- Mestrado em Horticultura Irrigada

Transcrição

UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)
Pró-Reitoria de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG)
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS)
Programa de Pós-Graduação em Horticultura Irrigada – Mestrado (PPHI)
Morgana Mateus Santos
HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE Xanthomonas campestris pv. viticola
E POTENCIAL DE USO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia gracilis PARA
CONTROLE DA BACTÉRIA
JUAZEIRO – BA
2013
UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)
Pró-Reitoria de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG)
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS)
Programa de Pós-Graduação em Horticultura Irrigada - Mestrado (PPHI)
Morgana Mateus Santos
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Horticultura
Irrigada
do
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais da
Universidade do Estado da Bahia (PPHI/
DTCS/UNEB), como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em Agronomia. Área de
Concentração: Horticultura Irrigada.
Orientadora: Prof. Dra. Ana Rosa Peixoto
Co-orientadora: Prof. Dra. Cristiane Domingos da Paz
JUAZEIRO - BA
2013
2
MORGANA MATEUS SANTOS
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Horticultura
Irrigada
do
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais da
Universidade do Estado da Bahia (PPHI/
DTCS/UNEB), como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre em Agronomia. Área de
Concentração: Horticultura Irrigada.
Aprovada em: 12/03/2013
Comissão Examinadora
Prof. Dra. Ana Rosa Peixoto
Universidade do Estado da Bahia (UNEB)
Dr. José Mauro da Cunha e Castro
Pesquisador da Embrapa Semiárido (EMBRAPA)
Dra. Ana Valéria Vieira de Souza
Pesquisadora da Embrapa Semiárido (EMBRAPA)
3
iv
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho ao meu marido Esmailly, grande
incentivador e parceiro, que me cerca de carinho e respeito,
e aos meus pais, Josefa e João Carlos, que me deram
AGRADECIMENTOS
muito apoio nos momentos mais difíceis da minha vida.
Obrigada por tudo!
4
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por sua presença na minha vida e por
ser minha força espiritual.
Agradeço ao meu grande amor e esposo (Esmailly de Sousa Pessoa)
por sua paciência e compreensão; por me tranquilizar nos momentos difíceis e
me dar forças para superar os obstáculos. Jamais conseguirei expressar esse
sentimento e tudo que essa pessoa representa na minha vida.
Agradeço aos meus amados pais e a minha irmã (Vanessa) que são
fundamentais em minha vida; minha fonte de juventude, pois sempre serei a
caçulinha. Eles são meu conforto, minha segurança e alicerce.
Agradeço à Dona Rose, Liemara e Mirna que, com o passar dos anos,
tornaram-se grandes amigas, sempre me ajudando e aconselhando.
Agradeço aos meus mestres, que tiveram presença fundamental na
minha vida profissional e pessoal. As minhas amadas e eternas professoras:
Professora Ana Rosa Peixoto que, com seu sorriso e tranquilidade,
soube me tranquilizar quando, nervosa e agitada, chegava para conversar
sobre a dissertação. Tornou-se uma grande amiga no decorrer deste tempo.
Professora Cristiane Domingos da Paz que sempre esteve presente na
minha caminhada na graduação e no mestrado, que me ensinou, aconselhou e
estimulou. Uma grande mulher que admiro imensamente.
Professora Grécia Cavalcanti por quem, desde o período da graduação
tenho grande carinho e admiração, pessoa especial que me ensinou inúmeras
coisas.
Professora Lindete Mírian Martins que está sempre disposta a ajudar e
se preocupa com todos seus alunos, sempre estimulando e protegendo. É uma
pessoa muito especial, por quem tenho enorme admiração e carinho.
Agradeço à Doutora Maria Angélica Guimarães Barbosa que me deu a
oportunidade de trabalhar em parceria com a Embrapa Semiárido no projeto
sobre o “Estudo da gama de hospedeiros do cancro-bacteriano em plantas
invasoras e em outras espécies de plantas cultivadas”.
Agradeço à Doutora Ana Valéria Vieira de Souza, também pesquisadora
da Embrapa Semiárido, pela oportunidade de trabalhar no projeto sobre a
5
vi
“Ação antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracilis no crescimento in vitro
de Xanthomonas campestris pv. Viticola (Xcv)”.
Agradeço à Doutora Rosa de Lima Ramos Mariano da Universidade
Federal Rural de Pernambuco pela oportunidade de executar e realizar a etapa
de identificação e caracterização molecular dos isolados de Xcv.
Agradeço ao Doutor Marco Aurélio Gama da Universidade Federal Rural
de Pernambuco por me ensinar e ajudar a realizar a identificação molecular
dos isolados de Xcv.
Agradeço ao professor Carlos Aragão pela ajuda nas estatísticas do meu
trabalho de Dissertação.
Agradeço à Helena, Mariana, Márcia e Laíse, bolsistas de iniciação
científica, pela grande ajuda na avaliação dos experimentos.
Agradeço a ajuda de todos os funcionários do campo, da faxina, os
técnicos dos Laboratórios de Solos e de Fitopatologia. Em especial, Seu
Bernadino, Tia Lucilha, Dona Carmem e Tia Neuma.
Agradeço a todas as pessoas que contribuíram para o aprimoramento
deste trabalho. Incontáveis foram os incentivos dos familiares, amigos,
professores e orientadores. A todos vocês, deixo registrados meus sinceros
agradecimentos às ações executadas, às palavras encorajadoras, às
demonstrações de compreensão e amor que me fizeram acreditar e vencer
esse desafio.
6
vii
SUMÁRIO
PÁG.
RESUMO GERAL.............................................................................................X
GENERAL ABSTRACT...................................................................................XII
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................14
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................16
2.1 IMPORTÂNCIA DA CULTURA DA VIDEIRA.......................................16
2.2 O CANCRO BACTERIANO DA VIDEIRA.............................................20
2.2.1 HISTÓRICO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA.........................20
2.2.2 ETIOLOGIA ...............................................................................21
2.2.3 SINTOMATOLOGIA. .................................................................22
2.2.4 DIAGNOSE.................................................................................23
2.2.5 DISSEMINAÇÃO.........................................................................25
2.2.6 SOBREVIVÊNCIA.......................................................................26
2.2.7 HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS.............................................27
2.2.8 ESTRATÉGIAS DE CONTROLE........................... .....................28
2.3 ÓLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE ALTERNATIVO DE DOENÇAS
DE PLANTAS..................................................................................................30
2.3.1. ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia...................................................31
7
viii
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................33
4. OBJETIVO....................................................................................................44
CAPÍTULO I......................................................................................................45
ESPÉCIES ESPONTÂNEAS E OLERÍCOLAS COMO
HOSPEDEIRAS
ALTERNATIVAS DE Xanthomonas campestris pv. viticola
RESUMO ...................................................................................................46
ABSTRACT ...............................................................................................47
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................48
2. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................49
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................53
4. CONCLUSÕES .............. .......................................................................61
AGRADECIMENTOS..................................................................................61
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................61
CAPÍTULO II...............................................................................................66
EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia gracilis SOBRE
CRESCIMENTO “IN VITRO” DE Xanthomonas campestris pv. viticola
O
RESUMO ...................................................................................................67
ABSTRACT ...............................................................................................68
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... ...68
8
ix
2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................70
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................73
4. CONCLUSÕES .............. .......................................................................79
AGRADECIMENTOS..................................................................................80
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................80
CONSIDERAÇÕES GERAIS...........................................................................86
9
x
RESUMO GERAL
A cultura da videira tem se expandido, significativamente, na região do
Submédio do Vale do São Francisco, nos últimos anos. No entanto, o cancro
bacteriano da videira, causado por Xanthomonas campestris pv. viticola – Xcv,
tem proporcionado elevadas perdas a esta cultura, constituindo-se na doença
bacteriana mas importante da videira na região. No presente trabalho, foi
estudado o potencial de 19 espécies espontâneas, seis espécies comerciais e
de Azadirachta indica, como hospedeiras alternativas do patógeno; bem como,
avaliou-se a ação antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracilis, no
crescimento “in vitro” de Xcv. As plantas em teste foram inoculadas com a
suspensão do isolado de Xcv (A570= 0,4 correspondente a 10
8
UFC mL-1),
incubadas em casa de vegetação e observadas diariamente quanto aos
componentes epidemiológicos do cancro bacteriano: período de incubação (PI)
e incidência de folhas com sintomas (INC). O isolado de Xcv obtido de cada
hospedeiro
alternativo
foi
identificado
molecularmente
por
iniciadores
(“Primers”) específicos na Universidade Federal Rural de Pernambuco UFRPE, Recife, PE. Os menores PI foram observados em Glycine sp.(2,6 dias)
e Senna obtusifolia (3 dias). Todas as espécies pertencentes à família
Poaceae,
Bidens
subalternans,
Emilia
fosbergii,
Praxelis
pauciflora,
Macroptilium lathyroides e Portulaca oleracea apresentaram PI=42 dias, não
sendo hospedeiras alternativas do patógeno. Os maiores índices de incidência
da doença foram verificados em Glycine sp.,S. obtusifolia, Desmodium discolor,
Amaranthus deflexus, Azadirachta indica, Solanun esculentum e Vigna
unguiculata que apresentaram 100%, enquanto que os menores valores de
INC foram observados em Leonotis nepetifolia e Tridax procumbens com 50 e
60%, respectivamente. As amplificações com os oligonucleotídeos específicos,
a partir do DNA genômico purificado do isolado de Xcv, obtido das 10
diferentes hospedeiras, resultaram em fragmentos de 240pb, característicos de
Xcv. A ação microbiana de oito óleos extraídos de L. gracilis cultivada com e
sem adubação mineral, adubação orgânica e irrigação, foi testada em três
dosagens diferentes (200; 250 e 300 ppm), testemunha com o oxicloreto de
cobre (controle padrão) e a testemunha absoluta. A suscetibilidade do isolado
10
xi
Xcv3 aos óleos testados foi avaliada na primeira etapa pela presença e
ausência do crescimento bacteriano e, na segunda etapa, pela porcentagem de
inibição do crescimento bacteriano. Os tratamentos referentes aos óleos 01,
06 e 07, extraídos de L. gracilis cultivada com adubação mineral (NPK) e
adubação orgânica, apresentaram as maiores porcentagens de inibição no
crescimento bacteriano de Xcv, ou seja, 94,75%, 96,50% e 94,02%,
respectivamente. Os óleos 4 e 16 proporcionaram menores porcentagens de
inibição no crescimento bacteriano de Xcv, porém causando inibição superior
ao tratamento com oxicloreto de cobre. Os resultados encontrados neste
trabalho confirmam a ação bactericida do óleo essencial de L. gracilis, sobre o
crescimento de Xcv. O uso destes óleos tem potencial e pode ser uma
alternativa no manejo integrado do cancro bacteriano da videira, necessitando
desta forma, a continuar este trabalho, em condições de campo.
Palavras chaves: Sobrevivência; Cancro bacteriano da videira; PCR;
Ação antimicrobiana; Óleo essencial.
11
xii
GENERAL ABSTRACT
The culture of the vine has expanded significantly in the sub-medium of Vale of
San Francisco in recent years. However, the grapevine bacterial canker
(Xanthomonas campestris pv. Viticola - Xcv) has provided high losses to this
crop, constituting the bacterial disease more important in the region. In this
work, we studied the potential of 19 spontaneous species, six vegetables
species and the Azadirachta indica, as alternative hosts of the pathogen, as
well as evaluated the antimicrobial activity of essential oil of Lippia gracilis on
growth "in vitro" of Xcv. Plants with the possibility to being alternative hosts of
Xcv were inoculated with the suspension of isolated Xcv3 (A570 = 0.4
corresponds to 10 8 CFU mL-1), incubated in a greenhouse and observed daily
for epidemiological components of bacterial canker: incubation period (IP) and
incidence of leaves with symptoms (ILS). The isolated Xcv3 obtained from each
alternative host was identified molecularly by primers ("Primer") specifics in
UFRPE, Recife-PE. The minors IP were observed in Glycine sp. (2.6 days) and
Senna obtusifolia (3 days). While all species of the family Poaceae, the
Poaceae,
Bidens
subalternans,
Emilia
fosbergii,
Praxelis
pauciflora,
Macroptilium lathyroides e Portulaca oleracea showed IP = 42 days, not being
therefore, alternate hosts of the pathogen. The highest incidence rates of the
disease were observed in Glycine sp., S. obtusifolia, Desmodium discolor,
Amaranthus deflexus, Azadirachta indica, Solanun esculentum and Vigna
unguiculata wich showed 100%, while the lowest values were observed in the
ILS and Leonotis nepetifolia Tridax procumbens with 50 and 60%, respectively.
The amplifications from genomic DNA purified from isolated Xcv with specific
primers, obtained from the 10 different hosts have resulted in fragments with the
expected size of 240pb. The microbial action of eight oils extracted from L.
gracilis grown with and without chemical fertilization, organic fertilization and
irrigation, were tested in three different doses (200, 250 and 300 ppm), using as
check treatment the Copper oxychloride (standard control) and absolute
standard. The susceptibility of isolated Xcv3 to the oils tested was evaluated in
the first stage through the presence or absence of bacterial growth in the
second stage through the percentage of growth inhibition. The treatments
12
xii
relating to oil 01, 06 and 07 extracted from L. gracilis grown with mineral
fertilizer (NPK) and organic fertilization presented the highest percentages of
inhibition of bacterial growth to Xcv, 94.75%, 96.50% and 94.02%, respectively.
The 4 and 16 oils that gave smaller percentages of inhibition of bacterial growth
in Xcv, however produced inhibition superior to treatment with copper. The
results of this study confirmed the bactericidal action from oils, on bacterial
growth of Xcv. The use of these oils has potential and can be an alternative in
the integrated management of bacterial canker of grapevine, so needed to be
continued this work in field conditions.
Keywords: Survival; Cancer bacterial vine, PCR; Antimicrobial action; Essential
oil.
13
INTRODUÇÃO
A intensificação do cultivo da videira e o plantio de cultivares suscetíveis,
além do manejo inadequado prevalentes no Submédio do Vale do São
Francisco, têm propiciado o surgimento de problemas fitossanitários, afetando
diretamente a produção. Dentre as várias doenças, o cancro bacteriano,
causado por Xanthomonas camprestris pv. viticola Nayudu (Dye) (Xcv), tem se
destacado, tanto pelos prejuízos causados quanto por sua distribuição, restrita
a algumas regiões produtoras no Nordeste brasileiro (TAVARES, 1995).
Xcv tem a capacidade de sobreviver de um ciclo para outro em videiras,
bacelos e mudas infectadas; epifiticamente em folhas e ramos assintomáticas;
em áreas de produção (ARAÚJO, 2001); em restos culturais (NASCIMENTO et
al., 2000) e em hospedeiras alternativas (PEIXOTO et al., 2007). A bactéria,
além de sobreviver em restos culturais e em tecidos vivos infectados de videira,
também consegue infectar outras espécies vegetais que apresentem afinidade
com a cultura. Nessas espécies, essas plantas exibem sintomas semelhantes
ou não àqueles obeservados em videira, atuando, em condições naturais,
como nicho alternativo do patógeno e fonte de inóculo nos parreirais
(NAYUDU,1972).
O controle do cancro bacteriano da videira é complexo devido à
ausência de produtos registrados específicos e ao uso de compostos cúpricos
pouco efetivos. Além disso, existem estirpes de Xcv que apresentam
variabilidade na tolerância ao cobre, tornando o uso contínuo destes produtos
químicos no Submédio do Vale do São Francisco pouco promissor no manejo
da doença em médio prazo. Esse comportamento é agravado pela seleção e
dominância das estirpes mais tolerantes na população bacteriana (LIMA et al.,
2009; MARQUES et al., 2009).
Um dos enfoques da agricultura moderna é o controle alternativo de
doenças, incluindo o uso de óleos essenciais com atividade antimicrobiana.
Vários trabalhos vêm sendo realizados, buscando demonstrar o potencial da
utilização desses óleos no controle de fitopatógenos. Os constituintes dos óleos
14
essenciais variam desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e
terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos,
ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com enxofre. Tais
compostos se apresentam em diferentes concentrações; normalmente um
deles é o composto majoritário, existindo outros em menores teores e alguns
em baixíssimas quantidades (SILVA et al., 2003). A combinação desses
compostos nos óleos essenciais confere atividades biológicas de interesse
contra insetos, plantas daninhas e micro-organismos. (PRABUSEENIVASAN et
al., 2006).
A identificação de hospedeiros alternativos e a busca de produtos
naturais para o controle alternativo de Xcv são passos importantes para a
construção de propostas de manejo do cancro bacteriano. Assim, os objetivos
desse estudo foram: a) identificar plantas espontâneas hospedeiras de Xcv, b)
testar plantas de interesse comercial e de uso como quebra-vento, cultivadas
na região, para verificar seu potencial como hospedeiras alternativas de Xcv e
c) estudar a eficácia do óleo essencial de L. gracilis, na inibição do crescimento
“in vitro” de Xcv.
15
2.REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Importância da cultura da videira
A videira (Vitis spp. L.) está entre as espécies cultivadas mais antigas do
mundo (POMMER & MAIA, 2003). Registros fósseis encontrados em Kannish,
uma antiga cidade comercial da Turquia, mostraram que a viticultura era
praticada há cerca de 3.500 anos a.C. (LEÃO & POSSÍDIO, 2009). Tem como
centro de origem a região do Cáucaso, de onde foi difundida por toda a costa
mediterrânea há centenas de anos, para produção de fruta, consumo in natura
e como matéria-prima para a elaboração de vinhos. Na costa do mediterrâneo,
ao longo dos séculos, foram selecionadas milhares de variedades de Vitis
vinifera que se espalharam pelo mundo (CAMARGO, 2009).
A videira pertence à ordem Rhamnales, família Vitaceae, composto
pelas secções Muscadinia e Euvitis, e gênero Vitis. A família Vitaceae é
dividida em várias subfamílias que compreendem um grande número de
gêneros e espécies, dentre os quais se destacam as espécies V. vinifera L. (de
origem europeia) e V. labrusca L. (de origem americana), que são as mais
cultivadas devido às suas características agronômicas superiores (TEIXEIRA &
AZEVEDO, 1996).
Existem cerca de 10 mil variedades de videira, adaptadas a vários tipos
de solo e clima, o que possibilita o cultivo em mais de 40 países no mundo.
Embora amplamente produzidas, as uvas são bem sensíveis e variam de
acordo com as condições edafoclimáticas em que se desenvolvem,
apresentando características diferenciadoras como sabor, acidez, doçura,
formato, coloração, resistência da casca, tamanho, quantidade de sementes e
formato dos cachos (QUEIROZ-VOLTAN & PIRES, 2003; TONIETTO, 2009).
A partir da introdução do cultivo da videira no Brasil, ocorrida em 1535,
muitos estados brasileiros em diferentes regiões, chegaram a experimentar e a
desenvolver o cultivo da videira e a produção de vinhos. Contudo, a
vitivinicultura somente ganhou impulso e tornou-se atividade de importância
16
socioeconômica a partir do final do século XIX, com a chegada dos imigrantes
italianos, sobretudo no Estado do Rio Grande do Sul (TONIETTO, 2009).
A viticultura vem contribuindo significativamente para o êxito do
agronegócio brasileiro de frutas. Embora a uva seja produzida tradicionalmente
em clima temperado, a videira é cultivada numa enorme diversidade de
condições climáticas. Em terras brasileiras, é produzida também como fruta
tropical, permitindo atender aos mercados internacionais no período de
entressafra dos demais países produtores, uma vez que pode haver oferta de
uva ao longo do ano em distintas regiões do País (PEDRO JÚNIOR &
SENTELHAS, 2003; SILVA et al., 2009).
Atualmente, o Brasil é o 4º produtor mundial de uvas de mesa, com uma
produção de 1.300.000 toneladas de uvas frescas, o que corresponde a 8,2%
da produção mundial que, na média anual de 2010- 2011, se situou em
15.942.000 toneladas. A China com 38,9%, seguida da Turquia e União
Europeia com 13,5 e 11,9%, respectivamente (USDA, 2012), são os três
maiores produtores.
A viticultura brasileira ocupa uma área de aproximadamente 83.484
hectares, com produção anual 1.453.395 toneladas. A maior parte da produção
da uva está localizada na região Sul do Brasil, com 981.705 t, que corresponde
a 67,8% da produção nacional. A maior parte desta produção é destinada à
industrialização de vinhos e sucos. A região Nordeste aparece em segundo,
lugar participando com 19,7% na produção nacional (IBGE, 2012).
A produção nordestina, que em 2002 foi de 186.548 toneladas, alcançou
285.047 t em 2012, ou seja, um aumento de 52,8%. Esse avanço na produção
foi alavancado pelo Estado de Pernambuco com um aumento na produção em
224,8%. A Bahia apresentou uma queda na produção de 27,6%. Pernambuco
aumentou a sua participação regional de 53% para 78,8% de um censo ao
outro, enquanto a Bahia diminuiu sua produção, de 44,6% em 2002, para
21,2% em 2012 (IBGE, 2012).
17
O Submédio do Vale do São Francisco é o principal centro produtor e
exportador de uvas de mesa no Brasil, participando com 93% do que se produz
na região Nordeste. Os munícipios de Petrolina, Lagoa Grande, Santa Maria da
Boa Vista e Orocó, no Estado de Pernambuco, seguidos dos municípios de
Juazeiro, Casa Nova, Curaçá, Sobradinho e Sento Sé, no Estado da Bahia
(IBGE, 2010), são os maiores produtores.
As variedades cultivadas nos núcleos viticultores do polo Juazeiro–
Petrolina são de diferentes genótipos de V. vinifera para a produção de uvas
finas de mesa. As variedades Itália, Benitaka, Brasil e Ribier são as
predominantes. Red Globe foi uma importante variedade cultivada em diversas
áreas, mas, devido à sua elevada suscetibilidade ao cancro bacteriano e ao
dispendioso custo para o convívio com a doença, foi sendo erradicada
(LOPES, 2006). Há apenas pequenas glebas que ainda preservam seu cultivo.
Entre as variedades sem sementes, destacam-se a Festival, também
chamada de Sugraone, Superior Seedless ou White Seedless, Crimson
Seedless e Thompson Seedless (LEÃO et al., 2009a; LEÃO et al., 2009b). Nas
áreas produtores do Submédio do Vale do São Francisco predomina o cultivo
das variedades Festival (60%), Thompson Seedless (35%) e Crimson Seedless
(5%) (ANUÁRIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2009).
A viticultura no Submédio do Vale do São Francisco tem características
dinâmicas e peculiares, que a diferencia daquelas praticadas nas tradicionais
regiões vitivinícolas brasileiras. Atualmente, essa relevância está voltada para o
polo agroindustrial que engloba as cidades de Petrolina, Lagoa Grande,
Juazeiro e Casa Nova ou polo da agricultura irrigada do Submédio do Vale do
São Francisco, às margens do rio. Essas áreas de plantio irrigadas fornecem
uvas, de elevada qualidade em quase todos os meses do ano. A irrigação,
aliada à programação de podas, permite adaptar as parreiras a ciclos
sucessivos, possibilitando a administração da oferta, fazendo-a coincidir com
as entressafras das demais regiões vitivinícolas brasileiras e internacionais,
driblando entraves inerentes à sazonalidade (SILVA et al., 2009).
18
Os níveis elevados de radiação na região, aliados a altas temperaturas,
reduzem os ciclos da videira em 30 dias, o que permite até 2,5 safras por ano
com produtividade acima da média nacional (PEDRO JÚNIOR & SENTELHAS,
2003; POMMER & MAIA, 2003). Essas condições tornaram o Submédio do
Vale do São Francisco uma região de grande importância na viticultura
brasileira, considerando-se que mais de 90% das uvas finas de mesa são
exportadas do Brasil. Entretanto, a ocorrência simultânea de várias fases
fenológicas da planta nesta região aliado às condições climáticas, ao uso de
material propagativo sem sanidade comprovada e à importâção irregular de
materiais genéticos, entre outros, são alguns dos fatores que têm propiciado a
intensificação e o surgimento de novos problemas fitossanitários na cultura
(LIMA et al., 2009).
A videira está sujeita a diversos problemas fitossanitários, entre os
quais, doenças causadas por fungos, vírus e bactérias. Dentre as doenças de
etiologia bacteriana, apenas duas, causadas por Agrobacterium vitis Ophel &
Kerr e Agrobacterium sp., haviam sido descritas até o ano de 1998, no Brasil. A
formação de galhas induzida pela bactéria não apresenta expressão para a
cultura e já foi descrita em parreirais dos estados de Minas Gerais, Rio Grande
do Norte, São Paulo, Bahia e Pernambuco (LIMA & MOREIRA, 2002).
No Brasil, de acordo com a portaria Ministerial nº180 de março de 1996,
publicada no diário Oficial da União de 25 de março de 1996, são relatadas 221
pragas de importância quarentenária. A legislação brasileira considera pragas
A1 aquelas ausentes no País, mas com características de serem potenciais
causadores de danos econômicos, se introduzidas. Em videira, somente a
Xylophilus ampelinus Willems
é descrita como praga A1. As pragas
quarentenárias A2 são aquelas de importância econômica potencial, mas já
presentes no país, em áreas restritas, estando sob programa oficial de controle.
Em videira, somente X. campestris pv. viticola é citada nesta categoria
(BRASIL, 2007).
19
2.2. O cancro bacteriano da videira
2.2.1. Histórico e distribuição geográfica
O cancro bacteriano da videira foi detectado pela primeira vez em V.
vinifera cv. Anab-e-shahi em Tirupati (Andhra Pradesh), em 1960 (NAYUDU,
1972). Este autor estudou a doença e identificou o organismo causal como
Pseudomonas
viticola.
Mas,
posteriormente,
foi
renomeada
como
Xanthomonas campestris pv. viticola (DYE, 1978). A doença também foi
identificada em 1984 na cultivar Thompson Seedless em Sangli e nos distritos
de Solapur, em Maharashtra (PATIL, 1988), onde causou uma perda de 60 a
70% da produção (CHAND & KISHUN, 1990). O segundo relato mundial da
bacteriose ocorreu em lavouras de cultivo comercial, no polo Juazeiro, BA –
Petrolina, PE (LIMA et al., 1999; MALAVOLTA Jr. et al., 1999a). A Índia e o
Brasil permanecem como as únicas fronteiras internacionais da doença, onde
causa graves prejuízos (JAMBENAL, 2008).
No Brasil, no início do ano de 1998, os sintomas do cancro bacteriano da
videira foram detectados, pela primeira vez, em parreirais comerciais do
Submédio do Vale São Francisco, doença, até então, desconhecida na região.
Na ocasião, plantas de V. vinifera da variedade Red Globe foram coletadas,
apresentando sintomas nas folhas, nos ramos, nas ráquis e nas bagas. Os
sintomas foram constatados, inicialmente, em plantios novos, com 2 a 3 anos
após enxertia, com incidência de até 100% em Red Globe e nas variedades
sem sementes, oriundas de ‘Thompson Seedless’. Também foram registrados
sintomas do cancro bacteriano em videiras das cultivares Perlette, Itália,
Festival,
Brasil,
Ribier,
Piratininga,
Patrícia,
Catalunha
e
Benitaka
(MALAVOLTA Jr. et al., 2003).
Acredita-se que a introdução do cancro bacteriano da videira no Brasil
tenha ocorrido em 1996 ou 1997, com a utilização de material propagativo
infectado originário da Índia (ROBBS & RODRIGUES NETO, 1999; LIMA et al.,
1999; MALAVOLTA Jr. et al., 1999a; ARAÚJO, 2000). Estudos mostraram que
as estirpes brasileiras e o isolado tipo NCPPB 2475, da Índia, são altamente
20
relacionados geneticamente, indicando uma origem comum, em acordo com a
hipótese da introdução (TRINDADE et al., 2005). Segundo Freire & Oliveira
(2001), o patógeno foi introduzido inadvertidamente por produtores do
Submédio do Vale São Francisco, diretamente da Índia, por meio de estacas
contaminadas da variedade Red Globe contaminada.
O segundo relato desta doença no Brasil ocorreu no município de
Teresina, PI, em maio de 1998. Os sintomas, desta vez, foram observados em
ramos e folhas das variedades Red Globe, Itália e Ribier (MALAVOLTA Jr. et
al., 1999b). Em 1999, a doença já havia sido disseminada nos municípios de
Petrolina e Santa Maria da Boa Vista, PE; Curaçá, Casa Nova, Juazeiro e
Sento Sé, BA e Teresina, PI. Em 2001, a doença já havia chegado ao
município de Jaguaruana, CE, infectando plantas de ‘Red Globe’, ‘Flame
Seedless’ e ‘Festival’ (FREIRE & OLIVEIRA, 2001). Em 2006, foi confirmada a
presença do cancro bacteriano em Boa Vista, RR e no município de Formosa,
GO (HALFELD-VIEIRA & NECHET, 2006; JUNQUEIRA et al., 2006). O último
relato oficial do cancro bacteriano da videira ocorreu em agosto de 2010, em
Tatuí, SP, demonstrando, mais uma vez, a capacidade de disseminação da
bactéria. A região foi mantida em inspeção por fiscais fitossanitários da
Coordenadoria de Defesa Agropecuária de São Paulo, sob a supervisão do
Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento e todas as videiras com
sintomas da doença foram eliminadas (BRASIL, 2011).
2.2.2. Etiologia
A etiologia do cancro bacteriano foi esclarecida por meio do isolamento
do agente causal, a partir de amostras de V. vinifera, variedade Red Globe,
coletadas em cultivos comerciais no Submédio do Vale do São Francisco. Em
seguida, foram realizados testes bioquímicos, culturais, fisiológicos e de
patogenicidade. Por meio destes testes o agente causal foi identificado como
X. campestris pv. viticola (MALAVOLTA Jr. et al.,1999a; LIMA et al.,1999).
Xcv apresenta células em forma de bastonetes Gram-negativos,
medindo 0,6 x 1,2-2,5 µm, não encapsulados e possuem um flagelo polar.
21
Produz colônias arredondadas, brilhantes com bordos lisos e de coloração
esbranquiçada
em
xantomonadina
–
meio
ágar-nutritivo,
pigmento
devido
característico
das
à
não
produção
bactérias
do
de
gênero
Xanthomonas (NAYUDU, 1972; CHAND & KISHUN, 1990b). Seu crescimento
ótimo em meio de cultura ocorre entre 27 e 29°C, pH 7,5 e concentração de até
3% de NaCl. Não utiliza nitrato como fonte de nitrogênio, mas cresce bem em
sais de amônio e ácido glutâmico, embora seu crescimento seja melhor em
caseína hidrolisada (NASCIMENTO et al., 2005).
Nayudu, em 1972, realizou os testes: vermelho de metila; do indol; de
Voges-Proskauer; urease; oxidase; uso de asparagina como única fonte de
nitrogênio e carbono; redução de nitrato a nitrito e produção de acetoína, que
foram negativos para a bactéria em estudo. Realizou, também, os testes para
produção de catalase e hidrólise de amido e gelatina que apresentaram
resultados positivos. O teste de hipersensibilidade foi positivo em folhas de
tomateiro ‘Santa Clara’, mas negativo em fumo (LIMA et al.,1999; MALAVOLTA
et al., 1999), confirmando a identificação de Xcv.
2.2.3. Sintomatologia
Os
sintomas
do
cancro
bacteriano
da
videira
aparecem,
preferencialmente, em épocas de alta umidade e elevadas temperaturas,
períodos em que a infecção é mais intensa. Em plantas infectadas, os sintomas
manifestam-se, inicialmente, nas folhas, como pontos necróticos de 1 a 2 mm
de diâmetro, com ou sem halos amarelados, podendo aparecer próximos às
nervuras ou espaçados na superfície foliar e evoluem para manchas angulares
escuras, algumas vezes, coalescendo e causando crestamento e morte de
extensas áreas do limbo foliar (Figura 1). Nas nervuras e pecíolos das folhas,
ramos (Figura 2) e ráquis dos frutos, formam-se manchas escuras alongadas,
que evoluem para fissuras longitudinais de coloração negra, conhecidas como
cancros. As bagas são desuniformes em tamanho e cor, podendo apresentar
lesões necróticas e, quando severamente afetadas, são pequenas e murchas,
em decorrência da necrose da ráquis e dos pedicelos. Nesse estágio, as folhas
se tornam amareladas e caem. A presença de cancros na ráquis e bagas
22
favorece, ainda, a proliferação de patógenos secundários, aumentando a
incidência de podridões de cachos. Alcançando o sistema vascular da planta, a
bactéria assume caráter sistêmico. Os sinais da doença podem ser
visualizados na forma de descoloração vascular, em pequena extensão
próximo aos cancros (NAYUDU, 1972; NASCIMENTO et al., 2000; LOPES,
SANTOS, M.M. , 2012.
2006; LIMA et al, 2009).
Figura 1. Sintomas do cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris
pv. viticola na cultivar Red Globe, observados pelas manchas localizadas nas nervuras e no
limbo foliar.
Figura 2. Sintomas do cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris
pv. viticola na cultivar Red Globe, observados no pecíolo foliar.
2.2.4. Diagnose
O diagnóstico do cancro bacteriano da videira é feito com base nos
sintomas observados nas folhas, cachos e caules, seguido pelo isolamento
bacteriano e identificação por meio de testes bioquímicos, nutricionais e de
patogenicidade (LIMA et al., 1999; MALAVOLTA Jr. et al., 1999a).
23
Para o isolamento de Xcv, Peixoto & Mariano (2006) desenvolveram um
meio de cultura semisseletivo, o NYDAM (extrato de carne 3 g.L-1, peptona 5
g.L-1, glicose 10 g.L-1, extrato de levedura 5 g.L-1, ágar 18 g.L-1, ampicilina
0,1g.L-1),
que
impede
o
crescimento
de
bactérias
epifíticas,
como
Mycobacterium barkeri, sempre presentes nos isolamentos e citadas desde os
trabalhos de Chand & Kishum (1990). Esse meio favorece o crescimento e
desenvolvimento de Xcv, facilitando, assim, o isolamento bacteriano e a
identificação da doença.
A utilização dos métodos de isolamento, dos testes bioquímicos e da
patogenicidade para a detecção e identificação de Xcv em partes de plantas de
videira e/ou material propagativo, quer sintomática ou não, é um processo
demorado. Diante disso, Araújo
et al. (2005) desenvolveram anticorpos
policlonais para Xcv que são usados para diagnóstico sorológico pelo método
Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) indireto e para imunomarcação
a partir de amostras de folhas e ramos de videira infectados. Os anticorpos
mostraram-se altamente reativos e específicos para o patovar viticola e a
imunomarcação confirmou a presença da bactéria em amostras sintomáticas e
assintomáticas por meio de microscopia eletrônica de transmissão.
A diagnose do cancro bacteriano também pode ser realizada por
métodos moleculares. Trindade et al. (2005) verificaram que 41 estirpes de
Xvc, caracterizadas pelo método molecular de rep-PCR (REP, ERIC e BOX),
apresentaram presença de bandas diagnósticas e um padrão de bandas
distintos de outras patovares do gênero Xanthomonas. Em 2007, os mesmos
autores, desenvolveram um método molecular para detecção de Xcv, em
tecidos vegetais, com a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A bactéria
não foi detectada diretamente por PCR a partir do macerado de tecidos de
videira infectados e sintomáticos, mas, a detecção foi possível após o
enriquecimento em meio de cultura, numa etapa anterior à PCR, a partir de
tecidos sintomáticos. O tempo total necessário para a detecção e identificação
de Xcv por PCR foi de 3 a 4 dias, o que é uma vantagem do método, quando
comparado com as técnicas convencionais. Pelo menos 10 dias são
24
necessários para isolamento e a identificação por testes bacteriológicos e de
patogenicidade tradicionais. Porém, os autores ainda não recomendam a
técnica para detecção a partir de amostras assintomáticas ou de hospedeiros
alternativos.
2.2.5. Disseminação
A disseminação de Xcv ocorre a partir de restos culturais de videira
infectados presentes nos parreirais, que constituem importante fonte de inóculo
e de sobrevivência da bactéria. Os restos culturais podem ser transportados
em veículos, contentores e aderidos a roupas. As operações de desbaste,
desbrota, poda, torção de ramos e raleio de cachos também disseminam as
bactérias devido às injúrias causadas as plantas. Essas injúrias, além das
aberturas naturais, são um dos principais sítios utilizados pela bactéria para
penetração e infecção dos tecidos vegetais (ARAÚJO, 2001; LOPES, 2006).
Após a penetração, a bactéria se multiplica rapidamente, colonizando os
espaços intercelulares e atingindo o sistema vascular, sendo transmitida a
todos os órgãos da planta (NASCIMENTO& MARIANO, 2004).
Em condições de elevada precipitação pluviométrica, associada a fortes
ventos, ocorrem lesões no limbo foliar e outros tecidos tenros da videira, o que
facilita à penetração da bactéria, e a ocorrência de temperaturas elevadas
contribui para o seu crescimento acelerado (LIMA, 2003). A irrigação também
atua disseminando a bactéria, por meio dos respingos. Essa disseminação é
potencializada quando ocorre exsudação bacteriana na planta. As gotas de
água dissolvem os aglomerados bacterianos, presentes nos tecidos doentes da
planta, e se fragmentam, formando gotículas bem menores que ficam em
suspensão no ar. Pela ação do vento, são depositadas nos órgãos da própria
planta ou carreadas para plantas vizinhas, resultando em uma inoculação
natural (LIMA & MOREIRA, 2002; ROMEIRO, 2005). À longa distância, Xcv
também pode ser disseminada pela aquisição de mudas ou bacelos infectados
(ARAÚJO, 2001).
25
2.2.6. Sobrevivência
Romeiro (2005) relatou que as bactérias que incitam doenças em
plantas de interesse econômico sobrevivem, dependendo da espécie
considerada, associadas às sementes, partes propagativas, órgãos vegetais,
restos culturais, epifiticamente ou endofiticamente em planta cultivadas ou de
plantas espontâneas. Segundo Leben (1981), uma das principais formas de
sobrevivência das fitobactérias é a fase hipobiótica, condição em que
sobrevivem dentro de tecidos infectados de difícil decomposição. Muitas
bactérias podem, também, permanecer latentes no tecido hospedeiro, como
mecanismo de sobrevivência, e, estrategicamente, aguardam até que o
hospedeiro seja enfraquecido por condições desfavoráveis do meio para iniciar
o processo de infecção e desenvolvimento da doença (VALE et al, 2004).
A bactéria exerce parte do seu ciclo numa fase residente, em que
populações desta se multiplicam na superfície das plantas hospedeiras sem
infectá-las, constituindo fonte de inóculo na ausência da doença (ROMEIRO,
2005). Esse mecanismo de multiplicação e sobrevivência epifítica já era citado
por Chand et al. (1999), como um mecanismo adaptativo de Xcv, exibido na
espera por condições favoráveis à infecção no hospedeiro.
Xcv tem a capacidade de sobreviver de um ciclo para outro em videiras,
bacelos e mudas infectadas, epifiticamente em folhas e ramos de videiras
assintomáticas (ARAÚJO, 2001); em restos culturais (NASCIMENTO et al.,
2000), e em hospedeiras alternativas (PEIXOTO et al., 2007): Em restos de
poda de videira infectados a bactéria pode sobreviver, durante, pelo menos, 80
dias do ciclo da cultura, constituindo fonte de inóculo primário para plantas
sadias (SILVA et al., 2009). Nascimento et al. (2005), observaram que, em
condição de laboratório (25ºC), este patógeno foi capaz de sobreviver por até
150 dias, em folhas de videira herborizadas.
Xcv
também
consegue
infectar
outras
espécies
vegetais
que
apresentem afinidade, por vezes exibindo sintomas semelhantes ou não
aqueles observados em videira. Nayudu (1972) já citava, em seu trabalho, a
26
possibilidade de outras espécies vegetais atuarem, em condições naturais,
como um nicho alternativo do patógeno e fonte inóculo nos parreirais. A
mangueira e o nim, na Índia, são exemplos que confirmam essa observação.
Em condições adversas do ambiente, as fitobactérias têm a capacidade
de sobreviver, epifiticamente no hospedeiro, sem causar doença ou de
encontrar
hospedeiras
alternativas.
Xanthomonas
campestris
pv.
mangiferaeindicae foi encontrada epifiticamente em 50% das principais plantas
daninhas presentes em pomares de manga na Índia (RAM et al.,1994).
Robinson et al. (2006) verificaram que Xanthomonas campestris pv. vitians
(Brown) sobrevivia em alface, tomate, pimentão, beterraba e, também, nas
principais plantas daninhas encontradas em campos de produção na
Califórnia/EUA, utilizando essas plantas como hospedeiras alternativas.
Kurozawa e Pavan (2005) também descreveram a sobrevivência de
Xanthomonas vesicatoria (Doidge) em Amaranthus retroflexus, Chenopodium
album, Datura spp., Digitaria sanguinalis, Portulaca oleraceae, Setaria glauca,
Solanum nigrum e Physalis spp., sendo plantas hospedeiras potenciais na
sobrevivência de forma epifítica da bactéria em culturas de tomateiro.
2.2.7. Hospedeiras alternativas
Na Índia, segundo Desai et al. (1966) e Nayudu (1972), Xcv além de
infectar a videira, também infecta naturalmente plantas de nim (Azadirachta
indica A. Juss e Phyllanthus maderaspatensis L. com sintomas semelhantes
àqueles observados em V. vinifera.
No Brasil, Xcv foi capaz de infectar, por meio de inoculação artificial,
mangueira (Mangifera indica L.), cajueiro (Anacardium occidentale L.), cajámanga (Spondias dulcis G. Forst.), umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda) e
aroeira
(Schinus
terebenthifolius
Raddi),
resultando
em
infecções
características. Contudo, infecções naturais não foram registradas nessas
espécies (ARAÚJO et al., 1999).
27
Também, a partir de inoculações artificiais, Peixoto et al. (2007)
observaram sintomas típicos do cancro bacteriano em plantas espontâneas
como erva-de-santa-luzia [Chamaesyce hirta (L.) Millsp.], capim-pé-de-galinha
[Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd], capim-meloso (Eragrostis pilosa P.
Beauv.), quebra-pedra rasteiro (Euphorbia prostata) e madrepérola (Pilea sp.).
Por outro lado, Braga e Ferreira (2000) não observaram sintomas da doença
quando, artificialmente, inocularam a bactéria em plantas de fumo, cebola,
tomate, beterraba, cenoura, repolho, pepino, soja, feijão e alface. No Submédio
do Vale São Francisco, Peixoto et al. (2007) realizaram de levantamento do
cancro bacteriano da videira e observaram infecção natural de Xcv em plantas
espontâneas
como
apaga-fogo
(Alternanthera
tenella
Colla),
bredo
(Amaranthus sp.), soja-perene (Glycine sp.), fedegoso (Senna obtusifolia L.),
melão-de-são-caetano (Mormordica charantia L.) e Phyllanthus sp.
Moreira et al. (2006) observaram plantas de nim com lesões necróticas
e, a partir do isolamento, conseguiram obter a bactéria em cultura pura. Desta
forma, nas condições climáticas do Submédio do Vale do São Francisco, o nim
é uma hospedeira alternativa do patógeno, podendo servir como fonte de
inóculo potencial já que é muito utilizado como quebra-vento (NASCIMENTO et
al., 2001). A infecção desta planta por Xcv leva a manchas foliares e cancros
em ramos e pecíolos, sintomas semelhantes aos observados em videira (LIMA
& MOREIRA 2002). Robbs & Neto (1999), também levantaram a possibilidade
de um ciclo epifítico de Xcv em mangueiras, devido às semelhanças na
sintomatologia
e
epidemiologia
entre
Xcv
e
X.
campestris
pv.
mangiferaeindicae.
2.2.8. Estratégias de controle
O controle do cancro bacteriano da videira é complexo por causa da
ausência de produtos registrados específicos (GAVA, 2006). O controle desta
doença deve ser realizado de forma preventiva, com compostos cúpricos e
calda bordalesa, logo após a poda, a brotação, e quando ocorrerem ferimentos
nas plantas. Ensaios com termoterapia de bacelos, indutores de resistência e
antibióticos podem ser alternativas de manejo da doença para as regiões
28
produtoras (MALAVOLTA Jr. et al., 1999a; LOPES, 2006). Porém, o uso
exclusivo de compostos à base de cobre nem sempre é efetivo, por causa da
existência de estirpes de Xcv que apresentam variabilidade na tolerância ao
cobre (MARQUES et al., 2009). Isso torna o uso contínuo destes produtos
químicos no Submédio do Vale do São Francisco pouco promissor no manejo
da doença, em médio prazo, podendo levar a seleção e dominância das
estirpes mais tolerantes na população bacteriana (LIMA et al., 2009;
MARQUES et al., 2009).
Medidas preventivas são recomendadas para interferir no ciclo da
bactéria, sua sobrevivência e disseminação. Segundo a Instrução Normativa nº
09 de 20 de abril de 2006, para as medidas de prevenção e controle de Xcv é
necessário que todo o material resultante das podas de produção seja retirado
da área e queimado; o produtor deve vistoriar, periódicamente, o talhão com o
objetivo de detectar a presença da bactéria; todo material com sintoma deve
ser retirado e incinerado. Durante o período chuvoso, nos talhões plantados
com variedades suscetíveis, deve ser realizado o controle químico a partir do
início das brotações, com produtos recomendados. As podas em variedades
altamente suscetíveis não deverão ser feitas durante o período chuvoso e,
deve-se, ainda, eliminar as plantas que sejam hospedeiras alternativas dessa
bactéria (LIMA, 2002; BRASIL, 2006; PEIXOTO et al., 2007).
A eficácia do controle químico do cancro bacteriano da videira, pela
pulverização das plantas com produtos bactericidas, tem sido de pouca
magnitude nos parreirais, devido à baixa eficiência dos produtos usados.
Pesquisas desenvolvidas evidenciam a ineficácia das pulverizações dos
produtos à base de cobre no controle da doença. Os isolados brasileiros
de Xcv diferem em sua sensibilidade ao sulfato de cobre, e cepas mais
tolerantes ocorrem naturalmente em vinhedos nos estados de Pernambuco e
Bahia (MARQUES et al., 2009). O uso contínuo de compostos cúpricos como
uma das medidas adotadas para prevenir a disseminação da doença, pode ter
levado à seleção dessas estirpes mais tolerantes (ARAÚJO, 2001). Por esse
motivo, a utilização de métodos alternativos de controle, entre os quais se inclui
29
o uso de produtos naturais com atividade antimicrobiana, vem sendo
pesquisada.
2.3. Óleos essenciais no controle alternativo de doenças de plantas
doenças, o qual inclui o controle biológico, a indução de resistência em plantas
e o uso de produtos naturais com atividade antimicrobiana (SCHWAN et al.,
2003). Dentre os produtos naturais com atividade antimicrobiana, os óleos
essenciais vêm tendo grande interesse na investigação das suas propriedades
químicas e farmacológicas (SILVA et al., 2003; BARBOSA, 2006). Em muitos
casos, estas substâncias servem como mecanismo de defesa da planta contra
micro-organismos, insetos e herbívoros (SCHULTES, 1978).
Os óleos essenciais estão sendo considerados como uma alternativa
importante no controle microbiano em plantas. De origem natural, são seguros
para o ambiente, pois apresentam menor risco de promover resistência
microbiana, já que são misturas de vários compostos que apresentam
diferentes ações antimicrobianas (DAFERERA et al., 2003). Vários trabalhos
vêm sendo realizados, buscando demonstrar o potencial da utilização dos
óleos essenciais no controle de fitopatógenos (ARRAS & USAI, 2001;
GADELHA et al., 2003; SILVA et al., 2004; AMORIM et al, 2011; NETO et al.,
2012).
Os constituintes dos óleos essenciais variam desde hidrocarbonetos
terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres,
óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até
compostos com enxofre. Na mistura, tais compostos apresentam-se em
diferentes concentrações; normalmente um deles é o composto majoritário,
existindo outros em menores teores e alguns em baixíssimas quantidades
(SILVA et al., 2003). As combinações de um grande número de compostos
presentes nos óleos essenciais confere atividades biológicas de interesse, tais
como: inseticida, herbicida e ação antimicrobiana (PRABUSEENIVASAN et al.,
2006).
30
Estudo realizado por Bergonzelli et al. (2003) identificou 16 óleos
essenciais, disponíveis comercialmente, que apresentavam atividade antiHelicobacter, in vitro. Os constituintes puros de alguns desses óleos essenciais
mostraram a presença dos compostos carvacrol, isoeugenol, nerol, citral e
sabineno, mostrando forte poder de inibição de Helicobacter pylori.
Vários trabalhos têm mostrado que extratos e óleos inibem o
crescimento de fitopatógenos in vitro, incluindo bactérias. Vigo-Schultz et al.
(2005) relataram a atividade de extratos alcoólicos de erva-cidreira, alecrim e
guaco in vitro sobre o crescimento de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
(Smith). Oliveira et al. (2010), trabalhando com óleo, extratos vegetais e sais
sobre bactérias fitopatogênicas, obtiveram a inibição do crescimento de
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Doidge e X. campestris pv. campestris
Pammel com extratos de hortelã. O crescimento dessas bactérias, e de
Pectobaterium carotovorum subsp. carotovorum Jones, também foi inibido com
extratos de alho. O óleo essencial e extrato de pimenta-longa (Piper aduncum
L.) e extrato etanólico de comigo-ninguém-pode (Dieffenbachia picta Schott)
apresentam capacidade de inibição do crescimento de Ralstonia solanacearum
(Smith) (VÉRAS & YUYAMA, 2001; VÉRAS et al., 2002).
2.3.1. Óleo essencial de Lippia
O gênero Lippia inclui aproximadamente 200 espécies de ervas,
arbustos e árvores de pequeno porte, sendo caracterizado pela presença de
óleos essenciais com atividade antimicrobiana,
em cuja constituição,
substâncias como timol e carvacrol estão presentes. Segundo estudos
realizados por Goodmam e Gilman (1978), o óleo de Lippia sidoides Cham,
constituído de timol (50 a 60%) e carvacrol (5 a 8%), apresenta efeito
bactericida sobre espécies de fungo do gênero Penicilium. Estudos realizados
por Leal et al. (2003) também verificaram que este óleo apresenta atividade
antibacteriana, no controle de Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas
aeruginosa,
Acinetobacter
sp.,
Streptococcus
mutans,
Corynebacterium xerosis, e antifúngica a Candida albicans, Trichophyton
rubrum e T. interdigitale, dentre outros.
31
Os óleos de Lippia alba (Mill) N.E.Br. mostraram-se com atividade
antimicrobiana sobre bactérias de interesse clínico, principalmente aquelas
Gram positivas (ALEA et al., 1997). Segundo trabalho realizado por Oliveira
(2000), esses óleos também apresentavam efeito inibidor sobre o fungo
Geotrichum spp. Os óleos mostraram-se altamente efetivo no controle da
germinação de teleosporos de Ustilago scitaminea Sydow e conídios de
Colletotrichum falcatum Went e de Curvularia lunata Wakker, apresentando
efeito superior a fungicidas comerciais no controle de fungos patogênicos de
plantas (RAO et al., 2000).
O alecrim da chapada (Lippia gracillis Schauer) é um subarbusto pouco
ramificado, com folhas aromáticas e altura variando de 1,2 a 3,0 m. É
encontrado na região Nordeste no município de Piripiri-PI, nas proximidades do
Parque Nacional de Sete-Cidades (MATOS, 1998; MATOS et al., 2004). É uma
planta rica em óleo essencial, cuja composição é constituída pelo timol (10%) e
carvacrol (41,7%) (RASSOLI & MIRMOSTAFA, 2003; ALBUQUERQUE, 2005).
O óleo de L. gracilis apresenta elevada atividade antimicrobiana e antifúngica
(Matos et al., 1999). Segundo Albuquerque et al. (2006), este óleo é eficiente
na inibição de algumas bactérias que comumente causam contaminação em
laboratórios de cultura de tecidos de plantas, tais como Salmonella sp.,
Klebsiella pneumoniae e Bacillus cereus. Também mostrou atividade
antifúngica contra Geotrichum candidum White, Aspergillus flavus, Curvularia
lunata e Aspergillus niger.
A determinação da atividade biológica desses compostos, com
referência ao efeito antimicrobiano, poderá contribuir para o desenvolvimento
de novos defensivos agrícolas, fundamentais para o manejo de doenças de
plantas, minimizando o aparecimento de micro-organismos resistentes, bem
como a contaminação do ambiente.
32
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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43
4. OBJETIVOS
A identificação de hospedeiros alternativos e a busca de produtos
naturais para o controle alternativo de Xcv são passos importantes para a
construção de propostas de manejo do cancro bacteriano. Assim, os objetivos
desse estudo foram: a) identificar plantas espontâneas hospedeiras de Xcv, b)
na região, para verificar seu potencial como hospedeiras alternativas de Xcv e
c) estudar a eficácia do óleo essencial de L. gracilis, na inibição do crescimento
“in vitro” de Xcv.
44
CAPÍTULO I
IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE
Xanthomonas campestris pv. viticola
45
IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE
Xanthomonas campestris pv. viticola
Morgana Mateus Santos1; Ana Rosa Peixoto1; Esmailly de Sousa Pessoa1;
Marco Aurélio Gama2; Rosa Lima Ramos Mariano2; Maria Angélica Guimarães
Barbosa3.
1
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, Universidade do Estado da Bahia, CEP
48900-000,
Juazeiro,
BA,
email:
[email protected],
2
Departamento
de
Agronomia, Área de Fitossanidade, Universidade Federal Rural de Pernambuco, CEP 521713
030, Recife, PE. EMBRAPA- Semiárido, Cx. Postal 23, CEP 56302-970, Petrolina, PE
RESUMO
Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), agente causal do cancro bacteriano
da videira, sobrevive em hospedeiras alternativas, plantas infectadas e
epifiticamente em órgãos da parte aérea. O presente trabalho teve como
objetivo investigar possíveis hospedeiras alternativas do patógeno, visando
fornecer subsídios para o manejo da doença. Foram testadas 26 espécies
vegetais, entre elas, oleráceas, espécies espontâneas e quebra vento,
comumente encontradas nos parreirais, nas quais inoculou-se o patógeno na
concentração de 10
8
UFC/mL pelo método de fricção por dupla gaze, em
condições de casa de vegetação, no DTCS/UNEB, Juazeiro, BA. O
delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 27 tratamentos e
cinco repetições. A suscetibilidade das plantas ao isolado de Xcv foi avaliada
pelas variáveis epidemiológicas: período de incubação (PI) e incidência da
doença (INC). Após a observação dos sintomas de Xcv nas espécies citadas,
realizaram-se os Postulados de Koch nas mesmas, bem como em mudas de
videira ‘Thompson seedless’. O isolado de Xcv 3, utilizado nos testes e obtido
de cada hospedeiro alternativo foi identificado molecularmente, utilizando-se a
técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) com iniciadores (“Primers”)
específicos, na Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife,
PE. Nas espécies inoculadas, os menores PI foram observados em Glycine
sp.(2,6 dias) e Senna obtusifolia (3 dias). Os maiores valores de incidência da
doença, iguais a 100%, foram verificados em Glycine sp., S. obtusifolia,
46
Desmodium discolor, Amaranthus deflexus, Azadirachta indica, Solanum
licopersicum e Vigna unguiculata. Os menores valores de
INC foram
observados em Leonotis nepetifolia, Tridax procumbens e Mormodica charantia
com 50, 60 e 40%, respectivamente. As espécies da família Poaceae, Bidens
pilosa, Emilia fosbergii, Praxelis pauciflora, Macroptilium lthyroides e Portulaca
oleracea apresentaram PI=43 dias, não sendo hospedeiras alternativas do
patógeno. As amplificações a partir do DNA genômico purificado do isolado de
Xcv, com os oligonucleotídeos específicos, resultaram em fragmentos de
tamanho esperado de 240pb, confirmando a identidade do isolado testado
como X. campestris pv. viticola.
Palavras chaves: Sobrevivência; Cancro bacteriano da videira; PCR.
ABSTRACT
The grapevine bacterial canker caused by Xanthomonas campestris pv. viticola
(Xcv) survive on alternative hosts, and plants infected epiphytically organs in
the aerial part. The present study aimed to investigate possible alternative hosts
of the pathogen, to provide data for disease management. Were tested 19
species of weeds commonly found in vineyards, six species of vegetables
grown in sub-medium San Francisco and Azadirachta indica, in which the
pathogen was inoculated at a concentration of 10 8 CFU / mL by the method of
friction pair gauze in greenhouse conditions, on the DTCS / UNEB, JuazeiroBA. The susceptibility of plants to isolate Xcv was evaluated by epidemiological
parameters: incubation period (IP) and disease incidence (DI). After observing
the symptoms of Xcv in the species mentioned, were applied the Koch's
postulates in the same. The isolated Xcv3, utilized on the tests, obtained from
each factitious host was identified molecularly using the PCR (Polymerase
Chain Reaction) with primers ("primers") specific in UFRPE, Recife. In the
inoculated species, the lowest PI was observed in Glycine sp. (2.6 days) and
Senna obtusifolia (3 days). The highest values of disease incidence were
observed in Glycine sp., Senna obtusifolia, Desmodium discolor, Amaranthus
deflexus, Azadirachta indica, Solanum and Vigna unguiculata licopersicun that
showed 100% INC. The lowest values of DI were observed in Leonotis
47
nepetifolia, Tridax procumbens and Mormodica charantia with 50, 60 and 40%,
respectively. The species of the family Poaceae, Bidens pilosa, Emilia fosbergii,
Praxelis pauciflora, Macroptilium Lathyroides e Portulaca oleracea showed IP =
42 days, not being alternate hosts of the pathogen. The amplifications from
genomic DNA purified from isolated Xcv with the specific primers resulted in the
expected size fragments of 240pb, confirming the identity of the isolated tested
as Xanthomonas campestris pv. Viticola.
Keywords: Survival; Canker bacterial vine, PCR (Polymerase Chain Reaction).
INTRODUÇÃO
A vitivinicultura vem contribuindo significativamente para o êxito do
agronegócio brasileiro de frutas. A região Nordeste participa com 19,7% da
produção nacional, sendo o Submédio do Vale do São Francisco o principal
centro produtor e exportador de uvas de mesa do Brasil contribuindo, com 93%
da produção da região Nordeste (IBGE, 2010).
O cancro bacteriano, causado por Xanthomonas campestris pv. viticola
(Xcv)(Nayudu) Dye, é uma importante doença da videira no Submédio do Vale
do São Francisco, com incidência expressiva e causando perdas significativas
em cultivares suscetíveis, como Red Globe, Thompson Seedless, Perlette,
Itália, Festival, Brasil, Ribier, Piratininga, Patrícia, Catalunha e Benitaka (LIMA
et al., 1999; LIMA & MOREIRA, 2002; MALAVOLTA Jr. et al., 2003). Os
sintomas aparecem, preferencialmente, em épocas de maior umidade e
elevadas temperaturas, que corresponde ao primeiro semestre, na região,
manifestando-se nas folhas como pontos necróticos, com ou sem halos
amarelados, podendo aparecer próximos às nervuras. Nas nervuras e pecíolos
das folhas, ramos e ráquis dos frutos formam-se manchas escuras alongadas,
que evoluem para fissuras, conhecidas como cancros (NASCIMENTO et al.,
2000; ARAÚJO, 2001). Em condições adversas, as fitobactérias têm a
capacidade de sobreviver epifiticamente em hospedeiras alternativas sem
causar doença. Segundo Araújo (2001), Xcv tem a capacidade de sobreviver
de um ciclo para outro em videiras, bacelos e mudas infectadas; epifiticamente
48
em folhas e ramos de videiras assintomáticas; em restos culturais
(NASCIMENTO et al., 2000) e em hospedeiras alternativas (PEIXOTO et al.,
2007). Nayudu (1972), mencionou a possibilidade de outras espécies vegetais
atuarem em, condições naturais, como um nicho alternativo do patógeno e
fonte inóculo nos parreirais. Silva et al. (2012), verificaram que Xcv era capaz
de sobreviver em altas populações em restos de poda de videira infectados
durante, pelo menos, 80 dias do ciclo da cultura, constituindo fonte de inóculo
primário para plantas sadias. Nascimento et al. (2005) observaram que, em
condição de laboratório, este patógeno era capaz de sobreviver por até 150
dias em folhas de videira herborizadas.
A identificação de plantas hospedeiras alternativas de fitopatógenos em
patossistemas agrícolas é um dos principais passos para a construção de
propostas de manejo para o controle das doenças. Assim, os objetivos desse
estudo foram: a) identificar plantas espontâneas hospedeiras de Xcv, e b)
na região, para verificar seu potencial como hospedeiras alternativas de Xcv.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram realizadas visitas técnicas às fazendas produtoras de uvas, nos
municípios de Juazeiro, BA e Petrolina, PE, registradas na ADAB (Agência
Estadual de Defesa Agropecuária da Bahia) e ADAGRO (Agência de Defesa e
Fiscalização Agropecuária de Pernambuco), com incidência do cancro
bacteriano. Realizaram-se coletas de folhas e ramos de videira com sintomas
da doença. Todo material sintomático coletado foi levado para o Laboratório de
Fitopatologia do Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais – DTCS III da
Universidade do Estado da Bahia, Juazeiro, BA, para isolamento do patógeno.
Para isto utilizou-se a metodologia de Mariano e Silveira (2000), a partir
de tecidos com lesões típicas da doença, preferindo-se os cancros dos ramos e
pecíolo. A suspensão obtida foi plaqueada pelo método de estrias (MARIANO
& SILVEIRA, 2000) em meio semi-seletivo de ágar nutritivo-dextrose-extrato de
levedura e ampicilina (NYDAM) (NASCIMENTO et al., 2006). Os isolados foram
49
preservados em água destilada e esterilizada (ADE) (NASCIMENTO et al.,
2005) para realização dos Postulados de Koch, com concentração da
suspensão de Xcv ajustada em fotocolorímetro para A570 = 0,4 de absorbância
(108 ufc/ml), conforme proposto por Nascimento et al. (2005).
Inoculação artificial de Xanthomonas campestris pv. viticola nas espécies
testadas
Coletaram-se sementes de 19 espécies de plantas espontâneas,
comumente encontradas nas áreas de produção de videira, para a realização
da inoculação artificial de Xcv. Foram também testadas cinco espécies de
plantas de interesse comercial e uma espécie de quebra-vento, comumente
cultivadas no Submédio do Vale do São Francisco (Tabela 1).
As sementes das 26 espécies citadas foram plantadas em sacos de
polietileno (capacidade para 500g) com substrato 2:1:2 (Argila; areia; esterco)
esterilizados em autoclave a 120ºC, por duas horas. Vinte dias após a
emergência, essas espécies foram inoculadas artificialmente com Xcv pelo
método de fricção com dupla gaze (NASCIMENTO et al., 2005). Compressas
de gaze dobradas foram umedecidas com a solução bacteriana diluída em
ADE, contendo Tween 20 (0,05%). Foram inoculadas cinco folhas por planta.
Mudas de videira ‘Thompson seedless’ foram utilizadas como padrão de
suscetibilidade (NASCIMENTO et al.,2006), e como as demais espécies
testadas, foram submetidas à pré e pós-tratamento em câmara úmida por 48
horas (NASCIMENTO et al.,2005) e incubadas em condições de casa de
vegetação, com temperatura e umidade relativa em torno de 30ºC e 75%,
respectivamente.
As avaliações tiveram início 48 horas após a inoculação artificial. As
plantas foram avaliadas, diariamente, até os 42 dias da inoculação, por meio
dos componentes epidemiológicos do cancro bacteriano: Período de incubação
(PI) e Incidência da doença aos 42 dias após a inoculação (INC).
50
TABELA 01. Espécies vegetais inoculadas artificialmente com Xanthomonas
campesris pv. Vitícola para determinação de hospedeiras alternativas da
bactéria.
Tratamentos
Família
Nome científico
Nome comum
T1
Amaranthaceae
Amaranthus deflexus L.
Bredo
T2
Asteraceae
Bidens pilosa DC.
Picão-preto
T3
Asteraceae
Eclipta alba (L.) Hassk.
Erva-de-botão
T4
Asteraceae
Emilia fosbergii Nicolson
Falsa-emília
T5
Asteraceae
Praxelis pauciflora (Kunth)
Couve-cravinho
T6
Asteraceae
Tridax procumbens L.
Erva-de-touro
T7
Cucurbitaceae
Mormodica charantia L.
T8
Lamiaceae
Leonotis nepetifolia (L.) R. Br.
Melão-de-sãocaetano
Cordão-de-frade
T9
Fabaceae
Desmodium discolor Vogel
Amor-agarradinho
T10
Fabaceae
Feijão miúdo
T11
Fabaceae
Macroptilium Lathyroides (L.)
Urb
Glycine sp.
T12
Fabaceae
Fedegoso
T13
Poaceae
Senna obtusifolia (L.) Irwin &
Barneby
Chloris barbata (L.) Swartz
T14
Poaceae
Setaria geniculata P. Beauv.
T15
Poaceae
Eluesine indica (L.) Gaertn
T16
Poaceae
T17
Poaceae
Dactyloctenium aegyptium (L.)
Willd
Digitaria horizontalis Willd.
Capim rabo-degato
Capim pé-degalinha
Capim mão-desapo
Capim-colchão
T18
Poaceae
Cenchrus echinatus L.
Capim-carrapicho
T19
Portulacaceae
Portulaca oleracea L.
Beldroega
T20
Fabaceae
Vignia unguiculata(L.) walp.
Feijão-de-corda
T21
Alliaceae
Allium cepa L.
Cebola
T22
Meliaceae
Azadirachta indica A. Juss.
Nim
T23
Solanaceae
Solanum licopersicum
Tomate IPA 6
T24
Cucurbitaceae
Cucumis melo L.
Melão
T25
Cucurbitaceae
Melancia
T26
Cucurbitaceae
Citrullus lanatus (Thunb.) &
Nakai
Curcubita pepo L.
Soja perene
Pé-de-galinha
Abóbora
51
As avaliações foram feitas diariamente quanto ao PI, representado pelo
número de dias entre a inoculação e o surgimento dos sintomas. Plantas que
não apresentaram sintomas da doença tiveram o PI ajustado para 43 dias,
correspondendo ao período de avaliação total acrescido de um dia, conforme
proposto por Iamsupasit et al. (1993). A INC de folhas com sintomas, aos 42
dias após a inoculação, foi calculada pela porcentagem de folhas com sintomas
em relação ao total de folhas avaliadas por planta.
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com 27
tratamentos e cinco repetições por tratamento. A unidade experimental foi
constituída de cinco folhas inoculadas. Avaliaram-se o período de incubação e
a Incidência dos sintomas para a posterior identificação das espécies
hospedeiras de Xcv.
Os dados obtidos foram submetidos à análise de
variância, e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
Identificação de Xanthomonas campesris pv. viticola por meio de PCR
As
análises
moleculares
foram
realizadas
no
Laboratório
de
Fitobacteriologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),
Recife, PE. Foi utilizado o isolado de Xcv patogênico, obtido por isolamento a
partir das folhas inoculadas nas diferentes espécies testadas e que
manifestaram sintomas da doença.
Extração e quantificação do DNA genômico
A extração do DNA genômico dos isolados que se mostraram
patogênicos tanto as hospedeiras alternativas quanto às mudas de videira cv.
Thompson seedless foi realizada utilizando-se o kit Axyprep para extração de
DNA genômico bacteriano (Axygen Brasil).
A quantificação do DNA genômico foi realizada por meio de análise
comparativa com o marcador High DNA Mass Ladder (Invitrogen), utilizando-se
uma mistura contendo 4 μl do DNA concentrado adicionado a 2 μl de tampão
de carregamento (6X DNA Loading Dye, Fermentas Life Sciences) e a 1 μl de
52
Syber® Safe (Invitrogen). A análise foi realizada por meio de eletroforese em
gel de agarose a 1% preparado em tampão TBE 0,5X (5,4 g de Tris-base; 2,75
g de ácido bórico e 0,375 g de EDTA, para 1000 ml) por 40 min a 80 V.
Posteriormente, o gel foi fotodocumentado e, após a quantificação, as amostras
foram diluídas para uma concentração final de 10 ng/μl de DNA sendo
armazenadas a -20°C (AUSUBEL et al., 1992).
Identificação com iniciadores (“Primers”) específicos
A identificação molecular dos isolados foi realizada utilizando-se os
“primers” Xcv1F/Xcv3R, de fragmento de 243 pb do gene hrpB (TRINDADE et
al., 2005; TRINDADE et al., 2007).
As reações de amplificação foram realizadas de acordo com Trindade et
al. (2007), sendo compostas por: Master Mix 2X (1X) 0,5 μM de cada “primer” e
200 ng de DNA. Reações livres de DNA foram incluídas nas análises para
assegurar a ausência de contaminantes. As amostras foram amplificadas em
termociclador modelo MJ96 (Biocycler).
Doze microlitros de cada reação de amplificação foram misturados a 3 μl
do tampão de carregamento e a 2,5 μl de Syber® Safe, aplicando-se um volume
total de 17,5 μl em cada poço do gel. A visualização dos fragmentos
amplificados foi realizada em gel de agarose a 1% preparado em tampão TBE
0,5X. A corrida eletroforética foi realizada por 1 h e 10 min a 80 V em tampão
TBE 0,5X, utilizando-se como marcadores 100pb-DNA Ladder (GenRulerTM) e
1kb-DNA Ladder (GenRulerTM). O foi gel fotodocumentado em seguida.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inoculação artificial de Xanthomonas campestris pv. viticola nas espécies
testadas
A partir das 27 diferentes espécies de plantas inoculadas com X.
campestris pv. viticola, observou-se a manifestação de sintomas do cancro
bacteriano em tomateiro e feijoeiro, nas plantas espontâneas: amor53
agarradinho, bredo, fedegoso, soja-perene, erva-de-touro, cordão-de-frade,
melão-de-são-caetano, e no quebra-vento: nim, das quais foram isoladas em
meio semi-seletivo NYDAM populações de bactérias semelhantes à Xcv,
apresentando colônias arredondadas, coloração esbranquiçada, brilhantes com
bordos lisos, células em forma de bastonetes, Gram-negativas. Por outro lado,
as espécies testadas, pertencentes às famílias Poaceae, Cucurbitaceae,
Portulacaceae e Alliaceae não manifestaram sintomas, não sendo hospedeiras
alternativas de Xcv (Tabela 02). Os sintomas observados nas folhas do
tomateiro, feijão-de-corda, fedegoso, soja perene, amor-agarradinho, bredo e
nim, mostraram-se semelhantes àqueles observados em videira (Figura 01).
Os sintomas nas folhas se apresentaram com pontuações minúsculas de
coloração amarelada que evoluíram para manchas circulares necróticas com
halo amarelado. Nas nervuras, formam-se manchas escuras alongadas, que
E
B
C
F
G
D
H
A
Figura 01: Sintomas observados a partir da inoculação artificial de Xanthomonas
campestris pv. viticola nas folhas de videira (A), tomateiro (B), feijão-de-corda, fedegoso(D),
soja-perene (E), amor-agarradinho (F), bredo (G) e nim (H) (com camada de abscisão da
área lesionada com o avanço da bactéria, superando o mecanismo de defesa da planta).
Juazeiro, BA, 2012.
54
evoluem para fissuras (cancros). Resultados semelhantes foram encontrados
por Nascimento et al. (2004), que inocularam artificialmente, diferentes
espécies de plantas com Acidovorax avenae subsp. citrulli Williems, agente
causal da mancha-aquosa do melão. Os autores observaram reprodução dos
sintomas da doença em plantas de mamão, melancia, melão, pimentão,
maxixe, pepino, abobrinha, tomate e abóbora, comprovando o potencial dessas
espécies como hospedeiras alternativas do patógeno. Existem vários trabalhos
que relatam a sobrevivência de fitobacterias em hospedeiras alternativas. Gent
et al. (2005), por exemplo, observaram população de Xanthomonas axonopodis
pv. allii sobrevivendo epifiticamente em alfafa, feijão, lentilha e soja. Já Martins
(2007) relatou que Ensete spp., uma planta nativa das regiões tropicais da
África, é um hospedeiro alternativo de Xanthomonas campestris. pv.
musacearum (Yirgou & Bradbury) Dye.
A observação dos sintomas do cancro bacteriano em soja-perene,
fedegoso e bredo confirma o que já havia sido citado por Peixoto et al. (2007),
que observaram que essas espécies apresentaram infecção natural por Xcv em
parreirais comerciais do Submédio do Vale do São Francisco. Estudos
realizados por Kurozawa e Pavan (2005) também verificaram a sobrevivência
de Xanthomonas vesicatoria (Doidge), agente causal do cancro bacteriano do
tomateiro,
em
plantas espontâneas como
Amaranthus retroflexus
L.,
Chenopodium album L., Datura spp., Digitaria sanguinalis (L.) Scop, Portulaca
oleraceae, Setaria glauca (Poir.) Roem. & Schult., Solanum nigrum L. e
Physalis spp., constituindo-se em importantes fontes de inóculo do patógeno.
Também Robinson et al. (2006), estudaram as formas de sobrevivência de
Xanthomonas campestris pv. vitians (Brown) Dye e verificaram que plantas de
alface, tomate, pimentão e beterraba e as principais plantas espontâneas
encontradas em campos de produção na Califórnia/EUA eram hospedeiras
alternativas, potenciais fontes de inóculo e de sobrevivência desta fitobactéria.
55
TABELA 02: Interação de Xanthomonas campestris pv. viticola, com espécies vegetais presentes
no Semiárido brasileiro. Juazeiro-BA, 2012.
Patogenicidade
Espécie
Videira
*
+
+
Família
Nome
comum
Presença
de
sintomas
Isolamento
de Xcv
Identificação
molecular
Vitaceae
Videira
+
+
Confirmado
+
+
Confirmado
+
+
-
np
np
np
np
-
np
np
np
np
+
-
np
-
-
-
np
np
np
np
+
+
Confirmado
+
+
+
+
Confirmado
+
+
+
+
Confirmado
+
+
-
np
np
np
np
+
+
Confirmado
+
+
+
+
Confirmado
+
+
+
+
Confirmado
+
+
-
np
np
-
-
-
np
np
-
-
-
np
np
-
-
-
np
np
-
-
-
np
np
-
-
-
np
np
-
-
-
np
np
-
-
-
np
np
-
-
+
+
Confirmado
+
+
+
+
Confirmado
+
+
Amaranthaceae
Bredo
1
1
Asteraceae
Lamiaceae
Fabaceae
Picão-preto
Erva de
1
botão
1
Falsa-emília
Couve1
cravinho
Erva-de1
touro
Cordão-de1
frade
Amor1
agarradinho
Feijão2
miúdo
1
Soja perene
1
Poaceae
Portulacaceae
Alliaceae
Meliaceae
Solanaceae
Fedegoso
Feijão-decorda
Capim pé1
de-galinha
Capim rabo1
de-gato
Capim pé1
de-galinha
Capim mão1
de-sapo
Capim1
colchão
Capim
1
carrapicho
1
Beldroega
2
Cebola
Nim
3
2
Tomate
2
Melão
-
np
np
-
-
2
-
np
np
-
-
2
-
np
np
-
-
+
+
Confirmado
+
+
Melancia
Cucurbitaceae
Abóbora
Melão-de1
são-caetano
* Teste de patogenicidade realizado na espécie em estudo.
1
Plantas espontâneas encontradas nos parreirais.
2
Espécies de interesse comercial.
3
Quebra-vento.
np = não pertinente.
56
As plantas de nim também se apresentaram como hospedeiras
alternativas de Xcv, mostrando-se muito suscetíveis, confirmando o relato de
Desai et al. (1966). Nayudu (1972), também relatou a possibilidade do nim
atuar como fonte adicional de inóculo, principalmente, em áreas onde a videira
tivesse sendo introduzida. Moreira et al. (2006) também observaram plantas de
nim com lesões necróticas, em condições de campo, das quais obtiveram a
bactéria em cultura pura. Além disso, o nim foi hospedeiro suscetível em
diversas inoculações artificiais realizadas no Brasil (MALAVOLTA Jr. &
ALMEIDA, 2000; NASCIMENTO et al, 2007). O nim também apresentou, com o
início da infecção, um mecanismo de defesa conhecido como camada de
abscisão, no qual se observou dissolução da lamela média nas células
infectadas, resultando na queda do tecido infectado (AGRIOS, 2004), porém o
avanço do patógeno foi sempre mais rápido do que o mecanismo de defesa da
planta, proporcionando o avanço da doença (Figura 02, H).
Os sintomas do cancro bacteriano nas folhas da erva-de-touro, cordão
de frade e melão-de-são-caetano se manifestaram como manchas circulares a
irregulares, deprimidas e de coloração esbranquiçada, que não são
visualizadas em videira (Figura 02). É muito comum encontrar o mesmo
patógeno manifestando diferentes sintomas em espécies distintas. Conforme
observado por Kimati et al., (2005), os sintomas de Xylella fastidiosa Wells em
algodoeiro, mostram-se diferentes daqueles observados em cafeeiro e em
A
B
C
citros.
Figura 02: Sintomas observados a partir da inoculação artificial de Xanthomonas
campestris pv. viticola nas folhas de erva-de-touro (A), cordão-de-frade (B); e melão-desão-caetano (C). Juazeiro, BA, 2012.
57
Em relação ao PI, pode-se observar a formação de três grupos distintos:
a soja perene, o fedegoso e a videira apresentaram período de incubação de
2,6; 3,0; 3,8 dias, respectivamente, não diferindo estatisticamente entre si e
diferindo das demais espécies testadas, mostrando-se como as espécies mais
suscetíveis à infecção do patógeno. Em seguida, o amor-agarradinho e o
tomateiro apresentaram PI de 5,6 e 5,8 dias, respectivamente. Os períodos
mais longos foram observados em feijão-de-corda (11,0), nim (12,0), erva-detouro (12,5), melão-de-são-caetano (14,0), bredo (14,5) e cordão-de-frade
(15,25) (Tabela 03).
Todas as espécies testadas, pertencentes à família Poaceae, bem como
picão-preto,
beldroega,
erva-de-botão,
não
mostraram
falsa-emília,
sintomas
couve-cravinho,
quando
feijão-miúdo
inoculadas
com
e
Xcv,
apresentando PI de 43 dias. Resultados semelhantes foram encontrados por
Montovani et al. (2006). Esses autores testaram 31 espécies de gramíneas e
observaram que apenas Sorghum bicolor (L.) Moench (sorgo), Zea mays L.
(milho) e Avena sativa L. (aveia) apresentaram sintomas quando inoculadas
com Xanthomonas sp.. Nascimento et al. (2007) também verificaram que as
gramíneas Eragrostis pilosa (L.) P. Beauv (capim barbicha-de-leão) e
Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd (capim mão-de-sapo), quando inoculadas
artificialmente com Xcv, não manifestaram sintomas. Nascimento et al. (2004)
também não observaram sintomas da mancha-aquosa do melão quando
inocularam artificialmente o milho 'São José' com Acidovorax avenae subsp.
citrulli, agente causal da doença. A incidência da doença causada por Xcv nas
plântulas suscetíveis foi máxima (100%) nas Fabaceas, com exceção do feijãomiúdo (0%). O bredo, tomateiro e videira, não diferiram estatisticamente do nim
que apresentou 90% de INC. Essas espécies se mostraram muito suscetíveis
ao patógeno. A erva-de-touro e o cordão-de-frade apresentaram 60 e 50% de
INC, respectivamente (Tabela 03).
Dentre as espécies comerciais testadas, o tomateiro e o feijão-de-corda
se mostraram como hospedeiras alternativas de Xcv discordando do trabalho
realizado por Braga & Ferreira (2000), que não observaram sintomas da
58
doença inoculando-se, artificialmente, a bactéria em plantas de fumo, cebola,
tomate, beterraba, cenoura, repolho, pepino, soja, feijão e alface. Neste
trabalho,
confirmaram-se
os
resultados
obtidos
por
aqueles
autores,
TABELA 03 - Período de incubação (PI) e incidência (INC) do
cancro bacteriano da videira, em diferentes hospedeiros, causadas
por Xanthomonas campestris pv. viticola. Juazeiro-BA, UNEB, 2012.
Família
Nome comum
Vitaceae
Amaranthaceae
Videira
Bredo3
Picão-preto3
Erva-de-botão3
Falsa-emília3
Couve-cravinho3
Erva-de-touro3
Cordão-de-frade3
Amor-agarradinho3
Feijão-miúdo3
Soja perene3
Fedegoso3
Feijão-de-corda4
Pé-de-galinha3
C. rabo-de-gato3
C. pé-de-galinha3
Capim mão-de-sapo3
Capim-colchão3
Capim carrapicho3
Beldroega3
Cebola4
Nim5
Tomate 4
Melão4
Melancia4
Abóbora4
Melão-de-são-caetano3
CV %
Asteraceae
Lamiaceae
Leguminosae
Poaceae
Portulacaceae
Alliaceae
Meliaceae
Solanaceae
Cucurbitaceae
PI
(Dias)1
3,8 e6
14,2 b
42,0 a
42,0 a
42,0 a
42,0 a
12,25 c
15,25 b
5,6 d
42,0 a
2,6 e
3,0 e
11,0 c
42,0 a
42,0 a
42,0 a
42,0 a
42,0 a
42,0 a
42,0 a
42,0 a
12,0 c
5,8 d
42,0 a
42,0 a
42,0 a
14,0 b
2,13
INC
(%)2
100 c6
100 c
0,0 a
0,0 a
0,0 a
0,0 a
60,0 b
50,0 b
100,0 c
0,0 a
100,0 c
100,0 c
100,0 c
0,0 a
0,0 a
0,0 a
0,0 a
0,0 a
0,0 a
0,0 a
0,0 a
90,0 c
100,0 c
0,0 a
0,0 a
0,0 a
100,0 c
20,92
1
: Período de incubação representado pelo número de dias entre a inoculação e o
surgimento da doença.
2
Incidência da doença aos 42 dias após a inoculação
3
Plantas espontâneas encontradas nos parreirais.
4
Espécies de interesse comercial.
5
Quebra-vento.
6
Média seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey, ao nível
de 5% de significância.
59
verificando-se que plantas de cebola não manifestaram sintomas, quando
inoculadas artificialmente com Xcv. Observou-se, ainda, que as plantas de
melão, melancia e abóbora também não mostraram sintomas quando
inoculadas com Xcv, apresentando PI de 43 dias. Em vista desses resultados,
conclui-se que não há impedimento à continuidade do cultivo dessas espécies
em áreas próximas ao parrerais. Por outro lado, deve-se evitar o plantio de
tomate e feijão-de-corda próximo as áreas de plantio de videiras.
Identificação de Xanthomonas campesris pv. viticola por meio de PCR
As amplificações a partir do DNA genômico purificado do isolado obtido
das diferentes espécies testadas, que manifestaram sintomas da doença, com
os oligonucleotídeos específicos, resultaram em fragmentos de tamanho
esperado de 243pb quando visualizados em gel de agarose (Figura 03). Os
resultados obtidos, juntamente aos Postulados de Koch, confirmam a
identidade do isolado como Xanthomonas campestris pv. viticola. O mesmo foi
observado para o isolado de Xcv, IBSBF 2738, obtido da coleção da
Universidade Federal Rural de Pernambuco que foi utilizado como controle
2
3
4
5
6
7
8 M
9 10 11 12 13
GAMA, M.A. , 2012.
1
Figura 03. Análise eletroforética da amplificação da sequência de 243 pb do
gene hrpB do isolado de X. campestres pv. vitícola utilizado neste estudo com
os primers Xcv1F/Xcv3R. M = Marcador 1Kb DNA Ladder (GenRulerTM).
1.Cordão-de-frade, 2. Erva-de-touro, 3. Bredo, 4. Nin, 5. Soja, 6. Xcv,
7.Tomate, 8. Feijão-de-corda, 9. Fedegoso, 10. Melão-de-São-Caetano, 11.
Amor agarradinho, 12. controle negativo e 13 (IBSBF 2738 - Xanthomonas
campestres pv. viticola).
60
positivo do experimento. Utilizando a mesma técnica de PCR, Trindade et al.
(2007) permitiram a detecção e identificação da Xcv obtidas de tecidos de
videira com manifestação de sintomas do cancro bacteriano. Este método está
sendo muito usado para detectar e identificar fitopatógenos, incluindo várias
bactérias fitopatogênicas (FATMI et al., 2005; MOLTMANN & ZIMMERMANN,
2005; PARK et al. , 2006).
CONCLUSÕES
É evidente a importância do estudo das hospedeiras alternativas
de Xcv, pois a sobrevivência do patógeno nos parreirais pode estar relacionada
aos cultivos de tomateiro e feijão-de-corda em áreas próximas as videiras e as
plantas espontâneas como: amor-agarradinho, bredo, fedegoso, soja-perene,
erva-de-touro e cordão-de-frade. Não há impedimento à continuidade do cultivo
das plantas de melão, melancia e abóbora em áreas próximas aos parreirais. É
importante
a
eliminação
de
plantas
espontâneas
comprovadamente
hospedeiras alternativas do patógeno, bem como evitar o plantio do nim como
quebra-vento ou em áreas próximas aos parreirais.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Universidade do Estado da Bahia – UNEB, à
FAPESB pelo fornecimento da bolsa e à EMBRAPA Semiárido, em especial à
Doutora Angélica Guimarães, pela parceria e disponibilização de materiais para
a realização desse trabalho.
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65
CAPÍTULO II
POTENCIAL DE USO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia gracilis
PARA O CONTROLE DE Xanthomonas campestris pv. viticola
66
POTENCIAL DE USO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia gracilis
PARA O CONTROLE DE Xanthomonas campestris pv. viticola
Morgana Mateus Santos1; Ana Rosa Peixoto1; Esmailly de Sousa Pessoa1;
Helena Brandão1; Ana Valéria Vieira de Souza 2.
1
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, Universidade do Estado da Bahia, CEP
48900-000, Juazeiro, BA, email: [email protected].
2
EMBRAPA- Semiárido, Cx.
Postal 23, CEP 56302-970, Petrolina, PE.
RESUMO
Xanthomonas campestres pv. viticola, agente causal do cancro bacteriano da
videira, apresenta variabilidade na tolerância aos compostos à base de cobre, o
que torna esses produtos pouco promissores no manejo da doença. Diante
disso, este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a eficácia de óleos
essenciais de Lippia gracilis, no crescimento in vitro de X. campestris pv.
viticola (Xcv). Foram testados oito óleos extraídos de L. gracilis, de diferentes
manejos de cultivo: com e sem adubação mineral, adubação orgânica e
irrigação, em três dosagens diferentes (200; 250 e 300 ppm), testemunha com
o oxicloreto de cobre (controle padrão) e a testemunha absoluta. A
suscetibilidade do isolado Xcv3 aos óleos testados foi avaliada na primeira
etapa pela presença e ausência do crescimento bacteriano e, na segunda
etapa, pela porcentagem de inibição do crescimento bacteriano. A análise da
composição química dos óleos essenciais extraídos de L.gracilis por GC/MS e
GC/FID, sob diferentes práticas agrícolas, mostrou o carvacrol (73,9 a 77%)
como composto majoritário, além de timol (4,9 a 10,3%), ρ-cimeno (1,68 a
3,19%), Éter metil timol (0,46 a 2,36%) e o E-cariofileno (1,33 a 3,85). Os
tratamentos referentes aos óleos 01, 06 e 07 foram os que apresentaram
maiores porcentagens de inibição no crescimento bacteriano de Xcv, ou seja,
94,75%, 96,50% e 94,02%, respectivamente, sendo superiores ao oxicloreto de
cobre (49,6%). Não houve diferença estatística nas dosagens utilizadas dos
óleos, com exceção aos óleos 02, 05 e 15. As concentrações que
apresentaram as melhores porcentagem de inibição do cresimento bacteriano
67
foi de 300 uL L -1 para os óleos 02 e 05; de 250 uL L -1 para o óleo 15 e de 100
uL L -1 para os óleos 01, 04, 06, 07 e 16, em condições de casa de vegetação
e, posteriormente, em campo.
Palavras-chaves: Timol, Carvacrol, Ação antimicrobiana, Oxicloreto de cobre,
cancro bacteriano.
ABSTRACT
Xanthomonas campestris pv. viticola, causal agent of bacterial canker of
grapevine presents variability in tolerance to copper-based compounds, which
makes this product very promising in the management of this disease. Thus,
this study was conducted with the aim of assessing the efficacy of essential oil
of Lippia gracilis, in vitro growth of X. campestris pv. viticola (Xcv3). Eight were
tested oils extracted from L. gracilis grown with and without chemical
fertilization, organic fertilization and irrigation in three different doses (200, 250
and 300 ppm), using as check treatment the Copper oxychloride (standard
control) and absolute standard. The susceptibility of isolated Xcv3 to the oils
tested was evaluated in the first stage through the presence or absence of
bacterial growth and in the second stage through the percentage of growth
inhibition. The treatments relating to oil 01, 06 and 07 extracted from L. gracilis
grown with mineral fertilizer (NPK) and organic fertilization presented the
highest percentages of inhibition of bacterial growth in Xcv, 94.75%, 96.50%
and 94.02%, respectively, and were superior to copper oxychloride (49 , 6%).
There was no statistical difference in the dosages used oils, except the oils 2, 5
and 15. It is recommended to test the use of dosages of 300 uL L -1 oils to 2:05,
250 uL L -1 for oil and 15 uL of 100 L -1 for oils 1,4,6,7 and 16 under conditions
of greenhouse and later at the field level.
Keywords: Timol, Carvacrol, Antimicrobial action, Copper oxychloride,
Bacterial canker.
68
INTRODUÇÃO
Dentre as doenças que ocorrem em videira no Submédio do Vale do São
Francisco, destaca-se o cancro bacteriano, causado por Xanthomonas
campestris pv. viticola (Xcv) (Nayudu) Dye, de grande importância devido sua
distribuição nas áreas de produção e as perdas severas que tem ocasionado
na produtividade da cultura (LIMA et a.l, 2009).
O controle da doença em condições que são favoráveis é considerado
difícil. O uso de produtos à base de cobre no manejo desta doença nem
sempre é efetivo, devido à existência de estirpes de Xcv que apresentam
tolerância a esses compostos (MARQUES et al., 2009). Isso torna o uso
contínuo destes produtos químicos, no Submédio do Vale do São Francisco,
pouco promissor no manejo da doença, em médio prazo, devido à seleção e
dominância de estirpes tolerantes na população bacteriana (LIMA et al., 2009;
MARQUES et al., 2009).
doenças, o qual inclui o controle biológico e o uso de óleos essenciais com
atividade antimicrobiana (SCHWAN et al., 2003). Vários trabalhos vêm sendo
realizados buscando demonstrar o potencial da utilização desses óleos no
controle de fitopatógenos (ARRAS & USAI, 2001; GADELHA et al.,2003; SILVA
et al., 2005; AMORIM et al, 2011; NETO et al., 2012). O alecrim da chapada,
(Lippia gracillis Schauer) é uma planta rica em óleo essencial, constituído pelo
timol (10%) e pelo carvacrol (41,7%) que apresenta atividade antimicrobiana
(RASSOLI & MIRMOSTAFA, 2003; ALBUQUERQUE, 2005;). Goodmam e
Gilman (1978) observaram que o óleo de Lippia sidoides Cham, constituído de
timol (50 a 60%) e carvacrol (5 a 8%), apresentou efeito fungicida sobre
espécies de Penicilium. Leal et al. (2003) também verificaram que este óleo
demostrou atividade antimicrobiana, no controle das bactérias de Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp.,
Streptococcus mutans, Corynebacterium xerosis, e dos fungos Candida
albicans, Trichophyton rubrum e T. interdigitale, dentre outros.
69
A utilização de adubação orgânica com esterco de aves maximizou o
rendimento de óleo essencial de Origanum vulgare L., mostrando que a
aplicação de esterco, aumentava a produção de hidrato de trans-sabineno.
Porém se o interesse for a produção de timol, deve-se evitar a aplicação de
adubos orgânicos (CORRÊA et al., 2010). Trabalho realizado por Rodrigues et
al., (2004) também evidenciou que a adubação química com fósforo
proporcionou o máximo de teor foliar de óleo essencial de menta. Fatores como
variabilidade genética intraespecífica, condições ambientais, épocas de
colheita, condições de cultivo, tipo de solo e parte da planta analisada podem
influenciar no teor e na composição química dos óleos essenciais (MARTINS et
al.,
2006) e, com isso, também na eficiência dos mesmos na inibição de
fitopatógenos.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a ação
antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracilis, obtido de diferentes
manejos de cultivo, no crescimento in vitro de X. campestris pv. viticola.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia da Universidade do
Estado da Bahia (UNEB), Juazeiro, BA, entre os meses de setembro a
dezembro de 2012. O isolado utilizado de Xanthomonas campestris pv. viticola
(Xcv3), foi proveniente da coleção de culturas bacterianas do Laboratório de
Fitopatologia da UNEB, Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais
(DTCS), Campus III, Juazeiro, BA, que se encontrava preservado em água
destilada esterilizada (ADE) à temperatura de 25°C, e identificado por PCR
com primers específicos (Xcv1F/Xcv3R) (TRINDADE et al. 2007). O isolado
Xcv3 foi repicado para a obtenção de colônias isoladas e multiplicado pelo
método de estrias, em quatro placas de Petri contendo meio nutritivo ágar
nutritivo-dextrose-extrato de levedura - NYDA (MARIANO et al., 2005)
solidificado.
Obtenção e composição química dos óleos essenciais de Lippia gracilis
70
O experimento de cultivo foi instalado no Campo Experimental de
Bebedouro, pertencente a Embrapa Semiárido, município de Petrolina-PE (376
m de altitude e coordenadas geográficas de 09°23'35'' de latitude sul e
40°30'27'' de longitude oeste). As mudas foram produzidas a partir do
enraizamento de estacas coletadas em plantas ocorrentes em ambiente natural
de Caatinga, próximo a mesma instituição.
O plantio das mudas foi realizado no período matutino em canteiros
previamente preparados (1,5 x 1,0 m), em espaçamento de 0,5 m entre plantas
e 1,0 m entre linhas. Os tratamentos foram diferentes doses de adubação
orgânica (esterco de animal – ovino/caprino curtido) adicionado de 100 gramas
do adubo mineral NPK para a formulação 15-9-20. As plantas foram irrigadas
por gotejamento uma vez ao dia durante quatro horas.
O experimento foi instalado em delineamento em blocos ao acaso em três
repetições e cada parcela, constituiu-se de três plantas. A colheita das plantas
foi realizada após 120 dias de cultivo no período matutino. Sendo as plantas da
bordadura descartadas. Durante a condução do experimento, os tratos culturais
foram capinas manuais para o controle das ervas infestantes (Tabela 01).
TABELA 01: Caracterização, dos tipos de óleo essecial de Lippia gracilis,
conforme os diferentes manejos de cultivo avaliados.
Tratamento
Adubação
orgânica (t/ha)
Adubação mineral
(15-9-20)
Irrigação por
gotejamento
T1
0
Presença
Presença
T2
0
Ausência
Presença
T3
20
Ausência
Presença
T4
40
Presença
Presença
T5
40
Ausência
Presença
T6
60
Presença
Presença
T7
60
Presença
Ausência
T8
60
Ausência
Ausência
71
Atividade antimicrobiana
1. Seleção da concentração inibitória mínima dos óleos essenciais de
Lippia gracilis para Xanthomonas campestris pv. viticola
Testes qualitativos foram realizados a fim de selecionar uma dose
mínima dos óleos essenciais de L. gracilis capazes de inibir o isolado Xcv 3. O
crescimento bacteriano de Xcv 3 foram transferidos pelo método de estrias com
alça de platina, em meio NYDA solidificado, contendo óleos de L. gracilis nas
concentrações de 100, 200, 300 e 400 uL L -1, diluídos em dimetilsulfóxido
(DMSO) a 2% do volume total do meio de cultura (HOOD et al., 2003). A
inibição do crescimento de Xcv 3 foi avaliada a partir da menor dosagem capaz
de impedir o crescimento do isolado no meio de cultura. Cada tratamento com
quatro repetição, onde foi avaliada a presença e ausência de crescimento
bacteriano na placa de petri.
2. Ação dos óleos de Lippia gracilis sobre Xanthomonas campestris pv.
viticola cultivada in vitro
A suspensão bacteriana de Xcv3 foi preparada em placas de Petri com
48 horas em meio de cultura NYDA. A diluição foi feita adicionando 10 ml de
água destilada esterilizada (ADE) por placa. As suspensões foram transferidas
para tubos de ensaio e homogeneizadas em misturador Vortex, ajustando a
concentração para A 580 = 0,4 (correspondente a 108 UFC ml-1). A ação
inibidora dos óleos de L. gracilis em meio líquido foi avaliada adicionando-se
alíquotas de 1 ml da suspensão bacteriana em tubos de ensaio rosqueados
contendo 10 mL de meio de NYD (meio nutritivo com dextrose e extrato de
levedura). Os tratamentos foram constituídos pelos oito óleos de L. gracilis
obtidos de diferentes manejos do cultivo (Tabela 01), nas dosagens de 200,
250 e 300 ppm, determinadas na etapa anterior, testemunha absoluta e
oxicloreto de cobre (produto utilizado pelos produtores da região para o
controle do patógeno, em condições de campo). A absorbância das
suspensões foi avaliada após 48 horas. A porcentagem de inibição do
crescimento da bactéria foi determinada pela aplicação da fórmula: I = [ ( CB c 72
CB t ) / CB c ] x 100, onde I = percentagem de inibição; CB c = crescimento
bacteriano
no
controle;
CB t =
crescimento
bacteriano
no
tratamento
(Albuquerque et al., 2006). O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, constituído por 26 tratamentos, sendo oito óleos de L. gracilis
obtidos de diferentes manejos de cultivo, três dosagens para cada óleo (200;
250 e 300 ppm), testemunha com o oxicloreto de cobre (controle padrão) e a
testemunha absoluta. Cada tratamento consta de quatro repetições. As médias
dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade pelo software ASSISTAT 7.5, sendo a testemunha absoluta
comparada com a média geral dos tratamentos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Composição química do óleo essencial
A análise da composição química dos óleos essenciais extraídos de
L.gracilis por GC/MS e GC/FID, sob diferentes práticas agrícolas, mostrou o
carvacrol (73,9 a 77%) como composto majoritário, além de timol (4,9 a 10,3%),
ρ-cimeno (1,68 a 3,19%), Éter metil timol (0,46 a 2,36%) e o E-cariofileno (1,33
a 3,85) (Tabela 02).
Resultados semelhantes foram encontrados por
Albuquerque (2005) em que o óleo de L. gracilis era constituído por 10% de
timol, e diferindo apenas nos teores de carvacrol que se apresentou com
41,7%. Nos resultados obtidos pode-se verificar flutuações nas porcentagens
dos compostos majoritários com relação as diferentes práticas agrícolas, ao
qual as plantas de L. gracilis foram submetidas, por exemplo, o tratamento 08
e 03 apresentaram 77% de carvacrol quando não houve adubação química e
no tratamento 04 apresentou 73,4% quando houve presença da adubação
química. Pode-se verificar, também, que a maior porcentagem de timol (10,3%)
foi no tratamento 06 que apresentou 60 t ha-1 de adubação orgânica e
adubação química. Este resultado está de acordo com aqueles obtidos por
Corrêa et al. (2010), pois os autores verificaram que a utilização de adubação
orgânica com esterco de aves maximizou o rendimento de óleo essencial de
Origanum vulgare L.. Em seus trabalhos, a adubação orgânica aumentava a
produção de hidrato de trans-sabineno; enquanto que se o interesse fosse a
produção de timol, dever-se-ia evitar a aplicação de adubos orgânicos.
73
Tabela 02. Composição química dos óleos essenciais de L. gracilis
caracterizados por GC/MS e GC/FID sob diferentes práticas agrícolas.
IR
a
Composto
a
T1
T4
T6
T2
T3
T5
T7
T8
-1
Adubação orgânica (t ha )
0
40
60
0
20 40
60
60
Irrigação ausente
Irrigação presente (gotejamento)
(gotejamento)
Presença Ausência
Presença NPK
Ausência NPK
NPK (15- NPK (15(15-9-20)
(15-9-20)
9-20)
9-20)
α-tujeno
945
α-pineno
951
0,04
1-octen-3-ol
984
0,06 0,15
Mirceno
994
0,31 0,36 0,37
α -terpineno
1020
ρ-cimeno
0,07 0,1
0,07
0,06 0,02
0,07
0,02
0,03
0,05 0,09
0,04
0,08
0,32
0,37 0,28
0,46
0,31
0,15 0,24 0,24
0,26
0,2
0,12
0,25
0,06
1027
2,22 2,37 2,23
2,32
2,63 1,68
3,19
2,68
1,8-cineol
1034
0,56 1,66
0,85
0,16
0,64
E-b-ocimeno
1048
0,03

Cis-sabinene
hydrate
Linalol
1061
0,84 1,76 1,48
1,89
1,28 0,68
1,44
0,35
1069
0,29 0,42 0,42
0,38
0,29 0,21
0,25
0,38
1102
0,58 0,63 0,41
0,89
0,6
1,06
0,38
0,45
Ipsdienol
1148
0,68 0,51 0,51
0,42
0,65 0,76
0,63
0,63
Terpinen-4-ol
1181
0,64 0,68 0,61
0,82
0,66 0,7
0,71
0,56
Éter metil timol
1238
1,82 1,35 1,31
2,36
2,3
0,46
2,05
1,36
Éter metil carvacrol
1247
0,2
0,25 0,25
0,23
0,35 0,26
0,3
0,32
Timol
1297
5,7
6,0
4,9
4,9
5,4
7,0
Carvacrol
1311
74,9 73,9 75,9
76,2
77,3 74,8
74,9
77,0
Acetato de timol
Acetato de
carvacrol
E-cariofileno
1358
0,16 0,39 0,06
0,13
0,21
1375
1,03 1,78
0,38
0,65 0,45
1,7
0,12
1425
3,85 2,65 1,33
2,55
1,56 4,53
2,85
1,28
Aromadendreno
1443
0,07
0,41
0,25 0,33
0,06
0,24
α-humuleno
1458
0,27
0,2
0,04
ar-curcumeno
1484
0,2
α-zingibereno
1496
0,67

1509
0,51 0,28 0,29
0,23
0,37 0,52
0,14
0,32

1526
0,17
0,26
0,31
0,46
Espatulenol
1584
0,2
0,35 0,14
0,61
0,33 0,22
0,32
0,68
Óxido de cariofileno
Epóxido de
humuleno
Total detectado (%)
1591
1,41 1,29 0,64
1,2
1,28 1,11
1,05
1,98
96,4 97
97,7
96,3 97,8
97,2
96,5
0,07
10,3
0,4
8,0
0,3
1616
97,4
Índice de retenção calculado utilizando a equação de Van den Dool e Kratz 1963 em relação a
uma série homóloga de n-alcanos (nC9- nC18).
b
Valores do conteúdo dos compostos obtido pela média de três diferentes determinações
obtidas por GC/MS e GC/FID. Traços indicam que o composto não foi encontrado.
74
Martins et al. (2006) também relataram que a disponibilidade de NPK no
cultivo de Hyptis suaveolens (L.), para a extração de óleos, revelou-se um fator
importante para a composição química do óleo essencial, reforçado a relação
entre componentes do óleo e fatores edáficos. De acordo com o trabalho
daqueles autores, os óleos extraídos das plantas cultivadas com NPK
apresentaram
as
maiores
concentrações
dos
principais
constituintes
(Espatulenol, Globulol, Desidro Abietol, α-Candinol, Abietol, γ-Cadineno e α-TBergamoteno) do óleo essencial de H. suaveolens. Gomes et al. (2011),
relataram que a composição química do óleo de L. gracilis apresenta flutuações
quantitativas
dos
componentes
majoritários,
provavelmente,
devido
a
condições genéticas, em função do local e condições em que a planta foi
cultivada.
Segundo
Neves
et
al.
(2008),
os
compostos
químicos presentes no óleo essencial de L.gracilis em dois locais da Caatinga
de Pernambuco, foram diferentes. Em Buíque, mostraram a presença de
carvacrol e p-cimeno foi observado como constituintes principais. Em Ouricuri,
timol, g-terpineno e 4-metoxi-acetofenona apresentaram-se como compostos
majoritários. Ouricuri, timol, g-terpineno e 4-metoxi-acetofenona apresentaramse como compostos majoritários.
Atividade antimicrobiana
Nos testes para obtenção da concentração mínima inibitória para Xcv 3,
foi verificado que em 300 e em 400 uL L -1 houve inibição total do crescimento
bacteriano para todos os óleos testados. Na dosagem de 200 uL L-1 houve
inibição total do crescimento bacteriano apenas nos óleos 01, 05 e 06; já na
dosagem de 100 uL L-1 não houve inibição do crescimento bacteriano (Tabela
03). Em face desses resultados, novas dosagens, em um intervalo de 50 ppm,
foram testadas no segundo experimento (200, 250 e 300 uL L-1).
A partir da Tabela 4, podem-se observar diferenças significativas entre
as porcentagens de inibição do crescimento do patógeno para todos os óleos
de L. gracilis, sob diferentes práticas agrícolas, apresentando valores entre
62,67% a 96,50%, valores desejáveis no controle in vitro de Xcv. Os
tratamentos 01 e 06 na concentração de 300 uL L
-1
, e o tratamento 05 na
75
concentração de 200 uL L -1, foram os que proporcionaram maior inibiçãodo de
crescimento do patógeno, com uma porcentagem de controle de 94,75%,
96,50%, e 94,02%, respectivamente, não ocorrendo diferenças estatísticas
entre as concentrações testadas. Para os tratamentos 06 as concentrações de
200 e 300 uL L
-1
também não diferiram entre si. Já o tratamento 02 na
dosagem de 300 uL L -1 foi o que proporcionou a maior inibição de Xcv 3, com
uma porcentagem de controle de 91,20%. Os tratamentos 03, 06 e 08
apresentaram porcentagens de inibição do crescimento do patógeno de 81,60,
94,02, 81.70%, respectivamente, não havendo diferença estatística entre as
concetrações avaliadas.
Tabela 03: Seleção da concentração mínima inibitória dos óleos de Lippia
gracilis, obtidos de diferentes manejos de cultivo, a partir da inibição total do
crescimento bacteriano do isolado Xcv3. Juazeiro-BA, 2013.
Dosagem (ppm)
Óleo
1
2
3
4
1
100
200
300
400
2
3
IT
IT
SI
4
IP
IT
IT
SI
IP
IT
IT
SI
IP
IT
IT
SI
IT
IT
IT
SI
IT
IT
IT
SI
IP
IT
IT
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
SI
IT
SI
IP
IT
IT
ADE
SI
SI
SI
SI
Dosagem utilizada do óleo essencial de Lippia gracilis.
SI – Sem inibição do crescimento bacteriano do isolado Xcv 3.
IT – Inibição total do crescimento bacteriano do isolado Xcv 3 .
IP – Inibição parcial do crescimento bacteriano do isolado Xcv 3
Os ótimos resultados obtidos neste trabalho, com a alta porcentagem de
inibição do crescimento de Xcv, bactéria Gram-negativa, refletem a capacidade
do carvacrol e timol de desintegrar a membrana externa dessas bactérias,
liberando lipopolissacarídeos, e consequentemente, gerando alterações na
permeabilidade da membrana plasmática, o que resulta na morte da célula
76
bacteriana de um microrganismo gram-negativo (KNOWLES et al., 2005). No
caso relatado por Burt (2007), existe interação entre o carvacrol e o timol,
resultando em ação sinergística entre eles potencializando a ação de ambos
frente ao controle das células bacterianas O óleo de L. gracilis apresenta
elevada atividade antimicrobiana e antifúngica (MATOS et al., 1999). Segundo
Albuquerque et al. (2006), este óleo é eficiente na inibição de algumas
bactérias que comumente causam contaminação em laboratórios de cultura de
tecidos de plantas, tais como Salmonella sp., Klebsiella pneumoniae e Bacillus
cereus. Também mostrou atividade antifúngica contra Geotrichum candidum
White, Aspergillus flavus, Curvularia lunata e Aspergillus niger. Oliveira et al.
(2010),
trabalhando
com
óleo
e
extratos
vegetais
sobre
bactérias
fitopatogênicas, obtiveram a inibição do crescimento Xanthomonas campestris
pv. vesicatoria Doidge e X. campestris pv. campestres Pammel com extratos de
hortelã. Extrato de alho conseguiu inibir o crescimento dessas bactérias e de
Pectobaterium carotovorum subsp. carotovorum Jones.
Conforme Albuquerque et al. (2006), os compostos químicos presentes
no óleo essencial, principalmente, os monoterpenos carvacrol e timol, das
espécies do gênero Lippia, tem apresentado forte ação contra bactérias e
fungos contaminantes, presentes em laboratório de cultura de tecido de
helicônias. O óleo essencial e extrato de pimenta-longa (Piper aduncum L.) e
extrato etanólico de comigo-ninguém-pode (Dieffenbachia picta Schott)
apresentam capacidade de inibição do crescimento de Ralstonia solanacearum
(Smith) (VÉRAS E YUYAMA, 2001; VÉRAS et al., 2002). Trabalho realizado
por Amorim et al. (2011), também observaram que o óleo essencial de citronela
(Cymbopogon nardus L.) e gengibre (Zingiber officinale Roscoe) foram capazes
de inibir o crescimento de R. solanacearum em todas as concentrações
testadas, sendo o óleo de cintronela capaz de controlar em 100% a incidência
da doença, quando testado em mudas de bananeira. Estudos realizados por
Leal et al. (2003), com óleo de L. sidoides Cham, que apresentam como
componentes majoritários o timol e carvacrol, também verificaram que este
óleo apresenta atividade antibacteriana, no controle de Escherichia coli,
Staphylococcus
aureus,
Pseudomonas
aeruginosa,
Acinetobacter
sp.,
77
Streptococcus
mutans,
Corynebacterium
xerosis,
controle
de
fungos
fitopatogênicos.
No entanto, a maioria dos trabalhos nessa linha de pesquisa relata o uso
do óleo de L. gracilis no controle de fungos fitopatogênicos. Albuquerque et al.
(2006) ao testarem o óleo essencial de L. gracilis verificou a inibição do
crescimento de 100% contra os fungos Geotrichum candidum, Trichoderma
viride, Torula herbarum, Paecillomyces sp, Aspergillus nidulans, Fusicoccum
Tabela 04. Porcentagem de inibição do crescimento in vitro de Xanthomonas
campestris pv. viticola, cultivada em meio com diferentes concentrações de
óleo essencial produzido em distintos manejos de cultivo Lippia gracilis,
Juazeiro,BA, 2013.
Tratamento
Concentração (ppm)
01
01
01
02
02
02
03
03
03
04
04
04
05
05
05
06
06
06
07
07
07
08
08
08
Oxicloreto de
cobre
200
250
300
200
250
300
200
250
300
200
250
300
200
250
300
200
250
300
200
250
300
200
250
300
Dosagem recomendada
pelo fabricante
Testemunha
absoluta
CV%
----
Porcentagem de
inibição (%)
93.67 a
93.70 a
94.75 a
62.67 d
62.67 d
91.20 a
81.35 c
80.62 c
81.60 c
85.20 c
86.25 b
94.37 a
96.50 a
91.17 a
94.40 a
92.97 a
90.80 a
94.02 a
83.07 c
86.95 b
86.95 b
78.87 c
81.70 c
79.95 c
49,6 e
0,0 f
4,90
1
Tratamento do óleo essencial extraído de Lippia gracilis em diferentes manejos de cultivo.
2
Concentração do óleo essencial de Lippia gracilis no meio de cultura NYD.
78
sp, Aspergillus flavus e Paecillomyces aeruginens; 95,58% contra Curvularia
lunata e de 89,40% contra Aspergillus niger. Estudos realizados por Leal et al.
(2003), com óleo de L. sidoides, também verificaram que este óleo apresenta
atividade antifúngica a Candida albicans, Trichophyton rubrum e T. interdigitale,
dentre outros. O óleo de Lippia alba (Mill) N. E. Brown, que também apresenta
o timol e carvacrol como componentes majoritários, mostrou efeito inibidor
sobre o fungo Geotrichum spp (Oliveira, 2000). Segundo trabalho realizado por
Rao
et al. (2000) o óleo de L. alba foi altamente efetivo no controle da
germinação de teleosporos de Ustilago scitaminea Sydow e conídios de
Colletotrichum falcatum Went e de Curvularia lunata Wakker, apresentando
efeito superior a fungicidas comerciais no controle de fungos patogênicos de
plantas.
Todos os óleos testados proporcionaram uma porcentagem de inibição
do crescimento bacteriano significativamente superior ao oxicloreto de cobre,
produto padrão utilizado no campo para o controle de Xcv (MARQUES, 2009),
que inibiu apenas 49,6 %. Estes resultados concordam com aqueles obtidos
por outras pesquisas que evidenciam a ineficácia das pulverizações dos
produtos à base de cobre no controle da doença, em condições de campo.
Segundo
Marques
et
al.
(2009),
os
isolados
brasileiros
de X. campestris pv. viticola diferem em sua sensibilidade aos produtos a
base de cobre, apresentando estirpes mais tolerantes naturalmente, em
vinhedos nos estados de Pernambuco e Bahia.
Os óleos de plantas
apresentam menor risco de promover resistência microbiana, já que são
misturas
de
vários
compostos
que
apresentam
diferentes
ações
antimicrobianas (DAFERERA et al., 2003). Vários trabalhos vêm sendo
realizados, buscando demonstrar o potencial da utilização dos óleos essenciais
no controle de fitopatógenos (GADELHA et al., 2003; SILVA et al., 2004;
AMORIM et al, 2011; NETO et al., 2012).
CONCLUSÕES
O Carvacrol mostrouse como composto majoritário dos óleos extraídos
de L.gracilis, sob diferentes práticas agrícolas.
79
O tipo de cultivo influencia diretamente na atividade antimicrobiana do
óleo essencial de Lippia gracilis.
Apesar da existência de poucos trabalhos relacionados ao uso do óleo
de L. gracilis no controle de fitobactérias, os resultados encontrados sugerem
que o uso deste óleo tem potencial e pode ser uma alternativa no manejo
integrado do cancro bacteriano da videira, necessitando, desta forma, continuar
as pesquisas, em condições de campo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Universidade do Estado da Bahia – UNEB, à
FAPESB pelo fornecimento da bolsa e à Embrapa Semiárido, em especial à
Doutora Ana Valéria Vieira, pela parceria e disponibilização de materiais para a
realização desse trabalho.
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85
CONSIDERAÇÕES GERAIS
1. As espécies espontâneas amor-agarradinho, bredo, fedegoso,
soja-perene,
erva-de-touro,
cordão-de-frade
e
melão-de-são-
caetano são hospedeiras alternativas de Xcv, bem como plantas de
nim, feijão e tomate.
2. Os menores PI foram observados em soja perene (2,6 dias),
fedegoso (3,0 dias) e videira cv. Thompson seedles (3,8 dias);
enquanto que, a INC foi de 100% nas plantas da família
leguminosae.
3. As
espécies
testadas
pertencentes
as
famílias
Poaceae,
Portulacaceae, Liliaceae e Cucurbitaceae não são hospedeiras
alternativas de Xcv, bem como plantas de picão-preto, erva de
botão, falsa-emília e couve cravinho, que apresentaram os maiores
PI (42 dias para todas as espécies)
4. As amplificações a partir do DNA genômico purificado do isolado
de Xcv, com os oligonucleotídeos específicos, resultaram em
fragmentos de tamanho esperado de 240pb.
5. O Carvacrol mostrou-se como composto majoritário dos óleos
extraídos de L.gracilis, sob diferentes práticas agrícolas.
6. O tipo de cultivo influencia diretamente na atividade antimicrobiana
do óleo essencial de Lippia gracilis.
7. Todos os óleos testados proporcionaram inibição do patógeno
superior as observadas por Oxicloreto de cobre, sendo que os
óleos 1, 6 e 7 extraídos de L. gracilis cultivados com adubação
mineral (NPK) e adubação orgânica foram os que apresentaram
maiores porcentagens de inibição ao crescimento bacteriano de
Xcv, 94,75%, 96,50%, e 94,02%, respectivamente .
8. As dosagens que proporcionaram maiores porcentagens de
inibição do patógeno foram de 300 uL L -1 para os óleos 2 e 5; 250
uL L -1 para o óleo 15; e 200 uLL -1 para os óleos 1,4,6,7 e 16.
86

- Mestrado em Horticultura Irrigada

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