hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test
Transcrição
hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test
hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test ® Gebrauchsanweisung In-vitro-Nukleinsäure-Hybridisierungsassay mit Signalverstärkung mittels MikrotiterplattenChemilumineszenz zum qualitativen Nachweis von 13 High-Risk-Typen des humanen Papillomavirus DNA (HPV-DNA) in Zervixproben. Zum Gebrauch mit: DNAPap™ Cervical Sampler HC Cervical Sampler™ Specimen Transport Medium™ Cytyc ThinPrep® Pap Test PreservCyt® Solution TriPath Imaging® SurePath® Preservative Fluid WICHTIGSTE VERÄNDERUNGEN IM VERGLEICH ZUR LETZTEN REVISION DES BEIPACKZETTELS 1. Aktualisierte Informationen für Hersteller und Vertreter in der Europäischen Gemeinschaft. Nur zum Laboratoriumsgebrauch durch ausgebildetes und geprüftes Laborpersonal. Vor Anwendung dieses Tests die Anleitungen sorgfältig durchlesen. QIAGEN Gaithersburg, Inc. 1201 Clopper Road Gaithersburg, MD 20878 USA 96 QIAGEN GmbH QIAGEN Str. 1 D-40724 Hilden Germany © 2008 QIAGEN Gaithersburg, Inc. 5197-1330 L2127DE Rev. 3 Durch das CE-Zeichen wird bestätigt, dass der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test den Anforderungen der Richtlinie 98/79/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 27. Oktober 1998 über In-vitro-Diagnostika entspricht. INHALT NAME UND VERWENDUNGSZWECK .........................................................................................................................1 ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG ................................................................................................................2 VERFAHRENSPRINZIP ................................................................................................................................................3 MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN................................................................................................4 WARN- UND SICHERHEITSHINWEISE .......................................................................................................................6 SICHERHEITSHINWEISE ...............................................................................................................................6 INFORMATIONEN ZU SICHERHEITS- UND GESUNDHEITSRISIKEN .........................................................7 VORSICHTSMASSNAHMEN ..........................................................................................................................7 VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN ...........................................................................................9 PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG..............................................................................................................11 ZERVIXPROBEN IN STM..............................................................................................................................11 ZERVIXBIOPSIEN .........................................................................................................................................11 ZERVIXPROBEN IN CYTYC PRESERVCYT LÖSUNG................................................................................12 ZERVIX-PROBEN IN SUREPATH PRESERVATIVE FLUID.........................................................................12 TESTVERFAHREN......................................................................................................................................................12 TESTS MIT GROSSEM PROBENDURCHSATZ MITTELS RAPID CAPTURE SYSTEMGERÄTEANWENDUNG .........................................................................................................................12 DENATURIERUNG........................................................................................................................................13 Verfahren zur Vorbereitung von Kalibratoren, Qualitätskontrollen und STM-Proben.......................14 Verfahren zur Vorbereitung von PreservCyt Solution-Proben .........................................................15 MISCHEN UND DENATURIEREN ................................................................................................................17 Manuelles Vortexverfahren..............................................................................................................17 Vortexer 2-Verfahren mit Multi-Specimen Tubes (MST)..................................................................17 Vorbereitungsverfahren für SurePath Proben .................................................................................18 HYBRIDISIERUNG ........................................................................................................................................19 Hybridisierungsverfahren mittels Hybridisierungsplatte und Mikrotiterplatteninkubator I .................20 Hybridisierungsverfahren mittels Mikroröhrchen und Wasserbad....................................................20 HYBRID CAPTURE .......................................................................................................................................21 HYBRIDNACHWEIS ......................................................................................................................................22 SPÜLEN ........................................................................................................................................................23 Automatisches Plattenspüler I-Verfahren: .......................................................................................23 Manuelles Spülverfahren: ................................................................................................................24 SIGNALVERSTÄRKUNG ............................................................................................................................................24 VERIFIKATIONSKRITERIEN FÜR DIE ASSAY-KALIBRIERUNG .............................................................................25 BERECHNUNG DER GRENZWERTE ........................................................................................................................27 QUALITÄTSKONTROLLE ..........................................................................................................................................28 INTERPRETATION DER PROBENERGEBNISSE .....................................................................................................29 LEISTUNGSMERKMALE ............................................................................................................................................29 KLINISCHE LEISTUNG BEIM SCREENING VON PATIENTINNEN MIT NORMALEN PAPABSTRICHERGEBNISSEN ALS EIN HILFSMITTEL BEI DER RISIKOBEURTEILUNG FÜR DAS PATIENTENMANAGEMENT ..................................................................................................................29 KLINISCHE LEISTUNG BEIM SCREENING VON PATIENTINNEN MIT ASC-US PAPABSTRICHERGEBNISSEN ZUR ERMITTLUNG DER NOTWENDIGKEIT EINER ÜBERWEISUNG ZUR KOLPOSKOPIE..............................................................................................................................32 KLINISCHE EMPFINDLICHKEIT UND SPEZIFITÄT FÜR DIE ERMITTLUNG DES RISIKOS FÜR EINE HIGH-GRADE-ERKRANKUNG BEI FRAUEN MIT LSIL- ODER HSIL-PAP-ABSTRICHEN ..................33 ANALYTISCHE EMPFINDLICHKEIT.............................................................................................................36 ÄQUIVALENZ ZWISCHEN DEN PROBEN IN SPECIMEN TRANSPORT MEDIUM (STM) UND DEN PROBEN IN PRESERVCYT (PC) LÖSUNG ..........................................................................................36 KORRELATION ZWISCHEN SUREPATH-PROBENERGEBNIS UND QIAGEN STM PROBEN IN EINER KLINISCHEN POPULATION ..................................................................................................................37 REPRODUZIERBARKEIT .............................................................................................................................37 KREUZREAKTIVITÄT .................................................................................................................................................39 KREUZREAKTIVITÄTSPANEL .....................................................................................................................39 KREUZHYBRIDISIERUNG............................................................................................................................40 EFFEKT VON BLUT UND ANDEREN SUBSTANZEN AUF STM-PROBEN .................................................40 i EFFEKT VON BLUT UND ANDEREN SUBSTANZEN AUF PROBEN IN PRESERVCYT LÖSUNG ............40 REPRODUZIERBARKEIT DES HC2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS MIT IN STM GEGEBENEN KLINISCHEN PROBEN ..........................................................................................................................40 REPRODUZIERBARKET DES HC2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS MIT IN PRESERVCYT LÖSUNG GEGEBENEN KLINISCHEN PROBEN ..................................................................................................41 REPRODUZIERBARKEIT EINES HC2 HIGH-RISK HPV DNA-TESTS MIT PROBEN IN SUREPATH KONSERVIERUNGSFLÜSSIGKEIT.......................................................................................................42 REPRODUZIERBARKEIT DER SUREPATH-ERGEBNISSE UNTER VERWENDUNG DES HALBAUTOMATISCHEN QIAGEN RAPID CAPTURE SYSTEM FOR ASSAY PROCESSING......................43 GRENZEN DES VERFAHRENS..................................................................................................................................44 LITERATUR.................................................................................................................................................................45 HC2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TEST LEITFADEN ZUR FEHLERSUCHE .....................................................................48 KONTAMINATIONSTEST .............................................................................................................................53 QIAGEN KONTAKTINFORMATIONEN ......................................................................................................................54 ZUSAMMENFASSUNG DES HC2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS.............................................................................55 ii NAME UND VERWENDUNGSZWECK In-vitro-Diagnostikum ® Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test® unter Verwendung der Hybrid Capture 2 (hc2)-Technologie ist ein Nukleinsäure-Hybridisierungsassay mit Signalverstärkung mittels Mikrotiterplatten-Chemilumineszenz zum qualitativen Nachweis der DNA von dreizehn High-Risk-Typen des humanen Papillomavirus (HPV) in Zervixproben. Zervixproben, die mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test getestet werden können, schließen folgende ein: • • • • Mit dem DNAPap™ Cervical Sampler oder dem HC Cervical Sampler™ entnommene Proben. Mit einer Entnahmevorrichtung des Besentyps oder einer Bürsten-/Spatelkombination ® entnommene und in Cytyc PreservCyt Solution gegebene Proben (nähere Einzelheiten sind der Packungsbeilage des hc2-Probenkonversionskits zu entnehmen). Proben in TriPath Imaging® SurePath® Preservative Fluid. In Specimen Transport Medium™ (STM) gegebene Biopsien. Die Verwendung dieses Tests ist angezeigt: 1. Zum Nachweis der High-Risk-HPV-Typen 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68, von denen gezeigt wurde, dass sie den primären kausalen Faktor bei der Entwicklung des Zervixkarzinoms darstellen. 2. Als initialer Screening-Test der Allgemeinbevölkerung, zur Verwendung mit oder ohne PapAbstrich, um Frauen mit erhöhtem Risiko für die Entwicklung eines Zervixkarzinoms oder dem Vorliegen einer High-Grade-Erkrankung der Zervix zu identifizieren. Die HPV-Diagnose ist mit zunehmendem Alter verstärkt indikativ für eine Zervixerkrankung. 3. Als Follow-up-Test für Patientinnen nach abnormen Pap-Abstrichergebnissen oder einer Zervixerkrankung zur Ermittlung, ob eine Überweisung zur Kolposkopie oder zu anderen Followup-Verfahren erforderlich ist. 4. Als Follow-up-Test für Patientinnen mit leichter Dysplasie, d. h. einer Low-Grade Squamous Intraepithelial Läsion (LSIL), oder schwerer Dysplasie, d. h. High-Grade Squamous Intraepithelial Läsion (HSIL), in den Pap-Abstrichergebnissen vor der Kolposkopie. Bei diesen Patientinnen hilft ein hc2 HPV-Ergebnis dem Arzt bei der Behandlung der betreffenden Patientin durch Risikobeurteilung von Frauen zum Ausschluss des Vorliegens einer High-Grade-Erkrankung. Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test sollte zusammen mit anderen von diagnostischen und von ScreeningTests hergeleiteten klinischen Informationen, körperlichen Untersuchungen und einer vollständigen Erhebung der Anamnese im Rahmen angemessener Patienten-Management-Verfahren eingesetzt werden. Die hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testergebnisse sollten jedoch nicht als alleinige Basis bei der klinischen Beurteilung und Behandlung von Patientinnen eingesetzt werden. 1 ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG Das Vorliegen bestimmter HPV-Typen im weiblichen Genitaltrakt ist von einer Reihe verschiedener Erkrankungen begleitet, einschließlich Kondylomen, bowenoider Papulose, zervikaler, vaginaler und 1-3 vulvarer intraepithelialer Neoplasien und Karzinomen. Es ist allgemein anerkannt, dass die Übertragung dieser Viren überwiegend sexuell erfolgt und dass es sich bei den High-Risk-HPV-Typen um den 4-8 wichtigsten anerkannten Risikofaktor für die Entwicklung eines Zervixkarzinoms handelt. Humane Papillomaviren sind aus einem Ikosaeder-Viruspartikel (Virion) aufgebaut, das ein doppelsträngiges zirkuläres DNA-Molekül mit 8000 Basenpaaren enthält und von einem Proteinkapsid umgeben ist. Im Anschluss an eine Infektion der Epithelzellen breitet sich die virale DNA über die gesamte Dicke des Epithels aus, während intakte Virionen nur in den oberen Gewebeschichten zu finden sind. Demzufolge kann virale DNA, abhängig von dem Typ und dem Grad der Läsion, entweder in Virionen oder als episomale oder integrierte HPV-Sequenz vorliegen. Bisher ist die Kultivierung von HPV in vitro nicht gelungen, und die immunologischen Tests zur Bestimmung des Vorliegens einer durch HPV verursachten Zervixinfektion sind unzulänglich. Indirekte Hinweise auf eine anogenitale HPV-Infektion ergeben sich allerdings aus der körperlichen Untersuchung sowie durch die Anwesenheit der mit der viralen Replikation im Pap-Abstrich oder in Biopsieproben einhergehenden charakteristischen Zellveränderungen. Als Alternative können Biopsien mittels Nukleinsäure-Hybridisierung im Direktnachweis auf das Vorliegen von HPV-DNA eingesetzt werden. Historisch wurden HPV 16 und HPV 18 als mit hohem Karzinomrisiko assoziierte HPV-Typen 8-10 Für die HPV-Typen 31, 33 und 35 wurde der Nachweis erbracht, dass sie einen eingestuft. 2,11-14 intermediären Zusammenhang mit einem Karzinom aufweisen. Dieser intermediäre Zusammenhang ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass diese Typen häufiger in High-Grade Squamous Intraepithelial Läsionen (HSIL) als in Karzinomen nachgewiesen werden. Infolge dessen ist die Induktion von Karzinomen aufgrund des Vorliegens dieser Typen weniger wahrscheinlich als wenn High-Risk-HPV38 DNA-Typen anwesend sind. Diese fünf HPV-Typen machen zusammen ca. 73 % der HPV-Infektionen 21,34 aus. Weitere HPV-DNA-Typen, einschließlich der Typen 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68, wurden als 15-20,30-34 die in den übrigen Läsionen nachweisbaren wichtigsten HPV identifiziert. Diese HPV-Typen lassen sich basierend auf ihrer relativen Verteilung auf verschiedene histopathologische 21, 30-35 Diagnosekategorien außerdem auch in Gruppen mit intermediärem und hohem Risiko einteilen. Es wurde gezeigt, dass HPV-DNA bei ca. 10 % der Frauen mit normalem Zervixepithel vorliegt, obwohl die tatsächliche Prävalenz bei Frauen spezifischer Gruppen stark vom Alter und anderen demografischen 2,10,21,29 Aus prospektiven Studien ist ersichtlich, dass im Vergleich zu nur 1 Variablen beeinflusst wird. 3 % HPV-DNA-negativen Frauen 15 - 28 % HPV-DNA-positive Frauen innerhalb von 2 Jahren SIL 22,23 (Squamous Intraepithelial Lesions) entwickelten. Im Vergleich zu anderen HPV-Typen war 22 insbesondere das Risiko einer Progression für HPV-Typen 16 und 18 größer (ca. 40 %). 2 VERFAHRENSPRINZIP Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test unter Verwendung der Hybrid Capture 2-Technologie ist ein Nukleinsäure-Hybridisierungsassay mit Signalverstärkung, der sich den MikrotiterplattenChemilumineszenznachweis zunutze macht. Die in den Proben enthaltene Ziel-DNA hybridisiert mit einer spezifischen HPV-RNA-Sonde. Die sich ergebenden RNA:DNA-Hybride werden an die Oberfläche einer mit für RNA:DNA-Hybriden spezifischen Antikörpern beschichteten Mikrotiterplatten-Vertiefung fixiert (capturing). Immobilisierte Hybride werden dann mit alkalischer Phosphatase-konjugierten Antikörpern, die für die RNA:DNA-Hybride spezifisch sind, zur Reaktion gebracht und mit einem ChemilumineszenzSubstrat nachgewiesen. An jeden Antikörper werden mehrere alkalische Phosphatasemoleküle konjugiert. Mehrfach konjugierte Antikörper binden an jedes fixierte (captured) Hybrid, was zu einer erheblichen Signalverstärkung führt. Wird das Substrat durch die gebundene alkalische Phosphatase gespalten, erfolgt die Abgabe von Licht, die als relative Lumineszenzeinheiten (RLU) an einem Luminometer gemessen wird. Die Intensität des abgegebenen Lichts zeigt die An- oder Abwesenheit von Ziel-DNA in der Probe an. Eine RLU-Messung, die gleich oder größer als der Grenzwert ist, zeigt das Vorliegen von High-Risk-HPVDNA-Sequenzen in der Probe an. Eine unter dem Grenzwert liegende RLU-Messung weist auf die Abwesenheit der getesteten spezifischen High-Risk-HPV-DNA-Sequenzen oder HPV-DNAKonzentrationen unter der Nachweisgrenze des Assays hin. Tests mit großem Probendurchsatz mittels des hc2 HPV-DNA-Tests können unter Verwendung des Rapid Capture® Systems (RCS) durchgeführt werden. Dieses Instrument verarbeitet bis zu 352 Proben in acht Stunden. Damit Tests mit großem Probedurchsatz getätigt werden können, werden alle Verfahrensschritte des Assays vom RCS übernommen, mit Ausnahme von Probendenaturierung, Chemilumineszenzsignalnachweis und Ausgabe der Ergebnisse. 3 MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN In einem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test-Kit ( 5197-1330) sind 96 Tests enthalten. Die Anzahl der Patientenergebnisse variiert abhängig von der Anzahl der Anwendungen pro Kit: 1 Anwendung = 88 Patientenergebnisse 2 Anwendungen = 80 Patientenergebnisse 3 Anwendungen = 72 Patientenergebnisse 4 Anwendungen = 64 Patientenergebnisse 1 x 0,35 ml Indikator-Farbstoff Enthält 0,05 % m/V Natriumazid. 1 x 50 ml Denaturierungsreagenz Verdünnte Natriumhydroxid-Lösung (NaOH). 1 x 5 ml Sonden-Verdünnungsmittel Gepufferte Lösung mit 0,05 % m/V Natriumazid. 1 x 200 µl High-Risk-HPV-Sonde HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 RNA-Sonde in gepufferter Lösung (roter Verschlussdeckel). 1 x 1 ml Low-Risk-HPV-Qualitätskontrolle 5 pg/ml (500.000 Kopien/ml) klonierte HPV-6-DNA und Träger-DNA in STM mit 0,05 % m/V Natriumazid. 1 x 1 ml High-Risk-HPV-Qualitätskontrolle 5 pg/ml (500.000 Kopien/ml) klonierte HPV-16-DNA und Träger-DNA in STM mit 0,05 % m/V Natriumazid. 1 x 2,0 ml Negativkalibrator Träger-DNA in Specimen Transport Medium mit 0,05 % m/V Natriumazid. 1 x 1,0 ml . High-Risk-HPV-Calibrator 1 pg/ml klonierte HPV-16-DNA und Träger-DNA in STM mit 0,05 % m/V Natriumazid. 1x1 . Capture-Mikrotiterplatte Beschichtet mit Anti-RNA:DNA-Hybridantikörpern. 1 x 12 ml . Nachweisreagenz 1 Alkalische Phosphatase-konjugierte Antikörper an RNA:DNA-Hybriden in gepufferter Lösung mit 0,05 % m/V Natriumazid. 1 x 12 ml . Nachweisreagenz 2 ® CDP-Star mit Emerald II (Chemilumineszenz-Substrat). 1 x 100 ml Waschpuffer-Konzentrat Enthält 1,5 % m/V Natriumazid. C . 4 T ERFORDERLICHE, ABER NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN A In-vitro-Diagnostika – Geräte und Zubehör für das Hybrid Capture System Digene Mikrotiterplatten-Luminometer 2000 Instrument (DML Rapid Capture® System (optional für Tests mit großem E ™ Probendurchsatz) 2000 ), PC-System mit Druckerkabel und Spülapparat Tintenstrahldrucker, Gebrauchsanweisung für das DML Mikrotiterplatte zur Hybridisierung 2000™-Instrument und für die Software, Version 2, sowie interaktives Bedienerhandbuch für die Digene Hybrid Capture Mikrotiterplattendeckel System Version 2 (DHCS V.2) Software (DML 2000 Leere Mikrotiterplattenstreifen (erhältlich von Costar, Modell Nr. Assayprotokolle für HPV Version 4.01 oder höher sind 2581); optional zum Gebrauch mit dem automatischen erforderlich) Hybrid Capture System Rotary Shaker I (Kreisschüttler I) Plattenspüler I Hybrid Capture System Microplate Heater I Extralange Pipettenspitzen zum Probentransfer (Mikrotiterplatteninkubator I) Probenentnahmeröhrchen Hybrid Capture System Automated Plate Washer I Probenentnahmeröhrchen-Gestell (passend zu den (Automatischer Plattenspüler I) Probenentnahmeröhrchen) Hybrid Capture System Multi-Specimen Tube (MST)-Vortexer I Probenröhrchengestell B oder 2 (Optional) Schraubdeckel für Probenentnahmeröhrchen C Einweg-Reagenzbehälter Konversionsgestell und Gestellabdeckung (optional) ® DuraSeal -Röhrchenabdeckungsfolie Digene Probengestell und Gestellabdeckung (optional) C Mikroröhrchen zur Hybridisierung ™ EXPAND-4 Dispenser und Gestell (optional) Mikroröhrchengestelle Hybrid Capture Cervical Sampler oder DNAPap Cervical D Plattenabdeckungen Sampler Spender für Röhrchenabdeckungsfolie und -Schneidegerät (optional, zur Verwendung mit dem MST-Vortexer I oder 2) Geräte und zubehör für den allgemeinen Laborgebrauch Zusätzliche Geräte und Zubehörteile für die Behandlung von Proben in PreservCyt-Solution Ausschwingrotor-Zentrifuge bis zu 2900 ± 150 x g, geeignet für konische 10-ml- oder 15-ml-PolypropylenZentrifugenröhrchen Wasserbad (65 ±2 °C) ausreichender Menge zur Aufnahme eines Gestells (36 x 21 x 9 cm) oder von Probenstativen Mikrozentrifuge (optional zum Zentrifugieren der SondenFläschchen zum Erhalt des maximalen Sondenvolumens) Vortex-Mischer mit Becheraufsatz 1-Kanal-Mikrodispenser; variabel einstellbar für Volumina von 20-200 µl und 200-1000 µl Direktverdrängungssystem-Dispenser, wie z. B. die Eppendorf ® Repeater Multipette- oder ein entsprechender 8-Kanal-Dispenser: variabel einstellbar für Volumina von 25 200 µl Stoppuhr Natriumhypochlorit-Lösung, 5 % (V/V) (oder Haushaltsbleiche) ® Parafilm oder entsprechende Folie Einweg-Filterspitzen für den 1-Kanal-Dispenser (20 bis 200 µl und 200-1000 µl) ® Einwegspitzen für die Eppendorf Repeater Multipette (25 und 500 µl) Einwegspitzen für den 8-Kanal-Dispenser (25 bis 200 µl ) ® Kimtowels -Wischtücher oder entsprechende fusselfreie Papiertücher Einweg-Arbeitstischabdeckung Ungepuderte Handschuhe 5 ml und/oder 15 ml Polypropylenröhrchen mit Schnappdeckel und rundem Boden (für die Sondenverdünnung) 2,0-ml-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen mit Verschlussdeckeln 5-ml serologische oder Vollpipetten A hc2 Probenkonversionskit ® Einwegspitzen für den Eppendorf Repeater Multipette (50 und 100 µl) Für manuelles Vortexverfahren: F hc2 Probenkonversionsröhrchen (15 ml, konisch) , konische 10ml-Sarstedt-Röhrchen mit Deckeln oder 15-ml RundbodenPolypropylenröhrchen mit Deckeln von VWR oder der Marke Corning® Röhrchengestell für konische 10- oder 15-ml- Röhrchen Für Vortexer 2-Verfahren mit Multi-Specimen Tubes: F hc2 Probenkonversionsröhrchen (15 ml, konisch) Vortexer 2 für Multi-Specimen Tubes (MST) Konversionsgestell und Deckel (für konische 15-ml-Röhrchen) Spender für Röhrchenabdeckungsfolie und Schneidevorrichtung ® DuraSeal Film zum Verschließen der Röhrchen (zum Gebrauch mit MST Vortexer 2) Zusätzliche Geräte und Zubehörteile für die Behandlung von Proben in Surepath Preservative Fluid Ausschwingrotor-Zentrifuge bis zu 800 ± 15 x g, geeignet für konische 15-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen F hc2 Probenkonversionsröhrchen (15 ml, konisch) 7-ml Transferpipetten mit Standardspitze oder entsprechende Pipetten QIAGEN Specimen Transport Medium Einwegspitzen für die Eppendorf Repeater® Pipette (100 µl) A B C D E F Bei QIAGEN sind nur hc2 CT/GC DNA-Tests validierte Ausrüstungsgegenstände und Zubehörteile erhältlich. Wenden Sie sich an Ihren QIAGEN-Vertreter. Ist bei halbautomatischer RCS-Anwendung ebenfalls erforderlich. Kundenanfertigung. Es können auch andere kundenspezifische expandierbare Mehrkanalpipetten verwendet werden, sofern im expandierten Zustand noch ein Abstand von 3,2 cm zwischen den Spitzen möglich ist. Alternativ kann eine Einkanalpipette mit einem Pipettiervolumen von 75 µl eingesetzt werden. Die Leistungsmerkmale des hc2 CT-ID DNA-Tests wurden ausschließlich mit den beiden genannten Entnahme-Kits ermittelt. Anweisungen zum Einsatz dieses Systems für Tests mit großem Probendurchsatz finden Sie im Rapid Capture System BenutzerAnwendungshandbuch. Die bei QIAGEN erhältlichen hc2-Probenkonversionsröhrchen (von VWR oder der Marke Corning®) müssen benutzt werden, damit bei Anwendung des Vortexverfahrens mit Multi-Specimen Tubes eine saubere Assay-Durchführung gewährleistet ist. 5 WARN- UND SICHERHEITSHINWEISE VOR ANWENDUNG DIESES TESTS ALLE ANLEITUNGEN SORGFÄLTIG DURCHLESEN. Sehen Sie auch das Glossar auf dieser CD-ROM zwecks Erläuterungen der für die Etikettierung verwendeten Symbole ein. SICHERHEITSHINWEISE ALLE PROBEN sind als potenziell infektiös anzusehen. Keine bekannte Testmethode kann absolute Gewähr dafür bieten, dass die Proben keine Infektion übertragen können. Es wird empfohlen, dass Proben menschlicher Herkunft unter Beachtung der entsprechenden nationalen/lokalen Sicherheitsrichtlinien für den Umgang mit biologischem Material gehandhabt werden. Befolgen Sie diese Sicherheitsrichtlinien beim Umgang mit biologischem Material, das infektiöse oder vermutlich infektiöse Materialien enthält. Diese Vorsichtsmaßnahmen schließen Folgendes ein, sind aber nicht beschränkt darauf: 1. Nicht mit dem Mund pipettieren. 2. In Bereichen, in denen Reagenzien oder Proben gehandhabt werden, nicht rauchen, essen oder trinken. 3. Bei der Handhabung von Reagenzien oder Proben sind ungepuderte Einweg-Handschuhe zu tragen. Nach Durchführung des Tests die Hände gründlich waschen. 4. Verschüttete Proben unter Verwendung eines tuberkuloziden Desinfektionsmittels, wie zum Beispiel 0,5 % (V/V) Natriumhypochlorit oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel 40,41 reinigen und desinfizieren. 5. Alle Proben, Reagenzien und andere potenziell kontaminierte Materialien unter Einhaltung nationaler und lokaler Bestimmungen dekontaminieren und entsorgen. Einige Reagenzien enthalten Natriumazid. Natriumazid kann Berichten zufolge in den Laborrohrleitungen Blei- und Kupferazid bilden. Diese Azide können bei Erschütterung, wie z. B. Hämmern usw., explodieren. Zur Verhinderung von Blei- oder Kupferazidbildung sind die Ausgüsse nach der Entsorgung natriumazidhaltiger Lösungen gründlich mit Wasser zu spülen. Zur Entfernung von Kontamination aus alten Abflüssen mit vermuteter Azidansammlung empfiehlt die US-amerikanische Occupational Safety and Health Institution (OSHI) Folgendes: (1) Flüssigkeit vollständig mit einem Gummi- oder Kunststoffschlauch aus dem Siphon heben, (2) mit 10 %iger v/v Natriumhydroxid-Lösung füllen, (3) 16 Stunden stehen lassen und (4) mit reichlich Wasser spülen. 6 INFORMATIONEN ZU SICHERHEITS- UND GESUNDHEITSRISIKEN Die nachstehenden Materialien wurden gemäß den EU-Richtlinien 2001/59/EG und 99/45/EG beurteilt. Achtung! Das Sonden-Verdünnungsmittel kann eine reversible Augenreizung verursachen. Bei Kontakt mit den Augen, sofort mit reichlich Wasser ausspülen und ärztlichen Rat einholen. Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. Im Fall eines Unfalls oder wenn Sie sich unwohl fühlen, sollten Sie sofort den Arzt aufsuchen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen). T C Das Waschpuffer-Konzentrat enthält Natriumazid und wird nach den zutreffenden Richtlinien der Europäischen Union (EU) als: Toxisch (T) bezeichnet. Bei Nachstehendem handelt es sich um die entsprechenden Hinweise auf besondere Gefahren (R-Sätze) und Sicherheitsratschläge (S-Sätze). R25: Giftig beim Verschlucken. R32: Entwickelt beim Berühren mit Säuren sehr giftige Gase. S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S45: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Das Denaturierungsreagenz enthält Natriumhydroxid und wird nach den zutreffenden Richtlinien der Europäischen Union (EU) als: Ätzend (C) bezeichnet. Nachstehend sind die entsprechenden Hinweise auf besondere Gefahren (R-Sätze) und Sicherheitsratschläge (SSätze) zu finden. R35: Verursacht schwere Verätzungen. S26: Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser ausspülen und Arzt konsultieren. S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. S45: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Bei Tests mit großem Probendurchsatz mit diesem Assay beachten Sie bitte die zusätzlichen Warnhinweise im Rapid Capture System Benutzer-Anwendungshandbuch. VORSICHTSMASSNAHMEN 1. In-vitro-Diagnostikum. 2. Die Zervixbürste ist nur zum Gebrauch bei nicht schwangeren Frauen bestimmt. 3. Die Reagenzien nicht über das neben dem Symbol angegebene Verfallsdatum hinaus verwenden. auf dem Etikett der Außenverpackung 4. Das Durchführen des Assays außerhalb der vorgesehenen Zeit- und Temperaturbereiche kann zu ungültigen Ergebnissen führen. Assays, die nicht in die festgelegten Zeit- und Temperaturbereiche fallen, müssen wiederholt werden. 5. Das hc2 HPV-DNA-Testverfahren, die Verifikationskriterien für die Assaykalibrierung, die Qualitätskontrolle und die Interpretation der Probenergebnisse sind zum Erhalt zuverlässiger Testergebnisse genau zu befolgen. 6. Es ist wichtig, das genaue Reagenzvolumen zu pipettieren und nach jeder Reagenzzugabe gründlich zu mischen. Nichtbeachtung könnte zu falschen Testergebnissen führen. Die Gewähr, dass die angegebenen Farbumschläge auftreten, dient der Bestätigung, dass diesen Bedingungen entsprochen wurde. 7. Die Kit-Bestandteile wurden als eine Einheit getestet. Bestandteile anderer Herkunft oder aus anderen Chargen dürfen nicht verwendet werden. 8. Nukleinsäuren sind sehr empfindlich gegenüber Nukleaseabbau. Nukleasen kommen auf der menschlichen Haut und auf Oberflächen oder Materialien vor, die von Personen gehandhabt 7 werden. Die Arbeitsflächen reinigen, mit Einweg-Arbeitstischabdeckungen abdecken und bei der Durchführung aller Assay-Schritte ungepuderte Handschuhe tragen. 9. Darauf achten, dass eine Kontamination der Capture-Mikrotiterplatte und des Nachweisreagenzes 2 mit exogener alkalischer Phosphatase während der Assay-Durchführung vermieden wird. Zu Substanzen, die gegebenenfalls alkalische Phosphatase enthalten könnten, zählen das Nachweisreagenz 1, Bakterien, Speichel, Haar und Öle der Haut. Das Abdecken der Capture-Mikrotiterplatte nach dem Spülschritt und während der Inkubation des Nachweisreagenzes 2 ist besonders wichtig, da exogene alkalische Phosphatase mit dem Nachweisreagenz 2 reagieren und zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann. 10. Das Nachweisreagenz 2 vor längerer direkter Lichteinwirkung schützen. Das Reagenz sofort nach der Aufteilung in Aliquote verwenden und direktes Sonnenlicht vermeiden. 11. Der Direktverdrängungssystem-Dispenser sollte vor der Reagenzabgabe geprimt und periodisch auf das Auftreten großer Luftbläschen kontrolliert werden. Exzessive Mengen großer Luftbläschen in der Dispenser-Spitze können zur ungenauen Abgabe führen. Dies lässt sich durch das Füllen des Dispensers, die Abgabe der gesamten Flüssigkeit und erneutes Befüllen vermeiden. Spezifische Hinweise zur Anwendung sind der Dispenser-Gebrauchsanweisung des Lieferanten zu entnehmen. 12. Das Mehrkanal-Pipettieren sollte unter Verwendung der reversen Pipettiertechnik zur Abgabe der Nachweisreagenzien 1 und 2 durchgeführt werden. Überprüfen, dass jede Pipettenspitze vorschriftsmäßig auf dem Mehrkanal-Dispenser sitzt und sich füllt. Die Gebrauchsanweisung des Herstellers für Mehrkanal-Pipetten einsehen. 13. Darauf achten, dass jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte, wie in den Spülanweisungen angegeben, gründlich gespült wird. Unzureichendes Spülen führt zu einem erhöhten Hintergrund und kann folglich zu falsch-positiven Ergebnissen führen. In den Vertiefungen zurückbleibender restlicher Waschpuffer kann zu reduzierten Signalen oder schlechter Reproduzierbarkeit führen. 14. Den Hybrid Capture System-Mikrotiterplatteninkubator I vom Kaltstart an mindestens 60 Minuten auf 65 °C ±2 °C äquilibrieren lassen. Nichteinhaltung dieser Anwärmungsperiode könnte zum Schmelzen der Mikrotiterplatte zur Hybridisierung führen. Nähere Einzelheiten sind in der Bedienungsanleitung für den Mikrotiterplatteninkubator I zu finden. 8 VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN 1. Nach Erhalt das Kit bei 2 - 8 °C lagern. Waschpufferkonzentrat, Denaturierungsreagenz und Indikator-Farbstoff können gegebenenfalls bei 2 - 30 °C gelagert werden. auf dem Verpackungsetikett angegebene Verfallsdatum 2. Nicht über das neben dem Symbol oder das Verfallsdatum der vorbereiteten Reagenzien hinaus verwenden (siehe nachstehend). 3. Alle Reagenzien außer dem Denaturierungsreagenz, der High-Risk-HPV-Sonde und dem Waschpufferkonzentrat sind gebrauchsfertig. Lesen Sie zur Vorbereitung der HPV-Sondenmischungen, des Waschpuffers, sowie der Nachweisreagenzien 1 und 2 das Benutzer-Anwendungshandbuch zum Rapid Capture System, da die darin enthaltenen Anweisungen speziell für den Einsatz dieses Systems bei Tests mit großem Probendurchsatz abgestimmt sind. REAGENZ VORBEREITUNGSVERFAHREN Denaturierungsreagenz Zuerst vorbereiten: Der Flasche mit dem Denaturierungsreagenz 5 Tropfen Indikator-Farbstoff zufügen und gründlich mischen. Das Denaturierungsreagenz sollte eine gleichmäßige, dunkel-purpurrote Farbe aufweisen. Nach der Vorbereitung ist das Denaturierungsreagenz bei einer Lagerung von 2 - 8 °C drei Monate stabil. Das Reagenz mit dem neuen Verfalldatum kennzeichnen. Bei Verblassen der Farbe vor Gebrauch 3 weitere Tropfen Indikator-Farbstoff zufügen und gründlich mischen. Vorsicht: Das Denaturierungsreagenz ist ätzend. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe, Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. Bei der Handhabung vorsichtig vorgehen. High-Risk-HPVSondenmischung (Vorbereitung aus High-RiskHPV-Sonde und Sondenverdünnungsmittel) Vorbereitung während der Proben-Denaturierungsinkubation: Wichtig: Manchmal befindet sich die Sonde in dem Verschlussdeckel des Fläschchens. Hinweis: Dieser Schritt ist zur Verhinderung der Kontamination von Sonde und SondenCocktail mit RNase mit äußerster Vorsicht durchzuführen. Zum Pipettieren der Sonde Filterspitzen verwenden. Das Sonden-Verdünnungsmittel ist viskos. Bei der Vorbereitung der High-Risk-HPV-Sondenmischung ist unbedingt auf gründliches Mischen zu achten. Während des Mischschrittes muss sich in der Flüssigkeit ein sichtbarer Wirbel bilden. Unvollständiges Mischen kann zu einem reduzierten Signal führen. • • • Das Fläschchen mit der High-Risk-HPV-Sonde kurz zentrifugieren, damit die Flüssigkeit auf den Boden des Fläschchens gebracht wird. Durch vorsichtiges Klopfen mischen. Die Menge der erforderlichen Sondenmischung (25 µl/Test) ermitteln. Es wird empfohlen, zur Kompensation für das in den Pipettenspitzen oder an den Seiten des Fläschchens verloren gegangene Volumen etwas mehr Sondenmischung anzusetzen. Vorgeschlagene Volumina sind nachstehend aufgelistet. Die für jede Anwendung empfohlene kleinste Anzahl an Vertiefungen ist 24. Sind weniger als 24 Vertiefungen pro Assay erwünscht, kann die Gesamttestzahl pro Kit aufgrund der begrenzten Sonden- und Sondenverdünnungsvolumina reduziert sein. Die erforderliche Sondenverdünnungsmittelmenge in einen neuen Einweg-Behälter überführen. Abhängig von der Anzahl der Tests wird entweder ein 5-ml- oder 15-mlPolypropylenröhrchen mit Schnappdeckel und rundem Boden empfohlen. Zur Vorbereitung der Sondenmischung eine Verdünnung von 1:25 aus High-Risk-HPVSonde in Sonden-Verdünnungsmittel ansetzen. 9 Anzahl der Tests/Streifen Volumen des Sondenverdünnungsmittels* 96/12 4,0 ml 72/9 3,0 ml 48/6 2,0 ml 24/3 1,0 ml pro Vertiefung 0,045 ml * Diese Werte enthalten das empfohlene zusätzliche Volumen. • • Waschpuffer Volumen der Sonde* 160,0 µl 120,0 µl 80,0 µl 40,0 µl 1,8 µl Die High-Risk-HPV-Sonde in das Sondenverdünnungsmittel pipettieren, indem die Pipettenspitze gegen die Innenwand des Röhrchens knapp über dem Meniskus platziert und der Inhalt abgegeben wird. Die Spitze nicht in das Sondenverdünnungsmittel eintauchen. Zum gründlichen Mischen mindestens 5 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Es muss ein sichtbarer Wirbel entstehen. Mit „High-Risk-HPVSondenmischung“ kennzeichnen und bis zur Gebrauchsfertigkeit in einem sauberen, geschlossenen Behälter aufbewahren. Nicht aufgebrauchte Sondenmischung verwerfen. Vorbereitung während des Capture-Schrittes: Für das Hybrid Capture System mit dem automatischen Plattenspüler I kann der Waschpuffer wie nachstehend beschrieben vorbereitet und in einem abgedeckten Behälter gelagert oder zur Vorbereitung von jeweils 1 l und Platzieren in die Waschbehälter des automatischen Plattenspülers I hergestellt werden. Aus der nachstehenden Tabelle gehen die Mischvolumina hervor: Weitere Pflege- und Wartungsanleitungen sind den Bedienungs- und Wartungsanweisungen für den automatischen Plattenspüler I zu entnehmen. Vorsicht: Das Waschpufferkonzentrat ist bei Verschlucken toxisch. Es sind geeignete Schutzkleidung, geeignete Schutzhandschuhe und ein geeigneter Augen- / Gesichtsschutz zu tragen. Um die Exposition so gering wie möglich zu halten, ist das Waschpufferkonzentrat bei der Vorbereitung mit Wasser zu verdünnen. Mengen des Waschpuffer- Menge destillierten oder Konzentrats entionisierten Wassers 33,3 ml 66,6 ml 100 ml 966,7 1933,4 2900,0 ml ml ml Endvolumen des Waschpuffers 1l 2l 3l Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass der automatische Plattenspüler I jederzeit eingeschaltet bleibt. Hierdurch wird die Durchführung der Wartungsspülung ermöglicht, wenn das Gerät acht Stunden nicht in Gebrauch war. Vor jedem Assay sicherstellen, dass der Abwassertank des automatischen Plattenspülers I leer und sein Spülwassertank mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gefüllt ist. Für das manuelle Plattenspülverfahren: • Das Waschpuffer-Konzentrat gut mischen. • 100 ml Waschpuffer-Konzentrat mit 2,9 l destilliertem oder entionisiertem Wasser in dem Spülapparat verdünnen und gut mischen (das Endvolumen sollte 3 l betragen). • Den Behälter zur Verhinderung von Kontamination oder Verdunstung fest verschließen. Nach der Vorbereitung ist der Waschpuffer drei Monate bei 2 - 30 °C stabil. Mit dem neuen Verfallsdatum kennzeichnen. Wenn der Waschpuffer im Kühlschrank aufbewahrt wurde, ist er vor Gebrauch auf 20 - 25 °C zu bringen. Es wird empfohlen, dass der Spülapparat und die Schläuche zur Verhinderung einer möglichen Kontamination durch in Bakterien und Schimmelpilzen vorhandener alkalischer Phosphatase alle drei Monate mit 0,5 % Natriumhypochlorit-Lösung gereinigt und mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gründlich gespült werden. 10 VOLUMINA FÜR GEBRAUCHSFERTIGE REAGENZIEN Nachweisreagenz 1 und Nachweisreagenz 2 UNMITTELBAR VOR GEBRAUCH: Reagenz gründlich mischen, dann das entsprechende Volumen des Nachweisreagenzes 1 oder 2 unter Beachtung des nachstehenden Leitfadens vorschriftsmäßig in einen sauberen Reagenzbehälter abmessen. Zur Kontaminationsverhinderung DÜRFEN diese Reagenzien NICHT mehr in die Originalflaschen zurückgegeben werden. Nicht aufgebrauchtes Material nach Gebrauch verwerfen. Anstelle eines 8-Kanal-Dispensers kann auch ein geeigneter Direktverdrängungssystem-Dispenser verwendet werden. In diesem Fall sollten die unten angegebenen Volumina in ein Polypropylenröhrchen von ausreichender Größe pipettiert werden. Anzahl der Volumen des NachweisTests/Streifen reagenzes 1 oder 2 96/12 Flascheninhalt 72/9 7,0 ml 48/6 5,0 ml 24/3 3,0 ml 1 Test 0,125 ml PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG Im hc2 HPV DNA-Test dürfen nur Zervixproben verwendet werden, die mithilfe des DNAPap Cervical Sampler oder des HC Cervical Sampler™ (beide bestehend aus Zervixbürste und Probentransportmedium STM (Specimen Transport Medium™)) entnommen wurden oder Proben, die mit einem besenähnlichen Entnahmegerät oder einer Bürsten-Spatel-Kombination entnommen und in Cytyc PreservCyt Solution gegeben wurden. Mit anderen Entnahmevorrichtungen entnommene oder in anderen Transportmedien transportierte Proben wurden nicht zur Verwendung mit diesem Assay getestet. Die Leistungsmerkmale dieses Kits wurden ausschließlich auf Grundlage der genannten Kits aufgestellt. Bei Durchführung einer kolposkopischen Untersuchung muss die Entnahme von Zervixproben vor Applikation von Essigsäure oder Jod erfolgen. Weitere Probenentnahme- und Handhabungsverfahren sind der Packungsbeilage für den DNAPap Cervical Sampler bzw. für den HC Cervical Sampler™ zu entnehmen. ZERVIXPROBEN IN STM Die STM-Proben können bis zu 2 Wochen bei Raumtemperatur aufbewahrt und ohne Kühlung zum Testen in das Laboratorium transportiert werden. Die Proben werden mittels eines Kurierdienstes in einem isolierten Behälter entweder über Nacht oder zur Lieferung innerhalb von 2 Tagen versandt. Bei Durchführung des Assays innerhalb einer Woche sind die Proben im Testlaboratorium bei 2 - 8 °C zu lagern. Erfolgt die Durchführung des Assays später als eine Woche, die Proben bis zu 3 Monate bei 20 °C lagern (vor dem Einfrieren siehe ‚Hinweise‘ unter ‚Zervixbiopsien‘). Zur Verzögerung von Bakterienwachstum und zur Stabilisierung der DNA wurde dem Specimen Transport Medium ein Konservierungsmittel zugesetzt. Die Erhaltung der Lebensfähigkeit von Organismen oder Zellen ist jedoch nicht beabsichtigt. ZERVIXBIOPSIEN Frisch entnommene Zervixbiopsien (Querschnitt: 2 - 5 mm) lassen sich auch mit dem hc2 High-RiskHPV-DNA-Test analysieren. Die Biopsieprobe muss sofort in 1,0 ml Specimen Transport Medium gegeben und bei -20 °C eingefroren gelagert werden. Die Biopsieproben können zur Lieferung an das Testlabor über Nacht bei 2 - 30 °C versandt und bis zur Verarbeitung bei -20 °C gelagert werden. Biopsien mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm sind nicht zu verwenden. Hinweise: Um zu verhindern, dass die Verschlussdeckel während des Versands oder der Lagerung im eingefrorenen Zustand abspringen: • • Die Verschlussdeckel vor dem Versand der zuvor eingefrorenen Probenröhrchen mit Parafilm® abdecken. Die Proben können im gefrorenen Zustand oder bei 20 - 25 °C versandt werden. Wenn die Proben zum Testen aus dem Gefrierschrank genommen werden, die Verschlussdeckel sofort durch Schraubdeckel für Probenentnahmeröhrchen ersetzen. 11 ZERVIXPROBEN IN CYTYC PRESERVCYT LÖSUNG Mit einer Entnahmevorrichtung des Besentyps oder der Bürsten-/Spatelkombination entnommene und in Cytyc PreservCyt Lösung gegebene Proben zur Herstellung von ThinPrep® Pap-Test™-Präparaten sind zur Verwendung im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test geeignet. Die Proben sind wie üblich zu entnehmen, und die Vorbereitung der ThinPrep Pap-Test-Präparate erfolgt gemäß den Cytyc-Anleitungen. Für den hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test müssen mindestens 4 ml PreservCyt Lösung übrig bleiben. Proben mit weniger als 4 ml nach Vorbereitung des Pap-Tests könnten gegebenenfalls nicht genügend Material enthalten und im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Proben in PreservCyt-Lösung können bis zu drei Monaten bei Temperaturen zwischen 2 °C und 30 °C, nach Entnahme und vor Verarbeitung für den hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test aufbewahrt werden. Proben in PreservCyt Lösung dürfen nicht eingefroren werden. Informationen zur Verarbeitung dieser Proben finden Sie im Verfahren zur Vorbereitung von PreservCyt-Proben. ZERVIX-PROBEN IN SUREPATH PRESERVATIVE FLUID Nach Standardverfahren gehandhabte Proben in SurePath Preservative Fluid bieten eine Option, um nach High-Risk HPV DNA an der gleichen Probe zu testen, die zur Vorbereitung von Präparaten zur ® zytologischen Untersuchung anhand des TriPath Imaging PrepStain™ Slide Processors verwendet wurde. Zervixproben sollten nach Routineverfahren entnommen und die dünnschichtigen zytologischen Präparate gemäß den Anweisungen des Handbuchs „PrepStain Slide Processor System Operator’s Manual” präpariert werden. TESTVERFAHREN PROBEN KÖNNEN INFEKTIÖSE BESTANDTEILE ENTHALTEN UND SIND ENTSPRECHEND ZU HANDHABEN. Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test kann gemäß den Anweisungen in dieser Packungsbeilage manuell bzw. bei Tests mit großem Probendurchsatz mithilfe des Rapid Capture System–Instruments durchgeführt werden. TESTS MIT GROSSEM PROBENDURCHSATZ MITTELS RAPID CAPTURE SYSTEMGERÄTEANWENDUNG Das Rapid Capture System ist ein universelles automatisches Pipettier- und Verdünnungssystem, das mit dem hc2 HPV DNA -Test bei Tests mit großem Probendurchsatz eingesetzt werden kann. Dieses System verarbeitet bis zu 352 Proben in acht Stunden, wobei eine Zeitspanne von 3,5 Stunden enthalten ist, während der keine Benutzerintervention erforderlich ist; bis zu 704 Probeergebnisse können so binnen 13 Stunden bereit gestellt werden. Die testvorbereitende Denaturierung der Proben wird unabhängig vom RCS im Hauptprobeentnahmeröhrchen durchgeführt, wie es für die manuelle Methode des hc2 HighRisk-HPV-DNA-Tests weiter unten beschrieben wird, bevor die Proben auf die RCS-Plattform aufgetragen werden. Außerdem erfolgt der Chemilumineszenzsignalnachweis und die Ergebnisberichterstattung mittels des Offline-Luminometersystems [Digene Microplate Luminometer 2000 (DML 2000TM) Instrument], das sowohl der manuellen Methode als auch der RCS-Methode eigen ist. Die Verfahrensschritte des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests werden in exakt derselben Abfolge wie jene beim manuellen Testverfahren ausgeführt. Die RCS-Anwendung ermöglicht eine gestaffelte Verarbeitung von bis zu 4 Mikrotiterplatten, die Proben und die erforderlichen Kalibratoren und Qualitätskontrollen enthalten. . Die für die Benutzung des Rapid Capture System erforderliche verfahrensbezogene Beschreibung befindet sich im Benutzer-Anwendungshandbuch zum Rapid Capture System, das zusammen mit dem Instrument und zusätzlich zu dieser Packungsbeilage geliefert wird. VORBEREITUNG 1. Wird der Mikrotiterplatten-Inkubator I verwendet, sollte er vom Kaltstart an mindestens 60 Minuten bis auf 65 ±2 °C äquilibriert werden. Nähere Einzelheiten sind in den Bedienungsanleitungen für den Mikrotiterplatten-Inkubator I zu finden. 12 2. Darauf achten, dass das Wasserbad auf 65 °C beheizt und der Wasserspiegel zum Eintauchen des gesamten Volumens in den Probenröhrchen hoch genug ist. 3. Die Proben herausnehmen, und alle erforderlichen Reagenzien vor Beginn des Assays aus dem Kühlschrank nehmen. Die Reagenzien in 15 bis 30 Minuten auf 20 - 25 °C bringen. Hinweis: PreservCyt- und SurePath-Proben vorbereiten, bevor bereits denaturierte Proben oder Kitreagenzien auf Raumtemperatur äquilibriert werden. 4. Mit Hilfe der Digene Hybrid Capture System-Software, Version 2 (DHCS V.2), oder der Digene Qualitative Software eine Plattenanordnung erstellen. Nähere Einzelheiten zur Erstellung von Plattenanordnungen sind den entsprechenden Software-Gebrauchsanweisungen zu entnehmen. 5. Zu testende Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben in der gleichen Reihenfolge, in der sie getestet werden, in ein Teströhrchengestell bringen. Der Negativkalibrator und der High-RiskHPV-Kalibrator sind ZUERST zu testen. Negativkalibrator (NC), High-Risk-HPV-Kalibrator (HRC), Low-Risk-Qualitätskontrolle (QC1-LR), High-Risk-Qualitätskontrolle (QC2-HR) und Proben sollten in einer Spalte mit 8-Mikrotiterplatten-Vertiefungen angeordnet laufen. Siehe Beispielhafte Anordnung nachstehend. Beispielhafte Anordnung für einen Durchlauf mit 24 Mikrotiterplatten-Vertiefungen: Spalte Reihe 1 2 3 NC Probe 1 Probe 9 A NC Probe 2 Probe 10 B NC Probe 3 Probe 11 C HRC Probe 4 Probe 12 D HRC Probe 5 Probe 13 E HRC Probe 6 Probe 14 F QC1-LR Probe 7 Probe 15 G QC2-HR Probe 8 Probe 16 H 6. Die NC und der HRC werden in Dreifachbestimmung und die QC1-LR und QC2-HR mit der HighRisk-HPV-Sondenmischung in Einzelbestimmung getestet. Die Digene-Software bestimmt die Kalibrator- und Qualitätskontrollpositionen in der Mikrotiterplatte. Zum vorschriftsmäßigen Kalibrator-/Qualitätskontroll-/Proben-Setup in der Software ist die Gebrauchsanweisung für das DML 2000 Instrument und die Software, Version 2, sowie das interaktive Bedienerhandbuch für die Digene Hybrid Capture System, Version 2 (DHCS V.2) bzw. die Gebrauchsanweisung für die Digene Qualitative Software einzusehen. DENATURIERUNG Hinweise: • Vorsicht: Das Denaturierungsreagenz ist ätzend. Bei der Handhabung vorsichtig vorgehen und ungepuderte Handschuhe tragen. • Wichtig: Einige Zervixproben können Blut oder anderes biologisches Material enthalten, welche nach Zufügen des Denaturierungsreagenzes gegebenenfalls die Farbumschläge maskieren können. Proben, die vor Zufügen des Denaturierungsreagenzes eine dunkle Farbe aufweisen, könnten bei diesem Schritt möglicherweise keinen vorschriftsmäßigen Farbumschlag ergeben. In den Fällen, in denen kein vorschriftsmäßiger Farbumschlag auftritt, werden die Ergebnisse dieses Assays nicht negativ beeinflusst. Vorschriftsmäßiges Mischen kann durch Beobachtung des Farbumschlags der Kontrollen und Kalibratoren bestätigt werden. • Während der Denaturierungs- und Hybridisierungsschritte ist darauf zu achten, dass der Wasserspiegel im Wasserbad zum Eintauchen des gesamten Probenvolumens in dem Röhrchen ausreichend ist. • Die Kalibratoren, Kontrollen und Proben können bis zum Denaturierungsschritt vorbereitet und über Nacht bei 2 - 8 °C oder bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden. Maximal können 3 Gefrier-/Auftauzyklen in maximal 2 Stunden bei Raumtemperatur während jedem Auftauzyklus durchgeführt werden. Vor Gebrauch gut mischen. 26 • Nach der Denaturierung und Inkubation werden die Proben nicht mehr als infektiös angesehen. Das Laborpersonal sollte jedoch jederzeit die nationalen/lokalen Vorsichtsmaßnahmen beachten. 13 • • Die Probenentnahmevorrichtung darf vor der Denaturierung nicht entfernt werden. Zur Vermeidung falsch-positiver Ergebnisse ist es wichtig, dass das gesamte Kalibrator-, Qualitätskontroll- und STM-Probenmaterial mit dem Denaturierungsreagenz in Berührung kommt. Ein weiterer kritischer Schritt ist das Mischen nach Zugabe des Denaturierungsreagenzes: Es ist darauf zu achten, dass der Multi-Speciman Tube Vortexer auf 100 (maximale Geschwindigkeit) eingestellt ist und während des Mischens ein sichtbarer Flüssigkeitswirbel dergestalt beobachtet wird, dass die Flüssigkeit die gesamte Innenfläche des Röhrchens bespült. Bei Durchführung von manuellem Vortexen sicherstellen, dass jeder Kalibrator, jede Qualitätskontrolle und Probe jeweils mindestens 5 Sekunden bei voller Geschwindigkeit mittels Vortexen individuell gemischt werden, damit der Flüssigkeitswirbel die gesamte Innenfläche des Röhrchens bespült, gefolgt von einmaligem Invertieren des Röhrchens. Verfahren zur Vorbereitung von Kalibratoren, Qualitätskontrollen und STM-Proben 1. Die Verschlussdeckel von Kalibrator, Qualitätskontrollen und STM-Probenröhrchen abnehmen und verwerfen. Hinweis: Von Probenröhrchen entfernte Verschlusskappen sind als potentiell infektiös zu betrachten. Sie sind gemäß den nationalen/lokalen Bestimmungen zu entsorgen. 2. Das Denaturierungsreagenz mit dem Indikator-Farbstoff mit Hilfe eines Direktverdrängungssystem- oder einstellbaren Dispensers in jeden Kalibrator, jede Kontrolle oder STM-Probe pipettieren. Darauf achten, dass die Seiten des Röhrchens nicht berührt werden, um das Auftreten einer Kreuzkontamination der Proben zu verhindern. Das Volumen des benötigten Denaturierungsreagenzes entspricht der Hälfte des Probenvolumens. Das genaue Volumen für jeden Kalibrator-, Qualitätskontroll- und Probentyp ist in der nachstehenden Tabelle aufgelistet. Das restliche Denaturierungsreagenz in der Flasche vor der Entsorgung gemäß nationaler/lokaler Laboratoriumsverfahren verdünnen. Kalibrator, Qualitätskontrolle oder Probe Negativkalibrator High-Risk-HPV-Calibrator Low-Risk- oder High-Risk-Qualitätskontrollen Zervixprobe Erforderliche Volumina des Denaturierungsreagenzes 1000 µl 500 µl* 500 µl* 500 µl* 3. Die Proben unter Verwendung eines der beiden nachstehenden Verfahren mischen. Hinweis: Der MST-Vortexer I darf nur mit Proben in Specimen Transport Medium (STM) verwendet werden, die mit dem DNAPap Cervical Sampler oder dem HC Cervical Sampler entnommen wurden. Proben in PreservCyt Solution müssen gemäß den unten stehenden Anweisungen bearbeitet werden (siehe Verfahren zur Vorbereitung von PreservCyt-Proben). Vortexverfahren mit Multi-Specimen Tubes (MST) Hinweis: • Mit dem MST-Vortexer I gemischte DNAPap bzw. HC Cervical Sampler-Proben müssen unter Verwendung des Hybridisierungsmikrotiterplatten- und des Mikrotiterplatteninkubator-IVerfahrens hybridisiert werden. a) Die Kalibrator- Qualitätskontroll- und STM-Probenröhrchen mit DuraSeal® Abdeckungsfolie abdecken, indem die Folie über die Röhrchen in dem Gestell gezogen wird. b) Die Gestellabdeckung über die mit Folie abgedeckten Röhrchen bringen und mit den beiden Seitenclips sicher befestigen. Die Folie mit der Schneidevorrichtung zurechtschneiden. c) Das Gestell auf den Multi-Specimen Tube Vortexer stellen, und das Gestell mit der Klemme befestigen. Verifizieren, dass sich die Geschwindigkeitseinstellung bei 100 (maximale 14 Geschwindigkeit) befindet und den Schalter des Vortexer in die „EIN“-Stellung drehen. Die Röhrchen 10 Sekunden vortexen. Manuelles Vortexverfahren von individuellen Röhrchen a) Die Kalibrator-, Qualitätskontroll- und STM-Probenröhrchen mit sauberen Schraubdeckeln für die Probenentnahmeröhrchen wieder verschließen. b) Jedes Röhrchen durch individuelles Vortexen 5 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit gründlich mischen. c) Jedes Probenröhrchen zum Bespülen der Innenseite des Röhrchens, des Verschlussdeckels und des Randes einmal invertieren. d) Das Röhrchen wieder in das Gestell stellen. Unabhängig von dem verwendeten Vortexverfahren muss ein sichtbarer Flüssigkeitswirbel auf der Innenseite eines jeden Röhrchens während des Mischens dergestalt sichtbar sein, dass die Flüssigkeit die gesamte Innenfläche des Röhrchens bespült. Die Farbe der Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben sollte nach purpurrot umschlagen. 4. Die Röhrchen in dem Gestell in einem Wasserbad bei 65 ±2 °C 45 ±5 Minuten inkubieren (denaturierte Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben können sofort getestet oder wie in den vorstehenden Hinweisen beschrieben gelagert werden). Die High-Risk-HPV-Sondenmischung während dieser Inkubation vorbereiten. Siehe Abschnitt Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien. Verfahren zur Vorbereitung von PreservCyt Solution-Proben Hinweise: • Entnehmen Sie alle Einzelheiten der Packungsbeilage des hc2-Probenkonversionskits • Die Verarbeitung eines 4-ml-Aliquots der PreservCyt Solution ergibt genug Lösung für zwei Tests, wenn manuell getestet wird. 4 ml ist das kleinste Volumen, das verarbeitet werden kann. • Die PreservCyt Solution in Chargen von 36 oder weniger zubereiten; sonst können sich die Pellets beim Abdekantieren des Überstands verschieben. Dies ist wichtig, damit beim Abdekantieren die vollständigen Zellpellets erhalten bleiben. Mit der Vorbereitung zusätzlicher PreservCyt Solution Gefäße erst dann beginnen, wenn die Vorbereitung der ersten Charge beendet ist. Vorbereitung der Reagenzien Verwenden Sie entweder das mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test mitgelieferte Denaturierungsreagenz (DNR) (siehe Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien) oder das mit dem hc2-Probenkonversionskit mitgelieferte DNR. Zur Vorbereitung des mit dem hc2-Probenkonversionskit gelieferten DNR 3 Tropfen Indikatorfarbstoff in die DNR-Flasche geben und gründlich mischen. Die Flüssigkeit sollte eine gleichmäßige, dunkle purpurrote Farbe aufweisen. Erforderliches Volumen mithilfe von Tabelle 1 bestimmen. Tabelle 1. Erforderliche Mengen: Vorbereitung der Reagenzien. Anzahl der Tests Volumen der Volumen des PreservCyt Konversionspuffe Solution rs 1-2 4 ml 0,4 ml 3 6 ml 0,6 ml 4 8 ml 0,8 ml 5 10 ml 1,0 ml 6 12 ml 1,2 ml 15 1. Ein hc2-Probenkonversionsröhrchen, ein konisches 10-ml-Sarstedt-Röhrchen oder ein 15-ml-VWRoder Corning-Röhrchen mit der entsprechenden Probenidentifikationsnummer beschriften. 2. Nur eine Probe auf einmal verarbeiten: a. PreservCyt-Gefäß kräftig von Hand schütteln, bis die Zellen homogen verteilt sind. b. Da sich die Zellen schnell absetzen, sofort das entsprechende Volumen der PreservCyt-Probe in das beschriftete Röhrchen pipettieren. Die PreservCyt Solution ganz unten in ein konisches Röhrchen geben, damit möglichst wenig Zellmaterial an den Wänden haften bleibt. 3. Jedem Röhrchen das entsprechende Volumen Probenkonversionspuffer zufügen (siehe Tabelle 1). 4. Röhrchen wieder verschließen und den Inhalt mit einem Vortex-Mischer mit Zusatzschale mischen. Hinweis: Das Verfahren mit dem MST-Vortexer 2 wurde nicht zum Vortexen von Proben in PreservCyt Solution mit Probenkonversionspuffer vor der Zentrifugation validiert und darf daher für diesen Schritt nicht benutzt werden. 5. Röhrchen im Ausschwingrotor 15 ±2 Minuten bei 2900 ±150 U/min. zentrifugieren. 6. Während der Zentrifugation Mischung aus Probentransportmedium und Denaturierungsreagenz (STM/DNR) gemäß Tabelle 2 im Verhältnis 2:1 vorbereiten. Hinweis: Die STM/DNR-Mischung muss an jedem Testtag frisch zubereitet werden. a. Zur Berechnung des Gesamtvolumens der benötigten STM/DNR-Mischung Ausgangsvolumen der Probe in PreservCyt Solution als Anhaltspunkt nehmen und dann die STM- und DNR- Volumina „pro Röhrchen“ mit der Anzahl der zu testenden Proben multiplizieren (siehe Tabelle 2). Tabelle 2. Erforderliche Mengen: STM/DNR Ins Röhrchen STM-Volumen pro DNR-Volumen pro Röhrchen für gegebene Röhrchen für endgültige STM/DNRendgültige STM/DNRMischung STM/DNR* Mischung* Mischung 1-2 4 ml 120 µl 60 µl 150 µl 3 6 ml 170 µl 85 µl 225 µl 4 8 ml 220 µl 110 µl 300 µl 5 10 ml 270 µl 135 µl 375 µl 6 12 ml 320 µl 160 µl 450 µl *Die in diesen Spalten aufgelisteten Mengen dürfen den Probenröhrchen nicht direkt zugegeben werden Anzahl Tests Volumen der PreservCyt Solution b. Lösung gründlich mit dem Vortexer mischen. 7. Röhrchen einzeln aus der Zentrifuge nehmen und in einen Halter oder ein Konversionsgestell stellen. In jedem Röhrchen sollte am Grund ein pink-/orangefarbenes Pellet zu sehen sein. Hinweis: Proben, die nach dem Zentrifugieren kein sichtbares Pellet aufweisen, können nicht für den Test verwendet und müssen verworfen werden. 8. Individuelle Handhabung der Proben: a. Verschlusskappe entfernen und auf ein sauberes, fusselfreies Papiertuch legen. b. Überstand sorgfältig abdekantieren. c. Röhrchen in ungekehrter Position halten und vorsichtig (ungefähr sechsmal) auf absorbierenden, fusselfreien Papiertüchern abtupfen, bis keine Flüssigkeit mehr aus dem Röhrchen tropft. Jedes Mal eine saubere Stelle auf dem Papiertuch benutzen. Das Pellet darf während des Abtupfens nicht am Röhrchen herabrutschen. d. Hinweise: • Nicht mehrmals auf dieselbe Stelle des absorbierenden, fusselfreien Papiertuchs tupfen. • Es ist wichtig, dass die höchstmögliche Menge an PreservCyt durch Abtupfen entfernt wird. Aber es ist normal, wenn nach dem Abtupfen noch ein Rest an PreservCyt-Lösung zu sehen ist. Röhrchen in einen Halter oder ins Konversionsgestell stellen. 16 MISCHEN UND DENATURIEREN Manuelles Vortexverfahren 1. Zu jedem Pellet entsprechende Menge STM/DNR-Lösung geben (siehe Tabelle 2). Jedes Röhrchen wieder verschließen und einzeln auf dem Vortexer mindestens 30 Sekunden lang auf der höchsten Geschwindigkeitsstufe resuspendieren. Wenn sich ein Pellet schwer suspendieren lässt, nochmals 10 - 30 Sekunden oder solange, bis das Pellet sich vom Röhrchengrund löst, mischen. Wenn sich das Pellet nach erneutem Mischen (insgesamt maximal 2 Minuten) immer noch nicht ablöst, Probenkennnummer notieren und zum nächsten Schritt übergehen. 2. Röhrchen in ein Gestell stellen. 3. Gestell 15 ±2 Minuten in ein 65 ±2°C warmes Wasserbad stellen. Dabei ist darauf zu achten, dass der Wasserspiegel im Wasserbad zum Eintauchen des gesamten Probenvolumens in den Röhrchen ausreichend ist. 4. Gestell mit Proben aus dem Wasserbad nehmen und Proben einzeln auf dem Vortexer 15 - 30 Sekunden mischen. Hinweis: Überprüfen, dass zu diesem Zeitpunkt alle Pellets vollständig resuspendiert sind. Proben, die noch immer sichtbare Pellets aufweisen, sind für den Test ungeeignet und müssen verworfen werden. 5. Gestell ins 65 ±2°C warme Wasserbad zurückstellen und Denaturierung 30 ±3 Minuten fortsetzen. 6. Zur unten beschriebenen Hybridisierung übergehen oder siehe Optionaler Haltepunkt für die Aufbewahrung und Behandlung denaturierter Proben. Vortexer 2-Verfahren mit Multi-Specimen Tubes (MST) Hinweise: • • • • • Das Vortexer 2-Verfahren mit Multi-Specimen Tubes (MST) ist für die Behandlung von Proben in PreservCyt Solution nach dem Zentrifugieren und Abdekantieren des Überstands validiert. Für die Behandlung von Proben in PreservCyt Solution ist nur der MST Vortexer 2 geeignet. Der MultiSpecimen Tube (MST) Vortexer 1 ist für die Behandlung von Proben in PreservCyt-Lösung ungeeignet, weil er mit dem Konversionsgestell und der Abdeckung nicht kompatibel ist. Daher darf das Konversionsgestell nicht mit dem MST Vortexer I benutzt werden. Das Konversionsgestell und die Abdeckung wurden speziell zur Aufnahme von hc2Probenkonversionsröhrchen (VWR oder Corning, konische 15-ml-Röhrchen) entwickelt. Der Nutzer sollte nur einen Röhrchentyp zur selben Zeit verwenden. Andere Marken wurden nicht für den Gebrauch validiert. Die spezifizierten Mischzeiten für Konversionsgestell und Abdeckung sind genau einzuhalten. Konversionsgestell und Abdeckung können nicht zum Mischen der Kalibratoren oder Qualitätskontrollen des hc2-DNA-Testkits verwendet werden. Beim Gebrauch von Konversionsgestell und Abdeckung verhindert die Höhe der STM-Röhrchen das richtige Vortexen. 1. Jedes beschriftete konische 15-ml-Röhrchen abtupfen und dann an seine Position ins Konversionsgestell stellen. 2. Jedem Pellet das richtige Volumen an STM/DNR-Mischung hinzufügen (Tabelle 2) 3. Die konischen 15-ml-Röhrchen mit DuraSeal Verschlussfolie abdecken, indem die Folie über die Röhrchen in dem Gestell gezogen wird. 4. Die Gestellabdeckung über die mit Folie abgedeckten Röhrchen bringen und mit den beiden Seitenclips sicher befestigen. Die Folie mithilfe der Schneidevorrichtung zurechtschneiden, nachdem die Abdeckung sicher befestigt wurde. 5. Den Hebel mit rotem Griff in die waagerechte Position bringen. 6. Konversionsgestell und Abdeckung auf den MST Vortexer 2 stellen, so dass sich die größte abgeschrägte Ecke des Konversionsgestells in der vorderen rechten Ecke befindet. Gestell und Abdeckung so auf der Plattform des MST Vortexer 2 positionieren, dass es sicher in den Schienen sitzt. Gestell befestigen, indem der Hebel mit rotem Griff nach unten in die senkrechte Position bewegt wird. Dadurch wird das Gestell festgehalten. 7. Vergewissern Sie sich, dass die Geschwindigkeit auf 100 (maximale Geschwindigkeit) eingestellt ist und bringen Sie den Kippschalter des Pulsers auf Position „AUS“. 8. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „EIN“. Die Röhrchen 30 Sekunden vortexen. 17 9. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „AUS“. 10. Entfernen Sie Konversionsgestell und Abdeckung vom MST Vortexer 2, indem Sie den Hebel mit rotem Griff anheben. 11. Das Gestell in einem Wasserbad bei 65 ±2°C 15 ±2 Minuten inkubieren. Dabei ist darauf zu achten, dass der Wasserspiegel im Wasserbad zum Eintauchen des gesamten Probenvolumens in den Röhrchen ausreichend ist. 12. Nach 15-minütiger Inkubation Gestell mit den Röhrchen aus dem Wasserbad nehmen. 13. Zur Vermeidung von Spritzern überschüssiges Wasser am Gestell abtrocknen, bevor dieses auf den MST Vortexer 2 gestellt wird. 14. Konversionsgestell und Abdeckung auf dem MST Vortexer 2 wie in Schritt 6 beschrieben befestigen. 15. Vergewissern Sie sich, dass die Geschwindigkeit auf 100 (maximale Geschwindigkeit) eingestellt ist und bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „EIN“. Die Röhrchen 1 Minute vortexen. 16. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „AUS“ Hinweis: Bei dem Verfahren mit dem MST Vortexer 2 sind Mischgeschwindigkeit, Zeiten und Verfahren standardisiert. Daher ist keine visuelle Kontrolle auf Zellpellets erforderlich, wie es beim manuellen Vortexverfahren der Fall ist. 17. Stellen Sie das Gestell erneut ins Wasserbad und setzen Sie die Denaturierung bei 65 ±2°C 30 ±3 Minuten fort. 18. Gestell aus dem Wasserbad nehmen, abtrocknen und auf dem Vortexer befestigen. 19. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „EIN“. 10 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. 20. Bringen Sie den Vortexer-Schalter auf Position „AUS“. Gestell entfernen. 21. Sofort Gestellabdeckung abnehmen und DuraSeal Verschlussfolie von den Proben entfernen. 22. Zur unten beschriebenen Hybridisierung übergehen, oder siehe Optionaler Haltepunkt für die Lagerung und Behandlung denaturierter Proben. Vorbereitungsverfahren für SurePath Proben Nach der zytologischen Analyse können SurePath-Proben bis zu 4 Wochen bei 2-30ºC aufbewahrt werden. Nach zytologischem Verfahren folgendermaßen vorgehen: 1. Sicherstellen, dass Proben auf Raumtemperatur äquilibriert werden und das Flüssigkeitsvolumen ca. 2,8 ml beträgt. VORSICHT: Wenn die Probe weniger als 1ml Flüssigkeit enthält, ist es möglich, dass nach der zytologischen Vorbereitung SurePath Preservative Fluid nicht hinzugefügt wurde. Die Probe ist in dem Fall NICHT geeignet für einen High-Risk HPV DNA-Test. 2. Die Probe im Ausschwingrotor 10 ± 1 Minuten bei 800 ± 15 x g zentrifugieren. 3. Die Röhrchen aus der Zentrifuge nehmen. 4. Den Überstand sofort nach der Zentrifugation sorgfältig abdekantieren und Röhrchen vorsichtig (ungefähr dreimmal) auf absorbierenden, fusselfreien Papiertüchern abtupfen, bis keine Flüssigkeit mehr aus dem Röhrchen tropft. In jedem Röhrchen sollte ein Pellet zu sehen sein. Das Pellet darf während des Abtupfens nicht am Röhrchen herabrutschen. 5. Röhrchen in den Halter stellen. 6. Zu jedem Pellet 200 μl hc2 Specimen Transport Medium (STM) mittels eines Direktverdrängungssystem- oder einstellbaren Dispensers geben. Hinweis: Röhrchen können ohne Verschlusskappe gemischt werden. 7. Jedes Röhrchen einzeln auf dem Vortexer 15 Sekunden lang auf der höchsten Geschwindigkeitsstufe resuspendieren. Wenn sich ein Pellet schwer suspendieren lässt, nochmals 5 - 30 Sekunden oder solange, bis das Pellet sich vom Röhrchengrund löst, mischen. 8. In jede Probe mittels eines Direktverdrängungssystem- oder einstellbaren Dispensers 100 μl vorbereitetes Denaturierungsreagenz (mit Indikatorfarbstoff) pipettieren. 18 VORSICHT: Darauf achten, dass die Seiten des Röhrchens nicht berührt werden, um das Auftreten einer Kreuzkontamination zu verhindern. Das restliche Denaturierungsreagenz in der Flasche vor der Entsorgung gemäß nationaler/lokaler Laborverfahren verdünnen. 9. Jedes Röhrchen durch individuelles Vortexen 5 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit gründlich mischen. Hinweis: Röhrchen können ohne Verschlusskappe gemischt werden. Das konische 15-ml Röhrchen mit der entsprechenden Probenidentifizierung kennzeichen (Bsp.: „SP” für den Probentyp SurePath) und in den Halter zurückstellen. Hinweis: Bei Verwendung des QIAGEN Rapid Capture® Systems zur halbautomatischen Probenverarbeitung müssen konische 15-ml Röhrchen des Typs VWR or Corning® verwendet werden, um eine korrekte Platzierung im Digene Konversionsgestell (silbernes Gestell) zu gewährleisten. 10. Das Volumen des gesamten Röhrchens anhand einer 7-ml standard-tipped Transferpipette (oder entsprechenden Pipette) in ein konisches 15-ml Röhrchen mit Drehverschluss transferierenfn. Die 1 konischen 15-ml Röhrchen verschließen . 11. 90 ± 5 Minuten in einem Wasserbad von 65 ± 2°C inkubieren. VORSICHT: Diese Inkubationszeit ist länger als die für andere genehmigte Probentypen erforderliche Inkubationszeit. 12. Wird ein HPV-Test am selben Tag durchgeführt, hc2 High-Risk Kalibratoren 45 Minuten in einem Wasserbad von 65ºC gemäß der hc2 HPV DNA Testanweisungen denaturieren. 13. Probengestell aus dem Wasserbad nehmen. Optionaler Haltepunkt Nach der Denaturierung können STM-Proben und konvertierte PreservCyt- und SurePath-Proben bei 2 8°C über Nacht oder bei -20°C bis zu drei Monaten aufbewahrt werden. Über Nacht können die Proben im Konversionsgestell gekühlt werden. Die DuraSeal Verschlussfolie und die Abdeckung müssen dann wieder angebracht werden. Vor der Lagerung bei -20°C müssen Abdeckung und DuraSeal Verschlussfolie entfernt und die Röhrchen mit Deckeln verschlossen werden. In beiden Fällen müssen die Proben vor der Hybridisierung auf 20 - 25°C äquilibriert und sorgfältig gemischt werden. Hinweis: Denaturierte Proben nicht auf Trockeneis aufbewahren oder versenden. Die Proben können maximal dreimal eingefroren/aufgetaut werden und dürfen zwischen den Tauzyklen maximal 2 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. HYBRIDISIERUNG Hinweise: • • • 1 Die High-Risk-HPV-Sondenmischung ist viskos. Gründliches Mischen ist wichtig; darauf achten, dass in jedes Mikroröhrchen bzw. jede Mikrotiterplatten-Vertiefung die erforderliche Menge vollständig abgegeben wird. Siehe Abschnitt Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien. Wenn die denaturierte Probe bei -20°C gelagert wurde, muss sie zum Auftauen auf 20 -25°C gebracht und vor der Hybridisierung gründlich gevortext werden. Den Mikrotiterplatteninkubator I 60 Minuten vor Gebrauch auf 65 +2° C vorwärmen. Weitere Einzelheiten sind bei Bedarf in den Bedienungsanweisungen für den Mikrotiterplatteninkubator I zu finden. Bei den bei QIAGEN zur Verifizierung durchgeführten Tests wurden konische 15-ml-Teströhrchen der Marke VWR verwendet. 19 Hybridisierungsverfahren mittels Hybridisierungsplatte und Mikrotiterplatteninkubator I Hinweis: Mit dem DNAPap Cervical Sampler oder dem HC Cervical Sampler in Specimen Transport Medium (STM) entnommene und mit dem MST Vortexverfahren verarbeitete Proben dürfen nur mittels des Mikrotiterplatteninkubator I-Verfahrens hybridisiert werden. 1. Eine Mikrotiterplatte zur Hybridisierung nehmen und beschriften. 2. Die Kontrollen, Kalibratoren und Proben nach der Inkubation aus dem Wasserbad nehmen. Bei Verwendung des Multi-Specimen Tube Vortexers das gesamte Gestell mit STM-Proben mindestens 5 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeitseinstellung vortexen. Wenn sich die Proben in PreservCyt Solution befinden, das gesamte Konversionsgestell mindestens 10 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeitseinstellung vortexen. Als Alternative kann jedes Röhrchen mindestens 5 Sekunden individuell gevortext werden. 3. Jeweils 75 µl Kontrolle, Kalibrator oder Probe unter Beachtung der unter Vorbereitung erstellten Plattenanordnung unten auf den Boden einer leeren Vertiefung einer Mikrotiterplatte zur Hybridisierung pipettieren. Dabei nicht die Seiten der Vertiefungen berühren und möglichst die Bildung von Luftbläschen verhindern. Zur Vermeidung einer Kreuzkontamination von Kontrollen, Kalibratoren oder Proben ist für jeden Transfer eine saubere, extralange Pipettenspitze zu verwenden. Das Entfernen der Probenentnahmevorrichtung aus dem Probentransportröhrchen ist nicht notwendig. Denaturierte Proben können mit den Schraubdeckeln für die Probenentnahmeröhrchen verschlossen und gelagert werden, wobei die Probenentnahmevorrichtungen in den Röhrchen bleiben. Denaturierte PreservCyt-Proben können mit Ihren Originaldeckeln verschlossen werden. Hinweis: Falsch-positive Ergebnisse können auftreten, wenn die Proben-Aliquoten nicht sorgfältig überführt werden. Während der Probenüberführung darf die Pipettenspitze bei der Entnahme von 75 µl Aliquot die Innenseite des Röhrchens nicht berühren. 4. Nach dem Überführen der letzten Probe die Platte mit einer Plattenabdeckung verschließen und die Mikrotiterplatte zur Hybridisierung 10 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. 5. Die vorbereitete und gründlich gevortexte High-Risk-HPV-Sondenmischung in einen EinwegReagenzbehälter aliquotieren. Mit einem 8-Kanal-Dispenser und frischen Spitzen für jede Reihe in jeweils jede die Kontrolle, Kalibratoren und Proben enthaltende Vertiefung der Mikrotiterplatte zur Hybridisierung sorgfältig 25 µl der High-Risk-HPV-Sondenmischung pipettieren. In jede Hybridisierungsvertiefung ohne Verspritzen das Sondenvolumen abgeben. Dabei dürfen die Seiten der Vertiefungen nicht berührt werden. 6. Die Mikrotiterplatte zur Hybridisierung mit einem Plattendeckel abdecken und auf einem auf 1100 ±100 U/min eingestellten Hybrid Capture System-Kreisschüttler I 3 ±2 Minuten schütteln. Die Kontrollen, Kalibratoren und Proben sollten nach dem Schütteln nach gelb umschlagen. Vertiefungen, die purpurrot bleiben, haben nicht die vorschriftsmäßige Menge der Sondenmischung erhalten. Den purpurrot gebliebenen Proben zusätzliche 25 µl der Sondenmischung zufügen und erneut schütteln. Wenn die Vertiefungen nach erneuter Zugabe purpurrot bleiben, müssen die Proben erneut getestet werden. Hinweise: • Nach dem Schütteln sollten die Proben in der PreservCyt-Lösung anstelle von gelb nach rosa umschlagen. • Wenn die Mikrotiterplatte zur Hybridisierung in den Mikrotiterplatteninkubator I gebracht wird, ist darauf zu achten, dass kein Material verspritzt wird. 7. Hybridisierungsmikrotiterplatte in einem auf 65 ±2 °C vorgewärmten und äquilibrierten Mikrotiterplatteninkubator I 60 ±5 Minuten inkubieren. Hybridisierungsverfahren mittels Mikroröhrchen und Wasserbad Hinweise: • Die Verarbeitung der mit dem HC Cervical Sampler in Specimen Transport Medium (STM) entnommenen Proben mit Hilfe des MST-Vortexverfahrens zum Mischen und des Wasserbadverfahrens zur Hybridisierung wurde nicht validiert. Mit dem DNAPap oder HC 20 Cervical Sampler in STM entnommene und mittels des MST-Vortexverfahrens verarbeitete Proben dürfen nur mit dem Mikrotiterplatteninkubator I-Verfahren hybridisiert werden. • Wenn die denaturierte Probe bei -20 °C gelagert wurde, muss die Probe zum Auftauen auf 20 - 25 °C gebracht und vor der Weiterverarbeitung in der Hybridisierung gründlich gevortext werden. 1. Kennzeichnen und die erforderliche Anzahl sauberer Hybridisierungsmikroröhrchen in das Mikroröhrchengestell geben. 2. Die Kontrollen, Kalibratoren und Proben nach der Inkubation aus dem Wasserbad nehmen. Jedes Röhrchen unmittelbar vor der Entnahme von Aliquoten individuell mindestens 5 Sekunden vortexen. 3. Nach der unter Vorbereitung erstellten Plattenanordnung jeweils 75 µl Kontrolle, Kalibrator oder Probe auf den Boden des entsprechenden Hybridisierungsmikroröhrchens pipettieren. Dabei die Seiten des Mikroröhrchens nicht berühren und die Bildung von Luftbläschen möglichst verhindern. Zur Vermeidung einer Kreuzkontamination von Kontrollen, Kalibratoren oder Proben für jeden Transfer eine saubere, extralange Pipettenspitze verwenden. Das Entfernen der Probenentnahmevorrichtung aus dem Probentransportröhrchen ist nicht notwendig. Denaturierte Proben können mit den Schraubdeckeln für die Probenentnahmeröhrchen verschlossen und gelagert werden, indem die Probenentnahmevorrichtungen in den Röhrchen bleiben 4. Nach dem Überführen der letzten Probe die Mikroröhrchen zur Hybridisierung 10 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. 5. Die vorbereitete und gründlich gevortexte Sondenmischung in einen Einweg-Reagenzbehälter aliquotieren. Mit einem 8-Kanal-Dispenser und frischen Spitzen für jede Reihe in jedes die Kontrollen, Kalibratoren und Proben enthaltende Mikroröhrchen sorgfältig 25 µl der Sondenmischung pipettieren. In jedes Hybridisierungsmikroröhrchen ohne Verspritzen das Sondenmischungsvolumen abgeben. Dabei dürfen die Seiten der Röhrchen nicht berührt werden. Das Gestell zur Verifizierung, dass alle Röhrchen die entsprechende Sondenmenge erhalten haben, von unten prüfen. 6. Die Mikroröhrchen mit einer Plattenabdeckung abdecken. Die Gestellabdeckung oben auf das Gestell geben. Das Mikroröhrchengestell auf einem bei 1100 ±100 U/min eingestellten Kreisschüttler I 3 ±2 Minuten schütteln. Die Kontrollen, Kalibratoren und Proben sollten nach dem Schütteln nach gelb umschlagen. Röhrchen, die purpurrot bleiben, haben nicht die vorschriftsmäßige Menge der Sondenmischung erhalten. Den purpurrot gebliebenen Proben zusätzlich 25 µl der Sondenmischung zufügen und erneut schütteln. Wenn die Röhrchen nach erneuter Zugabe purpurrot bleiben, sind die Proben erneut zu testen. Hinweis: Nach dem Schütteln sollten die Proben in der PreservCyt-Lösung von gelb nach rosa umschlagen. 7. Das Mikroröhrchengestell in einem auf 65 ±2 °C vorgewärmten Wasserbad 60 ±5 Minuten inkubieren. Sicherstellen, dass der Wasserspiegel in dem Wasserbad zur Bedeckung des gesamten Volumens des Hybridisierungsgemischs ausreichend ist. Das Mikroröhrchengestell schwimmt dann im Wasserbad. Hinweis: Mit der DHCS-Software, V.2 oder Digene Qualitative Software eine Plattenanordnungsdatei erstellen, sofern dies nicht bereits früher vorgenommen wurde. HYBRID CAPTURE 1. Alle, außer der erforderlichen Anzahl der Capture-Mikroplatten-Vertiefungen, aus der Platte herausnehmen. Nicht gebrauchte Mikrotiterplatten-Vertiefungen in den Originalbeutel zurückgeben und wieder verschließen. Die Spalten mit einem Markierungsstift mit 1, 2, 3. . . nummerieren, und die Mikroplatte mit dem entsprechenden Kennzeichen beschriften. Die Proben werden den Vertiefungen nach der unter ‚Vorbereitung‘ erstellten beispielhaften Anordnung zugefügt. 21 2. 85Die Mikrotiterplatte zur Hybridisierung mit Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben vorsichtig aus dem Mikrotiterplatteninkubator I nehmen. Sofort den Plattendeckel abnehmen und ihn auf eine saubere Oberfläche legen. Als Alternative wird das Mikroröhrchengestell aus dem Wasserbad genommen. Sofort die Abdeckung von dem Gestell nehmen und die Plattenabdeckung langsam nach oben vom Gestell abziehen. 3. Mit einem 8-Kanal-Dispenser den gesamten Inhalt (ca. 100 µl) der Kontrollen, Kalibratoren und Proben aus den Hybridisierungs-Mikrotiterplatten-Vertiefungen oder Mikroröhrchen auf den Boden der entsprechenden Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefung überführen. Für jede überführte Reihe sind auf dem 8-Kanal-Dispenser neue Pipettenspitzen zu verwenden, und jede Pipettenspitze muss zur Gewährleistung einer vollständigen Probenüberführung gut auslaufen. Gegebenenfalls kann der Dispenser ruhig gehalten werden, indem die Mitte der Pipettenspitzen gegen die obere Kante der Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen gelehnt wird (siehe Abbildung 1). ABBILDUNG 1: RICHTIGES PIPETTIEREN RICHTIG Nicht vertikal pipettieren. Verspritzen vermeiden. Die Spitze darf die Seite der Vertiefung nicht berühren. 4. Die Mikrotiterplatte mit dem Plattendeckel oder der Plattenabdeckung abdecken und auf dem Kreisschüttler I bei 1100 ±100 U/min, 60 ± 5 Minuten bei 20 - 25 °C schütteln. 5. Den Waschpuffer vorbereiten. Die Spül und Abwassertanks des automatischen Plattenspülers I während dieser Inkubation überprüfen. Siehe Abschnitt Vorbereitung der Reagenzien. 6. Wenn der Capture-Schritt abgeschlossen ist, die Capture-Mikrotiterplatte aus dem Kreisschüttler I nehmen, und den Plattendeckel oder die Plattenabdeckung vorsichtig entfernen. Die Flüssigkeit aus den Vertiefungen entfernen und sie im Ausguss verwerfen; die Platte über dem Ausguss umdrehen und mit einer Bewegung kräftig nach unten schütteln. Vorsichtig vorgehen, damit beim Dekantieren zu dicht am Boden des Ausgusses kein Material verspritzt wird. Die Platte nicht wieder umdrehen; mit sauberen Kimtowels®-Wischtüchern oder entsprechenden fusselfreien Papiertüchern 2 bis 3 Mal kräftig abtupfen. Darauf achten, dass alle Flüssigkeit aus den Vertiefungen entfernt und die Oberseite der Platte trocken ist. HYBRIDNACHWEIS Hinweise: • Alle Zugaben über die gesamte Platte mit einem 8-Kanal-Dispenser von links nach rechts vornehmen. • Zwecks Konsistenz der Reagenzabgabe wird die reverse Pipettiertechnik empfohlen. Bei dieser Technik werden die Pipettenspitzen unter Verwendung des zweiten Anschlags an der Aspirier-/Abgabekontrolle (Kolben) initial überfüllt. Siehe nachstehendes Verfahren. Die Spitzen vor Abgabe an die Platte an dem Einweg-Reagenzbehälter abstreifen. • Gegebenenfalls kann der Dispenser ruhig gehalten werden, indem man die Mitte der Pipettenspitzen gegen die obere Kante der Mikrotiterplatten-Vertiefungen lehnt. Darauf achten, dass die Seiten der Mikrotiterplatten-Vertiefungen nicht berührt werden, weil andernfalls eine Kreuzkontamination der Proben auftreten könnte. Bitte die vorstehende Abbildung 1 beachten. 22 1. Das entsprechende Volumen des Nachweisreagenzes 1 in einen Einweg-Reagenzbehälter aliquotieren (weitere Anweisungen sind dem Abschnitt Vorbereitung der Reagenzien zu entnehmen). 75 µl des Nachweisreagenzes 1 mit einem 8-Kanal-Dispenser und der reversen Pipettiertechnik vorsichtig in jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte pipettieren. Reverses Pipettierverfahren: a) b) c) d) e) f) Die Spitzen auf einen 8-Kanal-Dispenser setzen; sicherstellen, dass alle Spitzen fest aufsitzen. Den Dispenser-Kolben an dem ersten Anschlag vorbei auf den zweiten Anschlag drücken. Die Spitzen in die Nachweisreagenzlösung 1 eintauchen. Den Kolben langsam freigeben und die Spitzen mit Flüssigkeit füllen lassen. 75 µl der Lösung durch Drücken des Kolbens auf den ersten Anschlag in die Mikrotiterplatten-Vertiefungen abgeben. Den Kolben nicht freigeben, bis die Pipettenspitzen erneut in die Lösung von Nachweisreagenz 1 getaucht wurden. Die Spitzen erneut füllen, und diesen Vorgang wiederholen, bis alle Vertiefungen gefüllt sind. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte von links nach rechts befüllen. Verifizieren, dass alle Vertiefungen gefüllt wurden, indem die Intensität der rosa Farbe beobachtet wird. Alle Vertiefungen sollten eine ähnliche Intensität aufweisen. 2. Die Platten mit einem Plattendeckel oder sauberem Parafilm (oder einem ähnlichen Material) abdecken und 30 - 45 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. SPÜLEN Die Capture-Platte nach einem der beiden nachstehenden Verfahren spülen. Automatisches Plattenspüler I-Verfahren: Hinweis: Den automatischen Plattenspüler I immer eingeschaltet lassen. Darauf achten, dass der Spülwassertank gefüllt und der Abwassertank leer ist. Der automatische Plattenspülapparat I spült das System zu Reinigungszwecken routinemäßig. Siehe gegebenenfalls die Bedienungsund Wartungsanleitungen für den automatischen Plattenspülapparat I. VOR JEDEM GEBRAUCH: • Verifizieren, dass der Wassertank mindestens bis zur 1-l-Marke mit Waschpufferlösung gefüllt ist. Wenn nicht, Waschpuffer-Lösung vorbereiten. Siehe den Abschnitt Vorbereitung der Reagenzien. • Verifizieren, dass der Spülwassertank mit entionisiertem oder destilliertem Wasser gefüllt ist. • Verifizieren, dass der Abwassertank leer und der Verschlussdeckel sicher befestigt ist. • Der automatische Plattenspülapparat I füllt sich vor jedem Spülvorgang automatisch von selbst und führt nach jedem Spülvorgang eine Pflegespülung durch. 1. Den Plattendeckel abnehmen und die Platte auf die Plattform des automatischen Plattenspülapparates I geben. 2. Verifizieren, dass der Strom eingeschaltet und auf dem Display „Digene Wash Ready“ erscheint. Hinweis: Wenn nur ein Teil einer Reihe der Capture-Vertiefungen gebraucht wird, müssen die leeren Mikrotiterplatten-Vertiefungen in die Capture-Platte gegeben werden, um die Reihe vor dem Spülen zu vervollständigen. 3. Die Zahl der zu spülenden Reihen durch Drücken der Taste „Rows“ [Reihen] und dann zum Einstellen „+“ oder „-“ wählen. Die Taste „Rows“ [Reihen] drücken, um auf „Digene Wash Ready“ zurückzukehren. 4. Zum Beginn „Start/Stop“ drücken. 5. Der Spülapparat führt sechs ca. 10 Minuten dauernde Füll- und Absaugzyklen durch. Während des Programmablaufs tritt eine kurze Pause ein; darauf achten, dass die Platte nicht frühzeitig entfernt wird. Wenn der automatische Plattenspüler I das Spülen beendet hat, erscheint die Anzeige „Digene Wash Ready“. 23 6. Wenn das Programm beendet ist, die Mikrotiterplatte aus dem Spülapparat nehmen. Die Platte sollte weiß aussehen, und es sollte keine rosa Flüssigkeit in den Mikrotiterplatten-Vertiefungen zurückbleiben. Manuelles Spülverfahren: 1. Das Nachweisreagenz 1 aus den Vertiefungen entfernen, indem saubere Kimtowels-Wischtücher oder entsprechende fusselfreie Papiertücher oben auf die Platte gelegt und die Platte vorsichtig umgedreht wird. Vor dem Umdrehen gewährleisten, dass sich das Papier mit der gesamten Oberfläche der Platte in Kontakt befindet. Die Platte 1 - 2 Minuten ablaufen lassen. Auf sauberen Kimtowels-Wischtüchern oder entsprechenden fusselfreien Papiertüchern gut abtupfen. Die gebrauchten Papiertücher vorsichtig entsorgen, um eine Kontamination der späteren Schritte mit alkalischer Phosphatase zu vermeiden. 2. Die Platten unter Verwendung des Spülapparates 6 Mal manuell spülen. Jede Vertiefung wird zur Entfernung von Nachweisreagenz 1 von den Oberseiten der Vertiefungen bis zum Überfließen gespült. Das Spülen beginnt bei Vertiefung A1 und wird in einer Schlangenlinie nach rechts und unten fortgesetzt. Nachdem alle Vertiefungen gefüllt wurden, die Flüssigkeit mit einer kräftigen Bewegung nach unten in den Ausguss dekantieren. Der zweite Spülvorgang beginnt bei Vertiefung H12 und verläuft in einer Schlangenlinie nach links und oben. Diese aus 2 Spülvorgängen bestehende Sequenz wird zwei weitere Male für insgesamt 6 Spülvorgänge pro Vertiefung wiederholt. 3. Nach dem Spülen wird die Platte umgedreht auf sauberen Kimtowels-Wischtüchern oder entsprechenden fusselfreien Papiertüchern abgetupft und 3 bis 4 Mal kräftig ausgeklopft. Die Papiertücher austauschen und erneut abtupfen. Die Platte umgedreht 5 Minuten ablaufen lassen. Die Platte nochmals abtupfen. 4. Die Platte sollte weiß aussehen, d. h. es sollte keine restliche rosa Flüssigkeit in den Mikrotiterplatten-Vertiefungen zurückbleiben. SIGNALVERSTÄRKUNG Hinweise: • Zur Handhabung des Nachweisreagenzes 2 ein neues Paar Handschuhe verwenden. • Zur Vermeidung einer Kontamination von Nachweisreagenz 2 nur die zur Durchführung des Assays erforderliche Reagenzmenge in den Einweg-Reagenzbehälter aliquotieren. Siehe den Abschnitt ‚Vorbereitung des Reagenzes‘. Das Nachweisreagenz 2 darf nicht in die Originalflasche zurückgegeben werden. Nach dem Gebrauch nicht aufgebrauchtes Material verwerfen. • Die Zugabe von Nachweisreagenz 2 sollte ohne Unterbrechung erfolgen. Die Inkubationszeit aller Vertiefungen muss so dicht wie möglich beieinander liegen. • Darauf achten, dass die Seiten der Mikrotiterplatten-Vertiefungen nicht berührt werden oder Reagenz zurück auf die Spitzen gespritzt wird, da eine Kreuzkontamination der Proben auftreten könnte (siehe Abbildung 1). 1. 75 µl des Nachweisreagenzes 2 unter Verwendung eines 8-Kanal-Dispensers, wie zuvor beschrieben, sorgfältig in jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte pipettieren. Alle Mikrotiterplatten-Vertiefungen sollten in eine gelbe Farbe umschlagen. Durch Beobachtung der Intensität der gelben Farbe verifizieren, dass alle Vertiefungen gefüllt wurden. Alle Vertiefungen sollten eine ähnliche Intensität aufweisen. 2. Die Mikrotiterplatte mit einem Plattendeckel, sauberem Parafilm (oder entsprechendem Material) abdecken und 15 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Direkte Sonnenlichteinwirkung vermeiden. 3. Die Mikrotiterplatte nach 15-minütiger Inkubation (und nicht später als 30 Minuten nach der Inkubation) im Digene Mikrotiterplatten-Luminometer 2000 (DML 2000™) messen. 4. Das Assay-spezifische Software-Protokoll des DML 2000-Instrumentes erlaubt die Eingabe von relevanten Assayinformationen direkt in die Software. 24 5. Wenn eine Mikrotiterplatte nicht vollständig verwendet wurde, die verwendeten MikrotiterplattenVertiefungen aus dem Mikrotiterplattenhalter entfernen, das Gestell gründlich mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen, trocknen und für den nächsten Assay bereithalten. VERIFIKATIONSKRITERIEN FÜR DIE ASSAY-KALIBRIERUNG Die Verifikation der Assay-Kalibrierung wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Reagenzien und bereitgestellten Kalibrator- und Kontrollmaterialien vorschriftsmäßig funktionieren und den Assay-Grenzwert genau ermitteln. Für den hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test ist die Kalibrierung bei jedem Assay erforderlich. Deshalb ist es notwendig, jeden Assay unter Verwendung der folgenden Kriterien zu verifizieren. Dieses Verifikationsverfahren ist nicht als Ersatz der internen Qualitätskontrollprüfung bestimmt. Die DHCS, Version 2, und die Qualitative Software von Digene mit den DML-Assayprotokollen für HPV, Version 4.01 oder höher, verifizieren automatisch nachfolgende Kriterien. 1. Negativkalibrator Der Negativkalibrator muss bei jedem Assay in dreifacher Ausführung getestet werden. Um mit dem Test fortfahren zu können, muss der Mittelwert des Negativkalibrators ≥10 und ≤250 RLU sein. Die vom Negativkalibrator erhaltenen Ergebnisse sollten einen Variationskoeffizienten (VK (%)) von ≤25 % ergeben. Liegt der VK (%) bei >25 %, wird der Kontrollwert mit einem RLU-Wert, der sich am weitesten von dem Mittelwert befindet, als ein Ausreißer verworfen und der Mittelwert unter Verwendung der beiden verbleibenden Kontrollwerte erneut berechnet. Wenn der Unterschied zwischen dem Mittelwert und jedem der beiden Werte ≤25 % beträgt, mit Schritt 2 fortfahren. Andernfalls ist die Assay-Kalibrationsverifikation ungültig, und der Assay muss für alle Patientenproben wiederholt werden. In diesem Fall dürfen die Ergebnisse der Patientenproben nicht berichtet werden. 2. Kalibrator Der High-Risk-HPV-Calibrator (HRC) muss bei jedem Assay in dreifacher Ausführung getestet werden. Die Kalibratorergebnisse sollten einen Variationskoeffizienten (VK (%)) von ≤15 % ergeben. Liegt der VK (%) > 15% muss der Kalibratorwert mit einem am weitesten von dem Mittelwert liegenden RLU-Wert als ein Ausreißer verworfen und der Mittelwert unter Verwendung der verbleibenden beiden Kalibratorwerte erneut berechnet werden. Wenn der Unterschied zwischen dem Mittelwert und jedem der beiden Werte ≤ 15% beträgt, mit Schritt 3 fortfahren. Andernfalls ist die Assay-Kalibrationsverifikation ungültig, und der Assay muss für alle Patientenproben wiederholt werden. In diesem Fall dürfen die Patientenergebnisse nicht berichtet werden. Die oben beschriebene Assay-Kalibrationsverifikation für den Negativkalibrator und den Kalibrator wird von der DHCS, V.2 und der Digene Qualitative Software automatisch durchgeführt und auf dem Datenanalysenbericht ausgedruckt. Die DHCS-Software, V.2 und die Digene Qualitative Software mit den DML 2000 Assayprotokollen für HPV, Version 4.01 oder höher, verifizieren automatisch, dass der VK (%) für den High-Risk-HPV-Calibrator ≤ 15 % liegt. Die Digene Qualitative Software (V1.0.2 und V1.0.3) macht den Assay jedoch NICHT ungültig, es sei denn, dass der VK (%) für den High-Risk-HPV-Calibrator >25 % liegt. Der Anwender muss deshalb manuell verifizieren, dass der durch die DML 2000 Instrument Software berechnete VK (%) ≤15% beträgt, und wie für Situation 1 aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, fortfahren. Wenn der VK (%) der Kalibrator-Wiederholungstests zwischen 15 % und 25 % fällt, sind die Anleitungen für Situation 2 oder 3 in der nachstehenden Tabelle einzusehen, und es ist wie unter Aktion des Anwenders angegeben fortzufahren. 25 Situation 1 Wert des VK (%) für die HRCWiederholungstests ≤15 % Aktion mittels der Digene Qualitative Software Aktion des Anwenders Assay als „gültig“ berichtet Ergebnisse können berichtet werden, es ist keine weitere Aktion erforderlich. 2 Zwischen 15 % und 25 % Keine Bereinigung der Ausreißer; der Assay wird als „gültig“ berichtet Den am weitesten vom Mittelwert entfernt liegenden Kalibrator-RLU-Wert bereinigen. Den VK (%) des Kalibrators mit den beiden verbleibenden Werten erneut berechnen. Wenn der VK (%) der beiden verbleibenden RLU-Werte >15 % liegt, ist der Assay ungültig. Die Ergebnisse dürfen nicht berichtet werden. Wenn der VK (%) der verbleibenden RLUWerte ≤15 % liegt, den Assay-Grenzwert erneut berechnen und dann den RLU/GrenzwertQuotienten von jeder Probe mittels dieses Grenzwertes erneut berechnen. Diese erneut berechneten Werte können berichtet werden. 3 Zwischen 15 % und 25 % Bereinigung eines Ausreißers; der Assay wird als „gültig“ berichtet Der Assay ist ungültig. Die Ergebnisse dürfen nicht berichtet werden. Der Assay muss wiederholt werden. 4 >25 % Bereinigung eines Ausreißers; der Assay wird als „ungültig“ berichtet Der Assay ist ungültig. Die Ergebnisse dürfen nicht berichtet werden. Der Assay muss wiederholt werden. Zur manuellen Berechnung des VK (%), wie in der vorstehenden Situation 2 erforderlich, sollte der Anwender die Standardabweichung (n-1) der verbleibenden RLU-Werte aus dem Wiederholungstest durch den Mittelwert der verbliebenen RLU-Werte (HRC) aus dem Wiederholungstest dividieren und dieses Ergebnis mit 100 multiplizieren. Zur Berechnung des VK (%) mit Microsoft® Excel (mit der Digene Qualitative Software geliefert) kann der Anwender die Standardabweichung von den Kalibrator-Wiederholungstests mit der Formel Standardabweichung (STDEV) berechnen und den RLU-Mittelwert des Kalibrators mit der Formel Mittelwert (AVERAGE) ermitteln. Sobald diese beiden Werte vorliegen, die Standardabweichung durch den Mittelwert dividieren und das Ergebnis zum Erhalt des VK (%) mit 100 multiplizieren. (STDEV/AVERAGE) * 100 = VK (%) Bei auf die Berechnung der VK (%), die erneute Berechnung des Assay-Grenzwertes oder die erneute Berechnung des RLU/Grenzwertes der Proben bezogenen Fragen setzen Sie sich bitte mit Ihrem lokalen QIAGEN-Vertreter in Verbindung. Zur Ermittlung der Kalibrator-Reproduzierbarkeit und der Schätzung der Frequenz, mit der die manuellen Neuberechnungen erforderlich sein könnten, wurden die Ergebnisse aus drei klinischen Evaluationen der mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test durchgeführten 152 AssayDurchläufe gesammelt. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass der durchschnittliche VK (%) für diese 152 Durchläufe 8,1 % betrug. Unter Berücksichtigung aller drei Wiederholungstests des Kalibrators pro Testdurchlauf wurde eine Kalibrator-Reproduzierbarkeit des VK (%) von > 15 % für nur 17 der 152 Durchläufe (11,2 %) beobachtet, wobei 10 dieser 17 Testdurchläufe einen VK (%) zwischen 15 % und 25 % ergaben (Situation 2). Für die 17 Testdurchläufe, die einen VK (%) von >15 % ergaben, wurde für einen einzelnen Ausreißer bereinigt und der VK (%) erneut berechnet. Nach der ‚Aktion des Anwenders‘ für Situation 2 blieb nur einer der VK (%) für die Testdurchläufe >15 % und machte folglich den Testdurchlauf ungültig. Die VK (%) der übrigen 151 Testdurchläufe wurden mit einem durchschnittlichen VK (%) von 6,0 % berechnet. 3. Die Ergebnisse des Kalibrator-Mittelwertes (HRC ) und des Mittelwertes des Negativkalibrators (NC ) werden zur Berechnung des HRC /NC -Quotienten verwendet. Bevor die Probenergebnisse interpretiert werden können, müssen diese Quotienten den folgenden Kriterien entsprechen, um die Assay-Kalibration zu verifizieren: 26 Verifikation der Assay-Kalibration – zulässige Bereiche 2,0 ≤ HRC / NC ≤ 15 4. Den HRC /NC -Quotienten berechnen. Wenn der Quotient ≥2,0 und ≤15 ist, auf den nächsten Schritt übergehen. Wenn der Quotient <2,0 oder >15 ist, ist der Assay ungültig und muss wiederholt werden. Alle Patientenproben in dem Durchlauf wiederholen. Hinweis: Zulässige Bereiche für den Negativkalibrator und den Kalibrator wurden nur für das DML 2000-Instrument ermittelt. BERECHNUNG DER GRENZWERTE Sobald ein Assay nach den vorstehenden Kriterien validiert wurde, ist der Grenzwert zur Bestimmung der positiven Proben HRC . Beispiel einer Grenzwert-Berechnung: NC-RLU-Werte 97 101 91 96 Mittlerer RLU-Wert VK (%) 4,9 HRC /NC Nicht zutreffend Folglich ist der positive Grenzwert (HRC ) = 318. HRC-RLU-Werte 312 335 307 318 4,7 3,31 Alle von den Proben erhaltenen RLU-Werte sollten in einen Quotienten des entsprechenden Grenzwertes umgewandelt werden. So sollten zum Beispiel alle Assays als Proben-RLU/Grenzwert ausgedrückt werden. Hinweis: Die RLU/Grenzwerte und positiven/negativen Ergebnisse für alle Proben werden in dem Datenanalyse-Bericht für DML 2000 berichtet. Für die Anwendung des Rapid Capture System Geräts wurde das Protokoll der RCS HPV Software so programmiert, dass der mittlere RLU-Wert gültiger positiver KalibratorWiederholungstests durch einen Kalibrierungsanpassungsfaktor (Calibration Adjustment Factor, CAF) von 0,8 korrigiert wird. Dieser CAF ist notwendig, damit die Leistungsmerkmale des Assays denen des manuellen Testverfahrens entsprechen. Diese Änderung wird nur bei Assays eingesetzt, die unter Anwendung des Rapid Capture Geräts durchgeführt wurden. Daher ist es entscheidend, für jedes Testverfahren das richtige Software-Protokoll zu wählen, um genaue Testergebnisse zu erzielen. Sämtliche Proben-RLU-Werte sollten in ein Verhältnis zu dem entsprechenden Cutoff- (CO) Wert umgewandelt werden. So sollten zum Beispiel alle Assays als Proben-RLU/CO ausgedrückt werden. 27 QUALITÄTSKONTROLLE Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test wird mit Qualitätskontrollproben geliefert. Nähere Anleitungen, wie beispielsweise die Chargen-Bezeichnungen oder die Verfalldaten der Qualitätskontrollen einzugeben sind, gehen aus den Gebrauchsanweisungen des Digene Hybrid Capture Systems Version 2, dem interaktiven Bedienerhandbuch für die DHCS V.2 Software oder den Gebrauchsanweisungen der Digene Qualitative Software hervor. Diese Qualitätskontrollen müssen bei jedem Testdurchlauf eingeschlossen werden, und der RLU/Grenzwert Quotient von jedem Assay muss in die folgenden zulässigen Bereiche fallen, damit der Durchlauf als gültig eingestuft werden kann. Wenn die Qualitätskontrollen nicht in diese Bereiche fallen, ist der Assay ungültig und muss wiederholt werden. Demzufolge dürfen für einen ungültigen Durchlauf keine Patientenergebnisse berichtet werden. Qualitäts kontrolle Erwartetes Ergebnis (RLU/Grenzwert) High-Risk HPV-Sonde HPV-Typ QC1-LR Low-Risk (HPV 6) QC2-HR High-Risk (HPV 16) Minimum Maximum Durchsch nitt %CV 0,001 0,999 0,5 25 2 8 5,0 25 1. Die im Kit bereitgestellten Qualitätskontrollen sind klonierte HPV-DNA-Sequenzen, die sich nicht von HPV des Wildtyps herleiten. Hierbei handelt es sich um die gleiche Material wie für die Kalibratoren verwendete Materialart, die mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test geliefert wird. 2. Dieses Qualitätskontrollmaterial ist keine geeignete Kontrolle für die Behandlung von Specimen Transport Medium, PreservCyt Solution oder SurePath Preservative Fluid. 3. Die mit diesem Testkit bereitgestellten Qualitätskontrollen sind für die interne Qualitätskontrolle zu verwenden. Zusätzliche Kontrollen können nach den Leitfäden oder Anforderungen der jeweiligen lokalen, und/oder Landesbestimmungen oder der Akkreditierungsorganisationen getestet werden. 28 INTERPRETATION DER PROBENERGEBNISSE Hinweis: Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test-Grenzwert von 1 pg/ml entspricht 100.000 HPV-Kopien/ml oder 5.000 HPV-Kopien pro Assay. 1. STM-Proben mit RLU/Grenzwert-Quotienten ≥1,0 werden als „positiv“ eingestuft. 2. Proben mit RLU/Grenzwert-Quotienten <1,0 werden für die getesteten 13 HPV-Typen als „negativ“ oder „nicht nachweisbar“ eingestuft. Es sind entweder keine High-Risk-HPV-DNA-Sequenzen vorhanden oder die HPV-DNA-Konzentration liegt unter der Nachweisgrenze des Assays. 3. Wenn Proben in PreservCyt Solution getestet werden und der RLU/CO-Quotient einer Probe ≥1,0 und <2,5 ist, wird von QIAGEN empfohlen, die Proben erneut zu testen. Wenn das Ergebnis des ersten Wiederholungstests positiv ist (≥1,0 RLU/CO), kann die Probe als positiv registriert werden, und es sind keine weiteren Wiederholungstests erforderlich. Wenn aber das Ergebnis des ersten Wiederholungstests negativ ist, (<1,0), muss ein zweiter Wiederholungstest (drittes Ergebnis) durchgeführt werden, um das endgültige Ergebnis zu erzeugen. Das Ergebnis des zweiten Wiederholungstests wird als Endergebnis betrachtet und ist zu berichten. 4. Wenn der RLU/Grenzwert-Quotient einer Probe dicht bei oder unter 1,0 liegt und eine High-RiskHPV-Infektion vermutet wird, sind alternative Testverfahren und/oder eine Wiederholungsprobe in Betracht zu ziehen. 5. Da mit diesem Assay nur die High-Risk-HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68 nachgewiesen werden, muss man sich bewusst sein, dass in der Probe auch Low-Risk-HPVTypen vorliegen können. Wird speziell auf das Vorliegen sexuell übertragener Low-Risk-HPV getestet, ist die Verwendung des hc2 HPV-DNA-Tests erforderlich, mit dem Low- und High-RiskHPV-DNA-Typen nachgewiesen werden können. LEISTUNGSMERKMALE KLINISCHE LEISTUNG BEIM SCREENING VON PATIENTINNEN MIT NORMALEN PAPABSTRICHERGEBNISSEN ALS EIN HILFSMITTEL BEI DER RISIKOBEURTEILUNG FÜR DAS PATIENTENMANAGEMENT Nachstehend werden die Ergebnisse von acht unabhängigen klinischen Studien beschrieben, die von namhaften medizinischen, akademischen und Regierungseinrichtungen in Zentren in den USA und anderen Ländern durchgeführt wurden. In diese Studien wurden etablierte Pap-Methoden einbezogen, die in den Ländern Verwendung finden, in denen die Studie durchgeführt wurde. In allen bis auf zwei Fälle wurden zur Interpretation der Pap-Ergebnisse das Bethesda Grading-System verwendet. Die für das Screening auf ein Zervixkarzinom entsprechende Terminologie in der Europäischen Union ist in den 42 European Guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer Screening [Europäische Leitlinien für Qualitätssicherung beim Screening auf ein Zervixkarzinom] einzusehen. Außerdem wurde für jede Studie mittels Einsatz der Kolposkopie geführten Biopsie High-Grade-Zervixerkrankungen diagnostiziert. Anhand dieser Studien wurde die klinische Brauchbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests im Vergleich zum Pap-Abstrich für ältere Frauen (im Allgemeinen im Alter über 30-35 Jahren) beurteilt. Außer in einer Studie führten alle auch prospektiven HPV-Tests unter Verwendung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests durch. Bei den Studien handelte es um Screening-Studien an einem Querschnitt der Allgemeinbevölkerung unter Verwendung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests sofern nachstehend nicht anderweitig angegeben wird. Wie bereits zuvor angeführt, wurden 2 der 8 Screening-Studien in den USA, 2 in Europa, 2 in Lateinamerika, 1 in Afrika und 1 in Asien durchgeführt. Die Leistung des anhand der sechs Querschnittsstudien beobachteten hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests wird in Tabellen 3 und 4 für Frauen im Alter von 30 Jahren und älter, die mit einer histologisch bestätigten High-Grade-Zervixneoplasie (definiert als CIN3 oder schwerwiegender) diagnostiziert wurden, zusammengefasst. 29 Tabelle 3 Bestimmungen der Leistung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests – Empfindlichkeit und Spezifität Population n Empfindlichkeit (%) PAP allein HPV allein Spezifität y(%) HPV + PAP PAP allein 51,6 96,3 100 98,5 (14/27) (26/27) (27/27) (7453/7565) 95 % KI 32,0-71,3 81,0-99,9 87,2-100 98,2- 98,8 58,4 94,8 97,4 98,7 Lateinamerika 1 (45/77) (73/77) 6115 (75/77) (5962/6038) 95 % KI 46,68-69,6 87.2-98.6 90,9-99,7 98,4-99,0 77,9 89,7 94,1 94,1 Lateinamerika 2† (53/68) (61/68) 6176 (64/68) (5745/6108) 95 % KI 66,2-87.1 79,9-95,8 85,6-98,4 93,4-94,6 84.1 89.7 92,5 86,4 Afrika (90/107) (96/107) (99/107) (2436/2818) 2925 95 % KI 75,8-90,5 82,4-94,8 85,8-96,7 85,1-87,7 97,6 100 100 76,3 1936 Asien (41/42) (42/42) (42/42) (1445/1894) 95 % KI 87,4-99,9 91,6-100,0 91,6-100,0 74,3-78,2 50.0 100 100 97,6 1040 USA 1 (1/2) (2/2) (2/2) (1013/1038) 95 % KI 1,26-98,7 15,8-100,0 15,8-100,0 96,5-98,4 hc2-Daten, sofern verfügbar, andernfalls Verwendung von HCS-Daten; kombinierte Daten. Westeuropa 1 7592 HPV allein HPV + PAP 96,2 (7275/7565) 95,7-96,6 93,9 (5669/6038) 93,3-94,5 94,0 (5742/6108) 93,4-94,6 80,0 (2253/2818) 78,4-81,4 83,0 (1572/1894) 81,2-85,0 96,2 (999/1038) 94,9-97,3 95,1 (7193/7565) 94,6-95,6 93,4 (5637/6038) 92,7-94,0 89,9 (5490/6108) 89,1-90,6 76,4 (2152/2818) 74,8-77,9 68,0 (1287/1894) 65,8-70,1 95,5 (991/1038) 94,0-96,7 Tabelle 4 Bestimmungen der Leistung des hc2 High-isk-HPV-DNA-Tests – positiver und negativer Vorhersagewert Population n Prävalenz (%) Positiver Vorhersagewert (%) PAP allein HPV allein HPV + PAP CIN 3 0,36 11,1 8,23 6,77 West7592 (27/399) (27/7592) (14/126) (26/316) europa 1 95 % KI 0,23-0,52 6,21-17,9 5,45-11,8 4,51-9,69 1,26 37,2 16,5 15,8 Latein6115 (75/476) (77/6115) (45/121) (73/442) amerika 1 95 % KI 0,99-1,57 28,6-46,4 13,2-20,3 12,6-19,4 1,10 12,7 14,3 9,4 Latein(64/682) 6176 (68/6176) (53/416) (61/427) amerika 2† 95 % KI 0,86-1,39 9,69-16,3 11,1-18,0 7,30-11,8 3,66 19,1 14,5 12,9 2925 (99/765) (107/2925) (90/472) (96/661) Afrika 95 % KI 3,01-4,40 15,6-22,9 11,9-17,4 10,6-15,5 2,17 8,37 11,5 6,47 1936 (42/649) (42/1936) (41/490) (42/364) Asien 95 % KI 1,57-2,92 6,07-11,2 8,44-15,3 4,70-8,65 0,19 3,85 4,88 4,08 1040 (2/49) (2/1040) (1/26) (2/41) USA 1 95 %KI 0,02-0,69 0,10-19,6 0,60-16,5 0,50-14,0 hc2-Daten, sofern verfügbar, andernfalls Verwendung von HCS-Daten; kombinierte Daten. Negativer Vorhersagewert (%) PAP allein 99,83 (7453/7466) 99,70-99,91 99,47 (5962/5994) 99,25-99,63 99,74 (5745/5760) 99,57-99,85 99,31 (2436/2453) 98,89-99,60 99,93 (1445/1446) 99,62-100,0 99,90 (1013/1014) 99,45-100,0 HPV allein 99,99 (7275/7276) 99,92-100,0 99,93 (5669/5673) 99,82-99,98 99,88 (5742/5749) 99,75-99,95 99,51 (2253/2264) 99,13-99,76 100,0 (1572/1572) 99,77-100,0 100.0 (999/999) 99,63-100,0 HPV + PAP 100,0 (7193/7193) 99,95-100,0 99,96 (5637/5639) 99,87-100,0 99,93 (5490/5494) 99,81-99.,98 99,63 (2152/2160) 99,27-99,84 100,0 (1287/1287) 99,71-100,0 100,0 (991/991) 99,63-100,0 In allen Studien fand sich eine gleichmäßige und häufig sehr signifikante Verbesserung der Empfindlichkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests im Vergleich zum Pap allein. Wie bereits bei der Empfindlichkeit festgestellt, übertrifft auch der negative Vorhersagewert (NPW) von HPV in allen Fällen den von Pap allein, und nähert sich 100 %. Dieser NPW weist mit hoher Wahrscheinlichkeit die Abwesenheit einer High-Grade-Zervixerkrankung oder eines -karzinoms bei zytologisch normalen Frauen nach, die an keiner HPV-Infektion leiden. Obwohl die Spezifität des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests niedriger als für den Pap allein war, hat die Wahrscheinlichkeitsverhältnisanalyse nachgewiesen, dass die beobachtete Spezifizitätsabnahme nicht signifikant genug ist, um sich auf die klinische Brauchbarkeit des Tests bei der Identifikation von Frauen auszuwirken, die ein geringes oder kein Risiko für die Entwicklung einer Zervixerkrankung aufweisen. Dennoch ist es wichtig, dass die Entscheidung zur Überweisung einer Patientin zur Kolposkopie auf allen klinischen und Risikoinformationen und der dem Arzt verfügbaren Anamnese der jeweiligen Patientin basiert. Zu wichtigen Variablen zählen anamnestisch eine HPV-Infektion und/oder abnorme Pap30 Abstriche, das Alter beim ersten Koitus, die Anzahl der Geschlechtspartner und gleichzeitig vorliegende 27,28 sexuell übertragene Krankheiten. Obwohl die Prävalenz einer High-Grade-Erkrankung nicht signifikant unter den einer Leistungsermittlung unterzogenen Studien variiert, kann sich die Prävalenz einer HPV-Infektion in einer Population auf die Leistung auswirken und variiert typischerweise mit der Patientenpopulation. Außerdem wurde gezeigt, 28-37 Positive dass die Prävalenz einer HPV-Infektion mit zunehmendem Alter sehr stark abnimmt. Vorhersagewerte nehmen beim Testen von Populationen mit einer geringen Prävalenz oder bei individuellen Patientinnen mit einem geringen Infektionsrisiko ab. Longitudinalanalysen wurden unter Verwendung der Ergebnisse aus zwei Studien, einer in den USA von dem National Cancer Institute (NCI) in Portland, Oregon und der anderen in Frankreich, im Laboratoire Pol Bouin C.H.U. de Reims durchgeführten, angestellt. Diese Longitudinalanalysen sollten dem Nachweis dienen, dass Pap-negative/HPV-negative Patientinnen im Vergleich zu den herkömmlich als Low-Risk definierten Frauen, deren HPV-Status unbekannt ist und verglichen mit Pap-negativen/HPV-positiven Patientinnen ein geringeres Risiko für eine Zervixerkrankung aufweisen. Die Ergebnisse dieser Longitudinaldatenanalysen sind Tabellen 5 und 6 nachstehend zu entnehmen. Tabelle 5 Zusammenfassung der Ergebnisse: NCI- und in Frankreich durchgeführte Studien – relatives Risiko für eine High-Grade-Erkrankung Alter Low-RiskKlassifikation n CIN 3+ Fälle Pap normal, HPV negativ Konsekutive normale Paps* Pap normal, HPV negativ Konsekutive normale Paps* Pap normal, HPV negativ Konsekutive normale Paps** Pap normal, HPV negativ Konsekutive normale Paps** 12 054 28 Rate (pro 100 Patientenjahre) 0,043 9 429 19 0,048 17 594 48 0,056 13 392 44 0,082 1 690 3 0,084 2 026 4 0,099 2 180 3 0,066 2 650 7 0,136 Studiengruppe 30 Jahre und älter NCI Alle 30 Jahre und älter Frankreich Alle Relatives Risiko (95 %-KI) 0,897 (0,596; 1,348) 1,000 0,678 (0,514; 0,894) 1 000 0,849 (0,307; 2,35) 1,000 0,491 (0,221; 1,09) 1,000 *Drei normale Paps über ca. 2 Jahre **Zwei normale Paps über ca. 2 Jahre Tabelle 6 Zusammenfassung der Ergebnisse: NCI- und in Frankreich durchgeführte Studien – durch den HPV-Status zur Baseline stratifizierte Erkrankungsraten Alter Baseline-Status n CIN 3+ Fälle Rate (pro 100 Patientenjahre) Pap normal, HPV positiv Pap normal, HPV negativ Pap normal, HPV positiv Pap normal, HPV negativ Pap normal, HPV positiv Pap normal, HPV negativ Pap normal, HPV positiv Pap normal, HPV negativ 1 078 24 0,451 12 054 28 0,043 2 561 63 0,096 17 594 48 0,056 419 14 2,346 1 696 3 0,084 619 22 2,520 2 180 3 0,066 Studiengruppe 30 Jahre und älter NCI Alle 30 Jahre und älter Frankreich Alle 31 Relatives Risiko (95 %-KI) 10,50 (6,13; 18,0) 1,00 10,64 (7,33 – 15,5) 1,00 27,3 (8,41; 88,3) 1,00 37,0 (11,8; 116) 1,00 Die klinische Brauchbarkeit des HPV-Testergebnisses wird weiter durch das erhöhte Risiko für eine Zervixerkrankung bei HPV-positiven Frauen im Vergleich zu HPV-negativen Frauen nachgewiesen. KLINISCHE LEISTUNG BEIM SCREENING VON PATIENTINNEN MIT ASC-US PAPABSTRICHERGEBNISSEN ZUR ERMITTLUNG DER NOTWENDIGKEIT EINER ÜBERWEISUNG ZUR KOLPOSKOPIE In den USA wurde 1996 unter der Leitung des Kaiser Foundation Research Institute und der Kaiser Permanente Medical Group eine Studie unter dem Titel „Utility of HPV DNA Testing for Triage of Women with Borderline Pap Smears“ [Nützlichkeit des HPV-DNA-Testens für eine Triage von Frauen mit Borderline-Pap-Abstrichen] durchgeführt. Bei Frauen, die verschiedene klinische Kaiser-Einrichtungen aufsuchten, wurden Zervixproben für Routine-Pap-Abstriche und zum hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testen entnommen. Die Bewertung der initialen Pap-Abstriche erfolgte nach der Bethesda-Klassifikation. Die für das Screening auf ein Zervixkarzinom entsprechende Terminologie in der Europäischen Union ist in den 42 European Guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer Screening [Europäische Leitlinien für Qualitätssicherung beim Screening auf ein Zervixkarzinom] einzusehen. Frauen (im Alter von 15 Jahren oder älter) mit Pap-Abstrichergebnissen von ASC-US (atypical cells of undetermined significance; atypischen Plattenepithelzellen unklarer Signifikanz) wurden zur Kolposkopie und Biopsie erneut einbestellt. Kolposkopisch gewonnene histologische Proben wurden zur initialen Diagnosestellung von Pathologen untersucht. Jede histologische Probe wurde auch von einem unabhängigen Pathologen überprüft, und Diskrepanzen zwischen der initialen Überprüfung und der unabhängigen Überprüfung wurden von einem dritten Pathologen schlüssig beurteilt. hc2 HPV-DNA-Tests wurden an der initialen Probe durchgeführt, und es wurde nur die High-Risk-HPVSonde verwendet. Die HPV-DNA-Tests wurden mit einem Prototyp des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests durchgeführt, der Sonden für 11 der 13 High-Risk-HPV-Typen, aber keine Sonden für die HPV-Typen 59 und 68 enthielt. Es ist nicht zu erwarten, dass dieser Unterschied zu signifikant unterschiedlichen Leistungsprofilen der beiden Assays führt. High-Risk-HPV-Testergebnisse und histologische Diagnosen standen von 885 Frauen mit ASC-US-PapAbstrichen zur Verfügung. Die Tests an den meisten Patientinnen wurden mit Proben durchgeführt, die sowohl in STM als auch in PreservCyt Lösung (PC) überführt wurden. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den Leistungsmerkmalen des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests für STM- und PC-Medien wird nur die Assay-Leistung für die PreservCyt Lösung dargestellt. Tabelle 7 zeigt, dass unter den Frauen, die aufgrund von ASC-US im Pap-Abstrich überwiesen wurden, der negative Vorhersagewert des hc2 High-Risk-HPV DNA-Tests auf das Vorliegen von HSIL oder einer fortgeschritteneren Erkrankung bei der Kolposkopie 99 % beträgt. Tabelle 7 Vergleich des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests im Vergleich zu Konsens-Histologie bei einer Population mit Überweisung nach einem ASC-US-Pap Kaiser-Studie, Proben in PreservCyt Lösung hc2 High-RiskHPV HSIL oder fortgeschrittenere Erkrankung zum Zeitpunkt der Kolposkopie + Insgesamt + 66 317 383 5 497 502 Insgesamt 71 814 885 Empfindlichkeit [TP/(TP+FN)] = 93,0 % (66/71) 95 % KI = 84,3 bis 97,7 Spezifität [TN/(TN+FP)] = 61,1 % (497/814) 95 % KI = 57,7 bis 64,4 Krankheitsprävalenz = 8,0 % (71/885) Positiver Assay-Vorhersagewert = 17,2 % (66/383) Negativer Assay-Vorhersagewert = 99,0 % (497/502) 32 Tabelle 8 zeigt theoretische positive und negative Vorhersagewerte basierend auf verschiedenen Prävalenzen für initiale ASC-US, von denen ermittelt wurde, dass es sich basierend auf den hc2 HighRisk-HPV-Sondenergebnissen um HSIL oder eine fortgeschrittenere Erkrankung handelt. Tabelle 8 Theoretischer positiver und negativer Vorhersagewert hc2 High-Risk-HPV-Sonde ASC-US Pap-Abstrichergebnisse Theoretische Prävalenz für HSIL 5 10 15 20 25 30 Initiales ASC-US-Pap-Abstrichergebnis Positiver Assay-Vorhersagewert Negativer Assay-Vorhersagewert 11,2 99,4 21,0 98,7 29,7 98,0 37,4 97,2 44,3 96,3 50,6 95,3 Tabelle 9 veranschaulicht die Variation zwischen den verschiedenen Altersgruppen in dieser Studie: Tabelle 9 Kaiser-Studiendaten hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testleistung im Vergleich zu Konsens-Histologie Ergebnisse (HSIL) Altersspezifische Merkmale N Krankheitsprävalenz (%) Empfindlichkeit (%) 95%-Konfidenzintervall Spezifität (%) 95%-Konfidenzintervall Negativer Vorhersagewert (%) Positiver Vorhersagewert (%) Alter <30 287 12,2 100,00 (35/35) 90,0-100 31,4 (79/252) 25,7-37,5 100 (79/79) 16,83 (35/208) Alter 30-39 233 11,2 88,46 (23/26) 69,9-97,6 66,2 (137/207) 59,3-72,6 97,86 (137/140) 24,73 (23/93) Alter >39 365 2,7 80,00 (8/10) 44,4-97,5 79,15 (281/355) 74,6-83,3 99,29 (281/283) 9,76 (8/82) KLINISCHE EMPFINDLICHKEIT UND SPEZIFITÄT FÜR DIE ERMITTLUNG DES RISIKOS FÜR EINE HIGH-GRADE-ERKRANKUNG BEI FRAUEN MIT LSIL- ODER HSIL-PAP-ABSTRICHEN Es wurde eine multizentrische klinische Studie unter Verwendung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests an Proben durchgeführt, die in mehreren großen Kolposkopie-Kliniken (3 Zentren) an einem Krankenhaus und medizinischen Zentren mit einer hohen Prävalenz zervikaler Erkrankungen und HPV im Westen und Süden der USA entnommen wurden. Der HPV-Test wurde an 3 Studienzentren durchgeführt, die nicht an die Kolposkopiekliniken, in denen die Proben entnommen wurden, angeschlossen waren. Die Population für diese klinische Studie bestand aus Frauen mit entweder der LSIL- oder HSIL-Diagnose basierend auf einem vor kurzem angefertigten Pap-Abstrich, die zur „Follow-up“-Kolposkopie überwiesen wurden. Bei den 702 in die Studie aufgenommenen Patientinnen waren 327 Pap-Abstrichergebnisse schwerwiegender als ASC-US, und die Patientinnen wurden angemessen informiert; 96 von diesen wiesen einen Enderkrankungsstatus von HSIL oder schwerwiegender auf. Exfolierte Zervixzellproben wurden entweder mit der QIAGEN Zervixbürste, die in STM gegeben wurde, oder mit einer besenartigen Vorrichtung entnommen und in PreservCyt Lösung gespült. Die Proben wurden zum Zeitpunkt der Kolposkopie entnommen und mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test untersucht und die Ergebnisse mit dem für jede Patientin ermittelten Krankheitsstatus verglichen. Der Krankheitsstatus basierte auf den Ergebnissen der histologischen Beurteilung. Wenn jedoch die Histologie negativ war oder bei Abwesenheit eines histologischen Ergebnisses wurde der Krankheitsstatus mittels zytologischer Untersuchung zum Zeitpunkt der Kolposkopie bestimmt (siehe Tabelle 10). Der hc2 High-Risk-HPV-DNATest wurde an 3 großen medizinischen Schwerpunktzentren, die nicht an die Zentren angeschlossen waren, an denen die Proben anlässlich der Kolposkopie entnommen wurden, durchgeführt. Die 33 zytologischen Untersuchungen wurden in einem pathologischen Referenzlabor und die histologischen Untersuchungen in den Einrichtungen, in denen die Kolposkopie stattfand, durchgeführt. Die Testergebnisse wurden zur Beurteilung der Empfindlichkeit, der Spezifität des Tests sowie des negativen und positiven Vorhersagewertes zum Nachweis einer High-Grade-Zervixneoplasie mit dem Krankheitsstatus verglichen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den Leistungsmerkmalen zwischen dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test für STM und PC-Medien wird nur die Assay-Leistung für PC dargestellt. Zwischen den Testergebnissen mit High-Risk-HPV-Sonden von Proben in STM und PreservCyt Lösung wurde kein Unterschied festgestellt. Aus Tabelle 11 gehen die Ergebnisse bei Verwendung der hc2 HighRisk-HPV-Sonde in dieser Population hervor: Tabelle 10 Algorithmus des Krankheitsstatus der Patientinnen Zytologieergebnis NEG LSIL HSIL Karzinom NEG LSIL LSIL HSIL Karzinom NEG LSIL HSIL HSIL Karzinom NEG LSIL HSIL Karzinom Karzinom Histologieergebnis NEG oder nicht durchgeführt* NEG NEG NEG LSIL Nicht durchgeführt* LSIL LSIL LSIL HSIL HSIL HSIL Nicht durchgeführt* HSIL Karzinom Karzinom Karzinom Nicht durchgeführt* Karzinom Krankheitsstatus NEG LSIL HSIL HSIL+ LSIL LSIL LSIL LSIL LSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL HSIL+ HSIL+ HSIL+ HSIL+ HSIL+ *Eine Biopsie und/oder endozervikale Kürettage (ECC) wurde nicht durchgeführt, weil bei der Kolposkopie keine Auffälligkeiten festgestellt wurden oder histologische Ergebnisse nicht zur Verfügung standen. Tabellen 11 und 12 stellen die Leistung des an 327 PC-Proben bestimmten hc2 HPV-DNA-Tests dar, von denen 96 Proben bei Frauen durchgeführt wurden, die mit einer High-Grade-Zervixerkrankung diagnostiziert wurden. Die Vergleiche wurden an allen an der Studie teilnehmenden Patientinnen, die nach abnormen Pap-Abstrichergebnissen überwiesen wurden, vorgenommen. Vergleiche für die mit der High-Risk-Sonde getesteten PC-Proben sind dargestellt. Aus Tabelle 12 geht hervor, dass der HPV-DNA-Test bei Verwendung der High-Risk-HPV-Sonde eine Gesamtempfindlichkeit von ca. 93 % bei der Identifikation von Frauen mit einer High-Grade-Neoplasie in einer Population aufwies, die auf der Basis einer LSIL-, HSIL- oder ähnlichen Diagnose anhand des PapAbstriches zur Kolposkopie überwiesen wurde. Es wurde außerdem nachgewiesen, dass dieser Test auch einen negativen Vorhersagewert von nahezu 95 % bei dieser Population besaß. 34 Tabelle 11 Ergebnisse mit der hc2 High Risk-HPV-Sonde Endgültiger Krankheitsstatus Überweisung aufgrund der Pap-AbstrichErgebnisse High-Risk-HPVErgebnisse LSIL HSIL Insgesamt HSIL LSIL POS NEG 44 45 89 4 3 7 POS NEG 78 33 29 14 107 47 154 96 Negativ POS NEG 28 5 33 37 7 44 Insgesamt 224 103 327 77 Tabelle 12 Leistungsmerkmale hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test bei Patientinnen, die mit einem Pap-Abstrich mit LSIL oder fortgeschrittenerer Erkrankung und einem Enderkrankungsstatus von HSIL überwiesen wurden High-RiskHPVSondenErgebnis Überweisung nach Pap mit LSIL oder HSIL → HSIL-Erkrankung + Insgesamt 89 140 + 229 7 91 98 Insgesamt 96 231 327 Empfindlichkeit [TP/(TP+FN)] = 92,7 % (89/96) 95 % KI = 85,6 bis 97,0 Spezifität [TN/(TN+FP)] = 39,4 % (91/231) 95 % KI = 33,1 bis 46,0 Krankheitsprävalenz von LSIL bei Überweisung bis zur endgültigen HSIL = 21,4 % Krankheitsprävalenz von HSIL bei Überweisung bis zur endgültigen HSIL = 46,6 % Positiver Gesamt-Vorhersagewert = 38,9 % (89/229) Negativer Gesamt-Vorhersagewert = 92,8 % (91/98) Obwohl die Spezifität des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests etwas niedrig zu sein schien, wird eine strikte Korrelation zwischen der Abwesenheit einer Neoplasie und einem negativen HPV-Ergebnis nicht erwartet. HPV-DNA kann bei Frauen vorliegen, bei denen sich keine Erkrankung eines höheren Grades entwickelt hat. Wenn faktisch ein HPV-Polymerase Chain Reaction (PCR)-Test (ein nur zu Forschungszwecken verwendeter Assay) an Proben mit positiven hc2 High-Risk-HPV-DNATestergebnissen durchgeführt wurde und deren entsprechender Krankheitsstatus geringer als eine LowGrade-Neoplasie war, waren fast 75 % positiv. Aus Tabelle 13 gehen mit der theoretischen High-Risk-HPV-Sonde positive und negative Vorhersagewerte für eine initiale LSIL oder HSIL hervor, von denen bei der Kolposkopie gefunden wurde, dass es sich um eine HSIL oder schwerwiegendere Erkrankung handelte. 35 Tabelle 13 Theoretischer positiver und negativer Vorhersagewert High-Risk-HPV-Sonde Initiale LSIL- oder HSIL-Pap-Abstrichergebnisse Theoretische Prävalenz für HSIL Initiales LSIL- oder HSIL-Pap-Abstrichergebnis Positiver Assay-Vorhersagewert Negativer Assay-Vorhersagewert 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 7,4 14,5 21,2 27,6 33,7 39,6 45,1 50,4 55,5 60,4 99,0 97,9 96,8 95,5 94,1 92,6 90,9 89,0 86,8 84,3 ANALYTISCHE EMPFINDLICHKEIT Ein nicht klinisches Panel klonierter HPV-Plasmid-DNA wurde zur Ermittlung, ob jeder der 13 HPV-Typen mittels des hc2 HPV-DNA-Tests nachweisbar ist, sowie zur Ermittlung der analytischen Empfindlichkeit des Assays für jeden der HPV-Typen getestet. Jede HPV-Zielkonzentration (100 pg/ml, 10 pg/ml, 2,5 pg/ml, 1 pg/ml, 0,5 pg/ml und 0,2 pg/ml) von jedem der 13 HPV-DNA-Typen (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 and 68) wurde in Dreifachbestimmung getestet. Das mittlere Signal (in relativen Lumineszenzeinheiten, RLU) für jede Konzentration von jedem HPV-Typ wurde berechnet und mit dem positiven High-Risk-Calibrator verglichen. Die Nachweisgrenze für jeden HPV-Typ in STM geht aus Tabelle 14 hervor. Die Nachweisgrenzen variierten abhängig von dem getesteten HPV-Typ von 0,62 pg/ml bis 1,39 pg/ml. Die mittlere Nachweisgrenze von allen 13 HPV-DNA-Typen betrug 1,08 pg/ml mit einer Standardabweichung von 0,05. Table 14 Zusammenfassung der Nachweisgrenzen der Empfindlichkeit für jeden HPV-DNA-Typ in STM im hc2 HPV-DNA-Test HPV-DNATyp Nachweisbare HPVDNA-Konzentration Standardabweichung (pg/ml) 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 68 Mittelwert (alle Typen) 1,09 1,05 1,01 1,35 1,11 1,39 1,14 0,78 1,37 0,62 0,82 1,10 1,19 1,08 0,06 0,05 0,05 0,02 0,05 0,09 0,04 0,10 0,06 0,04 0,04 0,06 0,04 0,05 95 %Konfidenzbereich 0,94-1,29 0,88-1,29 0,91-1,15 1,26-1,45 0,95-1,31 1,16-1,71 0,99-1,35 0,70-0,88 1,21-1,58 0,58-0,67 0,73-0,94 1,00-1,21 1,03-1,39 0,95-1,25 ÄQUIVALENZ ZWISCHEN DEN PROBEN IN SPECIMEN TRANSPORT MEDIUM (STM) UND DEN PROBEN IN PRESERVCYT (PC) LÖSUNG Die Äquivalenz zwischen Proben in STM und PreservCyt Lösung wurde auf eine gleiche Wiederfindung 6 von HPV-18-DNA aus ca. 10 positiven HeLa-Zellen mit integrierten HPV-18-Genomen, die in STM und in einem Pool negativer Zellen in PreservCyt Lösung gespickt waren, untersucht. Jeder Probentyp wurde 36 nach den in dieser Packungsbeilage beschriebenen Verarbeitungs-/Denaturierungsverfahren verarbeitet und mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test mittels der High-Risk-HPV-Sonde getestet. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Wiederfindung der HPV-18-DNA aus humanen Karzinomzellen für die beiden Medien äquivalent ist und dass sich das Vorbereitungsverfahren der PreservCyt Lösung nicht auf die analytische Empfindlichkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests auswirkt. KORRELATION ZWISCHEN SUREPATH-PROBENERGEBNIS UND QIAGEN STM PROBEN IN EINER KLINISCHEN POPULATION In den USA wurde eine zweiphasige Bewertung anhand von 6 Laborzentren und 3 Test-Sites durchgeführt. Patienten von Abteilungen für sexuell übertragbare Krankheiten, Gynekologie, Kolposkopie, eines Krankenhauses oder einer Familienplanungsstelle waren für die Teilnahme nach vorbestimmten Ein- und Ausschlusskriterien qualifiziert. An der Feasibility-Phase, während der ein passender hc2 High-Risk HPV DNA Assay-Cutoff für die Verwendung mit SurePath-Proben bestimmt werden sollte, waren ca. 400 Patienten beteiligt. Die klinische Evaluierungssphase zur Bewertung des gewählten Assay-Cutoff-Wertes, an der ca. 1500 Patienten beteiligt waren, begann, nachdem eine Feasability-Interimanalyse gezeigt hatte, dass ein Assay-Cutoff-Wert von 1,0 RLU/CO unter Verwendung von SurePath Proben, eine akzeptable Übereinstimmung mit den Probeergebnissen von QIAGEN’s STM ergab. Für beide Evaluierungsphasen wurden gepaarte SurePath und STM-Zervixproben von allen einwilligenden Patientinnen genommen. Anschließend wurde die SurePath Probe zur Aufbereitung an ein zytologisches Labor geschickt. Nach der zytologischen Präparation wurden die übrigen SurePathProben und die entsprechenden STM-Proben mit dem hc2 High-Risk HPV DNA-Test ahand eines AssayCutoffs von 1,0 RLU/CO getestet. In Tabelle 15 wird die Korrelation zwischen den SurePath-Ergebnissen und den gepaarten STM-Proben, dargestellt, die sich aus dem für die Datenanalyse zulässigen Endergebnis aller Teilnehmerinnen ergab. Tabelle 15 SurePath Ergebnisübereinstimmung mit QIAGEN’s STM (alle Altersgruppen und zytologischen Klassifikationen) (n = 1490) Positive Übereinstimmung % Negative Übereinstimmung % 95% CI 95% CI (n/N) (n/N) Niedrig Negativ Hoch positiv Alle Negativ Untergruppe Alle Positiv Untergruppe (RLU/CO ≥ 2,5) RLU/CO (<0,80) 93,5 96,4 95,3 96,0 90,7, 95,6 94,1, 98,0 93,8, 96,5 94,6, 97,1 (401/429) (378/392) (1011/1061) (1002/1044) Diese Ergebnisse zeigen, dass die relative Assay-Sensitivität und Spezifizität unter Verwendung von SurePath-Proben eine hohe Korrelation mit dem durch die STM-Proben erzielten Ergebnis aufweist, nachgewiesen durch den unteren Wert des Konfidenzintervalls von 95% für die positive und negative Übereinstimmung. REPRODUZIERBARKEIT Es wurde eine multizentrische Reproduzierbarkeitsstudie bezüglich unterschiedlicher Tage und Orte und der Gesamtreproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests mittels eines Panels von HPV-DNATargets und HPV-positiven und HPV-negativen in STM entnommenen klinischen Proben durchgeführt. Drei externe Laboratorien führten die Tests mit der gleichen Charge der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testkits an 3 verschiedenen Tagen mit einem identischen Reproduzierbarkeitspanel durch. Das Reproduzierbarkeitspanel schloss folgende Proben ein: 12 denaturierte klinische STM-Proben-Pools; 3 nicht denaturierte klinische Proben-Pools in PreservCyt Lösung; einen Negativkalibrator und einen positiven High-Risk-HPV-Calibrator, bei Konzentrationen von 1 pg/ml, 0,5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml und 37 10 pg/ml. Alle Panelproben wurden täglich in Dreifachbestimmung sowohl mit der High-Risk-HPV-Sonde als auch den CPC-Verfahren getestet. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 16 hervor. Tabelle 16 Zusammenfassung der Statistik insgesamt für die multizentrische Reproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPVDNA-Tests Statistische Erhebung Anteil von erwarteten positiven Ergebnissen mit einem beobachteten positiven Ergebnis Anteil von erwarteten negativen Ergebnissen mit einem beobachteten negativen Ergebnis High-Risk-HPV-Sonde 100 % (99,0-100,0)* 99,0 % (97,49-99,73)* Übereinstimmung 99,5% (98,70-99,86)* Kappa 0,990 *Die Zahlenangaben in Klammern zeigen die 95 %Konfidenzintervalle an. Die Gesamtdaten sind eine Kombination aller Durchläufe an allen Orten. Hieraus geht hervor, dass die Reproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests mit in STM entnommenen klinischen Proben sehr gut ist. 38 KREUZREAKTIVITÄT KREUZREAKTIVITÄTSPANEL Eine Reihe von Bakterien, Viren und Plasmiden, die häufig im weiblichen Anogenitaltrakt vorkommen, sowie eine Sammlung kutaneotropher HPV-Typen, für die Klone zur Verfügung standen, wurden getestet, um festzustellen, ob eine Kreuzreaktivität mit den im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test verwendeten HPV5 7 Sonden auftritt. Alle Mikroorganismen wurden bei Konzentrationen von 1 x 10 und 1 x 10 Organismen pro ml getestet. Gereinigte DNAs von Viren und Plasmiden wurden bei einer Konzentration von 4 ng/ml untersucht. Nachstehend folgt eine Liste der getesteten Bakterien. Alle Bakterien waren im hc2 High-Risk-HPV-DNATest negativ. Acinetobacter anitratus Acinetobacter lwoffi (ATCC 17908) Bacteroides fragilis (ATCC 25285) Bacteroides melaninogenicus Candida albicans (ATCC 14053 or 10231) Chlamydia trachomatis Enterobacter cloacae Escherichia coli (HB101)* Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi Klebsiella pneumoniae Lactobacillus acidophilus Mobiluncus curtisii Mobiluncus mulieris Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424) Neisseria lactamica (NRL 2118) Neisseria meningitidis (ATCC 13077) Neisseria sicca (ATCC 29256) Peptostreptococcus anaerobius Proteus vulgaris (ATCC 21117, 8427, 33420) Serratia marcescens Staphylococcus aureus (Cowan-Stamm) Staphylococcus epidermidis Streptococcus faecalis (ATCC 14508) Streptococcus pyogenes (ATCC27762) Treponema pallidum Trichomonas vaginalis Ureaplasma urealyticum * Sowohl der zum Wachsen von Plasmiden (HB101) verwendete E. coli-Stamm als auch ein klinisches Isolat von E. coli wurden untersucht. Nachstehend findet sich eine Liste der getesteten Virus- oder Plasmid-DNA oder des Humanserums: Adenovirus 2 Cytomegalovirus Epstein-Barr-Virus Hepatitis-B-Surface-Antigen-positives Serum Herpes simplex I Herpes simplex II Human Immunodeficiency Virus (HIV, RT-DNA) Simian-Virus-Typ 40 (SV40) Humanes Papillomavirus Typ 1 Humanes Papillomavirus Typ 2 Humanes Papillomavirus Typ 3 Humanes Papillomavirus Typ 4 Humanes Papillomavirus Typ 5 Humanes Papillomavirus Typ 8 Humanes Papillomavirus Typ 13 Humanes Papillomavirus Typ 30 pBR322 Bei dem einzigen Plasmid, das im hc2 High-Risk-HPV- DNA-Test Kreuzreaktivität aufwies, handelte es sich um pBR322. Eine Kreuzreaktivität zwischen pBR322 und der hc2 High-Risk-HPV-Testsonde ist nicht unerwartet, weil die Entfernung der gesamten Vektor-pBR322-DNA bei der Isolation des HPV-Inserts schwierig ist. Das Vorliegen homologer Sequenzen von pBR322 in Proben aus dem menschlichen Genitale wurde berichtet, und falsch-positive Ergebnisse könnten bei Vorliegen hoher bakterieller Plasmid-Konzentrationen auftreten. Von den 298 klinischen Proben, die im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test positiv waren, ließen jedoch keine auf positive Ergebnisse schließen, die – wenn mit einer pBR322Sonde getestet – auf pBR322 zurückzuführen waren. Folglich scheint die Wahrscheinlichkeit, im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test aufgrund homologer pBR322-Sequenzen in klinischen Proben falschpositive Ergebnisse zu erhalten, gering zu sein. 39 KREUZHYBRIDISIERUNG Mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test wurden 18 verschiedene HPV-Typen (High- und Low-Risk) bei Konzentrationen von 4 ng/ml HPV-DNA getestet. Alle High-Risk-HPV-Targets waren mit der High-RiskHPV-Sonde positiv. Aus dieser Studie ging auch hervor, dass im geringem Ausmaß eine Kreuzhybridisierung zwischen HPV-Typen 6 and 42 und der High-Risk-HPV-Sonde auftrat. Patientenproben mit hohen HPV-6- oder HPV-42-DNA-Spiegeln (4ng/ml oder höher) können mit dem hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test falsch-positiv sein. Die klinische Signifikanz besteht darin, dass Patientinnen mit 4 ng/ml oder mehr HPV-6- oder HPV-42-DNA unnötigerweise zur Kolposkopie überwiesen werden könnten. Es wurde auch gezeigt, dass der hc2-High-Risk-HPV-DNA-Test mit den HPV-Typen 40, 53 und 66 kreuzreagiert. Diese Typen sind selten, und es liegen nicht genügend Hinweise zur Ermittlung der genauen Korrelation zwischen der Infektion mit diesen Typen und der Entstehung einer High-Grade38 Erkrankung vor . In der Literatur wurde zudem auch berichtet, dass komplexe Sonden, ähnlich den in diesem Test verwendeten, aufgrund der Kreuzhybridisierung mit HPV-Typen 11, 53, 54, 55, 66, MM4, 39 MM7, MM8 oder MM9 zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten. Obwohl mehrere dieser HPVTypen selten sind oder neuen Typen bei der High-Grade-Erkrankung häufig nicht begegnet wird, könnten Patientinnen, in deren Proben nachweislich hohe Konzentrationen dieser HPV-DNA-Typen vorliegen, unnötigerweise zur Kolposkopie überwiesen werden. EFFEKT VON BLUT UND ANDEREN SUBSTANZEN AUF STM-PROBEN Der Effekt von Blut und anderen potenziell störenden definierten und nicht definierten Substanzen wurde im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test bewertet. Vollblut, Duschbad, antifungale Creme und empfängnisverhütendes Gel (Mittel, die häufig in Zervixproben gefunden werden können) wurden den STM-negativen und -positiven Proben (Pools klinischer Proben und nicht klinischer Proben) in Konzentrationen zugefügt, die in Zervixproben gefunden werden können. Es wurden mit keinem der vier Mittel bei keiner der Konzentrationen falsch-positive Ergebnisse beobachtet. Ein falsch-negatives Ergebnis kann jedoch in klinischen Proben mit HPV-DNA-Konzentrationen dicht an denen des positiven Grenzwerts für den Assay (1 pg/ml) gefunden werden, wenn hohe Konzentrationen einer antifungalen Creme oder eines empfängnisverhütenden Gels vorlagen. Es ist jedoch sehr unwahrscheinlich, dass eine klinische Probe fast vollständig aus einer dieser Substanzen besteht, weil die Zervix vor Entnahme von Proben für den Pap-Abstrich und zum HPV-Testen routinemäßig gereinigt wird. EFFEKT VON BLUT UND ANDEREN SUBSTANZEN AUF PROBEN IN PRESERVCYT LÖSUNG Der Effekt von Blut und anderen potenziell störenden definierten oder nicht definierten Substanzen, die in klinischen Proben in PreservCyt Lösung potenziell vorliegen können, wurde im hc2 High-Risk-HPV-DNATest bewertet. Vollblut, Duschbad, antifungale Creme und empfängnisverhütende Gele (Mittel, die in Zervixproben häufig anzutreffen sind) wurden den Pools negativer und positiver klinischer Proben in PreservCyt Lösung in Konzentrationen, die in der Zervixprobe gefunden werden können, zugefügt. Mit keinem der vier Mittel und bei keiner der Konzentrationen wurden falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse beobachtet. In einigen klinischen Proben inhärent vorkommende Substanzen inhibieren ferner nicht den Nachweis der HPV-DNA im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test. REPRODUZIERBARKEIT DES hc2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS MIT IN STM GEGEBENEN KLINISCHEN PROBEN Die Reproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests mit in STM gegebenen klinischen Proben wurde in einer Studie unter Verwendung von 20 klinischen Pools (10 positiven und 10 negativen), die durch Kombination zuvor denaturierter und getesteter in STM gegebener Bürsten-Zervixproben vorbereitet wurden, bestimmt. Die Proben wurden in 4 Wiederholungsbestimmungen an jedem von 5 Tagen für insgesamt 20 Wiederholungsbestimmungen pro Probe getestet. Das Testen wurde unter Verwendung eines Kombinationssonden-Cocktails durchgeführt, der aus der hc2 High-Risk-HPV-DNATestsonde und den Sonden des Low-Risk-HPV-Typs bestand. Mittelwerte, Standardabweichung und 95 %-Konfidenzintervalle um den Mittelwert (KI) wurden für jede Probe innerhalb eines Tages und über 5 Tage getestet und gehen aus Tabelle 17 hervor. Es wird nicht erwartet, dass die Reproduzierbarkeit 40 des Assays anders wäre, wenn nur die in diesem Kit enthaltende Sonde des High-Risk-HPV-Typs verwendet wird. Tabelle 17 Mittlere RLU/CO mit Konfidenzintervallen und prozentualen Anteilen positiver Proben (absteigende Reihenfolge des mittleren RLU/CO) Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Probe ID 10 20 11 12 15 13 16 17 14 18 19 7 4 9 1 2 8 3 6 5 Mittlere RLU/CO 3,18 1,43 1,25 1,21 1,20 1,07 1,06 1,04 0,98 0,92 0,72 0,40 0,38 0,37 0,35 0,35 0,32 0,30 0,27 0,26 KI 3,02-3,35 1,36-1,50 1,20-1,28 1,15-1,27 1,14-1,25 1,01-1.,11 1,01-1,09 1,00-1,06 0,92-1,02 0,87-0,96 0,68-0,75 0,33-0,46 0,35-0,39 0,32-0,41 0,32-0,36 0,31-0,37 0,29-0,34 0,27-0,31 0,24-0,30 0,23-0,28 Positiv (%) 100 (20/20) 100 (20/20) 100 (20/20) 100 (20/20) 100 (20/20) 80 (16/20) 75 (15/20) 80 (16/20) 45 (9/20) 20 (4/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) Für die 5 Proben mit einem mittleren RLU/CO bei 20 % oder mehr über dem Grenzwert (Nr. 1-5), waren 100 von 100 Wiederholungsbestimmungen (100,0 %) positiv. Für die 5 Proben mit einem mittleren RLU/CO innerhalb von 20 % über oder unter dem Grenzwert des Assays (Nr. 6-10) waren 60 von 100 der Wiederholungsbestimmungen positiv, und 40 von 100 (40 %) waren negativ. Für die 10 Proben mit einer mittleren RLU/CO bei mehr als 20 % unter dem Grenzwert des Assays waren 200 von 200 Wiederholungsbestimmungen (100 %) negativ. Folglich waren Proben mit einer mittleren RLU/CO von 20 % oder mehr über dem Grenzwert die gesamte Zeit über 100 % positiv, während Proben mit einer mittleren RLU/CO von 20 % oder mehr unter dem Grenzwert die gesamte Zeit über 100 % negativ waren, was darauf hindeutet, dass von Proben, die 20 % oder mehr vom Grenzwert entfernt liegen, erwartet werden kann, dass sie konsistente Ergebnisse ergeben. Dicht am Grenzwert befindliche Proben ergaben annähernd die gleiche Anzahl positiver und negativer Ergebnisse. Diese Daten deuten darauf hin, dass STM-Proben mit dem hc2 High-Risk-HPVDNA-Test reproduzierbare Resultate ergeben. REPRODUZIERBARKET DES hc2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TESTS MIT IN PRESERVCYT LÖSUNG GEGEBENEN KLINISCHEN PROBEN Die Reproduzierbarkeit des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests mit in PreservCyt Lösung gegebenen klinischen Proben wurden in einer Studie mit 24 Blindproben bei verschiedenen HPV-DNAKonzentrationen bestimmt. Die Proben bestanden aus PreservCyt Lösung und Leukozyten mit und ohne HPV-16-Plasmid enthaltenden Bakterien. Die Proben wurden in Wiederholungsbestimmungen von 4 an jedem von 5 Tagen für insgesamt 20 Wiederholungsbestimmungen pro Probe bestimmt. An jedem der 5 Tage der Studie wurde von jeder Probe ein 8-ml-Aliquot verarbeitet und nach den in der Packungsbeilage enthaltenen Anweisungen für das hc2-Probenkonversionskit getestet. Mittelwerte, Standardabweichungen und 95 %Konfidenzintervalle (KI) wurden für jede Probe innerhalb eines jeden Tages und über alle 5 Tage und Wiederholungsbestimmungen berechnet. Die mittlere RLU/CO, das Konfidenzintervall um den Mittelwert 41 und der Prozentsatz positiver Wiederholungsbestimmungen gehen für jede Probe, in absteigender Reihenfolge, basierend auf der mittleren RLU/CO, aus Tabelle 18 hervor. Tabelle 18 Mittlere RLU/CO mit Konfidenzintervallen und prozentualen Anteilen positiver Proben (absteigende Reihenfolge der mittleren RLU/CO) Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Probe Nr. 21 12 13 17 18 15 23 16 20 19 22 11 14 24 3 1 7 2 5 4 9 8 10 6 Mittlere RLU/CO 3,51 1,58 1,42 1,38 1,36 1,32 1,17 1,14 1,10 1,06 1,05 1,04 0,94 0,77 0,28 0,27 0,27 0,27 0,26 0,24 0,23 0,22 0,22 0,19 KI 3,19-3,83 1,48-1,69 1,32-1,52 1,23-1,53 1,23-1,48 1,16-1,49 1,06-1,27 1,07-1,20 0,96-1.,21 0,95-1,17 0,99-1,10 0,96-1,11 0,86-1,01 0,73-0,81 0,25-0,30 0,24-0,30 0,25-0,30 0,25-0,28 0,24-0,28 0,22-0,25 0,21-0,25 0,18-0,27 0,20-0,25 0,17-0,21 Positiv (%) 100 (20/20) 100 (20/20) 100 (20/20) 90 (18/20) 95 (19/20) 85 (17/20) 75 (15/20) 75 (15/20) 85 (17/20) 45 (9/19) 70 (14/20) 65 (13/20) 25 (5/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) 0 (0/20) Für die 6 Proben mit einer mittleren RLU/CO bei 20 % oder mehr über dem Grenzwert (Nr. 1-6), waren 114 von 120 Wiederholungsbestimmungen (95,0 %) positiv. Für die 7 Proben mit einer mittleren RLU/CO innerhalb von 20 % über oder unter dem Assay-Grenzwert (Nr. 7-13), waren 88 von 139 (63,3 %) der Wiederholungsbestimmungen positiv und 51 von 139 (36,7 %) waren negativ. Für die 4 Proben in den 10 % über oder unter dem Grenzwert (Nr. 10-13) waren 41 der 79 (51,9 %) der Wiederholungsbestimmungen positiv und 38 (48,1 %) waren negativ. Für die 11 Proben mit der mittleren RLU/CO bei mehr als 20 % unter dem Assay-Grenzwert waren 220 von 220 Wiederholungsbestimmungen (100 %) negativ. Folglich waren Proben mit einer mittleren RLU/CO von 20 % oder mehr über dem Grenzwert mehr als 95 % der Zeit positiv, während Proben mit einer mittleren RLU/CO von 20 % oder mehr unter dem Grenzwert 100 % der Zeit negativ waren, was erkennen lässt, dass von Proben, die 20 % oder mehr vom Grenzwert entfernt liegen, erwartet werden kann, dass sie konsistente Ergebnisse ergeben. Proben dicht am Grenzwert ergaben annähernd die gleiche Anzahl positiver und negativer Ergebnisse. Diese Daten weisen darauf hin, dass Proben in PreservCyt Lösung im hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test reproduzierbare Ergebnisse ergeben. REPRODUZIERBARKEIT EINES HC2 HIGH-RISK HPV DNA-TESTS MIT PROBEN IN SUREPATH KONSERVIERUNGSFLÜSSIGKEIT Es wurden Reproduzierbarkeitsbewertungen durchgeführt, um die Eignung von 3 Labors zu beschreiben, ein ähnliches diagnostisches Ergebnis an verschiedenen Tagen und verschiedenen Durchläufen mit einer identischen Gruppe von Proben mit bekanntem Positiv-/Negativ-HPV-Status unter Verwendung eines Assay-Cutoff-Werts von 1,0 RLU/CO zu erzielen. 42 Panel-Proben wurden präpariert, indem eindeutige SurePath-Patientenproben mit einem bekannten negativen und positiven HPV-Status kombiniert wurden, um die gewünschten RLU/CO-Zielwerte zu erreichen. Alle Panel-Proben wurden in doppelter Ausfertigung, zweimal am Tag und 5 Tage lang in jedem der drei beteiligten Labors getestet. Tabelle 19 Reproduzierbarkeitsstudie SurePath-Proben Qualitative Ergebnisse nach Panel-Proben PanelProben 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Mittlere RLU/CO 0,20 0,21 0,22 0,28 0,36 0,83 1,17 19,47 25,65 81,52 154,18 765,29 Erwartetes Ergebnis negativ negativ negativ negativ negativ negativ positiv positiv positiv positiv positiv positiv HPV-positiv n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 2 (3,3) 2 (3,3) 13 (21,7) 26 (43,3) 60 (100) 60 (100) 60 (100) 60 (100) 60 (100) HPV-negativ n (%) 60 (100) 60 (100) 60 (100) 58 (96,7) 58 (96,7) 47 (78,3) 34 (56,7) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) REPRODUZIERBARKEIT DER SUREPATH-ERGEBNISSE UNTER VERWENDUNG DES HALBAUTOMATISCHEN QIAGEN RAPID CAPTURE SYSTEM FOR ASSAY PROCESSING Die Reproduzierbarkeit der SurePath Probenergebnisse unter Verwendung des Rapid Capture System zur Assay-Behandlung wurden mit den Ergbnissen der manuellen Behandlung von Assays verglichen. Es wurden zwei vergleichende Tests an separaten Aliquoten der gleichen behandelten Proben durchgeführt. Tabelle 20 Innerhalb der Proben SurePath Ergbnisübereinstimmung mit RCS (RCS im Vergleich zu manuellem Assay) Positive Übereinstimmung % 95% CI (n/N) Hoch positiv Alle positiv Untergruppe (RLU/CO ≥ 2,5) 99,0 100 417/421 375/375 97,6, 99,7 99,0, 100 Negative Übereinstimmung % 95% CI (n/N) Niedrig Negativ Alle negativ Untergruppe RLU/CO (<0,80) 97,7 98,7 1057/1079 1050/1064 96,9, 98,7 97,8, 99,28 43 GRENZEN DES VERFAHRENS In-vitro-Diagnostikum Weitere Grenzen des Verfahrens, die für Tests mit großen Probendurchsätzen typisch sind, sind dem Benutzer-Anwendungshandbuch zum Rapid Capture System zu entnehmen. • Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test auf das humane Papillomavirus, Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68 wird nicht zur Bewertung bei Verdacht auf sexuellen Missbrauch empfohlen. • Die Prävalenz einer HPV-Infektion in einer Population kann sich auf die Leistung auswirken. Positive Vorhersagewerte nehmen beim Testen von Populationen mit einer niedrigen Prävalenz oder einzelnen Patientinnen mit keinem Infektionsrisiko ab. • Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit einer HPV-Infektion nicht aus, weil sehr geringe Konzentrationen oder ein Probenentnahmefehler zu einem falsch-negativen Ergebnis führen können. Dieser Test weist überdies nicht die HPV-DNA der Low-Risk-Typen (6, 11, 42, 43 und 44) nach. • Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test kann nur mit Zervixproben, die mit dem DNAPap oder dem HC Cervical Sampler entnommen oder Biopsien, die in Specimen Transport Medium gegeben wurden oder Zervixproben, die mit einer Entnahmevorrichtung des Besentyps oder einer Bürsten-/Spatelkombination entnommen und in PreservCyt-Lösung oder SurePath Preservative Fluid gegeben wurden, verwendet werden. Biopsieproben können nur bestimmt werden, wenn sie sofort in Specimen Transport Medium gegeben und bis zur Bestimmung bei -20 °C gelagert werden. • Der DNAPap und der HC Cervical Sampler sollten nicht zur Probenentnahme bei schwangeren Frauen verwendet werden. • Eine Infektion mit HPV ist weder ein definitiver Indikator des Vorliegens einer High-GradeZervixerkrankung, noch impliziert sie in allen Fällen, dass sich eine High-Grade-Erkrankung oder ein Karzinom entwickeln wird. • Eine geringfügige Kreuzhybridisierung zwischen HPV-Typen 6, 11, 40, 42, 53, 54, 55, 66, MM4, MM7, MM8, und MM9, und der High Risk-HPV-Sonde ist zu beobachten. Patientinnen mit Proben, die hohe Konzentrationen dieser HPV-Typen enthalten, könnten gegebenenfalls 38-39 . unnötigerweise zur Kolposkopie überwiesen werden • Der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test ist zum Nachweis von High-Risk-HPV-Typen, einschließlich 39, 58, 59 und 68 ausgelegt. Von QIAGEN durchgeführte analytische Studien unter Verwendung klonierter HPV-Plasmid-DNA weisen darauf hin, dass diese Typen bei Konzentrationen im Bereich von 0,62 pg/ml bis 1,39 pg/ml mit diesem Assay nachgewiesen werden können. Dies entspricht den Nachweischarakteristika der anderen HPV-Typen, auf die der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Test gerichtet war. QIAGEN konnte den Nachweis dieser HPV-Typen nur an einer begrenzten Anzahl klinischer Proben validieren. Aufgrund der geringen Prävalenz dieser Typen in der Allgemeinbevölkerung (wie aus Bosch et. al.35 hervorgeht) wurden die Leistungsmerkmale des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests zum Nachweis der HPV-Typen 39, 58, 59 und 68 nicht statistisch bestätigt. • Wenn hohe Konzentrationen an antifungaler Creme, empfängnisverhütendem Gel oder Duschbad zum Zeitpunkt der Probenentnahme zum HPV-Test vorhanden waren, ist die Erzielung eines falsch-negativen Ergebnisses wahrscheinlich, wenn diese Proben HPV-DNAKonzentrationen enthalten, die RLU/Grenzwert Quotienten in der Nähe des AssayGrenzwertes ergeben. • Kreuzreaktivität zwischen der hc2 High-Risk-HPV-DNA-Testsonde und dem Plasmid pBR322 ist möglich. Das Vorliegen homologer Sequenzen von pBR322 in Proben vom humanen Genitale wurde berichtet, und bei Vorliegen hoher bakterieller Plasmidkonzentrationen könnten falsch-positive Ergebnisse auftreten. 44 LITERATUR 1. Broker, T. R.; Botchan, M. Papillomaviruses: retrospectives and prospectives. In: DNA Tumor Viruses. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1986: 17-36. Von der Krebszellentagung 1985 in Cold Spring Harbor. 2. Lorincz, A. T.; Reid, R. Association of human papillomavirus with gynecologic cancer. Current Opinion in Oncology 1:123-132; 1989. 3. Jenson, A. B.; Kurman, R. J.; Lancaster, W. D. Human papillomaviruses. In: Belshe, R. B. Textbook of Human Virology. Littleton, MA: PSG-Wright; 1984: 951-968. 4. Becker, T. M.; Stone, K. M.; Alexander, E. R. Genital human papillomavirus infection: a growing concern. Obstet Gynecol Clin North Am 14(2):389-396; 1987. 5. McCance, D. J.; Walker, P. G.; Dyson, J. L.; Coleman, D. V.; Singer, A. Presence of human papillomavirus DNA sequences in cervical intraepithelial neoplasia. Br Med J 287:784-788; 1983. 6. Naghashfar, Z.; Sawada, E.; Kutcher, M. J.; Swancar, J.; Gupta, J.; Daniel, R.; Kashima, H.; Woodruff, J. D.; Shah, K. Identification of genital tract papillomaviruses HPV-6 and HPV-16 in warts of the oral cavity. J Med Virol 17:313-324; 1985. 7. Gissmann, L.; Wolnik, L.; Ikenberg, H.; Koldovsky, U.; Schnurch, H. G.; zur Hausen, H. Human papillomavirus types 6 and 11 DNA sequences in genital and laryngeal papillomas and in some cervical cancers. PNAS USA 80:560-563; 1983. 8. Munoz, N.; Bosch, F. X.; Shah, K. V.; Meheus, A., Eds. The Epidemiology of Cervical Cancer and Human Papillomavirus. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 1992. IARC Scientific Publication Nr. 119. 9. Reid, R.; Greenberg, M.; Jenson, A. B.; Husain, M.; Willett, J.; Daoud, Y.; Temple, G.; Stanhope, C. R.; Sherman, A. I.; Phibbs, G. D.; Lorincz, A. T. Sexually transmitted papillomaviral infections. I. The anatomic distribution and pathologic grade of neoplastic lesions associated with different viral types. Am J Obstet Gynecol 156(1):212-222; 1987. 10. Fuchs, P. G.; Girardi, F.; Pfister, H. Human papillomavirus DNA in normal, metaplastic, preneoplastic and neoplastic epithelia of the cervix uteri. Int J Cancer 41:41-45; 1988. 11. Lorincz, A. T.; Temple, G. F.; Kurman, R. J.; Jenson, A. B.; Lancaster, W. D. Oncogenic association of specific human papillomavirus types with cervical neoplasia. JNCI 79(4):671-677; 1987. 12. Lorincz, A. T.; Lancaster, W. D.; Temple, G. F. Cloning and characterization of the DNA of a new human papillomavirus from a woman with dysplasia of the uterine cervix. J Virol 58(1):225-229; 1986. 13. Beaudenon, S.; Kremsdorf, D.; Croissant, O.; Jablonska, S.; Wain-Hobson, S.; Orth, G. A novel type of human papillomavirus associated with genital neoplasias. Nature 321:246-249; 1986. 14. Lorincz, A. T.; Quinn, A. P.; Lancaster, W. D.; Temple, G. F. A new type of papillomavirus associated with cancer of the uterine cervix. Virology 159:187-190; 1987. 15. Naghashfar, Z. S.; Rosenshein, N. B.; Lorincz, A. T.; Buscema, J.; Shah, K. V. Characterization of human papillomavirus type 45, a new type 18-related virus of the genital tract. J gen Virol 68:3073-3079; 1987. 16. Nuovo, G. J.; Crum, C. P.; de Villiers, E. M.; Levine, R. U.; Silverstein, S. J. Isolation of a novel human papillomavirus (type 51) from a cervical condyloma. J Virol 62(4):1452-1455; 1988. 17. Shimoda, K.; Lorincz, A. T.; Temple, G. F.; Lancaster, W. D. Human papillomavirus type 52: a new virus associated with cervical neoplasia. J gen Virol 69:2925-2928; 1988. 18. Lorincz, A. T.; Quinn, A. P.; Goldsborough, M. D.; McAllister, P.; Temple, G. F. Human papillomavirus type 56: a new virus detected in cervical cancers. J gen Virol 70:3099-3104; 1989. 19. Lorincz, A. T.; Quinn, A. P.; Goldsborough, M. D.; Schmidt, B. J.; Temple, G. F. Cloning and partial DNA sequencing of two new human papillomavirus types associated with condylomas and low-grade cervical neoplasia. J Virol 63(6):2829-2834; 1989. 45 20. Beaudenon, S.; Kremsdorf, D.; Obalek, S.; Jablonska, S.; Pehau-Arnaudet, G.; Croissant, O.; Orth, G. Plurality of genital human papillomaviruses: characterization of two new types with distinct biological properties. Virology 161:374-384; 1987. 21. Lorincz, A. T.; Reid, R.; Jenson, A. B.; Greenberg, M. D.; Lancaster, W.; Kurman, R. J. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types. Obstet Gynecol 79:328-337; 1992. 22. Koutsky, L. A.; Holmes, K. K.; Critchlow, C. W.; Stevens, C. E.; Paavonen, J.; Beckmann, A. M.; DeRouen, T. A.; Galloway, D. A.; Vernon, D.; Kiviat, N. B. A cohort study of the risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 in relation to papillomavirus infection. N Engl J Med 327:1272-1278; 1992. 23. Nieminen, P.; Aho, M.; Vesterinen, E.; Stellato, G.; Vaheri, A.; Soares, V. R. X.; Paavonen, J. Natural history of HPV infection: preliminary results of a cohort study [abstract]. In: 1991 Papillomavirus Workshop. Seattle, WA: 1991: 77. 24. Sehulster, L. M.; Hollinger, F. B.; Dreesman, G. R.; Melnick, J. L. Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl Envir Microbiol 42(5):762-767; 1981. 25. Spire, B.; Barré-Sinoussi, F.; Montagnier, L.; Chermann, J. C. Inactivation of lymphadenopathy associated virus by chemical disinfectants. Lancet; 1984 October 20: pp. 899-901. 26. Martin, L. S.; McDougal, J. S.; Loskoski, S. L. Disinfection and inactivation of the human T lymphotropic virus type III/lymphadenopathy-associated virus. J Infect Dis 152(2):400-403; 1985. 27. Lorincz, A. T.; Schiffman, M. H.; Jaffurs, W. J.; Marlow, J.; Quinn, A. P.; Temple, G. F. Temporal associations of human papillomavirus infection with cervical cytologic abnormalities. Am J Obstet Gynecol 162(3):645-651; 1990. 28. Morrison, E. A. B.; Ho, G. Y. F.; Vermund, S. H.; Goldberg, G. L.; Kadish, A. S.; Kelley, K. F.; Burk, R. D. Human papillomavirus infection and other risk factors for cervical neoplasia: a case-control study. Int J Cancer 49:6-13; 1991. 29. Kahn, T.; Schwarz, E.; zur Hausen, H. Molecular cloning and characterization of the DNA of a new human papillomavirus (HPV 30) from a laryngeal carcinoma. Int J Cancer 51:61-65; 1986. 30. Schiffman, M. Latest HPV findings: some clinical implications. Cont. OB/GYN 38(10):27-40; 1993. 31. Volpers, C.; Streeck, R. E. Genome organization and nucleotide sequence of human papillomavirus type 39. Virology 181:419-423; 1991. 32. Matsukura, T.; Sugase, M. Molecular cloning of a novel human papillomavirus (type 58) from an invasive cervical carcinoma. Virology 177:833-836; 1990. 33. Rho, J.; Roy-Burman, A.; Kim, H.; de Villiers, E.M.; Matsukura, T.; Choe, J. Nucleotide sequence and phylogenetic classification of human papillomavirus type 59. Virology 203:158-161; 1994. 34. Longuet, M.; Beaudenon, S.; Orth, G. Two novel genital human papillomavirus (HPV) types, HPV68 and HPV70, related to the potentially oncogenic HPV39. J Clin Microbiol 34(3):738-744; 1996. 35. Bosch, F.X.; Manos, M.M.; Munoz, N.; Sherman, M.; Jansen, A.M.; Peto, J.;Schiffman, M.H.; Moreno,V.; Kurman,R.; Shah, K.V.; International Biological Study on Cervical Cancer (IBSCC) Study Group. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. JNCI 87(11):796-802; 1995. 36. Wheeler, C.M.; Stewart, A.M.; Gravitt, P.E.; Cheng, S. Generation of entire human papillomavirus genomes by long PCR: frequency of errors produced during amplification. Genome Research 5(1):79-88; 1995. 37. RD Burke, P Kelly, J Feldman, et. al., Declining Prevalence of Cervicovaginal Human Papillomavirus Infection With Age Is Independent of Other Risk Factors, Sexually Transmitted Diseases, Juli-August, 1996:333-341). 38. Meyer, T., et. al., Association of Rare Human Papillomavirus Types with Genital Premalignant and Malignant Lesions, J. Infectious Diseases, 178:252-255 (1998). 46 39. Vernon, S. D.; Unger, E. R.;and Williams, D.; Comparison of Human Papillomavirus Detection and Typing by Cycle Sequencing, Line Blotting, and Hybrid Capture, JCM, Feb. 2000, S. 651655. 40. CDC. Recommendations for Prevention of HIV Transmission in Health-Care Settings. MMWR 1987;36(2S):3S-18S. 41. Sehulster L.M., Hollinger F.B., Dreesman G.R., et al. Immunological and Biophysical Alteration of Hepatitis B Virus Antigens by Sodium Hypochlorite Disinfection. Appl Envir Microbiol 1981;42(5):762-7. 42. European Guidelines for the Quality Assurance in Cervical Screening. The European Journal of Cancer, ISSN 0944-1947, 29.A Supp. 4; 1993 47 hc2 HIGH-RISK-HPV-DNA-TEST LEITFADEN ZUR FEHLERSUCHE Beobachtung Mögliche Ursachen Lösungen Beobachtung eines falschen oder keines Farbumschlags während der Denaturierung. Das Denaturierungsreagenz wurde nicht vorschriftsmäßig vorbereitet oder Verifizieren, dass das Denaturierungsreagenz den Indikator-Farbstoff enthält und eine dunkel-purpurrote Farbe aufweist. das Denaturierungsreagenz wurde nicht zugefügt Verifizieren, dass das Denaturierungsreagenz der Probe mittels Abmessen des Probenvolumens (erwartet werden 1,5 ml) zugefügt wurde. Wenn anhand des Volumens ersichtlich ist, dass das Denaturierungsreagenz nicht zugefügt wurde, den entsprechenden Zusatz vornehmen, mischen und mit dem Assay fortfahren, wenn der richtige Farbumschlag beobachtet wurde. Proben enthalten Blut oder anderes Material, das den Farbumschlag maskiert. Mit diesen Probentypen wird der beschriebene genaue Farbumschlag nicht erwartet; die hc2 HPV-DNA-Testergebnisse sollten nicht nachteilig beeinflusst werden. Der pH der Probe könnte ungewöhnlich sauer sein. Die Qualitätskontrollen ergeben falsche Ergebnisse. Beobachtung eines falschen Farbumschlags während der Hybridisierung. Wahl des für den Test inkorrekten SoftwareProtokolls. Wenn keine der anderen Ursachen zutreffen, könnten die Proben gegebenenfalls ungewöhnlich sauer sein, und der erwartete Farbumschlag tritt nicht auf. Vor Applikation von Essigsäure auf die Zervix eine neue Probe entnehmen, da sich ein falscher pH der Proben nachteilig auf die Testergebnisse auswirkt. Wenn das Software-Protokoll für den durchzuführenden Test inkorrekt ist, sollte die Platte innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe von Nachweisreagenz 2 mit dem korrekten Protokoll erneut gemessen werden. Umgekehrte Platzierung von QC1-LR und QC2-HR. Proben erneut testen. Umgekehrte Platzierung von HRC und QC2HR Unzureichendes Mischen der Sondenmischung mit denaturierter Kontrolle, Kalibratoren und/oder Proben; oder die Sondenmischung wurde nicht zugefügt, oder ein falsches Reagenzvolumen wurde zugefügt. Proben erneut testen Die Probe enthält Blut oder anderes Material, das den Farbumschlag maskiert. Die Probe enthielt <1000 µl STM. Das Gestell mit der Mikrotiterplatte oder dem Mikroröhrchen zur Hybridisierung weitere 2 Minuten schütteln. Wenn Röhrchen oder Vertiefungen vorhanden sind, die weiterhin purpurrot bleiben, sollten zusätzliche 25 µl der entsprechenden Sondenmischung zugefügt und gut gemischt werden. Wenn nach Zugabe der Sondenmischung und erneutem Mischen die vorschriftsmäßige Farbänderung nicht auftritt und die Probe kein Blut oder andere Materialien enthielt, die Probe erneut testen. Mit diesen Probentypen wird der beschriebene genaue Farbumschlag nicht erwartet; die hc2 HPV-DNA-Testergebnisse sollten nicht nachteilig beeinflusst werden. Das Volumen der Originalprobe prüfen. Das Volumen sollte 1425 µl ±20 µl (nach Entfernung von 75 µl Aliquot zum Testen) betragen. Wenn das Volumen <1425 µl liegt, enthielt die Originalprobe < 1000 µl STM. Eine neue Probe entnehmen. 48 Beobachtung Mögliche Ursachen Lösungen Der Assay entspricht nicht den Validationskriterien. Es wurde kein Signal in den positiven Kalibratoren, in den Qualitätskontrollen oder in den Proben beobachtet. Dem Sondenverdünnungsmittel wurde keine Sonde zugefügt. Die Sondenmischung wie in der Packungsbeilage beschrieben vorbereiten. Die Röhrchen sorgfältig beschriften. Kontamination der Sonde mit RNase während der Vorbereitung. Beim Pipettieren der Sonde Filterspitzen verwenden und Handschuhe tragen. Die Sonde in einem sterilen Behälter verdünnen. Nur saubere, neue Einweg-Reagenzbehälter verwenden. Unzureichendes Mischen von Sonde und Sondenverdünnungsmittel. Nachdem die Sonde dem Sondenverdünnungsmittel zugefügt wurde, 5 Sekunden durch Vortexen bei hoher Geschwindigkeit sehr gründlich mischen. Es muss ein sichtbarer Wirbel gebildet werden. Unzureichendes Mischen von verdünnter Sonde und denaturierter Probe. Nach Zufügen der Sondenmischung und der Probe zu jeder Hybridisierungsmikrotiterplatten-Vertiefung oder jedem Hybridisierungsmikroröhrchen auf dem Kreisschüttler I, eingestellt auf 3 ±2 Minuten bei 1100 ±100 U/min, schütteln. Prüfen, dass in jedem Röhrchen ein Farbumschlag von purpurrot nach gelb auftritt. Inkorrekte Zeit oder Temperatur während des Hybridisierungsschrittes. 60 ±5 Minuten bei 65 ±2 °C hybridisieren. Die Temperatur des Mikrotiterplatteninkubators I oder des Wasserbades prüfen. Darauf achten, dass der Mikrotiterplatteninkubator I zum Erhitzen der Proben auf die korrekte Temperatur eingestellt ist und vor Gebrauch 60 Minuten vorgewärmt wurde. Sicherstellen, dass der Wasserspiegel zum Erhitzen der Proben auf die korrekte Temperatur ausreichend ist. Die Wasserbäder sollten periodisch kalibriert werden. Unzureichendes Mischen während des Capture-Schrittes. Auf dem Kreisschüttler I 60 ±5 Minuten bei 20 - 25 °C wie in der Packungsbeilage beschrieben schütteln. Die Geschwindigkeit des Kreisschüttlers I mittels Kalibration verifizieren. Die korrekte Menge des Nachweisreagenzes 1 wurde nicht zugefügt, oder es wurde nicht für die vorgeschriebene Zeit inkubiert. 75 µl Nachweisreagenz 1 mit einem 8-Kanal-Dispenser in jede Vertiefung pipettieren. 30 - 45 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Die richtige Menge des Nachweisreagenzes 2 wurde nicht zugefügt, oder es wurde nicht für die vorgeschriebene Zeit inkubiert. 75 µl Nachweisreagenz 2 mit einem 8-Kanal-Dispenser in jede Vertiefung pipettieren. 15 bis 30 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Funktionsstörung des Luminometers oder inkorrektes Programmieren. Weitere Informationen zum DML 2000-Instrument und der Software, Version 2, sind in der Gebrauchsanweisung (Abschnitt Wartung und Fehlersuche), im interaktiven Bedienerhandbuch für die Digene Hybrid Capture System, Version 2 (DHCS V.2) Software oder in der Gebrauchsanweisung für die Digene Qualitative Software einzusehen; oder setzen Sie sich mit Ihrem lokalen QIAGEN-Vertreter in Verbindung. 49 Beobachtung Mögliche Ursachen Lösungen Erhöhte RLU-Werte in den Kalibratoren, Qualitätskontrollen und/oder in den Proben (≥200 RLU in vielen oder allen Vertiefungen). Der Assay entspricht nicht den Validationskriterien. Es wurde kein Denaturierungsreagenz zugefügt; oder es wurde das inkorrekte Reagenzvolumen zugefügt; oder das Denaturierungsreagenz wurde unzureichend mit den Proben und Kalibratoren gemischt. Vor Zufügen des Denaturierungsreagenzes verifizieren, dass der Direktverdrängungssystem-Dispenser genaue Mengen abgibt. Kalibrierte Dispenser sind unerlässlich. Jedem Röhrchen die Hälfte des Denaturierungsreagenzvolumens zufügen und gut mischen. Zur Vermeidung falsch-positiver Ergebnisse darauf achten, dass die Flüssigkeit die gesamte Innenfläche des Röhrchens benetzt. Kalibratoren, Kontrollen und Proben sollten nach Zufügen des Denaturierungsreagenzes nach purpurrot umschlagen. Lichtaustritt in dem Luminometer. Tür nicht abgedichtet. Die Abdichtung um die Tür ist zerbrochen. Die Hintergrundablesung des Luminometers durch Ablesen einer leeren Mikrotiterplatte prüfen. Eine höhere Ablesung als 50 RLU deutet darauf hin, dass eine leichte Leckstelle vorliegt. Für weitere Anweisungen die Gebrauchsanweisung für das DML 2000-Instrument und die Software, Version 2, das interaktive Bedienerhandbuch für die Digene Hybrid Capture System Version 2 (DHCS V.") Software oder die Gebrauchsanweisung für die Digene Qualitative Software (Abschnitt Wartung und Fehlersuche) einsehen; oder setzen Sie sich mit Ihrem lokalen QIAGEN-Vertreter in Verbindung. Kontamination des Nachweisreagenzes 2 oder der Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen durch Nachweisreagenz 1 oder exogene alkalische Phosphatase. Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche. Kontaminierter Waschpuffer. Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche. Kontaminierter automatischer Plattenspüler I. Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche. Unzureichendes Spülen der CaptureMikrovertiefungen nach der Inkubation mit dem Nachweisreagenz 1. Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen 6 Mal gründlich mit Waschpuffer spülen, indem die Vertiefungen jedes Mal bis zum Überfließen gefüllt werden. Siehe die Bedienungs- und Wartungsanweisungen für den automatischen Plattenspülapparat I für Anleitungen zum Testen auf Kontamination oder Funktionsstörungen. Kontamination der MikrotiterplattenVertiefungen mit Nachweisreagenz 1. Darauf achten, dass alle Arbeitsflächen sauber und trocken sind. Bei der Verwendung von Nachweisreagenz 1 vorsichtig sein. Aerosole sind zu vermeiden. 50 Beobachtung Niedrige PK/NCQuotienten oder eine hohe Anzahl an gering positiven Proben mit Quotienten <2,0 (>20 %). Der Assay entspricht nicht den Validationskriterien . Mögliche Ursachen Lösungen Abtropfen der Hybridisierungslösung auf der gleichen Stelle der KimtowelsWischtücher oder entsprechenden fusselfreien Papiertüchern. Nicht zwei Mal an derselben Stelle des Kimtowels-Wischtuches oder des entsprechenden fusselfreien Papiertuches abtupfen. Verwendung falscher Saugtücher. Unzureichende Probenvorbereitung. Unzureichendes Mischen der Sondemischung oder den Assays wurde ungenügend Sondemischung zugefügt. Jedem Hybridisierungsmikroröhrchen wurde ein unzureichendes Volumen verdünnter Sonde zugefügt. Zum Abtupfen Kimtowels-Wischtücher oder geeignete fusselfreie Papiertücher verwenden Das entsprechende Denaturierungsreagenz-Volumen zufügen und mittels Vortexen gründlich mischen. Zum Vermeiden falsch-positiver Ergebnisse darauf achten, dass die Flüssigkeit sowohl mit dem manuellen als auch dem MST-Vortexer I-Verfahren (für das manuelle Vortexverfahren das Röhrchen einmal invertieren) die gesamte Innenfläche des Röhrchens benetzt. Es sollte ein distinkter Farbumschlag von klar nach purpurrot auftreten. 45 ±5 Minuten bei 65 ±2 °C inkubieren. Die Sondenmischungen, wie beschrieben, vorbereiten. Durch Vortexen gründlich mischen, darauf achten, dass ein sichtbarer Wirbel produziert wird. Die Sondenmischung ist den Röhrchen zur Gewährleistung einer genauen Abgabe mit einem Direktverdrängungssystem-Dispenser zuzufügen. Vor dem Zufügen der Sondenmischung zur Hybridisierungsmikrotiterplatte oder zu den Hybridisierungsmikroröhrchen verifizieren, dass der 8-Kanal-Dispenser die genauen Mengen abgibt. Jeder Mikrotiterplatten-Vertiefung bzw. jedem Mikroröhrchen mit denaturiertem Kalibrator, Qualitätskontrollen und klinischen Proben 25 µl zufügen. Vor Zufügen der Sondenmischung zu den Hybridisierungs-Mikrotiterplatten-Vertiefungen verifizieren, dass der 8-Kanal-Dispenser die genaue Menge abgibt. Nach dem Zufügen und gründlichen Mischen der Sondenmischung sollte ein Farbumschlag von dunkel-purpurrot nach gelb auftreten. Proben in PreservCyt-Lösung sollten anstelle von gelb nach rosa umschlagen. Nachweisreagenz 1 bei 2 - 8 °C lagern. Vor dem auf dem Etikett auf dem äußeren Behältnis des Kits angegebenen Verfallsdatum verwenden. Verlust der Aktivität des Nachweisreagenzes 1. Unzureichendes Capture. Der Capture-Schritt sollte unter Verwendung eines bei 1100 ±100 U/min eingestellten Kreisschüttlers I durchgeführt werden. Die Schüttlergeschwindigkeit durch Kalibration validieren. Unzureichendes Spülen. Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen 6 Mal gründlich mit Waschpuffer spülen, die Vertiefungen jedes Mal bis zum Überfließen füllen oder den automatischen Plattenspüler I verwenden. Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche. Reihe positiver Proben mit annähernd den gleichen RLUWerten. Kontaminierter Waschpuffer. Kontamination von Capture-MikrotiterplattenVertiefungen während der AssayManipulation. Kontamination des Nachweisreagenzes 2. Die Capture-Mikrotiterplatte während aller Inkubationen abdecken. Während der Durchführung des Assays dürfen die Röhrchen keinem Aerosol ausgesetzt werden. Während der Manipulationen ungepuderte Handschuhe tragen. Darauf achten, dass die Stammlösung beim Pipettieren des Nachweisreagenzes 2 in die Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen nicht kontaminiert wird. Eine Kontamination des Nachweisreagenzes 2 durch Aerosole aus dem Nachweisreagenz 1 oder aus dem Laboratoriumsstaub Funktionsstörung des automatischen Plattenspülers I. usw. ist zu vermeiden. Anleitungen zum Testen auf Kontamination oder Funktionsstörungen sind dem Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche oder der Bedienungs- und Wartungsanweisung für den automatischen Plattenspülapparat I zu entnehmen. 51 Beobachtung Mögliche Ursachen Lösungen Breiter VK(%) zwischen den Wiederholungsbestimmungen. Ungenaues Pipettieren. Den Dispenser überprüfen, um zu gewährleisten, dass reproduzierbare Volumina abgegeben werden. Die Dispenser routinemäßig kalibrieren. Unzureichendes Mischen. Bei allen Schritten gründlich mischen. Vor und nach der Denaturierungsinkubation und nach Zugabe der Sondenmischung vortexen. Darauf achten, dass ein sichtbarer Wirbel gebildet wird. Unvollständige Überführung von Flüssigkeit aus den Hybridisierungsmikroröhrchen in die Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen. Während des Überführungsschrittes aus der Hybridisierungsmikrotiterplatte oder den Hybridisierungsmikroröhrchen in die Capture-Mikrotiterplatten-Vertiefungen vorsichtig vorgehen, um zu gewährleisten, dass reproduzierbare Volumina überführt werden. Unzureichende Spülbedingungen. Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit Waschpuffer 6 Mal gründlich spülen, jedes Mal bis zum Überfließen füllen oder den automatischen Plattenspülapparat I und die relevanten Protokolle für den automatischen Plattenspülapparat I befolgen. Kontamination der MikrotiterplattenVertiefungen mit Nachweisreagenz 1. Sicherstellen, dass alle Arbeitsflächen sauber und trocken sind. Bei der Verwendung des Nachweisreagenzes 1 vorsichtig vorgehen. Aerosole vermeiden. Zur Verhinderung einer Kreuzkontamination der Proben beim Aliquotieren des Nachweisreagenzes 2 zwischen den Proben mit Vorsicht vorgehen. Wird nur ein Teil eines Kits verwendet, ist das für diesen Assay benötigte Volumen vor Befüllen des Dispensers in einen sauberen Einweg-Reagenzbehälter zu aliquotieren. Falsch-positive Ergebnisse aus bekannten negativen Proben. Erhöhte NegativkalibratorRLU-Werte (>200 RLU). Die Leistung des übrigen Assays ist wie erwartet. Kontamination von Nachweisreagenz 2. Kontamination der MikrotiterplattenVertiefungen mit Nachweisreagenz 1. Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit Waschpuffer 6 Mal gründlich spülen, jedes Mal bis zum Überfließen füllen oder den automatischen Plattenspüler I verwenden. Nach dem Spülen sollte in den Mikrotiterplatten-Vertiefungen keine restliche rosa Flüssigkeit zurückbleiben. Abtupfen im gleichen Bereich der KimtowelsWischtücher oder entsprechenden fusselfreien Papiertücher über mehrere Reihen. Nicht auf einem Bereich abtupfen, der bereits zuvor verwendet wurde. Unzureichende Probenvorbereitung. Das entsprechende Volumen des Denaturierungsreagenzes zufügen und mittels Vortexen gründlich mischen. Zur Verhinderung falsch-positiver Ergebnisse darauf achten, dass Flüssigkeit die gesamte Innenfläche des Röhrchens mit entweder dem manuellen Verfahren oder dem MST Vortexer I-Verfahren (für das manuelle Vortexverfahren das Röhrchen einmal invertieren) benetzt. Für Proben in PreservCyt Lösung ist auf vorschriftsmäßiges Mischen zu achten sowie darauf, dass die Resuspension des Zellpellets vor der Denaturierungsinkubation abgeschlossen ist. Protokolldetails gehen aus der Packungsbeilage für das hc2-Probenkonversionskit hervor. Es sollte ein distinkter Farbumschlag nach dunkel-purpurrot auftreten. 45 ±5 Minuten bei 65 ±2° C inkubieren. SurePath-Proben müssen 90±5 Minuten bei 65 ±2°C inkubiert werden Unzureichende Spülbedingungen. Die Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit Waschpuffer 6 Mal gründlich spülen, indem die Mikrovertiefungen jedes Mal bis zum Überfließen gefüllt werden oder der automatische Plattenspülapparat I verwendet und die vorschriftsmäßigen Protokolle für den automatischen Plattenspülapparat I befolgt werden. Kontamination der Pipettenspitze mit nichtdenaturiertem Material während des Transfers der denaturierten Probe in die Vertiefung der Mikrotiterplatte, die zur HPVSondenhybridisierung benutzt wird. Das Nachweisreagenz 2 wurde bei einer höheren Temperatur als 20 - 25 °C inkubiert. Der Denaturierungsschritt im Verfahren zur Probenbehandlung muss wie in dieser Anleitung beschrieben durchgeführt werden. Unsachgemäßes Vortexen der Proben oder Umdrehen und Schütteln der Röhrchen kann zur unvollständigen Denaturierung unspezifischer RNA/DNA-Hybride in den Zervixproben führen. Besonders bei der Verwendung von PreservCyt Solution- oder SurePath Preservative Fluid-Proben ist das Vorkommen dieser Hybride an den Innenwänden des Probenkonversionsröhrchens wahrscheinlich. Um einen eventuellen Transfer dieses nicht-denaturierten Zellmaterials zu vermeiden, darf die Pipettenspitze während des Transfers der denaturierten Probe in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte zur HPVSondenhybridisierung die Wände nicht berühren. Den Test wiederholen, und darauf achten, dass die Capture- und Nachweisschritte bei 20 - 25 °C inkubiert werden. Das Nachweisreagenz 2 wurde länger als 30 Minuten inkubiert. Die Platten nach 15-minütiger Inkubation (und nicht später als 30 Minuten nach der Inkubation) bei 20 - 25 °C messen. Das Nachweisreagenz 2 oder der Waschpuffer wurde mit alkalischer Phosphatase oder Nachweisreagenz 1 kontaminiert. Siehe Kontaminationstest in diesem Leitfaden zur Fehlersuche 52 Beobachtung Mögliche Ursachen Lösungen Der Assay entspricht nicht den Validationskriterien. Erhöhter PC/NCQuotient. Umgekehrte Platzierung von HRC und QC2HR Proben erneut testen. Die Etiketten des Kalibrators und der Qualitätskontrollsproben aufmerksam lesen, um zu vermeiden, dass diese Reagenzien umgekehrt platziert werden. KONTAMINATIONSTEST Getestetes Kontaminationstest-Verfahren Interpretation der Ergebnisse Reagenz Hinweis: Beim Pipettieren von Nachweisreagenz 2 vorsichtig vorgehen, um Kontaminationen zu vermeiden. Handschuhe tragen und Berührungen der Arbeitsoberfläche mit den Pipettenspitzen vermeiden. Nachweis• Der Kontrollwert des • 75 µl von Nachweisreagenz 2 aus dem angebrochenen reagenz 2 Nachweisreagenz 2 muss unter 50 oder dem Originalfläschchen in eine leere Vertiefung RLU liegen. einer Capture-Mikrotiterplatte geben. • Wenn die Werte des • 15 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Direkte Nachweisreagenz 2 unter 50 RLU Sonneneinstrahlung vermeiden. liegen, kann das Nachweisreagenz 2 • Die Mikrotiterplatte in das Luminometer einlesen. benutzt werden, um den Test zu wiederholen. Hinweis: Der Test von Nachweisreagenz 2 in Replikaten • Falls eine Kontamination vorliegt von 3 erlaubt eine optimale Leistungsüberprüfung. (oberhalb 50 RLU), einen neuen Kit benutzen und den Test wiederholen. Waschpuffersystem und/oder Wasseranschluss • • • • • • • • • Automatischer Plattenspüler • • • • • • • • • • • 75 µl des Nachweisreagenz 2 in 4 leere Vertiefungen einer Capture-Mikrotiterplatte geben. Die Vertiefungen mit 1-4 bezeichnen. Vertiefung 1 dient als Kontrolle für das Nachweisreagenz 2. Aus dem Behälter für Waschflüssigkeit 10 µl des Waschpuffers in Vertiefung 2 geben. Waschpuffer durch die Schläuche der Wascheinrichtung laufen lassen. Aus den Schläuchen 10 µl des Waschpuffers in Vertiefung 3 pipettieren. Etwas von dem Wasser nehmen, das zur Herstellung des Waschpuffers benutzt wird. Von dem Wasser 10 µl in Vertiefung 4 pipettieren. 15 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden. Die Mikrotiterplatte in das Luminometer einlesen. • 75 µl des Nachweisreagenz 2 in 5 leere Vertiefungen einer Capture-Mikrotiterplatte geben. Die Vertiefungen mit 1-5 bezeichnen. Vertiefung 1 dient als Kontrolle für das Nachweisreagenz 2. Aus dem mit Wash bezeichneten Behälter des Plattenspülers 10 µl des Waschpuffers in Vertiefung 2 geben. Aus dem mit Rinse bezeichneten Behälter des Plattenspülers 10 µl Spülflüssigkeit in Vertiefung 3 geben. Den Schalter „Prime“ auf der Tastatur des Plattenspülers betätigen, damit Waschpuffer durch die Leitungen fließen kann. Aus dem Behälter 10 µl des Waschpuffers in Vertiefung 4 pipettieren. Den Schalter „Rinse“ auf der Tastatur des Plattenspülers betätigen, damit Spülflüssigkeit durch die Leitungen fließen kann. Aus dem Behälter 10 µl des Waschpuffers in Vertiefung 5 pipettieren. Abdecken und 15 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden. Die Mikrotiterplatte in das Luminometer einlesen. • 53 • • • • • Der Wert der Kontrolle des Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1) muss unter 50 RLU liegen. Die RLU-Werte der Vertiefungen 2, 3 und 4 mit dem Wert der Kontrolle des Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1) vergleichen. Die RLU Werte der Vertiefungen 2, 3 und 4 dürfen den RLU Wert der Kontrolle des Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1) um nicht mehr als 50 RLU überschreiten. Werte, die mehr als 50 RLU über dem Wert der Kontrolle für das Nachweisreagenz 2 liegen, sind ein Zeichen für eine Kontamination. Hinweise zur Reinigung und Pflege des Plattenspülers finden sich im Abschnitt „Vorbereitung und Aufbewahrung der Reagenzien“. Der Wert der Kontrolle des Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1) muss unter 50 RLU liegen. Die RLU Werte der Vertiefungen 2, 3, 4 und 5 mit dem Wert der Kontrolle des Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1) vergleichen. Die RLU-Werte der Vertiefungen 2, 3, 4 und 5 dürfen den RLU Wert der Kontrolle des Nachweisreagenz 2 (Vertiefung 1) um nicht mehr als 50 RLU überschreiten. Werte, die mehr als 50 RLU über dem Wert der Kontrolle für das Nachweisreagenz 2 liegen, sind ein Zeichen für eine Kontamination des Plattenspülers. Siehe Bedienungsanleitung des automatischen Plattenspülers, Kapitel „Dekontamination“. QIAGEN KONTAKTINFORMATIONEN Benutzen Sie bitte das beigefügte Blatt mit Kontaktinformationen, um mit Ihrem zuständigen QIAGENVertreter in Verbindung zu treten. Hybrid Capture, Digene und Rapid Capture sind eingetragene Warenzeichen der QIAGEN Gaithersburg, Inc. DNAPap, Cervical Sampler, DML 2000, EXPAND-4, Female Swab Specimen Collection Kit, HC und Specimen Transport Medium sind Warenzeichen der QIAGEN Gaithersburg, Inc. Dieses Produkt und die zugehörigen Anwendungsverfahren sind von einem oder mehreren der folgenden Patente abgedeckt: U.S. HPV-Patente Nr. 4,849,331 ● 4,849,332 ● 4,849,334 ● 4,908,306 ● 5,411,857 ● 5,643,715 ● 5,712,092 ● 5,876,922 ● 5,952,487 ● 5,958,674 ● 5,981,173 ● 6,107,086 HPV-Patente (Ausland) Nr. EP 294,659 ● JP 1047383 ● EP 0192001B1 ● EP 0591376B1 ● CA 1,339,729 ● EP 0370625B1 ● JP 3076578 ● JP 02796332 US Hybrid Capture-Patente Nr. 4,732,847 ● 4,865,980 ● 6,228,578B1 Andere Patente ® Das CDP-Star -Substrat durch ein oder mehrere der US-Patente Nr. 4,931,569 ● 4,978,614 ● 5,145,772 ● 5,326,882 ● 5,538,847 ● 5,582,980 ● 5,851,771 geschützt. Anerkennungen eingetragener Warenzeichen: CDP-Star: Tropix, Inc. Kimtowels-Wischtücher: Kimberly-Clark Corporation Eppendorf Repeater: Eppendorf-Netheler-Hinz Parafilm: American Can Co. DuraSeal: Diversified Biotech, Inc ThinPrep und PreservCyt: Cytyc Corporation Windows: Microsoft Corporation TriPath Imaging und SurePath: TriPath Imaging, Inc., Burlington, North Carolina, USA Anerkennungen von Warenzeichen: Prepstain: TriPath Imaging, Inc., Burlington, North Carolina, USA 54 Zusammenfassung des hc2 High-Risk-HPV-DNA-Tests Wichtig: Vor Gebrauch dieser Zusammenfassung ist es wichtig, dass der Anwender mit den einzelnen Verfahrensschritten gründlich vertraut ist. Verfahren Manuelles Vortexverfahren Multi-Specimen Tube (MST) Vortexer I-Verfahren Hybridisierungsmikroröhrchen beschriften. Denaturierungsreagenz vorbereiten. È Denaturierungsreagenz (Volumen entspricht der Hälfte des Probenvolumens) in die Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben pipettieren. Jede Probe, jeder Kalibrator und jede Qualitätskontrolle 5 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit einzeln vortexen (nähere Einzelheiten siehe Packungsbeilage). Prüfen, dass alle Röhrchen eine purpurrote Farbe aufweisen. È 45 ±5 Minuten bei 65 ±2 °C inkubieren. È HPV-Sondenmischung vorbereiten. È È È Die Hybridisierungsplatte beschriften. Das Denaturierungsreagenz vorbereiten. È Denaturierungsreagenz (Volumen entspricht der Hälfte des Probenvolumens) in die Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Proben pipettieren. Prüfen, dass alle Röhrchen eine purpurrote Farbe aufweisen. È Das Gestell mit Folie oder einem Verschlussdeckel abdecken. È 10 Sekunden vortexen. È 45 ±5 Minuten bei 65 ±2 °C inkubieren. È HPV-Sondenmischung vorbereiten. È Wasserbadverfahren Mikroplatteninkubator I-Verfahren Die denaturierte Probe gut mischen und 75 µl in Röhrchen pipettieren. Die denaturierte Probe gut mischen und 75 µl in die Mikrotiterplatten-Vertiefungen pipettieren. È 10 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. ↓ 10 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. ↓ 25 µl High-Risk-HPV-Sondenmischung in Röhrchen pipettieren. ↓ ↓ 25 µl High-Risk-HPV-Sondenmischung in MikrotiterplattenVertiefungen pipettieren. ↓ Die Mikroröhrchen mit einer Plattenabdeckung abdecken und 3 ±2 Minuten bei 1100 ±100 U/min auf einem Kreisschüttler I schütteln. Prüfen, dass alle Röhrchen eine gelbe Farbe aufweisen. ↓ 60 ±5 Minuten bei 65 ±2° C inkubieren. Die Capture-Mikrotiterplatte vorbereiten. ↓ Die Mikroröhrchen mit einer Plattenabdeckung abdecken und 3 ±2 Minuten bei 1100 ±100 U/min auf einem Kreisschüttler I schütteln. Prüfen, dass alle Röhrchen eine gelbe Farbe aufweisen. ↓ 60 ±5 Minuten bei 65 ± 2 °C inkubieren. Die Capture-Mikrotiterplatte vorbereiten. ↓ ↓ Den Inhalt von jeder Hybridisierungsplattenvertiefung oder dem Mikroröhrchen mit einem 8-Kanal-Dispenser in die entsprechende Vertiefung in der Capture-Mikrotiterplatte pipettieren. Mit einem Plattendeckel oder einer Plattenabdeckung abdecken. 60 ±5 Minuten bei 20 - 25 °C bei 1100 ±100 U/min schütteln. Den Waschpuffer vorbereiten. È Dekantieren und die Capture-Mikrotiterplatte abtupfen (nähere Einzelheiten gehen aus der Packungsbeilage hervor). È 75 µl Nachweisreagenz 1 in jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte pipettieren. Die Capture-Mikrotiterplatte mit einem Plattendeckel, Parafilm oder entsprechendem Material abdecken. 30 - 45 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. Platte mit Hilfe des gewünschten Verfahrens spülen. È Manuelles Spülverfahren Verfahren mit dem automatischen Plattenspülapparat I Dekantieren und die Capture-Mikrotiterplatte abtupfen Die Platte auf den Spülapparat geben und zum Beginnen „START/STOP“ (nähere Einzelheiten gehen aus der Packungsbeilage hervor) drücken. È È 6 Mal spülen. Auf den nächsten Schritt übergehen. È È È Auf fusselfreien Papiertüchern abtupfen È È In jede Vertiefung der Capture-Mikrotiterplatte 75 µl Nachweisreagenz 2 pipettieren. 15 - 30 Minuten bei 20 - 25 °C inkubieren. È Die Capture-Mikrotiterplatte am Luminometer messen. È Validation des Assays und Interpretation der Probenergebnisse. 55