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LABORWELT
Nr. 3 / 2003 - Vol. 4
Proteomanalyse
in der AntibiotikaForschung
Marktübersicht
siRNA-Tools/Services
Proteomics
Protein Binding
Analysis with Surface
Plasmon Fluorescence
Expressions-Systeme
in der Proteinforschung
Massiv parallele
DNA-EinzelmolekülSequenzierung
RT-PCR for Measuring
Gene Silencing by RNA
Interference
Automationsfortschritt
in den Proteomics
BIOCOM AG
Das
-Themenheft
I
Zum Thema
N
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Fokus auf Automation
und Proteomics
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INHALT
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REPORT
쑺 Proteomanalyse in der Antibiotikaforschung
BLITZLICHT
쑺 Automatisierte Datenverarbeitung für Proteomics
Nach der Mitte April vom Humangenom-Konsortium gemeldeten
99%igen Entzifferung der humanen Referenz-DNA, geht es jetzt um
die Umsetzung der Genominformationen in medizinisch nutzbringende und gesellschaftlich akzeptierte Produkte. Zwar ist der Weg dorthin noch weit, schreibt NIHGR-Chef Francis Collins in NATURE (24.
April). Aber neuere Entwicklungen in den Feldern Automation, Proteomics und RNA-Interferenz versprechen Effizienzsteigerungen bei
der Funktionsanalyse der Gene und der Targetvalidierung.
Wissenschaftlern der Bayer AG und der Universität Greifswald etwa
ist es unlängst mit Hilfe der 2D-PAGE-basierten Proteomanalyse gelungen, die Wirkungsweise neuer Antibiotika vorauszusagen (siehe
Bericht Seite 4). Und nachdem US-Forscher die Expression von Krebsund Virusproteinen mit Hilfe der RNA-Interferenz erfolgreich verhindert haben, bietet sich die kostengünstige neue Technologie als schnelle Alternative zu Knock-out-Mäusen an (vgl. Seite 22) – um Genfunktionen zu ermitteln und neue Medikamenten-Targets zu finden. Einen
Überblick über die neuen RNAi-Ressourcen – kurze doppelsträngige
RNAs, die sequenzspezifisch zum Abbau von mRNAs in der Zelle führen – sowie RNAi-Anbieter finden Sie in unserer Marktübersicht
„siRNA – Tools & Services“ (vgl. Seite 24).
4
Heike Brötz-Oesterhelt, Harald Labischinski et al., Bayer AG
10
Andreas Wattenberg et al., Protagen AG, Dortmund
BLITZLICHT
쑺 Verbesserte Proteomanalyse durch Automation
14
Christoph Eckerkorn, Tecan München GmbH, Kirchheim
WISSENSCHAFT
쑺 Surface Plasmon Fluorescence Techniques for
Protein Binding Studies
19
Wolfgang Knoll et al., MPI for Polymer Research, Mainz
BLITZLICHT
쑺 RT-PCR for Measuring Gene Silencing by RNAi
22
Jill Spoerke et al, Celera Genomics, South San Francisco
M A R K T Ü B E R S IC H T
쑺 RNA-Interferenz
24
BLITZLICHT
쑺 Automatisierte Protein-Analytik
32
Carsten Mang, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz
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Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer
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BLITZLICHT
쑺 Expressionssysteme in der Proteinforschung
34
Burkhard Ziebolz, Roche Diagnostics, Mannheim
BLITZLICHT
쑺 Forschungsantikörper aus Phage Display Libraries
38
Dieter Lingelbach, MorphoSys AG, Martinsried
Ihr LABORWELT-Team
왘
BLITZLICHT
쑺 Massiv parallele Einzelmolekül-Sequenzierung
40
Christian Hennig, Genovoxx GmbH, Lübeck
BLITZLICHT
쑺 QC-System für Bio-Imager
42
Heiko Mixtacki, biostep GmbH, Jahnsdorf
BLITZLICHT
쑺 Scaling up Automatic Protein Excision
44
Chris Mann, Genetix Ltd., UK
쑺 Produktwelt
48
쑺 Stellenmarkt
51
쑺 Verbände/Bestellformular
53
쑺 Termine/Impressum
54
© Max-Planck-Gesellschaft
Im Wachstumsmarkt Proteomforschung – Thema dieser LABORWELT-Ausgabe – zeichnet sich nach Einschätzung von Prof. Dr. Klaus
Unger von der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung ein langfristiges Nebeneinander konkurrierender Technologien ab. Immer mehr
der führenden Laboranbieter, die sich Ende Mai auf der ACHEMA in
Frankfurt präsentieren, setzen auf die Automation der 2D-Gelelektrophorese-Trennung (vgl. Seite 14, 32). Daneben drängen laut Unger verstärkt multidimensionale LC/MS-Systeme und Mikrofluidik-Trennchips auf den Markt, die auch Membranproteine aufzutrennen vermögen.
Große Zukunftschancen räumt eine neue Studie der Unternehmensberatung Frost & Sullivan der Molekulardiagnostik mit AntikörperArrays ein. Deutsche biopharmazeutische Unternehmen prüfen bereits,
ob es lohnt, in die Herstellung der dafür benötigten Forschungsantikörper einzusteigen (siehe Seite 38). Wie sich Unternehmen und die
deutsche Proteomforschungs-Szene in diesem Zukunftsbereich international positionieren werden, bleibt eine spannende Frage.
Zuletzt noch eine Information in eigener Sache: Angesichts des großen Interesses einer stetig wachsenden Zahl biowissenschaftlicher Fachgesellschaften am Bezug von LABORWELT starten wir mit dieser Ausgabe einen kostenfreien akademischen Stellenmarkt. Ziel ist es, Forschungsinstituten eine qualifizierte Verteilung (vgl. Seite 53) ihrer Stellenausschreibungen bei gleichzeitiger Kostenentlastung anzubieten.
Wir würden uns freuen, wenn Sie das Angebot nutzen würden.
REM-Aufnahme einer Gruppe von Haarsinneszellen einer Zebrafisch-Larve (pseudocoloriert).
AG Dr. Theresa Nicolson (Aufnahme), MPI für
Entwicklungsbiologie, Tübingen.
Kennziffer 11 LW 03 · Informationen ordern? · www.biocom.de
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4. Jahrgang | Nr.3/2003
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Drug Development
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Anwendung der
Proteomanalyse in der
Antibiotika-Forschung
Heike Brötz-Oesterhelt, Harald Labischinski,
Antibakterielle Forschung, Bayer AG, Wuppertal
Julia Elisabeth Bandow, Michael Hecker, Universität Greifswald
Die Technik der Proteomanalyse findet zunehmend Anwendung bei vielfältigen Fragestellungen in der pharmazeutischen und akademischen Forschung. Wir haben den Proteomansatz
dazu verwendet, die komplexen physiologischen Reaktionen von Bacillus subtilis auf mehr
als 30 verschiedene antibakterielle Substanzen aus klassischen und modernen Target-Bereichen zu untersuchen. Die in Gegenwart der Antibiotika neusynthetisierten cytoplasmatischen Proteine wurden im pI-Bereich von 4 bis 7 mittels zweidimensionaler PolyacrylamidGelelektrophorese (2D-PAGE) analysiert und die charakteristischen Proteinsignaturen in einer umfassenden Datensammlung zusammengestellt. Obwohl sich jedes Antibiotikum durch
ein individuelles Protein-Expressionsprofil auszeichnete, führten ähnliche antibakterielle Wirkmechnismen zu überlappenden Proteinsignaturen. Diese Parallelen in der Expression spezifischer Markerproteine deuten an, daß es möglich sein wird, auch für neue antibakterielle
Leitstrukturen Hinweise auf bislang unbekannte Wirkungsmechanismen aus dem Vergleich
mit bekannten Antibiotika abzuleiten. Tatsächlich gelang es eine solche Verbindung – den
strukturell neuen Proteinsynthesehemmer BAY 50-2369 – als Inhibitor der Peptidyltransferase-Reaktion einzuordnen. Diese Ergebnisse demonstrieren die Leistungsfähigkeit des Proteom-Ansatzes für die moderne Antibiotikaforschung.
Key Words: Proteomics, Bacillus subtilis, Antibiotika, Wirkmechanismus
Multiple Antibiotika-Resistenzen verbreiten
sich zunehmend innerhalb der bakteriellen
Population und machen die Suche nach neuen Verbindungen mit innovativem Wirkmechanismus und ohne Kreuzresistenz mit bekannten Klassen unabdingbar. Die Kenntnis
des molekularen Targets einer neuen antibakteriellen Prüfsubstanz ist jedoch nicht nur zur
Vermeidung von Resistenzproblemen wichtig, sondern auch um potentielle Interaktio-
nen mit eukaryotischen Homologen frühzeitig zu erkennen und mögliche Target-bedingte Nebenwirkungen einschätzen zu können.
Aufbau einer umfassenden ProteomDatenbank unter Antibiotikastreß
Ziel des Projekts war es zu evaluieren, ob sich
die Technik der Proteomanalyse zur Untersuchung des Wirkmechanismus antibakterieller
Abb. 1: In silico-Vergleich der Autoradiogramme einer Kontrollprobe und einer Antibiotika-behandelten
Probe. Falschfarbendarstellung der Autoradiogramme und programmgestützte Überlagerung der zusammengehörigen Proteinspots, läßt induzierte Proteine in rot und reprimierte Proteine in grün hervortreten.
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Verbindungen eignet1. Zu diesem Zweck wurden mehr als 30 antibiotisch wirksame Substanzen ausgewählt – darunter alle wichtigen
Klassen vermarkteter Antibiotika, Inhibitoren
neuer Stoffwechselwege, die sich aktuell bei
verschiedenen Firmen in Forschung oder Entwicklung befinden, sowie zusätzlich Substanzen, die generelle unspezifische Zellschädigungen hervorrufen. Die untersuchten Verbindungen wirkten im Bereich der RNA-,
DNA-, Protein-, Fettsäure- und Zellwandsynthese und schlossen auch Schädigung der
DNA-Struktur sowie Membranperturbationen mit ein. Als Modellbakterium verwendeten wir den bestuntersuchten Gram-positiven
Organismus B. subtilis, der den Vorteil bietet,
daß er im Hinblick auf sein Genom, sein Proteom und auch seine Reaktionen auf physiologischen Streß wie Hitze, Salz, Oxidation,
Hunger etc. bereits recht gut charakterisiert ist.
Da das Proteom einer Zelle dynamisch ist und
sensibel an veränderte Umweltbedingungen
adaptiert wird, analysierten wir es als Indikator für den physiologischen Zustand von Bacillus unter vielfältigem Antibiotikastreß.
Proteomanalyse und Identifizierung
von Markerproteinen
Reproduzierbare Wachstumsbedingungen
und die geeignete Wahl von Antibiotika-Konzentrationen und Inkubationszeiten erwiesen
sich als essentiell für die Erhebung aussagekräftiger Daten. B. subtilis wurde in einem
definierten Minimalmedium in Gegenwart
von Bruchteilen und Vielfachen der minimalen Hemmkonzentration des jeweiligen Antibiotikums kultiviert und die optische Dichte der Kultur verfolgt. Für jedes Antibiotikum
wurden mindestens zwei Wachstumszustände untersucht, eine Situation, bei der eine erste, leichte Schädigung der Zellen zu erwarten war, und eine weitere Situation, bei der
der Effekt des Inhibitors bei höheren Konzentrationen und/oder nach längeren Einwirkzeiten betrachtet wurde. Alle Experimente
wurden in unabhängigen Ansätzen wiederholt, um eine solide Datenbasis bereitzustellen. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe des Antibiotikums wurden Kulturaliquote mit 35S-Methionin für 5 Minuten pulsmarkiert, geerntet und mit Ultraschall aufgeschlossen. Nach Abtrennung der partikulären Fraktion wurde die cytoplasmatische
Fraktion mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt. Dazu wurden 50 µg
Proteinextrakt auf Streifen mit einem immobilisierten pH Gradienten im Bereich pH 4-7
(Amersham Pharmacia) aufgebracht und in
einer Multiphor II (Amersham Pharmacia)
isoelektrisch fokussiert. In der zweiten Dimension wurden die Proteinbanden in vertikalen SDS-Polyacrylamid-Gelen im Investigator 2D System (Genomics Solutions) weiter separiert. Nach Färbung mit Silbernitrat
Kennziffer 12 LW 03 · www.biocom.de
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Abb. 2: Cluster-Analyse der verschiedenen im Rahmen des Projektes analysierten Antibiotika nach Anzahl der überlappenden Markerproteine. Substanzen
mit ähnlichen Wirkmechanismen clustern zusammen.
wurden die Gele auf PhosphorImagerScreens zur Autoradiographie exponiert. Das
erzeugte Autoradiogramm spiegelt die im Beobachtungszeitraum de novo synthetisierten
Proteine wider, während die Silberfärbung
das Gesamtprotein der Zelle detektiert (Cytoplasma, pH 4-7). Die Autoradiographie der
neusynthetisierten Proteine erwies sich als
das empfindlichere Verfahren, um die durch
das Antibiotikum hervorgerufenen Veränderungen nachzuweisen und wurde für die
meisten Analysen herangezogen. Zum Vergleich des Gels der Antibiotika-behandelten
Probe mit dem Kontrollansatz wurden die
beiden Autoradiogramme mit Hilfe der
Delta2D Software (Decodon) exakt aufeinander projiziert. Gleichzeitig wurde in einem
praktischen Auswerteverfahren das Kontrollautoradiogramm mit der Falschfarbe grün
versehen und die behandelte Probe in rot
koloriert (Abb 1.). Nach Überlagern der beiden Gele in silico erscheinen Proteine rot, die
unter Einfluß des Antibiotikums neu gebildet wurden, solche, deren Synthese eingestellt wurde, grün und unveränderte Proteine gelb. Spots von Proteinen, deren Synthese
in Gegenwart des Antibiotikums in wiederholten Experimenten mindestens um den
Faktor 2 angestiegen war, wurden als Markerproteine für diese Substanz definiert. Sofern sich diese Proteine in ausreichenden
Mengen unter Einfluß des Antibiotikums akkumulierten, wurden sie nachfolgend aus mit
Sypro Ruby gefärbten Gelen nicht-radioakti6 | Nr. 3/2003
ver Extrakte nach tryptischem in-Gel-Verdau
ausgeschnitten und durch peptide mass fingerprinting identifiziert.
Ähnliche Wirkmechnismen liefern
überlappende Proteinsignaturen
Eine der ersten zu beantwortenden Fragen
war, ob die Proteinsignatur, die ein spezieller Inhibitor erzeugt, mit dem derzeitigen
Verständnis des antibakteriellen Mechanismus dieser Verbindung im Einklang steht. Als
Grundlage für diese Untersuchung dienten
die Referenzantibiotika mit bekanntem Wirkmechanismus. Zahlreiche Markerproteine
ließen sich tatsächlich durch literaturbekannte regulierende Vorgänge in der bakteriellen
Zelle erklären. So führten etwa die beiden
DNA-alkylierenden Verbindungen Mitomycin C und Nitrochinolin-oxid zur Induktion
der SOS-Antwort, was sich – wie erwartet –
in der Induktion von RecA, DinB oder zahlreichen Proteinen des PBSX-Prophagen niederschlug. Beim nächsten Beispiel, Mupirocin, einem Inhibitor der Isoleucyl-tRNA-Synthetase, zeigte die Proteinsignatur das typische Bild der stringenten Kontrolle, in Übereinstimmung mit dem Vorkommen unbeladener tRNAs in der Zelle. Zusätzlich waren
einige Proteine des Isoleucin/Valin-Stoffwechsels induziert und sogar das direkte Target, die α-Untereinheit der Isoleucyl-tRNA
Synthetase, befand sich unter den Markerproteinen. Andere Beispiele, in denen das unmit-
telbare Target unter den Markerproteinen
vertreten waren, bilden der Fettsäurebiosynthese Inhibitor Cerulenin (Target: β-Ketoacylsynthase, FabF) und der kompetitive Inhibitor der DNA-Gyrase Novobiocin (Target:
GyrB). Im Fall von Rifampicin war die α-Untereinheit der RNA-Polymerase deutlich induziert. Die β-Untereinheit, die das eigentliche Target darstellt, wurde nicht als Markerprotein identifiziert. Dies könnte daran liegen, daß dieses Protein zu hochmolekular ist,
um auf den Gelen reproduzierbar aufgetrennt
zu werden. Unter den von uns ausgewählten direkten Translationsinhibitoren ließen
sich zwei große Gruppen unterscheiden:
Zum einen solche Verbindungen, die das Ribosom arretieren und ein Weiterrücken der
Synthesemaschinerie auf der mRNA unterbinden. Diese Gruppe – repräsentiert durch
Chloramphenicol, Erythromycin, Tetracyclin
und Fusidinsäure – bewirkte eine verstärkte
relative Expression von ribosomalen Proteinen und Elongationsfaktoren. Im Gegensatz
dazu zeigten die Aminoglycoside und Puromycin ein vollkommen anderes Bild und induzierten die Synthese von Chaperonen und
Proteasen. Auch dieser Befund ist verständlich, da die Zelle durch die Vertreter dieser
letzten Gruppe mit einer Vielzahl von fehltranslatierten und verkürzten Polypeptiden
überschwemmt wird, die sie umzufalten und
abzubauen versucht.
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Abb. 3: Proteom-Vergleich des Pyrimidinon Antibiotikums BAY 50-2369 mit dem klassischen Peptidyltransferase Inhibitor Chloramphenicol. Beide Substanzen zeigen stark überlappenden Proteinsignaturen. Ähnliche Übereinstimmungen ergaben sich auch zu Erythromycin, Fusidinsäure und
Tetracyclin.
Zusammenfassend läßt sich folgern, daß
viele der beobachteten Effekte auf Proteomebene im Lichte des bekannten Wissens über
die Antibiotikawirkung rational nachzuvollziehen sind. Keine der beobachteten Proteinsignaturen eines Antibiotikums stimmte jedoch exakt mit der eines anderen überein. Dies
reflektierte die Individualität jedes der getesteten Hemmstoffe. Gleichwohl zeigte sich
deutlich, daß Substanzen mit ähnlichem Mechanismus oder ähnlichen Auswirkungen auf
den Bakterienstoffwechsel zu überlappenden
Proteinmustern führten (Abb. 2). Damit stellt
sich das System als geeignete Grundlage für
die Einordnung neuer Prüfsubstanzen mit unbekanntem Mechanismus dar.
Tatsächlich fiel das neue Pyrimidinon-Antibiotikum Bay 50-2369, auf das wir unser System erstmals angewendet haben, in ein Cluster mit sämtlichen anderen Inhibitoren der
ribosomalen Elongation (Abb. 3). Dies deutet auf eine Hemmung der Peptidyltransferase-Reaktion hin, was durch unabhängige biochemische Untersuchungen mit dem strukturverwandten Tan 1057 A/B unterstützt
wird2.
Nicht unerwähnt sollte jedoch bleiben, daß
sich auch zahlreiche Proteine mit bislang unbekannter Funktion unter den Markerproteinen befanden. Zusätzlich schlossen die Signaturen auch diverse unerwartete und zum Teil
bisher unverständliche Reaktionen ein, die als
neue Bausteine zum komplexen Puzzle der
Antibiotikawirkung addiert werden können.
Detektion neuer Proteinmodifikationen
auf 2D-Gelen
Eine besondere Leistungsfähigkeit der Proteomanalyse liegt in der Detektion von Pro-
teinmodifikationen. Das Beispiel des PeptidDeformylase-Inhibitors Actinonin demonstrierte eindrucksvoll den Effekt der verbleibenden Formylgruppe am Start-Methionin
auf das Laufverhalten der Proteine auf den
2D-Gelen. In Gegenwart von Actinonin gewonnene Proben wiesen bislang noch nicht
beobachtete Proteinspotverschiebungen auf.
Das Ausmaß dieser Verschiebung war so
immens, daß es nicht möglich war, das Autoradiogramm der Actinonin-behandelten
Probe unmittelbar mit dem der Kontrollprobe in Übereinstimmung zu bringen. Überlagerung des Autoradiogramms mit den silbergefärbten Proteinsspots desselben Gels deckte die Ursache auf (Abb. 4). Es zeigte sich, daß
die Mehrheit der unter Actinonin neu synthetisierten Proteine einen pI besaßen, der im
Vergleich zum Originalspot zum Sauren hin
verschoben war. Massenspektrometrische
Analysen (MALDI-TOF und ESI) zeigten, daß
in diesen neu aufgetretenen Proteinformen
das N-terminale Methionin formyliert vorlag.
Neben dem direkten Nachweis der gehemmten Aktivität des Actinonin-Targets war dies
der erste Nachweis der Formylierung als einer Form der Proteinmodifikation auf 2DGelen. In vertieften Untersuchungen wurden
solche formylierten Proteine nachträglich
auch in B. subtilis -Zellen nachgewiesen, die
in Abwesenheit des Antibiotikums gewachsenen waren3.
Zusammenfassend verdeutlichen diese Ergebnisse, daß die Technik der Proteomanalyse dazu geeignet ist, das Verständnis der
bakteriellen Reaktion auf bekannte Antibiotikaklassen zu vertiefen und Hinweise zum
Wirkmechanismus neuer antibakterieller
Leitstrukturen zu liefern.
Eine weiterführende Publikation enthält
ausführlichere Beschreibungen der beobachteten Signaturen1. Die Datensammlung ist
darüber hinaus auch auf folgender Webseite
abgelegt: http://microbio2.biologie.uni-greifs
wald.de:8880/antibiotics/
Literatur
[1]
[2]
[3]
Bandow, J. E., Brötz, H., Leichert, L. I. O., Labischinski, H., und Hecker, M.;
Proteomic approach to understanding antibiotic action. Antimicrob. Agents
Chemother., 47, 948-955 (2003).
Boddecker, N., Bahador, G., Mabery, E., Wolf, J. J., Xu, L., Watson, J. C.
Abstractband 41st ICCAC, Seite 245 (2001).
Bandow, J. E., Becher, D., Büttner, K., Hochgräfe, F., Freiberg, C., Brötz, H.,
und Hecker, M.; The role of peptide deformylase in protein synthesis: a
proteomic study. Proteomics, 3, 299-306 (2003).
Korrespondenzadresse
Dr. Heike Brötz-Oesterhelt
Bayer AG, Anti-Infectiva
Pharmaforschungszentrum
Aprather Weg 18a, D-42096 Wuppertal
Tel./Fax: +49-(O)202-36-4561/-4116
eMail: [email protected]
Abb. 4: Proteinspotverschiebung in Gegenwart von Actinonin. Vergleich des Autoradiogramms mit der
Silberfärbung desselben Gels. Durch blockierte Abspaltung der Formylgruppe erfahren die Proteine
eine pI-Verschiebung zum Sauren.
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LIMS
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Proteomanalyse durch automatisierte Datenverarbeitung
Andreas Wattenberg, Martin Blüggel, Protagen AG, Dortmund
Die Automatisierung von Proteomanalysen ist von großem Interesse, allerdings hat die Vielfalt
der Analysetechniken sowie die Komplexität der Analyseschritte eine allgemein verwendbare
Automatisierung bislang erschwert. Für Proteomstudien mit Hilfe von 2D-Gelen und massenspektrometrischer Analyse gibt es inzwischen einen weitgehend standardisierten, automatisierbaren Arbeitsablauf. Mehrere Firmen bieten komplette Geräte-Lösungen (Proteomics-Straßen) oder Teillösungen an. Die elektronische Datenverarbeitung soll dabei die Aufgaben eines
‚Labor Informations Management Systems‘ (LIMS) und der bioinformatischen Datenauswertung erfüllen. Die softwaretechnische Umsetzung muß hohe Anforderungen an die Flexibilität
der Anbindung weiterer Techniken, des Durchsatzes, der Prozeß-Stabilität, der Transparenz
sowie eine Integration in die bioinformatische Auswertung erfüllen. Die Umsetzung des vielschichtigen Anforderungsprofils für die Datenverarbeitung einer Proteomanalysestraße wird
am Beispiel der PROTEINEER TM Line (Bruker Daltonik) dargestellt.
Bei einer großen Zahl an automatisch analysierbaren Proben ist die Kontrolle der Datenund Probenflüsse im Labor und eine parallelisierte Datenauswertung wichtig für eine erfolgreiche Proteomanalyse. Zum einen müssen Daten für die Steuerung einzelner Geräte
und von Geräten erzeugte Daten weitergegeben und zentral verwaltet werden (LIMS).
Zum anderen müssen vom Massenspektrometer (MS) erzeugte Daten weiterverarbeitet, in
Primärstrukturinformationen umgewandelt
und mit den biochemischen Daten der Probe
unter Berücksichtigung der biochemischen
Fragestellung der Proteomstudie korreliert
werden (Bioinformatik). Eine Trennung beider
Ebenen in ein LIMS (Sample Tracking) und
eine Proteom-Datenbank (Knowledge Library) ist sowohl aus Stabilitäts- und Kompatibilitäts- als aus Transparenzgründen vorteilhaft.
Proteomanalysestraße
Kommerziell erhältliche Roboterplattformen
und Implementierungen von Laborprotokollen sind bei unterschiedlichen Proteomanalysestraßen sehr verschiedenen. Generell
läßt sich aber die Analyse in diskrete Schritte unterteilen.
Zunächst wird das Proteom mittels 2D-Gelelektrophorese in die einzelnen Proteine aufgetrennt. Diese Technik erlaubt auch ohne Automatisierung eine hohe Trennleistung und Parallelisierung für mehrere 10.000 Proteine pro
Woche. Anschließend werden die angefärbten
Proteine mit einem Roboter aus dem 2D-Gel
ausgestochen und einzeln in eine Mikrotiterplatte abgelegt. Im nächsten Schritt werden die
Gelstücke gewaschen, die Proteine enzymatisch
verdaut und für die Massenspektrometrie vor-
bereitet (z.B. MALDI-Target-Präparation). Im
letzten Schritt erfolgt die Analyse der Proben
im Massenspektrometer. Als MS-Verfahren finden die LC-ESI-MS oder die MALDI-MS Einsatz, wobei das letztere Verfahren für eine Automatisierung bevorzugt verwendet wird. Der
Ablauf der Analyse und die entsprechenden
Datenflüsse sind in Abbildung 1 dargestellt.
Die erste Komponente in der Analysestraße ist ein Roboter (Spot-Picker), der die angefärbten Proteine aus dem 2D-Gel aussticht.
Dabei müssen die Koordinaten der einzelnen
Proteinspots im Gel möglichst exakt bestimmt
werden, um ein präzises Ausschneiden zu
gewährleisten. Ein hochaufgelöstes Bild des
2D-Gels wird deshalb direkt auf dem Roboter
mit Hilfe eines speziell entwickelten Durchlichtscanners erzeugt. Neben der Kommunikation mit einer externen Imageanalysesoftware ist eine Positionsbestimmung der Spots
durch eine auf dem Roboter integrierte Spoterkennung möglich. Bei der Auswahl der zu
analysierenden Proteinspots können auch
Analyseprotokolle für die folgenden Schritte
festgelegt und zum LIMS exportiert werden.
Die zweite Komponente bildet ein VerdauRoboter, der die ausgestochenen Gelstücke in
einem mehrstufigen Prozeß wäscht, enzymatisch verdaut und vollautomatisch auf einen
MALDI-Probenträger präpariert. Für diesen
Roboter sind die verwendeten Protokolle entscheidend, um auch kleinste Proteinmengen
erfolgreich zu analysieren. Da dieser Prozeß
für die Nachweisempfindlichkeit der gesamten Analyse limitierend ist, wurden bei der
Entwicklung des Roboters die Protokolle
durch ein definiertes Testsystem optimiert.
Parallel dazu sind definierte Chemikalienkits,
die alle für den Roboter nötigen Reagenzien
in verschlossenen Behältern enthalten, für
eine optimale Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit notwendig.
Die dritte Komponente der Analysestraße
ist ein MALDI-MS, in dem die Proben aus
dem Verdauroboter analysiert werden. Die
MS-Daten bilden die Basis für eine bioinformatische Analyse der Primärstruktur der Proteine. Die Besonderheit der neuen MALDIMS-Generation ist, daß neben MALDI-Peptid-Massen-Fingerprint- (PMF) Spektren auch
Fragmentspektren einzelner Peptide direkt
aus dem komplexen Gemisch heraus in hoher Qualität erzeugbar sind (Peptid Fragmentierungs Fingerprints, PFF). So ist es möglich,
die Aminosäuresequenz eines Peptids zu bestimmen und eine höhere Signifikanz der Proteinidentifikation und der Analyse von posttranslationalen Modifizierungen zu erhalten.
LIMS
Das LIMS ist für die Speicherung der Prozeßdaten und die Probeninformationen elementar. Die Stati einzelner Proteinspots („detecAbb. 1: Informationsfluß in der Proteomanalysestraße. Prozeß-spezifische Informationen werden von
den einzelnen Robotern in das LIMS geschrieben und abgerufen. Die erzeugten Daten werden in der
Knowledge Library mit weiteren Daten kombiniert und ausgewertet.
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ted”, „picked”, „digested”, „acquired”,
„identified”) werden zentral erfaßt und den
Robotern zur Verfügung gestellt. Damit kann
die Software der Robotersteuerung vom
LIMS die benötigten Informationen erhalten
und die Informationen nach Prozeßbeendigung zurückschreiben. Die Protokolle, die an
den einzelnen Stellen der Straße angewendet
werden sollen, sind im voraus definierbar
und erhöhen so den Automatisierungsgrad.
Voraussetzung dafür ist, daß die Nachverfolgung der Probe (des Proteinspots) an allen
Stellen der Straße möglich und eindeutig ist.
Dazu werden die drei Probenträger – das
Passepartout des 2D-Gels, der Halter der Mikrotiterplatte und das MALDI-Target – mit
einem Transponder versehen. Auf dem Transponder wird für die Probe eine Zahlenkombination zur eindeutigen Indentifizierung gespeichert. Der Vorteil eines Transponders gegenüber einem Barcode ist, daß er neben dem
Auslesen auch beschrieben werden kann. Der
Status kann damit nach Beendigung des Protokolls inkrementiert werden. Jede Probenposition der Proteomanalysestraße ist mit einer Lese- und Schreibstationen ausgestattet
und stellt so eine verwechslungsfreie Nachverfolgung der Proben sicher. Durch eine definierte Schnittstelle ist eine Einbindung weiterer Roboter gleichen Typs oder auch von Systemen verschiedener Hersteller möglich.
Bioinformatik
Für die bioinformatische Analyse der Daten
ist eine komplexe Datenbanksoftware wie die
Proteomdatenbank-Software Proteinscape
(Bruker Daltonik) nötig. Zuerst werden Daten zur biochemischen Fragestellung der Proteomstudie und zu den Proben vor der Proteinauftrennung erfaßt. Die Datenbank speichert
die Daten aus den einzelnen Schritten der
Proteomanalysestraße in einer hierarchischen
Struktur. So können die MS-Spektren (PMF
und PFF) vollautomatisch Gelbildern und
Spotkoordinaten des Spotpickers zugeordnet
werden (Abb. 2). Der Umwandlung von MSDaten in die Primärstrukturinformation der
Proteine kommt eine zentrale Rolle zu.
Der Ablauf einer typischen MALDI-Datenanalyse ist in Abbildung 3 dargestellt. Die
Massenspektren werden aufgrund immer
wieder auftretender Ionen (z.B. tryptischen
Eigenpeptiden, Ionen des Farbstoffs, KeratinHintergrund) nach der Peak-Erkennung erneut intern kalibriert. Dann werden die Molekulargewichte der Kalibranten eliminiert,
so daß nur unbekannte Massen der Peptide
an die Suchmaschinen geschickt werden. Für
eine optimale Proteinidentifizierung muß
diese Kalibrantenliste automatisch und spezifisch für jedes Labor und Projekt erzeugt
werden. Für die Auswertung der Massenspektren werden oft mehrere Suchalgorithmen mit verschiedenen Suchstrategien verwendet. Die Suchergebnisse müssen für eine
übersichtliche Ergebnisdarstellung zusam12 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
Abb. 2: Annotiertes 2D-Gel. Die Stati der Prozessierung der einzelnen Proteinspots können nachverfolgt werden. Die identifizierten Proteine werden direkt im 2D-Gel annotiert.
mengefaßt werden. Für eine automatisierte
Auswertung ist es dabei wichtig, aus den Ergebnissen aller Suchmaschinen einen Metascore zu errechnen, der für die Beurteilung
der Signifikanz unabhängig von verwendeten Suchmaschinen und Strategien ist. Die
Datenauswertung muß eine intelligente und
parallele Prozessierung vieler Spektren ermöglichen, da große Datenmengen manuell
nicht mehr einzeln prozessierbar sind. So
dauert eine automatisierte Datenanalyse für
einen Proteinspot weniger als zwei Minuten.
Durch eine Aufgabenverteilung auf mehrere
Computer ist ein Durchsatz von mehreren
tausend Proteinproben pro Tag möglich. Die
identifizierten Proteine können durch komplexe Abfragemöglichkeiten in Beziehung zu
der Projektfragestellung gebracht werden.
Dazu werden Proteinlisten geclustert, verglichen sowie die Ontologie der Proteine verglichen und bewertet.
Ausblick
Die Einführung von Proteomanalysestraßen
ermöglicht eine Analyse ganzer 2D-Gele mit
mehreren tausend Proteinspots. Eine enge Verzahnung der Datenverarbeitung mit den einzelnen Komponenten der Analysestraße bietet einen hohen Automatisierungsgrad und
eine parallele Datenverarbeitung in vielen
Einzelschritten. So können erstmals komplexe Proteome auf molekularer Ebene analysiert und auf Ebene der identifizierten Proteine verglichen werden. Dieses neue Proteomanalyse-Werkzeug wird neue Ansätze der Proteomforschung ermöglichen.
Abb. 3: Analyse von massenspektrometrischen
Daten der Proteomanalysestraße zur Primärstruktur-Identifizierung von Proteinen
Martin Blüggel
Protagen AG
Emil-Figge-Str. 76A, D-44227 Dortmund
Tel./Fax: +49-(0)231-9742-890 / -891
www.protagen.de
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Proteomik
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Automatisierte Proteinanalytik
steigert Reproduzierbarkeit,
Sensitivität und Durchsatz
PD Dr. Christoph Eckerskorn, Tecan München GmbH, Kirchheim
Aus den Sequenzdaten des Human-Genoms lassen sich etwa 30.000 Gene ableiten. Die Identifizierung vieler Proteine nach zweidimensionaler elektrophoretischer Auftrennung (2D-PAGE)
haben jedoch gezeigt, daß die meisten Proteine posttranslational modifiziert werden und in
mehreren Protein-Isoformen in der Zelle vorkommen. Die Herausforderung für die Proteinanalytik besteht unter anderem darin, daß von einem komplexen Proteingemisch von mehr
als 100.000 verschiedenen Protein-Isoformen ausgegangen werden muß. Hinzu kommt, daß
sich die Zusammensetzung der exprimierten Proteine sowie deren kovalente Modifikationen
in Abhängigkeit der Dynamik zellulärer Vorgänge verändert. Die physiko-chemischen Eigenschaften von Proteinen wie etwa die Löslichkeit sind extrem unterschiedlich, ihre absoluten
Konzentrationen in der Zelle verteilen sich über mehr als sechs Größenordnungen. Oft läßt
sich diese große zelluläre Komplexität mit bestehenden Methoden der Proteinanalytik nicht
zufriedenstellend darstellen. Um limitierenden Faktoren wie mangelnder Reproduzierbarkeit, geringer Sensitivität und geringem Durchsatz zu begegnen, entwickelt Tecan automatisierte Technologien, die einzeln oder als Produktserie (Abb. 1) einsetzbar sind.
Die vielen Versuche der vergangenen Jahre,
die Proteine einer Zelle hinsichtlich ihrer
quantitativen Zusammensetzung und ihres
interaktiven Zusammenwirkens zu untersuchen (Proteomics), zeigten rasch die außerordentlich große Komplexität des Systems
Zelle und die damit verbundenen Grenzen
der zur Zeit zur Verfügung stehenden Technologien. Wesentliche Limitierungen werden
durch mangelnde Reproduzierbarkeit einzelner Methoden, eine zu geringe Sensitivität
und einen geringen Probendurchsatz verursacht. Die existierenden elektrophoretischen
oder chromatographischen Trennmethoden
reichen in ihrer Auflösung allein nicht aus um
auch die seltenen sogenannten „low abundant“ Proteine in einem komplexeren Prote-
A
B
ingemisch nachzuweisen und zu quantifizieren. Außerdem fehlen noch standardisierte
Methoden zur Vorbereitung von Proben, die
reproduzierbar sind und einen definierten
Ausgangs- oder Referenzzustand eines Proteoms repräsentieren.
Proteinanalytik – eine
technologische Herausforderung
Tecan will mit einer zweigleisigen Strategie
verbesserte Technologien für die Proteinanalytik entwickeln. Auf einer ersten Ebene werden für die einzelnen Schritte der Proteinanalytik automatisierte Instrumente entwickelt.
Dabei wird neben der Reduktion manueller
Arbeitsschritte vor allem Wert auf die Kontrol-
C
D
le sämtlicher experimenteller Parameter (Temperatur, elektrische Spannung, Zeit etc.) gelegt,
um optimale Reproduzierbarkeit und Standardisierung zu erzielen. Die ProTeam-Produktserie besteht, entsprechend dem experimentellen Vorgehen von der ganzen „Zelle“ zur
Identifizierung und Charakterisierung einzelner Proteine, aus folgenden Modulen:
– Cell Maintenance System: AutomatisierteZellkultivierung und Verfahren für reproduzierbare und konsistente Präparationen;
– ProTeam FFE: (Semi-)präparative Trenntechnologie zur Fraktionierung geladener
Partikel und Moleküle wie Peptiden, Proteinen, Zellorganellen und Zellen in Lösung;
– ProTeam 2D: Automatisierte 2D-PAGE mit
den einzelnen Modulen ProTeam IEF, ProTeam Casting, ProTeam PAGE sowie ProTeam Staining inklusive Imaging und Spot
Picking;
– ProTeam Digest: Automatisiertes System
um gelelektrophoretisch aufgetrennte Proteine für die Massenspektrometrie zu prozessieren (Proteinverdau, peptidchemische
Modifizierung und Probenvorbereitung für
die Massenspektrometrie);
– ProTeam IPE: Software für das ProbenHandling, Daten-Tracking und die Integration und Kombination mit Datenbanken für
eine anschließende Datenanalytik
– ProTeam Crystallization: Automatisiertes
Verfahren zur Bestimmung der optimalen
Bedingungen für eine Proteinkristallisation.
Das Design der Geräte erlaubt es, diese sowohl als Stand-alone-Instrumente als auch in
integrierten Kombinationen für verschiedene proteinchemische Fragestellungen zu nutzen.
Auf einer zweiten Ebene entwickelt Tecan
integrierte Lösungen wie etwa die komplett
automatisierte Plattform „Spotpicking - Protein Digest - MS-Interface” oder „2D-PAGE”.
Einige Komponenten der ProTeam-Produktserie sind in Abbildung 1 dargestellt.
E
F
Abb. 1: Kernkomponenten der neuen Tecan-Workstation für Fraktionierung (A: Free-Flow-Elektrophorese, B: Probenvorbereitung), Trennung (C: Isoelektrische Fokussierung, D: Gelgießen, E: SDS-PAGE, nicht dargestellt: Färben) und Protein-Prozessierung für weitere Analysen (nicht dargestellt: Spot Picking,
F: Gelverdau). Weitere Details: siehe Text
14 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
LABORWELT
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B L I T Z L I C H T
Abb. 2: Vergleich von Leberproteinen aus der Ratte. Links: Direkter Auftrag des Proteingemisches auf
ein 2D-Gel (pH-Gradient: 3,5 bis 5). Rechts: Eine etwa 10fache Menge des Proteingemisches wurde
über FFE fraktioniert. Die drei FFE-Fraktionen (von 40 proteinhaltigen Fraktionen) mit den entsprechenden IEP-Bereichen sind auf drei unabhängigen 2D-Gelen (pH-Gradient: 3,0 bis 6,5) aufgetrennt.
Free-Flow-Elektrophorese – vielseitige
Trenn- und Fraktionierungsmethode
ProTeam FFE arbeitet nach dem Prinzip der
Free-Flow-Elektrophorese (FFE). Darunter
versteht man eine trägerfreie Elektrophorese, bei der der Trennprozeß in Abwesenheit
einer festen Matrix wie beispielsweise Acrylamid stattfindet. Statt dessen werden Analyte in einem kontinuierlichen, laminaren
Fluß von Pufferlösungen in einem quer zum
Fluß angelegten Feld entsprechend ihrer
Ladung und ihrer elektrophoretischen Mobilität getrennt. Der laminare Fluß wird am
Ende der Trennkammer in 96 Kapillaren
übertragen, wodurch eine kontinuierliche
Fraktionierung im Mikroplattenformat ermöglicht wird. Entsprechend der Zusammensetzung der Trennmedien können drei
verschiedene Trennprinzipien angewendet
werden: Isoelektrische Fokussierung (IEF),
Zonenelektrophorese (ZE) und Isotachophorese (ITP).
Die Probe kann zu jedem Zeitpunkt in den
kontinuierlich laufenden laminaren Fluß injiziert werden. Dies kann wenigen 100 µl in
einigen Minuten bis hin zu 100 ml in einem
24-stündigem Lauf entsprechen. Dabei können Probenmengen bis zu etwa 30 mg pro
Stunde getrennt werden. Die Trennzeit und
damit auch die Verweildauer der Probe im
elektrischen Feld ist abhängig von der Flußrate und beträgt in Abhängigkeit der elektrophoretischen Methode etwa 15 bis 25 Minuten. Aufgrund der fehlenden Matrix und
den damit fehlenden Wechselwirkungen
können sowohl kleine Moleküle (Peptide)
sowie große Polymere (Proteine) bis hin zu
Partikeln (Zellorganellen) getrennt werden,
sofern sie eine Ladung tragen oder durch
Modifikation geladen werden können. Neben denaturierenden Trennbedingungen
sind auch native Fraktionierungen möglich,
die beispielweise zur Trennung von Zellen
oder Proteinkomplexen eingesetzt werden.
Die FFE ist ferner mit nicht-ionischen und
zwitterionischen Detergenzien kompatibel,
wodurch periphere und transmembrane
Membranproteine getrennt werden können.
Die FFE ist mit ihren vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten optimal dazu geeignet
die Komplexität einer Probe durch Vorfraktionierung zu reduzieren. Dies kann zum einen durch die Isolierung verschiedener Zellorganellen erreicht werden1, oder durch die
Fraktionierung des kompletten zellulären
Proteingemisches. Die FFE-Fraktionen können dann einzeln in der hochauflösenden
2D-PAGE (Abb. 2) oder in weiteren chromatographischen Schritten aufgetrennt wer-
Abb. 3: ProTeam IEF (siehe Abb. 1C) für die vollautomatische Durchführung der IPG-Fokussierung im
Rahmen der 2D-Elektrophorese. Links: Robotisches Aufsetzen des Prozeßkammerdeckels mit integrierten Elektroden und Probenauftragegefäßen. Rechts: Automatische Probenapplikation mit einem
Acht-Kanal-Pipettierarm
16 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
den. Da die Proteinmenge jeder FFE-Fraktion nur von der eingesetzten Menge an Ausgangsmaterial abhängig ist, stehen für die
weiteren Trennverfahren größere Proteinmengen zur Verfügung, deren Komplexität
im Vergleich zum Ausgangsmaterial deutlich reduziert ist. Somit können Proteine mit
geringer zellulärer Konzentration detektiert
und in den Empfindlichkeitsbereich der
nachfolgenden Analytik (Massenspektrometrie, ELISA, etc.) angereichert werden.
Für die Aufkonzentrierung und Entsalzung größerer Volumina der FFE-Fraktionen
stehen chromatographische Verfahren zur
Verfügung wie beispielweise die Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC).
Dies kann unter anderem automatisch über
entsprechende SPE-Mikrotiterplatten auf
einer Workstation für die Probenvorbereitung (Abb. 1B) durchgeführt werden. Die
konzentrierten Proteingemische können
dann mit hohen Rückgewinnungsraten unter Bedingungen eluiert werden, die für die
nachfolgenden Trennmethoden wie 2DPAGE oder Chromatographie kompatibel
sind. Alternativ können die FFE-Fraktionen
auch über Ultrafiltration aufkonzentriert
und umgepuffert werden. Weitere Optionen
auf der automatisierten Workstation sind
das Messen der pH-Profile der FFE-Trennungen, UV- oder Fluoreszenzmessungen,
Proteinbestimmung sowie die enzymatische
Spaltung der Proteine und anschließende
chemische Modifizierung der entstandenen
Peptide.
2D-PAGE – eine hochauflösende
Trennmethode für Proteine
Die Kopplung zweier komplementärer und
effizienter elektrophoretischen Trennprinzipien – die Isoelektrische Fokussierung (IEF)
und die SDS-Polyacrylamidelektrophorese
(SDS-PAGE) – macht die 2D-PAGE zu einer
optimalen Trenntechnik für Proteine. Beide
Methoden sind prinzipiell aufgrund spezieller Puffersysteme und Detergenzkompatibilität für alle Proteine einsetzbar. Der hohen
Auflösung dieser Methode stehen jedoch
speziell für Proteomeprojekte unzureichende Reproduzierbarkeit und Anwenderfreundlichkeit gegenüber.
Diese Nachteile sind bedingt durch eine
Vielzahl, teilweise aufwendiger manueller
Arbeitschritte, und eine fehlende präzise
Kontrolle über physikalische Parameter wie
Temperatur, elektrische Felder oder Pufferkapazitäten. Tecan hat mit der Entwicklung
der ProTeam 2D-Suite durch eine weitgehende Automatisierung und Kontrolle der entscheidenden Prozeßparameter die Qualität
der Trennung verbessert und die Reproduzierbarkeit erheblich gesteigert.
LABORWELT
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B L I T Z L I C H T
Der komplett automatische ProTeam IEFProzeß (Abb. 1C und Abb. 3) beginnt mit
einer Rehydratisierung von bis zu 16 IPGStreifen (Polyacrylamidmatrix mit immobilisiertem pH-Gradienten). Die IPG-Streifen
befinden sich auf einem Träger, der die
Schnittstelle zur nachfolgenden 2D-Elektrophorese darstellt. Nach sechs bis acht Stunden werden die Proben appliziert (Cup-loading) und die Fokussierung startet gemäß
per Software voreingestellter Parameter –
wobei jeder IPG-Streifen von einer Stromversorgung gespeist und überwacht wird
(max. 12.000 V). Diese Konfiguration ermöglicht eine maximale Flexibilität, denn
mit ProTeam IEF können völlig unterschiedliche IPG-Streifen gleichzeitig ohne
Qualitätsverlust prozessiert werden. Nach
ergaben nach einem Vergleich verschiedener
2D-Gele mit einem Format von 26 x 20 cm
eine Standardabweichung der Spotpositionen von durchschnittlich einem Prozent.
Protein-Identifizierung und
-Charakterisierung
Für eine weitere Analyse der gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteine werden die
proteinhaltigen Gelstückchen automatisch
ausgestanzt und in Mikroplatten abgelegt.
Die Weiterverarbeitung der Proteine, beginnend mit Waschprozeduren, Umpufferungen und enzymatischem Verdau, wird komplett automatisiert in einer neuen MicroSPE-Platte (TecPrep 96) auf dem ProTeam
Digest (Abb. 1F) durchgeführt. Die TecPrep
tation der experimentellen Parameter substantiell zu einer Verbesserung der Proteinanalytik bei. Durch die höhere Reproduzierbarkeit werden Experimente vergleichbarer. Dies ermöglicht weitere proteinanalytische Applikationen wie eine zeitaufgelöste Quantifizierung von Proteinexpression in der Wirkstoffsuche und -Validierung
oder der Toxikologie. Der Aufwand für einzelne Experimente reduziert sich durch die
Qualität der Ergebnisse, wodurch signifikant Ressourcen und Kosten gespart werden können.
Die Integration der FFE stellt eine zusätzliche Trenndimension zur Verfügung. In der
Kombination mit einer weiteren hochauflösenden Trenntechnik wie beispielweise
der 2D-PAGE sind auch Proteine mit gerinAbb. 4: ProTeam Digest (siehe Abb. 1F) für die
Prozessierung der proteinhaltigen Gelstückchen
für die MALDI-Massenspektrometrie. Der komplette Proteinverdau sowie die Aufkonzentrierung und Entsalzung wird in der TecPrep 96Platte (links) durchgeführt und in kleinen Volumina direkt auf das MALDI-Target gespottet
(rechts).
einer erfolgreichen Fokussierung werden
die IPG-Streifen für die zweite Dimension
(SDS-Elektrophorese) automatisch equilibriert.
Das ProTeam Casting System (Abb. 1D)
nutzt die Eigenschaften eines automatisierten Liquid-Handling-Systems für die reproduzierbare Herstellung von SDS-Gelen. Dabei werden sowohl die Vorbereitung der
Lösungen (Mischung der Reagenzien, Sauerstoffgehalt, Temperatur, etc.) als auch die
Polymerisation (Geschwindigkeit, Temperatur etc.) präzise kontrolliert.
Die fertigen Gele zeichnen sich gegenüber
manuell produzierten Gelen durch eine erhöhte Qualität und Stabilität aus. Das Beladen der SDS-Gele mit den Streifen der ersten Dimension geschieht durch einfaches
Einschieben des Trägers in den vorgesehenen Spalt der Gelkassette. Dabei unterstützt
der Träger des IEF-Streifens eine präzise Positionierung auf dem SDS-Gel. Entsprechend
der ersten Dimension werden auch bei der
ProTeam PAGE alle entscheidenden Parameter, wie elektrische Bedingungen, Pufferkapazität, Ionenverfügbarkeit und Temperatur
kontrolliert und angezeigt. Die Laufzeit
kann dadurch extrem verkürzt werden und
liegt im Bereich von weniger als sechs Stunden für eine Trennstrecke von 21 cm. Die mit
ProTeam PAGE prozessierten SDS-Gele werden anschließend mittels eines speziellen
Floating-Systems kontrolliert gefärbt. Erste
Ergebnisse mit Prototypen der ProTeam 2D
18 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
96 besteht aus einer speziellen Mikroplatte, bei der jedes Well mit einer Quartzkapillare bestückt wurde, die mit einem neuartigen, monolithischen reversed phaseMaterial gefüllt ist (Abb. 4 links). Die bei
der enzymatischen Spaltung entstandenen
Peptidgemische können in dieser Mikroplatte mit hohen Ausbeuten vom ursprünglichen Gelstückchen direkt auf die reversed
phase-Oberfläche der Monolithen extrahiert werden. In einem weiteren Schritt
werden die aufkonzentrierten und entsalzten Peptide in Volumina kleiner als 1µl direkt auf die Analyseplatten (Targets) entsprechender MALDI-Massenspektrometer
eluiert (Abb. 4 rechts). Mit dieser Prozeßführung (geringe Volumina und keine
Transferschritte) werden die Verluste an
Peptiden durch unspezifische Adsorption
an Oberflächen minimiert. So konnte eine
erhebliche Steigerung der Sensitivität dieser Methode erreicht werden. Proteinmengen von weniger als ein Femtomol konnten über ‚Peptide Mass Fingerprinting‘
nachgewiesen werden. Der Durchsatz dieser Methode im Mikroplatten-Format erlaubt die Prozessierung von mehr als 3.000
Proteinen pro Tag.
geren Konzentrationen (low-abundant proteins) zugänglich. Die ersten Ergebnisse
einer Trennung von Leberproteinen über
FFE-2D-PAGE zeigten bereits für die ersten
20 FFE-Fraktionen mehr als 20.000 Proteine beziehungsweise Protein-Isoformen. Der
qualitative wie quantitative analytische
Zugang zu einer größeren Zahl von Proteinen ist ein weiterer Schritt zu einem besseren Verständnis zellulärer Vorgänge.
Literatur
[1]
Zischka et al.,2003, Improved proteome analysis of Saccharomyces
cerevisiae mitochondria by Free-Flow Electrophoresis, Proteomics, in
press
PD Dr. Christoph Eckerskorn
Tecan München GmbH
Feldkirchner Straße 12a
D-85551 Kirchheim
Tel.: +49-(0)89-98-106-110
Fax: +49-(0)89-98-106-180
www.tecan.com
Zusammenfassung
Die Tecan ProTeam-Produktgruppe trägt
durch Automatisierung vieler Teilschritte
sowie durch die Kontrolle und Dokumen-
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W I S S E N S C H A F T
Protein Binding Assay
왔
Surface Plasmon Fluorescence
Techniques for Interfacial
Protein Binding Studies
Fang Yu, Döne Demirgöz and Prof. Wolfgang Knoll, MPI for Polymer Research, Mainz
The development of methods for the quantitative evaluation of interactions between proteins
and their surface-bound ligands or between different proteins at interfaces is an essential step
towards experimental schemes that eventually will allow for a better understanding of biochemical reaction pathways, will be instrumental in gene expression studies, or can be used for drug
screening assays. Other than in the case of DNA studies for which established chip fabrication and
read-out protocols are well documented the protein array technology still suffers from a number
of unsolved problems: (1) The multiple functionalization of the sensor surface by one of the interaction partners still constitutes a major challenge in that the surface attachment should not lead to a
modification of the binding affinity or even to partial denaturing of the protein; (2) unlike for DNA or
oligonucleotides the non-specific interaction of proteins with the functionalized sensor surface is
still not completely under control; (3) the required assay sensitivity exceeds the detection limits of
most experimental techniques; (4) none of the existing detection principles allows for the in situ
real-time recording of multiple binding events in an array format. Especially the latter two problems could be solved by a recently developed fluorescence detection scheme that employs the
optical field enhancement mechanisms operating at resonant excitation of surface plasmon modes at a precious metal/dielectric interface.1
A surface plasmon (more precisely, a plasmon
surface polariton) is the coupled state of an
elementary excitation of the nearly free electron gas of a precoius metal – the plasmons –
and an electromagnetic mode propagating along a metal/dielectric interface.2 It constitutes
a kind of surface light that interacts with matter in a way equivalent to planar electromagnetic waves or „normal” photons. Owing to
their specific dispersion properties, i.e. their
energy-momentum relation, surface plasmons
cannot be excited directly by an incoming laser beam but require a grating or a prism as a
so-called plasmon coupler. The corresponding
experimental setup is shown schematically in
Figure 1(A). Briefly, the excitation laser light –
chopped for lock-in detection and linearly ppolarized in the plane of incidence – is reflected off the metal-coated base of the coupling
prism (cf also Fig. 1(B)) and is monitored by a
photodiode as a function of time in a kinetic
scan or as a function of the angle of incidence,
in an angular scan. The reflected intensity passes a sharp minimum at the angle at which
resonance excitation of such a surface plasmon
mode occurs. The exact angular position of this
resonance depends on the details of the interfacial architecture probed by the evanescent,
i.e. exponentially decaying, plasmon field in
the vicinity (Lz~ 150nm) of the metal/dielectric interface. For instance, if the dielectric
medium is an aqueous buffer the time-depen-
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4. Jahrgang | Nr. 3/2003
| 19
Fig. 1: A. Schematics of a
surface plasmon spectrometer in the Kretschmann
configuration extended by
a photomultiplier tube
(PMT) or a CCD camera for
fluorescence detection.
B. Details of the flow cell
attached to the prism
coupler and the liquid
handling system.
dent reflectivity change after injection of a protein solution is a measure for the layer formation by the binding of the proteins to their surface-attached ligands or to other (unspecific)
binding sites. This is the classical Kretschmann
configuration, which is commercially implemented for label-free detection of binding reactions. This measurement scheme, however,
has limitations for very small analytes to be detected or in cases where only a very low surface coverage can be achieved. In these cases
the change in the surface plasmon resonance
conditions, i.e. the resonance angle, is too small
to be detected.
However, should the analyte carry a chromophore, i.e. a dye-labeled antibody, its binding to the sensor surface brings the chromophore into the strongly enhanced optical field
of the surface plasmon mode. The resulting
fluorescence emission that can then be detected by either a photomultiplier tube in the
case of a spectroscopic mode of operation3 or
Fig. 2: The polymer brush architecture of the
interfacial binding matrix at
the surface of
the sensor.
20 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
by a highly-sensitive CCD camera in the
microscopic mode4 allows for protein binding
and dissociation studies with unprecedented
sensitivity.
The Sensor Surface
In a first set of experiments aiming at
– an optimized binding architecture,
– maximizing the fluorescence yield by placing
the dye molecules attached to the analyte at
a distance for which the quantum efficiency
for surface plasmon field-enhanced fluorescence emission is near its optimum, and
– minimizing the loss of intensity by chromophores being quenched in the vicinity of the
(acceptor states of the) metal substrates i.e.
within the Förster radius for energy transfer,
we used the commercial sensor chip CM5
from Biacore mounted to our setup.
We coupled an antibody to the activated dextran matrix of the sensor chip (cf. Fig. 2) and
monitored the increase of fluorescence intensity by the binding of a fluorescently labeled
anti-IgG directly5.
In a second set of sample preparations we
used a streptavidin-based generic coupling
strategy for generating a sensor array by the
inkjet principle: we fabricated a 2x2 matrix
of sensor spots6 (each with ca 300 µm in diameter) by depositing small droplets of different antibody solutions onto a streptavidincoated substrate thus generating an array of
sensing elements with different affinities able
to bind dye-labeled IgGs injected into the
flow cell.
Using the imaging mode of the surface-plasmon field-enhanced fluorescence detection
scheme the parallel read-out of the multiple
binding reactions to the various sensor spots
could be monitored simultaneously, again online and in real time.
Limit of Detection for
Antibody-Antibody Binding
Figures 3A and B document the observed fluorescence intensity monitored in the spectroscopic mode with a photon-counting unit as a
function of time after injection of the chromophre-labeled antibody solutions into the
flow cell (cf Fig. 1B for the continuous flow
mode of the liquid handling system). Note
that we are dealing with protein solutions of
extremely low concentrations. Hence, the observed kinetic behavior is totally mass transfer limited: the linear increase in the observed fluorescence intensity with time originates from dye-labeled antibodies diffusing
from the bulk of the liquid cell to the interface and binding to the surface attached ligands, another antibody in this case.
The slope of the time-dependent fluorescence
increase is a linear function of the injected protein concentration tested over more than 6 orders of magnitude. This is summarized in Figure 3(C). After running the reaction for typically 30 min after each injection pure buffer was rinsed through the cell, which immediately stopped any further intensity increase. Next the sensor surface was regenerated
(all bound fluorescence-labeled antibodies
were removed) by rinsing the cell with 10mM
Glycine solution (pH 1.7), and the next protein solution was injected. As can be seen
from Fig. 3 the reproducibility for several
fresh injections of the same protein concentration was excellent and a lower limit of detection was identified in the several hundred
attomolar concentration range. We should
point out that the lower end of the detection
for a 333 attomolar solution corresponds to
an experimental situation in which 6 protein
molecules per minute and mm2 of the sensor
surface are detected.
Surface Plasmon Fluorescence
Microscopy in an Array Format
In order to document the possibility for multiple parallel read-out of protein binding events
to individual sensor spots in a matrix arrangement on the chip we present the fluorescence microscopic recording of the binding
to an array exposing different antibodies as
ligands of different affinities to the injected antibody solution. In the example documented
in Figure 4 we fabricated an array of 2x2 spots
with each row of sensor elements being
functionalized with a different antibody: the
upper row exposes a biotinylated anti-hIL8 antibody whereas the lower row has biotinylated anti-mouse antibodies, both systems coupled via biotin-streptavidin conjugation. The
first fluorescence microscopy picture was ta-
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왘
Conclusions
Fig. 3: Protein binding assay in the mass transfer
limited regime of low analyte concentrations.
Increase of fluorescence intensity after injection of
anti-IgG solutions of low concentrations (A, B). Note
that A and B were recorded with different optical
(attenuator) configurations. C summarizes the slopes of the linear intensity increase after each protein injection taken from A and B. Note the linearity of
this calibration curve over 6 orders of magnitude.
ken 5 min after injection of a 30 nanomolar
solution of fluorescently-labeled mouse-IgG,
whereas the second frame shows the fluorescence intensities after 1h of reaction time.
The presented examples document that surface plasmon field-enhanced fluorescence
spectroscopy results in a significantly improved limit of detection in protein binding assays. This was possible by the concerted action of 3 factors: (1) the intrinsic sensitivity of
fluorescence detection schemes, (2) the optical field enhancement at resonant excitation
of surface plasmon modes, and (3) an optimized binding matrix at the sensor surface
providing multiple binding sites for the analyte and taking care of the distance dependence of fluorescence emission of chromophores near metal surfaces. This way, a few
molecule detection limits could be reached.
The microscopic mode of surface plasmon
fluorescence, in addition, will allow for a parallel detection of these binding events in an
array format.
Figure 4: Surface plasmon fluorescence microscopic images taken from a 2x2 array of sensor
spots functionalized with 2 different antibodies
(ant-hIL8 and anti-mouse) after injection of a
30 nM solution of mouse-IgG. The left panel was
taken after 5 min, the right panel after 1h.
References
[1]
[2]
[3]
Contact
Prof. Dr. Wolfgang Knoll
Max-Planck-Institute for Polymer Research
Ackermannweg 10
D-55128 Mainz
Tel. / Fax:: +49-(0)6131-379-160 / -360
[4]
[5]
[6]
Neumann, T.; Johansson, M. L.; Kambhampati, D.; Knoll, W. SurfacePlasmon Fluorescence Spectroscopy Advanced Functional Materials 12,
575-585 (2002)
Knoll, W. Interfaces and Thin Films as Seen by Bound Electromagnetic
Waves Ann. Rev. Phys. Chem. 49, 569-638 (1998)
Kambhampati, D.; Nielsen, P. E.; Knoll, W. Investigating the Kinetics of
DNA-DNA and PNA-DNA Interactions Using Surface Plasmon ResonanceEnhanced Fluorescence Spectroscopy Biosensors and Bioelectronics 16,
1109-1118 (2001)
Liebermann, T.; Knoll, W. Parallel Multispot Detection of Target Hybridization to Surface-Bound Probe Oligonucleotides of Different Base Mismatch
by Surface-Plasmon Field-Enhanced Fluorescence Microscopy Langmuir
19, 1567-1572 (2003)
Yu, F.; Yao, D.; Knoll, W., Anal. Chem. 000, 00-00 (2003)
Zizlsperger, M.; Knoll, W. Multispot Parallel On-line Monitoring of Interfacial Binding Reactions by Surface Plasmon Microscopy Progress in Colloid
& Polymer Science109, 244-253 (1998)
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| 21
B L I T Z L I C H T
RNA Interference
왔
Real-Time-PCR for Measuring
Gene Silencing by RNAi
Lee Honigberg, Stefany Snyder, Jill Spoerke, Celera Genomics, South San Francisco, USA;
Kathleen Shelton, Applied Biosystems, Foster City, USA
We have applied the recently discovered techniques for RNAi in mammalian cells1 to generate
knockdown reagents for a set of 50 genes. In order to identify effective siRNAs (>80% knockdown), we used Applied Biosystems Assays-on-Demand Gene-Expression products to quantify mRNA levels. We evaluated these predesigned TaqMan reagents using a dilution series of
cell line RNA and found that their sensitivity and reproducibility allowed reliable measurement of low transcript levels following knockdown. Using Assays-On-Demand to measure
knockdown, we tested candidate siRNA sequences in batches of three per gene until a successful siRNA was found. For a subset of genes, a second potent siRNA was generated to
allow confirmation of phenotypic effects using two independent knockdown reagents.
One-tube TaqMan Real-Time RT-PCR was performed using Amplitaq Gold and standard
conditions in 25ul reactions on the SDS 7700
(Applied Biosystems). Manually designed
TaqMan reagent sequences were chosen using
a combination of Primer Express software and
manual review to select at least one intronspanning primer. Standard curves for TaqMan
validation were performed in duplicate using
a 5-point dilution series from 50ng to 0.2 ng of
total RNA from PC3 cells. TaqMan standard
curve „pass” required R2 > 0.98 and a slope in
log2 vs. Ct plot between 0.9 and 1.2. siRNA
sequences were selected based on standard
criteria2. Some sequences were tested using in
vitro transcribed siRNAs (Ambion), but all
Fig. 1: Assays-on-Demand reagents use a
quenched-fluorescence probe with Minor Groove
Binder (MGB). MGB increases Tm and allows use
of shorter probes.
data shown here are from chemically synthesized siRNAs (Dharmacon and Xeragon). siRNAs were transfected into PC3-cells at 100 nM
in serum containing media using siRNA optimized transfection lipids (Ambion, Gene
Therapy Systems, Invitrogen, Mirus, Novagen, Qbiogene or Stratagene). Transfections
were performed in duplicate in 96-well plates
and cells were harvested 48 hours after transfection. One tenth of the RNA from each well
was analyzed by TaqMan and mRNA levels
for each gene were normalized to the amount
of total RNA as measured by Ribogreen (Molecular Probes). The amount of total RNA in
each TaqMan reaction was typically 10-40 ng.
Treated cells were normalized relative to untreated control cells processed in parallel.
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22 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
LABORWELT
B L I T Z L I C H T
Results
A common problem encountered in mammalian cell RNAi is that not all siRNAs work
equally well for gene knockdown. Real-time
RT-PCR was used to allow screening of large
numbers of siRNAs for mRNA knockdown.
In a comparison between manually designed
Taqman reagents and Assays-On-Demand
pre-designed Taqman reagents (Fig. 1), we
found that Assays-on-Demand reagents yielded greater absolute changes in fluorescence
following amplification and produced more
reproducible signals at later PCR cycles (Fig.
2). Prior to screening for siRNAs, Taqman
reagents were validated using a dilution series of RNA. Based on these experiments, we
were able to use 65 out of 67 (97%) of the Assays-on-Demand reagents tested.
To screen candidate siRNAs, we transfected them into PC3 tumor cells grown in 96well format and measured mRNA knockdown after 48 hours. For each gene, three
siRNAs were tested at a time until a potent
siRNA was identified. Sample screening data
for eight genes is shown (Fig. 3A). In total,
we screened 356 siRNAs against 64 genes.
The average number of siRNAs screened in
order to find one that induced >80% knockdown was 4.2. Effective siRNAs for 50 genes
were identified (Fig 3B). Thirteen siRNAs
from this group induced a particular cellular
phenotype (not shown) and more siRNA sequences for these genes were tested to find a
second potent siRNA. Figure 3C shows sample Taqman quantitation for these 13 genes
and illustrates knockdown with two indepen-
Manually Designed Probeset
Applied Biosystems Assays-on-Demand Probeset
Fig. 2: Manually designed TaqMan reagents compared with Assays-On-Demand TaqMan reagents.
Real-time RT-PCR amplification plots are shown for two genes using a dilution series ranging from 50 ng
to 0.2 ng of total RNA.
dent siRNAs and the absence of knockdown
from a negative control „scramble” siRNA.
Phenotypic assays were then tested for confirmation using these siRNA pairs.
offer an easily accessible solution to the problem of finding high quality TaqMan reagents
for measuring gene knockdown.
References
Conclusions
Gene function experiments using RNAi demand careful control of a wide range of variables affecting transfection efficiency and subsequent phenotypic assays. Having a rapid
and quantitative measure for target gene
mRNA levels in each experiment allows successful optimization of a large number of experimental parameters. Assays-on-Demand
[1]
[2]
Elbashir et al, Nature 411:494
http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html
Contact
Applied Biosystems/Applera Deutschland GmbH
Frankfurter Str. 129 B, 64293 Darmstadt
Tel./Fax: +49 (0) 6154-696-440 / - 619
[email protected]
http://europe.appliedbiosystems.com/
A
B
C
Fig. 3: (A) siRNAs were screened using Assays-On-Demand to quantitate mRNA levels. Red arrows indicate identification of siRNAs that yield >80% knockdown. (B) Successful siRNAs were identified for a set of 50 genes. (C) A second siRNA was identified for use in confirmation assays.
LABORWELT
| 23
24 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
Transfektion von Säugerzellen
siRNA-Oligos funktionell getestet
–
–
–
–
Säuger-und Insektenzellen
Abhängig von transfizierter siRNA
–
–
–
–
6. Für welche Organismen/Zelltypen
7. Validierter Knock-down
(Welche Zellinie? Wieviel %
Knock-down wird erreicht?)
8. Angebotene RNAi-Dienstleistungen
9. Eigene Patente/
vorhandene Patentlizenzen
10. Kundenservice
11. Extras/Besonderheiten
550,- g pro siRNA-Oligo
In vitro synthetisierte siRNA-Oligos
Für siRNA-Transfektion von Zellinien und
Primärzellen
5. siRNA-Bildung in vitro/in vivo
• 175,- g für 1 ml (mindestens 160
Transfektionen)
• 40,- g für 0,2 ml (mindestens 32
Transfektionen)
ungelabelte siRNA-Oligos
Liposomen-Kombination aus
polykationischem Lipid und neutralem
Lipid, Lagerung bei 4°C
4. Produktmerkmale
12. Preis (Euro)
25 verschiedene si-RNA-Oligos zum Knock- Kits: siRNA-Pools plus Kontroll-siRNA-Pool, in vitro-Transcription-Kit
down von 25 verschiedenen spezifischen
mit Kontroll-Antikörper, Kontroll-Zellysat
Transkriptionsfaktoren
und Puffer
Transfektionsreagenz für siRNA
3. Kurzbeschreibung/Merkmale
790,- g
• Durch 2’-ACE-Synthese sehr homogene
Oligos
• hohe Knock-down-Quote durch
SMARTselection und SMARTpooling, mit
Kontroll-Antikörpern und KontrollZellysaten von Upstate
Ja
Patente bei Dharmacon
Keine Angaben
• 97 % Wahrscheinlichkeit für 50% Knockdown
• 75 % Wahrscheinlichkeit für 95 % Knockdown
• Garantierter Knock-down:
50 % Knock-down oder mehr mit 100 nM
siRNA, 24 h Inkubation
• Getestet und validiert in HeLa- und
HEK293-Zellen.
Für Menschen
siRNA-Bildung in vitro
• 2’-ACE-synthetisierte, aufgereinigte,
deprotektierte, entsalzte, doppelsträngig
annealte Oligos von 21 Basenpaaren Länge
sowie UU-Überhang und 5’-Phosphat,
ungelabelt, mit mind. 50% mRNA-Knockdown
• Lagerung bei -20 °C, 5 nmol + 1 nmol
(Kontrolle)
• Qualitätskontrolle: Duplexbildung – Nondenaturing gel electrophoresis, Masse –
MALDI-TOF-Massen-Spektroskopie
TM
DuraScribeTM T7 Transcription-Kit (25
Reaktionen): 619,- g
DuraScribe T7 Transcription-Kit erzeugt
2’Fluor-modifizierte RNA-Transkripte
(vollständig resistent gegen RNase A)
Keine
US Patente: 5,849,546 und 6,107,037
Keine
Keine
Keine speziellen
In vitro-Transcription-Kit für Sequenzen
(dsOligos, Plasmide, PCR-Produkte) unter
Kontrolle des T7-Promotors
Erzeugung von etwa 50 µg 2’-Fluormodifizierter RNA (aus 1 µg Template DNA),
vollständig resistent gegen RNase A,
stabiler in der Lagerung
DuraScribeTM T7-Transcription-Kit von
Epicentre Technologies Corp.
siRNA/siABTM (Dharmacon/Upstate)
Transcription Factor siRNAs
siFector
2. Produkt/Linie
Biozym Diagnostik GmbH
Postfach
D-31833 Hessisch Oldendorf
Ansprechpartner: Dr. Bernhard Nußbaumer
Tel.: +49-(0)5152-9020
Fax: +49-(0)5152-2070
www.biozym.com
Biomol GmbH
Waidmannstr. 35
D-22769 Hamburg
Ansprechpartner: Frau Dr. Katja Jansen
Tel.: +49-(0)800-2466-651
+49-(0)40-8532-600
Fax: +49-(0)800-2466-652
+49-40-8532-6022
www.biomol.de
BioCat GmbH
Im Neuenheimer Feld 581
D-69120 Heidelberg
Ansprechpartner Dr. Michael Ehret
Tel.: +49-(0)6221-585-844
Fax: +49-(0)6221-585-809
www.biocat.de
BioCat GmbH
Im Neuenheimer Feld 581
D-69120 Heidelberg
Ansprechpartner Dr. Michael Ehret
Tel.: +49-(0)6221-585-844
Fax: +49-(0)6221-585-809
www.biocat.de
1. Firmenanschrift/Ansprechpartner
• AmpliScribeTM T7-FlashTM TranscriptionKit (50 Reaktionen): 279,- g
• AmpliScribeTM T7-, T3- und SP6 High Yield
Transcription-Kit (50 Reaktionen): 245,- g
AmpliScribeTM T7-FlashTM Transcription-Kit
erzeugt 160-180 µg RNA in 30 Minuten
Keine
Keine eigenen Patente. Für RNAiExperimente gelten die Patente der
Carnegie Institution of Washington, USA
Keine
Keine
Keine speziellen
In vitro-Transcription-Kits für Sequenzen
unter Kontrolle des T7-, T3- und SP6Promotors
in vitro-Transcription-Kit zur Erzeugung von
bis zu 180 µg RNA mit dem AmpliScribeTMT7-FlashTM-Transcription-Kit in 30 Minuten
und bis zu 150 µg RNA mit den
AmpliScribeTM T7-, T3- und SP6-High Yield
Transcription-Kits in zwei Stunden (jeweils
aus 1 µg Template DNA)
in vitro-Transcription-Kits
AmpliScribeTM T7-, T3-, und SP6Transcription-Kits (Flash und High Yield)
von Epicentre Technologies Corp.
Biozym Diagnostik GmbH
Postfach
D-31833 Hessisch Oldendorf
Ansprechpartner: Dr. Bernhard Nußbaumer
Tel.: +49-(0)5152-9020
Fax: +49-(0)5152-2070
www.biozym.com
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LABORWELT
LABORWELT
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Not specified
10. Kundenservice
12. Preis (Euro)
9. Eigene Patente/vorhandene
Patentlizenzen
8. Angebotene RNAiDienstleistungen
Welche Zellinie? Wieviel %
–
Production time: approx. five
working days for dsRNA
On request
All organisms / cell types
transfectable human cell lines
Many siRNAs available via
–
Ambion will be validated to at
least 70 % knock-down within
48 hours in HeLa cells.
• HT RNAi-based screening
–
for target gene discovery:
– Genome-wide or focused on
spec. groups of genes; – In C.
elegans, Drosophila and
mammalian cells; – Use of
synthetic dsRNAs allows wide
range of user-defined assays
and cell lines; – Online DB
access: direct monitoring,
annotation and web
dissemination
• RNAi-based characterization of gene function/target
validation: parallelized infrastructure; cross-genomic
analysis of function (human,
Drosophila, C. elegans);
readout assays and cell lines
• Custom Design of siRNA
libraries: Proprietary algorithms used for large scale
Not specified
–
5. siRNA-Bildung in vitro/ in vivo Not specified
C. elegans, Drosophila, all
6. Organismen/Zelltypen
4. Produktmerkmale
Reagents: – human genomewide library of optimized
siRNAs (soon available via
Ambion Inc.); – optimized
siRNAs for custom human
gene sets (soon available via
Ambion Inc.);
– Drosophila genome-wide
library of optimized dsRNAs
(available now); – C. elegans
genome-wide library of optimized dsRNAs (available now)
Both reagents are covered
under Invitrogen’s Limited
Use Label License
Extensive product citations in
online Cell Lines Database
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– 0.75 ml, cat. no. 11668-027,
299,- g; – 1.5 ml, cat. no.
11668-019, 498.- g
• OligofectamineTM 1ml, cat.
no. 12252-011, 343,- g
All commonly used cell types
and primary& neuronal cells
In-house data:
CHO cells: 75 %,
293 cells: 90 %,
BHK cells: 95%
None
Cationic lipid reagents f. genedelivery in mammalian cells
• LipofectamineTM 2000:
– Proprietary cationic lipid
reagent designed for transfection of nucleic acid sequences into mammalian cells;
– Low toxicity, simple protocol
and efficient delivery of
nucleic acids in presence or
absence of serum: ideal for
high-throughput-screening of
sequences in many cell and
tissue types; – Effective gene
silencing in many difficult to
transfect cell types;
• OligofectamineTM:
– Proprietary lipid reagent;
Exhibits superior complexing with short nucleic acidsequences: for transfection of
antisense DNA-oligos as well
as siRNA molecules
Primarily used in vitro
ssRNA and dsRNA with all
modifications
• PAGE purified (>95 % purity)
• HPLC and PAGE quality
controlled
• modifications: e.g. 2'-Amino,
2'-Fluoro, 2'-O-Methyl, Inosine
• dye
• labeled
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Transfection Reagents
Custom dsRNA-synthesis
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service programmes (see 8)
• Reagents: (see 4)
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D-37079 Göttingen
Ansprechpartner: Dr. Kai Franke
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26 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
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RNA-Oligo-knock-out-Anwendungen
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Transfektions-Reagenz)
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Individuelle technische Beratung vor Ort oder via free
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Affinitäts-Chromatographie >90 % rein • Ultrapure
siRNA, HPLC, >97 % rein • Crude siRNA, 80 bis 85 %
rein
– Libary siRNA: Ultrapure siRNA, HPLC, >97 % rein (z.B.
negativ und positive Kontrollen sowie publizierte siRNA
Sequenzen)
– Cancer siRNA Oligo Set (1.0): Je zwei siRNAs für 139
Gene aus dem Bereich Krebs (Onkogene,
Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Kinasen, TumorSupressor-Gene u.a.)
– Qualititätskontrolle: HPLC / MALDI-TOF
– Angebotene Modifizierungen: 3'-Fluorescein (6-FAM),
5'-Fluorescein (6-FAM) • 3'-TAMRA (Rhodamine), 5'TAMRA (Rhodamine) • 5'-Hex, 5'-TET, 5'-Phosphate u.a.
– Angebotene Mengen in nmol: HPP Grade siRNA
(garantierte Menge 20 nmol) • HPP Grade siRNA
(garantierte Menge 40 nmol) • HPLC-purified siRNA
(Synthese Scales 0.2 µM und 1 µM) • HPLC-purified
siRNA mit Modifikationen (Synthese Scales 0.2 µM und
1 µM) • Crude siRNA (Synthese Scales 0.2 µM und 1
µM) • Weitere Synthese Scales auf Anfrage • HPP
Grade siRNA auch im 96-well-Format erhältlich
• Hohe Transfektionseffizienz bei minimaler Toxizität
• Geeignet zur Transfektion einer großen bandbreite
verschiedener Zellen
• Einfaches und schnelles Protokoll
• Kein Serumwechsel nötig • Transfektion in
Gegenwart von Serum
• Endotoxin level <10 EU/ml
• Getestet auf die Abwesenheit von RNase-Aktivität
Schnell, direkt und kostengünstig da
• kein RNA- oder Oligo-Handling und keine Klonierung
notwendig;
• einfaches Arbeiten mit DNA Primern;
• wesentlich verlängerte Target-gene-supression im
Vergleich zu RNA-Oligos und
• das System alle Komponenten für PCR Ansatz, PCRAufreinigung und Transfektion beinhaltet
4. Produktmerkmale
• RNAiFect Transfections Reagent: Speziell entwickelt
• Custom siRNA
für die Transfektion von siRNA
• Libary siRNA
• RNAi Starter Kit: Enthält RNAiFect Reagent, Lamin
• Cancer siRNA Oligo Set (1.0)
A/C siRNA (5nmol), Non-silencing flourescein-labeled
control siRNA (5nmol) und ein ausführliches Handbuch.
Auf PCR und U6-Casette basierendes in vivo-RNAiSystem für Säugerzellen. Target-Gen-Supression nach
Transfektion der DNA.
Automatisierte Validierung von siRNAs und Targets mit
Hilfe von RNA-Interferenz, automatisierte Functional
Assays
–
Auf Anfrage
–
–
Service
Automatisierte Validierung von siRNAs und Targets mit
Hilfe von RNA-Interferenz
RNAx GmbH
Breddiner Weg 5
D-13591 Berlin
Ansprechpartner: Dr. Jörg Pötzsch
Tel.: +49-(0)30-4863-7389
Fax: +49-(0)30-4863-7379
Web: www.RNAx.de
Validierungen erfolgen im Hochdurchsatz
Siehe 8
Bsp.: HPP Grade siRNA (garantierte Ausbeute 20 nmol) Auf Anfrage
304,- g. Weitere Infos auf Anfrage.
Kostenloses siRNA-Online-Design-Tool unter
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Technischer Service: +49-(0)2103-29-12400
• Patent RNA-Synthesechemie: US Patent 5,986,084
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• Co-exklusive Lizenz: US Pat. Anmeldung 60/265232,
09/821832 und PCT/US01/10188 (RNA Sequence-Specific
Mediators of RNA Interference, D. P. Bartel, P. A. Sharp,
T. Tuschl und P. D. Zamore from MIT)
• siRNA Design-Service, siRNA-Transfektionsreagenz
–
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siRNA-Synthesis-Service
Transfektions Reagenz:
• RNAiFect Transfection Reagent,
(1ml), Katalognummer 301605
(4x1ml), Katalognummer 301607
(100ml), Katalognummer 301608
• RNAi Starter Kit, Katalognummer 301699
siLentGeneTM U6 Cassette RNA Interference-System,
Katalognummer C7800
2. Produkt/linie
QIAGEN GmbH
Qiagen-Straße 1
D-40724 Hilden
Ansprechpartner: Dr. Bettina Möckel
Tel.: +49-(0)2103-2912-130
www.qiagen.com
QIAGEN GmbH
Qiagen-Straße 1
D-40724 Hilden
Ansprechpartner: Dr. Constanze Kindler
Tel.: +49-(0)2103-2916-236
Fax: +49-(0)2103-2926-236
www.qiagen.com
Promega GmbH
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D-68199 Mannheim
Ansprechpartner: Dr. Uwe Mohr
Tel.: 0621-8501-100
Fax: 0621-8501-222
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| 31
B L I T Z L I C H T
Automation
왔
Neue Möglichkeiten in der
automatisierten Proteinanalytik
Dr. Carsten Mang, Hamilton Life Science Robotics, Hamilton Bonaduz AG
Nach der Entzifferung des menschlichen Genoms gilt das Interesse der Forschung nun dem
Proteom – der Gesamtzahl aller vorhandenen Proteine in einer Zelle, einem Organismus
oder Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter bestimmten Bedingungen. Hierbei
interessieren neben der Identifizierung und Charakterisierung der Proteine auch die Struktur
sowie die Wechselwirkungen von Proteinen miteinander und mit anderen organischen Verbindungen. Um auch laborübergreifend reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, ist es ein
Ziel, alle arbeitsintensiven Schritte möglichst automatisiert zu erledigen. Dieser Artikel beschreibt neue Wege zur Automation verschiedener Methoden der Proteinanalytik auf einer
einzigen Geräte-Plattform.
Key Words: Proteomics, Proteinanalytik, Automation, In-Gel-Verdau, MALDI-Target-Spotting,
Proteinkristallisation
Der Identifizierung und Charakterisierung
von Proteinen ist die Auftrennung des Proteoms mittels 2-D-Gelelektrophorese vorgeschaltet. Dies ist die derzeit in der Proteomforschung meistgenutzte Trenntechnik, die
von allen derzeit bekannten Verfahren, über
die größte Trennkapazität verfügt. Mittels
Imagingsystemen werden die angefärbten
Gele fotografiert und anschließend Proteinspots von Interesse ausgestanzt und in
Mikrotiterplatten transferiert. Den zeitaufwendigen In-Gel-Verdau und das Spotten
der Proben auf ein MALDI-Target hat Hamilton auf der MICROLAB ® STAR-Plattform automatisiert (Abb. 1).
In-Gel-Verdau und
MALDI-Target-Spotting
Die ausgestanzten Gelstücke werden mit
Wasser/Acetonitril gewaschen und anschließend die Proteine mit DTT bei 55° C
reduziert und mit Iodacetamid im Dunkeln
bei Raumtemperatur alkyliert. Ein Verdampfen der Flüssigkeit während der Inkubationsschritte aus den Wells auf einen
Temperatur-kontrollierten Mikrotiterplattenträger wird mittels speziell entwickelter Deckel verhindert, die eine homogene
Temperaturverteilung in Z-Richtung gewährleisten. Nach weiteren Waschschritten
werden die Proteine mit Trypsin verdaut
und anschließend die erhaltenen Peptide
extrahiert.
Ein unbeabsichtigtes Aufnehmen der
Gelstücke – ein immerwährendes Problem
der Automatisierung des In-Gel-Verdaus –
wird durch aktive Kontrolle der Aspiration („Monitored Air Displacement“) mittels
Druck-LLD und automatischem Fehlerhandling vermieden. Sobald ein bestimmter Grenzwert des Drucksensors auf einem
beliebigen Pipettierkanal unterschritten
wird – sobald also ein Gelstückchen den Tip
blockiert –, dispensiert dieser Kanal alles
wieder im Freistrahlmodus in das Ursprungswell zurück und wiederholt mit
diesem Kanal die Aspiration.
Der Peptidextrakt wird ankonzentriert
und kann, falls gewünscht, über Zip-Tips
entsalzt werden oder direkt auf speziellen
MALDI- Targets gewaschen werden. Dank
Hamiltons patentierter CO-RE-Technologie
kann die Pipettiergenauigkeit von ≤ 0,1mm
entlang allen Achsen bis in die Tipspitzen
übertragen werden. Der Abstand des Tips
zum MALDI-Target wird mittels kapazitiver LLD-Messung aktiv bestimmt und gespeichert, so daß der Tip bei weiteren
Waschschritten die Oberfläche des MALDITargets nicht wieder berührt. Dadurch resultieren kleine Spotdurchmesser (ca. 1
mm) und damit eine homogene Peptidverteilung im Spot (Abb. 2). Verluste von bereits gespotteten Peptidproben bei weiteren
Waschschritten auf dem Target durch anhaftende Peptid/Matrixkristalle an der TipSpitze selbst können so vermieden werden.
Der MICROLAB® STAR kann bis zu 768
Proteine in 20 Stunden enzymatisch verdauen und die Peptide anschließend auf
das MALDI-Target spotten.
Automatisierung der
Proteinkristallisation
Abb. 1: Der MICROLAB® STAR-Pipettierroboter von HAMILTON mit patentierter CO-RE-Technologie und
Monitored Air Displacement – eine flexible einsetzbare Plattform, die für eine Vielzahl von Applikationen eingesetzt werden kann.
32 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
Eine Strategie, um 3-D-Strukturinformationen von Proteinen zu erhalten, ist die Kristallisation der Proteine in Gegenwart von
Präzipitatlösungen und nachgeschalteter
Röntgenstrukturanalyse. Bei der Kristallisation verfolgt Hamilton zwei Ansätze: Es
können fertig gemischte Präzipitatlösungen
zum Screening diverser Bedingungen verwendet und anschließend die Bedingungen
feiner abgestimmt werden (Abb. 3).
Werden Fertiglösungen eingesetzt, können die Deep-Well-Platten nach Verwendung mit einem Anti-Evaporationsdeckel
abgedeckt werden, so daß sich die Zusammensetzung der fertigen Präzipitatlösung
nicht durch Verdunsten verändert. Die Mikrotiterplatten werden zusammen mit
dem Anti-Evaporationsdeckel durch den
MICROLAB® SWAP – einen externen Greifer – auf dem Deck des MICROLAB® STAR
plaziert. Anschließend werden die Reservoir- Wells befüllt und danach 0,5 µl oder 1
LABORWELT
B L I T Z L I C H T
Abb. 2: Proteins-Spots auf dem MALDI-Target
µl Proteinlösung zusammen mit der entsprechenden Menge Reservoirlösung in die Mikrokavität der Kristallisationsplatten transferiert. Sobald eine Reihe der Kristallisationsplatte befüllt ist, wird
diese durch einen Anti-Evaporationsdeckel abgedeckt (Abb. 4), um
ein Austrocknen der Mikrokavitäten zu verhindern und konstante Bedingungen zu gewährleisten. Ist eine Platte fertig prozessiert,
wird diese zurück ins Plattenhotel gestellt und die nächste abgearbeitet.
Ausgehend von Stammlösungen können auch von Anfang an
Präzipitatlösungen direkt in den Reservoir-Wells der Mikrotiterplatten gemischt werden. Hierzu werden für jede Mikrotiterplatte, die befüllt werden soll, Arbeitslisten erstellt und mit Barcode
versehen. Nicht komplett ausgefüllte Arbeitslisten werden nicht
abgearbeitet. Die abzuarbeitenden Mikrotiterplatten werden mit
Barcode- Label in das Plattenhotel gestellt. Anschließend wird geprüft, ob für jede Arbeitsliste eine Mikrotiterplatte existiert. Ist dies
nicht der Fall, wird auch diese Arbeitsliste oder die entsprechende
Mikrotiterplatte von der Abarbeitung ausgeschlossen. Abschließend wird geprüft, ob in den Reagenzwannen genügend Flüssigkeit vorhanden ist, um den Arbeitslisten entsprechend die Mischungen direkt in den Wells herzustellen. Alle Test dienen dazu,
einen reibungslosen Ablauf der Pipettierung ohne Anwendereingriff zu gewährleisten. Die eigentliche Plattenpipettierung erfolgt
dann wie oben beschrieben.
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Abb. 3: Links: Aus einem kommerziell erhältlichen Protein-KristallisationKit können viele kleine Kristalle gewonnen werden. Rechts: Dasselbe Protein – nach einem fein abgestimmten Screen kristallisiert – ergibt wenige,
größere Kristalle.
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Werden fertige Kit-Lösungen verwendet,
ist die Kristallisations-Workstation in der
Lage, alle 25 Minuten eine 96-Well-Kristallisationsplatte zu befüllen. Sollen die Präzipitatlösungen gemäß Arbeitslisten in der
Mikrotiterplatte gemischt werden, so arbeitet die Workstation pro Stunde eine 96Well-Kristallisationsplatte ab.
Proteinexpression
왔
Expressionssysteme in der
Proteinforschung
Zusammenfassung
Dr. Burkhard Ziebolz, Roche Diagnostics
Mit der vielseitigen MICROLAB ® STARPlattform bietet Hamilton Lösungen für die
Proteinidentifizierung und -charakterisierung sowie für die Kristallisation an. Trotz
der unterschiedlichen Applikationsanforderungen, kann die Plattform sehr einfach
für die genannten Applikationen ausgerüstet werden. Der modulare Deckaufbau, die
Nach der heißen Phase der Genomanalyse hat die Proteinforschung in den letzten Jahren
enorm an Bedeutung gewonnen. Bei der Untersuchung der genetischen Komponente von
Krankheiten etwa reicht es meist nicht, die beteiligten Gene und ihre DNA-Sequenz zu kennen. Um die Ursachen dieser Krankheiten zu verstehen und zu kontrollieren, ist es entscheidend die Vorgänge auf Proteinebene zu kennen – die Hunderttausende von Proteinen, die im
menschlichen Körper für die entsprechenden metabolischen Prozesse verantwortlich sind.
Derzeit wird eine große Zahl genomischer Sequenzen mit bioinformatischen Methoden analysiert, um Vorhersagen über Genprodukte und deren Funktion zu treffen. Um diese Vorhersagen bezüglich kodierter Proteine experimentell zu bestätigen oder um die Funktion und
Struktur unbekannter Proteine zu ermitteln, müssen diese zunächst in ausreichender Menge
vorliegen. Hier lag bislang eines der größten Hindernisse der Analyse: Es gab keine Technik,
die schnell und bequem die Proteinexpression ermöglichte. Zell-basierte Expressionssysteme arbeiten zum Teil langsam und führen unter Umständen zur Ausbildung unlöslicher Inclusion Bodies, toxischen Effekten oder dem Abbau des gebildeten Zielproteins durch zelluläre
Enzyme. Sofern die zellbasierten Systeme das Zielprotein nicht sekretieren, muß dieses nach
der Expression in funktionell aktiver Form und mit guter Ausbeute hochrein isoliert werden.
Die meisten Organismen oder Zellen eignen sich nicht zur Expression rekombinanter Proteine. Für ihre Produktion wird daher ein geeigneter Wirtsorganismus (Host)
benötigt .
Fig. 4 : Der externe Greifer MICROLAB® SWAP
deckt die frisch pipettierte Reihe der Kristallisationsplatte mit einem speziellem Anti-Evaporationsdeckel ab. Dies verhindert ein Austrocknen der Mikrokavitäten während des weiteren
Prozesses.
hohe Präzision der Pipettierkanäle entlang
aller Achsen – die durch die patentierte CORE-Technologie gewährleistet ist – und die
mittels Druck-LLD und kapazitiver LLD
überwachte Aspiration ergeben ein hohes
Maß an Flexibilität. . Auch weitere Applikationen wie etwa die Reinigung rekombinanter Proteine oder genomische Applikationen (Plasmid-Isolierung, PCR-Aufreinigung etc.) sind bei sehr guter Reinheit und
Ausbeute leicht auf der vielseitig einsetzbaren Plattform durchzuführen.
Zellbasierte Expressionssysteme
Häufig werden bakterielle Expressionssysteme verwendet, meist mit E. coli. Diese verursachen geringe Kosten und arbeiten - verglichen mit anderen Systemen – schnell. Zudem
ist die Ausbeute an rekombinantem Protein
relativ hoch. Gleichwohl liefert die Expression in E. coli nur begrenzte Erfolge, insbesondere bei der Expression nicht-bakterieller Proteine, da diese oft nicht kompatibel mit den
Dr. Carsten Mang
HAMILTON Bonaduz AG
Via Crusch 8
CH-7402 Bonaduz
Tel.: +41-(0)81-660 6216
34 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
Abb. 1: Das RTS-Reaktionsgefäß besteht aus
einer Reaktionskammer für die eigentliche gekoppelte Transkriptions/Transaltionsreaktion und
einer Versorgungskammer.
E.coli-Expressions- und -Stoffwechselsystemen sind. Daraus resultieren häufig Probleme wie die Aggregatbildung und der Abbau
des produzierten Proteins.
Andere bakterielle Expressionssysteme sind
Bacillus, Caulobacter, Pseudomonas und Streptomyces. Grundsätzliches Manko aller bakteriellen Expressionssysteme, ob zellbasiert oder
zellfrei: rekombinante eukaryotische Proteine
werden nicht posttranslational modifiziert –
für die Funktion vieler humaner oder Säugetierproteine eine essentielle Voraussetzung.
Alternativ zu bakteriellen Systemen stehen
verschiedene eukaryotische Expressionssysteme zur Verfügung, wie zum Beispiel die
Hefen Saccharomyces, Pichia pastoris oder Hansenula polymorpha. Weil Hefen jedoch andere
posttranslationale Modifizierungsschemata
besitzen als Säuger, müssen viele eukaryotische – speziell humane und aus Säugetieren
stammende – Proteine in Insekten- oder Säugetierzellen (z.B. CHO-Zellen) angereichert
werden. Nachteil dieser Verfahren sind ein
komplexes Handling, höhere Kosten, geringere Ausbeuten und ein höherer Zeitaufwand
als in den Einzellersystemen.
Nach der Anreicherung werden die rekombinanten Proteine aus einem Mix von tausenden Proteinen aufgereinigt. Dabei gibt es klassische chromatographische Aufreinigungsverfahren, die das rekombinante Protein in
der Sequenz unverändert lassen, oder TagVerfahren. Bei diesen wird ein hochaffines
Protein-Fragment oder Peptid (Tag) mit dem
LABORWELT
왘
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zu untersuchenden Protein fusioniert und
durch Bindung des „Fänger-Tags“ an einer
Affinitätssäule in einem Schritt aufgereinigt.
Auch in transgenen Pflanzen und Tieren
wird die Proteinexpression erforscht. Diese
Art der Expression wird allerdings in der Öffentlichkeit zur Zeit heftig kontrovers diskutiert, so daß der Zeitrahmen bis zu ihrer Etablierung schwer abzuschätzen ist.
tausch von Substraten zwischen den beiden
Kammern ermöglicht, kann die Reaktion
über 24 Stunden aufrechterhalten und so die
Ausbeute an exprimiertem Protein gesteigert
werden.
RTS liefert in vier Schritten vom Gen das
gewünschte Protein – in Mikrogramm-Mengen (in 2 h) bis über 10 Milligramm (in 24 h).
DNA-Sequenz
Zellfreie Expressionssysteme
Um die Nachteile zellbasierter Systeme zu
vermeiden, wurden in der Vergangenheit
verschiedene zellfreie Verfahren entwickelt
(Abb. 1). Die in vitro-Systeme basieren meist
auf Extrakten von E. coli, Weizenkeimen oder
Kaninchen-Retikulozyten. Sie enthalten alle
Komponenten für die Expression – Amino-
Eine erfolgreiche Proteinexpression gründet
sich auf eine geeignete DNA-Sequenz. Die
Gensequenzen, die zur Expression eingesetzt
werden, sind oft schwer zu optimieren. Hier
hilft der Web-Service ProteoExpert, die Arbeit zu beschleunigen: Der Kunde teilt über
die Website www.proteoexpert.com die Nukleotidsequenz seiner DNA mit. ProteoExpert errechnet Sequenzvariationen, die – ohne
die Sequenz des Zielproteins zu verändern –
einen ausbeutesteigernden Einfluß haben.
Gegen eine Gebühr gibt es zehn Vorschläge
für verbesserte DNA-Sequenzen plus Informationen über die Reaktionsbedingungen
zur Herstellung der dazugehörigen DNAMoleküle.
Template-Herstellung über PCR
Abb. 2: Schema der zellfreien Expression von
Proteinen.
säuren, Ribosomen und energieliefernde
Moleküle wie ATP. Die Ausbeuten dieser Kits
sind meistens begrenzt, weil sich die Bausteine der Translationsmaschinerie relativ schnell
aufbrauchen; außerdem reichern sich inhibitorische Substanzen an, die den Weitergang
der Synthese verhindern. Oft müssen radioaktive Aminosäuren als Tracer hinzugesetzt
werden, um das Produkt später zu finden.
Eine neue Generation von Expressions/
Translationssystemen wie das von Roche Diagnostics entwickelte Rapid Translation System (RTS) sind diesen Systemen in vielerlei
Hinsicht überlegen. Das RTS-Reaktionsgefäß
besteht aus einer Reaktionskammer, in der
die eigentliche gekoppelte Transkriptions/
Translationsreaktion stattfindet, und einer
etwa zehnmal größeren Versorgungskammer.
Diese ist das Reservoir für die Proteinbausteine und bildet als Kompartiment, das mit einer semipermeablen Membran von der Reaktionskammer getrennt ist, eine Art „Überlauf“, in den inhibitorische Substanzen diffundieren können. Mit dieser patentgeschützten CECF(Continous-Exchange Cell-Free)Technologie, die einen permanenten Aus36 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
aktionsbedingungen zu verändern und Komponenten (wie Detergenzien, Chaperone etc.)
zur weiteren Optimierung einzuführen.
Scale-up
Weil die Kits zur Proteinsynthese im präparativen Maßstab (RTS 500 und 9000) auf dem
gleichen Lysat basieren wie das kleine System
RTS 100, ist eine Maßstabsvergrößerung einfach.
Applikation
Die zellfreie Proteinsynthese mit RTS hat
mittlerweile in vielen Forschungsbereichen
Anwendung gefunden. Neben der hohen
Ausbeute hat sie weitere Vorzüge: Durch CoExpression von Proteinen erlaubt sie zum
Beispiel die einfache und schnelle Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen.
Außerdem ist sie geeignet zur Herstellung
modifizierter Proteine (z.B. truncated proteins oder Punktmutationen). Proteine, die in
zellulären Systemen den Wirtsorganismus
schädigen, können ebenfalls in diesem zellfreien System exprimiert werden.
Die gewünschte Gensequenz wird in einer
PCR-Reaktion amplifiziert und gleichzeitig
komfortabel und schnell mit den für die in
vitro-Transkription und -Translation essentiellen Elementen (Promotor, RBS, etc) versehen. Das Produkt kann dann direkt im RTS
100 (siehe unten) eingesetzt werden, um ein
erstes Screening der Expression durchzuführen. So können beispielsweise die von ProteoExpert vorgeschlagenen Varianten leicht
überprüft und getestet werden.
Neben dieser Möglichkeit bietet Roche
auch Expressionsvektoren an, in die die Gensequenz kloniert werden kann. Auch diese
Vektoren enthalten alle für die Expression in
RTS benötigten und optimierten Elemente.
Für die Scale-up-Expression ist das Klonieren in Vektoren unerläßlich, PCR-Produkte
sind hier nicht verwendbar.
Auch im Vorfeld der Strukturermittlung
von Proteinen findet die zellfreie Technik
verstärkt Anwendung. Forscher am Berkeley
Structural Genomics Center nutzten sie zur
Bestimmung der Röntgen- und NMR-Struktur von Proteinen aus Mycoplasma pneumoniae und M. genitalium 1. Die Forscher produzierten Milligramm-Mengen einer Phosphoserin-Phosphatase, die für die NMR–Analyse komplett sowie selektiv mit 15N Aminosäuren markiert ist.
Ein weiteres Anwendungsfeld der zellfreien Expression ist die Herstellung pharmazeutisch nutzbarer Proteine. Masao Fukushima
und Ryuji Kawaguchi verwendeten RTS für
die Herstellung von rekombinantem humanem Interleukin-22. Wird IL-2 in E. coli exprimiert, bildet es unlösliche Aggregate. Mit
RTS konnten die japanischen Forscher aktives und lösliches IL-2 fast im MilligrammMaßstab isolieren.
Screening und Optimierung
Literatur
Für Screening und Optimierungsstudien werden Expressionstechniken benötigt, die
schnell und in kleinem Maßstab ausreichende Ausbeuten erzielen. In Roches RTS 100
kann die über PCR amplifizierte Gensequenz
ohne vorherige Aufreinigung des PCR-Produktes eingesetzt werden. Die Ausbeute – bis
zu 20 µg Protein in 2 bis 4 Stunden bei 50 µl
Reaktionsvolumen – ermöglicht Studien zur
Analyse der Expressions-Niveaus verschiedener DNA-Konstrukte und ihrer Kompatibilität mit dem Translationssystem. Nach
Optimierung der Ausbeute können die Eigenschaften des Proteines untersucht werden.
Das zellfreie Verfahren gestattet es, die Re-
[1]
[2]
Cho, H. S.; et al.; Application Note No. 4/2001; Roche Applied Science.
Fukushima, M.; Kawaguchi, R.; Application Note No. 3/2001; Roche Applied
Science.
Dr. Burkhard Ziebolz
Roche Diagnostics GmbH
D-98305 Mannheim
Fax: 0621-7598609
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Markteinschätzung
Neue Anforderungen
왔
Neuartige ForschungsAntikörper aus Bibliotheken
durch Phagen Display
Dieter Lingelbach, MorphoSys AG, München
Binnen nur acht Wochen lassen sich hochaffine Antikörper, wie sie die Proteomforschung
benötigt, aus bestehenden Bibliotheken mithilfe der Phagen Display-Technologie gewinnen.
Erkenntnisse der vergangenen zehn Jahre haben einen Paradigmenwechsel bei der Antikörperbereitstellung eingeleitet: das humorale Immunsystem kann weitestgehend in vitro abgebildet werden. Hierdurch lassen sich für mehrere tausend neuartige Antigene pro Jahr die
jeweiligen Antikörper erzeugen. Positiver Nebeneffekt: die Antikörper liegen als „getaggte“
Fab-Fragmente vor, und zwar inklusive ihrer Sequenz – zum einfachen weiteren Experimentieren oder für Produktionszwecke.
Die biowissenschaftliche Forschung benötigt
zunehmend Antikörper: bis 2008 sagt eine
Studie der britischen Unternehmensberatung
LEK dem Markt für Forschungs-Antikörper
zweistellige Wachstumsraten pro Jahr voraus.
Dies gilt für existierende Katalog-Antikörper
sowie für ‚Custom Designed Antibodies‘ –
Antikörper, die auf Kundenwunsch hin hergestellt werden. Einen regelrechten Boom
sagen diverse Marktbeobachter (siehe DZBank-Studie „Biochips“, BioInsights Marktreport „Protein Biochips“) den Antikörpern
als Capture-Moleküle für Protein-Arrays voraus. Die Ursachen scheinen offenkundig: der
Anteil analytischer Arbeiten am Proteom
nimmt rasant zu. Entsprechende Publikationen haben sich seit 1999 etwa verzehnfacht.
Das Bundesforschungsministerium (BMBF)
förderte nach Recherchen der Consultech
GmbH Proteomics-Projekte im Zeitraum von
1996 bis 2001 mit rund 106 Mio. a. Und die
Ende 2001 gegründete Deutsche Gesellschaft
für Proteomforschung (DGPF) plant, EU-Gelder zur Herstellung von rund hunderttau-
send monoklonalen Antikörpern im Rahmen
der sogenannten European Protein Initiative
im 6. Rahmenprogramm zu beantragen 2 (und
transkript 6/2003).
Klassische elektrophoretische Methoden
wie 2D-Elektrophoresegele sind nach Einschätzung einiger Proteomics-Experten3 zu
langsam und nicht genügend reproduzierbar,
um in Proteomics-Hochdurchsatzstudien eingesetzt werden zu können. Daher drängen
nach einer Analyse von Marktstudie Front
Line Strategic Management in jüngerer Zeit
zunehmend affinitätsbasiernde Methoden bei
der Proteomanalyse in den Markt (vgl. EUROPEAN BIOTECHNOLOGY NEWS 1/2003). Unter
diesen erscheinen Protein-Chips in puncto
Durchsatz und Multiplexing als ideale Zukunftslösung, liegen derzeit allerdings noch
nicht in verläßlicher Qualität vor. Es mangelt
besonders an Content, also an gereinigten
(humanen) Proteinen und Antikörpern als
Fänger- oder Capture-Moleküle4, die noch
nicht in einschlägigen Katalogen bestellt werden können.
Abb: Ein vollständiger
IgG-Antikörper im
Strukturmodell. Gekennzeichnet ist die
Benennung der variablen (V) und der konstanten (C) Regionen,
der leichten (L) und
der schweren (H) Kette. Zwei häufig verwendete Antikörperfragmente, Fab und Fv,
sind ebenfalls angedeutet. Die Antigenbindenden Regionen
sind mit roten Pfeilen
markiert.
38 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
Die Proteomforschung der nächsten fünf bis
acht Jahre stellt neue Anforderungen an Antikörper. Es geht dabei weniger um das breite Bindungsspektrum polyklonaler Antikörper, ebensowenig um umfangreich charakterisierte monoklonale Antikörper. Sicherlich
werden Tags und Labels benötigt, ebenso wie
Antikörper-Paare für komfortable SandwichAssays. In den neuen Hochdurchsatz-Umgebungen der modernen Biologie wird darüber
hinaus verstärktes Interesse bekundet an Antikörperfragmenten (rekombinant hergestellte, deutlich kleinere Moleküle) wie Fab oder
scFv (siehe Glossar), welche die antigenbindenden Eigenschaften des Antikörpers vollständig enthalten. Die reduzierte Größe der
Fragmente fördert die Miniaturisierung (es
passen mehr Moleküle auf die Chip-Oberfläche) und reduziert die Menge an benötigtem
Proben-Material. Forscher fragen auch immer
mehr nach monovalenten Antikörpern, um
mögliche Kreuzreaktionen zu reduzieren. Zusätzlich ist das Interesse gestiegen an Antikörpern mit verschiedenen bekannten Affinitäten, um gleichzeitig Proteine messen zu
können, die in der Probe in verschiedener
Konzentration vorliegen.
Aktuelle Erkenntnisse zu Antikörpern
Das wachsende Verständnis des humoralen
Immunsystems hat in den vergangenen zehn
Jahren zu neuartigen Anwendungsmöglichkeiten geführt: Das seit Jahrzehnten verfolgte Ziel, das humorale Immunsystem im Reagenzglas abzubilden, ist Schritt für Schritt gelungen, wie etwa Arbeiten von Smith 5,
Plückthun6 und Knappik7 belegen.
In vitro-Antikörperbibliotheken enthalten
bereits vorgefertigt mehr als 10 Milliarden unterschiedliche Antikörperspezifitäten. Diese
liegen entweder in E. coli oder in Phagen vor.
Im wesentlichen wird bei MorphoSys die
strukturelle Vielfalt des menschlichen Antikörperrepertoires durch 49 Gerüststrukturen
abgebildet. Durch das Einfügen hochvariabler genetischer Kassetten in diese Gerüststrukturen läßt sich das riesige Antikörperrepertoire des Menschen reproduzieren. Die
so entstandenen Antikörperspezifitäten treffen im sogenannten Panning (zu deutsch:
Goldwäsche) auf das Ziel-Antigen. Hierbei
wird das sogenannte Huckepack-Verfahren
genutzt: Jeder Phage verhält sich wie derjenige Antikörper, dessen DNA-Sequenz er
„huckepack“ in sich trägt. So ermöglicht das
Panning, die wenigen Tausend Phagen relativ zügig zu identifizieren, die an das Antigen binden. Darüber hinaus ermöglicht das
patentierte Verfahren auch die Identifizierung der dazugehörenden DNA-Sequenzen.
MorphoSys hat die Methode des Phagen Display durch den Einbau spaltbarer Disulfidbrücken zwischen dem Phagen und dem
Antikörpermolekül indes verfeinert. Die DiLABORWELT
B L I T Z L I C H T
sulfidverbindung kann durch Zugabe von
Reduktionsmittel gespalten werden und
hängt daher nicht von der Bindungsstärke
des jeweiligen Antikörpers ab. Im nächsten
Schritt, dem Screening, erfolgt die Auswahl
einer Handvoll gutbindender Antikörper (Panel). Diese werden gereinigt und ihre Affinität nochmals überprüft, zum Beispiel mit
Hilfe eines ELISA. Das ganze Verfahren dauert bis zu acht Wochen, ist ein vollständig
kontrollierter Laborprozeß und kommt ohne
den Einsatz von Labortieren aus.
Weitere Beschleunigung erfährt die Forschung durch Fortschritte in der Automatisierung, dafür sorgen Anbieter wie ABI, Perkin Elmer, Beckman, Qiagen oder MWG.
Richtig konfiguriert, können mit entsprechenden Pipettierobotern mehrere Dutzend
Antigene gleichzeitig verarbeitet werden.
Dies ermöglicht hochgerechnet ein „Abarbeiten“ mehrerer tausend Antigene pro Jahr –
der Prozeß ist prinzipiell beliebig skalierbar.
Für die Bereitstellung der von der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung im
Rahmen der European Protein Initiative angestrebten Anzahl an Antikörpern wären
demnach rund fünf Jahre erforderlich. Neben dem schnellen Abarbeiten ermöglicht
die Automatisierung wettbewerbsfähige Kosten bei der Antikörperbereitstellung: Der
Preis eines monoklonalen Custom-Antikörpers beträgt durchschnittlich etwa 10.000 a
für typischerweise 2 mg ger
einigtes IgG und
schwankt je nach Service zwischen 6.000 a
und 16.000 a 8. Rekombinante Antikörper
auf Basis der hier beschriebenen Automatisierung und Technologie können inzwischen
zu gleichen und im Prinzip wegen der Parallelisierbarkeit zu eher günstigeren Preisen
angeboten werden.
Da zu jedem Zeitpunkt des Auswahlprozesses die DNA-Sequenz oder der Klon der
jeweils interessierenden Antikörper bekannt sind, entfällt das Isolieren der relevanten Sequenz aus Hybridomzellen. Diese Information ist besonders hilfreich bei
der therapeutischen oder diagnostischen
Weiterverwendung des gefundenen Antikörpers, sie ermöglicht weitere Affinitätsreifungen und Umformatierungen in bivalente Antikörper, Änderungen der Tags und
Labels oder genetische Fusionen mit Reporterenzymen.
Auch zur rekombinanten Antikörperherstellung wird das Antigen benötigt. Allerdings wird bei dem erwarteten Bedarf an neuartigen Antikörpern die Bereitstellung der
Antigene zum Engpaß. MorphoSys hat deshalb eine Methode entwickelt, mit der sehr
zuverlässig und schnell Teile von Proteinen
im mg-Maßstab als Antigenquelle hergestellt
werden können9. Antikörper gegen diese Proteinfragmente haben sich als deutlich besser
in den typischen immunochemischen Anwendungen herausgestellt als Antikörper gegen Peptide. Ausgangsmaterial für die neue
Methode ist nur noch DNA.
LABORWELT
Literatur
Glossar
[1]
Die Antigen-Bindungsspezifität eines Antikörpers wird nur von einem kleinen Teil des Gesamtproteins vermittelt: den variablen Regionen.
– Fab:Der Antigen-bindende Arm eines Antikörpers, hergestellt entweder durch genetisches Engineering oder durch Abspaltung von
einem Gesamtantikörper mithilfe von Papain.
– Fv:Etwa die Hälfte eines Fab’s und die kleinste funktionelle Einheit eines Antikörpers. Das
Fv Fragment besteht aus der VL und der VH
Domäne (siehe Abbildung)
– scFv:das „single-chain” Fv-Fragment ist ein
künstliches Produkt, entstanden durch die
Einfügung eines Peptidlinkers zwischen dem
C-Terminus der schweren und dem N-Terminus der leichten Kette.
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
http://gesundheit.icpro.de/PGG/PG
GA/pgga.htm?snr=8857
http://eoi.cordis.lu/dsp_details.cfm?ID=29935
Voss T, Haberl P., Electrophoresis 2000 Oct 21(16): 3345-50
Ian Humphery-Smith, TARGETS Vol: 2, No. I, February 2003
Smith Science Vol 228, p. 1315 (1985)
Skerra & Plückthun, Science Vol. 240, p. 1038 1988)
Knappik et al.,J Mol Biol. Vol. 296, p. 57 (2000)
MorphoSys AG, interne Analysen
Frisch et al., J Immunol Methods Vol. 275, p.203 (2003)
Dieter Lingelbach
MorphoSys AG
Lena-Christ-Straße 48
D-82152 Martinsried
Tel.: +49-(0)89-899-27-455
왔
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Functional Genomics
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Massiv-parallele
Einzelmolekül-Sequenzierung
Dr. Christian Hennig, Dmitri Tcherkassov, Genovoxx GmbH, Lübeck
Mit der AnyGene®-Technologie der Genovoxx GmbH wurde erstmals ein Verfahren entwikkelt, das auf Einzelmolekül-Ebene mehrere 100.000 Nukleinsäure-Ketten gleichzeitig sequenzieren kann. Damit ist diese Technologie ein heißer Kandidat im Rennen um das „1.000-Dollar-Genom“, der nächsten Etappe auf dem Weg zur personalisierten Medizin.
Am 14. April 2003 wurde in einer feierlichen
Zeremonie die Vollendung des Human- Genom-Projektes bekanntgegeben. Damit existiert eine 3 Milliarden Basen umfassende Referenz-Datenbank, an der sich Wissenschaft
und Forschung auf dem Weg zu einer personalisierten Medizin orientieren werden. Eine
Herausforderung für das nächste Jahrzehnt
ist es, die Voraussetzungen zu schaffen, um
die kompletten, relevanten genetischen Informationen jedes Individuums innerhalb weniger Stunden zu digitalisieren und damit
beispielsweise für Diagnostik und Therapie
zugänglich zu machen.
Das bedeutet zum einen die Anpassung
beziehungsweise Neuentwicklung von Technologien für die immens steigenden Anforderungen an Prozesse zum Gewinnen genetischer Information. Das im Herbst 2002
gestartete internationale HapMap-Projekt
www.genome.gov/10005336, siehe EUROPEAN
BIOTECHNOLOGY NEWS 1/2002) geht beispielsweise davon aus, daß die komplette Genotypisierung eines Menschen auf Grundlage von
Haplotypen die Analyse von ca. 500.000 SNPs
(sogenannte Tag-SNPs) pro Genom erfordert.
Bei diesen Anforderungen (1/2 Million Stellen pro Genom innerhalb von Stunden bis Ta-
Abb. 1: Massiv-parallele Einzelmolekül-Sequenzierung. Positionsweises, automatisiertes Abscannen des Sequenzier-Chips mit Hilfe eines
Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopes (Zeiss axioskop 2 mot plus). Die Aufnahme zeigt eine einzelne Scanposition mit ca. 10.000 einzelnen DNAMolekülen, die durch eingebaute fluoreszenzmarkierte AnyBase®-Nukleotide nachgewiesen
werden. Pro Chip sind mehrere 100 Positionen
scannbar.
gen und für Kosten von weniger als 1.000 US$) stoßen alle heute eingesetzten Verfahren
an ihre Grenzen. Daraus resultiert die Suche
nach einer Methode, die die komplette Genotypisierung im Routine-Einsatz ermöglicht
– von Craig Venter medienwirksam als „1000Dollar-Genom“ bezeichnet.
Parallel zu dieser technologischen Entwicklung muß eine weitere Strukturierung
und Verfeinerung der Referenz-Datenbanken
durch Analyse zehntausender Individual-Genome und die Vernetzung funktioneller und
struktureller genetischer Informationen erfolgen. Diese Arbeit wird derzeit stark von den
Limitationen (Geschwindigkeit, Kosten) der
existierenden Verfahren behindert.
AnyGene®-Technologie
Abb. 2: Ausschnitt aus einem AnyDot®-Sequenzierchip (25µm Gesamtfläche pro Chip: 10 mm2) Zyklischer Einbau und Detektion der eingebauten Nukleotide in ein Oligonukleotid-Gemisch im zeitlichen
Verlauf. A. 1.Zyklus: Einbau von AnyBase®-dCTP, Detektion und Abspaltung; B. 2.Zyklus: Einbau von
AnyBase®-dTTP, Detektion und Abspaltung; C. 3.Zyklus: Einbau von AnyBase®-dCTP, Detektion und
Abspaltung. Das Einzelmolekül-Tracking-System generiert die zu jedem einzelnen DNA-Molekül gehörende Sequenz. Dies ist beispielhaft an drei individuellen Molekülen dargestellt.
1. DNA (Einzelmolekül); 2. Im aktuellen Zyklus eingebautes, fluoreszenzmarkiertes, terminierendes
AnyBase®-Nukleotid; 3. In vorangehenden Zyklen eingebautes AnyBase®-Nukleotid mit abgespaltetem
Fluoreszenzfarbstoff, ohne Termination; 4. Primer; 5. Oberfläche zur spezifischen Fixierung der Primer-DNA-Hybride
40 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
Genovoxx entwickelt mit der AnyGene®Technologie eine völlig neue Form der Sequenzierung, die künftig routinemäßig für
komplette Genotypisierungen eingesetzt
werden kann. Grundlage ist die massiv-parallele Sequenzierung hunderttausender einzelner, nicht amplifizierter NukleinsäureMoleküle. Die Technologie arbeitet nach fünf
Kernprozessen:
1. Zunächst werden Millionen zufällig-verteilter, unterschiedlicher, individueller
DNA/RNA-Moleküle im Abstand von
durchschnittlich 400 nm auf einer für Einzelmolekül-Detektion optimierten Oberfläche (AnyDot®-Chip) fixiert und geprimt. Als
Ausgangsmaterial können dabei zum Beispiel cDNA, mRNA oder genomische DNA
dienen.
2. Nach dem Priming startet eine Polymerasekatalysierte Sequenzierungsreaktion an allen fixierten Nukleinsäureketten gleichzeitig: der Einbau von speziellen, temporär-terminierenden, fluoreszenzmarkierten Nukleotiden (AnyBase®-Nukleotide) führt zu
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einem reversiblen Abbruch der Sequenzierungs-Reaktion. Dieses „Pausing“ der Sequenzierungsreaktion ermöglicht die Detektion aller eingebauten Basen auf der gesamten Chipoberfläche.
3. Der (gleichzeitige) Nachweis der eingebauten Basen und deren Zuordnung zu einzelnen DNA-Molekülen erfolgt nach jedem
Zyklus über Einzelmolekül-FluoreszenzDetektion und ein Einzelmolekül-TrackingSystem. Dies geschieht über automatisiertes Scannen der Chipoberfläche mit Hilfe
eines modifizierten Auflicht-FluoreszenzMikroskopes (Zeiss Axioskop 2 mot plus)
(Abb. 1). (Vorschlag: Ein kompletter Zyklus
dauert in einem Geräte-Protoypen, der derzeit optimiert wird, fünf Minuten.)
4. Nach jedem Zyklus wird die Modifikation
des eingebauten AnyBase®-Nukleotids entfernt, die zum Terminieren der Sequenzierreaktion führt. Damit stehen die 3’-Enden der
DNA-Moleküle im nächsten Zyklus wieder
für eine Einbau-Reaktion zur Verfügung.
5. Für die eindeutige Zuordnung einer Einzelsequenz zu einer Referenz-Datenbank wie
beispielsweise die humane cDNA-Referenz
des NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) sind Sequenzlängen zwischen 15 und 35 Nukleotiden pro einzelnem DNA-Molekül notwendig. Deshalb erfolgt eine zyklische Wiederholung der Schritte 2 und 3, bis die gewünschten Sequenzlängen bei einem Großteil der Moleküle erreicht sind. Alle Schritte
erfolgen durch einfachen Austausch der Reaktionsflüssigkeiten über ein MicrofluidikSystem. Steuerung, Bilderkennung und Sequenz-Generierung erfolgen durch eine von
Genovoxx entwickelte G-Analyzer®-Software (Abb. 2).
Zunächst wird Genovoxx ab 2004 Genexpressions- und SNp-Analytik anbieten. Ein
Automat wird voraussichtlich ab 2005 die
Marktreife erreichen.
Abb. 3: Einzelmolekül-Sequenzierung mit polydA
folgte Abspaltung der dTTP-Markierung bei
einzelnen Molekülen bedingt.
plifikation oder Selektion zu analysieren – die
Grundvoraussetzung für das „1000-DollarGenom“.
Zusammenfassung
Mit AnyGene® hat Genovoxx die weltweit erste Technologie entwickelt, die effizient und
parallel große Mengen an individuellen
DNA-Molekülen innerhalb kurzer Zeit sequenzieren kann. Durch Weiterentwicklung
der Technologie wird es möglich sein, auf einem Chip mehrere 100.000 unterschiedliche
SNPs gleichzeitig und ohne vorherige Am-
Dr. Christian Hennig
Genovoxx GmbH
Innovationscampus Lübeck
Stephensonstraße 1
D-23562 Lübeck
Tel./Fax: +49-(0)451-2903-360/-333
Applikation
Anhand eines Beispieles mit folgenden Versuchsparametern soll das Verhalten von identischen einzelnen Molekülen während einer
zyklischen Sequenzierung mit der GenovoxxTechnologie demonstriert werden:
– Sequenzierung einer homogenen Population von Molekülen am Beispiel von polydA
– Sequenziermodus: Alternierende Zugabe
von AnyBase®-dTTP und AnyBase®-dCTP
über 6 Zyklen
– Gescannte Oberfläche: 200 x 50 µm.
Bemerkenswert ist die totale Desynchronisation der Prozesse an den einzelnen Sequenzen (Abb. 3): Nicht alle DNA-Stränge befinden sich im gleichen Stadium des SequenzAufbaus. Einzelne Sequenzen setzen für ein
oder mehrere Zyklen aus, nehmen dann aber
wieder an der Sequenzierung teil. Die Mehrzahl aller Sequenzen hat in vorliegendem Beispiel die Länge 5. Fehldetektionen (in diesem
Fall „C“) sind beispielsweise durch nicht erLABORWELT
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Bio-Imaging
왔
Qualitäts- und Parameterkontrolle an Fluoreszenz- und
Chemilumineszenz-Imagern
Dipl.-Ing. Heiko Mixtacki, biostep GmbH, Jahnsdorf
Bio-Imager für die Gel-Dokumentation, Fluoreszenz und Chemilumineszenz gehören bei der
Elektrophorese in jedem Labor zur Standardausstattung. Diese Systeme sind in ihrem technischen Aufbau durch die optische Achse: Probe – Filter – bildgebende Einheit gekennzeichnet. Zur Bildaufnahme werden vorwiegend CCD-Kameras eingesetzt. Alle Gel-Dokumentations-, Fluoreszenz- und Chemilumineszenzsysteme haben unterschiedliche technische und
optische Eigenschaften, die selbst bei Geräten des gleichen Typs verschieden sein können.
Ferner unterliegen die Systeme bei der Nutzung stetig Alterungsprozessen wie etwa Materialermüdung durch UV-Strahlung, Kontamination der optischen Oberflächen durch Staub und
dem Angriff der optischen Oberflächen durch Laborgase. Aus diesen Gründen ist es notwendig die Systeme zyklisch einer Qualitäts- und Parameterkontrolle zu unterziehen.
In der pharmazeutischen Industrie und in klinischen Laboren werden auf der Basis definierter SOP- und GLP-Protokolle Qualitätssicherungskontrollen durchgeführt. Als Medium dienen dazu hauptsächlich unterschiedlich standardisierte Proben (z.B. Gele,
Blots). Die Hauptproblematik dieser Medien
sind ihre mangelnde Reproduzierbarkeit –
abhängig unter anderem von der Material-
Abb. 1: Imager-Testgerät TD216 mit Testfunktionen zur Überprüfung von Auflösungsvermögen,
Schärfe, Verzeichnung und Homogenität
charge, der Gerätetechnik, dem Operator –,
geringe Haltbarkeit und zusätzlicher Zeitaufwand für ihre Herstellung. Mit dem ImagerTestgerät TD216 steht erstmals ein elektronisches Werkzeug zur Verfügung, das den Prozeß der Qualitäts- und Parameterüberprüfung vereinfacht und standardisiert.
Aufbau des Imager-Testgerätes TD216
Das kompakte Gehäuse des TD216 (Außenmaße LxBxH 163x135x24mm) vereint die
Funktionsbereiche „Quantifizierungsemp42 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
findlichkeit”, „Auflösung und Homogenität”
sowie „spektrale Empfindlichkeit” (Abb. 1).
Mit der Testfunktion „Quantifizierungsempfindlichkeit” wird auf der Basis einer kalibrierten LED-Reihe aus 16 Einzel-LEDs die
Grenze der Nachweisempfindlichkeit, die
Linearität und die Reproduzierbarkeit des
optischen Systems überprüft. Die LEDs sind
auf diskrete Photonenwerte im Bereich von
60 bis 4.800.000 Photonen/ms abgeglichen,
die bei Quantifizierungen als Sollwert genutzt werden können. Der Dynamikbereich
ist somit auch für die Überprüfung von 16Bit-Kameras (Einsatzschwerpunkt in Chemilumineszenz-Systemen) geeignet. Das getestete Bio-Imaging-System kann so nach der
minimalsten detektierbaren Lichtmenge – in
Abhängigkeit von der vorgegebenen bzw.
maximalen Integrationszeit – und dem maximalen linearen Detektionsbereich (Verhältnis des kleinsten zum größten linear detektierten Peak) klassifiziert werden.
Weitere wichtige Qualitätskriterien bei der
Beurteilung von Imager-Systemen sind ihre
Auflösung, Schärfe, Verzeichnung und Homogenität (Abb. 1). Alle Elemente dieser Testfunktion sind vermessen und die entsprechenden Werte wie etwa Linienstärke, Linienabstand, Flächenmaße, Objektgrößen und
Graustufenwerte dienen als Sollwert bei der
Überprüfung der aufgenommenen und ausgewerteten Daten. Durch einen separaten
Bereich der Testfunktion wird die Konstanz
der Empfindlichkeit über den aufgenommenen Bereich des Kamerasensors ausgewertet.
Resultate dieses Tests können einzelne ausgefallene Bereiche oder unterschiedliche
Empfindlichkeitsniveaus innerhalb des Kamerachips sein. Bei Mehrfachmessungen
über einen längeren Zeitraum (Vorausset-
Abb. 2: Aufnahme der Testfunktion „spektrale
Empfindlichkeit” ohne Filter (oben), „spektrale
Empfindlichkeit” mit EtBr-Filter (Mitte) und Profildarstellung der Aufnahme mit EtBr-Filter (unten)
zung: definierte Aufnahmekriterien) können
Abweichungen in der Flächenempfindlichkeit erkannt werden. Die Testfunktion „spektrale Empfindlichkeit” ist für die Erkennung
der Filtereigenschaften gedacht, die bei GelDokumentation und Fluoreszenzapplikationen eingesetzt werden. Die Funktionalität
beruht auf unterschiedlichen Emissionswellenlängen der sechs eingesetzten LEDs: blau
(Peak 468 nm), grün (Peak 565 nm), gelb
(Peak 590nm), rot (Peak 700 nm), infrarot
(Peak 940 nm) und weiß (1. Peak 430 nm, 2.
Peak 610 nm). Der Spektralbereich der Filter
ist dem Emissionsbereich des jeweiligen
Fluoreszenzfarbstoffes (z.B. SYBRGreen und
EtBr. ) angepaßt. Ein optimaler SYBRGreenFilter hat somit sein Maximum im Bereich der
grünen LED. Die rote LED wird nur noch sehr
schwach und die infrarote LED nicht mehr
detektiert. Mit einem optimalen EtBr-Filter
(Maximum bei 595 nm) sind die blaue und
infrarote LED nicht mehr zu erkennen, die
gelbe LED aber deutlich (Abb. 2).
Linearitätstest bei Bio-Imaging-System
Zur Überprüfung der Linearität der Meßergebnisse und der Nachweisempfindlichkeit
eines Bio-Imaging-Systems können ein oder
mehrere Bereiche der Testfunktion „Quantifizierungsempfindlichkeit” ausgewählt
werden. Ferner ist ein definiertes Endkriterium der Messung festzulegen. Sinnvoll sind
die Integrationszeit (Belichtungszeit) oder
ein Graustufenwert, bei dem die Messung
automatisch beendet wird. Beide Werte
müssen so gewählt werden, daß kein Bereich
der „Probe” in der Sättigung (Überbelichtung) ist. Die Darstellung erfolgt als Laneprofil mit detektierten Banden und Backgroundabzug. Zur Vereinfachung der visuellen Kontrolle der korrekten Banden- und
Backgrounddetektion (Abb l.) unten in der
Auswertesoftware (Softwarepakete Phoretix
LABORWELT
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TotalLab und Phoretix 1D Advanced von Nonlinear Dynamics Ltd.,
Newcastle upon Tyne, UK) ist ein Spreizen des Anzeigebereiches
des Laneprofils möglich. Auf der Basis der berechneten Volumenwerte (Gesamtvolumen minus Background) und der durch die kalibrierten LEDs definierten Sollwerte kann das Linearitätsverhältnis mathematisch berechnet und grafisch dargestellt werden. Die
Linearität von Bio-Imaging-Systemen ist etwa bei einem R2-Wert
<0,95 und einem absoluten Glied der linearen Gleichung von <100
(Berechnung der Kennlinie ohne erzwungenen Nulldurchgang)
optimal.
Vergleich der Reproduzierbarkeit
Die Kontrolle der Reproduzierbarkeit von Meßergebnissen bei unterschiedlichen Integrationszeiten oder Meßpositionen innerhalb eines oder zwischen zwei Bio-Imaging-Systemen ist, etwa durch Gele,
ist nahezu unmöglich. Dennoch ist dies ein sehr wichtiger Test zur
Einschätzung der Gerätequalität. In Testmessungen läßt sich der Bereich „Quantifizierungsempfindlichkeit“ an zwei verschiedenen BioImaging-Systemen zu unterschiedlichen Integrationzeiten aufnehmen.
In der Auswertung können neben Lane-, Banden- und Backgrounddetektion die Quantifizierungen einzelner „Proben” (Messungen)
durch eine Mengenstandardisierungsfunktion auf 100% normiert und
so die Reproduzierbarkeit geprüft werden.
Überbelichtungsverhalten
Da besonders bei Chemilumineszenzproben die Bandenintensitäten
einen sehr großen Dynamikbereich besitzen, sollten die Überbelichtungseigenschaften des Imager-Systems durch die Funktion „Quantenempfindlichkeit“ getestet werden. Bei der geometrischen Nähe
starker und schwacher Banden muß das Imaging-System diese Banden mit ihren unterschiedlichen Intensitäten ohne ein Überstrahlen
der schwachen durch die starke Bande detektieren können. Wenn
starke Banden einen „Schweif” in ihre Umgebung ausstrahlen,
Anzeige
Abb. 3: Bei zu starker Überbelichtung ist die Quantifizierung der Banden 1, 2
und 3 durch das „Ausbluten” des CCD-Sensors fast unmöglich. Eine schwache Bande zwischen den „überstrahlenden” Banden 1 und 2 wäre nicht detektierbar (links). Bei korrekter Detektion beeinflußt die überbelichtete Bande 1 die Detektion der Banden 2 und 3 nicht (rechts).
spricht man vom „Ausbluten” des Sensors, da er die Ladungsträger nicht nur in den CCD-Zellen beläßt, in denen die ursprüngliche
Information detektiert wurde (Abb. 3).
Dipl.-Ing. Heiko Mixtacki
biostep GmbH
Meinersdorfer Str. 47A, D-09387 Jahnsdorf
Tel./Fax: +49-(0)3721-39050 / -38572
www.biostep.de
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Automation
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Scaling Up Automated Protein
Excision from 1D and 2D Gels
Chris Mann, Ph.D., Genetix Ltd., UK
imaged, analysed and excised without moving the gel.
Coomassie and silver stained gels are visualised with white light while Sypro RubyTM
stained gels are visualised using a non-UV
light source, giving crisp, clear spots on a
clean background. Gel imaging is quickly and
conveniently achieved with an on-board high
dynamic range cooled CCD camera, and the
system is controlled by the user-definable
QSoft Excision software.
Proteins are the molecules that perform most biological functions and represent the targets
for more than 90% of today’s drugs. The race is now on to dissect out those proteins underlying
disease states, and thus to identify novel drug targets or diagnostic markers. For unparalleled
resolving power, polyacrylamide gel electrophoresis remains the method of choice for observing the expression levels of thousands of post-translationally modified proteins. The recent rapid increase in MALDI mass spectrometry capability demands significantly faster protein excision than can be achieved with currently available spot-picking instruments. For this
purpose, the Genetix GelPix protein spot excision robot has been developed with a proprietary
multi-channel picking head. This reduces the excision cycle time and will enable today’s MALDI
tandem time-of-flight mass spectrometers to be used to their full potential.
Key Words: GelPix, automation, protein spot excision, 1D gels, 2D gels, MALDI Tandem-TOF
The Genetix GelPix automates the time consuming process of 1D and 2D gel analysis and
protein spot excision from silver, Coomassie
and Sypro Ruby™ (Molecular Probes) stained
gels, ensuring accurate, fast and contamination free isolation of proteins (Fig. 1). Developed in conjunction with the Max Planck Institute for Molecular Genetics in Berlin, Germany1, the GelPix has a proprietary eightchannel head with independently firing excision pins (Fig. 2). This reduces the average
cycle time as all eight pins are dispensed and
washed simultaneously, resulting in highest
possible throughput. GelPix is based on
Genetix’s genomics robotic platforms ensuring that the pins locate and excise the protein
spots precisely every time.
Each of the excision head’s eight channels
fires independently, excising a target protein
spot. The multiplicity of the excision head
allows for high throughput excision of spots
at speeds up to 600 protein spots per hour
with excision success rates of >99%. The orbital movement of the pins ensures the excision of clean and precise cores that are de-
posited simultaneously into wells of up to
fifteen 96-well standard or deep-well
microplates located on the bed of the machine.
The location of each excised protein in the
microplate is automatically logged to allow
matching of the excised gel plug to the original gel image for sample tracking. Ultraclean wash and purge procedures minimize
sample cross-contamination, while external
contamination is eliminated due to the combination of a HEPA filter with positive air
pressure and a fully enclosed working area.
During the imaging and excision steps, the
precisely monitored humidified environment maintains gel integrity and allows excision without water-borne contamination.
GelPix’s system can accommodate
backed and unbacked 1D and 2D gels up to
240 mm x 270 mm. Optional excision heads
of 1.4 mm or 2 mm in diameter can excise
from gels of 0.5 to 2 mm thickness. The removable easy-load gel holder is a convenient way to load the GelPix, and allows large
or small, backed or unbacked gels to be
Fig. 1: Genetix GelPix protein spot excision robot
Depending on the gel type, the captured
image is then analyzed by the integrated
Phoretix 2D Advanced or Phoretix 1D software, which generates a user-defined protein
target excision list. The system is also compatible with imported tif-format gel images,
which allows the GelPix system to excise from
gels imaged remotely.
Conclusion
The Genetix GelPix achieves an excision rate
of greater than 600 proteins per hour and will
enable MALDI mass spectrometry to be used
to its full potential. Automation of 2D gel
analysis and protein spot excision by the
GelPix not only improves the throughput of
protein spots for analysis, but also the accuracy and reproducibility of spot isolation. Additionally, the reduction in manual intervention improves contamination control of isolated proteins for downstream protein
processing and identification.
References
[1]
Fig. 2: The GelPix
robot has an
eight-channel
head with independently firing
excision pins, enabling high through-put excision of
spots at speeds up
to 600 protein
spots per hour
with excision success rates of >99%.
44 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
Nordhoff E, Egelhofer V, Giavalisco P, et al (2001) Electrophoresis 22,
2844-55.
Contact
Chris Mann, PhD
Genetix
Queensway, New Milton
Hampshire BH25 5NN, UK
Phone: +44-(0)1425-624-617
Fax: +44-(0)1425-624-787
www.genetix.com
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Technology
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Protein Chips – The Power
of Proteomics is in the Isoforms
Proteome Systems Ltd., an unlisted Australian public company, is dedicated to the development of proteomics technology, to the discovery of biomarkers and drug targets, and to the
development of proteomic bioinformatics. LABORWELT spoke with Dr. Keith Williams, CEO of
Proteome Systems, about present state and future developments of proteomics technologies.
?
LABORWELT
How would you describe Proteome Systems’
market position at present and where do you
see yourself in the future?
!
We are an integrated proteomics company
from technology development and commercialisation, bioinformatic tools, through to
discovery and diagnostic capabilities. We
have re-visited the technology required to do
proteomics and in partnership with a number of other companies, we have developed
new technologies.
The most notable of which is soon to be
released ChIP which is a revolutionary instrument that allows chip based proteomics of
authentic proteins. Our ProteomIQ integrated proteomics solution, which is marketed
in partnership with IBM, is the only fully integrated system implemented with an enterprise level IT solution. The first of our proteomics systems is established at the Charles
River Proteomics Services facility in Worcester Massachusetts (USA), which is a joint
venture between Charles River Labs and Proteome Systems. We have a significant presence in Japan, Proteome Systems Japan KK,
a joint venture with Itochu Corporation, as
well as a wholly owned subsidiary located
in Boston USA. We have our own in-house
diagnostics and discovery programs in the
areas of lung disease especially tuberculosis,
cancer and aging. We have partnered programs in cystic fibrosis with the Cystic Fibrosis Foundation of America and glycoproteomics with Nestlé.
In the future, we see the consolidation of
our position as an integrated proteomics company. We believe our technology will become well accepted and have a substantial position as technology providers. Our informatics solution, BioinformatIQ, likewise may
become the industry standard. We expect to
have substantial products in the diagnostics
area with our rapid point-of-care DiagnostIQ
technology and development of drugs in our
own rights is not out of the question. We expect to establish a presence in Europe and
further develop our presence in Asia particularly through joint ventures.
Dr. Keith Williams
46 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
?
LABORWELT
Which proteomics technologies are going to
play a dominating role in five years, both
worldwide and for your company – e.g. LC/
MS, microfluidics, microarrays, 2D-GE/MS,
CE – and why?
!
We see the future as the combination of well
established technologies partnered up with
novel technologies. Sample preparation will
continue to evolve to allow the study of rare,
small, large membrane, native and alkaline
proteins. We expect that new generation 2Dtechnology will continue to have a dominant
position because this is the only technology
that allows proteins in their many forms to
be analysed. Microfluidics printing technologies will bring chip applications to proteins separated by 2D and blotted onto membranes.
Our chip instrument is the beginning of this
new technology. Identification and characterisation will continue to be dominated by
mass spectrometry, which will continue to
evolve. While conventional chips will be developed for specific applications (e.g. kinases), we do not expect the same success for
protein chips that has been experienced with
DNA chips. The power of proteomics is in
the isoforms which result from a vast range
of modifications to the basic protein chain.
Changes to the proteins such as glycosylation and phosphorylation are known to affect
protein function and their interaction with
other biological molecules. Technologies to
analyse these modifications will become critical. Extension of these studies will lead to
an understanding of protein-protein interactions.
Dr. Keith Williams
?
LABORWELT
Where is the business focus in Proteome Systems’ own technology development and services offered at the moment, and where will
it be placed in the future? Could you please
quantify, also in terms of generated revenues?
!
The key differentiator products are in sample prep and array with the recent release of
Dr. Keith Williams
Dr. Keith Williams, CEO of Proteome Systems
our new generation liquid phase and gel based instrumentation. Because it is highly integrated and interfaces with our informatics
system, we expect this new generation electrophoresis equipment will attract a lot of
interest. Likewise, our emphasis on integration through informatics is attracting interest.
We have only had products in the market in
the last half year, but we expect to sell around
US$ 5 million in our 02/03 financial year. We
expect that to grow rapidly.
?
LABORWELT
You also offer a technology for antibody-based diagnostic tests. What is your source for
the antibodies used?
!
Concerning our antibody based tests, we
have a proprietary rapid, point-of-care diagnostic platform that is as sensitive as ELISA
technology. For some programs we are developing our own antibodies, e.g. tuberculosis. In other programs, we are partnering with
groups who already have antibodies. This is
the case for a test for wheat quality (partnered with C-Qentec a wholly owned subsidiary of Bayer Crop Science) and a test for immune function in elite athletes (partnered
with VRI Biomedical, an Australian biotech
company). We are in discussion with a number of other groups who have quality antibodies they wish to have formatted in a pointof-care test.
Dr. Keith Williams
!
LABORWELT
Thank you for the interview, Dr. Williams!
Contact
Proteome Systems Ltd.
1/35-41 Waterloo Road
North Ryde NSW 2113
Australia
Phone: +61-2-9889-1830
Fax: +61-2-9889-1805
www.proteomesystems.com
LABORWELT
P R O D U K T W E L T
Kennziffer 34 LW 03
왔
Kennziffer 35 LW 03
왔
New A2™ Protein MicroArray System for
multiplexed biochemical analysis of immunoassays
Pocket-PC-Software
für Luminometer
The new A2-Protein-MicroArray-platform of
Beckman Coulter Inc. for the measurement
and quantitation of multiplexed immunoassays delivers more than a thousand results
from a single microplate in less than five minutes – based on the widely used ELISA-format. The high-throughput-A2-MicroArraySystem, part of the Proteome-Lab™-family,
is ideal for drug discovery applications and
Als weltweit erster Hersteller bietet Berthold
Detection Systems GmbH eine leistungsfähige Software an, die auf Basis der Microsoft®
Pocket-PC-Plattform Luminometer-Meßdaten auswerten kann. Die Pocket PC-Rechner,
mittlerweile von allen namhaften PC-Herstellern erhältlich, erfreuen sich aufgrund ihrer
Leistungsfähigkeit, Flexibilität und geringen
Abmessungen großer Beliebtheit.
for research into diseases and their pathways.
It enables the simultaneous quantitation of
up to 13 different analytes or proteins within
a single well of a 96-well plate.
The complete system includes prespotted
A2-MicroArray-96-well-plates, new Universal
Linker Reagent-Kits and the new A2-Reader
and -software. The platform can be automated on a robotic liquid handling system for
even higher throughput. The Linker-Kit provides complementary sequences, modified to
attach to antibodies, of the 13 different oligonucleotides printed on the plate. It also
contains the necessary reagents to conjugate
these activated oligonucleotides to the antibodies of interest. Each well of the patented
A2-MicroArray-plates is prespotted with 13
different oligonucleotide sequences (ssDNA),
which act as tags, or specific locators, of multiplexed assays.
To ensure the reliability of the assay, each
of these different analyte-specific oligosequences, plus a fourteenth control-oligo, are
printed in each well in triplicate, for a total of
42 spots per well. Complementary DNAstrands are coupled and bound to selected antibodies and serve as tethers, or spacers, locating the specific test to an x-y-coordinate
in the well and allowing reactions to occur
off the surface of the microarray.
The A2-Reader-software quickly and precisely aligns a grid around each of the spots
on the A2-MicroArray-Plate and measures the
fluorescent intensity, which can then be correlated to analyte concentration. It utilizes a
cooled 12-bit CCD-camera to image one well
at a time and up to two fluorescent wavelengths per scan. The A2-Reader takes up
minimal lab space and can be integrated with
the Biomek® automated liquid handling platforms for complete automation of the assay.
The A2-MicroArray-format offers a great
degree of flexibility as the oligonucleotides,
rather than the antibodies, are provided on
the plate. Researchers may develop their own
assays by choosing from a range of antibodies, including their own custom antibodies.
Kennziffer 36 LW 03
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New Series II Mega-Systems gets a boost
Genevac Ltd has announced a new, improved version of its successful Mega 980 UltraHigh-Throughput-Evaporator for drug discovery applications. The new Series II MegaSystems provide high-throughput solvent
evaporation accommodating samples in an
extensive variety of formats. In addition to
smaller formats such as microtitre plates,
Mega systems have been designed to handle
larger sample holders including fraction collector racks from LC/MS-systems, larger reaction blocks and proprietary sample formats.
Genevac significantly improved evaporation performance in the Series II Mega-Systems through the use of higher-powered
lamps, more sophisticated control software
48 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
and increased condensing power. The new
machine is approximately 40% faster with
like-for-like loads than the older model, making the improved Mega 980 twice as fast as
any comparable machine on the market. Four
complete fraction collector racks from either
Gilson or Waters HPLC-systems can be dried
down simultaneously, giving huge increases
in productivity for the busy compound synthesis or purification lab.
Genevac‘s Mega Series II-Systems have an
big range of options to enhance their performance and versatility. These include DriPure anti-bumping system, continuous running condensers, solvent waste pumps, fumehood enclosure and condenser flushing
system.
Die neue Berthold Pocket-PC-Software erfaßt
die im Luminometer gemessenen Werte.
Optional stehen ferner eine Probenidentifikation per Barcode-Scan sowie eine Reihe
weiterer Funktionen zur Verrechnung der Daten zur Verfügung. Die Daten-Archivierung
und -Weiterverarbeitung ist durch direkten
Ausdruck auf IR-fähigem Drucker oder
Upload auf einen PC möglich. Die Anwendung läuft in Verbindung mit allen RöhrchenLuminometern von Berthold Detection Systems. Die Pocket PC-Software ist als Upgrade zu installierten Geräten oder im Paket mit
einem neuen Luminometer und Pocket-PC
erhältlich.
Kennziffer 37 LW 03
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Free Biosystems Solutions
Magazine
Biosystems Solutions is the customer focused
magazine from Applied Biosystems. It is produced three times a year and aims to keep
customers up to date with what is happening
in the life sciences field in and around Europe. It includes high impact research articles,
together with news about the latest technologies and services.
Biosystem Solutions comprises product reviews of new innovations from Applied Biosystems, along with current special offers, as
well as information on application techniques
and the range of apllication based courses
available. A free copy is available after registration.
LABORWELT
Kennziffer 38 LW 03
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Sartocheck 4 erleichtert Filter-Integritätsprüfungen
Für den Einsatz in der Biotech- und PharmaIndustrie bietet die Sartorius AG mit dem
neuen Sartocheck 4 eine konsequente Weiterentwicklung des erfolgreichen Testgeräts Sartocheck 3 an. Der Sartocheck 4 dient der Integritätsprüfung von Membranfiltersystemen, ist einfach zu bedienen und verbindet
die hohen technischen Anforderungen, die an
ein modernes Filter-Integritätstestgerät gestellt werden. Die Menü-Struktur des Sartocheck 3 findet sich auch im neuen Testgerät wieder. Per Fingerdruck am Farbdisplay
(Touchscreen) wird das gewünschte Testprogramm direkt angewählt. Eine Online-Grafik informiert den Anwender während des
Tests über aktuelle Testwerte sowie über den
aktuellen Stand der Testphase. Der Sar-
Datenmanagement und ‚Audit trail‘ im vollen Umfang den gesetzlichen Bestimmungen
gemäß 21 CFR Part 11.
왔
384-well-Filterplatte für Proteomics-Anwendungen
Moderne Methoden in der Proteinforschung
arbeiten mit immer kleineren Mengen an Proteinen in immer kleineren Volumina. Ein Minimaler Verlust wertvoller Proteine bei
gleichzeitiger, vollautomatischer Verarbeitung ist daher einer der Engpäße.
Die AcroPrep™ 384-Filterplatten von Pall
Life Sciences wurden speziell für diese hohen Anforderungen entwickelt. Die besondere rund-konische Form der Wells sorgt für
eine Konzentration auch sehr kleiner Volumina auf der Membran und schließt Kapillarkräfte praktisch aus. So können extrem geringe Volumina, wie etwa beim In-Gel-Digest,
gut verarbeitet werden. Besondere Filtratauslässe verhindern sicher Crosstalk beim Auffangen der Probe. Die Membran aus hydrophilem Polypropylen (PP) in einem PP-Gehäuse gewährleistet minimale Adsorption
und maximale Lösungsmittelstabilität.
Beim Design des stabilen Plattenkörpers
wurde auf zuverlässiges automatisiertes
Handling viel Wert gelegt. Robustheit und
왔
Effiziente Gasanalyse
Barcode sind nur zwei wichtige Ergebnisse
dieser Optimierungsarbeit. Anwendungen
von Zellysatklärung über In-Gel-Digest und
Bead-Retention können mit AcroPrep™ 384
optimiert und automatisiert werden.
왔
Novel proteomics-platform to be presented at ACHEMA
LABORWELT
Amersham Biosciences launched the GenomiPhiTM DNA-Amplification-Kit to simplify
the DNA-preparation process and enable
high-quality DNA to be prepared from limited biological material. The simple isothermal method employed by the kit allows
microgram quantities of DNA to be produced overnight from nanogram amounts of
starting material. With only one protocol needed for different types of starting material,
total hands-on time required is just 20 minutes. The technique also eliminates the need
for a thermocycler. The source material can
be purified DNA or lysed cells from whole
blood, buccal swabs, cell-blotted paper, plant
tissue and microorganisms. The amplified
DNA preserves original SNP-information
and can be used in various applications including SNP-genotyping and short-tandem-repeat-genotyping, PCR and library construction. The GenomiPhi-method employs the
Phi29-DNA-polymerase in combination with
random-sequence hexamer primers. This is
the only Phi29 DNA-polymerase-based product that can be sold for nucleic acid research use under applicable patents.
Kennziffer 41 LW 03
Kennziffer 42 LW 03
At this year‘s ACHEMA Molecular Probes
will launch Multiplexed ProteomicsTM, a new
platform that facilitates comprehensive proteome analysis. It allows the direct detection
and quantitation of total and specific proteins in the same gel, using rea-gents that have
contrasting colours. The Multiplexed ProteomicsTM-platform brings together Molecular
Probes‘ new phosphoprotein stain Pro-QTM
Diamond, SYPRO Ruby® protein stain and
Pro-QTM Emerald glycoprotein stains. Each is
왔
Isothermal Amplification
tocheck 4 wurde nach den aktuellen GAMPGuidelines entwickelt und entspricht mit den
Kriterien individuelle Benutzerkennung,
Kennziffer 40 LW 03
Kennziffer 39 LW 03
a powerful reagent in its own right. When
acting in combination, they enable the simultaneous detection of multiple protein targets
in a single sample on the same gel. This allows more data to be collected from samples.
The platform simplifies the identification if
changes in expression, post-translational protein modification in the form of phosphorylation and glycosylation. It also allows the
accurate and reproducible comparison of
multiple samples.
Das Gasanalysegerät OmniStarTM von Pfeiffer Vacuum erlaubt eine vollautomatische
Gasanalyse in den Massenbereichen 1 bis 100,
1 bis 200 und 1 bis 300 amu. Gegenüber üblichen gasspezifischen Sensoren können alle
Gase bis 300 amu gleichzeitig gemessen werden. Zudem können bis zu 64 Komponenten
parallel überwacht werden. Eine einfache
Handhabung, schnelle Ansprechzeit von 10
ms pro Masse und Nachweisgrenze <1 ppm
für nicht interferierende Komponenten bieten deutliche Vorteile für den Einsatz bei
quantitativen und qualitativen Gasanalysen.
Das Massenspektrometer wird über die leistungsstarke und leicht bedienbare Software
QuadStar™ gesteuert. Das Einlesen und ausgeben analoger Daten und digitaler Steuersignale vereinfacht die Integration des Analysegerätes in vorhandene Anlagen. Auch
externe Signale wie die Temperatur werden
eingelesen. Ebenso können Signale ausgegeben und von einem übergeordneten Rechner
verarbeitet werden. Eine kundenspezifische
Anpassung der Software ist möglich. Das geheizte Einlaßsystem bis 200°C ermöglicht
eine Analyse kondensierbarer Dämpfe mit einem Einlaßdruck bis zu 5x10–3 mbar. Über
eine Ventilbatterie können bis zu 12 Gasströme eingelassen und analysiert werden.
| 49
Kennziffer 43 LW 03
왔
Kennziffer 44 LW 03
왔
FokussierteTM Mikrowellen steigern Wirkstoffsynthese
Stammzellen-Nachweis
Das Basis-Mono-Mode-Mikrowellengerät Discover zur chemischen Synthese – entwickelt
von der CEM GmbH auf Basis ihrer fokussiertenTM Mikrowellentechnologie – läßt sich
durch den Synthese-Automaten Explorer PLS
und das Fließ-Synthesegerät Voyager aufrüsten. Die Vorteile der Technologie liegen in
einer hohen Reproduzierbarkeit durch gleichmäßige Energiedichte, bis zu tausendfacher
Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeiten
durch hohe Energiedichten (mehr als 700 W/
l), Minimierung der Lösungsmittelmengen
und Edukte sowie die Wahl unpolarer Lösungsmittel wie Toluol, das sich in MultiMode-Geräten praktisch nicht erhitzt.
Der Explorer, in dem unterschiedliche Behälter der organischen Synthese einsetzbar
sind, erzielt einen hohen Probendurchsatz
durch einen 24-Proben-Aufnehmer mit auswechselbaren Racks. Abgearbeitete Racks
werden gegen neue ausgewechselt, die per
Kopfdruck in das laufende Programm eingefügt werden.
Das Fließ-Synthesegerät Voyager ermöglicht ein Up-Scaling – Maßstabsvergrößerung
der Wirkstoffproduktion – vom mg zum kgMaßstab mit Hilfe der fokussiertenTM Mikrowellen-Synthese. Alle traditionellen Arbeitsschritte der organischen Synthese können auf
das System übertragen werden, das auch im
Discover und im Explorer optimierte Reaktionsparameter übernehmen kann. Zwei unabhängige Pumpen befördern die Stoffströme
Mit dem Aldefluor-Kit von Stemco Biomedical präsentiert BD Biosciences exklusiv ein innovatives Verfahren zur Identifikation und
Isolierung früher Progenitorzellen mittels
Durchflußzytometrie. Die Methode, die auf in
frühen Vorläuferzellen typischerweise stark erhöhte ALDH-Aktivität basiert, ermöglicht eine
Charakterisierung von Populationen, die über
den CD34-Nachweis bislang nicht zugänglich
waren. Zugleich leistet das Verfahren eine Lebend-Tod-Diskriminierung von Stammzellen, da das gemessene Reaktionsprodukt nur
in lebenden Zellen akkumuliert wird. Eine
eingehende Typisierung der durch Aldefluor
identifizierten Populationen über simultane
Antikörpermarkierungen ist möglich. Auch
nachfolgende Kultivierungen und CFU-Assays der Aldefluor-positiven Zellen sind ohne
physiologische Beeinträchtigungen sichergestellt, da das Substrat und das Reaktionsprodukt keine toxische Wirkung ausüben.
in die spulenförmige Reaktionskammer, an die
zwei weitere Pumpen angeschließbar sind.
Über eine patentierte faseroptische Temperatursonde läßt sich die Temperatur in der
Spule in-situ regeln. Die Drucksensorik kontrolliert den Druck in Echtzeit und steuert sie
über einen Back-Pressure-Regulator. Eine
programmierbare Kühlfunktion erlaubt es,
Reaktionen schnell abzubrechen und exotherme Reaktionsverläufe abzufangen. Die Kühlung führt ferner Reaktionswärme und aus
der Mikrowellenbestrahlung entstehende
Erwärmung ab. Damit lassen sich wesentlich
höhere Ausbeuten und geringere Seitenkettenreaktionen erzielen. Umfangreiche Aufreinigungsschritte entfallen. Beide Geräte können
über die ChemDriver-Software gesteuert
werden. Hot Keys ermöglichen einen Wechsel der Parameter Zeit, Mikrowellenleistung,
Druck, Temperatur und Kühlung ohne Unterbrechung bei laufenden Versuchen.
Kennziffer 46 LW 03
왔
Biochromatographiesäulen
Nanoflow LC-System for Proteomics Applications
Millipores QuikScaleTM-Chromatographiesäulen beschleunigen laut Herstellerangaben die
Maßstabsvergrößerung von Separationsprozessen und erzielen eine höhere Reinheit als
gebräuchliche Säulen. Sie sind einfach zu bedienen und ermöglichen einen schnellen
Durchsatz. Eine optimierte Verteilerzelle minimiert ungespülte Bereiche und verbessert so
die Trennleistung. Eine breite Auswahl an
Durchmessern vom Labor- bis zum Produktionsmaßstab gewährleistet eine schnelle
Agilent Technologies Europe‘s 1100 Series
Nanoflow LC-System for MS can be used for
mass spectrometry (MS)-based proteomics
applications. This liquid chromatography
(LC) system provides stable, ultra-low flow
control, high sensitivity and reproducibility
for protein analysis. It is well-suited to perform one- and multi-dimensional separations
and can be connected to mass spectrometers.
Based on the Agilent 1100 Series HPLC system, the Nanoflow LC uses a solvent delivery technology. Its pump is optimized for
nanoliter-per-minute flows and features active-feedback flow control. This provides stable and accurate flow, resulting in stable ion
generation, which in turn provides higher MS
sensitivity. Active feedback automatically
compensates for partial blockages or backpressure changes, and the real-time display
of flow rate and pressure simplifies troubleshooting. The Nanoflow LC-System includes
the modules Agilent 1100 Series Nanoflow
Maßstabsvergrößerung. Durch einen stabilen
Rahmen und optimale Säulenqualität für ist
ein konstanter Betrieb und die Reproduzierbarkeit sichergestellt. Drei Säulenmaterialien
für verschiedene Anwendungen und ein modulares Säulenrohr sorgen für Flexibilität.
Kennziffer 45 LW 03
50 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
왔
Pump with Electronic Flow Control, combined with low instrument downtime; Agilent
1100 Series Micro Vacuum Degasser with low
internal volume per channel (1 ml) for fast
changeover of mobile phases and quick purge; Agilent 1100 Series Microwell-plate-Sampler, which enables the handling of nl to µl
injection volumes and the flexibility to inject
from various sample containers and the
Agilent 1100 Series Handheld-Controller for
convenient local status monitoring.
Additional 1100 Series modules enhance the
system’s performance: a thermostat for wellplate sampler/autosampler to prevent thermolabile samples from damage; a Thermostatted Column Compartment with a microcolumn switching option; and four pumping systems for performing 2D-LC-applications to
analyze complex protein samples. For high
sensitivity, the nanoflow-compatible Agilent
1100 Series LC/MSD Trap SL ion-trap-MS and
dedicated software is recommended.
LABORWELT
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Neurowissenschaftliche
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35392 Gießen
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Fax: +49-(0)-641-99-41609
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Straße / Postfach: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Impressum
LABORWELT (ISSN 1611-0854)
erscheint zweimonatlich im Verlag der
BIOCOM AG
Stralsunder Str. 58-59
D- 13355 Berlin
Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11
Internet: www.biocom.de
Redaktion:
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19.-24.05.03: ACHEMA 2003, Frankfurt a.M.
Info: DECHEMA, Theodor-Heuss-Allee 25, D-60486 Frankfurt
(Tel.: +49-(0)69-7564-0, Fax: +49-(0)69-7564-201,
eMail: [email protected], Web: www.achema.de)
19.-20.05.03: Kurs „Patent and Licensing Strategies for Pharma- and Biotech-Industry“, Basel
Info: Dr. Susanne Daniel, Scivent GmbH, Talweg 34, D-79540
Lörrach (Tel.: +49-(0)7621-163443, Fax: +49-(0)7621163372, eMail: [email protected], Web: www.scivent.com)
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Mortimer Street, London W1T 3JH (Tel: +44-(0)20-7453-5404,
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21.05.03: 1. Life Science-Meeting „Aktuelle
Trends in Forschung und Anwendung“, Krems
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22.-25.06.03: BIO 2003, Washington DC, USA
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25.-28.05.03: DGPF – Protein Expression &
Protein Function Congress, Berlin
Info: CTW Congress Organisation Thomas Wiese GmbH,
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Web: www.dgpf.org/dgpf-set.htm)
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Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen
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54 | 4. Jahrgang | Nr. 3/2003
Info: Bay to Bio – Förderkreis Life Science e.V.
(Tel.: +49-(0)40-47-196-260, eMail: [email protected],
Web: www.baytobio.de/veranstaltungen.html)
12.-13.06.03: International Workshop
Metagenomics 2003 – From Microbial
Diversity to Function, Darmstadt
Info: ZEB e.V., Institut für Mikrobiologie und Genetik,
Technische Universität Darmstadt, Schnittspahnstr. 10,
D-64287 Darmstadt (Fax: +49-(0)6151-16-2956,
eMail: [email protected],
Web: www.metagenome-science.de)
18.06.03: Symposium zur deutschen ImpfstoffInitiative, Braunschweig
Info: Ingeborg Jacobi, Vakzine Projekt Management GmbH
(Tel.: +49-(0)531-285040, [email protected])
23.-26.06.03: 10. Arbeitstagung „Mikromethoden
in der Proteinchemie“, Martinsried
Info: Dr. Roland Kellner, Merck KGaA (Tel.: +49-(0)6151-727262, Fax: +49-(0)6151-727-729-0722,
eMail: [email protected], www.arbeitstagung.de)
27.06.03: Heidelberg Forum of Molecular
Catalysis, Heidelberg
26.-28.05.2003: GVC/DECHEMA-Tagung
„Zellkulturen – Vom biologischen System
zum Produktionsprozeß“, Bad Dürckheim
Info: DECHEMA, Theodor-Heuss-Allee 25, D-60486 Frankfurt
(Tel.: +49-(0)69-7564-0, Fax: +49-(0)69-7564-201,
eMail: [email protected], Web: www.achema.de)
30.06.-02.07.03: Nanotrends – Markets and
Applications, Köln
Mayer & Söhne, D- 86551 Aichach
Mitglieder der DECHEMA-Fachsektion
Biotechnologie, der Österreichischen
Gesellschaft für Biotechnologie ÖGBT, der
Neurowissenschaftlichen Gesellschaft NWG,
der Gesellschaft für Genetik GfG, der
Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung DGPF, des Verbandes Deutscher
Biologen vdbiol, der Deutschen Gesellschaft
für Neurogenetik (DGNG), des Vereins zur
Förderung der Nutrigenomforschung sowie
die Wissenschaftler des Nationalen
Genomforschungsnetzes NGFN erhalten die
Zeitschrift im Rahmen ihrer Mitgliedschaft.
05.06.03: Produkt- und Geschäftsführerhaftung
in der Biotechnologie, Hamburg
Info: Prof. Dr. Peter Hofmann, Ruprecht-Karls-Universität
Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 270, D-69120 Heidelberg
(Tel.: +49-(0)6221-54-8502, Fax: +49-(0)6221-54-4885,
Web: www.akph.uni-hd.de/hfmc2003.htm)
Heiko Fritz
Graphik-Design:
Info: Pharmaceutical Training Institute, Postfach 1050,
D-65836 Sulzbach/Ts. (Tel.: +49-(0)6196-585-131,
Fax: +49-(0)6196-585-485, Web: www.pti-aktuell.de)
21.-23.05.03: EuroBiochips 2003, London, UK
Dipl.-Biol. Veronika Szentpétery (verantw.)
Tel.: 030/264921-48
Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk
Tel.: 030/264921-50
Angelika Werner
Tel. 030/264921-40
02.-03.06.03: Seminar „BWL für Biotechs“,
Frankfurt a.M.
27.05.2003: 3. ipal-Seminar, „Protecting Biotech
and Pharmaceutical Inventions before the EPO
and USPTO“, Berlin
Info: Jennifer Heinrich, ipal Gesellschaft für Patentverwertung
Berlin mbH, Bundesallee 210, D-10719 Berlin
(Tel.:+49-(0) 30-2125-4823, Fax: +49-(0) 30-2125-4822,
eMail: [email protected], Web: www.ipal.de)
25.-28.05.03: „Genomics and Cancer - Integrating
Genomics with Clinical Research and Therapy",
Heidelberg
Info: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ),
Im Neuenheimer Feld 580, D-69120
(Tel.: +49-(0)6221-424646, Fax: +49-(0)6221-4249,
Web: www.dkfz.de/LIFEdb/conference/)
27.-28.05.2003 Fortbildungsseminar „Digital
Imaging: Digitale Bilddokumentation in der Mikroskopie“, Bensheim
Leica Mikrosysteme Vetrieb GmbH, Lilienthalstraße 39-45,
D-64625 Bensheim (Fax: +49-(0)6251-136-133,
Web: www.leica-microsystems.de)
02.06.03: Workshop „Hygienekontrolle und
mikrobiologische Probenahme im
Lebensmittelbereich“, Hannover
Info: Petra Grein-Laumeister, VWR International GmbH,
Hilpertstr. 20A, D-64295 Darmstadt
(Tel.: +49-(0)6151-722-053, Fax: +49-(0)6151-7223-777,
Web: www.vwr.com)
02.06.03: Fortbildung „Bio-Analytik/
Flüssigkeitschromatographie – Auswertung
von LC/MS-Spektren“, Sprockhövel
Info: Waltraud Wache, Axel Semrau GmbH & Co.,
Stefansbecke 42, D-45549 Sprockhövel
(Tel.: +49-(0)2339-120925, Fax: +49-(0)2339-6030,
eMail: [email protected], Web: www.axel-semrau.de)
Info: Ilka Schröer, IIR Deutschland GmbH, Otto-Volger-Str. 25,
D- 65843 Sulbach/Ts (Tel.: +49-(0)6196-585-249,
Fax: +49-(0)6196-585-363, Web: www.nanotrends.de)
07.-08.07.03: Seminar „Regulatorische
Anforderungen an die Durchführung klinischer
Studien“, Düsseldorf
Info: Pharmaceutical Training Institute, Postfach 1050,
D-65836 Sulzbach/Ts. (Tel.: +49-(0)6196-585-131,
Fax: +49-(0)6196-585-485, Web: www.pti-aktuell.de)
07.-11.07.03: EMBO Practical Course „Cytometry
and Cell Sorting for Functional Genomics and
Proteomics“, Berlin
Info: (eMail: [email protected], Web: www.drfz.de/pages/
others/embosite)
19.-24.07.03: XII. International Congress – Genes,
Gene Families and Isozymes, Berlin
Info: CTW – Congress Organisation Thomas Wiese GmbH,
Goßlerstr. 30, D-12161 Berlin (Tel.: +49-(0)30-85-99-62-0,
Fax: 49-(0)30-85-07-98-26, eMail: [email protected],
Web: www.ctw-congress.de/genes)
04.-05.08.03: Symposium „Integrative
Bioinformatik“, Bielefeld
Info: Ralf Hofestäft, Universität Bielefeld, Technische Fakultät,
AG Bioinformatik, Universitätsstrasse 25, D-33615 Bielefeld
(Tel.: +49-(0)521-1065-283, [email protected], Web: http://cweb.uni-bielefeld.de/agbi/home/
index.cw)
24.08.-29.08.03: 11th European Congress on Biotechnology – Building Bridges between Biosciences and Bioengineering, Basel, Switzerland
Info: ECB11, c/o AKM Congress Service, PO Box, Clarastrasse
57, CH-4005 Basel, Switzerland (Tel.: +41-61-686-77-11,
Fax: +41-61-686-77-88, eMail [email protected], www.ecb11.ch)
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