Poster 159 - IPA - Ruhr

Vergleich und Validierung verschiedener Methoden zur Erfassung eines möglichen kanzerogenen Potentials von aromatischen Aminen
BGFA
B. Voss1, G. Engelhardt2, K-R. Schwind2, M. Beth-Hübner3, T. Brüning1
1
2
Berufsgenossenschaftliches Forschungsinstitut für Arbeitsmedizin, Institut der Ruhr-Universität Bochum;
BASF Aktiengesellschaft, Ludwigshafen; 3 BG-Chemie, Heidelberg
Einleitung
Aromatische Amine sind eine wichtige Stoffgruppe, die industriell in grossen Mengen und
vorwiegend als Zwischenprodukt eingesetzt wird.
Eine Reihe ihrer Verbindungen stellen als kanzerogene Substanzen ein hohes Gesundheitsrisiko dar. Zur Zeit sind etwa 40 aromatische
Amine in die Kategorien 1-3 der MAK-WerteListe eingestuft. Daher steht die gesamte
Stoffruppe im Verdacht, möglicherweise krebserregende Eigenschaften zu besitzen.
Im Vordergrund der Erkrankungen stehen dabei
Schleimhautveränderungen, Krebs oder andere
Neubildungen der Harnwege (BK 1301). Gefährdet sind vor allem Beschäftigte in der Industrie, etwa in Kunststoff-, Strahlen-, Druck- und
Textilindustrie, aber auch Chemielaboranten,
Friseure und Kammerjäger. Aromatische Amine können über den Gastrointestinaltrakt, die
Lunge und die Haut aufgenommen werden.
Ergebnisse
Tab. 1a:
RATTE - TYP II – ZELLEN
675μg/ml
1350μg/ml
2700μg/ml
o-Anisidin
90-04-0
0
0
0
++
+++++
o-Toluidin
CAS-Nr.
95-53-4
168.75μg/ml
0
337.50μg/ml
0
0
0
++
+++++
95-69-2
0
0
0
+++++
95-80-7
0
0
0
(+)
(+)
m-Toluidin
108-44-1
0
0
0
0
++
m-Phenylendiamin
108-45-2
0
0
( +)
(+)
4-Chlor-2-Methylanilin
4-Methyl-m-Phenylendiamin
(+)
118-92-3
0
0
0
2.6-Diaminotoluol 2HCl
15481-70-6
0
0
+
++
++
2-Chlor-1,4-Phenylendiaminsulfat
61702-44-1
0
0
0
+++++
+++++
4.22μg/ml
8.44μg/ml
16.875μg/ml
33.75μg/ml
67.5μg/ml
Anthranilsäure
2.5-Diaminotoluolsulfat
615-50-9
0
0
( +)
0
0
+++
0
0
337.50μg/ml
675μg/ml
1350μg/ml
2700μg/ml
90-04-0
0
(+ )
+
+
+++
o-Toluidin
95-53-4
0
0
Tab. 1b:
0
+++++
o-Anisidin
4-Chlor-2.5-di-methoxyanilin
6358-64-1
0
0
MAUS CLARA - ZELLEN
CAS-Nr.
168.75μg/ml
0
0
4-Chlor-2-Methylanilin
95-69-2
0
0
0
+
++++
4-Methyl-m-Phenylendiamin
95-80-7
0
0
+
++
++
108-44-1
m-Toluidin
m-Phenylendiamin
0
108-45-2
0
0
+
0
+
0
+
++
+
+
118-92-3
0
0
0
0
0
2.6-Diaminotoluol 2HCl
15481-70-6
+
++
+++
+++
+++
2-Chlor-1,4-Phenylendiaminsulfat
61702-44-1
0
0
+
++
+++++
4.22μg/ml
8.44μg/ml
16.875μg/ml
33.75μg/ml
67.5μg/ml
Anthranilsäure
2.5-Diaminotoluolsulfat
4-Chlor-2.5-di-methoxyanilin
615-50-9
0
6358-64-1
0
0
++
0
Tab. 1c:
+++
0
+++
0
0
1350μg/ml
2700μg/ml
0
++
HUMANE HAUT - FIBROBLASTEN
CAS-Nr.
168.75μg/ml
337.50μg/ml
675μg/ml
o-Anisidin
90-04-0
0
0
0
o-Toluidin
95-53-4
0
0
0
0
0
4-Chlor-2-Methylanilin
95-69-2
0
0
0
0
++
4-Methyl-m-Phenylendiamin
95-80-7
0
0
0
+
++
108-44-1
0
0
0
0
+
++
m-Toluidin
0
108-45-2
0
(+)
118-92-3
0
0
0
0
0
2.6-Diaminotoluol 2HCl
15481-70-6
0
0
+
+
++++
2-Chlor-1,4-Phenylendiaminsulfat
61702-44-1
m-Phenylendiamin
Anthranilsäure
2.5-Diaminotoluolsulfat
4-Chlor-2.5-dimethoxyanilin
+++
0
0
0
+
+++
4.22μg/ml
8.44μg/ml
16.875μg/ml
33.75μg/ml
67.5μg/ml
6358-64-1
0
0
0
0
0
615-50-9
0
++
++++
+++
+++++
Ziel der Studie
Tab. 2a:
X Zur Verhütung von Gesundheitsschäden,
insbesondere zur Vermeidung der Entstehung von Blasenkrebs, ist eine kanzerogene Beurteilung der Stoffe erforderlich.
X Langzeitstudien zu allen aromatischen
Aminen sind zeit- und kostenintensiv.
X Daher war zu prüfen, ob ein mögliches
kanzerogenes Potential durch einzelne
Tests oder durch eine Kombination von
Assays valide abgebildet werden kann.
RATTE - TYP II - ZELLEN
Stoffname
CAS - Nr.
168.75μg/ml
337.5μg/ml
675μg/ml
1350μg/ml
2700μg/ml
121 - 14 - 2
0
0
+
++
++++
2 - Methyl - 5 - nitroanilin
99 - 55 - 8
0
0
0
0
(+)
o - Toluidin hydrochlorid
636 - 21 - 5
0
0
0
0
o - Anisidin hydrochlorid
134 - 29 - 2
0
0
0
0
+
83.38μg/ml
168.75μg/ml
337.5μg/ml
675μg/ml
1350μg/ml
2.4 Dinitrotoluol
2 - Naphthylamin
Zur Evaluierung möglicher Testmethoden wurden zunächst 10 aromatische Amine eingesetzt,
deren Wirkung im Salmonella / MikrosomenTest (Ames- Test), im in vivo Mikrokern-Test und
im UDS-Test bekannt war. Weitere 10 Stoffe mit
bekannter Wirkung im Langzeittest wurden im
pH 6,7 SHE-Assay nach LeBoeuf, der die Transformation von embryonalen Stammzellen auf
Basis ihres Wachstumsverhaltens sichtbar
macht, untersucht. Alle aromatischen Amine
wurden zum Vergleich auch mit dem CometAssay getestet. Als Zielzellen dienten Typ II
Pneumozyten der Ratte, Clara-Zellen der Maus
und humane Hautfibroblasten. Die Ergebnisse
aus den Mittelwerten der Mediane der Olive
Tail Momente (OTM) wurden nach einer vereinfachten Bewertung entsprechend einer
DKFZ-Empfehlung zusammengefasst:
0
( +)
= OTM annähernd oder gleich Kontrolle
+
+
++
0
0
+
0
0
0
0
0
624 - 18 - 0
+
+
++
+++
+++++
4 - Nitro - o - phenylendiamin
91 - 59 - 8
0
0
0
0
0
1 - Naphthylamin
134 - 32 - 7
0
0
0
++
++++
1.4 Phenylendiamin- 2HCl
Tab. 2b:
MAUS CLARA - ZELLEN
Stoffname
CAS - Nr.
168.75μg/ ml
337.50μg/ ml
675μg/ ml
1350μg/ml
2700μg/ml
121 - 14 - 2
0
0
+
+++
+++++
99 - 55 - 8
0
0
0
0
(+)
o - Toluidin hydrochlorid
636 - 21 - 5
0
0
0
0
++
0.105μg / ml
0.210μg / ml
0.42μg/ml
0.84μg/ml
1.68μg/ ml
cytotoxic
o-Anisidin
0
0
(+)
++
++
o-Toluidin
+
++
4-Chlor-2-methylanilin
2 - Naphthylamin
o - Anisidin hydrochlorid
2.4 Dimethoxyanilin
91 - 59 - 8
0
134 - 29 - 2
2735 - 32 - 7
++
0
+++++
0
cytotoxic
0
33229 - 34 - 4
0
0
0
0
+
624 - 18 - 0
+
++
++
++
++
4 - Nitro - o - phenylendiamin
91 - 59 - 8
0
0
0
0
0
1 - Naphthylamin
134 - 32 - 7
0.105μg / ml
0.210μg / ml
0.42μg/ml
0.84μg/ml
1.4 Phenylendiamin 2HCl
0
Tab. 2c:
++
+++++
+++++
1.68μg/ ml
+++++
HUMANE HAUT- FIBROBLASTEN
Stoffname
CAS - Nr.
168.75μg/ml
337.50μg/ml
675μg/ml
1350μg/ml
2700μg/ml
121 - 14 - 2
0
0
0
+
+
2 - Methyl - 5 - nitroanilin
99 - 55 - 8
0
0
0
0
0
o - Toluidin hydrochlorid
636 - 21 - 5
o - Anisidin hydrochlorid
134 - 29 - 2
2.4 Dinitrotoluol
0
0
0
0
Tab. 4
Einstufung
Stoffname
4-Methyl-m-phenylendiamin
0
0
+
++
67.5μg/ml
135μg/ml
270μg/ml
540μg/ml
CAS-Nr.
Ames
Ames
+N
MNT
UDS
CometAssayd
SHE
90-04-0
2
3
+
+
-
+
-
-
+
ng
95-53-4
2
-
+
+
-
+
-
-
+
ng
95-69-2
1
3
-
+
+
+
-
-
+
ng
95-80-7
2
-
+
+
108-45-2
61702-44-1
++
0
0
0
0
2735 - 32 - 7
0
0
+
++
+++
o-Toluidin HCl
636-21-5
33229 - 34 - 4
0
0
0
0
(+)
2-Naphtylamin
91-59-8
16.875μg/ml
33.75μg/ml
67.5μg/ml
135μg/ml
270μg/ml
4-Nitro-o-phenylandiamin
99-56-9
1,4-Phenylendiamin 2HC l
624-18-0
1 - Naphthylamin
134 - 32 - 7
Im SHE - Assay als kanzerogen eingestuft
84.325μg/ml
0
0
168.75μg/ml
0
Im SHE - Assay als fraglich eingestuft
(+)
337.5μg/ ml
0
++
675μg/ml
+
+++
1350μg/ml
++++
Im SHE - Assay als nicht kanzerogen eingestuft
Stoffname
SHE-Assay
AMES-Test
In vivo (Maus / Ratte)
2,4-Dinitrotoluol
+
+
+/+
2,4-Diaminotoluol
+
+
+/+
o-Toluidin hydrochlorid
+
+
-/+
o-Anisidin hydrochlorid
+
+
+/ -
2-Amino-4-nitrotoluol
+
+
+/+
2,4-Dimethoxyanilin
-
+
- /-
HC blue #2
-
+
- /-
p-Phenylendiamin dihydrochlorid
-
+
- /-
4-Nitro-o-phenylendiamin
-
+
- /-
2,6-Diaminotoluol
-
+
- /-
+
-
= positiv
= negativ
Von LeBoeuf (1996) publizierte Ergebnisse des pH 6,7 SHE-Assays im Vergleich mit
Ames-Test und tierexperimentellen Langzeitversuchen. Der Ames-Test unterscheidet nicht
zwischen kanzerogen und nicht-kanzerogen wirkenden aromatischen Aminen.
Tab. 3b
Stoffname
Kanzerogenität
SHE - Assay
24 Stunden
7 Tage
+
ng
+
2.5 –
4.0 x erhöht
2-Methyl-5-nitroanilin
+
ng
+
++
= OTM
4.0 –
8.0 x erhöht
o-Toluidin hydrochlorid
+
ng
+
2-Naphtylamin
+
ng
+
+++
= OTM
8.0 – 11.0 x erhöht
o-Anisidin hydrochlorid
+
ng
+
- /+
+
-
2,4-Dimethoxyanilin
-
-
-
HC blue #2
-
-
-
p-Phenylendiamin
-
-
-
4-Nitro-o-phenylendiamin
-
-
-
1-Naphthylamin
+
-/ +
ng
=
=
=
=
positiv
negativ
fraglich
nicht getested
Im SHE - Assay als
fraglich eingestuft
Im SHE - Assay als
kanzerogen eingestuft
Die Ergebnisse des pH 6,7 SHE-Assays, durchgeführt nach der Vorschrift von LeBoeuf (1996),
zeigen eine hohe Übereinstimmung mit den Literaturangaben und den Langzeitversuchen.
Das kanzerogene Risiko für 1-Naphtylamin konnte allerdings auch mit diesem Test nicht
zweifelsfrei belegt werden
ng
+
ng
-
+
+
-
+
ng
-
M
134-29-2
2,4-Dinitroroluol
121-14-2
2
3
99-55-8
3b
-
2-Methyl-5-nitroanilin
2,4-Dimethoxyanilin
HC Blue #2
1-Naphthylamin
1
-
-
in vivo
Kanzerogenität
Ratte
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
ng
-
-
+
ng
-
-
+
ng
-
+
ng
+
+
in vitro
Genotoxizitäts-Studien
BGFAStudie
BASF-HVBG- Ergebnisse aus
Studie
der Literatur
Maus
Ames
Ames
+N
MNT
UDS
COMETAssayd
SHE
SHE
ng
ng
ng
+
+
+
ng
ng
ng
+
+
+
+
+
+c
+
-
+c
-
+
+c
ng
-
-
+
+
+
+
+
+c
ng
ng
ng
+
+
+
+
+
ng
ng
ng
ng
+
+
+
-
-
+c
ng
ng
ng
-
-
-
-
-
+c
ng
ng
ng
+
-
-
c
2735-04-8
-
-
+
ng
ng
ng
+
-
-
33229-34-4
-
-
+c
ng
ng
ng
+
-
-
134-32-7
-
-
+c
ng
-c
+c
+
-
-
Kanzerogenität
Mutagenität
plus Norharman (Ames Test)
Mikronukleus-Test
UDS-Test
Zelltransformationstest an embryonalen Zellen
des syrischen Hamsters
+
(+)
ng
a
b
c
d
Im SHE - Assay als
kanzerogen eingestuft
+
-
-
o-Anisidin HCl
K
M
+N
MNT
UDS
SHE
Tab. 3a
-
-
-
K
+++
0
-
-
-
CAS-Nr.
0
624 - 18 - 0
+
-
-
Einstufung
Stoffname
+
1.4 Phenylendiamin 2HCl
+
-
SHE
Tab. 5
91 - 59 - 8
HC Blue #2
3
118-92-3
15481-70-6
2-Chlor-1,4-phenylendiamin
91 - 59 - 8
2.4 Dimethoxyanilin
-a
615-50-9
2,6-Diaminoto luol 2HCl
4 - Nitro - o - phenylendiamin
+++
BASF-HVBG- Ergebnisse aus
Studie
der Literatur
Maus
2 - Naphthylamin
+++
BGFAStudie
Ratte
m-Phenylendiamin
2,5-Diamino-to luo lsulfat
in vitro
Genotoxizitäts-Studien
M
108-44-1
Anthranilsäure
in vivo
Kanzerogenität
K
m-Toluid in
0
0
33.75μg/ml
= OTM
Alle Teste wurden nach international anerkannten Standardrichtlinien durchgeführt.
+++
2 - Methyl - 5 - nitroanilin
2.4 Dinitrotoluol
+
+++++ = OTM > 14.0 x erhöht
++++
0
= OTM bis 2.5 x erhöht (Mindestforderung DKFZ)
= OTM 11.0 – 14.0 x erhöht
++++
2735 - 32 - 7
HC Blue #2
2,4-Dinitrotoluol
++++
0
33229 - 34 - 4
2.4 Dimethoxyanilin
HC Blue #2
Methoden
91 - 59 - 8
Die im Comet-Assay beobachtete Genotoxizität der Substanzen war abhängig von
der Dosis und von der Zielzelle. Im Vergleich
mit den bekannten, in vivo erzielten Ergebnissen, zeigte der Comet-Assay deutliche Abweichungen (Tab.1a,b,c und 2a,b,c). Eine
eindeutige Abschätzung des kanzerogenen
Risikos gelang mit dem Comet-Assay nicht.
Auch der Salmonella / Mikrosomen-Test
konnte sowohl ohne als auch unter artifiziellen Bedingungen mit Zusatz von
Norharman positiv sein. Bei einigen Stoffen
wurden im Mikronukleus-Test (MNT) bei
männlichen und weiblichen Tieren unterschiedliche Antworten beobachtet wie aus
der Zusammenfassung aller Daten zu erkennen ist (Tab. 4,5).
Mit dem SHE-Assay konnte bei den hier eingesetzten Stoffen eine hohe Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Langzeituntersuchungen und des beim Menschen bekannten kanzerogenen Risikos erzielt werden. Obwohl alle Methoden validiert
durchgeführt worden waren, konnte eine
Übereinstimmung bezüglich der Abschätzung der Kanzerogenität mit in vivo (Maus /
Ratte) Untersuchungen nur durch den SHEAssay erzielt werden (Tab. 3a, 3b).
Negatives Ergebnis
Positives Ergebnis
Fraglich positives ergebnis
nicht getestet
MAK K3B
MAK K2
Daten aus der Literatur
Werte abhängig von Konzentration und Zellart
Schlussfolgerungen
X Die jetzt vorliegenden umfangreichen
Untersuchungsergebnisse machen deutlich, dass der Comet-Assay für die Abschätzung der kanzerogenen Wirkung
für die Stoffgruppe der aromatischen
Amine nicht in Frage kommt.
X Mit dem SHE-Assay steht für die aromatischen Amine wahrscheinlich erstmalig
ein in vitro Test zur Abschätzung des
kanzerogenen Potenzials zur Verfügung.