a +17°C e +10°C. Os experimentos foram realizados usando AndrostarPlus e
BTS como meios de diluição. Uma pré-incubação a 25°C por 24 horas do sêmen altamente diluído mostrou um efeito
claramente significativo em comparação a doses sem pré-incubação. Um armazenamento do sêmen a 25°C até o dia
7 resultou uma perda significativa de motilidade e aumento de acrossomas com defeito em comparação a préincubação curta. Os diluentes mostraram um efeito protetor diferente, como já verificado nos experimentos anteriores
(Fig. 11 e 12).
Para investigar mais detalhadamente o efeito da temperatura do diluente no momento da primeira diluição se
realizou uma diluição isotérmica a 32 °C comparando com um tratamento bitérmico, em que o sêmen foi diluído 1 : 1
com diluente isotérmico, seguido por aplicação do resto do diluente com 22 °C (diluição bitérmica). Os resultados dos
tratamentos 3 e 4 (isotérmico vs bitérmico) mostrou um efeito protetor da diluição isotérmica, indicando que as células
precisam ser adaptados lentamente à descida de temperatura. Os efeitos dos diluentes mostraram diferenças
significativas como nos experimentos anteriores.
Fig. 11
V 12 2010 Eber; MOT progr: AndrostarPlus vs BTS; Var 1: 25-10-17; Var2: 25-10; Var3: 17; Var
4: Vorverd. m it 32°,Nachverd. 22°, dann 17°. n=6
Diluição isotermica vs bitermica
100,0
90,0
AstPl 1
AstPl 2
MOT progr %
80,0
AstPl 3
70,0
AstPl 4
60,0
BTS1
BTS2
50,0
BTS3
BTS4
40,0
30,0
2h
72 h
168 h
AstPl 1
88,6
89,6
86,2
AstPl 2
87,4
87,7
86,9
AstPl 3
88,1
89,7
88,1
AstPl 4
87,5
87,8
86,5
BTS1
86,0
82,7
76,7
BTS2
86,0
81,0
75,9
BTS3
85,1
86,7
83,9
BTS4
84,2
85,4
80,5
Lagerzeit h
Fig. 12
V 12 2010 Eber, Defekte Akrosom e: AndrostarPlus
vs BTS; Var. 1: 25-10-17°;
Diluição isotermica
bitermica
17°; 4:Vorverd. vs
bei 32°,
Nachverd. m it 22°, dann 17°; n=6
2: 25-10°; 3:
30,0
Defkte Akrosome %
25,0
AstPl 1
= Isotermica (32°) vs bitermica (32/22°)
AstPl 2
20,0
AstPl 3
AstPl 4
15,0
BTS1
BTS2
10,0
BTS3
BTS4
5,0
0,0
2h
72 h
168 h
AstPl 1
1,8
4,3
8,1
AstPl 2
1,8
5,5
9,6
AstPl 3
2,3
3,8
6,5
AstPl 4
1,8
4,5
7,5
BTS1
2,5
10,8
16,7
BTS2
2,7
12,2
21,2
BTS3
2,7
6,4
10,7
BTS4
3,0
8,0
12,8
Lagerzeit h
Para avaliar mais detalhadamente a duração da pré-incubação, as amostras foram pré-incubadas por 3 vs 24
horas a 25°C, antes de reduzir a temperatura a 10°C.
Os resultados de motilidade e morfologia dos acrossomas mostraram um efeito protetor da pré-incubação
mais prolongada de 24 horas, com diferenças significativas a favor do diluente AndrostarPlus vs BTS. (Fig. 13, 14)
Fig. 13
Preincubação a +25 °, 3 vs 24 horas
depois a +10°C
Fig. 14
Preincubação a +25 °, 3 vs 24 horas
depois a +10°C
++
Experimentos paralelos investigando o efeito da refrigeração sobre o aumento de Ca intracelular como
indicador de primeiros passos a estimulação de capacitação e posterior reação acrossomal mostraram um aumento
++
significativo de Ca intracelular e uma redução da reatividade específica a sinais de capacitação quando a
temperatura foi reduzida de 17°C a 10°C e 5 °C gradualmente com diferença significativa entre os diluentes BTS vs
AndrostarPlus.( Fig. 15, 16, 17).
Fig. 15
Posiveis causas da refrigeração:
Aumento de [Ca2+]i devido a refrigeração
Refrigeração aumenta [Ca2+]i concentração
(Green and Watson 1981, Simpson and White 1987,
Robertson et al., 1988, 1990)
Refrigeração leva a absorbção de Ca2+ extracelular
e liberação de reservas internas
(Bailey and Buhr 1990)
Fig. 16
Aumento inicial [Ca2+]i em semen refrigerado
% High Ca2+ live sperm, 3min
Idade de semen: 24 h, n = 7)
25
*
20
c
*
15
b
10
BTS
a,b
b
Androstar Plus
a
a
5
* Significant differences
between extenders
0
17°C
10°C
5°C
P<0.05
Aumento de [Ca2+]i em SPZ vivos depende
de temperatura de armazenamento e diluente
Fig. 17
Reactividade especifica a sinais de
Capacitação em SPZ refrigerados
Specific reactivity (%)
60
50
(idade de semen : 24 h, n = 7)
a
a
*
a
b
b
40
BTS
30
c
Androstar Plus
20
10
* Significant differences
between extenders
0
P<0.05
17°C
10°C
5°C
Decida de reactividade especifica depende
de temperatura de armazenamento e diluente
++
Os resultados da ativação de Ca em dependência à temperatura de armazenamento e do diluente usado
indicam claramente o papel da temperatura e de meios de diluição sobre a sobrevivência dos SPTZ.
A conclusão geral dos experimentos é que altas taxas de diluição entre 1 e 0,5 bilhões de SPZ por dose
resultam numa diminuição significativa da motilidade em forma imediata e um aumento de danos acrossomais a partir
do dia 3 de armazenamento. Os diluentes usados nos experimentos mostram um efeito protetor especifico do fator
crioprotetor usado nos diluentes AndrostarPlus e AndrohepPlus. Vale mencionar que a adição de plasma seminal em
casos de altas diluições diminui o efeito negativo em forma significativa, indicando que o fator nocivo de altos graus
de diluição é a falta de um meio ambiental protetor, devido a alterações profundas do metabolismo, especialmente
em relação a estimulação de primeiros passos de capacitação e reação acrossomal como início de degradação das
membranas celulares.
Em relação aos experimentos de pré-incubaçã o com temperaturas elevadas antes de reduzir a temperatura
a valores abaixo de 15 °C, vale mencionar que uma pré-incubação a 25°C por 24 horas aumenta a resistência das
células contra o choque de frio. Os diluentes usados no experimento mostraram efeitos específicos de proteção
adicional.
Experiência e resultados da aplicação do sistema computadorizado de análise espermática (Sperm
Vision) em um programa de inseminação artificial em suínos.
Rafael Kummer
Master Agroindustrial, Videira - SC
Experiência e resultados da aplicação do sistema computadorizado de
análise espermática (Sperm Vision) em um programa de inseminação
artificial em suínos.
Rafael Kummer, PhD
Introdução
- Estrutura Master Agroindustrial;
- Importância estratégica da Central de Produção Semen;
- Utilização C.A.S.A. e avanços tecnológicos;
- Considerações finais.
Master Agroindustrial
• Fundação: 29 abril 1994.
• Negócio: produção e processamento de suínos, em sistema de parceria
com Agroindústrias e Produtores Rurais.
• 600 funcionários
• 30.000 fêmeas próprias
• 21.000 Agroceres – PIC
• 8.000 Db – Danbred
• 1.000 Genetiporc
• Alvo para 2012 (UP) – 830.000 desmamados (28 D/F/A)
Desmamados por ano – unidades próprias
900.000
830.000
800.000
700.000
600.000
560.978
500.000
587.853
442.153
382.939 398.894
400.000
300.000
241.880
271.877
200.000
114.000
100.000
24.000
0
1995
2002
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
Desmamados por ano – unidades próprias
900.000
830.000
800.000
700.000
600.000
560.978
500.000
587.853
442.153
382.939 398.894
400.000
300.000
241.880
271.877
200.000
114.000
100.000
24.000
0
1995
2002
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
Estrutura de produção atual - Granjas
Rio Verde – GO (PIC)
Iomere - SC (DB)
São Roque - SC (PIC)
Agua Doce – SC (Genetiporc)
Carijos e Arroio Fundo
Papanduva – SC (PIC)
Curitibanos – SC (DB)
2012
Estrutura de produção atual – CPS
CPS – Master Carijos
12.000 fêmeas
CPS – Master Curitibanos
8.000 fêmeas
Estrutura de produção atual – CPS
CPS – Master Carijos
Genética - Agroceres PIC
12.000 fêmeas – 55 machos
4 linhagens genéticas
CPS – Master Curitibanos
Genética DB - Danbred
8.000 fêmeas – 40 machos
2 linhagens genéticas
CPS – importância estratégica
1 - Atender demanda de doses, sem risco sanitário;
2 – Produzir sêmen com alto potencial fecundante;
_ Número de sptz na dose
_ Motilidade
_ Morfologia
_ Contaminação
_ Capacidade fecundante macho
3 – Produzir sêmen com custo baixo;
4 – Disseminação de gens;
5 – Processos simples com pessoas responsáveis;
CPS – importância estratégica
Tecnologia x Mentalidade
Knox, 2008
CPS – importância estratégica
Nascidos totais na linha pura (L02) conforme índice genético da mãe;
L02 - EBV
<31
31 a 40
41 a 50
51 a 60
61 a 70
>70
Média
Nascidos Totais
10,0
11,5
12,4
12,8
13,5
14,8
12,1
# Partos
743
674
811
622
407
261
3518
CPS – importância estratégica
Retorno econômico esperado com melhoramento de 10 pontos de índice genético - PIC
Line
R$/animal
337
1,35
327
1,34
415
1,24
1010 – Camb
1,71
1020 - Camb
0,57
18 – Avó
0,34
CPS – importância estratégica
• Realidade 2009:
– 1 bi de sptz por leitão
• (3,5 doses * 3 bi/dose)
• Desafio:
– 0,3 bi de sptz por leitão;
• Melhorar >50% utilização dos melhores gens;
• Manter resultado zootécnico;
Etapas de agregação do conhecimento
Fonte: Vicente Falconi, O Verdadeiro Poder.
Desafio – melhoria >50% utilização genética
– Rever protocolo/método de inseminação artificial
– Garantir qualidade da dose - concentração
– Garantir fertilidade dos macho
Desafio – principais pontos
– Rever protocolo/método de inseminação artificial
• Protocolo 24 hs – intervalo entre doses?
• Método de IA pós cervical?
• Utilização estratégica de machos geneticamente superiores?
• Protocolo leitoas/primíparas?
• Necessidade 4a dose?
• IATF?
Desafio – principais pontos
– Garantia da qualidade da dose/concentração
• Morfologia/contaminação;
• Método de avaliação da concentração – C.A.S.A system;
• Utilização estratégica de diluentes;
Desafio – garantir fertilidade do macho
Baseado em dados atuais pode ser experado de 10 a 15% de machos sub-férteis
em uma central de inseminação artificial
George Foxcroft, 2009.
Fertilidade de machos – fêmeas DB
Macho
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
Média
N
76
81
89
88
87
59
75
82
92
83
78
79
82
80
1131
Taxa de Parto
96,1%
97,5%
93,3%
98,9%
90,8%
98,3%
96,0%
100,0%
93,5%
91,6%
93,6%
91,1%
90,2%
77,5%
93,4%
NT
16,3
16,2
16,1
15,9
15,6
15,5
15,5
15,5
15,3
15,0
14,7
14,5
12,7
10,7
15,0
%MOT 10D
57
53
48
45
50
56
37
54
48
55
46
37
25
20
45
Problema de
morfologia (%)
16
22
15
25
12
17
37
20
20
12
21
22
43
68
25
Aline Kummer – UFRGS (dados não publicados)
Fertilidade de machos – fêmeas Ag-PIC
MACHO
N
TX Parto
NT
MOT 240hs
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
MÉDIA
67
67
68
67
68
70
69
68
66
67
68
68
67
68
948
98.5%
97.0%
92.6%
89.5%
92.6%
94.3%
91.3%
89.7%
92.4%
97.0%
97.0%
94.1%
95.5%
89.7%
93.4%
14.3
14.0
13.5
13.3
13.3
13.2
13.1
13.1
13.0
12.8
12.7
12.6
12.5
12.0
13.1
69.9%
60.6%
69.2%
74.5%
69.6%
62.5%
83.0%
63.2%
46.4%
72.7%
79.2%
67.1%
63.2%
40.3%
65.5%
Problema de
Morfologia (%)
8.6%
12.4%
11.2%
11.4%
17.0%
15.4%
9.8%
10.5%
15.4%
10.7%
6.6%
18.8%
14.0%
7.5%
12.0%
Aline Kummer – UFRGS (dados não publicados)
Inseminação artificial pós cervical (1 bi sptz por dose)
Situação atual
– 10.000 fêmeas com inseminação pós cervical (0,3 bi por leitão nascido);
– 20 machos para 6.000 fêmeas (1:300)
– Controle da dose e qualidade dos machos essencial;
– Necessidade de equipamento para garantia do processo;
Considerações finais
O diferencial sempre serão as pessoas.
Redução do número de espermatozóides na dose: principais cuidados e controles desde a
produção até a inseminação.
Alexandre Marchetti e Ana Paula Mellagi
Minitub do Brasil Ltda, Porto Alegre - RS
Redução do número de espermatozóides
na dose:
principais cuidados e controles desde a
produção até a inseminação.
Alexandre Marchetti
[email protected]
Ana Paula Mellagi
[email protected]
Redução sptz/dose: aplicações
• Planos de contingência
• Aumento do plantel de matrizes
• Redução plantel machos
• redução custos diretos
• Testes de fertilidade dos machos
• Otimização de machos geneticamente superiores
• Ganhos na qualidade da carcaça
Revisão literatura
• Weitze (1991)
- 1,5 x 2,5 bilhões sptz
• Colenbrander (1993)
- 3 bilhões sptz
• Steverink et al. (1997)
- 1 x 3 x 6 bilhões sptz
• Park et al. (1999)
- 1,5 x 2,0 x 2,5 x 3 bilhões sptz
• Marchetti (2001)
- 2 x 3 x 4 bilhões sptz
• Bennemann et al. (2005)
- 1,5 bilhões sptz
Revisão literatura
• Watson & Behan (2002)
- 1 x 2 x 3 bilhões sptz
• Williams (2002)
- 1 x 1,5 x 3 bilhões sptz
• Dallanora et al. (2004)
- 1,5 x 3 bilhões sptz
• Mezzalira et al. (2005)
- 0,25 x 0,5 x 1 bilhão sptz
• Mozo-Martín & Gil (2011)
- 1,5 x 0,75 bilhões sptz
Revisão literatura
Kummer (2012)
Busca de reprodutores sub férteis
2,0 bilhões sptz
Taxa parto & Nascidos Totais
X
Avaliação espermática
Na prática das centrais:
- 3 a 4 bilhões sptz/dose
- Avaliação subjetiva motilidade
- Avaliação morfológica ??
- Efeito macho (subfertilidade)
 Homospermia x heterospermia
- Perdas armazenamento & transporte
- Manejo matrizes: diagnóstico estro e IA
- Mão-de-obra
- Retorno dos dados de produção
?
» 1,8 a 2 bilhões sptz/dose
Fatores a serem considerados
Coleta
Técnica IA
Avaliação
Número sptz
dose
Diagnóstico
Estro &
Protocolo IA
Diluição &
Fracionamento
Transporte
&
Armazenamento
Central de IA – uma visão industrial...
EFICIÊNCIA = QUALIDADE
+
PROCESSOS CORRETOS
MAS EXECUTADOS
INCORRETAMENTE
PROCESSOS CORRETOS
EXECUTADOS
CORRETAMENTE
-
+
EFICÁCIA = RESULTADO
PROCESSOS INCORRETOS
EXECUTADOS
CORRETAMENTE
PROCESSOS INCORRETOS E
EXECUTADOS
INCORRETAMENTE
ONDE ESTÁ NOSSA CENTRAL ??
Coleta de sêmen: higiene
Absoluto cuidado
higiênico
Sem crescimento até
48h após a semeadura!
Bennemann et al., 2000
Goldberg, 2009
Coleta de sêmen: higiene
Coleta de sêmen: higiene
Coleta de sêmen: higiene
Coleta de sêmen: higiene
Coleta de sêmen: higiene
Coleta de sêmen: higiene
Avaliação do ejaculado
Sistema CASA SpermVision
Avaliação do ejaculado: concentração
Avaliação do ejaculado: concentração
Brasil
5 centrais
1.500.000 doses/ano
Sistema CASA SpermVision
Avaliação do ejaculado: concentração
• Broekhuijse et al. (2012)
- 110.186 ejaculados avaliados
- 7429 reprodutores
- Número sptz/dose: 2,7 ± 1,5 bilhões
» 1,2 a 4,2 bilhões sptz
• Amostras recebidas para análise Minitub Brasil
- Variação de ± 30% no número de sptz/dose,
» 3 bilhões
Avaliação: preparo da amostra
2,0 a 4,0 bilhões
Avaliação: preparo da amostra
Avaliação: preparo da amostra
Avaliação: preparo da amostra
Ação centrífuga:
Sptz em direção às laterais
Amostra retirada do centro:
Redução no número de células
Resultado:
Maior número de sptz nas doses
Avaliação: preparo da amostra
Avaliação: preparo da amostra
Avaliação: preparo da amostra
Avaliação: preparo da amostra
Avaliação: morfologia básica
?
Avaliação: morfologia básica
Avaliação: morfologia “completa”
Avaliação: morfologia
Laudos: ferramenta de apoio
Diluentes: função & importância
Proteção das células,
manutenção motilidade e
viabilidade até o momento
da fecundação
Diluentes: função & importância
Qualidade da água: purificação e armazenamento
Qualidade da água: purificação e armazenamento
Qualidade da água: purificação e armazenamento
Qualidade da água: purificação e armazenamento
Qualidade da água: purificação e armazenamento
Controle microbiológico: ferramenta de apoio
Fracionamento: homogeneização
Avaliação: avaliação das doses produzidas
Transporte & Armazenamento
Transporte & Armazenamento
Diagnóstico de estro e Protocolos de IA
Diagnóstico de estro e Protocolos de IA
n
TRE %
TP %
TL
IA
estro
268
6,34
93,4
11,36
IA
Metaestro
60
21,67
77,9
10,13
Marchetti et al., 2000
A cada 100 fêmeas cobertas: 272 leitões a menos
Técnica de IA propriamente dita
Técnica de IA propriamente dita:
cervical x pós cervical
20cm
1,5m
Técnica de IA propriamente dita:
refluxo de sêmen
• Flores (2004)
- IA tradicional e Auto IA (100 ml)
 120 min
 65 a 73% do volume
 28 a 32% das células
• Mezalira et al. (2005)
- IA pós cervical (20 ml)
 60 min
 64 a 68% do volume
 12 a 15% das células
•Fagocitose
•Passagem cav. abdominal
Técnica de IA propriamente dita:
cervical x pós cervical
INFERIOR
Williams, 2002
Leyun Izco, 2004
Rozeboom et al., 2004
Roberts et al., 205
Panzardi et al., 2010
IGUAL
Gil, 2002
Watson & behan, 2002
Valladares, 2003
Dallanora et al., 2003
Padilla-Mota et al., 2004
Cuevas et al., 2005
Llanes-Chalé et al., 2007
Fitzgerald et al., 2008
Dimitrov et al., 2009
SUPERIOR
Williams, 2005
Stancic et al., 2006
Gil et al., 2006
Leyun Izco, 2008
H. Caravaca et al., 2009
Adaptado de Carmen de Alba, 2010
Europa: crise econômica 2008
Espanha e França
Considerações Finais
• Número de células reduzidas:
-
Novos parâmetros: células viáveis/dose
Avaliação objetiva
Uso de diluentes que garantam a viabilidade das células
Maximização da produção
 Qualidade & quantidade
• OTIMIZAÇÃO DOS REPRODUTORES
- % de machos ativos
- Perda de um ejaculado passa a ser muito representativa
 Eficiência x Eficácia da central
Não há margens para erro!
Considerações Finais
3 bilhões sptz/dose
Tx Reposição 50%
1500 doses/macho/ano
3000 doses /vida útil
3 doses x 2,4 partos/ano
416 matrizes
28 terminados/matriz/ano
11.648 leitões
110 kg ao abate
1.281.280 kg de carne
Considerações Finais
3 bilhões sptz/dose
2 bilhões sptz/dose
Tx Reposição 50%
Tx Reposição 50%
1500 doses/macho/ano
15%
1750 doses/macho/ano
3000 doses /vida útil
3500 doses /vida útil
3 doses x 2,4 partos/ano
2 doses x 2,4 partos/ano
75%
416 matrizes
730 matrizes
28 terminados/matriz/ano
11.648 leitões
20.440 leitões
110 kg ao abate
1.281.280 kg de carne
28 terminados/matriz/ano
110 kg ao abate
75%
2.248.400 kg de carne
Considerações Finais
TECNOLOGIAS
BANCO DE DADOS
INFORMAÇÃO
TOMADA DE DECISÕES
Considerações Finais
TECNOLOGIAS
Não resolvem problemas mas proporcionam uma melhor
identificação e geração de um
BANCO DE DADOS
que deve ser analisado e transformado em
INFORMAÇÃO
que resultará na correta
TOMADA DE DECISÕES
Muito Obrigado !
Tecnologia
para todos!

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