Clique para visualizar o trabalho completo. - LEMC

Transcrição

LIANA CARBALLO MENEZES
Identificação Bacteriana e Resistência aos Antimicrobianos
de Patógenos Causadores de Infecção de Corrente
Sanguínea pela Técnica da Reação em Cadeia da
Polimerase em Tempo Real de Pacientes Submetidos à
Transplantes de Células-Tronco Hematopoiéticas
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Doutora em Ciências.
São Paulo
2012
Identificação Bacteriana e Resistência aos Antimicrobianos
de Patógenos Causadores de Infecção de Corrente
Sanguínea pela Técnica da Reação em Cadeia da
Polimerase em Tempo Real de Pacientes Submetidos à
Transplantes de Células-Tronco Hematopoiéticas
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Doutora em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos
Pignatari
Co-orientadora: Paola Cappellano
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro
fornecido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado
de
2008/04761-8
São
e
Paulo
(FAPESP)
Conselho
Processo
Nacional
de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Processo 141636/2008-4
São Paulo
2012
MENEZES, Liana Carballo
Identificação Bacteriana e Resistência aos Antimicrobianos de Patógenos
Causadores de Infecção de Corrente Sanguínea pela Técnica da Reação em
Cadeia da Polimerase em Tempo Real de Pacientes Submetidos à Transplantes
de Células-Tronco Hematopoiéticas – Liana Carballo Menezes - São Paulo,
2012. xviii, 228 p.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia
Título em inglês: Bacterial identification and antimicrobial resistance of the
pathogens causing bloodstream infections by real-time polymerase chain reaction
of patients undergoing hematopoietic stem cells transplant.
Palavra chave: 1. Identificação bacteriana; 2. Infecção de corrente sanguínea; 3.
PCR em Tempo Real; 4. Resistência a antimicrobianos; 5. Transplante de
células-tronco hematopoiética.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Angelo Amato Vicenzo de Paola
Coordenador do Curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobieh Diaz
São Paulo
2012
iii
Identificação Bacteriana e Resistência aos
Antimicrobianos de Patógenos Causadores de
Infecção de Corrente Sanguínea pela Técnica da
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
de Pacientes Submetidos à Transplantes de
Células-Tronco Hematopoiéticas
BANCA EXAMINADORA:
Titular: Profa. Dra. Elsa Massae Mamizuka
Titular: Profa. Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado
Titular: Profa. Dra. Silvia Figueiredo Costa
Titular: Dr. Carlos Alberto Pires Pereira
Suplente: Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Suplente: Jussimara Monteiro Nürmberger
i
“Não se pode ensinar tudo a alguém, pode-se apenas ajudá-lo a
encontrar por si mesmo o caminho.”
Galileu Galilei
ii
Dedico este trabalho
À minha família, meus pais Luiz e Zulma, à minha amada filha Giovanna e
ao meu marido Wilson, aos meus irmãos, Daniela e José Luiz, às minhas
sobrinhas Gabriela e Rafaela, por tornarem possível essa grande
conquista, por toda dedicação, companheirismo e amor. Todos vocês
foram importantes para a realização deste trabalho e sempre serão a
inspiração da minha vida!!!
iii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, sempre com
muita competência e profissionalismo. Agradeço pelo grande entusiasmo
dedicado a este estudo, pela orientação e pela disponibilidade em todos os
momentos. Meu respeito e admiração pelo exemplo de ética profissional. Muito
obrigada pela confiança depositada no meu trabalho e pelas oportunidades
concedidas ao longo destes anos no LEMC.
À minha co-orientadora Paola Cappellano pelos valiosos ensinamentos durante
o convívio, pela orientação e pela disponibilidade em todos os momentos em que
precisei, sempre com muita competência.
À Profª Dra. Ana Cristina Gales, pelas constantes ensinamentos, pelo exemplo
de caráter e por ter me concedido o privilégio de fazer parte da equipe
LEMC/ALERTA. Muito obrigada também, pela oportunidade do grande
desenvolvimento profissional e pessoal, como sua aluna de mestrado.
Aos professores da Disciplina de Doenças Infecciosas da Universidade Federal
de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, pelos ensinamentos enriquecedores
que contribuíram muito para a minha formação profissional.
Aos médicos e enfermeiros da unidade de hematologia e transplante de medula
óssea do Hospital São Paulo, em especial ao Dr. José Salvador Rodrigues de
Oliveira pela oportunidade de realizar este estudo.
Às minhas eternas amigas, Andrea Pereira e Jussimara Monteiro Nürmberger,
pelo amor, pela parceria em tantos projetos desenvolvidos juntas ao longo da
nossa história acadêmica.
Aos amigos, Paulo Bispo, Luiz Roberto Chiorotto, Karen Bauab e Milene Quiles
pelo auxílio prestado com muita competência durante a realização dos testes
iv
laboratoriais. A colaboração de vocês foi fundamental para o desenvolvimento
deste estudo. Em especial à Talita Trevizani Rocchetti, você foi essencial para a
realização e finalização deste projeto.
À Eliete Aguiar e André Doi, supervisores do LEMC, pela gentileza e vasta
experiência microbiológica.
À amiga e secretária do LEMC, Rosana Capecce, pela dedicação e valioso apoio
em todos os momentos.
À secretária da DIPA, Tereza Cristina, pela presteza e competência. À secretária
da Pós- Graduação, Patrícia pela colaboração ao longo destes anos.
A todos que passaram pelo LEMC/Alerta nestes últimos anos e que eu tive a
alegria e o privilégio de conviver. Em especial Rodrigo Cayô, Raquel Girardello,
Adriana Nicoletti, Renata Picão, Adryella, Loren, Kelly, Martha, Zonta, Fernanda
Inoue, Fernanda Marques, Thaís, Vinicius, Thomas, Eloiza, Danilo, Lorena,
Jéssica, Cecília Cergole, Cecília Godoy, Paula Peraro, Paula Ignez, Paula Koga,
Rafaela, Katia e Amilton pelo convívio agradável e carinho demonstrado durante
a realização deste trabalho.
À minha família, minha especial referência, cunhadas (o), sogra, sobrinhas (o) e
em especial aos meus irmãos, que mesmo distantes fisicamente, sempre
estiveram presentes nas minhas decisões, escolhas e conquistas. Agradeço o
amor, o apoio e a amizade fundamentais a nossa união.
A todos que participaram diretamente ou indiretamente do meu trabalho, o meu
muito obrigada!
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ................................................................................... xi
LISTA DE FIGURAS ................................................................................... xiii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................... xiv
RESUMO .................................................................................................... xvii
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................. 5
2.1. Transplante de Células-tronco Hematopoiéticas ............................. 5
2.2. Infecções de Corrente Sanguínea em TCTH ..................................... 6
2.3. Epidemiologia das Infecções em TCTH............................................. 8
2.4. Diagnóstico Microbiológico ............................................................... 13
2.4.1.......... Hemoculturas ............................................................................ 13
2.4.2.......... Identificação
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
Susceptibilidade aos Antimicrobianos .................................................... 15
2.5. Diagnóstico Microbiológico Molecular .............................................. 16
2.5.1.......... Reação em Cadeia da Polimerase - PCR ................................ 17
2.5.2.......... Genes de Resistência aos Antimicrobianos ........................... 19
2.5.2.1. ..... Gene mecA ................................................................................ 19
2.5.2.2. ..... Genes vanA e vanB................................................................... 20
2.5.2.3. ..... Produção de -Lactamases ...................................................... 22
2.5.2.3.1. . -Lactamases de Espectro Ampliado (ESLs) ....................... 24
2.5.2.3.1.1. -Lactamases TEM ............................................................... 25
2.5.2.3.1.2. -Lactamases SHV ............................................................... 26
2.5.2.3.1.3. -Lactamases CTX-M ........................................................... 27
2.5.2.3.2. . -Lactamases KPC .................................................................... 29
2.5.2.3.3. . Metalo-β-lactamases ................................................................. 30
vi
2.5.3.......... Microbiologia Molecular Aplicada no Diagnóstico Clínico ... 33
2.5.4.......... Validação de Novos Métodos Diagnósticos ........................... 37
3. OBJETIVOS .......................................................................................... 39
4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................... 40
4.1. Casuística ............................................................................................ 40
4.2. Variáveis Clínicas ................................................................................ 40
4.3.1.......... Hemoculturas ............................................................................ 41
4.3.1.1. ..... Coleta de Sangue ...................................................................... 41
4.3.1.2. ..... Processamento das Hemoculturas ......................................... 41
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
4.4.1.......... Padronização da PCR em Tempo Real .................................... 43
4.4.1.1. ..... Preparação das Amostras Controles e Amostras Clínicas ... 43
4.4.1.2. ..... Extração de DNA ....................................................................... 44
4.4.1.2.1. . Extração do DNA Direto dos Frascos de Hemocultura ......... 44
4.4.1.2.2. . Extração do DNA Direto dos Tubos com EDTA K2 Gel ......... 45
4.4.1.3. ..... Iniciadores e Sondas TaqMan-MGB ....................................... 47
4.4.1.4. ..... Amplificação por PCR em Tempo Real ................................... 50
4.4.1.5. ..... Eficiência da PCR em Tempo Real .......................................... 51
4.4.2.......... Validação de Novos Métodos de Diagnóstico ........................ 53
4.4.2.1. ..... Especificidade Analítica ........................................................... 53
4.4.2.2. ..... Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff”........... 53
4.4.2.3. ..... Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade) . 54
4.4.2.4. ..... Acurácia Clínica ........................................................................ 54
vii
4.4.2.5. ..... Concordância entre Testes Fenotípicos e PCR em Tempo
Real ........ .................................................................................................... 56
4.4.2.5.1. . Concordância da Identificação Bacteriana entre Teste
Fenotípico e PCR em Tempo Real ............................................................ 56
4.4.2.5.2. . Concordância da Resistência aos Antimicrobianos entre
Teste Fenotípico e PCR em Tempo Real.................................................. 57
4.4.2.5.3. . Medidas de Eficácia Diagnóstica ............................................. 57
4.5. Correlação dos Resultados de Liberação pelo Método Fenotípico
e do PCR em Tempo Real com a Adequação do Uso de
Antimicrobianos nos Pacientes Submetidos à TCTH ............................. 58
4.6. Detecção dos Microrganismos por Sequenciamento de DNA ........ 58
5. RESULTADOS ...................................................................................... 61
5.1. Casuísticas .......................................................................................... 61
5.2. Variáveis Clínicas ................................................................................ 61
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
5.4.1.......... Padronização PCR em Tempo Real ......................................... 65
5.4.1.1. ..... Amplificação por PCR em Tempo Real .................................. 65
5.4.1.2. ..... Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real ............. 66
5.4.1.2.1. . SYBR Green ............................................................................... 66
5.4.1.2.2. . TaqMan ...................................................................................... 69
5.4.2.......... Validação de Novos Métodos de Diagnóstico ........................ 72
5.4.2.1. ..... Determinação do Limite do Branco (LoB) .............................. 72
5.4.2.2. ..... Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade) . 72
5.4.2.3. ..... Acurácia Clínica ........................................................................ 74
5.4.3.......... Aplicação da PCR em Tempo Real nas Amostras de
Hemocultura de Pacientes Submetidos à TCTH. .................................... 78
viii
5.4.3.1. ..... Detecção do gene HFE de Controle Interno da Extração de
DNA gene. ................................................................................................... 78
5.4.3.2. ..... Detecção do Gene Bacteriano 16S rDNA ................................ 78
5.4.3.3. ..... Detecção do Gene 18S rDNA para Fungos ............................. 79
5.4.3.4. ..... Detecção dos Genes Espécie-específicos.............................. 80
5.4.3.5. ..... Detecção de Genes que Conferem Resistência aos
Antimicrobianos......................................................................................... 87
5.5. Concordância do PCR em Tempo Real com os Testes
Fenotípicos ................................................................................................. 96
5.5.1.......... Concordância entre a Identificação Fenotípica versus PCR
em Tempo Real das Amostras de Frascos de Hemocultura BACTEC® 96
5.5.2.......... Concordância entre a Identificação Fenotípica versus PCR
em Tempo Real das Amostras de tubos de EDTA K2 GEL .................... 96
5.5.3.......... Concordância entre os Frascos de Hemocultura BACTEC ®
versus Tubos de EDTA K2 GEL por PCR em Tempo Real ..................... 97
5.5.4.......... Concordância entre os Testes Fenotípicos e PCR em
Tempo Real na Detecção de Resistência aos Antimicrobianos ............ 97
5.5.5.......... Medidas de Eficácia Diagnóstica ............................................. 98
5.6. Correlação dos Resultados de Liberação pelo Método Fenotípico
e do PCR em Tempo Real com a Adequação do Uso de
Antimicrobianos nos Pacientes Submetidos à TCTH ............................. 99
5.7. Detecção dos Microrganismos por Sequenciamento de DNA ........ 104
6. DISCUSSÃO ......................................................................................... 105
7. CONCLUSÕES ..................................................................................... 128
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 129
9. ABSTRACT ........................................................................................... 171
10. ANEXOS ............................................................................................... 173
ANEXO I – Ficha médica preechida pelo serviço de racionalização de
antimicrobianos de vigilância de hemoculturas do HSP e
IOP/GRAACC .............................................................................................. 173
ANEXO II - Tabela 16.................................................................................. 175
ix
ANEXO III – Manuscritos submetidos à publicação ............................... 187
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Relação dos microrganismos controles positivos utilizados na
padronização das reações de PCR em Tempo Real. ........................................ 46
Tabela 2: Lista de iniciadores e sondas TaqMan para amplificação da região
codificadora dos genes de resistência aos antimicrobianos, controle interno e
genes espécie-especificos para a identificação dos microrganismos. ................ 48
Tabela 3: Categorias do Índice Kappa .............................................................. 57
Tabela 4: Resultados da Temperatura de melting e desvio padrão da Tm dos
produtos amplificados de amostras controles ATCC para os genes de
resistência. ........................................................................................................ 66
Tabela 5: Eficiência da reação de PCR em Tempo Real, Ct e Tm da última
diluição, concentração em UFC/mL do microrganismo detectado na última
diluição de amplificação dos genes de resistência. ............................................ 68
Tabela 6: Resultados da padronização dos protocolos de PCR em Tempo Real
utilizando sondas TaqMan-MGB multiplex Gram específicas............................. 70
Tabela 7: Resultados de “slope”, R2, eficiência e última diluição detectada das
reações de PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan e SYBR Green para os
genes espécie-específicos dos principais patógenos que causam infecção de
corrente sanguínea. ........................................................................................... 71
Tabela 8: Resultados de “cutoff” de amostras negativas e LoD de amostras
positivas baixas para os genes avaliados. ......................................................... 73
Tabela 9: Sensibilidade e especificidade clínica determinada pela curva ROC de
acordo com o Ct do LoD para os genes espécie-especificos, fungo 18S rDNA,
para o gene 16S rDNA para Gram positivo e Gram negativo e genes de
resistência aos antimicrobianos. ........................................................................ 75
Tabela 10: Dados clínicos dos pacientes, resultado fenotípico e da PCR em
Tempo Real para identificação dos microrganismos dos 160 frascos de
hemocultura BACTEC®. ..................................................................................... 82
Tabela 11: Resultado do teste de sensibilidade pelo método automatizado e da
PCR em Tempo Real para genes e resistência aos antimicrobianos dos frascos
de BACTEC®. .................................................................................................... 89
Tabela 12: Resultados da identificação fenotípica pelo sistema automatizado
Phoenix® e da PCR em Tempo Real dos frascos de hemocultura BACTEC® e dos
tubos de EDTA K2 gel coletados pareados........................................................ 94
Tabela 13: Resultados da detecção fenotípica pelo sistema automatizado
Phoenix® e da PCR em Tempo Real para detecção de resistência aos
antimicrobianos dos frascos de hemocultura BACTEC® e tubos de EDTA K2 gel
coletados pareados. .......................................................................................... 95
xi
Tabela 14: Valores de VPP, VPN, sensibilidade, especificidade, acurácia e
prevalência dos PCR em Tempo Real em relação ao sistema automatizado
Phoenix®. ........................................................................................................... 98
Tabela 15: Resultado do teste de sensibilidade e da PCR em Tempo Real para
genes que conferem resistência aos antimicrobianos e terapia antimicrobiana
utilizada nos episódios de infecção de corrente sanguínea. ............................ 102
Tabela 16: Resultados das técnicas de PCR para 160 amostras dos frascos de
hemocultura e 33 amostras de sangue total, identificação pela cultura e
antibiograma pelo sistema automatizado, PCR em Tempo Real para os genes
estudados. ....................................................................................................... 175
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Distribuição das doenças hematológica de base. ............................. 63
Figura 2 - Prevalência de espécies Gram positivas identificadas pelo sistema
automatizado (Phoenix®). .................................................................................. 64
Figura 3 - Prevalência de espécies Gram negativas identificadas pelo sistema
automatizado (Phoenix®). .................................................................................. 65
Figura 4 - Curva ROC para genes de resistência a antimicrobianos A- blaTEM; B vanA; C - vanB; D - blaCTX; E- blaSHV; F - mecA; G - blaKPC; H- blaIMP; I- blaVIM; JblaSPM. ................................................................................................................ 76
Figura 5 - Curva ROC para genes estudados espécie especifico, fungo 18S
rRNA e 16S rDNA Gram positivo e Gram negativo. ........................................... 77
xiii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC - American Type Cuture Collection
CCIH – Comissão de Controle de Infecção Hospitalar
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute
Ct – Ciclo do threshold
CVC – Cateter Venoso Central
Cutoff – Ponto de Corte
DNA - Ácido desoxirribonucléico
E – Eficiência
EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético
ESL - Extended Spectrum -Lactamase
FFP – Fração Falso Positivo
FVP – Fração Verdadeiro Positivo
GN – Gram Negativo
GP – Gram Positivo
HSP – Hospital São Paulo
ICS – Infecção de Corrente Sanguínea
IOP/GRAACC – Instituto de Oncologia Pediátrica
IS - Insertion Sequence
KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
xiv
LH – Linfoma Hodgkin
LMA – Leucemia Mielóide Aguda
LNH – Linfoma Não Hodgkin
LoB – Limite do Branco
LoD – Limite de Detecção
ML - Metalo--Lactamase
MM – Mieloma Múltiplo
MRSA – Staphylococcus Resistente à Meticilina
OMP - Outer Membrane Protein
PBP - Penicillin Binding Protein
PCR - Polymerase Chain Reaction
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis
RNA – Ácido Ribonucléico
ROC - Receiver Operating Characteristic
SCCmec - Staphylococcal Cassette Chromosome
SD – Desvio Padrão
SCoN – Staphylococcus coagulase negativo
SCOPE - Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance
SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
TBE - Tris-Borato-EDTA
TCTH – Transplante de Células-tronco Hematopoiética
Tm – Temperatura de melting
TMO – Transplante de Medula Óssea
TSB - Tryptone Soy Broth
xv
UFC - Unidade Formadora de Colônia
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
UV – Ultravioleta
VPP – Valor Preditivo Positivo
VPN – Valor Preditivo Negativo
VRE – Enterococcus Resistentes à Vancomicina
xvi
RESUMO
A identificação rápida de patógenos e da resistência antimicrobiana
em infecções da corrente sanguínea (ICS) diminui a morbidade e mortalidade,
principalmente em pacientes imunocomprometidos. Este estudo foi desenhado
para detectar 17 patógenos e 10 genes de resistência a antimicrobianos direto
de frascos de hemocultura e sangue periférico pela reação em cadeia da
polimerase em Tempo Real. Métodos: O limite de detecção (LoD) e limite de
corte (“cutoff”) foram realizados de acordo com “Clinical and Laboratory
Standards Institute” (CLSI). A sensibilidade e a especificidade clínica foram
calculadas pela curva “relative operating characteristic” (ROC). Um total de 160
frascos de hemocultura e 33 sangue periférico de paciente de transplante de
células-tronco hematopoiética (TCTH) foram triadas por sondas Gram
especificas por PCR em Tempo Real. Dezessete sequencias gênero específico
foram avaliadas utilizando sondas TaqMan e para os genes de resistência
blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB e mecA foi
utilizado o método com SYBR Green. Resultados: Os ensaios de PCR em
Tempo Real foram capazes de detectar os genes alvo nas diluições
correspondente 15 a 1,5 UFC por reação. Os menores valores de Ct do LoD
foram apresentados pelos microrganismos Staphylococcus coagulase negativo
(SCoN), Stenotrophomonas maltophilia e Escherichia coli, 30,9; 31,6 e 32,6
respectivamente. A área sob a curva ROC mostrou um desempenho satisfatório
acima de 0,70 para a maioria dos genes estudados. A sensibilidade pela curva
ROC foi superior a 80% para os genes blaKPC e 16S rDNA Gram positivos, e
abaixo de 60% para blaSHV, blaTEM e vanB. Vinte e quatro das 33 amostras
positivas foram concordantes entre hemocultura e qPCR. A identificação de
patógenos foi discordante em treze amostras. O gene mecA foi detectado em 12
dos 15 SCoN e 4 Enterococcus spp. foram positivos para o gene vanA. Foram
xvii
detectados duas amostras com o gene blaCTX e três blaSHV por PCR em Tempo
Real. Os genes para metalo-β-lactamase e blaKPC e não foram detectados. Cinco
espécies de fungos foram identificados apenas por PCR em Tempo Real. O
tratamento empírico considerando os resultados dos testes fenotípicos foi
inadequado em 66,6 % dos casos de ICS, 33,3% mantendo-se inadequados
após o resultado da coloração de Gram, e 6,66% mantiveram-se inadequados
após o resultado final da hemocultura com o antibiograma. Conclusão: A PCR
em Tempo Real pode ser uma ferramenta complementar útil na identificação
precoce de agentes patogênicos e genes de resistência a antimicrobianos na
ICS em pacientes submetidos à TCTH.
xviii
INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
Uma das mais importantes funções do laboratório de microbiologia clínica
é obter um diagnóstico microbiológico, geralmente, através da cultura de fluidos
corporais e tecidos. A identificação correta é crucial para determinar o agente
patogênico, a escolha e duração do antibiótico terapia, e os procedimentos
adequados no controle da infecção (Woo et. al., 2008). A triagem para
patógenos multirresistentes, como Staphylococcus aureus resistente à meticilina
(MRSA), Enterococcus resistente à vancomicina (VRE), e patógenos Gram
negativos multirresistentes são recomendados para o controle de infecção. Os
isolados microbiológicos positivos devem ser todos submetidos aos testes de
susceptibilidade aos antimicrobianos. Já para as infecções fúngica, os testes de
susceptibilidade ainda precisam ser clinicamente interpretados e correlacionados
com desfechos clínicos (Freifeld et. al., 2011).
A acurácia da identificação é importante nas análises epidemiológicas, na
determinação dos padrões de resistência aos antimicrobianos e para um
antibióticoterapia adequada. Tradicionalmente, a identificação de bactérias nos
laboratórios de microbiologia clínica é realizada com testes fenotípicos. No
entanto, estes métodos apresentam algumas limitações. Primeiramente, os
microrganismos com características bioquímicas, que não se enquadram nos
padrões de qualquer gênero e espécies são ocasionalmente encontrados. Em
segundo lugar, estes métodos não podem ser utilizados para microrganismos
não cultiváveis. Em terceiro lugar, a identificação de alguns grupos específicos
de bactérias, como anaeróbios e micobactérias, requerem equipamentos e
expertise adicionais, que não estão disponíveis na maioria dos laboratórios de
microbiologia clínica (Woo et. al., 2008).
1
INTRODUÇÃO
A avaliação laboratorial para investigação das infecções em pacientes de
TCTH incluem hemograma, exames bioquímicos (funções hepática e renal) e
dois conjuntos de culturas de sangue. No entanto, vários marcadores
inflamatórios foram propostos para diferenciar entre as causas infecciosas e não
infecciosas de uma resposta inflamatória sistêmica, orientando assim, os
episódios febris em pacientes com neutropenia (Sakr et. al., 2008).
Durante a
avaliação, é imprescindível dar devida atenção à identificação da fonte de
sepsis, entretanto, a causa da infecção pode não ser sempre aparente (Freifeld,
et. al., 2011). Para o diagnóstico de ICS relacionada ao cateter venoso central
(CVC) nos pacientes submetidos à TCTH, além de um conjunto de culturas
coletadas das veias periféricas, em seguida, a partir de cada lúmen do CVC
coleta-se um conjunto de cultura. No entanto, embora não seja essencial, um
tempo diferencial de positividade entre as culturas de sangue periférico e central
de mais de duas horas é fortemente sugestivo de ICS relacionada ao cateter
(Fätkenheuer et. al., 2003). As infecções de corrente sanguínea estão
associadas com altas taxas de mortalidade variando de 20% a 70%.
Especialmente, em pacientes pós-transplantados e pacientes com leucemia
(pacientes neutropênicos) a taxa de mortalidade para sepsis e choque séptico
varia de 28% a 50% (Angus et. al., 2001; Martin et. al., 2003).
As técnicas moleculares que detectam os ácidos nucleicos para a
identificação de patógenos tornaram-se cada vez mais disponíveis. Estas
técnicas são sensíveis na detecção do DNA bacteriano e fúngico no sangue
periférico, mas não está claro, se isto indica microrganismos patogênicos viáveis
que circulam na corrente sanguínea. Entre as técnicas moleculares mais
promissores está a reação em cadeia da polimerase (PCR). No entanto, os
médicos devem estar cientes do potencial de resultados falso positivo e falso
2
INTRODUÇÃO
negativo, e do fato de que estes testes não substituem a avaliação clínica e
microbiológica (Chen & Kontoyiannis, 2010).
Nas últimas décadas, as técnicas de biologia molecular e suas aplicações
no diagnóstico de doenças infecciosas estabeleceu uma nova era na detecção e
identificação de microrganismos. O uso disseminado da técnica de PCR e
sequenciamento de DNA, do gene 16S rDNA, tem desempenhado um papel
fundamental na correta identificação de isolados bacterianos, como também na
descoberta de novas bactérias. Para a identificação de microrganismo regiões
conservadas dos genomas microbianos, como regiões dos genes 16S-23S
rRNA,
são utilizadas como
alvo nessas reações. Muitos protocolos foram
desenvolvidos para identificar uma única espécie (Espy et. al., 2006) ou várias
espécies, utilizando regiões conservadas dentro do genoma, tais como ensaios
genéricos para detecção bacteriana e fúngica (Van Burik et. al., 1998).
As
técnicas de PCR baseadas na detecção de fluorescência automatizada de
fragmentos amplificados por PCR em Tempo Real são geralmente mais
robustas, menos trabalhosas e menos propensas à contaminação do que as
técnicas de PCR convencional (Klouche & Schröder, 2008).
A principal vantagem da aplicação da técnica de PCR no diagnóstico
microbiológico é devido a sua sensibilidade e capacidade de detectar o DNA do
patógeno, apresentando a possibilidade de detecção de microrganismos
fastidiosos, de crescimento lento, não cultiváveis ou de difícil detecção por
métodos convencionais de microbiologia. Outra vantagem está na otimização
dos resultados, reduzindo a liberação do mesmo para os clínicos (Speers, 2006).
As hemoculturas levam em média 24 a 36 h após a coleta para positivar e a
completa
identificação
do
microrganismo
e
perfil
de
susceptibilidade
normalmente não está disponível antes de 24 às 72h. O uso da PCR tem sido
sugerido em diagnóstico molecular, pois além de ser uma técnica sensível
3
INTRODUÇÃO
também diminui o tempo de liberação dos resultados quando comparado com o
método fenotípico (Valones et. al., 2009).
4
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.
Transplante de Células-tronco Hematopoiéticas
Na década de 1950 iniciou-se, com grande dificuldade, a história do
transplante de medula óssea (TMO). Em 1957, Thomas et. al. realizaram
infusões endovenosas de células da medula óssea de indivíduos normais em
pacientes
portadores
de
doença
hematológica
terminal
submetidos
à
radioterapia e apenas uma paciente obteve recuperação medular transitória.
Outros estudos também não obtiveram grandes resultados, o que causou um
descontentamento com os transplantes nas décadas de 50 e 60. Em 1968, Gatti
et. al. realizaram com sucesso o primeiro TMO alogênico em uma criança
portadora de imunodeficiência (Thomas et. al., 2004; Cutler & Antin, 2005). O
termo “transplante de medula óssea” (TMO) passa a ser substituído pelo termo
transplante
de
células-tronco
hematopoiéticas
(TCTH),
devido
ao
desenvolvimento de novas fontes de células progenitoras para o transplante
(Vogelsang et. al., 2005).
O Transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) é definido como
a transferência das células, a partir de um individuo para outro, definido como
TCTH alogênico. Ou o retorno de células previamente coletadas para o mesmo
individuo após a manipulação das células e ou do destinatário, TCTH autólogo
(Baron & Sandmaier, 2006; Huss et. al., 1996; Welniak, et. al., 2007). O TCTH
alogênico é uma importante modalidade para melhorar ou curar uma grande
variedade de doenças, incluindo leucemia, linfomas, doenças mieloproliferativas,
síndromes mielodisplásicas, síndrome da insuficiência da medula óssea,
imunodeficiências congênitas, deficiências enzimáticas e hemoglobinopatias
(Giralt, 2007; Oliansky et. al., 2007; Dreger et. al., 2007; Witte et. al., 2007 e
Davies & Guinan, 2007). No entanto, o TCTH está associado com uma
5
significante morbidade e mortalidade devido ao regime relacionado à toxicidade,
infecção e enxerto versus doença do hospedeiro. O TCTH autólogo pode
melhorar os resultados em doenças neoplásicas e doenças autoimunes, e
continua a ser investigado como plataforma para a terapia gênica (Sadelain et.
al., 2004). Os regimes relacionados à toxicidade e as infecções contribuem para
morbidade e mortalidade associadas com TCTH autólogo, apesar de todos os
avanços, a infecção é reportada como a causa primária da morte em 8% dos
pacientes TCTH autólogos e 17 a 20% dos receptores de TCTH alogênico.
Atualmente, existe uma ampla disponibilidade de ferramentas para o
diagnóstico das infecções permitindo assim o desenvolvimento de estratégias de
vigilância para um melhor conhecimento da epidemiologia, fatores de risco e
prognósticos de infecções adquiridas em centros de câncer nos últimos anos.
Esta consciência epidemiológica é fundamental para definir estratégias de
prevenção que pode ser adaptada para as várias categorias de pacientes com
diferentes riscos de infecção, e escolher protocolos de tratamento que possam
conter o fenômeno de resistência aos antimicrobianos (Girmenia et. al., 2011).
2.2.
Infecções de Corrente Sanguínea em TCTH
Infecção de Corrente Sanguínea (ICS) é causada pela presença de
bactérias ou fungos em uma ou mais amostras de hemoculturas associada a um
quadro clínico compatível com sepse (Bone et. al., 1992).
A ICS é a complicação infecciosa mais comum em TCTH (Poutsiaka et.
al., 2007). Como consequência da imunodeficiência que acompanha o TCTH, as
complicações infecciosas persistem como uma importante causa de morbidade e
mortalidade, embora existam todas as melhorias nos cuidados de manutenção
dos pacientes. A recuperação imunológica após o transplante e o os agentes
6
infecciosos
mais
relevantes
orientam
a
instituição
para
a
profilaxia
antibacteriana, antiviral e antifúngica nesta população (Walter & Bowden, 1995).
A incidência de infecção em transplantados é determinada pela interação entre a
exposição a agentes infecciosos e a terapia imunossupressora. Esta varia devido
a inúmeros fatores, a quantidade de medicamento imunossupressor usado, a
necessidade do uso de terapia adicional contra rejeição e complicações póscirúrgicas (Patel & Paya, 1997).
Em 1966, Bodey e colaboradores começa a incorporar o conceito de
neutropenia como risco para infecção, demonstrando que o risco de
complicações infecciosas em pacientes portadores de leucemia, submetidos à
quimioterapia, está relacionado diretamente ao grau e à duração da neutropenia.
O aumento de infecções graves ocorre à medida que o número de granulócitos
está abaixo de 1000 células/mm3, chegando a 12% de incidência; e 28% de
incidência quando este número está abaixo de 100 células/mm3. A incidência de
infecção chegou a 100% quando a neutropenia foi mantida por cinco semanas
ou mais (Bodey et. al., 1966).
A maioria dos pacientes submetidos à TCTH como outros pacientes
neutropênicos apresentam febre como sinal indicativo de infecção. Em um
estudo realizado por Quental e colaboradores no Hospital São Paulo, da
Universidade Federal de São Paulo, entre janeiro de 2003 a dezembro de 2006
de 149 pacientes submetidos à TCTH, 39 desenvolveram 56 episódios de ICS. A
incidência geral de ICS, ao longo dos quatro anos de seguimento, aumentou
340% (Quental et. al., 2006).
ICS é definida como o isolamento de bactérias, que não são normalmente
conhecidas por colonizar a pele, tais como bacilos Gram negativos, ou
patógenos, como S. aureus ou fungos, a partir de, pelo menos, uma cultura de
sangue (Horan & Gaynes, 2004). Para as bactérias, que tipicamente colonizam a
7
pele, como Staphylococcus coagulase negativa, Propionibacterium spp.,
Streptococcus do grupo viridans e Corynebacterium não-Jk, são consideradas
ICS a positividade de duas hemoculturas consecutivas, ou duas hemoculturas
positivas dentro de 72 horas, ou uma hemocultura positiva e uma positiva da
ponta de cateter intravascular dentro de 72 horas (DesJardin et. al., 1999).
2.3.
Epidemiologia das Infecções em TCTH
Nas últimas décadas, a epidemiologia de isolados bacterianos nas
infecções da corrente sanguínea em paciente neutropênico febris tem passado
por constante mudança. A partir da evolução dos pacientes neutropênicos febris
durante a década de 70, observou-se que os microrganismos mais prevalentes
das infecções no início da década eram 70% compostos por Gram negativos
(Viscoli et. al.,1994).
Durante os anos 1980 e 1990, os microrganismos Gram positivos, surgem
demonstrando um aumento na prevalência de bactérias Gram positivas,
provavelmente devido ao aumento do uso de cateteres venosos, que permitiu
assim a colonização e a infecção pela microbiota da pele, como Staphylococcus
spp., e o uso de profilaxia sistêmica por fluoroquinolonas, que facilitaram a
entrada da flora intestinal (Viscoli et. al.,1994; Zinner, 1999; Wisplinghoff et. al.,
2003). Outro fator envolvido é o uso de agentes quimioterápicos com maior ação
citotóxica, o que leva a um dano extenso das mucosas e permite a translocação
bacteriana de agentes como Streptococcus viridans e Enterococcus spp.
(Picazo, 2004; Bodey et. al., 1966; Ramphal, 2004; Viscoli et. al., 2002; Pizzo,
1999).
No decorrer destas décadas, o panorama dos agentes etiológicos
responsáveis pelas infecções modifica-se e passam a predominar as bactérias
8
Gram positivas como os principais agentes isolados nestes pacientes (Pizzo,
1984; Schimpff, 1985; Pizzo et. al., 1986; Rubin et. al., 1988).
Atualmente, os Staphylococcus coagulase negativo, continuam sendo o
isolado mais comum em hemocultura.
No entanto, tem sido observado em
vários centros o surgimento de infecções por Enterobacteriaceae, principalmente
Escherichia coli e Klebsiella spp., e patógenos Gram negativos não
fermentadores, como Pseudomonas aeruginosa e S. maltophilia. Em particular,
espécies Gram negativas resistentes aos antimicrobianos estão causando um
número crescente de infecções em pacientes neutropênicos febris. As espécies
de Klebsiella spp. e E. coli com aquisição de genes codificadores de enzimas βlactamase de espectro ampliado (ESβL), frequentemente mostram uma ampla
resistência a uma gama de β-lactâmicos. Esses produtores de ESβL são
susceptíveis aos carbapenens, porém, o seu uso pode induzir a seleção de
bactérias com padrões de resistência ainda maiores. Dessa forma, a utilização
de carbapenens aumenta o risco de infecções por espécies de Klebsiella spp. e
P. aeruginosa produtoras de carbapenemases, que são resistentes aos
carbapenens e a outras classes de antibióticos. Este fenômeno pode
representam um problema devastador, com a disseminação de infecções por
espécies Gram negativas multirresistentes, considerando-se também que as
drogas recentemente adicionadas ao arsenal antibacteriano são orientadas
principalmente contra bactérias Gram positivas (Cattaneo et. al., 2008; Oliveira
et. al., 2007; Aubron et. al., 2005; Morris et. al., 2008; Weinstock et. al., 2007;
Wang et. al., 2011; Chong, et. al., 2011; Gudiol, et. al., 2011; Arnan, et. al., 2011;
Gudiol, et. al., 2010; Trecarichi, et. al., 2009 e Trecarichi, et. al., 2011).
Um estudo realizado por Cordonnier e colaboradores (2003) relacionou os
fatores de risco associados à infecção por cocos Gram positivos em pacientes
neutropênicos febris e identificou que os fatores relacionam-se com terapias com
9
altas doses de citarabina, uso de inibidores de bomba de prótons,
descontaminação do trato gastrintestinal com antibiótico colimicina e a presença
de calafrios. Os autores concluíram que as infecções por cocos Gram positivos
devem originar-se do trato gastrintestinal, e assim o uso de drogas que
modificam o pH gástrico, favorece o crescimento e aumento do risco de
translocação bacteriana no paciente com prévia alteração na integridade da
mucosa.
A bacteremia por cocos Gram positivos, também foi correlacionada por
outros autores com a colonização das mucosas e mucosite, e os principais
patógenos são Staphylococcus coagulase negativo (SCoN) e Streptococcus
viridans (Paganini et. al., 2003; Bochud et. al., 1994; Costa et. al., 2006). A
mucosite é também descrita como fator de risco para ICS causadas por
Enterococcus spp. resistentes à vancomicina em pacientes com câncer
(Kuehnert et. al., 1999).
Recentemente alguns centros observaram um aumento na proporção de
bactérias Gram negativas como causadoras de ICS em pacientes neutropênicos,
talvez pela suspensão da profilaxia por quinolonas ou pelo aparecimento de
resistência aos antimicrobianos entre estes agentes (Collin et. al., 2001;
Ramphal, 2004; Viscoli & Castagnola, 2002).
Um estudo prospectivo em um centro de câncer espanhol realizado em
adultos durante o período de 2006-2009 mostrou que cerca de 50% das
bacteremias eram causadas por bacilos Gram negativos e 14% deles eram
bactérias multirresistente. O mecanismo de resistência mais frequente foi
produção ESβL (45%), principalmente em E. coli, seguido de hiperprodução de
cefalosporinase tipo AmpC (24%) (Gudiol et. al., 2011). Os pacientes com
bacteremias
por
bacilos
Gram
negativos
multirresistente
receberam
10
antibióticoterapia inicial inadequada (69% versus 9%, p <0,001), e o tempo para
terapia adequada (após 48 horas) foi maior neste grupo (Gudiol et. al., 2011).
Uma taxa muito elevada de bactérias Gram negativas resistentes isoladas
em pacientes com doenças hematológicas malignas foi observada em um estudo
italiano (Trecarichi et. al., 2009). Guidol e colaboradores observou que dos 62
episódios de bacteremia causadas por E. coli, a produção de ESBL e resistência
às fluoroquinolonas foram 41,9% e 62,9%, respectivamente. A taxa global de
mortalidade de 30 dias foi de 21%, e os preditores significativos de mortalidade
foram para terapia antimicrobiana inicial inadequada, na infecção por isolados
produtores de ESβL isolados e neutropenia prolongada (Gudiol et. al., 2011).
Um estudo prospectivo de infecções em centros italianos realizados em os
pacientes adultos com diagnóstico de doenças hematológicas malignas iniciadas
em 2009 mostrou que as bacteremias por P. aeruginosa foram 71%
multirresistentes. Em particular, a percentagens de resistência aos carbapenens
(Imipenem e meropenem), anti-pseudomonas cefalosporinas (Ceftazidima e
cefepime), amicacina e ciprofloxacina foram 60%, 42%, 50% e 66%,
respectivamente. Enquanto, que a percentagem de resistência à piperacilina foi
de 24%. A mortalidade em até 30 dias após a primeira hemocultura positiva
ocorreu em 40% das bacteremias por P. aeruginosa multirresistentes e em 9%
dos não multirresistentes. Em uma análise multivariada, a terapia antibacteriana
inicial inadequada foi independentemente associada com a mortalidade
(p=0,006) (Trecarichi et. al., 2011).
Em um estudo realizado por Quental e colaboradores (2006) em um
Hospital São Paulo, de julho de 2003 à de julho de 2005, foram observados 167
episódios de ICS em 107 pacientes. A maioria (67,3%) apresentou apenas um
episódio de ICS. Sessenta e três (58,9%) pacientes pertenciam ao sexo
11
masculino. Em relação à doença hematológica de base, o diagnóstico mais
prevalente foi Leucemia Mielóide Aguda (LMA), seguido de Mieloma Múltiplo
(MM) e Linfoma não Hodgkin (LNH). Em 31 episódios (18,6%) os pacientes
haviam sido submetidos ao TMO.
O estudo reportou que em 93 (55,7%) dos episódios de ICS os pacientes
apresentavam neutropenia. Em 82% dos episódios de ICS os pacientes
apresentaram febre ou hipotermia, e 70,7% mostrou sepse clinicamente
comprovada. Leucocitose ou leucopenia estavam presentes em 68,3% dos
episódios. A mortalidade após uma semana da última hemocultura positiva foi
31,8% (34 pacientes) e após 30 dias foi 59.8% (64 pacientes). A maior
mortalidade foi relacionada à Pseudomonas spp. com 29 episódios, 13 (44,8%)
foram a óbito em sete dias, sendo todos resistentes a carbapenens, e cinco
foram a óbito em 30 dias (17%), sendo dois resistentes a carbapenens (Quental
et. al., 2006).
Um estudo clínico prospectivo e de vigilância microbiológica realizado no
hospital do câncer do Rio de Janeiro avaliou pacientes pós TCTH em 859
episódios de ICS. A mortalidade geral foi de 25% e a idade média foi de 43 anos.
Os doentes com neoplasias hematológicas malignas subjacentes foram
responsáveis por 38,2% dos episódios. No total de 1039 microrganismos foram
isolados 56% de bacilos Gram negativos, 32% de Gram positivos e 10% de
fungos. Os microrganismos Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli foram
produtoras de β-lactamase ESβL 37,8% e 8,9%, respectivamente. Altas taxas de
resistência a ceftazidima foram detectados em Acinetobacter spp. (40%) e
Enterobacter spp. (51,2%). Os microrganismos E. coli,
aeruginosa
foram
isoladas, mais
frequentemente,
K. pneumoniae e P.
em
pacientes
com
neutropenia. Os SCoN predominaram em 73,2% das ICS por Gram positivos. A
resistência à oxacilina foi detectada em 18,7% dos Staphylococcus aureus e em
12
77,5% dos SCoN. Entre os isolados de Candida spp, 79% foram Candida não
albicans, principalmente Candida tropicalis e Candida parapsilosis. (Velasco et.
al., 2004).
Em infecções fúngicas, especialmente aquelas causadas por espécies de
Candida spp. e Aspergillus spp., historicamente representam uma das principais
causas de morte em pacientes com câncer, especialmente após a quimioterapia
intensiva e recebimento de TCTH (Maschmeyer, 2011; Pagano et. al., 2007;
Pagano et. al., 2006). Estudos reportaram episódios de candidemia em 33% dos
pacientes submetidos a cirurgias não transplante e 17% em doenças
hematológicas malignas (9,8%) e em receptores de TCTH (2,9%). As Candida
não-albicans representaram a grande maioria dos isolados, sendo que 72,6%
dos isolados foram provenientes de pacientes com malignidades hematológicas,
77,6% em TCTH e 52,4% em tumores sólidos (Horn et. al., 2009; Neofytos et.
al., 2009). Outros estudos reportaram que os microrganismos mais frequentes
em infecções fúngicas em TCTH foram Aspergillus spp. causando na maioria a
aspergilose invasiva (59%), seguido por Candida spp. (25%) e outros (14%)
(Neofytos et. al., 2009).
2.4.
Diagnóstico Microbiológico
2.4.1. Hemoculturas
Atualmente a hemocultura é o "padrão ouro" no diagnóstico das ICS, estes
métodos são baseados na detecção de microrganismos viáveis presentes no
sangue. As hemoculturas, além de detectar agentes patogênicos viáveis,
apresentam
a
vantagem
de
permitir
a
avaliação
da
susceptibilidade
antimicrobiana, demonstrando um fator importante na terapia antimicrobiana
adequada. (Leibovici et. al., 1998; Weinstein et. al. 1997).
13
Em 1970 ocorreu à introdução da automação da hemocultura no
laboratório de microbiologia com o primeiro sistema semi-automatizado. E em
1990 estes sistemas foram aprimorados e, atualmente, as hemoculturas são
realizadas com monitoramento contínuo ·por sistemas totalmente automatizados,
que permitem a incubação ·das amostras de sangue na temperatura de 37º C.
Esses instrumentos detectam o crescimento microbiano pela análise da
libertação de CO2, usando sensores fluorescentes (BACTEC® 9240, Becton
Dickinson) ou sensores colorimétricos (BacT/Alert®; BioMérieux, França) ou,
alternativamente, medindo as mudanças de pressão no espaço superior do
frasco, gerada pelo consumo dos nutrientes e a produção de gases
(VersaTREK®; TREK Sistemas de Diagnóstico).
Vários desenvolvimentos técnicos, incluindo o aprimoramento dos meios
de cultura e a detecção automática de crescimento, melhoraram muito as
performances de diagnóstico deste método de diagnóstico (Cockerill et. al.,
2004; Weinstein, 1996). No entanto, vários fatores podem ainda reduzir a
sensibilidade global de hemoculturas. O volume de sangue inoculado no frasco é
um dos fatores mais importantes que influenciam no diagnostico (Tenney et. al.,
1982). Vários estudos com adultos e em doentes pediátricos confirmaram que a
taxa de isolamento de microrganismo a partir das hemoculturas aumentam com
a quantidade de sangue inoculado (Bouza et. al., 2007; Cockerill et. al., 2004;
Kaditis et. al., 1996). Outra variável importante é o tempo para incubar o frasco
dentro do equipamento, o ideal é que sejam imediatamente colocadas no
monitoramento contínuo para minimizar o tempo de detecção e reduzir o número
de falsos negativos (Sautter et. al., 2006; Schwetz et. al., 2007). Uma limitação
intrínseca
as
culturas
automatizadas
é
a
baixa
sensibilidade
para
microrganismos fastidiosos e de crescimento lento como Bartonella spp.,
Francisella tularensis, Mycoplasma spp. e Nocardia spp.. Os microrganismos
14
não
cultiváveis
como
Rickettia
spp.,
Coxiella
burnetti,
Chlamydophila
pneumoniae e Tropheryma whipplei são melhores diagnosticados por teste
imunológicos ou técnicas moleculares (Fenollar & Raoult, 2007).
A detecção do crescimento do microrganismo é feita após o sinal positivo
indicado pelo equipamento, e então, é realizado diretamente do frasco a
pesquisa do microrganismo por coloração utilizando o método de Gram. A seguir
é realizada a semeadura em meios seletivos e enriquecedores para o isolamento
do microrganismo permitindo, assim a identificação e realização dos testes de
susceptibilidade aos antimicrobianos.
Atualmente, o potencial das técnicas moleculares baseadas na detecção
dos ácidos nucleicos foi apenas parcialmente explorado na rotina do laboratório
de microbiologia, principalmente quando comparada com a revolução que
alterou radicalmente os laboratórios de virologia nas ultimas duas décadas. No
entanto, vários estudos estão avaliando as metodologias moleculares no
diagnostico das infecções de corrente sanguínea e sepse aplicados aos frascos
de hemoculturas positivas (Mancini et. al., 2010).
2.4.2. Identificação
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
Susceptibilidade aos Antimicrobianos
A identificação de bactérias nos laboratórios de microbiologia clínica pode
ser realizada manualmente ou através de métodos automatizados, que realizam
testes fenotípicos, incluindo esfregaços de Gram e testes bioquímicos,
considerando os requisitos da cultura e características de crescimento (Woo et.
al., 2008).
15
Os métodos automatizados fornecem maior precisão nos resultados e
proporcionam uma rapidez na identificação. Os sistemas automatizados mais
utilizados são: Vitek®; Vitek-2® (BioMérieux, Hazelwood, MO); Walk-Away®
(DADE, West Sacramento, CA); Phoenix® (Becton Dickinson Microbiology
Systems, Coceysville, Md).
O teste de susceptibilidade aos antimicrobianos tem o objetivo da avaliar
o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e definir o fenótipo de resistência.
As amostras testadas são classificadas em sensíveis, intermediárias ou
resistentes, empregando-se os limites de sensibilidade preconizados pelo
“Clinical Laboratory Standards Intitute” (CLSI). A metodologia manual baseia-se
na técnica de Kirby-Bauer de disco difusão, e os halos de inibição são
interpretados de acordo com as recomendações vigentes do documento
“Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing” do CLSI. Outro
método, o Etest (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra), também pode ser utilizado
para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), que é a menor
concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano.
A maioria dos métodos automatizados que avaliam o perfil de
sensibilidade baseia-se na técnica de microdiluição em caldo, na qual diversas
concentrações de antimicrobianos são utilizadas para determinar a CIM. Estas
concentrações são interpretadas pelos equipamentos de acordo com as
recomendações vigentes do documento “Methods for dilution antimicrobial
susceptibility tests for bacteria that grow aerobically” do CLSI.
2.5.
Diagnóstico Microbiológico Molecular
16
2.5.1. Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
A técnica de PCR tornou-se uma ferramenta indispensável nos
diagnósticos moleculares após sua idealização pelo cientista Kerry Mullis em
1983. É surpreendente a rapidez com que os avanços tecnológicos baseados
nessa metodologia desenvolveram após a sua automação, isolamento e
purificação da enzima Taq DNA polimerase a partir da bactéria termofílica
Thermus aquaticus. Na área de diagnóstico por biologia molecular, a PCR
permitiu a detecção de genes alvos com inédita sensibilidade e facilidade. Sua
aplicação no diagnóstico de doenças infecciosas estabeleceu uma nova era na
detecção e caracterização de microrganismos e passaram, no presente, a fazer
parte da rotina de processamento de algumas amostras clínicas (Saiki et. al.,
1988). Na pratica clinica, a PCR pode ser pelo método convencional ou em
Tempo Real. Os reagentes utilizados na reação de amplificação do DNA são os
iniciadores, dNTPs, enzima como a Taq DNA polimerase, MgCl2, uma solução
tampão e água, além do DNA extraído. Esta reação é composta por uma
temperatura de desnaturação, uma de anelamento e uma de extensão do DNA,
repetidas vezes (Konenam et. al., 2006).
Importantes avanços tecnológicos, como PCR em Tempo Real e
espectrometria de massa, tem revolucionado o diagnóstico clínico. Em particular,
o PCR em Tempo Real que tem permitido a técnica maior sensibilidade,
robustez e menor contaminação, além da quantificação. Esta técnica combina a
amplificação e a quantificação de uma sequência de DNA alvo por meio da
detecção de fluorescência utilizando sondas específicas marcadas com
fluoróforos, ou com base na determinação da temperatura de desnaturação de
uma sequencia de DNA dupla fita (“melting temperature” - Tm) marcada com
substância intercalante de DNA fluorescente (Klein, 2002; Kubista et. al., 2006).
Os princípios aplicados para detecção de uma sequência alvo são baseados na
17
mensuração de fluorescência durante a reação por diferentes filtros que
capturam a fluorescência conforme o comprimento de onda emitido. A
fluorescência é proporcional à quantidade de produto amplificado em cada ciclo
e o número de ciclos de amplificação necessários para obter uma determinada
quantidade de DNA é registrado como ciclo do threshold (Mackay, 2004; Kubista
et. al., 2006).
Essa evolução tecnológica juntamente com o caráter indispensável da
PCR em laboratórios moleculares levou a uma vasta expansão do número de
aplicações clínicas. Atualmente, foi desenvolvida uma plataforma que utiliza a
espectrometria de massa de produtos de PCR ionizados (incluindo produtos do
gene 16S rDNA) que é capaz de integrar, no mesmo sistema, a identificação da
espécie do microrganismo, genotipagem, detecção de genes de virulência e de
resistência aos antimicrobianos (Ecker et. al., 2006).
Atualmente, a detecção de bactérias de interesse clínico pelos laboratórios
de biologia molecular é realizada pela amplificação do gene 16S rDNA,
codificador da subunidade menor do RNA ribossomal (rRNA). Este gene
apresenta regiões altamente conservadas entre todas as espécies bacterianas e
regiões altamente variáveis que permitem a diferenciação entre espécies (Van
de Peer et. al., 1996). O gene 16S rDNA, geralmente apresenta nove regiões
hipervariáveis, que demonstram diversidade filogenética entre as diferentes
espécies bacterianas, a utilização de iniciadores denominados universais,
complementares às regiões conservadas que flanqueiam as regiões variáveis do
gene, são suficiente para identificação bacteriana em grande parte dos casos.
Análises posteriores, utilizando hibridização com sondas de DNA, restrição
dos produtos de PCR por RFLP ou o sequenciamento direto dessas sequências
permitem a identificação da espécie bacteriana.
18
2.5.2. Genes de Resistência aos Antimicrobianos
2.5.2.1.
Gene mecA
Os antimicrobianos -lactâmicos agem através da inibição de enzimas
responsáveis por catalisar um estágio vital da biossíntese do peptideoglicano,
principal componente da parede celular das bactérias Gram positivas
(Giesbrecht et. al., 1998). Estas enzimas catalisam a etapa final da síntese da
parede celular e, por ser o sítio de ação das penicilinas, passaram a ser
chamadas de proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs). Estas PBPs catalisam a
reação de transpeptidação necessária para a união das cadeias de
peptideoglicano, constituintes da parede celular bacteriana. O mecanismo de
resistência ao -lactâmicos está associado à alteração do sítio de ação do
mesmo pela produção de uma proteína ligadora de penicilina adicional, a PBP2a
(também denominada PBP2’).
Esta proteína ligadora de penicilina adicional, a PBP2a, é codificada pelo
gene mecA, que confere resistência à meticilina em S. aureus e em
Staphylococcus Coagulase Negativo (SCoN). O gene mecA faz parte de um
elemento genético móvel designado cassete estafilocócico do cromossomo mec
(“staphylococcal cassette chromosome mec” - SCCmec), integrado ao
cromossomo de S. aureus e localizado próximo à sua origem de replicação.
(Katayama et. al., 2000). O SCCmec apresenta o complexo do gene mec, que
codifica resistência à meticilina, e o complexo do gene ccr (do inglês “cassette
chromosome recombinase”), que codifica recombinases responsáveis pela sua
mobilidade. Além disso, apresenta uma região denominada J (derivada do termo
inglês “junkyard”) que compõe o restante do material genético do complexo
SCCmec. Esta região é de grande importância para auxiliar na classificação dos
diferentes tipos de SCCmec, atualmente classificados em 11 tipos (Turlej et. al.,
2011).
19
O complexo do gene mecA é composto do gene propriamente dito e de
seus genes regulatórios mecI e mecR1, localizados na região posterior ao
promotor do gene mecA. O gene mecI codifica uma proteína que se liga ao DNA
e reprime a transcrição do gene mecA, enquanto que o gene mecR1 codifica
uma proteína que promove a transcrição do gene mecA na presença de lactâmicos (Sharma et. al., 1998). São conhecidas quatro classes deste
complexo, nomeadas de A a D, que divergem entre si de acordo com a presença
de determinadas seqüências de inserção (seqüências de DNA envolvidas com a
mobilização de informação genética, de função similar aos plasmídeos)
(Katayama et. al., 2001).
Diversos autores relataram alta incidência de infecção de corrente
sanguínea por Staphylococcus spp. resistentes à meticilina.
(Linares et. al.,
2009; Bert et. al., 2010). Em um recente estudo do Programa de Vigilância
SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program) realizado com 3.907 amostras de
bactérias Gram positivas coletadas de centros médicos no mostrou que S.
aureus foi o microrganismos mais prevalente em infecções de corrente
sanguínea seguido por SCoN. Neste mesmo estudo, 31% dos isolados de S.
aureus e 80% dos SCoN apresentaram resistência a meticilina (Gales et. al.,
2009).
2.5.2.2.
Genes vanA e vanB
Os antimicrobianos glicopeptídeos (vancomicina) agem no metabolismo de
construção da parede celular bacteriana, através da ligação da porção terminal
D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo encontrado em precursores de peptidoglicano,
principal componente estrutural da parede celular das bactérias Gram positivas
(Silveira et. al., 2006; Eggert et. al., 2001).
20
A resistência bacteriana à vancomicina ocorre pela produção de um
dipeptídeo, com terminação D-alanina-D-lactato (D-Ala-D-Lac), precursor do
peptidoglicano. Esse dipeptídio diminui em uma escala superior a 1000 vezes a
afinidade da vancomicina com a camada de peptidoglicano, conferindo
resistência a este antimicrobiano principalmente em Enterococcus faecium e E.
faecalis (McComas et. al., 2003; Silveira et. al., 2006).
O gene vanA é mediado pelo transposon Tn1546, localizado em plasmídeo
ou cromossomo da célula bacteriana. O transposon Tn1546 codifica nove
polipeptídeos que atuam em conjunto na conferência da resistência a
vancomicina. Estes polipeptídeos podem ser distribuídos em quatro grupos
funcionais: Transposição, Regulação, Resistência e Proteínas acessórias (não
essenciais).
São
descritos
sete
fenótipos
de
resistência
aos
glicopeptídios,
A,B,C,D,E,G e L, e os genes mais prevalentes, vanA e vanB estão descritos em
espécies E. faecalis e E. faecium, os enterococos com fenótipo vanA
apresentam alto grau de resistência a vancomicina e teicoplanina, com
resistência induzível à presença de glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina,
avorpacina, ristocetina) e por agentes não glicopeptídeos, como bacitracina e
polimixina B. O fenótipo VanB apresenta altos níveis de resistência à
vancomicina enquanto a sensibilidade a teicoplanina é mantida. Ambos os genes
podem ser encontrados em plasmídeos ou no cromossomo bacteriano e ser
transferidos entre espécies enterocócicas (Cetinkaya et. al., 2000).
O surgimento dos primeiros isolados de enterococos resistentes à
vancomicina e sua disseminação no ambiente hospitalar contribuiu para a busca
de novos antimicrobianos para o tratamento deste patógeno multirresistente
(Silveira et. al., 2006). Em infecções de corrente sanguínea, dentre os Gram
21
positivos, as espécies de Enterococcus spp. estão entre os microrganismos mais
isolados em ICS (Erdem et. al., 2009). No Brasil Gales e colaboradores, em um
estudo multicêntrico em 2008, reportaram os Enterococcus spp. como a oitavo
espécies mais encontradas, sendo o terceiro entre os Gram positivos, com
resistência a vancomicina em 7,7% dos isolados (Gales et. al., 2009).
2.5.2.3.
Produção de -Lactamases
Os antimicrobianos -lactâmicos interferem na parede celular de Gram
negativos e são frequentemente os mais utilizados no tratamento das infecções
bacterianas. A ampla utilização, principalmente, das cefalosporinas de segunda
e terceira gerações nos tratamento de infecções causadas por enterobactérias
foi acompanhada pelo surgimento e disseminação de cepas bacterianas
resistentes produtoras de enzimas do tipo ESβL (Tumbarello et. al., 2006).
As β-lactamases são um grupo de enzimas capazes de inativar
antimicrobianos β-lactâmicos, por hidrolisarem a ligação amida do β-lactâmicos,
causando a destruição irreversível do antimicrobiano (Livermore, 1995). A
atividade enzimática é variável de acordo com o tipo, a quantidade de βlactamase produzida e os diversos substratos β-lactâmicos existentes. Estas
enzimas
são
capazes
de
hidrolisar
as
penicilinas,
cefalosporinas,
monobactâmicos e carbapenens, e a interação entre estas enzimas e seus
substratos resulta em compostos inativos que permitem a sobrevivência da
célula bacteriana (Bush, 2001). A quantidade de enzima produzida, a habilidade
da enzima em hidrolisar o antimicrobiano e a velocidade com que o -lactâmico
penetra pela membrana celular externa são alguns fatores que podem influenciar
na capacidade da β-lactamase em conferir resistência (Livermore, 1991).
22
As β-lactamases constituem um grupo heterogêneo de enzimas produzidas
por inúmeras espécies bacterianas, tanto Gram-positivas quanto Gramnegativas, porém com diversidades estruturais e localizações diferentes. Nas
bactérias Gram-positivas, as β-lactamases são secretadas para o meio
extracelular, dessa forma são menos ativas que as β-lactamases produzidas
pelas bactérias Gram-negativas. Nesses microrganismos, as β-lactamases estão
presentes
no
espaço
periplásmico,
podendo
assim
alcançar
maiores
concentrações e agirem de uma maneira mais eficaz sobre os antimicrobianos βlactâmicos (Livermore, 1993).
A codificação para a produção das -lactamases pode ser cromossômica
ou mediada por plasmídios e transposons, podendo ser induzida tanto pela
presença de -lactâmicos, como de precursores de parede celular no meio
extracelular (Livermore, 1991; Livermore, 1993).
Devido à grande diversidade de tipos de β-lactamases, inúmeras tentativas
de estabelecer um sistema de classificação para estas enzimas foram propostos
ao longo dos anos. Atualmente, dois esquemas de classificações têm sido
considerados como de maior importância. A classificação de Ambler,
desenvolvida em 1980, foi baseada nas sequências de nucleotídeos e
aminoácidos das enzimas e somente quatro classes moleculares de βlactamases foram descritas: A) β-lactamases de espetro ampliado (ESβLs),
penicilinases e carbenicilinases; B) metalo-β-lactamases; C) cefalosporinases
cromossomais; e D) oxacilinases (Ambler, 1980). Em 1995, Bush, Jacoby e
Medeiros propuseram um esquema baseado nas propriedades bioquímicas,
estrutura molecular e sequencia nucleotídica das enzimas, combinando as
características estruturais e funcionais das -lactamases, classificando-as em
grupos funcionais (Bush et. al. 1995).
23
2.5.2.3.1. -Lactamases de Espectro Ampliado (ESLs)
Atualmente, as enzimas ESLs representam o maior grupo de lactamases estudadas (Bradford, 2001; Bush et. al., 1995). As ESLs são da
classe molecular A de Ambler (1980) e pertencentes ao grupo dois de Bush,
Jacoby e Medeiros (1995). Elas conferem resistência à ampicilina, à
carbenicilina, à ticarcilina e às cefalosporinas, no entanto, geralmente mantêm a
sensibilidade às cefamicinas, aos carbapenens e aos monobâctamicos. São,
geralmente, produzidas por Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, mas
podem ser produzidas por qualquer bactéria Gram negativa (Bradford, 2001).
As ESL apresentam uma serina no seu sítio ativo e são codificadas por genes
localizados em plasmídeos que podem também codificar resistência aos
aminoglicosídeos,
tetraciclina,
cloranfenicol
e
trimetoprim/sulfametoxazol.
(Rossolini et. al., 2008; Winokur et. al., 2001).
Outras variantes de ESβL também já foram descritas em diferentes
microrganismos. As ESβL BES (Serratia marcescens), FEC-1 (E. coli), CME-1
(Cryseobacterium meningosepticum), PER (P. aeruginosa e Salmonella
enterica), SFO (E. cloacae), TLA (E. coli) e VEB (E. coli), sendo pouco
frequentes
(Bradford, 2001)
(http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1).
Essas enzimas também conferem resistência a todas as oximino cefalosporinas,
especialmente a ceftazidima e ao aztreonam. No entanto, as enzimas blaTEM,
blaSHV e blaCTX-M são as mais prevalentes entre as enterobactérias (Harada et.
al., 2008).
24
2.5.2.3.1.1.
-Lactamases TEM
A descrição da primeira β-lactamase, denominada TEM-1 (subgrupo 2b),
ocorreu em 1960. A β-lactamases, TEM-1, foi encontrada em Escherichia coli
isolada da corrente sanguínea de uma paciente grega chamada Temoniera,
origem da sigla da β-lactamase TEM (Turner, 2005). Atualmente, responde por
mais de 90% da resistência a ampicilina em amostras de E. coli, sendo também
responsável pela resistência a ampicilina e penicilina em amostras de
Haemophilus influenza e Neisseria gonorrhoeae (Paterson & Bonomo 2005;
Livermore, 2008). Esta enzima é codificada por genes localizados, usualmente,
em elementos genéticos móveis, plasmídios e transposons, que podem ser
transferidos para diferentes plasmídios entre microrganismos da mesma espécie
ou de espécies diferentes. Devido à grande facilidade de disseminação, esta
enzima tem sido descrita em diversas espécies de Enterobactérias, e em outras
espécies bacterianas (Paterson & Bonomo 2005).
Atualmente
existem
mais
de
190
derivados
de
TEM
(http://www.lahey.org/Studies/temtable.asp) sendo algumas resistentes aos
inibidores de β-lactamase e a grande maioria apresenta o fenótipo ESβL
(Bradford,
2001).
As
substituições
de
aminoácidos
que
ocorrem
em
determinadas posições da enzima TEM resultam em leves alterações nos
fenótipos de ESβL, com a habilidade de hidrolisar oximino-cefalosporinas
específicas como ceftazidima e cefotaxima, ou alterar seus pontos isoelétricos
de 5,2 para 6,5. (Bradford, 2001). Estudos laboratoriais de indução de mutações
para a β-Lactamase TEM-1 (Blazquez et. al., 2000; Huang et. al., 1996;
Vakulenko et. al., 1995) demonstraram que essas mutações, ocorridas
naturalmente em ESβL do tipo TEM, são resultado da pressão seletiva de vários
agentes β-lactâmicos utilizados em uma determinada instituição (Blazquez et.
al., 2000). Embora essas β-lactamases sejam mais frequentemente relatadas em
25
E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter aerogenes, Morganella morganii, Proteus
mirabilis, Proteus rettgeri, e Salmonella spp. (Bonnet et. al., 1999; Marchandin et.
al., 1999; Morosini et. al., 1995; Palzkill et. al., 1995; Perilli et. al., 2000; Tessier
et. al., 1998), tem sido, também, reportadas entre bactérias Gram negativas não
Enterobacteriaceae. As β-lactamases TEM-21 (Dubois et. al., 2005) e TEM-42
(Mugnier et. al., 1996) foram descritas em uma cepa de P. aeruginosa e a TEM17 em uma cepa de Capnocytophaga ochracea (Rosenau et. al., 2000).
2.5.2.3.1.2.
-Lactamases SHV
A denominação da sigla SHV vem de uma propriedade bioquímica da
enzima variável sulfidrila (“sulphydryl variable”) (Tzouvelekis & Bonomo, 1999).
Em muitas cepas de K. pneumoniae o gene blaSHV-1, ou outro gene relacionado,
apresenta-se integrado ao cromossomo bacteriano (Livermore, 1995). O fenótipo
ESβL é caracterizado a partir de substituições de aminoácidos que ocorrem no
gene blaSHV-1, e estas alterações assemelham-se as que acontecem com as
ESβL do tipo TEM (Huletsky et. al. 1993). Em 1983, foi descrito o primeiro relato
de uma SHV de espectro ampliado, denominada SHV-2, encontrada em
amostras clínicas de K. pneumoniae, K. ozaenae e Serratia marcescens (Knothe
et. al., 1983).
Em 1983, foi descrito o primeiro relato de uma SHV de espectro ampliado,
denominada SHV-2, encontrada em amostras clínicas de K. pneumoniae, K.
ozaenae e Serratia marcescens (Knothe et. al. 1983). Em 1988, SHV-3 e SHV-4
foram descritas por Jarlier e colaboradores (Jarlier et. al., 1988) e Bure e
colaboradores (Bure et. al., 1988), respectivamente. Ambas foram encontradas
em amostras clínicas de K. pneumoniae recuperadas de hospitais franceses.
SHV-5 foi descrita na Grécia e Tailândia (Chanawong et. al., 2001; Neonakis et.
26
al., 2003; Poirel et. al., 2004a), enquanto SHV-12 foi identificada, até o momento,
somente na Tailândia (Chanawong et. al., 2001).
Apesar de grande parte das -lactamases do tipo SHV apresentar fenótipo
ESβL, as beta-lactamases SHV-10 e SHV-11, possuem fenótipo de resistência
aos inibidores das -lactamases e apesar de hidrolisar as penicilinas, essa
enzima apresenta uma hidrólise reduzida para as cefalosporinas e, dessa forma,
não é classificada como ESβL (Bradford, 2001). Até o presente momento, foram
descritas
mais
de
145
variantes
da
β-lactamase
da
classe
SHV
(http://www.lahey.org/Studies/webt.asp#SHV).
Os genes do tipo blaTEM e blaSHV possuem propriedades bioquímicas
parecidas, conservando, assim, um grau de similaridade entre si. A diferença
estrutural entre estas enzimas é discreta, e está relacionada com mudanças de
aminoácidos junto ao sítio ativo da enzima (Bradford, 2001).
2.5.2.3.1.3.
-Lactamases CTX-M
A β-lactamase tipo CTX-M pode ter sido originada da enzima
cromossômica AmpC de Kluyvera ascorbata, devido ao seu alto grau de
homologia (Bonnet, 2004).
As ESβL do tipo cefotaximase (CTX-M) são codificadas por genes, blaCTXM,
localizados em plasmídeos, que normalmente abrigam outros genes que
conferem resistência aos aminoglicosídeos, ao cloranfenicol, às sulfonamidas,
ao trimetoprim e à tetraciclina. Estas enzimas conferem resistência a todas as
cefalosporinas de espectro ampliado, entretanto, apresentam como substratos
preferenciais a cefotaxima e a ceftriaxona (Bonnet, 2004; Cartelle et. al., 2004;
Rossolini et. al., 2008). Apresentam apenas 40% de similaridade com as βlactamases TEM e SHV (Tzouvelekis et. al., 2000).
27
Os primeiros casos de infecções causadas por isolados de E. coli e K.
pneumoniae produtores de CTX-M foram relatados no final dos anos 80 no
Japão, Europa e Argentina. Desde então, essas enzimas vêm se disseminando
mundialmente em diferentes gêneros de enterobactérias (Bonnet, 2004;
Rossolini et. al., 2008). Atualmente, encontram-se descritos na literatura mais de
130 tipos de CTX-M diferentes (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1).
As enzimas pertencentes ao mesmo grupo diferem umas das outras por apenas
um, ou por pouquíssimos aminoácidos (Rossolini et. al., 2008). Embora tenha
sido descrito na literatura a ocorrência de β-lactamases do tipo CTX-M com
maior atividade hidrolítica contra a ceftazidima que a cefotaxima, esse achado
tem sido justificado devido ao uso extensivo de ceftazidima na prática médica
(Bonnet, 2004; Cartelle et. al., 2004; Rossolini et. al., 2008).
No início da década de 1990, a β-lactamase CTX-M-2 disseminou-se
rapidamente na Argentina e em países vizinhos (Rossolini et. al., 2008). Outros
membros da família CTX-M estão distribuídos em diversos lugares do mundo;
CTX-M-9 e CTX-M-14 predominantemente na Ásia e na Espanha (Hernandez et.
al., 2005; Munday et. al., 2004), CTX-M-3 e CTX-M-15 na Europa. Apesar de não
ter sido isolada no Reino Unido antes de 2001, a enzima CTX-M-15 é atualmente
a ESβL mais prevalente em amostras bacterianas de E. coli e K. pneumoniae
nesta região (Livermore & Hawkey 2005).
Durante muitos anos, a identificação da enzima CTX-M esteve restrita
aos membros da família Enterobacteriaceae. Porém em isolados clínicos de P.
aeruginosa já foram descritas as enzimas CTX-M-1, CTX-M-43 (Al Naiemi et. al.,
2006; Celenza et. al., 2006) e CTX-M-2 (Picão et. al., 2009a; Picão et. al.,
2009b). A disseminação das β-lactamases do tipo CTX-M está causando
importantes e imprevisíveis mudanças na epidemiologia da resistência aos
antibióticos β-lactâmicos (Rossolini et. al., 2008).
28
2.5.2.3.2. -Lactamases KPC
A enzima KPC foi primariamente descrita em uma cepa de K. pneumoniae
isolada na Carolina do Norte, EUA, em 1996, durante o estudo de vigilância
ICARE
(Intensive
carbapenemases
Care
do
tipo
Antimicrobial
KPC
Resistance
(sigla
para
Epidemiology).
“Klebsiella
As
pneumoniae
carbapenemase”), incluídas na classe A (Ambler, 1980) ou grupo 2f de Bush
(Bush et. al., 1995) são enzimas que são capazes de hidrolisar penicilinas,
cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos (Queenan & Bush 2007). A
descoberta da KPC-1 foi seguida por várias publicações de outra variante, a
KPC-2, identificada em 2003, de isolados de provenientes de Baltimore,
coletados durante os anos de 1998 e 1999. No entanto, uma recente correção na
sequência de nucleotídeos do gene blaKPC-1 indicou que as enzimas KPC-1 e
KPC-2 são idênticas (Yigit et. al., 2001). A partir de então, relatos de KPC-2
tornaram-se frequentes na Costa Leste dos Estados Unidos e rapidamente
expandiu-se, sendo descrito em diversas partes do mundo (Queenan & Bush
2007).
Até
o
momento,
12
variantes
de
KPC
foram
descritas
(http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1).
As enzimas do tipo KPC são as mais prevalentes entre as enzimas da
classe A de Ambler. Estas enzimas encontram-se disseminadas mundialmente,
com relatos na América do Sul, Canadá, Israel, China, em mais de oito países da
Europa; entretanto, a frequência destes isolados é endêmica somente nos
Estados Unidos, em Israel e na Grécia. Isolados produtores de KPC estão
amplamente disseminados no nordeste dos Estados Unidos, sendo detectados
em cerca de dez estados americanos. Em Tel Aviv, Israel, foi descrito o primeiro
surto de E. coli produtora de KPC-2 fora dos Estados Unidos. Na Grécia, um
estudo de vigilância revelou a predominância de um clone de K. pneumoniae
29
produtor de KPC-2 distribuído em 18 hospitais representativos de todo o território
grego (Navon-Venezia et. al., 2006; Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007;
Giakoupi et. al., 2009).
A enzima KPC-2 foi primeiramente descrita no Brasil por Monteiro e
colaboradores (2009), em quatro amostras de K. pneumoniae isoladas entre
setembro e novembro de 2006 em um hospital de Recife. Desde então, isolados
de K. pneumoniae e E. cloacae produtores de KPC-2 também foram descritas no
Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul, mostrando que a emergência
deste mecanismo de resistência em hospitais brasileiros vem ocorrendo desde,
pelo menos, desde o ano de 2005 (Pavez et. al., 2009; Peirano et. al., 2009;
Zavascki et. al., 2009).
2.5.2.3.3. Metalo-β-lactamases
As metalo-β-lactamases são um grupo de enzimas que possuem a
capacidade de hidrolisar todos os β - lactâmicos, exceto monobactâmicos. Não
são inibidas pelos inibidores das serino-β-lactamases como ácido clavulânico,
sulbactam e tazobactam (Queenan & Bush 2007), entretanto, são inibidas por
agentes quelantes, como o EDTA, derivados de tiol e do ácido dipicolínico
(Payne et. al., 1997a; Payne et. al., 1997b; Laraki et. al., 1999; Bebrone, 2007).
Estas enzimas são pertencentes ao grupo três de Bush (Bush et. al., 1995) e na
classe molecular B de Ambler (Ambler, 1980), e necessitam do Zn+2 ou outros
cátions divalentes como cofatores no sítio ativo.
As MLs foram inicialmente codificadas por genes cromossomais em
várias bactérias, incluindo Bacillus cereus (Sabath & Abraham 1966),
Stenotrophomonas maltophilia (Saino et. al., 1982), Aeromonas spp. (Shannon
et. al., 1986), Chryseobacterium spp. (Bellais et. al., 2000). As MLs adquiridas
30
apresentam-se em estruturas genéticas móveis que fornecem mobilidade ao
gene, facilitando a disseminação dessa enzima entre diferentes espécies
bacterianas. As MβLs são mais frequentemente isoladas em espécies de
bactérias Gram negativas não fermentadoras, como Pseudomonas aeruginosa e
Acinetobacter baumannii, entretanto, estas enzimas têm sido reportadas em
membros da família Enterobacteriaceae, incluindo K. pneumoniae (Lincopan et.
al., 2005; Morfin-Otero et. al., 2009).
Atualmente, são conhecidas 10 subclasses de MBLs adquiridas: IMP
(imipenemase), VIM (Verona imipenemase), SPM (São Paulo metalo-βlactamase), GIM (German imipenemase), SIM (Seul imipenemase), AIM
(Australian imipenemase), KHM (Kyorin Health Science metalo-β-lactamase),
NDM (New Delhi metalo-β-lactamase), DIM (Dutch imipenemase) e TMB (Tripoli
metalo-β-lactamase) (Osano et. al., 1994; Lauretti et. al., 1999; Toleman et. al.,
2002; Castanheira et. al., 2004; Lee et. al., 2005; Yong et. al., 2007a, Sekiguchi
et. al., 2008; Salabi et. al., 2009; Poirel et. al., 2009).
A primeira MβL, IMP-1, cuja produção era mediada por um gene situado
em um plasmídeo, foi reportado em uma amostra de Serratia marcescens,
isolada em um hospital de Osaka, em 1991 (Osano et. al., 1994). Diversas
variantes dessa enzima foram então descritas em P. aeruginosa, Acinetobacter
spp. e enterobactérias de praticamente todos os continentes (Walsh et. al., 2005;
Walsh, 2008). As variantes IMP-1, IMP-16 e IMP-18 já foram reportadas em
isolados clínicos brasileiros de P. aeruginosa (Mendes et. al., 2004; Mendes et.
al., 2007b; Xavier et. al., 2007). Em 2005, Lincopan e colaboradores relataram o
primeiro caso de K. pneumoniae produtora de IMP-1 isolada de uma única
amostra, na América Latina (Lincopan et. al., 2005).
Uma segunda família de -lactamase da classe B foi identificada
inicialmente em uma amostra de P. aeruginosa na Itália em 1997, essa enzima
31
foi designada como VIM-1 e deu origem à família VIM (Lauretti et. al., 1999).
Muitas
variantes
de
VIM
foram
descritas,
tanto
em
microrganismos
fermentadores da glicose, quanto em não fermentadores. A maioria das
descrições foi reportada na Europa, no entanto, algumas variantes já foram
identificadas na América e Ásia (Queenan & Bush, 2007; Walsh et. al., 2005;
Walsh, 2008).
Em
2001
foi
identificada
no
Instituto
de
Oncologia
Pediátrica
(IOP/GRAACC) do Complexo Hospitalar do Hospital São Paulo, São Paulo, a
enzima SPM-1. Foi identificada em uma cepa de P. aeruginosa isolada
inicialmente na urina e posteriormente na hemocultura de uma criança de quatro
anos, portadora de leucemia (Toleman et. al., 2002). Foram reportados vários
isolados bacterianos produtores desta enzima em diversas cidades brasileiras,
como São Paulo, Brasília, Salvador, Fortaleza, Santo André, Londrina, Maringá,
Curitiba, Recife, Rio de Janeiro, Porto Alegre e São Luiz (Gales et. al., 2003;
Pellegrino et. al., 2002; Poirel et. al., 2004b; Nouér et. al., 2005; Vieira et. al.,
2005; Zavascki et. al., 2005). A única descrição da produção de SPM-1 fora do
Brasil ocorreu em 2010, na Suíça. Entretanto, a amostra de P. aeruginosa, em
que o gene blaSPM-1 foi detectado, foi isolada de um paciente politraumatizado e
possuía internação prévia no Hospital Geral Regional, em Recife (Salabi et. al.,
2010).
Em 2002, cinco isolados de P. aeruginosa foram recuperados de diferentes
pacientes de um centro médico em Dusseldorf, Alemanha. Estes isolados
codificavam uma nova β-lactamase da classe B, denominada GIM-1 (German
imipenemase) (Castanheira et. al., 2004). Em 2005, Lee e colaboradores
reportaram uma nova enzima do tipo MBL, SIM-1 que foi identificada em sete
isolados clínicos de Acinetobacter baumannii na Coréia, os quais haviam sido
isolados entre setembro de 2003 e novembro de 2004.
32
Recentemente, foram descritas novas subclasses de MBLs adquiridas:
AIM-1(Australian imipenemase), recuperada de um isolado clínico de P.
aeruginosa, em 2007, na Austrália (Yong et. al., 2007b); KHM-1 (Kyorin Health
Science metalo-β-lactamase), descrita em 2008, no Japão, em um isolado clínico
de C. freundii (Seikiguchi et. al., 2008); NDM-1 (MIM- 1) (New Delhi metalo-βlactamase), descrita em 2008, na Índia, em um isolado clínico de K. pneumoniae,
e posteriormente, sua ocorrência também foi relatada em enterobactérias na
Inglaterra (Doumith et. al., 2009; Yong et. al., 2009); TMB-1 (Tripoli MBL),
recuperada de um isolado clínico de P. aeruginosa detectado da Líbia (África),
em 2008 (El Salabi et. al., 2009) e DIM-1 (Dutch Imipenemase), descrita em
2009 a partir de um isolado de P. stutzeri originário da Holanda (Poirel et. al.,
2010).
2.5.3. Microbiologia Molecular Aplicada no Diagnóstico Clínico
Numerosos ensaios moleculares foram desenvolvidos recentemente
utilizando uma variedade de tecnologias para o diagnóstico molecular de
doenças infecciosas. As técnicas de hibridização direta permitiram a análise de
hemocultura para identificação de microrganismos. Os métodos de amplificação
de genes alvos seguidos das técnicas de analises pós-amplificação usando uma
variedade de tecnologias dependendo das necessidades clínicas para o ensaio.
As análises de pós-amplificação incluem métodos tais como sequenciamento
Sanger, pirosequenciamento, hibridização reversa e “Luminex”, que estão se
tornando mais amplamente utilizada. A análise do genoma completo por
sequenciamento, a espectrometria de massa e análise de DNA por “microarray”
podem fornecer uma valiosa informação que pode ser utilizada especificamente
para adaptar o tratamento de doenças infecciosas (Muldrew, 2009).
33
Atualmente, existem testes moleculares disponíveis comercialmente
baseados na técnica de PCR em Tempo Real utilizados como ferramenta de
diagnóstico clínico para identificação de microrganismos e genes de resistência
aos antimicrobianos em ICS. O Kit SeptiFast® (LightCycler®, Roche Diagnostics,
Mannheim, Alemanha) apresenta a capacidade de detectar 25 diferentes
microrganismos patogênicos diretamente de sangue por PCR em Tempo Real
multiplex e detecção do gene de resistência mecA (Dierkes et. al., 2009). No
entanto, este kit ainda não está disponível para uso em diagnóstico clínico no
Brasil, podendo ser utilizado apenas para pesquisa.
A identificação bacteriana tem feito grandes avanços tecnológicos e a
aplicação de novas ferramentas como o “Microarray”, que realiza a detecção de
DNA por hibridação em microarranjos (Al-Khaldi et. al., 2012), esta sendo uma
das
abordagens
recentemente
introduzida
no
diagnóstico
clínico,
em
combinação ou não com a técnica de PCR. A principal vantagem do microarray
está na ampla cobertura do DNA do patógeno, o potencial de diferenciação com
precisão relacionada às espécies microbianas, e identificação simultânea de
múltiplos microrganismos em uma única reação (Klouche et. al., 2008; Muldrew,
2009; Leggieri et. al., 2010). Atualmente, existe disponível um teste comercial
baseado na tecnologia de DNA microarray, o “Check-Points ESBL/KPC array”
(Check-Points, Wageningen, The Netherlands), que foi desenvolvido para
identificar as β-Lactamases, ESβLs do tipo blaTEM, blaSHV e blaCTX-M, bem como
carbapenemases do tipo blaKPC (Naas et. al., 2010), OXA-48, blaVIM, blaIMP e
blaNDM (Naas et. al., 2011) e seis grupos de genes AmpC: CMY-2, MIR-1/ACT-1,
DHA, ACC-1, CMY-1 (MOX-1) e FOX-1 (Bogaerts et. al., 2011).
Outra recente plataforma disponibilizada comercialmente que emergiu
como uma técnica poderosa e com desenvolvimento de robusto para a
identificação de microrganismos foi o “MALDI-TOF” (Matrix-assisted laser
34
desorption/ionization time of flight mass spectrometry). A técnica baseia-se na
geração de "impressões digitais" de proteínas de microrganismos que são
comparadas com os espectros de referência em uma biblioteca bem
caracterizadas (Dhiman et. al., 2011). Esta plataforma promete trazer este
tecnologia
para
o
laboratório
de
microbiologia
clínica,
podendo
ser
complementar, e, em alguns casos, substituem métodos fenotípicos. A Bruker
Daltonics (Leipzig, Alemanha) recente parceria da Becton-Dickinson (BectonDickinson, Franklin Lakes, NJ) desenvolveu e comercializou um MALDI-TOF MS
com banco de dados espectral de microrganismo, que foram adotadas em
laboratórios clínicos na Europa Ocidental (Dekker & Branda, 2011). Além disso,
a Shimadzu Corp (Kyoto, Japão) e a bioMérieux SA (Marcyl'Etoile, França)
desenvolveram um MALDI-TOF MS para a identificação de microrganismos, o
“MALDI-TOF MS VITEK MS system” (bioMérieux, France) (Dubois et. al., 2012).
As tendências atuais no diagnóstico molecular de doenças infecciosa estão
direcionadas para obter tecnologias que fornecem o maior número de
informações possíveis dos microrganismos presentes em amostra clínicas,
como: identificação, fatores de virulência, resistência aos antimicrobianos,
determinantes que influenciam a gravidade da doença. Como resultado destes
desenvolvimentos, o diagnóstico de doenças infecciosas poderá ter mais
precisão e os pacientes poderão ser eficazmente tratados (Muldrew, 2009).
A garantia da qualidade, controle de qualidade e questões regulatórias em
órgãos governamentais como “Food and Drug Administration” (FDA) nos
Estados Unidos e Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) no Brasil
avaliam os testes utilizados em diagnóstico, fazendo a supervisão destes testes
de laboratório como um dispositivo médico.
35
Muitos testes moleculares foram aprovados para uso clínico de rotina em
diagnóstico, e o processo de aprovação é extenso. Os testes aprovados exigem
verificação laboratorial individual antes da sua utilização na rotina clínica. Os
testes desenvolvidos pelo próprio laboratório, modificações de testes já
aprovados e reagentes específicos para uso em diagnóstico clínico apresentam
os requisitos mais rigorosos para verificação clínica e laboratorial. A exigência
dos órgãos governamentais está na determinação do desempenho do ensaio, na
caracterização de precisão, exatidão, sensibilidade analítica, a especificidade, e
outros parâmetros. Como também na validação, demonstrando que o ensaio
continua com um bom desempenho. Os reagentes, como “primers” e sondas,
que fornecem a capacidade para detectar um determinado alvo em uma
amostra, apresentam sua comercialização restrita, pois não podem incluir uma
descrição das características do método, desempenho ou utilidade clínica e
devem ser configurados como outro teste laboratorial desenvolvido (Muldrew,
2009).
A supervisão e certificação por órgãos certificadores de qualidade em
laboratório como o “College of American Pathologists” (CAP) e “Joint
Commission” nos Estados Unidos são necessárias para laboratórios dentro de
hospitais para que possam continuar utilizando os testes moleculares como
diagnóstico. No Brasil, os órgãos certificadores de qualidade para laboratórios
são o Proficiência em Ensaios Laboratoriais (PELM) da ControlLab, o Programa
de Acreditação de Laboratórios Clínicos (PALC), e a Organização Nacional de
Acreditação (ONA).
36
2.5.4. Validação de Novos Métodos Diagnósticos
A implantação de um novo método de diagnóstico em laboratório clínico
necessita de uma padronização experimental de vários processos chaves e o
estabelecimento do desempenho do teste seguindo recomendações bem
estabelecidas. A validação de um novo teste pode ser definida como
comprovação, através do fornecimento de evidência objetiva de que os
requisitos para uma determinada utilização ou aplicação especificamente
pretendidos foram cumpridos (ISO 9000:2000). Fazem parte da validação o
controle de qualidade, testes de proficiência, analise da competência do
funcionário, calibração de instrumentos e correlação com achados clínicos. A
verificação é definida como
a comprovação, através do fornecimento de
evidência objetiva de que os requisitos especificados foram cumpridos (ISO
9000:2000).
Segundo o documento MM3-A2 (CLSI, 2006), a introdução da técnica
como método diagnóstico deve ser iniciado com a determinação da sensibilidade
analítica (limite de detecção – LoD), especificidade analítica, precisão, “cutoff”
(valor de corte), sensibilidade e especificidade diagnóstica, acurácia diagnóstica,
valores preditivos positivos e negativos. LoD (sensibilidade analítica) em termos
é a quantidade mínima do material de referência detectado, utilizando um
numero de amostras estatisticamente representativo de resultados tanto de
amostras positivas com baixa concentração quanto de amostras branco,
negativas. As amostras utilizadas podem ser a partir de diluições seriadas de
DNA e/ou microrganismos, de preferência “contaminando” amostras clínicas
sabidamente negativas conforme o documento EP17-A (CLSI, 2004).
A especificidade analítica avalia dois tópicos, reação cruzada e falsos
positivos. A determinação da especificidade analítica incluindo capacidade de
amplificação dos alvos que serão rotineiramente amplificados e a incapacidade
37
de amplificação cruzada de microrganismos relacionados aos microrganismos
alvo ou que possam estar presente na amostra clínica que será processada.
Além disso, o teste de especificidade analítica deve incluir um número
significante de controles negativos, coletados de pacientes sem história da
doença que será pesquisada, com o objetivo de determinar a proporção de
resultados falso-positivos que podem ser obtidos pelo uso da nova metodologia.
A sensibilidade clínica ou diagnostica testa a positividade do teste na
doença, é a proporção de pacientes portadores de uma doença bem definida
cujos valores do teste são positivos. Pode ser calculada pela equação:
verdadeiro positivo / (verdadeiro positivo + falso negativo). especificidade clínica
ou diagnostica testa a negatividade na saúde, é a capacidade de um teste para
identificar corretamente a ausência da doença no limiar de decisão. A equação
que pode definir é: verdadeiro negativo / (verdadeiro negativo + falso positivo)
segundo o documento GP10-A (CLSI,1995).
A acuracia clínica é a capacidade de um teste de diagnóstico em
discriminar entre dois ou mais estados clínicos. Para sua avaliação pode-se
construir uma curva ROC, que qualitativamente, mostra o bom desempenho
clinico do teste quando este alcança alta fração de verdadeiro positivo (FVP),
sensibilidade, e obtém uma baixa fração de falso positivo (FFP), correspondente
a uma alta especificidade. Os testes com alta acurácia, tem curva com pontos
perto do canto superior esquerdo, onde FVP TPF são elevados e FFP FPF são
baixos. Um teste com boa acuracia, dando perfeita discriminação entre os
grupos afetados e não afetados, atinge um FVP TPF de 1 (100% de
sensibilidade) e uma FFP FPF de 0 (100% de especificidade) com um ou mais
limiares de decisão. Essa curva, então, passa pelo ponto (0, 1) no canto superior
esquerdo de acordo com o documento GP10-A (CLSI,1995).
38
OBJETIVOS
3. OBJETIVOS
3.1.
Padronizar a técnica de PCR em Tempo Real para pesquisa direta dos
principais patógenos de infecção de corrente sanguínea e de genes de
resistência aos antimicrobianos diretamente de sangue periférico coletados em
frascos de hemocultura BACTEC® e tubos de EDTA K2 gel em pacientes
submetidos ao transplante de células-tronco hematopoiéticas.
3.2.
Avaliar a concordância da PCR em Tempo Real com os testes fenotípicos
para detecção e identificação de microrganismos isolados de amostras de
sangue.
3.3.
Avaliar a concordância da PCR em Tempo Real para a detecção dos
genes de resistência com os testes fenotípicos de sensibilidade aos
antimicrobianos.
3.4.
Correlacionar o resultado da PCR em Tempo Real com a adequação do
uso de antimicrobianos nos pacientes submetidos à transplante de células-tronco
hematopoiético.
39
MATERIAIS E MÉTODOS
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1.
Casuística
As amostras, incluídas no presente estudo, foram provenientes de
pacientes
na
fase
de
mobilização
pré-transplante
de
células-tronco
hematopoiéticas, pacientes submetidos ao transplante e também os pacientes
internados com intercorrências clínicas pós-transplante que foram internados na
enfermaria da Hematologia do Transplante de Medula Óssea do Hostipal São
Paulo (HSP), e no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP), que é mantido pelo
Grupo de Apoio ao Adolescente e à Criança com Câncer (GRAACC), vinculado
ao setor de Oncologia do Departamento de Pediatria da Universidade Federal de
São Paulo (UNIFESP/EPM).
Durante o período de 09 de outubro de 2008 a 15 de julho de 2011 foram
incluídas um total de 193 amostras de hemocultura. Deste total, 160 amostras
foram dos frascos de hemocultura BACTEC® (Becton Dickinson) e 33 amostras
de sangue periférico em tubos de EDTA K2 gel. Do Hospital São Paulo (HSP) foi
provenientes 154 amostras de BACTEC® e 29 amostras de EDTA K2 gel. Foi
incluído um total de 10 amostras do Instituto de Oncologia Pediátrica
(IOP/GRAACC), das quais seis foram do frasco BACTEC® e quatro de EDTA K2
gel.
4.2.
Variáveis Clínicas
Os dados clínicos e epidemiológicos de cada pacientes foram coletados
conforme as informações das fichas médicas em ANEXO I, preenchidas pelo
serviço de racionalização de antimicrobianos de vigilância de hemocultura do
HSP e IOP/GRAACC. Os dados microbiológicos da hemocultura e antibiograma
foram fornecidos pelo Laboratório Central do HSP, UNIFESP.
40
4.3.
4.3.1. Hemoculturas
4.3.1.1.
Coleta de Sangue
A coleta de sangue para os frascos de hemoculturas e tubos de EDTA K2
GEL foram realizadas na mesma hora, no mesmo pedido do médico assistente
na presença de febre e suspeita de infecção. Na persistência da febre uma
coleta adicional de hemocultura foi realizada a critério do médico assistente
após 24 horas da primeira coleta.
As coletas de hemocultura foram realizadas pela equipe de enfermagem
seguindo normas preconizadas pelas Comissões de Controle Infecção Hospitalar
(CCIH) do HSP e IOP/GRAACC.
A coleta de hemocultura de cateter foi realizada em pacientes portadores
de cateter venoso central (CVC), nos quais não é possível ou não está indicada
à punção periférica, para coleta de amostra sanguínea.
Dos pacientes adultos, foram coletados 10 mL de sangue no frasco
BACTEC Plus Aerobic/F® e das crianças foram coletados cinco mL de sangue no
frasco BACTEC Plus Pediatric/F®.
4.3.1.2.
Processamento das Hemoculturas
As hemoculturas do HSP e do IOP/GRAACC foram processadas no setor
de microbiologia do Laboratório Central do Hospital São Paulo, UNIFESP.
Após a coleta, os frascos de hemocultura foram processados pelo
equipamento BACTEC 9240® (Becton Dickinson, Maryland, EUA), um sistema
automatizado que realiza a monitorização contínua do crescimento bacteriano. O
41
meio de cultura do frasco possui nutrientes que são metabolizados frente à
presença de microrganismos viáveis na amostra. Esta metabolização resulta na
produção de CO2 e esta alteração pode ser detectada e interpretada pelo
sistema como amostra positiva.
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
Após a positivação da hemocultura pelo sistema BACTEC® foi realizada
um esfregaço corado pelo método de Gram, para liberação do resultado parcial
da hemocultura. A semeadura da hemocultura foi realizada em meios de cultura
enriquecedores e seletivos, como ágar chocolate, ágar sangue e ágar eosinometileno-blue (EMB).
A identificação dos microrganismos e o teste de susceptibilidade a
antimicrobianos foram realizadas pelo equipamento Phoenix® 100 (Becton
Dickinson Microbiology Systems, Coceysville, Md.) utilizando os painéis PMID121, o PMID-123 e PMID-104, para Gram negativos, Gram negativos não
fermentadores e Gram positivos, respectivamente. O sistema utiliza indicadores
colorimétricos e fluorométricos para leitura dos testes de identificação e
antibiograma.
O perfil de sensibilidade das amostras realizada pelo Phoenix® 100 (Becton
Dickinson Microbiology Systems, Coceysville, Md.) foi pela detecção da
concentração inibitória mímina (CIM) de acordo com as recomendações do CLSI
vigente na data de coleta de cada hemocultura, e foram conforme os
documentos M100-S18 (CLSI, 2008), M100-S19 (CLSI, 2009), M100-S20 (CLSI,
2010), M100-S21 (CLSI, 2011).
42
Através do sistema BD Phoenix também foi possível avaliar a produção
de β-lactamase de espectro ampliado (ESβL) pelos testes de triagem e
confirmatório, de acordo com as recomendações do M100-S18 (CLSI, 2008),
M100-S19 (CLSI, 2009), M100-S20 (CLSI, 2010), M100-S21 (CLSI, 2011). O
teste de triagem avaliou as drogas cefpodoxima (0,5 g/mL), ceftazidima (0,5
g/mL) e cefepima (2 g/mL), seguidas pelo teste confirmatório que utilizou as
drogas
combinadas:
ceftazidima/ácido
clavulânico
(0,125/4
g/mL),
ceftriaxona/ácido clavulânico (0,25/4 g/mL) e cefotaxima/ácido clavulânico
(0,25/4 g/mL). Para a validação do lote do painel e para o controle de qualidade
desses testes foram incluídas as amostras de E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa
ATCC 27853 e K. pneumoniae ATCC 700603 que foi incluída como controle
positivo para avaliar a acurácia do sistema para a detecção de ESβL.
Todos os frascos de hemocultura BACTEC® positivos e negativos, em
estudo, foram encaminhados ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica LEMC da Disciplina de Infectologia da UNIFESP, para a realização das
metodologias moleculares.
4.4.
4.4.1. Padronização da PCR em Tempo Real
4.4.1.1.
Preparação das Amostras Controles e Amostras Clínicas
Para a padronização das técnicas de PCR em Tempo Real foram
utilizadas cepas bacterianas e leveduras padrão ATCC (“American Type
Collection Culture”), preferencialmente, e cepas controles que apresentam genes
de resistências e que foram, gentilmente, cedidas por outros grupos de
pesquisas e que estão armazenadas no banco de microrganismos do LEMC
43
(Tabela1).
As
amostras clínicas controles negativas foram coletas de 30
voluntários profissionais de saúde da Disciplina de Infectologia da UNIFESP.
Todas as amostras bacterianas foram recuperadas em ágar sangue de
carneiro (5%) ou ágar chocolate após incubação por 24 horas em atmosfera
aeróbia ou microaerófila. As cepas de fungos e leveduras foram recuperadas em
ágar Sabouraud. As amostras controles de resistência aos antimicrobianos foram
semeadas em meios de cultura acrescidos de antimicrobianos indutores do
mecanismo de resistência presente em cada bactéria.
Os controles positivos foram preparados por contaminação do meio de
cultura do frasco BACTEC®, sangue periférico em EDTA K2 gel (BD, Franklin
Lakes, NJ, USA), e solução salina, por bactéria e fungos referenciados na
Tabela 1, correspondendo à escala 0,5 de McFarland. A partir desta escala
foram preparados tubos com diluições 10 vezes seriadas. Para fungos
filamentosos, os controles positivos foram contaminados e depois do DNA
extraído foi quantificado no equipamento NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop
Technologies, Inc., Delaware USA).
O DNA do microrganismo presente na corrente sanguínea de cada
paciente foi obtido a partir de 3 a 10 mL de sangue de veia periférica colhidos em
tubo com EDTA K2 gel, bem como a partir dos frascos de hemocultura depois de
detectados pelos sistemas automatizados.
4.4.1.2.
Extração de DNA
4.4.1.2.1. Extração do DNA Direto dos Frascos de Hemocultura
Para a extração do DNA foram aliquotados, em um tubo de dois mL estéril,
500 µL do frasco de hemocultura do sistema BACTEC® em 500 µL de brazol. Em
44
seguida foram adicionados 300 mg esferas de vidro 0,5 mm diâmetro (Scientific
Industries, Inc.) e agitados por 10 minutos (min.) no desrupitor de células modelo
Genie (Scientific Industries, Inc.). Após este tempo, foram acrescentados 180 µL
de clorofórmio gelado e a mistura homogeneizada por cinco segundos no vortex.
A solução foi centrifugada a 20.000 g por 12 min a 8 ºC. O sobrenadante foi
retirado e transferido para outro tubo contendo 500 µL de etanol gelado que
foram agitados 3 a 5 segundos no vortex e centrifugado a 20.000 g por 12 min. a
8 ºC. O sobrenadante foi retirado e foram adicionados 500 µL de etanol gelado e
centrifugados 20.000 g por 12 min. a 8 ºC. O sobrenadante foi retirado e foram
adicionados 50 µL de água MilliQ. O tubo foi colocado a 65 ºC por 30 minutos.
4.4.1.2.2. Extração do DNA Direto dos Tubos com EDTA K2 Gel
A partir dos tubos de EDTA K2 gel, um volume de 1,5 mL de sangue foi
aliquotado em um tubo de 2 mL estéril, a esse volume foram adicionados 300 mg
esferas de vidro de 0,5 mm diâmetro (Scientific Industries, Inc.) e agitados por 10
minutos no desrupitor de células modelo Genie (Scientific Industries, Inc.). Uma
alíquota de 1 mL foi transferida para um novo tubo e a extração do DNA foi
realizada pelo kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo
com as instruções do fabricante. Os reagentes proteinase K, buffer AL e etanol
foram adicionados proporcionalmente ao volume da amostra de sangue
periférico, conforme instruções do fabricante. Foram pipetados 100 μL de
proteinase K no fundo de um tubo no qual logo em seguida, foi adicionado 1mL
de sangue. Em seguida foram adicionados 1000 μL do buffer AL e
homogeneizados no vortex por 15 segundos. O tubo foi incubado a 56°C por 10
minutos e depois centrifugado (spin) para remover as gotículas da tampa do tubo
de microcentrífuga. Logo após, foram adicionados 1000 μL de etanol (96-100%).
Uma alíquota foi então transferida para um tubo de coluna acoplado ao tubo de
45
coleta de 2 mL e centrifugado a 6.000 x g por 1 minuto. O tubo acoplado foi
descartado e outra alíquota foi transferida para o mesmo tubo de coluna, que foi
novamente centrifugado. O tubo acoplado foi descartado e foram adicionados
500 μL do buffer AW1, centrifugados a 6.000 x g por 1 minuto e depois disso o
tubo acoplado foi descartado. Foram adicionados 500 μL do buffer AW2,
centrifugados a 20.000 x g por 3 minutos e o tubo da coluna foi transferido para
um tubo limpo. Foram adicionados 50 μL do buffer AE, o tubo foi incubado a
temperatura ambiente (15-25°C) por 5 minutos e centrifugado a 6.000 x g por 1
minuto.
Tabela 1: Relação dos microrganismos controles positivos utilizados na
padronização das reações de PCR em Tempo Real.
Microrganismo
Linhagem
Acinetobacter baumannii
ATCC 19606
Acinetobacter calcoaceticus
ATCC 33305
Aspergillus flavus
Amostra clínica
Aspergillus fumigatus
Amostra clínica
Aspergillus parasiticus
Amostra clínica
Burkholderia cepacia
Amostra clínica
Candida albicans
ATCC 90028
Candida krusei
ATCC 6258
Candida parapsilosis
ATCC 22019
Candida tropicalis
ATCC 750
Enterobacter aerogenes
ATCC 13048
Enterobacter cloacae
Controle blaVIM
Enterococcus avium
ATCC 35665
Enterococcus casseliflavus
ATCC 700327
Enterococcus durans
ATCC 6056
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Enterococcus faecium
ATCC 700221 vanA
46
Microrganismo
Linhagem
Controle vanB
ATCC 700802
Escherichia coli
ATCC 25922
Fusarium solani
Amostra clinica
Klebsiella pneumoniae
ATCC 700603
Controle blaTEM, SHV, CTX, KPC (A28005)
Proteus mirabilis
ATCC 29245
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Controle blaSPM (P1088)
Controle blaIMP
Controle blaVIM
Rhizopus sp
Amostra clínica
Rhodotorula sp
Amostra clínica
Salmonella sp
Amostra clínica
Serratia marcescens
Amostra clínica
Shigella flexineri
ATCC 12022
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
ATCC 43300 mecA
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228
Staphylococcus haemolyticus
ATCC 29968
Staphylococcus saprophyticus
ATCC 15305
Staphylococcus warneri
Amostra clínica
Stenotrophomonas maltophilia
Amostra clínica
Streptococcus mitis
Amostra clínica
Streptococcus pneumoniae
ATCC 49619
Streptococcus pyogenes
ATCC 18615
Streptococcus viridans
Amostra clínica
ATCC -American Type Collection Culture
4.4.1.3.
Iniciadores e Sondas TaqMan-MGB
Os iniciadores e sondas TaqMan para identificação dos principais
patógenos utilizados neste estudo foram desenhados para os genes espécies47
específicas no software “Primer Express” v2. 0 (Applied
apresentados na Tabela
2.
Para
Biosystems, CA)
os microrganismos
Mycobacterium
tuberculosis, (Desjardin et. al., 1998), Aspergillus spp. (Luong et. al., 2011),
Fusarium spp. (Hue et. al., 1999), Candida albicans (Guiver et. al., 2001), Gram
positivo e Gram negativo (Bispo et. al., 2011) foram utilizados iniciadores e
sondas já descritos anteriormente. Os iniciadores utilizados para controle interno
e os genes de resistência blaKPC, blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA,
vanB e mecA e 18S rDNA para fungos já foram descritos anteriormente e estão
apresentados na Tabela 2.
As sequências dos genes específicos para cada microrganismo foi obtida
do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) e alinhadas usando o programa
DNASTAR (Lasergene Software Package DNASTAR, Wisconsin, EUA). Todos
os iniciadores e sondas foram testados em relação à sua especificidade no
programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) e demonstraram ser
específicos para cada uma de suas finalidades.
Tabela 2: Lista de iniciadores e sondas TaqMan para amplificação da região
codificadora dos genes de resistência aos antimicrobianos, controle interno e
genes espécie-especificos para a identificação dos microrganismos.
Iniciadores
e Sondas
Sequencia (5’3’)
Acinet-F
TGGACTCGGTAGCTGCACTTAC
Acinet-R
CCCATATGAGAGTCACCCATCTC
Acinet-PB
CCTAAAGCAGAAATCGAA
Enteroco-F
AGAAATTCCAAACGAACTTG
Enteroco-R
CAGTGCTCTACCTCCATCATT
Enteroco-PB
TCTCTCCGAAATAGCTTTAG
Microrganismo
ou Resistência
aos
Antimicrobianos
Acinetobacter
baumannii
Gene
Número de acesso
GenBank e
Referências
recA
GU 942487.1
Este estudo
AF 35185
Enterococcus spp.
groES
Este estudo
48
Iniciadores
e Sondas
Microrganismo
ou Resistência
aos
Antimicrobianos
Ecoli-F
GCCGGGAAAAGTGTACGTATCA
Ecoli-R
CGGGATAGTCTGCCAGTTCAG
Ecoli-PB
CGTTTGTGTGAACAAC
Enterob-F
CATGATGGAGCTGATCCGTAAC
Enterob-R
CCCGCAAATACGGAGTAACC
Enterob-PB
TCGCGATCGAGCACT
Kpneu-F
GATTTAATCGCAACACGCATGA
Kpneu-R
TTCTCCCGAAAATGAGACACTTC
Kpneu-PB
CCTGGGTATGCTATAT
Paer-F
ACGACGGTCATGGGCAACT
Paer-R
GTGATAGTAGCCGGAGTAGTAGCTGT
Paer-PB
AAGCTGCTCTCGGAACAGGT
Sal-F
CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATT
Sal-R
ACGGCTGGTACTGATCGATAA
Sal-PB
CCACGCTCTTTCGTCTGG
Saur-F
AGCTGGCTTAGCGTATATTTATGCT
Saur-R
GCAACTTTAGCCAAGCCTTGA
Saur-PB
AATGGTAAACAAAGCTTTAG
SCN-F
CCCAATCATTTGTCCCACCTT
SCN-R
CCGAAGGTGGAGTAAC
coagulase
SCN-PB
ACGGCTAGCTCCAAAT
negativo
Spneu-F
CACGGCTCACAGCATGGA
Spneu-R
AGAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTCA
Spneu-PB
CTCAAGGTCAAGTTTGGT
Smarc-F
CCGTCGCGGTGCTGAT
Smarc-R
CCTGGTTGAGGTAGGACAGGAT
Smarc-PB
GATGAAGAAGGTAAAGAGA
Steno-F
TTGCCACTGCGCGTGTA
Steno -R
TGTCGTCGAACTTCAGTTTTGAA
Steno -PB
CTTGTTGCCGAAGCCT
Mtuber-F
GGCTGTGGGTAGCAGACC
Mtuber-R
CGGGTCCAGATGGCTTGC
Mtuber-PB
Pmira-F
TGTGGGTAGCAGACCTCACCTATGTGTC
GA
CCTGCGTGATGGTAACAATGA
Pmira1-R
GCAGCTTCAGATGCAGAACCT
Pmira1-PB
TCTGAACTTTGCTGCTTATT
Asperg-F
GTGGAGTGATTTGTCTGTTAATTG
Asperg -R
TCTAAGGGCATCACAGACCTGTT
Asperg -PB
CGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCG
Fusar-F
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT
Fusar-R
ACAAATTACAACTCGGGCCCGAGA
Calbic-F
GGGTTTGCTTGAAAGACGGTAGT
Calbic-R
TTGAAGATATACGTGGTGGACGTTTG
Calbic-PB
TAAGCCATTGTCAAAGCGATC
Candsp-F
CTCGTAGTTGAACCTTGG
Gene
Número de acesso
GenBank e
Referências
uidA
AM 180568.1
Escherichia coli
Este estudo
Enterobacter
cloacae
atpD
DQ 859777.1
Este estudo
Klebsiella
pneumoniae
hemolysin
AF 293352.1
Este estudo
Pseudomonas
aeruginosa
regA
EU 342000.1
Este estudo
invA
Salmonella spp.
Staphylococcus
aureus
U 43272
Este estudo
nuc
EF 529608.1
Este estudo
Staphylococcus
Streptococcus
pneumoniae
rrs
gi 281296180
Este estudo
GU 968411.1
ply
Este estudo
Serratia
marcescens
crp
AF 276243.1
Este estudo
metB
6365181
S. maltophilia
Este estudo
Mycobacterium
tuberculosis
IS 6110
X 52471
Desjardin et al, 1998
Proteus mirabilis
mrpA
Z 32686
Este estudo
Aspergillus spp.
18S
rDNA
AF 548061
Luong et al, 2011
Fusarium spp.
Hue et al, 1999
FJ 159679.1
Candida albicans
18S
rDNA
Guiver et al, 2001
Candida spp.
18S
GU 562348.1
49
Iniciadores
e Sondas
Microrganismo
ou Resistência
aos
Antimicrobianos
Candsp-R
GCCTGCTTTGAACACTCT
Candsp-PB
TTTGATGCGTACTGGACCC
NFW-F
GACTCCTACGGGAGGC
522Rv-R
GCGGCTGCTGGGAC
GP-PB
CTGAYSSAGCAACGCCGCG
Gram positivo
GN-PB
CCTGAYSCAGCMATGCCGCG
Gram negativo
HFE_ F
GATGACCAGCTGTTCGTGTTC
HFE_R
CCACATCTGGCTTGAAATTCT
NS5
AACTTAAAGGAATTGACGGAAG
NS6
GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC
blaSHV-F
ATGCGTTATACGCCTGTG
blaSHV-R
TGCTTTGTATTCGGGCCAA
blaTEM-F
TGCCGCATACACTATTCTCAGAATGA
blaTEM-R
ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT
blaCTX-F
ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC
blaCTX-R
blaKPC-F
TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCG
G
ATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTC
blaKPC-R
CAATCCCTCGAGCGCGAGTC
blaIMP-F
GAATAG(A\G) (A\G)TGGCTTAA(C\T)TCTC
blaIMP-R
CAAAC(C\T)ACTA(G\C)GTTATC
blaVIM-F
GTTTGGTCGCATATCGCAAC
blaVIM-R
AATGCGCAGCACCAGGATAG
blaSPM-F
CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG
blaSPM-R
CCTTTTCCGCGACCTTGATC
mecA-F
AAAACTAGGTGTTGGTGAAGATATACC
mecA-R
GAAAGGATCTGTACTGGGTTAATCAG
vanA-F
GGGAAAACGACAATTGC
vanA-R
GTACAATGCGGCCGTTA
vanB-F
ATGGGAAGCCGATAGTC
vanB-R
GATTTCGTTCCTCGAC
Gene
Número de acesso
GenBank e
Referências
rDNA
Este estudo
16S
rDNA
Bispo et al, 2011
HFE
NM 139004.2
18S
rDNA
White et al, 1990
blaSHV
Monteiro et al, 2009
Este estudo
Fungo
Cefalosporina
Monstein et al, 2007
blaTEM
Cefalosporina
blaCTX
Cefalosporina
blaKPC
Carbapenen
EU 784136
blaIMP
Mendes et al, 2007
blaVIM
Mendes et al, 2007
Carbapenen
Carbapenen
blaSPM
Carbapenen
AJ 492820
Mendes et al, 2007
mecA
Zhang et al, 2005
vanA
Dutka-Malen et al,
1995
vanB
Dutka-Malen et al,
1995
Metilicina
Glicopeptídeo
Glicopeptídeo
F - Iniciador Sense; R - Iniciador Anti-sense e PB - Sonda TaqMan
4.4.1.4.
Amplificação por PCR em Tempo Real
A amplificação da reação de PCR em Tempo Real foi realizada no
equipamento 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, CA) utilizando o
Kit Platinum SYBR Green PCR em Tempo Real Super Mix (Invitrogen, California,
EUA) e TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City,
EUA). As condições de termociclagem foram: 2 minutos a 50°C, seguidos de 10
50
minutos a 95°C e 45 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C. Todos os
iniciadores testados para a PCR em Tempo Real utilizando o fluoróforo SYBR
Green foram submetidos à análise da curva de desnaturação (melting curve)
para garantir a correta amplificação de cada conjunto de iniciador e assim,
determinar a temperatura de desnaturação (Tm - Temperatura de melting) dos
produtos de PCR para cada gene. O ciclo de dissociação dos produtos para a
curva de desnaturação (melting curve) foi: 95°C por 10 minutos, seguidos por 40
ciclos de 40 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C, e uma etapa para realização da
curva de desnaturação que variou de 68°C até 95°C, com aumento gradual na
temperatura de 0,5°C/s. Dessa forma, foi determinada a temperatura de
desnaturação (Tm) dos produtos de PCR dos genes analisados.
Tanto para o sistema SYBR Green quanto para o sistema TaqMan foi
avaliado o Ct em que ocorreu a detecção da positividade.
A triagem das amostras positivas para os microrganismos foi realizada
primeiramente pela PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan utilizando os
iniciadores ‘genéricos’ para os genes 16S rDNA para bactérias e sondas Gram
especificas, que diferenciam os bactérias em Gram positivas e Gram negativas.
E pela PCR em Tempo Real por SYBR Green para fungos com iniciadores
‘genéricos’ para o gene 18S rDNA. Depois disso, as amostras com resultados
positivos foram encaminhadas para outra reação de PCR em Tempo Real com
sondas espécie-especificas para cada microrganismo. Assim, foi possível
otimizar as reações de PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan, direcionando
para as reações para bactérias ou para as reações para fungos.
4.4.1.5.
Eficiência da PCR em Tempo Real
A eficiência (E) das reações para os protocolos de PCR em Tempo Real
foi calculada após construção de uma curva padrão utilizando a fórmula: E = 10(-
51
1/-slope) -1, onde E = eficiência, “slope” = inclinação da curva no 7500 Software
v2. 0.4 . O valor corresponde à eficiência da reação em porcentagem quando
multiplicado por 100. As curvas foram avaliadas por um ensaio com as amostras
em triplicata. A regressão linear foi construída com o mínimo de cinco pontos e
foram avaliadas as diferenças intra ensaio, com intervalo de confiança de 95%.
Para determinar a eficiência da PCR em Tempo Real foram utilizadas
cepas controles, para os genes espécie-especificos foram utilizadas cepas
ATCC ou amostras clinicas caracterizadas, e os genes de resistências foram
realizados com cepas cedidas gentilmente por outros grupos de pesquisas e que
estão armazenadas no banco de microrganismos do LEMC. Todas as amostras
bacterianas foram recuperadas em ágar sangue de carneiro (5%) após
incubação por 24 horas em atmosfera aeróbia ou microaerófila. Os respectivos
controles utilizados para os genes encontram-se na Tabela 1.
O limite mínimo de detecção de DNA para o gene HFE foi avaliado
utilizando DNA extraído dos frascos BACTEC®. Estes foram diluídos a partir de
10 ng/µL até 100 fg/µL. Em um tubo contendo 4 mL de salina foi preparada uma
suspensão bacteriana na escala 0,5 de McFarland (1,5 x 108 UFC/mL). Um mL
da solução foi transferida para tubo de 2 mL estéril e assim foi extraído o DNA
bacteriano por fervura, 10 minutos a 100°C e centrifugado a 16.000g por 5
minutos. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 2 mL estéril. Para a
preparação das amostras para a curva padrão, foi realizada uma diluição seriada
de 10-1 a 10-7 a partir do tubo da escala 0,5 de McFarland (1,5 x 108 UFC/mL)
para cada gene testado. Para a padronização as curvas foram realizadas em
triplicata.
52
4.4.2. Validação de Novos Métodos de Diagnóstico
4.4.2.1.
Especificidade Analítica
A determinação da especificidade analítica foi abordada em dois aspectos:
reação cruzada e falsos positivos, conforme o documento MM3-A2 (CLSI, 2006).
Foram avaliadas a capacidade de amplificação dos alvos amplificados e a
incapacidade de amplificação cruzada de microrganismos relacionados aos
microrganismos alvo (Tabela 1). Uma reação contendo todos os reagentes, com
exceção do DNA da amostra, também foi utilizada como controle negativo.
4.4.2.2.
Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff”
A determinação do Ct do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff point” foi
realizada usando amostras negativas. O “cutoff”, limiar o qual um resultado
abaixo dele é relatado como positivo e acima como negativo, foi calculado de
acordo com os documentos EP12-A2 (CLSI, 2008),
EP17-A (CLSI, 2004) e
Chandelier e colaboradores (2010). Para dados paramétricos com distribuição
dos Ct das amostras negativas correspondentes a uma distribuição normal, com
95% de confiabilidade e valor de α de 5%, o LoB foi calculado pela equação: LoB
= µCtN + 1.645 σCtN (CtN= Ct das amostras negativas).
Para dados não paramétricos com distribuição não correspondente a
distribuição normal e resultados quando truncado com zero, foi considerado p =
(100-α) = 95. Os valores mensurados foram ordenados de acordo com o
resultado e o percentil foi estimado pela observação dos valores classificados. O
LoB foi determinado pela posição do Ct correspondente aos 95 percentiis pela
equação: LoB = PctB (100-α), no qual LoB = NB (p/100) + 0,5.
53
Quando o valor da posição não for um valor inteiro, para o cálculo da
posição dos 95 percentiis, foi realizada a interpolação linear. Se a posição foi X1,5
a posição foi a média entre duas posições. Se a posição dos 95 percentil
corresponder a uma posição X1,25 , a posição foi calculada como X1 + 0,25 (X2 –
X1).
O ciclo de “cutoff” foi determinado a partir do Ct de amostras negativas. Os
valores de Ct determinado pelas amostras negativas puderam ser considerados
quando determinados e quando foram “undetermined” os resultados do Ct foram
considerados como valores Ct correspondentes a 40, ou seja, o último ciclo da
PCR usando o método em tempo real (Chandelier et. al., 2010).
4.4.2.3.
Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade)
Para métodos laboratoriais de análises clínicas foi conforme o CLSI, no
qual o limite inferior de detecção pode ser determinado conforme o documento
EP17-A (CLSI, 2004). Foi sugerido para determinar o LoD um número mínimo de
60 resultados de amostras positivas com baixa concentração.
O limite inferior de detecção das reações de PCR foi obtido pela equação:
LoD = LoB + cβ SDS (LoD – limite de detecção; LoB – limite do branco; cβ –
derivado do percentil de 95% da distribuição padrão Gaussiana e fator de
correção e SDS – desvio padrão estimado para a população).
4.4.2.4.
Acurácia Clínica
A acurácia clínica para a PCR em Tempo Real foi determinada pela curva
ROC. Foi utilizado como amostras controles negativo um total de 30 amostras
54
em um pool de três amostras por frasco de hemocultura BACTEC® e 30
amostras em tubos de EDTA K2 GEL com um pool de três amostras
provenientes de 30 profissionais da saúde sem a doença.
A Curva de Características de Operação do Receptor (Curva ROCReceiver Operating Characteristic) demonstra a relação normalmente antagônica
entre a sensibilidade e a especificidade dos exames que apresentam resultados
contínuos. É uma ferramenta poderosa para medir e especificar problemas no
desempenho do diagnóstico em medicina por permitir estudar a variação da
sensibilidade e especificidade para diferentes valores de corte. A sensibilidade e
a especificidade dependem muito do ponto de corte (“cutoff”) entre os resultados
positivos e negativos. A Curva ROC mostra um gráfico de sensibilidade (ou taxa
de verdadeiros positivos) versus taxa de falsos positivos. O valor do ponto de
corte é definido com um valor que pode ser selecionado arbitrariamente pelo
pesquisador entre os valores possíveis para a variável de decisão, acima do qual
o paciente é classificado como positivo (teste positivo, paciente com a doença) e
abaixo do qual é classificado como negativo (teste de diagnóstico negativo,
ausência de doença).
Para cada ponto de corte são calculados valores de sensibilidade e
especificidade, que podem então serem dispostos no gráfico. Um classificador
perfeito corresponderia a uma linha horizontal no topo do gráfico, porém esta
dificilmente será alcançada. Na prática, curvas consideradas boas estarão entre
a linha diagonal e a linha perfeita, onde quanto maior a distância da linha
diagonal, melhor o sistema. A linha diagonal indica uma classificação aleatória,
ou seja, um sistema que aleatoriamente seleciona saídas como positivas ou
negativas, como jogar uma moeda para cima e esperar cara ou coroa.
Finalmente, a partir de uma curva ROC, devemos poder selecionar o melhor
limiar de corte para obtermos o melhor desempenho possível.
55
4.4.2.5.
Concordância entre Testes Fenotípicos e PCR em Tempo
Real
Para avaliar a concordância entre os testes fenotípicos e PCR em Tempo
Real todos os valores de Ct foram considerados, incluindo também as amostras
que apresentaram resultado de PCR não detectado após considerar o Ct do
LoD.
4.4.2.5.1. Concordância da Identificação Bacteriana entre Teste
Fenotípico e PCR em Tempo Real
A proporção de concordância entre os resultados da PCR em Tempo Real
para o gene 16S rDNA e aos resultados do sistema automatizado Phoenix®, e
PCR em Tempo Real dos genes espécie especifico e sistema automatizado
Phoenix®, e entre os resultados dos frascos de BACTEC® e EDTA K2 GEL foram
estabelecidos pelo cálculo do coeficiente Kappa (K). O Kappa é uma medida de
concordância inter-observador que mede o grau de concordância além do que
seria esperado tão somente pelo acaso. Esta medida de concordância tem como
o valor máximo o “1”, valor que representa o máximo de concordância e o “0”
que indica ausência de concordância. Um eventual valor de Kappa menor que
zero sugere que a concordância encontrada foi menor do que aquela esperada
por acaso. Sugere, portanto, discordância, mas seu valor não tem interpretação
como intensidade de discordância (Feinstein et. al., 1990). A Tabela 3 mostra as
categorias do índice Kappa.
56
Tabela 3: Categorias do Índice Kappa
k
Grau de Concordância
0,00
Ruim
0,00 – 0,20
Fraco
0,21 – 0,40
Razoável
0,41 – 0,60
Moderado
0,61 – 0,80
Boa
0,81 – 0,99
Ótimo
1,00
Perfeito
Fonte: Landis e Koch apud Everitt (1992, p. 149).
4.4.2.5.2. Concordância da Resistência aos Antimicrobianos entre
Teste Fenotípico e PCR em Tempo Real
A concordância entre aos resultados do sistema automatizado Phoenix® e
os resultados da PCR em Tempo Real para a detecção da resistência aos
antimicrobianos foi calculada em porcentagem para os resultados dos frascos de
hemocultura BACTEC®.
4.4.2.5.3. Medidas de Eficácia Diagnóstica
Os valores preditivos positivos (VPP) e negativos (VPN) foram calculados
como medidas de eficácia diagnóstica da PCR em Tempo Real para o gene 16S
rDNA em relação aos resultados do sistema automatizado de identificação
Phoenix® (padrão ouro).
57
4.5.
Correlação
dos
Resultados
de
Liberação
pelo
Método
Fenotípico e do PCR em Tempo Real com a Adequação do Uso
de Antimicrobianos nos Pacientes Submetidos à TCTH
Foram utilizados os critérios de adequação do serviço de hemocultura do
HSP e IOP/GRAACC.
A adequação da antibioticoterapia foi avaliada por dois médicos e
definida como terapia adequada quando a bactéria foi sensível “in vitro” ao
antimicrobianos em uso, terapia inadequada quando o microrganismo foi
resistente “in vitro” aos antimicrobianos em uso ou o paciente não estava em uso
de nenhum antimicrobiano, e terapia corrigida quando a antibioticoterapia foi
adequada até 48 horas após a coleta da hemocultura, se ocorrer adequação
após 48h, foi considerado inadequado.
As informações dos pacientes foram coletadas pelas fichas médicas
(ANEXO I) preenchidas por este serviço: Antibioticoterapia antes da coleta da
hemocultura; modificação da antibioticoterapia após o resultado da coloração de
Gram dos frascos positivos pelo sistema BACTEC® e adequação da
antibioticoterapia após o resultado final da hemocultura.
4.6.
Detecção dos Microrganismos por Sequenciamento de DNA
A reação de sequenciamento foi padronizada para os genes 16S rDNA e
18S rDNA pela técnica de PCR, seguida pela reação de sequenciamento dos
respectivos produtos amplificados. Os iniciadores para o gene 16S rDNA, fita
sentido
5'
ATGCAAGTCGAGCGAAC
3’
e
fita
anti-sentido
5’TGTCTCAGTTCCAGTGTGGC 3’; e para o gene 18S rDNA, fita sentido 5’
TCCGTAGGTGAACCTGCG
3’
e
fita
anti-sentido
5’
58
TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’ (Einsele et. al., 1997; Van de Peer et. al.,
1996).
As condições de termociclagem para a reação de PCR para o gene 16S
rDNA foram: 10 minutos a 95 C, seguidos por 35 ciclos de 1 minuto a 94 C, 1
minuto a 58 C, 3 minutos a 72 C, e o produto amplificado foram de
aproximadamente 500pb. Para o gene 18S rDNA a ciclagem da PCR foi de 5
minutos a 94 C, seguidos por 38 ciclos de 15 segundos a 94 C, 45 segundos a
56 C, 2 minutos a 70 C, foram obtidos produtos de 600 pb. Os produtos
amplificados das reações de PCR foram purificados utilizando-se a ExoSAP-IT®
(UBS Corporation, Cleveland, Ohio, USA), antes de serem submetidas às
reações de sequenciamento conforme as instruções do fabricante.
As reações de sequenciamento para os produtos de PCR purificados e
quantificados foram realizadas segundo a técnica de Sanger e colaboradores
(1977). Após a purificação, a reação de sequenciamento foi realizada em dois
tubos de microcentrífuga, utilizando-se de 2 L de DNA. Em cada tubo contendo
essa quantidade de DNA foram adicionados 2 L dos iniciadores (1,6 M) (senso
em um tubo e anti-senso em outro), 2 L do tampão de sequenciamento, 2 L de
água destilada e 2 L do kit de sequenciamento “Big Dye terminator” (BigDye™
Terminators v3.1 - Cycle Sequencing Kit - Applied Biosystems - ABI PRISM®,
Califórnia, EUA). A seguir, os tubos foram homogeneizados e colocados no
termociclador para a reação de sequenciamento. A termociclagem utilizada foi
de 96 C por 1 minuto, seguido de 35 ciclos de 96 C por 10 segundos, 50 C por
30 segundos e 60 C por 4 minutos.
Após o término da reação de sequenciamento, o produto foi precipitado
para eliminação dos d-dNTPs marcados não incorporados à reação. A
precipitação da reação de sequenciamento foi realizada utilizando 40µL de
59
isopropanol 75% (concentração final de 60%). Depois de adicionado o
isopropanol, o produto foi deixado em temperatura ambiente por no mínimo 20
min. Em seguida, o produto foi centrifugado por 25 min. a 13000 RPM (tubos) ou
45 minutos a 4000 RPM (placas). O isopropanol foi removido invertendo o tubo
ou a placa. Foram adicionados 200 µL de etanol 70%, e a mistura foi
centrifugada por 5 min. a 13000 RPM (tubos) ou 5 min. a 4000 RPM (placas).
Todo o etanol foi removido (com pipeta apoiando ponteira do lado oposto ao do
“pellet” ou fazendo “spin” invertido com a placa), pois qualquer etanol residual
resulta em manchas fluorescentes. As amostras foram secas em placa quente
ou no ar. O “pellet” foi ressuspenso em 10 a 20 µL de formamida Hi-Di. A
eletroforese capilar foi realizada no equipamento ABI PRISM® 3100 “Genetic
Analyzer” ou ABI PRISM® 3100-Avant “Genetic Analyzer” ou ABI PRISM® 3130
Genetic Analyzer para a leitura das sequências. Após a leitura, o resultado foi
analisado, editado e comparado às sequências consenso da biblioteca para
identificação positiva e classificação taxonômica pela análise do segmento dos
genes e pesquisas em programas incluindo “BLAST”.
60
RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1.
Casuísticas
Amostras Clínicas
Um total de 193 amostras foi estudado, das quais 160 amostras de
frascos de hemocultura BACTEC® e 33 amostras de sangue periférico coletados
em tubos de EDTA K2 gel. Desse total, 154 amostras de frascos de BACTEC® e
29 amostras de sangue periférico em tubos de EDTA K2 gel foram provenientes
de pacientes do Hospital São Paulo (HSP), seis amostras de BACTEC® e quatro
de tubos de EDTA K2 gel do Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP/GRAACC).
No HSP, as amostras dos frascos de hemocultura BACTEC® foram
coletadas de 28 pacientes e as amostras de tubos de EDTA K2 gel foram
provenientes de 17 pacientes. As amostras de frascos BACTEC® do
IOP/GRAACC foram provenientes de cinco pacientes e as de EDTA K2 gel
foram de quatro pacientes diferentes e estão apresentados na Tabela 16 em
anexo II.
5.2.
Variáveis Clínicas
Para a análise das variáveis clinicas foram avaliadas 160 amostras de
frascos de hemocultura BACTEC®. Deste total foram identificadas 127 negativas
e 33 positivas pelo sistema automatizado BACTEC®. Estas amostras foram
provenientes de 33 pacientes na fase de mobilização pré-transplante de célulastronco hematopoiéticas, pacientes submetidos ao transplante e também todos os
pacientes internados com intercorrências clínicas pós-transplante. Dos 33
pacientes, 28 (85,3%) foram admitidos na enfermaria da Hematologia do HSP e
61
RESULTADOS
cinco (14,7%) no serviço de transplantados de medula óssea do IOP/GRAACC.
Em relação ao sexo, 45,45% (15/33) dos pacientes eram do sexo feminino e
54,54% (18/33) do sexo masculino. A idade média foi de 36,78 anos, sendo a
idade máxima de 69 anos e a mínima de um ano. Nove dos 33 pacientes
estavam na fase de mobilização pré-transplante. Todos os pacientes do presente
estudo estavam fazendo uso de drogas imunossupressoras e apresentaram
febre ou hipotermia, sendo que 15 deles (75%) estavam neutropênicos no
momento em que foram coletadas as culturas (Tabela 10).
Em relação à doença hematológica de base, o diagnóstico mais
prevalente foi Leucemia Mielóide Aguda (7/33); seguido de Mieloma Múltiplo
(6/33) e Linfoma não – Hodgkin (6/33); Leucemia Linfocítica Aguda (4/33);
Síndrome Mielodisplásica (2/33) e Linfoma Hodgkin (2/33); Leucemia Linfocítica
Crônica (1/33), Adenodistrofia (1/33), Síndrome de Ewing (1/33); Carcinoma de
Pineal (1/33), Aplasia medular (1/33) e Tumor de testículo (1/33) (Figura 1).
Nos 14 pacientes com hemocultura positiva foram observados 15
episódios de infecção de corrente sanguínea. Em 10 dos episódios (53,3%)
estavam presentes apenas bactérias Gram positivas; em sete (33,3%) apenas
bactérias Gram negativas e em dois episódios (13,4%) estavam presentes dois
tipos de bactérias. Entre as bactérias Gram positivas, Staphylococcus coagulase
negativa foi o mais prevalente. A prevalência de cada microrganismo está
apresentada nas Figuras 2 e 3. Nenhuma cultura pelo sistema automatizado
BACTEC® foi positiva para fungos.
62
RESULTADOS
Figura 1 - Distribuição das doenças hematológica de base.
5.3.
Bacteriana
Fenotípica
e
Teste
de
No presente estudo foram avaliadas 160 amostras de frascos de
hemocultura BACTEC®. Desse total, 127 amostras foram identificadas como
negativas e 33 amostras como positivas pelo sistema automatizado Phoenix®
apresentados na Tabela 10.
Das 33 hemoculturas positivas pelo sistema automatizado BACTEC®, 23
bactérias Gram positivas e 10 Gram negativas foram identificadas. Dentro das 23
amostras identificadas como Gram positivas foram identificadas: quatro
Enterococcus
faecium,
dois
Enterococcus
faecalis,
15
SCoN
e
dois
Streptococcus pneumoniae (Figura 2). Das 10 amostras Gram negativas foram
identificadas:
uma
Pseudomonas
putida,
dois
Acinetobacter
spp.,
três
63
RESULTADOS
Enterobacter cloacae, uma Klebsiella pneumoniae, uma Escherichia coli, um
Bacilo Gram Negativo não Fermentador (BGNNF) e um Citrobacter freundii
(Figura 3).
O teste de sensibilidade quantitativo foi realizado pelo sistema
automatizado Phoenix® para todas as amostras que foram detectadas como
positivas pelo sistema automatizado BACTEC®. Para as amostras Gram
positivas, 12 dos 15 SCoN identificados apresentaram resistência à oxacilina
Quatro E. faecium foram resistentes à vancomicina (Tabela 10).
Entre os Gram negativos, as amostras de E. cloacae com fenótipo ESβL
exibiram diminuição da sensibilidade para todos os agentes antimicrobianos
testados, exceto para os carbapenens. Um dos isolados de Acinetobacter spp.
mostrou resistência à todos os antimicrobianos testados. O perfil geral de
sensibilidade aos antimicrobianos podem ser avaliados na Tabela 16 do anexo II.
Figura 2 - Prevalência de espécies Gram positivas identificadas pelo sistema
automatizado (Phoenix®).
64
RESULTADOS
Figura 3 - Prevalência de espécies Gram negativas identificadas pelo sistema
automatizado (Phoenix®).
5.4.
5.4.1. Padronização PCR em Tempo Real
5.4.1.1.
Amplificação por PCR em Tempo Real
As temperaturas de desnaturação (Tm) obtidas na detecção do gene HFE
(controle interno), gene 18S rDNA de fungo, Enterobacter cloacae, Aspergillus
spp., Fusarium spp. e dos genes que conferem resistências aos antimicrobianos
para cada controle positivo (ATCC ou amostra bem caracterizada) testado foram
avaliadas, permitindo o estabelecimento de um intervalo experimental de Tm
possíveis. O Tm, a média e o desvio padrão observados para os genes avaliados
estão apresentados na Tabela 4.
65
RESULTADOS
Tabela 4: Resultados da Temperatura de melting e desvio padrão da Tm dos
produtos amplificados de amostras controles ATCC para os genes de
resistência.
Genes
Tm
Menor
Maior
Media
Desvio Padrão
mecA
71,37
72,54
71,92
0,29
vanA
85,32
85,67
85,48
0,08
vanB
74,28
74,61
74,41
0,14
blaSHV
91,04
91,82
91,67
0,22
blaTEM
85,53
86,01
85,85
0,22
blaCTX
88,80
88,96
88,85
0,09
blaKPC
91,19
91,35
91,31
0,07
blaIMP
76,15
76,33
76,27
0,10
blaSPM
84,73
84,91
84,85
0,10
blaVIM
89,37
89,55
89,43
0,10
18S rDNA Lev
82,01
84,20
83,33
0,69
18S rDNA Filam
85,50
86,16
85,13
0,24
HFE
81,05
82,16
81,72
0,30
E. cloacae
79,50
80,70
80,27
0,41
Aspergillus spp.
84,16
86,40
85,59
0,86
Fusarium spp.
90,60
91,20
90,86
0,22
Lev – Levedura; Filam – Filamentoso; Tm – Temperatura de melting
5.4.1.2.
Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real
5.4.1.2.1. SYBR Green
A eficiência das reações por SYBR Green apresentados na Tabela 5
foram de 81,487% para blaSHV, 81,96% para blaTEM, 86,40 para blaCTX, 81,233%
para blaKPC, 100% para blaIMP, 80,07% para blaSPM, 128,765% para blaVIM,
93,772% para vanA, 116,911% para vanB e 108,939% para mecA. Para o gene
66
RESULTADOS
HFE (controle interno) a eficiência foi de 89,47% e para o gene 18S rDNA foi de
100,923% para leveduras e 106,80% para fungos filamentosos. Para E. cloacae
foi de 129%, Aspergillus spp. 108,5% e Fusarium spp. de 97,34%.
A reação do gene HFE foi avaliada por três ensaios em dias diferentes.
A regressão linear foi construída com o mínimo de três pontos e foram avaliadas
as diferenças inter e intra-ensaio, com intervalo de confiança de 95%. Para os
genes que conferem resistência aos antimicrobianos foram avaliados por um
ensaio com as amostras em triplicata. A regressão linear foi construída com o
mínimo de cinco pontos e foram avaliadas as diferenças intra-ensaio, com
intervalo de confiança de 95%.
Para calcular a especificidade foram testados os iniciadores e sondas
para amplificar o DNA dos genes apresentados na Tabela 2. Todos os genes
apresentaram capacidade de positivar as amostras controles por PCR em
Tempo Real utilizando o fluoróforo SYBR Green. As amostras controles foram
testadas e foram amplificadas para o gene HFE. Todas as amostras foram PCR
positivas para os seus respectivos genes de resistência, e os controles negativos
apresentaram resultados negativos.
A detecção da última diluição foi calculada a partir da diluição seriada de
amostras controles para cada gene avaliado. Para o gene HFE, o controle
utilizado foi uma amostra de sangue periférico com concentração de DNA de 100
pg/µL. A diluição seriada variou de 10-1 a 10-7 e a menor diluição detectada foi a
10-4 e a menor concentração de DNA foi de 100 fg/µL. Para os genes blaSHV,
blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB, mecA e as menores
diluições foram de 10-6, 10-7, 10-6, 10-6, 10-7, 10-7, 10-7, 10-7, 10-6 e 10-7
respectivamente (Tabela 5).
67
RESULTADOS
Tabela 5: Eficiência da reação de PCR em Tempo Real, Ct e Tm da última diluição, concentração em UFC/mL do
microrganismo detectado na última diluição de amplificação dos genes de resistência.
HFE
blaSHV
blaTEM
blaCTX
blaKPC
blaIMP
blaSPM
blaVIM
vanA
mecA
vanB
18S rDNA
Levedura Filamentoso
Controle
100 pg/µL
escala
0,5
MF
escala
0,5
MF
escala
0,5
MF
escala
0,5
MF
escala
0,5
MF
escala
0,5
MF
escala
0,5
MF
escala
0,5
MF
escala
0,5
MF
escala 0,5
MF
escala 0,5
50 ng/uL
MF
Eficiência%
89,47
81,49
81,96
86,40
81,23
100,00
80,07
128,77
93,77
108,94
116,91
100,92
106,80
“Slope”
-3,60
3,86
3,85
3,70
-3,87
-3,30
-3,92
-2,78
3,48
-3,13
-2,97
-3,3
-3,16
Sensibilidade diluiçao
10-4
10-6
10-7
10-6
10-6
10-7
10-7
10-7
10-6
10-7
10-6
10-7
10-6
Ct diluição
35,91
38,21
37,41
30,92
36,84
36,50
35,72
36,13
30,74
35,93
36,94
36,96
36,1
Tm diluição
81,05
91,04
85,54
88,80
91,20
76,15
84,73
89,43
85,32
71,37
74,45
84,02
86,02
UFC/mL por reação
100 fg/µL
15,0
1,50
15,00
15,0
1,50
1,50
1,50
15,0
1,50
15,0
MF – McFarland; Tm – Temperatura de melting; Ct ciclo threshold
68
RESULTADOS
5.4.1.2.2. TaqMan
A reação de amplificação do gene 16S rDNA com sondas para diferenciar
entre Gram positivo e Gram negativas foram avaliadas por um ensaio com as
amostras em triplicata. A regressão linear foi construída com o mínimo de 5
pontos e foram avaliadas as diferenças intra ensaio, com intervalo de confiança
de 95%. As sondas Gram especificas foram testadas quanto à sua capacidade
em diferenciar as bactérias Gram positivas e Gram negativas com cepas
controles e amostras bem caracterizadas (Tabela 6). Estas sondas foram
capazes de positivar as amostras controles de S. aureus (ATCC 43300), E. coli
(ATCC 25922) e P. aeruginosa (ATCC 27853) por PCR e todas as amostras
controles foram PCR positivas para as suas respectivas sondas, e os controles
negativos apresentaram resultados negativos. Houve exceção para as sondas
Gram negativas, pois os controles negativos utilizados em uma reação contendo
todos os reagentes sem a adição do DNA extraído da amostra apresentaram
resultados positivos devido à presença de DNA contaminante da E. coli em um
dos reagentes.
A presença de contaminantes de DNA proveniente do processo de
produção dos reagentes dificulta a interpretação dos resultados das amostras
positivas realizadas por PCR em Tempo Real utilizando iniciadores universais
(Klaschik et. al., 2002a). As preparações de Taq DNA polimerase contêm uma
quantidade pequena de DNA contaminante proveniente de E. coli ou Thermus
aquaticus
(Carroll
et.
al.,
1999),
e
também
de
Pseudomonas
spp.,
Sphingomonas spp., Moraxella spp. e Acinetobacter spp. nas preparações para
utilização em PCR em Tempo Real (Mühl et. al., 2008). Para eliminar a
interferência destes resultados na reação foi calculado o Ct do LoD e Ct do
“cutoff” que estão apresentados na Tabela 8.
69
RESULTADOS
Tabela 6: Resultados da padronização dos protocolos de PCR em Tempo Real
utilizando sondas TaqMan-MGB multiplex Gram específicas.
Microrganismo
Linhagem
PCR TaqMan Multiplex
Sonda Gram
Sonda Gram
ATCC 25923
Positiva
Positivo
Negativa
Negativo
ATCC 43300
Positivo
Negativo
ATCC 29968
Positivo
Negativo
ATCC 12228
Positivo
Negativo
Amostra clínica
Positivo
Negativo
ATCC 29212
Positivo
Negativo
ATCC 700802
Positivo
Negativo
ATCC 93011
Positivo
Negativo
ATCC 18615
Positivo
Negativo
ATCC 49619
Positivo
Negativo
Amostra clínica
Positivo
Negativo
Streptococcus mitis
Amostra clínica
Positivo
Negativo
Escherichia coli
ATCC 25922
Negativo
Positivo
ATCC 13048
Negativo
Positivo
Amostra clínica
Negativo
Positivo
ATCC 27853
Negativo
Positivo
Controle blaSPM (P1088)
Negativo
Positivo
Controle blaIMP
Negativo
Positivo
Controle blaVIM
Negativo
Positivo
ATCC 700603
Negativo
Positivo
Controle blaTEM, SHV, CTX,
Negativo
Positivo
KPC (A28005)
ATCC 19606
Negativo
Positivo
Amostra clínica
Negativo
Positivo
Serratia marcescens
Salmonella spp.
A eficiência da reação de PCR em Tempo Real multiplex para Gram
positivos foi de 115% para S. aureus, 134% para SCoN, 78,49% para S.
pneumoniae. Para os Gram negativos foi de 93,68% para E. coli, 103,29% para
Salmonella spp., 178% para Serratia marcescens, 114% para S. maltophilia,
70
RESULTADOS
99,66% para A. baumannii e em torno de 70% P. aeruginosa. Para os genes
espécie-especificos avaliados no presente estudo a eficiência da reação de PCR
em Tempo Real pode ser observada na Tabela 7, estes apresentaram resultados
que variaram de 83,845 a 157,601%.
Tabela 7: Resultados de “slope”, R2, eficiência e última diluição detectada das
reações de PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan e SYBR Green para os
genes espécie-específicos dos principais patógenos que causam infecção de
corrente sanguínea.
Padronização Real Time - TaqMan
Microrganismo
Controle puro
Eficiência da
reação (%)
R2
“Slope”
Última diluição
detectada
1
S. aureus
escala 0,5 McFarland
123.447
0.996
-2.864
D 10-6
2
S. pneumoniae
103.367
0.998
-3.244
D 10-7
3
S. haemoliticus
125,59
0.96
-2.83
D 10-7
4
Serratia marcescens
83.845
0.971
-3.781
D 10-5
5
Salmonella spp.
105.003
0.977
-3.208
D 10-7
6
P. mirabilis
104.246
0.946
-3.224
D 10-6
7
K. pneumoniae
121,922
0.983
-2.888
D 10-7
8
E. faecalis/faecium
135.443
0.942
-2.689
D 10-7
8
E. faecalis
114.535
0.951
-3.017
D 10-7
8
E. faecium
157.601
0.972
-2.433
D 10-7
9
E. coli
121.052
0.985
-2.903
D 10-7
10 P. aeruginosa
99.457
0.993
-3.335
D 10-7
11 S. maltophilia
136.653
0.96
-2.673
D 10-7
12 A. baumannii
124.039
0.994
-2.854
D 10-7
13 C. albicans
30 ng/µL
105.371
0.994
-3.2
D 10-6
14 Candida spp.
116.917
0.941
-2.974
D 10-5
14 C. albicans
121
0.948
-2.901
D 10-4
14 C. tropicalis
113.54
0.935
-3.035
D 10-5
14 C. parapsilosis
106.685
0.989
-3.172
D 10-5
15 M. tuberculosis
200 ng/ µL
128.867
0.991
-2.781
D 10-7
escala 0,5 Mc Farland
129.4
0.998
-2.77
D 10-6
17 Aspergillus spp.*
9,3 ng/ µL
108.50
0.98
-3.134
D 10-6
18 Fusarium spp.*
8,9 ng/ µL
97.34
0,998
- 3.38
D 10-6
16 Enterobacter cloacae*
* PCR em Tempo Real por SYBR Green
71
RESULTADOS
5.4.2. Validação de Novos Métodos de Diagnóstico
5.4.2.1.
Determinação do Limite do Branco (LoB)
O Ct de ponto de corte, “cutoff”, foi calculado para os genes espécieespecíficos de cada microrganismo, para as sondas Gram específicas e para os
genes de resistência aos antimicrobianos . De acordo com o número de
amostras negativas, este número variou de microrganismo para microrganismo e
estão apresentados na Tabela 8. O menor Ct de “cutoff” foi de 31,9 para S.
maltophilia, e 33,1 para E. coli. O maior Ct de “cutoff” foi de 40 para os
microrganismos Enterococcus spp., K. pneumoniae, S. marcescens, P.
aeruginosa, A. baumannii e Gram positivo.
5.4.2.2.
Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade)
O Ct de LoD foi calculado a partir de amostras com baixa concentração
para os genes espécie-específicos de cada microrganismo, para as sondas
Gram específicas e para os genes de resistência aos antimicrobianos . O Ct LoD
de cada gene avaliado apresenta-se na Tabela 8. O menor Ct foi de 30,9 para
SCoN e o maior foi de 38,92 para A. baumannii .
72
RESULTADOS
Tabela 8: Resultados de “cutoff” de amostras negativas e LoD de amostras
positivas baixas para os genes avaliados.
Microrganismo
Amostras Negativas (n)
“Cutoff”
LoD
GP
62
40
38,6
GN
66
36,6
34,4
S. aureus
26
38
36,9
SCoN
25
34
30,9
Enterococcus spp.
10
40
37,1
S. pneumoniae
31
39,1
37,4
E. coli
72
33,1
32,6
K. pneumoniae
57
40
33,9
P. mirabilis
18
38,1
37
S. marcescens
23
40
38,58
Salmonella spp.
15
36,3
33
P. aeruginosa
46
40
38,8
S. maltophilia
15
31,9
33,38
A. baumannii
65
40
38,9
C. albicans
30
39
36
Candida spp.
31
39
36,5
M. tuberculosis
33
39
34
mecA
37
34,9
33,91
vanA
41
35,5
33,67
vanB
54
33,3
32,29
blaKPC
51
37,9
36,67
blaTEM
25
36,4
34,53
blaSHV
39
34,1
33,26
blaCTX
35
33,7
32,62
blaIMP
58
33,23
28,49
blaSPM
58
33,23
30,99
blaVIM
58
33,23
31,82
Fungo 18S rDNA
32
36,1
34,4
E. cloacae
37
37,47
36,2
Aspergillus spp.
42
38,0
37,2
Fusarium spp.
38
36,9
33,01
GP – Gram positivo; GN –Gram negativo; SCoN – Staphylococcus coagulase negativo; n – número de
amostras.
73
RESULTADOS
5.4.2.3.
Acurácia Clínica
A acurácia clínica foi determinada com todas as amostras clínicas de
frascos de hemocultura e amostras clínicas controles negativas de 30
profissionais da saúde sem a doença. Para os genes estudados foi realizada a
curva ROC com um intervalo de confiança de 95% (Figuras 4 e 5). A área sob a
curva ROC apresentado na Tabela 9 ficou acima de 0,70 para a maioria dos
genes estudados mostrando um desempenho satisfatório.
A sensibilidade, especificidade e falsos positivos para cada gene variou de
acordo com o Ct do LoD determinado conforme o documento EP17-A (CLSI,
2004) e pode ser observado na Tabela 9. A sensibilidade calculada pela curva
ROC para resistência aos antimicrobianos foi acima de 80% para os genes
blaKPC, e abaixo de 60% para os genes blaTEM, blaSHV e vanB. A especificidade
foi próxima a 100% para todos os genes avaliados.
A sensibilidade pela curva ROC para os genes espécie-específicos foi
abaixo de 50% para E. coli, K. pneumoniae, Salmonella spp., SCoN e Gram
negativo considerando o LoD do Ct determinado conforme o EP17-A (CLSI,
2004), a especificidade foi próxima a 100% para todos os genes avaliados. Os
PCR em Tempo Real para detecção de A. baumannii, Enterococcus spp. e P.
mirabilis apresentaram 41,2%, 15% e 35% respectivamente, de serem
detectadas incorretamente como positivas (Tabela 9).
74
RESULTADOS
Tabela 9: Sensibilidade e especificidade clínica determinada pela curva ROC de
acordo com o Ct do LoD para os genes espécie-especificos, fungo 18S rDNA,
para o gene 16S rDNA para Gram positivo e Gram negativo e genes de
resistência aos antimicrobianos.
Gene
A. baumannii
Área
N° de
N° de
sob a
amostras amostras
curva
positivas negativas
ROC
37
17
0,973
Sensibilidade
Sensibilidade
(%)
Especificidade
-1
Falsos
Especificidade
positivos
(%)
(%)
Ct
do
LoD
1
100,00
0,412
41,2
99,59
38,92
C. albicans
30
20
0,983
0,800
80,00
0,000
0,0
100,00
36,03
Candida spp.
33
20
0,985
0,727
72,7
0,000
0,0
100,00
36,5
E. coli
47
20
0,734
0,404
40,40
0,000
0,0
100,00
32,6
Enterococcus spp.
55
20
0,957
0,891
89,10
0,150
15,0
99,85
37,15
Fungo 18S rDNA
95
20
0,953
0,768
76,8
0,050
5,0
99,95
36,1
GN 16S rDNA
222
20
0,998
0,315
31,50
0,000
0,0
100,00
34,47
GP 16S rDNA
107
21
0,995
0,813
81,30
0,000
0,0
100,00
38,68
K. pneumoniae
48
20
0,961
0,5
50,00
0,000
0,0
100,00
33,97
M. tuberculosis
20
21
1
100
0,00
0,000
0,0
100,00
34,0
P. aeruginosa
82
20
0,994
0,976
97,60
0,000
0,0
100,00
38,8
P. mirabilis
23
20
0,843
0,826
82,60
0,350
35,0
99,65
37,07
S. maltophilia
28
28
0,997
0,714
71,4
0,000
0,0
100,00
33,38
S. aureus
66
21
1
0,803
80,30
0,000
0,0
100,00
36,96
S. marcescens
27
20
0,893
0,815
81,50
0,200
20,0
99,80
38,58
S. pneumoniae
48
20
0,99
0,917
91,70
0,000
0,0
100,00
37,47
Salmonella spp.
34
20
0,825
0,412
41,20
0,100
10,0
99,90
33,01
SCoN
109
21
0,872
0,486
48,60
0,000
0,0
100,00
30,9
E. cloacae
24
24
1
0,958
95,8
0,000
0,0
100,00
37,47
Fusarium spp.
20
22
1
0,70
70,0
0,000
0,0
100,0
33,01
Aspergillus spp.
19
20
1
0,947
94,7
0,000
0,0
100,00
38,0
blaTEM
55
25
0,996
0,673
67,3
0,040
4
99,96
34,53
blaCTX-M
24
35
0,896
0,708
70,8
0,029
3
99,97
32,62
blaSHV
35
39
0,863
0,257
25,7
0,000
0
100,00
33,26
blaKPC
52
51
0,984
0,827
82,7
0,039
4
99,96
36,67
mecA
83
37
0,976
0,771
77,1
0,054
5
99,95
33,91
vanA
51
40
0,990
0,745
74,5
0,000
0
100,00
33,67
vanB
19
54
0,961
0,579
57,9
0,037
4
99,96
32,29
blaSPM
19
58
0,981
0,737
73,7
0,017
0
98,30
30,99
blaVIM
18
58
0,938
0,722
72,2
0,017
0
98,30
31,82
blaIMP
34
58
0,954
0,676
67,6
0
0
100,00
N°.- numero; GP – Gram positivo; GN –Gram negativo; SCoN – Staphylococcus coagulase negativo; Ct – ciclo do threshold;
28,49
75
RESULTADOS
Figura 4 - Curva ROC para genes de resistência a antimicrobianos A- blaTEM; B vanA; C - vanB; D - blaCTX; E- blaSHV; F - mecA; G - blaKPC; H- blaIMP; I- blaVIM; JblaSPM.
76
RESULTADOS
Figura 5 - Curva ROC para genes estudados espécie especifico, fungo 18S
rRNA e 16S rDNA Gram positivo e Gram negativo.
77
RESULTADOS
5.4.3. Aplicação da PCR em Tempo Real nas Amostras de
Hemocultura de Pacientes Submetidos à TCTH.
5.4.3.1.
Detecção do gene HFE de Controle Interno da Extração de
DNA gene.
Todas as amostras de hemoculturas, sendo elas negativas ou positivas
pelo aparelho BACTEC®, foram submetidas à extração de DNA e a reação de
PCR em Tempo Real para o gene HFE. O Tm dos controles positivos variou de
81,076 a 81,245. As amostras foram consideradas positivas quando a Tm
encontrava se neste intervalo. Somente quando o resultado de PCR foi positivo
para esta reação, é que as mesmas foram encaminhadas para realizar a PCR
em Tempo Real para os demais genes em estudo. Todas as amostras incluídas
foram positivas para o gene HFE indicando que houve extração e evitando a
possibilidade de falso negativo para os demais genes. Após isso, todas essas
amostras foram submetidas à detecção dos genes 16S rDNA, 18S rDNA, genes
de resistência aos antimicrobianos e genes espécie-específicos por PCR em
Tempo Real.
5.4.3.2.
Detecção do Gene Bacteriano 16S rDNA
A PCR em Tempo Real para o gene 16S rDNA com as sondas Gram
positiva e Gram negativa foram realizadas nas 193 e detectou 26 amostras
positivas, destas, duas amostras foram amplificadas pelas duas sondas. Foram
detectadas 19 amostras como Gram positivas e 12 amostras como Gram
negativas. Dentre as 26 amostras PCR positivas, nove amostras foram negativas
pelo sistema BACTEC®. Os resultados dos frascos de hemocultura BACTEC®
78
RESULTADOS
podem ser avaliados na Tabela 10 e os resultados dos tubos de EDTA k2 gel na
Tabela 12.
Das 23 amostras identificadas pelo sistema automatizado Phoenix® como
espécies de bactérias Gram positivas, 12 amostras foram positivas para a sonda
Gram positiva e 11 não foram amplificadas por PCR para o gene 16S rDNA
(Tabela 10). Das 10 amostras identificadas pelo sistema automatizado Phoenix®
como espécies de bactérias Gram negativas, cinco amostras foram detectadas
por PCR em Tempo Real para o gene 16S rDNA (Tabela 10). A média de Ct
apresentada pelas amostras positivas para sonda Gram positiva foi 28,46 e para
Gram negativa foi 25,75 e estão apresentados na Tabela 16 em anexo II. Nas 33
amostras de tubos de EDTA K2 gel foi detectada apenas uma amostras
contendo o gene 16S rDNA com valor de Ct de 33,6 para sonda Gram positiva
(Tabela 16).
5.4.3.3.
Detecção do Gene 18S rDNA para Fungos
A detecção do gene 18S rDNA por PCR em Tempo Real com o fluoróforo
SYBR Green foi realizada na 193 amostras em estudo. Vinte e duas amostras
obtiveram valores de Ct positivos pelo PCR em Tempo Real para o gene 18S
rDNA.
Após considerar o Ct do LoD de 34,4 apenas 11 amostras foram
consideradas PCR detectadas. Os resultados dos frascos de hemocultura
BACTEC® estão na Tabela 10 e os dos tubos de EDTA K2 gel na Tabela 12.
79
RESULTADOS
5.4.3.4.
Detecção dos Genes Espécie-específicos
A reação de PCR em Tempo Real com iniciadores espécie-especificos foi
realizada em todas as amostras que apresentaram valores de Ct positivos, nas
amostras que obtiveram identificação pelo sistema automatizado Phoenix® e nas
amostras que apresentaram resultados negativos, na qual uma das amostra
coletadas na mesma data mostrou resultado positivo tanto para fenotípico
quanto para molecular.
A PCR em Tempo Real com genes espécie-especificos para detecção de
bactérias foi capaz de detectar 24 amostras das 33 amostras positivas pelo
sistema automatizado BACTEC®. Para as Gram positivas, seis amostras
identificadas pelo sistema automatizado Phoenix® como Enterococcus spp. (dois
E. faecalis e quatro E. faecium) somente três amostras foram detectadas como
Enterococcus spp. pela sonda espécie-especifica por PCR em Tempo Real. Das
15 amostras identificadas como SCoN pelo sistema automatizado Phoenix®,
apenas duas amostras não foram detectadas pela sonda espécie-especifica de
SCoN. Das duas amostras de S. pneumoniae identificadas fenotipicamente,
apenas uma foi detectada pela sonda espécie-especifica de S. pneumoniae por
PCR em Tempo Real (Tabela 10).
Dentre
as
espécies
Gram
negativas
identificadas
pelo
sistema
automatizado, BGNNF e A. baumannii foram detectadas por PCR Tempo Real
pela sonda espécie-especifica de A. baumannii, porém a amostra de
Acinetobacter spp. não foi detectada por esta sonda, pois não foi desenhada
sonda para Acinetobacter spp.. A amostra de E. coli foi detectada pela sonda
espécie-especifica. As amostras de Citrobacter freundii e P. putida não puderam
ser detectadas, já que não foram desenhadas sondas espécie-especificas para
estas duas espécies. As três amostras de Enterobacter cloacae foram
80
RESULTADOS
detectadas pelos iniciadores espécie-específicos utilizando o sistema SYBR
Green (Tabela 10).
Nas 33 amostras de tubos de EDTA K2 gel dos pacientes com episódios
de infecção de corrente sanguínea foi realizada a PCR em Tempo Real para
genes espécie-específicos e 10 amostras apresentaram valores de Ct, porém
após considerar o Ct do LoD apenas sete amostras foram PCR positivas. Dentre
estas sete amostras, cinco amostras tiveram PCR positiva para SCoN, duas para
Enterococcus spp. As espécies
consideradas negativas
foram para A.
baumannii, SCoN e E. cloacae estes dados podem ser encontrados na Tabela
12. Estas 33 amostras não foram encaminhadas para cultura e apenas para
duas amostras de tubos de EDTA K2 gel não foram coletados frascos de
hemocultura BACTEC®.
A PCR em Tempo Real com iniciadores espécie-específicos para a
identificação de fungos foi detectada para quatro amostras de Candida spp. e
cinco amostras de Aspergillus spp.. As amostras positivas para Aspergillus spp.
foram provenientes de dois frascos de hemocultura (Tabela 10) e três tubos de
EDTA (Tabela 12). Uma amostra de Aspergillus spp. proveniente de frasco de
hemocultura BACTEC® após considerar o Ct do LoD apresentou resultado não
detectado. O PCR em Tempo Real com sonda espécie-específica para Candida
spp. foi positivo para três amostras de frascos de hemocultura BACTEC® (Tabela
10) e em uma amostra de tubo de EDTA K2 gel (Tabela 12). Dentre as amostras
identificadas como Candida spp. duas amostras apresentaram PCR em Tempo
Real positivo para a sonda espécie-específica de Candida albicans.
81
RESULTADOS
Tabela 10: Dados clínicos dos pacientes, resultado fenotípico e da PCR em Tempo Real para identificação dos
microrganismos dos 160 frascos de hemocultura BACTEC®.
DADOS DO PACIENTE
Nº Paciente
e Sigla do
Hospital
01 HSP
Sexo/
Idade
F
54
Doença
de
base
Transplante
Episódio de
bacteremia
ou data da
amostra
MM
Pós Tx em QT
25/01/09
29/11/08
26/01/09
09/10/09
01/03/09
02 HSP
M
49
LNH
recidiva
Pós Tx em QT
06/03/09
11/10/09
20/12/09
01/01/10
09/01/10
07/05/09
09/05/09
03 HSP
F
64
SMD
Tx
11/05/09
04 HSP
M
23
LMA
Pré Tx em
indução
12/05/09
15/05/09
06/03/09
14/05/09
23/05/09
Nº
Resultado
amostra do GRAM
®
BACTEC
da HMC
407
409
25
23
445
446
450
45
49
41
548
553
560
568
570
591
559
428
329
333
44
354
351
350
336
347
54
355
345
344
CGP
CGP
CGP
BGN
CGP
-
DADOS DA AMOSTRA
PCR em
PCR em
Microrganismo
Tempo
Tempo
isolado na
Real
Real 18S
hemocultura
GP/GN
(fungo)
ND
ND
ND
ND
GP
GP
GP
GP/GN
ND
ND
ND
ND
GP/GN
GP
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Detectado
Detectado
Detectado
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Detectado
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Detectado
ND
ND
SCoN
SCoN
NHCBA
NHCBA
S. epidermidis
S. epidermidis
S. epidermidis
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
C. freundii
S. epidermidis
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
PCR em Tempo
Real espécie
específico
SCoN
SCoN
SCoN/ND
SCoN/ND
SCoN/ND
SCoN
ND
SCoN
SCoN
ND
Aspergillus spp
Aspergillus spp.*
-
82
RESULTADOS
Nº Paciente
e Sigla do
Hospital
DADOS DO PACIENTE
Sexo/ Doença Transplante
Idade
de
base
05 HSP
M
28
Tumor de
testículo
Tx
06 HSP
F
34
LMA
Pré Tx em
indução
34
LNH
recidiva
Episódio de
bacteremia
ou02/11/08
data da
amostra
04/12/08
05/03/09
02/12/08
07 HSP
M
Tx
14/12/08
30/12/08
08 HSP
M
54
LMA
Tx
09/10/08
04/04/08
06/05/08
08/05/08
09 HSP
M
37
LH
Tx
10/05/08
13/05/08
15/05/08
25/05/08
29/05/08
23/02/09
10 HSP
M
19
LNH
Anaplásic
o
01/03/09
Pré Tx em QT
07/03/09
04/05/09
02/01/00
11 HSP
F
33
LNH
esclerose
nodular
Pós Tx
23/08/09
31/08/09
Nº
Resultado
343
amostra
do GRAM
11 ®
BACTEC
da HMC
29
24
37
56
53
50
19
4
38
13
15
1
60
426
335
326
338
3
402
403
348
391
387
349
353
346
341
47
55
43
59
52
370
542
440
533
499
BGN
BGN
BGN
CGP
CGP
CGP
BGN
CGP
CGP
-
DADOS DA AMOSTRA
PCR em
PCR em
Microrganismo
ND
ND
NHCBAna
Tempo
Tempo
isolado
ND
ND18S
NHCBA
Real
Real
hemocultura
ND
ND
E. cloacae
GP/GN
(fungo)
ND
GN
GP
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
GP
GP
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Detectado
ND
ND
E. cloacae
E. cloacae
SCoN
SCoN
SCoN
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
P. putida
S. epidermidis
S. epidermidis
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
PCR em Tempo
Real espécie
específico
E. cloacae
E. cloacae
E. cloacae
SCoN
SCoN
SCoN
ND
SCoN
SCoN
ND
ND
-
83
RESULTADOS
Nº Paciente
e Sigla do
Hospital
DADOS DO PACIENTE
Idade
de
base
Episódio de
bacteremia
ou25/09/09
data da
amostra
28/09/09
12 HSP
M
44
MM
recidiva
precoce
Pós Tx em QT
02/08/09
05/12/09
06/05/09
13 HSP
M
49
MM
Tx
06/06/09
09/06/09
18/01/09
14 HSP
M
53
MM
Tx
31/01/09
30/01/09
04/02/09
15 HSP
M
16 HSP
F
38
58
MM
LMA/SM
D
Tx
Tx
08/02/09
02/03/09
04/02/09
08/03/09
14/03/09
23/10/08
17 HSP
F
47
LLC
Tx
14/11/08
20/11/08
22/11/08
17/06/09
18 HSP
F
62
LLA
Pré Tx
19 HSP
F
52
MM
Pré Tx
02/03/09
20/06/09
Nº
Resultado
498
amostra
do GRAM
503 ®
BACTEC
da HMC
502
500
510
483
474
17
397
404
340
337
327
324
328
334
429
12
21
42
30
40
27
32
46
8
39
6
14
10
7
35
20
22
48
469
62
51
508
CGP
CGP
CGP
CGP
CGP
BGN
BGN
BGN
-
DADOS DA AMOSTRA
PCR em
PCR em
Microrganismo
ND
ND
NHCBAna
Tempo
Tempo
isolado
ND
ND18S
NHCBA
Real
Real
hemocultura
ND
ND
NHCBA
GP/GN
(fungo)
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
GP
ND
GN
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
GP
GN
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Positivo
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Positivo
Positivo
ND
ND
Positivo
ND
ND
ND
ND
ND
NHCBA
NHCBA
S. pneumoniae
S. pneumoniae
NHCBA
NHCBA
NHCBA
E. faecium
E. faecium
E. faecium
NHCBA
BGNNF
Acinetobacter spp.
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
K. pneumoniae
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
PCR em Tempo
Real espécie
específico
S. pneumoniae
ND
ND
ND
Enterococcus spp.
ND
ND
ND
A. baumannii
ND
A. baumannii
ND
ND
ND
ND
ND
ND
-
84
RESULTADOS
Nº Paciente
e Sigla do
Hospital
20 HSP
DADOS DO PACIENTE
Idade
de
LMA/SM
base
F 50
Pós Tx
D
21 HSP
M
22 HSP
F
56
69
LNH
Linfoblást
ico
Tx
LMA
Pré Tx em
indução
Episódio de
bacteremia
ou28/09/09
data da
amostra
06/02/09
501
2
18
31
9
58
61
415
430
420
410
400
419
424
412
398
413
396
339
332
331
36
28
57
33
34
16
26
418
421
423
422
427
401
425
CGP
CGP
-
30/12/08
5
-
09/12/08
12/12/08
14/02/09
23/04/09
01/05/09
23 HSP
F
23
LH
Tx
02/05/09
04/05/09
11/05/09
09/12/08
18/12/08
24 HSP
M
23
LNH
Tx
21/12/08
21/02/09
25 HSP
26 HSP
M
21
F 28
Adenodis
trofia
LLA
(reicidiva)
Tx
Tx
Nº
Resultado
511
amostra
do GRAM
515 ®
BACTEC
daCGP
HMC
05/02/09
DADOS DA AMOSTRA
PCR em
PCR em
Microrganismo
ND
ND
NHCBAna
Tempo
Tempo
isolado
ND
ND18S
E. faecalis
Real
Real
hemocultura
ND
Positivo
E. faecalis
GP/GN
(fungo)
PCR em Tempo
Real espécie
ND
específico
Enterococcus spp.
ND
ND
Enterococcus spp.
Enterococcus spp.
ND
ND
ND
ND
Candida albicans
ND
ND
Candida albicans
-
ND
ND
ND
GP
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
GN
ND
ND
ND
GN
ND
GP
GP
ND
GP
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Positivo
ND
ND
ND
Detectado
Positivo
Positivo
Positivo
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Positivo
ND
ND
ND
ND
ND
NHCBA
NHCBA
NHCBA
E. faecium
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
K. pneumoniae
ND
ND
ND
K. pneumoniae
ND
SCoN/ Candida spp.
SCoN/ND
ND
ND
ND
-
ND
ND
NHCBA
-
85
RESULTADOS
Nº Paciente
e Sigla do
Hospital
27 HSP
DADOS DO PACIENTE
Idade
de
base
M
27
Episódio de
bacteremia
ou08/04/11
data da
amostra
619
622
623
621
626
624
94GR
88GR
89GR
CGP
-
04/11/10
7GR
26/03/11
61GR
31/03/11
66GR
LLA
Tx
F 28
SMD
Pré TX
29 IOP
M 04
LMA
Tx
30 IOP
F 25
Tx
31 IOP
M 13
Pós Tx
32 IOP
F 01
Tx
33 IOP
M
SE
Aplasia
Medular
LLA
Ca de
pineal
28/03/11
12/04/11
19/05/11
11/04/11
Pré Tx
20/03/11
29/03/11
28 HSP
Nº
Resultado
625
CGP
amostra
do GRAM
620 ®
BACTEC
daCGP
HMC
DADOS DA AMOSTRA
PCR em
PCR em
Microrganismo
GP
ND
S.
epidermidis
Tempo
Tempo
isolado
na
GP
ND18S
S. epidermidis
Real
Real
hemocultura
GP
ND
S. epidermidis
GP/GN
(fungo)
PCR em Tempo
RealSCoN
espécie
SCoN
específico
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
SCoN
SCoN/ND
-
BGN
ND
ND
A. baumannii
A. baumannii
BGN
GN
ND
E. coli
E. coli
CGP
GP
ND
S. epidermidis
SCoN
HSP: Hospital São Paulo; IOP: Instituto de Oncologia Pediátrica; MM: Mieloma Múltiplo; SMD: Síndrome mielodisplásica; LMA: Leucemia Mielocítica Aguda; LMC: Leucemia
Mielocítica Crônica; LLA: Leucemia Linfocítica Aguda; LLC: Leucemia Linfocítica Crônica; SE: Sarcoma de Ewing; LH: Linfona Hodgkin; LNH: Lonfona Não Hodgkin; TX:
Transplante; Ca: câncer ; CGP: Coco Gram Positivo; BGN: Bacilo Gram Negativo; GP: Gram Positivo; GN: Gram Negativo; SCoN: Staphylococcus Coagulase Negativa; ND:
Não Detectado; NHCBA: Não Houve Crescimento de Bactéria Aeróbia; *: amostra considerada não detectada após considerar o Ct do LoD; GR: GRAACC; F: feminimo; M:
masculino.
86
RESULTADOS
5.4.3.5.
Detecção
de
Genes
que
Conferem
Resistência
aos
Antimicrobianos
A PCR em Tempo Real pelo sistema SYBR Green para os genes de
resistência primeiramente foi realizada nas amostras provenientes de frascos de
hemocultura BACTEC® enumeradas de 1 a 60. Nas amostras de 61 a 160
oriundas de frascos BACTEC® e nas 33 amostras de tubos de EDTA K2 gel a
PCR em Tempo Real foi testada nas amostras que obtiveram identificação pelo
sistema automatizado Phoenix® e nas amostras que apresentaram resultados
negativos, na qual uma das amostra coletadas na mesma data mostrou
resultado positivo tanto para fenotípico quanto para molecular. Os genes de
resistência aos antimicorbianos testados foram: blaSHV, blaCTX-M, blaTEM, blaKPC,
blaIMP, blaSPM e blaVIM e mecA, vanA e vanB
O gene mecA foi positivo em 13 amostras identificadas como SCoN, tanto
pelo método fenotípico quanto pelo molecular. Após considerar o Ct do LoD,
quatro amostras com o gene mecA apresentaram resultados de PCR em Tempo
Real não detectado (Tabela 11 e 13). O gene vanB não foi detectado em
amostra de Enterococcus spp. e o gene vanA foi detectado em quatro amostras
de E. faecium (Tabela 11).
A PCR em Tempo Real para detectar os genes produtores das enzimas
ESβL foi positivo em seis amostras que foram identificadas pelos métodos
fenotípicos e moleculares. Três amostras foram positivas para o gene blaSHV,
porém quando foi considerado o Ct do LoD apenas uma amostra apresentou
resultado detectado por PCR em Tempo Real. Outras três amostras mostraram
resultados positivos para o gene blaCTX-M, e todas foram consideradas não
detectadas por PCR em Tempo Real quando foi aplicado o valor do Ct do LoD
(Tabela 11 e 13). Os genes de resistência blaKPC e metalo-ß-lactamases não
87
RESULTADOS
foram detectados nas amostra avaliadas.
Os respectivos Tm e Ct estão na
Tabela 16.
88
RESULTADOS
Tabela 11: Resultado do teste de sensibilidade pelo método automatizado e da PCR em Tempo Real para genes e resistência aos
antimicrobianos dos frascos de BACTEC®.
Nº
Paciente
e Sigla do
Hospital
Sexo/
Idade
Doença de base
Transplante
01 HSP
F
54
MM
Pós Tx em QT
Episódio
de
Nº
bacteremia amostra
ou data da BACTEC®
amostra
25/01/09
29/11/08
26/01/09
09/10/09
01/03/09
02 HSP
M
49
LHN recidiva
Pré Tx em QT
06/03/09
11/10/09
20/12/09
01/01/10
09/01/10
07/05/09
09/05/09
03 HSP
04 HSP
F
64
M
23
SMD
Tx
11/05/09
LMA
Pré Tx em
indução
12/05/09
15/05/09
06/03/09
14/05/09
23/05/09
407
409
25
23
445
446
450
45
49
41
548
553
560
568
570
591
559
428
329
333
44
354
351
350
336
347
54
355
345
344
Microrganismo
isolado na
hemocultura
SCoN
SCoN
NHCBA
NHCBA
S. epidermidis
S. epidermidis
S. epidermidis
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
C. freundii
S. epidermidis
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
Teste de Sensibilidade (Phoenix®)
R a Oxacilina
R a Oxacilina
S a Oxacilina
S a Oxacilina
S a Oxacilina
S Cefalosporinas e S Carbapenens
R a Oxacilina
PCR em
Tempo Real
para genes de
resistência
ND
ND
mecA*
mecA*
mecA*
blaSHV*
ND
mecA
-
89
RESULTADOS
Nº
Paciente
e Sigla do
Hospital
05 HSP
Sexo/
Idade
M
28
06 HSP
F
34
07 HSP
M
34
Doença de base
Transplante
Tumor de testículo
Tx
LMA
Pré Tx em
indução
Episódio
Nº
de
amostra
343
02/11/08
11
bacteremia
BACTEC®
29
ou data da
04/12/08
24
amostra
05/03/09
02/12/08
LNH recidiva
Tx
14/12/08
30/12/08
08 HSP
M
54
LMA
Tx
09/10/08
04/04/08
06/05/08
08/05/08
09 HSP
M
37
LH
Tx
10/05/08
13/05/08
15/05/08
25/05/08
29/05/08
23/02/09
10 HSP
M
19
01/03/09
LNH Anaplásico
Pré Tx em QT
07/03/09
04/05/09
02/01/00
11 HSP
F
33
LNH esclerose
nodular
23/08/09
Pós Tx
31/08/09
37
56
53
50
19
4
38
13
15
1
60
426
335
326
338
3
402
403
348
391
387
349
353
346
341
47
55
43
59
52
370
542
440
533
499
498
Microrganismo
isolado
NHCBAna
NHCBA
hemocultura
E. cloacae
E. cloacae
E. cloacae
SCoN
SCoN
SCoN
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
P. putida
S. epidermidis
S. epidermidis
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
R a cefalosporinas - sugestivo de ESBL
R a Oxacilina
R a Oxacilina
R a Oxacilina
Não realizado - Não há padronização
R a Oxacilina
R a Oxacilina
PCR em
Tempo
- Real
para genes
de
ND
resistência
ND
blaSHV
mecA
mecA
ND
ND
mecA
mecA
-
90
RESULTADOS
Nº
Paciente
e Sigla do
Hospital
12 HSP
Sexo/
Idade
M
44
Doença de base
MM recidiva
precoce
Transplante
Pós Tx em QT
Episódio
Nº
25/09/09
de
amostra
503
502
bacteremia BACTEC®
28/09/09
500
ou
data da
510
amostra
02/08/09
05/12/09
06/05/09
13 HSP
M
49
MM
Tx
06/06/09
09/06/09
14 HSP
M
53
18/01/09
MM
Tx
31/01/09
30/01/09
04/02/09
15 HSP
16 HSP
M
38
F
58
MM
LMA/ SMD
Tx
Tx
08/02/09
02/03/09
04/02/09
08/03/09
14/03/09
23/10/08
17 HSP
18 HSP
19 HSP
20 HSP
F
47
F
62
F
52
F
LLC
Tx
14/11/08
20/11/08
22/11/08
17/06/09
LLA
Pré Tx
MM
Pré Tx
20/06/09
LMA/SMD
Pós Tx
28/09/09
02/03/09
483
474
17
397
404
340
337
327
324
328
334
429
12
21
42
30
40
27
32
46
8
39
6
14
10
7
35
20
22
48
469
62
51
508
511
515
Microrganismo
isolado
NHCBAna
NHCBA
hemocultura
NHCBA
NHCBA
S. pneumoniae
S. pneumoniae
NHCBA
NHCBA
NHCBA
E. faecium
E. faecium
E. faecium
NHCBA
NHCBA
NHCBA
BGNNF
Acinetobacter spp.
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
K. pneumoniae
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
E. faecalis
R a Glicopepitídeos
R a Caefalosporinas e R Carbapenens
R a Caefalosporinas e R Carbapenens
R a Cefalosporinas/ S a Carbapenens
S a Glicopeptídeos
PCR em
Tempo
- Real
para genes
de
resistência
ND
ND
vanA
vanA
vanA
ND
ND
blaCTX*
ND
91
RESULTADOS
Nº
Paciente
e Sigla do
Hospital
Sexo/
Idade
50
M
56
21 HSP
Doença de base
LNH Linfoblástico
Transplante
Tx
Episódio
Nº
de
amostra
501
2
bacteremia BACTEC®
09/12/08
18
ou
data da
31
amostra
12/12/08
F
69
22 HSP
LMA
Pré Tx em
indução
14/02/09
23/04/09
01/05/09
F
23
23 HSP
LH
Tx
02/05/09
04/05/09
11/05/09
09/12/08
18/12/08
M
23
24 HSP
LNH
Tx
21/12/08
21/02/09
M
21
25 HSP
26 HSP
27 HSP
F
28
M
27
Adenodistrofia
Tx
LLA (reicidiva)
Tx
LLA
Tx
05/02/09
06/02/09
30/12/08
08/04/11
20/03/11
9
58
61
415
430
420
410
400
419
424
412
398
413
396
339
332
331
36
28
57
33
34
16
26
423
418
421
422
427
401
425
5
625
620
619
622
Microrganismo
isolado
E. faecalis
na
NHCBA
hemocultura
NHCBA
NHCBA
E. faecium
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
S. epidermidis
S. epidermidis
S. epidermidis
NHCBA
S a Glicopeptídeos
R a Oxacilina
R a Oxacilina
R a Oxacilina
PCR em
Tempo
ND Real
para genes
de
resistência
ND
vanA
blaCTX*
blaCTX*
mecA
mecA
mecA
-
92
RESULTADOS
Nº
Paciente
e Sigla do
Hospital
28 HSP
Sexo/
Idade
F
Doença de base
Transplante
28
SMD
M
29 IOP
LMA
04
30 IOP
F 25
SE
31 IOP
M 13
Aplasia Medular
32 IOP
F 01
LLA
33 IOP
M
Ca de pineal
M – masculino; F – feminino; R: Resitência; S:
Pré TX
Episódio
Nº
de
amostra
623
621
bacteremia BACTEC®
29/03/11
626
ou data da
28/03/11
624
amostra
12/04/11
94GR
19/05/11
88GR
Tx
11/04/11
89GR
Pós Tx
04/11/10
7GR
Tx
26/03/11
61GR
Pré Tx
31/03/11
66GR
Sensibilidade; ND: Não Detectado;
Tx
Microrganismo
isolado
NHCBAna
NHCBA
hemocultura
PCR em
Tempo
- Real
para genes
de
resistência
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
NHCBA
A. baumannii
S a Carbapenens
ND
E. coli
R a Cefalosporinas e S Carbapenens
ND
S. epidermidis
R a Oxacilina
mecA
Tx – Transplante; QT – quimioterapia; NHCBA – Não houve cresciemento bacteriano; IOP –
Instituto de Oncologia Pediátrica; GR – GRAACC; * amostras consideradas não detectadas após considerar o Ct do LoD.
93
RESULTADOS
Tabela 12: Resultados da identificação fenotípica pelo sistema automatizado
Phoenix® e da PCR em Tempo Real dos frascos de hemocultura BACTEC® e dos
tubos de EDTA K2 gel coletados pareados.
Nº
Paciente
e Sigla do
Hospital
Episódio
bacteremia ou
data da
amostra
Nº
amostra
®
BACTEC
Nº
amostra
EDTA
Microrganismo
isolado na
hemocultura
PCR em
Tempo Real
GP/GN
®
BACTEC
PCR em
Tempo Real
GP/GN
EDTA
PCR em Tempo
Real específico
®
BACTEC
PCR em Tempo
Real específico
EDTA
02 HSP
26/01/2009
23
16
NHCBA
ND
ND
-
Aspergillus spp.
09/05/2009
329
3
NHCBA
ND
ND
-
-
11/05/2009
351
6
NHCBA
ND
ND
-
-
04/12/2012
24
14
ND
ND
E. cloacae
E. cloacae*
02/12/2008
19
20
NHCBA
ND
ND
-
-
14/12/2008
4
13
NHCBA
ND
ND
-
-
30/12/2008
13
15
NHCBA
ND
ND
-
-
08 HSP
09/10/2008
1
17
NHCBA
ND
ND
-
-
09 HSP
29/05/2008
341
1
NHCBA
ND
ND
-
-
12 HSP
05/12/2009
17
24
NHCBA
ND
ND
-
-
13 HSP
09/06/2009
324
19
NHCBA
ND
ND
-
Enterococcus
spp.
14 HSP
30/01/2009
12
11
Acinetobacter sp
ND
ND
ND
A. baumannii*
04/02/2009
30
18
NHCBA
ND
ND
-
-
08/02/2009
32
8
NHCBA
ND
ND
-
-
02/03/2009
8
21
K. pneumoniae
GN
ND
ND
Aspergillus spp.
4
NHCBA
ND
ND
-
-
08/03/2009
6
9
NHCBA
ND
ND
-
-
03 HSP
05 HSP
07 HSP
15 HSP
16 HSP
17 HSP
14/03/2009
14
2
NHCBA
ND
ND
-
23/10/2008
10
23
NHCBA
ND
ND
-
-
-
Enterococcus
spp.
21 HSP
09/12/2008
2
22
NHCBA
ND
ND
24 HSP
21/12/2008
16
12
NHCBA
ND
ND
-
SCoN*/Candida
spp.
26 HSP
27 HSP
21/12/2008
421
5
NHCBA
GP
GP
SCoN/Candida
spp.
30/12/2008
5
10
NHCBA
ND
ND
-
-
619
43
S. epidemidis
GP
ND
SCoN
SCoN
620
44
S. epidemidis
GP
ND
SCoN
SCoN
GP
ND
08/04/2011
45
625
S. epidemidis
73
SCoN
SCoN
GP
ND
ND
28 HSP
28/03/2011
624
72
NHCBA
ND
ND
SCoN
SCoN/Aspergillus
spp.
29 IOP
12/04/2011
94GR
49GR
NHCBA
ND
ND
-
-
30 IOP
11/04/2011
89GR
68GR
NHCBA
ND
ND
-
-
HSP- Hospital São Paulo; IOP – Instituto de Oncologia Pediátrica; GP – Gram positivo; GN – Gram negativo; NHCBA - Não houve crescimento
bacteriano; SCoN – Staphylococcus coagulase negativo; ND – Não Detectado; GR – GRAACC. * amostras consideradas não detectadas após
considerar o Ct do LoD.
94
RESULTADOS
Tabela 13: Resultados da detecção fenotípica pelo sistema automatizado
Phoenix® e da PCR em Tempo Real para detecção de resistência aos
antimicrobianos dos frascos de hemocultura BACTEC® e tubos de EDTA K2 gel
coletados pareados.
Nº
Paciente
e Sigla do
Hospital
Episódio
bacteremia
ou data da
amostra
Nº
amostra
BACTEC®
Nº
amostra
EDTA
Microrganismo
isolado na
hemocultura
Teste de Sensibilidade
da hemocultura
(Phoenix®)
PCR em
Tempo Real
para genes de
resistência
BACTEC®
PCR em
Tempo Real
para genes de
resistência
EDTA
02 HSP
26/01/2009
23
16
NHCBA
NR
ND
ND
09/05/2009
329
3
NHCBA
NR
ND
ND
11/05/2009
351
6
NHCBA
NR
ND
ND
04/12/2008
24
14
R a cefalosporinas
ND
ND
02/12/2008
19
20
NHCBA
NR
ND
ND
14/12/2008
4
13
NHCBA
NR
ND
ND
30/12/2008
13
15
NHCBA
NR
ND
ND
08 HSP
09/10/2008
1
17
NHCBA
NR
ND
ND
09 HSP
29/05/2008
341
1
NHCBA
NR
ND
ND
12 HSP
05/12/2009
17
24
NHCBA
NR
ND
ND
13 HSP
09/06/2009
324
19
NHCBA
NR
ND
ND
ND
ND
03 HSP
05 HSP
07 HSP
14 HSP
15 HSP
30/01/2009
12
11
Acinetobacter spp.
R a cefalosporinas e
Carbapenêmicos
04/02/2009
30
18
NHCBA
NR
ND
ND
08/02/2009
32
8
NHCBA
NR
ND
ND
21
K. pneumoniae
R a cefalosporinas/ S a
Carbapenêmicos
ND
blaSHV*
4
NHCBA
NR
ND
ND
9
NHCBA
NR
ND
ND
02/03/2009
8
08/03/2009
6
16 HSP
14/03/2009
14
2
NHCBA
NR
blaCTX
ND
17 HSP
23/10/2008
10
23
NHCBA
NR
ND
ND
21 HSP
09/12/2008
2
22
NHCBA
NR
ND
ND
24 HSP
21/12/2008
16
12
NHCBA
NR
ND
ND
21/12/2008
421
5
NHCBA
NR
ND
ND
30/12/2008
5
10
NHCBA
NR
ND
ND
619
43
S. epidemidis
R a Oxacillina
mecA
ND
620
44
S. epidemidis
R a Oxacillina
mecA
ND
45
S. epidemidis
R a Oxacillina
mecA
mecA*
26 HSP
27 HSP
08/04/2011
625
73
S. epidemidis
R a Oxacillina
mecA
ND
28 HSP
28/03/2011
624
72
NHCBA
NR
ND
ND
29 IOP
12/04/2011
94GR
9GR
NHCBA
NR
ND
ND
30 IOP
11/04/2011
89GR
8GR
NHCBA
NR
ND
ND
HSP: Hospital São Paulo; IOP :Instituto de Oncologia Pediátrica; GP – Gram positivo; GN – Gram negativo; NHCBA - Não houve crescimento
bacteriano; SCoN – Staphylococcus coagulase negativo; ND – Não Detectado; GR – GRAACC.; R: Resitência; S: Sensibilidade; NR: Não
Realizado; * amostras consideradas não detectadas após considerar o Ct do LoD.
95
RESULTADOS
5.5.
Concordância do PCR em Tempo Real com os Testes
Fenotípicos
A concordância entre os testes fenotípicos e PCR em Tempo Real foi
avaliada em todas as amostras que apresentaram valores positivos de Ct,
incluindo também as amostras que apresentaram resultado de PCR não
detectado após considerar o Ct do LoD
5.5.1. Concordância entre a Identificação Fenotípica versus PCR em
Tempo Real das Amostras de Frascos de Hemocultura
BACTEC®
Os cálculos de concordância entre os métodos avaliados foram
realizados com 160 amostras de frascos de hemocultura BACTEC® (Tabela 10).
A análise de concordância mostrou coeficiente Kappa 0,482 entre o Gram da
hemocultura e a PCR em Tempo Real com sondas Gram negativa (GN) e Gram
positiva (GP). A concordância foi considerada moderada segundo os critérios
sugeridos por Landis e Koch apud Everitt (1992, p.149). A concordância foi boa,
com um Kappa 0,790, entre a identificação automatizada do microrganismo e
PCR Tempo Real Espécie-Especifico.
5.5.2. Concordância entre a Identificação Fenotípica versus PCR em
Tempo Real das Amostras de tubos de EDTA K2 GEL
Os cálculos de concordância entre os métodos avaliados foram realizados
com 23 amostras (Tabela 12). A análise de concordância mostrou coeficiente
Kappa 0,349 entre a identificação automatizada do microrganismo e a PCR em
Tempo Real das amostras dos tubos de EDTA K2 gel. A concordância foi
96
RESULTADOS
considerada moderada segundo os critérios sugeridos por Landis e Koch apud
Everitt (1992, p.149).
5.5.3. Concordância entre os Frascos de Hemocultura BACTEC®
versus Tubos de EDTA K2 GEL por PCR em Tempo Real
Os cálculos de concordância entre os métodos avaliados foram realizados
com 23 amostras. A análise de concordância mostrou coeficiente Kappa 0,796. A
concordância foi considerada boa segundo os critérios sugeridos por Landis e
Koch apud Everitt (1992, p.149).
5.5.4. Concordância entre os Testes Fenotípicos e PCR em Tempo
Real na Detecção de Resistência aos Antimicrobianos
Com relação aos resultados de susceptibilidade à oxacilina liberados pelo
sistema automatizado Phoenix® e a detecção do gene mecA pelo método da
PCR em Tempo Real, houve concordância em 9 amostras. Seis amostras foram
discordantes, três amostras de SCoN com resistência à oxacilina não
apresentaram PCR positiva para o gene mecA, enquanto três isolados
identificados como sensíveis à oxacilina foram positivos para o gene mecA por
PCR em Tempo Real. Para resistência à vancomicina a concordância foi de
100% entre o teste fenotípico e a detecção molecular do gene vanA (Tabela 11).
Das cinco amostras com resultado positivo para os genes que codificam as
ESβL, somente uma amostra apresentou resultado concordante pelo método
fenotípico (Tabela 11).
97
RESULTADOS
5.5.5. Medidas de Eficácia Diagnóstica
Em relação aos resultados entre o método automatizado e a PCR em
Tempo Real para as sondas Gram positiva e Gram negativa o VPP, VPN,
prevalência e acurácia foram de 51,51%, 92,91%, 16,25% e 84,3%,
respectivamente (Tabela 14).
Entre o método automatizado e a PCR em Tempo Real para as sondas
espécie-especificas o VPP, VPN, prevalência e acurácia foram de 72,72%,
99,21%, 15,62% e 91,8%, respectivamente. Os resultados estão apresentados
na Tabela 14.
Tabela 14: Valores de VPP, VPN, sensibilidade, especificidade, acurácia e
prevalência dos PCR em Tempo Real em relação ao sistema automatizado
Phoenix®.
PCR GP/GN e Phoenix
®
PCR Espécie-Especifico e Phoenix
Sensibilidade
0,6538
0,9600
Especificidade
0,8805
0,9333
VPP
0,5151
0,7272
VPN
0,9291
0,9921
Prevalência
0,1625
0,1562
Acurácia
0,8437
0,9187
GP- Gram positivo; GN – Gram negativo; VPP – valor preditivo positivo; VPN – valor
preditivo negativo
98
®
RESULTADOS
5.6.
Correlação
dos
Resultados
de
Liberação
pelo
Método
Fenotípico e do PCR em Tempo Real com a Adequação do Uso
de Antimicrobianos nos Pacientes Submetidos à TCTH
Trinta e três hemoculturas foram positivas pelo sistema automatizado
Phoenix®, sendo que 23 foram identificadas como bactérias Gram positivas e 10
como Gram negativas (Tabela 10). Estas amostras positivas foram coletadas de
14 pacientes. Dos 10 casos em que os pacientes receberam tratamento
inadequado antes da liberação do Gram, seis foram hemoculturas positivas para
Gram positivo e três para Gram negativo. Dois pacientes apresentaram
episódios com amostras que apresentaram detecção mista de microrganismos
pelo sistema automatizado. Na hemocultura de um paciente foi identificado S.
epidermidis e C. freundii, e no outro S. epidermidis e P. putida.
A adequação do tratamento, de acordo com o tempo de liberação dos
resultados do Gram e final da hemocultura podem ser observadas na Tabela 15.
Durante o tratamento empírico, isto é, antes da liberação do resultado do Gram,
em 66,66% (10/14) dos casos os pacientes recebiam tratamento considerado
inadequado. Após o resultado final da hemocultura 33,33% (6/14) pacientes
tiveram o tratamento corrigido. Na avaliação final, a terapia antimicrobiana foi
considerada inadequada em apenas um caso (6,66%), no qual o microrganismo
identificado foi Acinetobacter spp. resistente a carbapenêmicos e o paciente que
estava em uso de imipenem que foi trocado para ciprofloxacina.
Dos sete casos de hemoculturas identificadas como Gram positivos em
que os pacientes receberam tratamento inadequado antes da liberação do
Gram, em três dos pacientes foram identificados SCoN. Em dois pacientes foram
identificadas amostras de
SCoN resistentes
à oxacilina pelo
sistema
99
RESULTADOS
automatizado. Em três pacientes foram identificadas amostras de SCoN com
gene mecA positivo, um desses pacientes estava sem tratamento antimicrobiano
e foi introduzida vancomicina, o outro estava em uso de vancomicina. O último
paciente apresentou infecção mista e foi associada à amicacina na terapia
antimicrobiana.
As amostras 445 e 45 referentes ao paciente 2HSP obtiveram
sensibilidade à oxacilina pelo sistema automatizado, porém essas amostras
foram PCR positivas para o gene mecA. Neste caso, o paciente recebeu
vancomicina no tratamento após o resultado final da hemocultura, sendo assim,
a terapia foi considerada adequada.
Em três pacientes foram identificados Enterococcus spp., sendo dois E.
faecium e um E. faecalis. Os pacientes com infecção por E. faecium estavam em
tratamento com vancomicina e tiveram o tratamento corrigido para o uso de
linezolida. O paciente no qual foi identificada infecção por E. faecalis sensível à
vancomicina pelo sistema automatizado estava sendo tratado com cefepima e a
antibioticoterapia foi corrigida para teicoplanina. O gene vanA foi encontrado
apenas nas amostras que foram resistentes à vancomicina pelo sistema
automatizado. Em um paciente foi identificado S. pneumoniae e este paciente
estava sem uso de antimicrobiano, o que foi considerado inadequado e corrigido
com a introdução de ceftriaxona.
Dentre os três pacientes em que foram identificados Gram negativos com
inadequação antes do resultado do Gram, em dois deles foram identificados
bactérias
Gram
negativas
e
no
outro
houve
identificação
mista
de
microrganismos pelo sistema automatizado. As amostras foram identificadas
como E. cloacae e foram ESβL positiva para o sistema automatizado, e na PCR
foi encontrado o gene blaSHV. A terapia após o resultado final da hemocultura foi
100
RESULTADOS
trocada de cefepima para imipenem. No outro paciente foi identificado um
Acinetobacter
spp.
com
resistência
a
carbapenêmicos
pelo
sistema
automatizado. O paciente estava em tratamento com imipenem e posteriormente
foi trocado por ciprofloxacina, e assim a terapia foi considerada inadequada após
o resultado final da hemocultura. Não foram encontrados os genes de resistência
avaliados no estudo para a amostra de Acinetobacter spp.
Dentre as amostras de Gram negativos, duas amostras com blaSHV eram
de pacientes que estavam em uso de cefepima e após resultado do
antibiograma pelo sistema automatizado, os pacientes tiveram terapia alterada
para imipenem. Três amostras de pacientes que estavam em uso de
imipenem/meropenem antes do antibiograma tiveram a terapia mantida. Em uma
amostra na qual foi detectada com gene blaSHV o paciente não estava em uso de
antibióticoterapia no momento da coleta da hemocultura.
101
RESULTADOS
Tabela 15: Resultado do teste de sensibilidade e da PCR em Tempo Real para genes que conferem resistência aos antimicrobianos e terapia
antimicrobiana utilizada nos episódios de infecção de corrente sanguínea.
DADOS DO PACIENTE
Nº
Paciente
e Sigla do
Hospital
Episódio de
bacteremia
ou data da
amostra
09/10/09
02 HSP
DADOS DA AMOSTRA
TRATAMENTO
Microrganismo
isolado
(Phoenix®)
PCR em
Tempo Real
para genes
de
resistência
BACTEC®
PCR em
Tempo Real
para genes
de
resistência
EDTA
S. epidermidis
S a Oxacilina
mecA
ND
S. epidermidis
S a Oxacilina
ND
ND
S. epidermidis
S a Oxacilina
mecA
ND
C.freundii
S Cefalosporinas e Carbapenemicos
ND
ND
S. epidermidis
R a Oxacilina
mecA
ND
E. cloacae
R a cefalosporinas
ND
ND
E. cloacae
R a cefalosporinas
ND
ND
E. cloacae
R a cefalosporinas
SCoN
20/12/09
05 HSP
06 HSP
09 HSP
04/12/08
05/03/09
08/05/08
SHV
ND
R a Oxacilina
mecA
ND
SCoN
R a Oxacilina
mecA
ND
SCoN
R a Oxacilina
ND
ND
P. putida
Não realizado - Não há padronização
ND
ND
S. epidermidis
R a Oxacilina
mecA
ND
S. epidermidis
R a Oxacilina
mecA
ND
bla
Antibioticoterapia 48h
antes da coleta de
hemocultura
Adequação após
GRAM da
hemocultura
Adequação após
resultado final
da hemocultura
Análise final da Terapia
CIP + SUL/TRIM + CEFP + VAN
NÃO
NÃO
Adequada
CEFP + VAN
Associou AMI
NÃO
Adequada
SUL/TRIM + CEFP
Trocou CEFP por
IMI
NÃO
Adequada
CIP, IMI, VAN
NÃO
NÃO
Adequada
CIP + SUL/TRIM + CEFP + CLARIT
Introduziu VAN
Modificou CEFP por
IMI
Corrigida
102
RESULTADOS
DADOS DO PACIENTE
Nº
Episódio de
Paciente
bacteremia
e Sigla do
ou data da
Hospital
amostra
DADOS DA AMOSTRA
TRATAMENTO
PCR em
Tempo Real
para genes
de
resistência
ND
BACTEC®
PCR em
Tempo Real
para genes
de
resistência
ND
EDTA
Microrganismo
isolado
(Phoenix®)
S. pneumoniae
-
S. pneumoniae
-
ND
ND
E. faecium
vanA
ND
E. faecium
vanA
ND
E. faecium
vanA
ND
18/01/09
BGNNF
R a Caefalosporinas e Carbapenêmicos
ND
ND
31/01/09
Acinetobacter spp.
R a Caefalosporinas e Carbapenêmicos
ND
ND
15 HSP
02/03/09
K. pneumoniae
R a Caefalosporinas S a Carbapenêmicos
ND
bla SHV
E. faecalis
S a Glicopeptídeos
ND
ND
20 HSP
28/09/09
E. faecalis
S a Glicopeptídeos
ND
ND
E. faecium
vanA
ND
S. epidermidis
R a Oxacilina
mecA
ND
S. epidermidis
R a Oxacilina
mecA
ND
S. epidermidis
R a Oxacilina
mecA
mecA
A. baumannii
S a Carbapenêmicos
ND
ND
12 HSP
13 HSP
02/08/09
06/06/09
14 HSP
21 HSP
12/12/08
27 HSP
08/04/11
31 IOP
32 IOP
04/11/10
26/03/11
E. coli
S a Cefalosporinas e Cabapenêmicos
ND
ND
Antibioticoterapia 48h
antes da coleta de
hemocultura
Adequação após
GRAM da
hemocultura
Adequação após
resultado final
da hemocultura
Análise final da Terapia
Nenhuma
VAN
Modificado para
CRO
Corrigida
POLB, TEI
Trocou TEI por LIN
Associado GEN
Corrigida
IMI
Trocou IMI por CIP
NÃO
Inadequada
LEV + IMI +VAN
NÃO
Associado POLB
Adequada
CEFP + IMP
Associou LIN
Descalonado p/ TEI
Corrigida
VAN + CEFP
VAN no CVC
VAN por LIN
Corrigida
MER + VAN + ANFO
NÃO
NÃO
Adequada
Nenhuma
MER + AMI
NÃO
Adequada
MET + CEFP + VAN+ ANFO
Suspenso MET e
VAN
NÃO
Corrigida
33 IOP
31/03/11
S. epidermidis
R a Oxacilina
mecA
ND
CEFP
NÂO
NÃO
Considerado contaminação
R: Resistência; S: Sensibilidade; AMI: Amicacina; ANFO: Anfotericina; CEFP: Cefepima; CIP: Ciprofloxacina; CLARIT: Claritromicina; CRO: Ceftriaxona; GEN: Gentamicina; IMI: Imipenem; LEV: Levofloxacina; LIN: LInezolida; POLB: Polimixina B;
SUL/TRIM: Sulfa-Trimetropim; TEI: Teicoplanina; VAN: Vancomicina; CVC: Cateter venoso central; HSP – Hospital São Paulo; IOP – Instituto Oncológico Pediátrico.
103
RESULTADOS
5.7.
Detecção dos Microrganismos por Sequenciamento de DNA
As amostras 445, 446, 450, 440, 23 EDTA, 501, 413 e 3 EDTA K2 GEL
foram encaminhadas para o sequenciamento do gene 18S rDNA. Devido à
presença de mais de um fungo em uma amostra, não foi possível identificar os
fungos com o gene proposto, pois a técnica de sequenciamento não conseguiu
discriminar mais de uma espécie de fungo por amostra. As amostras 398 e 410
não puderam ser encaminhadas ao sequenciamento, pois a reação de PCR
convencional com os iniciadores 18S rDNA não mostrou produto amplificado. A
sensibilidade da PCR convencional foi inferior à sensibilidade da PCR em Tempo
Real SYBR Green. As amostras 391 e 397 também não apresentaram produtos
amplificados na reação de PCR convencional para posteriormente realizar a
reação de sequenciamento de DNA.
104
DISCUSSÃO
6. DISCUSSÃO
A infecção de corrente sanguínea é a complicação infecciosa mais
frequente em transplantado de célula tronco hematopoiética. Esta complicação é
decorrente da imunodeficiência que os acompanha após o transplante
(Poutsiaka et. al., 2007). Vários estudos ressaltam que as ICS continuam sendo
uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes transplantados,
principalmente, naqueles afetados por neoplasias hematológicas (Maschmeyer
et. al., 2008).
Atualmente, a hemocultura ainda é o diagnóstico padrão para a
identificação microbiológica de patógenos na corrente sanguínea (Mylotte &
Tayara, 2000). A detecção precoce do patógeno causador é crucial para o
tratamento antimicrobiano adequado, principalmente em casos de pacientes
transplantados favorecendo uma maior chance de sobrevida e sucesso póstransplante (Maschmeyer et. al., 2011).
A implantação de métodos moleculares resultou em um novo conjunto de
métodos rápidos para o diagnóstico de ICS. Estes métodos são mais sensíveis e
aumentam o número de casos com caracterização microbiológica laboratorial
positiva, além de permitir uma redução no tempo de liberação de resultado
(Engel et. al., 2007).
A técnica da PCR estabeleceu uma nova era na identificação de
microrganismos diretos de amostras clínicas. Diversos protocolos de PCR
baseados na amplificação do gene 16S rDNA tem sido utilizados para detecção
de DNA bacteriano diretamente de amostras clínicas coletadas de diferentes
sítios infecciosos (Klausegger et. al., 1999; Shang et. al., 2001; Klaschik et. al.,
2002b; Wellinghausen et. al., 2004; Shigemura et. al., 2005; Yang et. al., 2008;
105
DISCUSSÃO
Wu et. al., 2008; Ohlin et. al., 2008). Além disso, a técnica de PCR também tem
sido bastante utilizada na detecção de genes de resistência, incluindo amostras
de corrente sanguínea. Desta forma, a detecção precoce tanto do microrganismo
quanto do gene de resistência pode contribuir para a adequação do tratamento
antimicrobiano, proporcionando assim, uma diminuição na morbi/mortalidade
(Ferraresso & Berardineli, 2005).
Os objetivos deste estudo foram: o desenvolvimento de protocolos para
detecção, ausência e presença, dos microrganismos utilizando PCR em Tempo
Real multiplex na triagem para diferenciação entre patógenos Gram positivos e
Gram negativos; detecção de genes por PCR em Tempo Real com único alvo,
para genes espécie-especificos, genes de resistência à antimicrobianos, e a
detecção de fungos e leveduras. As reações de amplificação dos genes por
PCR em Tempo Real foram realizadas diretamente em amostras de sangue
coletadas em tubos com EDTA K2 gel e em frascos de hemocultura
automatizado (BACTEC®).
A mais importante característica que pode ser ressaltada na padronização
da PCR em Tempo Real foi o tempo total para obter o resultado final.
Considerando a extração de DNA diretamente de amostras clínicas de sangue
periférico coletados em EDTA K2 gel, a reação de amplificação TaqMan para
diferenciar Gram positivo e Gram negativo, seguida da reação para detectar
genes de resistências, direcionados conforme os resultados da PCR, e por
ultimo, as análises dos resultados, obteve tempo total de 8 horas. Comparado
com outras ferramentas de diagnóstico baseados em PCR, a metodologia
TaqMan Multiplex PCR não necessitou de análises posteriores, como restrição
de produtos por RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”), etapas de
hibridização com sondas de DNA e sequenciamento dos produtos amplificados
para identificação das espécies bacterianas (Shang et. al., 2001; Wellinghausen
106
DISCUSSÃO
et. al., 2004; Klaschik et. al., 2002b). No entanto, a PCR em Tempo Real SYBR
Green para a detecção dos genes de resistência necessitou de um tempo maior,
já que o fluoróforo aplicado nesta técnica utilizou uma curva de dissociação para
analisar a temperatura de melting (Klaschik et. al., 2004).
As temperaturas de melting (Tabela 4) encontradas neste estudo para os
genes de resistência aos antimicrobianos mostraram boa especificidade. O Tm
médios para os genes de resistência em Gram positivos foram de 71,92; 74,41 e
85,48 para mecA, vanB e vanA, respectivamente. E para os Gram negativos,
apenas os genes blaKPC e blaSHV, obtiveram Tm próximos, 91,31 e 91,67;
respectivamente. Os controles positivos utilizados na padronização obtiveram
um desvio padrão máximo de 0,30 para os genes estudados. Além disso, a
determinação dos Tm de cada produto amplificado após a diferenciação pela
análise da curva de dissociação mostrou picos altos permitindo a diferenciação
entre as várias sequencias de DNA.
Estudos mostraram uma melhoria na
especificidade de detecção de genes quando os produtos amplificados foram
diferenciados por Tm (Klaschik et. al., 2004; Wellinghausen et. al., 2004).
As
especificidades
dos
nossos
ensaios
testados
com
vários
microrganismos (Tabelas 1 e 6) não detectaram reação cruzada entre os DNA
extraídos de amostras controles positivas. Entretanto, algumas reações
mostraram sinais de fluorescência nos controles negativos para os genes 16S
rDNA e o uidA, que identifica E. coli. Outros estudos reportaram que nas
técnicas de PCR utilizando iniciadores universais, como 16S rDNA, ocorreu a
detecção de DNA entre 500 e 1.000 cópias bacteriana por reação. Este limite de
fundo, geralmente, foi detectado pela presença de DNA contaminante de E. coli
nos reagentes não descontaminados.
107
DISCUSSÃO
A descontaminação dos reagentes com o uso de DNAse I foi utilizados
em alguns estudos e mostraram efeitos inibitórios nas etapas de amplificação
(Corless et. al., 2000; Klaschik et. al., 2002a; Silkie et. al., 2008). A presença dos
restos de bactérias contaminantes pode prejudicar sensibilidade e especificidade
analítica dos ensaios de PCR em Tempo Real (Meier et. al., 1993; Klaschik et.
al., 2002a). Quando a técnica de PCR em Tempo Real é utilizada para a
detecção de patógenos em amostras clínicas com pequena quantidade de DNA
a presença de sinal positivo para os controles negativos pode dificultar a
interpretação dos resultados das amostras positivas (Klaschik et. al., 2002a).
Desta forma, para a identificação dos principais patógenos foram
selecionadas regiões alvos conservadas nos DNA de cada microrganismo e,
portanto, mais adequada para diferenciação de espécies. Cada microrganismo
foi diferenciado por sequências alvos bem descritas por vários autores e os
sinais de fluorescência não foram detectados nos demais genes alvos (Desjardin
et. al., 1998; Luong et. al., 2011; Hue et. al., 1999; Guiver et. al., 2001).
Na detecção de patógenos por PCR em Tempo Real com abordagem
qualitativa, presença/ausência, tem grande utilização definir o ciclo de corte (Ct
“cutoff”), número do ciclo do PCR (Burns &Valdivia, 2008). A definição de um Ct
de corte inadequado pode levar a erros de interpretação dos resultados da PCR
em Tempo Real e gerar com sérias consequências (Larianov et. al., 2005). No
presente estudo foram estabelecidos o Ct do LoD e Ct corte (“cutoff”) para todos
os genes estudados seguindo as recomendações do documento EP17-A (CLSI,
2004).
O limite de detecção de Unidade Formadora de Colônia (UFC) por reação
para os respectivos genes em estudo mostrou o teste muito sensível, sendo
possível a detecção dos genes na presença de 15 a 1,5 UFC por reação (Tabela
108
DISCUSSÃO
5), porém quando determinado o Ct “cutoff” e o LoD este limite aumentou a UFC
por reação para a maioria dos genes avaliados (Tabela 8). Outros autores
encontraram uma sensibilidade semelhante de 10 UFC/reação (Loonen et. al.,
2011). Para E. coli e Klebsiella pneumoniae em frascos de cultura de sangue
foram encontrados uma sensibilidade de 10 UFC/reação (Gerbet et. al., 2008 e
Kurupati et. al., 2004).
Alguns estudos relataram que a maioria dos episódios de bacteremia
clinicamente significativos em adulto realizados por hemocultura quantitativa foi
caracterizada por um numero baixo de bactérias circulando, 54% das
hemoculturas de pacientes com endocardite obtiveram 1 a 30 UFC/mL de
sangue. Em crianças, a magnitude da bacteremia, geralmente, foi inversamente
proporcional à idade da criança (Werner et. al., 2008). Outro autor mostrou que
em 73% dos pacientes com bacteremia por Gram negativos as hemoculturas
tiveram menor que 10 UFC/mL de sangue (Kreger et. al., 1980). Dessa forma, a
sensibilidade analítica em UFC/reação encontrada no nosso estudo limita a
capacidade de diagnóstico de bacteremia nos pacientes se comparados com a
sensibilidade teórica de um UFC/frasco de hemocultura quando inoculado 10 mL
de sangue periférico.
Entretanto, a hemocultura convencional, geralmente, necessita de um
período de 1 a 3 dias para fornecer resultados de identificação das espécies e o
antibiograma. E os resultados de sensibilidade analítica dos PCR em Tempo
Real, até o presente momento, não podem substituir a hemocultura
convencional, porém o tempo de liberação em 8 horas do PCR em Tempo Real
para os genes em estudo pode proporcionar uma valiosa informação adicional
aos médicos para um tratamento mais rápido. Alguns autores reportaram que a
utilização de testes moleculares para a detecção precoce de microrganismo em
corrente sanguínea e a detecção de genes de resistência ocasionou em
109
DISCUSSÃO
contribuição para a adequação do tratamento antimicrobiano diminuindo a
morbi/mortalidade (Ferraresso & Berardineli, 2005).
A eficiência da reação de PCR em Tempo Real utilizando a metodologia
de TaqMan Multiplex PCR em Tempo Real foi menor quando comparadas com a
reação com amplificação de único alvo para PCR em Tempo Real TaqMan na
detecção dos genes espécie-especificos. Outros autores também encontraram o
mesmo
resultado
utilizando
sondas
para
amplificação
de
dois
alvos
simultaneamente (Exner & Lewinski, 2002; Hayden, 2004; Mothershed &
Whitney, 2006). A eficiência das reações de SYBR Green para os genes blaTEM,
blaSHV, blaCTX-M e vanB foram menores em relação aos demais genes,
provavelmente, pelo tamanho dos produtos amplificados, 700 a 1000 pb. Alguns
estudos relatam que o tamanho dos produtos pode interferir na eficiência e
sensibilidade dos testes de PCR (Dorak, 2006).
No presente estudo, a prevalência de bactérias foi de 30,3% para Gram
negativas e de 69,7% Gram positivas (Figuras 3 e 2). Em um recente estudo
descritivo realizado no Hospital São Paulo por Goto e colaborados (2007), a ICS
por Gram negativos foi de 32,9% e a mortalidade foi de 41% em sete dias
quando causada por BGN multirresistente e 8,7% por outros agentes. A
identificação precoce destes microrganismos para o sucesso terapêutico dos
pacientes submetidos à TCTH e pacientes com doenças hematológicas
submetidas à quimioterapia torna-se de extrema relevância.
Observamos que a maior prevalência nas espécies de Gram positivas
foi o gênero Staphylococcus (Figura 2). Dentre este, houve o predomínio de
SCoN em relação a S. aureus. Nos SCoN foram detectadas altas taxas de
resistência à oxacilina pelo
sistema automatizado
Phoenix®.
Gales e
110
DISCUSSÃO
colaboradores relataram em um estudo resultados semelhantes com prevalência
de SCoN com alta resistência à meticilina (Gales et. al., 2009).
No presente estudo houve 26% dos casos de ICS por enterococos,
sendo 66,6% (4/6) VRE, com presença do gene vanA. Timmers e colaboradores
(2002) relataram que este gênero é comumente isolado em pacientes
transplantados e a transmissão nosocomial de Enterococcus resistentes à
vancomicina (VRE) ocorre, frequentemente, em pacientes de hematológicos. Um
estudo realizado em pacientes com câncer mostrou que a colonização por VRE
estava presente em 93% dos pacientes que apresentavam o microrganismo E.
faecium e em 67% dos pacientes colonizados por E. faecalis (Ghanem et. al,
2007). Rocchetti reportou em seu estudo a presença de Enterococcus spp em
8,3% dos casos de ICS (Rocchetti, 2011).
O número de ICS causadas por bactéria produtoras de ESβL apresenta
uma tendência crescente que expresa um impacto significativo sobre as taxas de
mortalidade e os custos hospitalares (Tumbarello et. al., 2006). Encontramos nas
espécies Gram negativas a prevalência de E. cloacae (Figura 3) com 100% de
detecção de ESβL pelo sistema automatizado Phoenix®.
Na avaliação da concordância entre a identificação pelo sistema
automatizado Phoenix® e PCR em Tempo Real nas amostras dos frascos
BACTEC® foram encontradas 16 amostras divergentes (Tabela 10). Estas
amostras foram detectadas e identificadas pelos testes fenotípicos, porém não
foram detectadas por PCR em Tempo Real. Este fato pode ser resultante da
baixa eficiência da reação multiplex com as sondas Gram positiva e Gram
negativa, uma vez que, destas 16 amostras, nove foram PCR em Tempo Real
positivas para os genes espécie-especificos.
111
DISCUSSÃO
Observamos que na comparação entre PCR em Tempo Real utilizando as
sondas espécie-especificas e sondas para Gram positivo e Gram negativo
(Tabela 10), a metodologia com detecção com único alvo foi maior em relação à
detecção pela metodologia de TaqMan Multiplex PCR,
provavelmente isso
ocorreu devido à amplificação simultânea de sondas para dois alvos, já que
reações multiplex apresentam menor sensibilidade de detecção quando
comparadas a reações com amplificação de um único alvo (Exner & Lewinski,
2002; Hayden et. al., 2004; Mothershed & Whitney, 2006).
A divergência encontrada entre a identificação por testes fenotípicos
realizados no Phoenix® e PCR em Tempo Real utilizando os iniciadores para
genes espécie-especificos foi de sete amostras. Estas amostras foram
detectadas fenotipicamente, porém apresentaram resultados negativos para o
PCR em Tempo Real (Tabela 10). Alguns autores atribuem este fato a presença
de substâncias como proteína heme, IgG, sódio polianetolsulfonato e
componentes do sangue presentes nos frascos BACTEC® (Al-Soud & Radstrom
2001; Engel et. al., 2007). Isso pode explicar uma possível queda da eficiência
de amplificação da PCR em Tempo Real observada nas amostras com
identificação pelos testes fenotípicos e não detectadas por PCR em Tempo Real.
Resultados semelhantes também foram relatados por Varani e
colaboradores (2009), que encontraram 16 amostras de frascos de hemocultura
positivos (BacT/Alert 3D system® (BioMerieux Italia, Rome, Italy)) com resultado
negativo pelo método de PCR em Tempo Real SeptiFast. Os microrganismos
discordantes no estudo de Varani foram SCoN, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa,
S. maltophilia e
E. cloacae.
Kellog e colaboradores (2000) encontraram
divergências na identificação para S. aureus e Staphylococcus coagulase
negativo que foram detectados na hemocultura fenotipicamente e apresentaram
PCR em Tempo Real negativa.
112
DISCUSSÃO
Alguns estudos observaram que os frascos de hemocultura podem ter
resultados negativos devido ao volume insuficiente de sangue coletado para a
detecção de bactérias, e também o baixo nível de bacteremia (<10 UFC / mL) foi
muito mais comum (até 68%) em pacientes pediátricos do que se acreditava
anteriormente. Kellog e colaboradores (2000) concluíram que é necessário
coletar até 4,5% do volume de sangue do paciente (cerca de 4 ml / kg) em pelo
menos duas amostras de sangue para detectar baixas concentrações de
patógenos.
Na análise da concordância entre PCR em Tempo Real com sondas
GN/GP e testes fenotípicos foram detectadas nove amostras pela PCR em
Tempo Real que apresentaram resultados negativos pelo sistema BACTEC®
(Tabela 10). A divergência encontrada foi PCR em Tempo Real positiva para a
sonda Gram negativa nas amostras 57 e 26 coletas do mesmo paciente (Tabela
10), estas amostras foram coletadas com uma diferença de dois dias uma da
outra. A PCR em Tempo Real com iniciadores para espécie-especificas
identificou o microrganismo K. pneumoniae nestas mesmas amostras. Depois de
19 dias este paciente apresentou cultura com K. pneumoniae, porém, este frasco
de hemocultura não foi enviado ao LEMC e não foi avaliado pela PCR em
Tempo Real. Assim, a alta concentração de DNA detectada sugere que a
contaminação nestas amostras parece menos provável (Tabela 16).
Outra discordância entre os testes fenotípicos e PCR em Tempo Real
encontrada foi a PCR em Tempo Real detectada pelas sondas Gram positivas
que o sistema BACTEC® não detectou. As amostras 421, 423 e 5 EDTA K2 GEL
(Tabela 12) foram coletadas no mesmo dia e apresentaram Ct de 36,5; 34,5 e
33,6; respectivamente. Este paciente apresentou dez dias antes cultura positiva
para S. epidermidis, porém, esta amostra não foi encaminhada ao LEMC e não
foi avaliada pela PCR. A PCR em Tempo Real com os iniciadores espécie113
DISCUSSÃO
especificos que detectou o microrganismo SCoN foram consideradas negativas,
mesmo apresentando Ct detectado (Tabela 16). Após o cálculo do Ct do LoD
para SCoN estas amostras foram negativas pela PCR em Tempo Real. Portanto,
a baixa concentração de DNA encontrada nestas amostras sugere a detecção de
DNA de bactérias mortas sugerindo contaminação.
Na avaliação da concordância a amostra 45 apresentou PCR positiva
tanto para sonda Gram positiva quanto para sonda Gram negativa, com Ct que
indicam alta concentração de DNA (Tabela 16). A hemocultura pelo sistema
BACTEC® foi negativa. Este paciente depois de 16 dias apresentou hemocultura
positiva para SCoN, porém, o frasco não foi encaminhado ao LEMC e, portanto,
não foi avaliada por PCR. A concentração de DNA encontrada para Gram
positivo sugere que não ocorreu contaminação, no entanto, para Gram negativo
sugere contaminação. Já que não houve crescimento de nenhum microrganismo
Gram negativo nas culturas anteriores ou posteriores a data da amostra
analisada. A PCR com sondas espécie-especificas para SCoN obteve o Ct de
nove.
Outra amostra (560) apresentou PCR positiva para ambas as sondas
GP/GN e o sistema automatizado Phoenix® identificou apenas o Gram negativo,
Citrobacter freundii. A amostra 568 do mesmo paciente e coletada na mesma
data da outra amostra, já apresentou concordância entre o teste fenotípico
Phoenix® e PCR em Tempo Real para detectar Gram positivo. Desta forma, a
sonda Gram positiva detectada na amostra 560 sugere pouco provável que seja
contaminação por GP. Uma vez que o sistema automatizado Phoenix®
identificou SCoN na amostra 568 e o Ct detectado de 21,6 sugere alta
concentração de DNA. A PCR espécie-especifica detectou Ct oito para SCoN na
amostra 560 e Ct 9,33 para amostra 568 (Tabela 16).
114
DISCUSSÃO
As amostras 327, 337 e 340 coletadas do mesmo paciente obtiveram
resultados positivos para sonda Gram positiva e foram concordantes com a
identificação de E. faecium pelo sistema automatizado Phoenix®. A amostra 328
coletada três dias depois apresentou PCR positiva para sonda Gram positiva e
identificação negativa pelo sistema automatizado Phoenix®. Portanto, a baixa
concentração de DNA detectado com Ct 35,5 sugere ser contaminação. Outras
amostras da mesma data tiveram resultados negativos para PCR (Tabela 10 e
16).
Resultados semelhantes aos encontrados no nosso estudo também
foram relatados por Lehmann e colaboradores (2008), que avaliaram a aplicação
da PCR em Tempo Real na detecção de patógenos no sangue pelo Kit SeptiFast
LightCycler® (Roche-Molecular Diagnosis) e comparou os resultados com os
obtidos pelo BACTEC®. Lehmann e colaboradores (2008) detectaram 114
amostras pelo SeptiFast e 46 destas amostras foram negativas pelo sistema
BACTEC®. Os resultados discordantes ocorreram tanto por algumas espécies
identificadas pelo sistema BACTEC® não estarem presentes no kit SeptiFast®
quanto podem ter sido consideradas contaminação na hemocultura. Em estudos,
a taxa de amostras consideradas contaminadas por SCoN chega a ser de 26%,
já que se trata de bactérias colonizantes da pele (Ikegaya et. al., 2010).
Uma questão importante é se estes patógenos adicionalmente detectados
por PCR em Tempo Real em frascos de hemocultura são clinicamente
relevantes ou se não são apenas contaminantes, sendo importante a
discriminação entre colonização e contaminação, ou infecção verdadeira. Em um
estudo realizado Dierkes e colaboradores (2009) a maioria dos patógenos
detectados apenas por SeptiFast® também estiveram presentes em outras
amostras do mesmo paciente, sugerindo uma relevância clínica. Os resultados
encontrados por estes autores estão em concordância com outros estudos, onde
115
DISCUSSÃO
patógenos detectados adicionalmente por PCR estavam presentes em outras
amostras do mesmo paciente (Mancini et. al., 2008; Louie et. al., 2008).
Apesar de todas as divergências encontradas no nosso estudo a acurácia
clínica mostrou um desempenho satisfatório para a maioria dos genes avaliados
com uma área sob a curva ROC acima de 0,82. Os ensaios mostraram uma alta
especificidade clinica pela curva ROC, acima de 99,5 % para todos os genes
avaliados (Tabela 9). A menor área (0,73) foi encontrada para o gene espécieespecifico que detecta E. coli, provavelmente o desempenho foi prejudicado pela
devido do DNA contaminante nos reagentes de PCR (Carroll et. al., 1999;
Corless et. al., 2000).
A sensibilidade clínica encontrada no presente estudo foi baixa para SCoN,
provavelmente, este resultado pode estar relacionado à alta detecção deste
microrganismo nas reações de PCR em Tempo Real, por estarem presentes
como microrganismos colonizantes de pele (Ikegaya et. al., 2010). Observamos
uma concordância moderada para o gene 16S rDNA com um coeficiente Kappa
de 0,482, já para a PCR com sondas espécie-especificas o grau de
concordância pelo Kappa foi 0,79 quando comparado com o sistema
automatizado Phoenix®, e assim considerado uma boa concordância.
No presente estudo, a PCR em Tempo Real para sondas Gram negativa
e Gram positiva em comparação com a identificação pelo sistema automatizado
Phoenix® mostrou sensibilidade de 65,38%, especificidade de 88,05%, VPP de
51,51% e VPN de 92,91%. Já para a PCR em Tempo Real com sondas espécieespecificas foi obtido 96% de sensibilidade, 93,33% de especificidade, 72,72%
de VPP e 99,21% de VPN da PCR em comparação com o sistema automatizado
Phoenix® (Tabela 14).
116
DISCUSSÃO
Jordan & Durso (2005) apresentaram resultados melhores, pois
encontraram 96% de sensibilidade, 99,4% de especificidade, 88,9% de valor
preditivo positivo e 99,8% de valor preditivo negativo da PCR em comparação
com o cultivo de 0,5-1,0 mL de sangue com frasco BACTEC®. No nosso estudo
não foi realizada a etapa de enriquecimento e isso pode explicar a diferença
entre os dois métodos em comparação com o que foi relatado por Jordan &
Durso. Não podemos excluir que os nove resultados de PCR em Tempo Real
positivos sem resultados concordantes com cultura positiva podem também
resultar de contaminação.
No presente estudo, as porcentagens de resultados falsos positivos,
calculados pela curva ROC, utilizando amostras controle ATCC e amostras
controles negativas de pacientes sem sinais de infecção de corrente sanguínea
para PCR com sondas GP/GN foi de zero, considerando o LoD calculado. A
PCR em Tempo Real com sondas espécie-especificas para A. baumannii,
Enterococcus spp., P. mirabilis, S. marcescens e Salmonella spp. apresentaram
os valores de falsos positivos calculados pela curva ROC de 41,2%, 15%, 35%,
20% e 10%, respectivamente (Tabela 9). Resultados semelhantes foram
relatados por Chiquet e colaboradores, que encontraram resultados falsos
positivos próximos de zero com a utilização de PCR convencional (Chiquet et.
al., 2007; Chiquet et. al., 2008). Outros autores encontraram uma proporção de
resultados falsos positivos de 5% utilizando Nested PCR para identificação de
microrganismo. (Okhravi et. al., 2000; Therese et. al., 1998).
Observamos a amplificação mista em duas amostras na detecção com
sondas Gram positiva e Gram negativa. Estas amostras que apresentaram sinal
misto
também
apresentaram
picos
mistos
nos
eletroferograma
do
sequenciamento com os iniciadores para o gene 16S rDNA, esta técnica não foi
capaz de diferenciar dois microrganismos em uma mesma amostra. Outros
117
DISCUSSÃO
autores detectaram um padrão de amplificação mista quando testadas sondas
para classificação de Gram incluindo amostras de líquido sinovial, urina e
sangue de pacientes com sepse, tanto com resultados positivos quanto
negativos por cultura (Shigemura et. al., 2005; Yang et. al., 2008; Ohlin et. al.,
2008).
A detecção dos genes de resistência é especialmente valiosa em
instituições que apresentam alta incidência de bacteremias devido à presença de
bactérias multirresistentes. A implantação deste ensaio em pacientes de TCTH
pode ajudar no direcionamento apropriado do tratamento antimicrobiano nas 2448 h antes dos resultados da cultura estar disponíveis. Dada às limitadas opções
terapêuticas disponíveis, a detecção rápida dos genes de resistência pode
assegurar a terapêutica ideal, e também um passo importante no controle da
disseminação destes microrganismos multirresistentes.
Na avaliação da concordância entre o teste fenotípico e PCR em Tempo
Real para a detecção de resistência à vancomicina em amostras de
Enterococcus spp. o sistema automatizado Phoenix® foi 100% concordante com
a detecção do gene vanA por PCR em Tempo Real (Tabela 11).
A discordância entre sistema automatizado Phoenix® e a detecção do
gene mecA pelo método da PCR em Tempo Real foi em seis amostras. As
amostras 445, 446 e 450 apresentaram sensibilidade à oxacilina pelo teste
fenotípico e tiveram detectado o gene mecA (Tabela 11). Kuwahara-Araik sugere
que a susceptibilidade corresponde ao controle transcriptacional mediado pelo
repressor (mecI) e o indutor (mecR1) da expressão do mecA (Kuwahara-Araik et.
al., 1996).
Outra divergência mostrou a amostra 50 que apresentou resistência à
oxacilina e não foi detectado o gene mecA (Tabela 11). Em um recente trabalho
118
DISCUSSÃO
elaborado por Yanagihara e colaboradores, 2010, em que foi avaliada a
concordância entre a detecção de isolados de Staphylococcus resistentes a
oxacilina pelo método fenotípico e a detecção do gene mecA pelo Kit de
detecção SeptiFast®, o método molecular não foi capaz de detectar o gene mecA
em duas amostras. Os autores sugerem que isto foi devido à diferença de
sensibilidade entre os dois testes (um foi realizado direto da amostra clinica e o
outro direto do isolado).
Entretanto, em um estudo recente foi detectado duas amostras de MRSA
com resistência a oxacilina e detecção do gene mecA negativa por vários
métodos, nestas amostras foi encontrado o novo SCCmec tipo XI, que
apresentou varias divergências entre os genes mecA, mecI, mecR1, blaZ e ccr.
Desta forma, os isolados bacterianos que apresentarem fenótipos de resistência
incompreensível com resistência a meticilina e mecA negativos, precisam ser
melhor caracterizados e submetidos à detecção do elemento SCCmec tipo XI e
quando positivos, devem ser tratados como MRSA (Shore et. al., 2011).
Quando comparado os resultados dos testes de susceptibilidade em
isolados Gram negativos pelo sistema automatizado Phoenix® em relação a PCR
em Tempo Real, houve concordância em apenas uma amostras na detecção dos
genes de resistência. No entanto não foram avaliados neste estudo a
prevalência de ESβL dos grupos VEB, GES, PER e OXA, que eventualmente
podem ser encontradas compondo um mesmo integron, estes grupos de ESβL
foram relatadas esporadicamente em alguns países da América do Sul (Celenza
et. al., 2006; Dropa et. al., 2010; Vignoli et. al., 2005).
A amostra oito foi sugestiva de produção de ESβL pelo antibiograma do
sistema automatizado Phoenix®, porém, a PCR para os genes em estudo, que
codificam a produção de β-lactamases, apresentaram resultados negativos para
119
DISCUSSÃO
esta amostra. A amostra 21 EDTA K2 gel do mesmo paciente coletada na
mesma data obteve PCR positiva para o gene blaSHV (Tabela 13).
As amostras 24, 29 e 37 coletadas na mesma data de um paciente e
foram sugestivas para ESβL pelo sistema automatizado Phoenix® e apenas uma
das amostras foi positiva para o gene blaSHV. A PCR em Tempo Real com
sondas espécie-especificas detectou o Ct 34,36; 31,9 e 16,6 respectivamente
para estas amostras acima citadas (Tabela 16). E apenas a amostra com Ct
16,6 apresentou positividade para os genes de resistência avaliados. Isso pode
explicar o fato das duas amostras com Ct maiores, e assim concentrações
menores de DNA, apresentarem resultados negativos para os genes estudados,
provavelmente estas duas amostras tiveram uma quantidade menor de
microrganismo inoculados nos frascos de BACTEC® e por isso a PCR foi
negativa.
Alguns estudos evidenciaram que o volume insuficiente de sangue
inoculado nos frascos de BACTEC® em pacientes pediátricos é mais comum do
que se acreditava, e concluíram que é necessário coletar até 4,5% do volume de
sangue (cerca de 4 mL/Kg) em pelo menos duas culturas de sangue para
detectar baixas concentrações de patógenos no sangue (Kellogg et. al., 2000).
A sensibilidade calculada pela curva ROC encontrada no nosso estudo
para os genes blaTEM e blaCTX foi próximo a 70%, a menor sensibilidade foi de
25% para o gene blaSHV. As especificidades calculadas pela curva ROC foi
próximo a 100% (Tabela 9). Para PCR em Tempo Real quanto maior o tamanho
do produto de amplificação maior é a especificidade e menor a sensibilidade do
teste. E a baixa sensibilidade encontrada nestes genes pode ser devido ao
tamanho dos produtos amplificados (Dorak, 2006), pois os iniciadores utilizados
para estes genes formam produtos de amplificação entre 700 a 1000pb.
120
DISCUSSÃO
Considerando que se trata de um teste elaborado para ser aplicado diretamente
em amostras clínicas, há a prioridade de manter uma boa sensibilidade com uma
boa especificidade. O desenho de iniciadores com menores tamanhos de
produtos amplificados pode melhorar a sensibilidade do método.
Um programa de vigilância, TRANSNET, composta por uma rede de 23
centros de transplante nos Estados Unidos, estudou prospectivamente a
epidemiologia da infecção fúngica invasiva entre órgãos sólidos e células-tronco
nas populações de transplantados por um período de cinco anos e observou a
incidência global da infecção fúngica invasiva em populações de TCTH e
encontrou 3,4%, um pouco menor do que as estimativas anteriores. Além disso,
a aspergilose invasiva superou a candidíase invasiva como a infecção fúngica
invasiva mais comum encontrada em TCTH. O Aspergillus spp. foi responsável
por 43% das infecções e Candida spp. representou 28%, seguido por Fusarium
spp. e Scedosporium spp. (16%) e, Zygomycetes spp. (8%).
As infecções
causadas por Fusarium spp. foram associadas com a sobrevida mais baixa em
um ano (6%), entretanto, a sobrevida em pacientes com zigomicose (28%) e
Candidíase invasiva (34%) não foi substancialmente melhor (Person et. al.,
2010).
No nosso estudo foram observadas quatro amostras, de dois pacientes,
positivas na PCR em Tempo Real para Candida spp., sendo duas amostras de
Candida albicans. O paciente que apresentou duas amostras com PCR positiva,
o Ct da primeira amostra foi de 26,99 e o da amostra seguinte foi de 17,11
(Tabela 16), sugerindo que a quantidade de DNA da Candida albicans presente
no sangue aumentou depois de dois dias. Este paciente apresentou cultura
positiva para leveduras um mês e dez dias antes da amostra em que foi
realizada a PCR. O fungo identificado na cultura foi C. albicans, sugerindo que o
DNA detectado nas amostras posteriores a cultura, podem ser de DNA de
121
DISCUSSÃO
leveduras mortas. Os resultados positivos de PCR em uma amostra não indicam
necessariamente a presença de candidíase sistêmica, no entanto, foi observado
que a amostra coletada dois dias depois obteve um aumento do Ct, e a paciente
foi a óbito em 20 dias após o resultado da última amostra de PCR em Tempo
Real. Outros estudos relataram que os métodos moleculares foram capazes de
diagnosticar infecções fúngicas antes de manifestações clínicas e, portanto, em
pacientes com doenças hematológicas que receberam quimioterapia múltipla e
tratamentos com esteróides, e que estavam neutropênicos em diferentes
estágios de sua doença, o DNA pode ser identificado antes de manifestações
clínicas (Herbat et. al. 2000; Badiee et. al., 2009).
No presente estudo, cinco pacientes apresentaram PCR positiva para
Aspergillus spp. sem cultura positiva (Tabela 10 e 12). Em um estudo foi
evidenciado que a PCR obteve uma sensibilidade de 19,4 vezes maior do que a
cultura para identificação de Aspergillus spp. (Badiee et. al., 2009). Badiee e
colaboradores (2009) observaram que os pacientes tiveram detectadas pequena
quantidades de DNA, mesmo na presença de sinais clínicos e / ou radiológicos e
até mesmo pouco antes da morte.
Observamos que a sensibilidade clínica do PCR em Tempo Real
determinada pela curva ROC foi de 94,7%, este valor foi maior do que os 91,6%
detectados por Badiee e colaboradores (2009). Estudos relataram que os
métodos moleculares podem ajudar a detectar as infecções fúngicas antes
achados clínicos. No entanto, alguns resultados obtidos com a detecção do DNA
de Aspergillus spp. em pacientes não conseguem distinguir uma contaminação
esporádica de uma aspergillemia transitória (Loeffler et. al., 1999).
As amostras 445, 446, 450, 440, 23 EDTA, 501, 413 e 3 EDTA K2 GEL
apresentaram o resultados positivos para PCR em Tempo Real com o iniciador
122
DISCUSSÃO
genérico para o gene 18S rDNA para detecção de fungos. O resultado do
sequenciamento para estas amostras foi inconclusivos quanto à identificação
fúngica, o eletroferograma mostrou vários picos em uma mesma posição,
sugerindo mais de um microrganismo por amostra. Portanto, estas amostras
sugerem a presença de contaminantes. Os fungos são ubíquos no ambiente,
portanto, um PCR com iniciadores genéricos tem maior probabilidade de
amplificar produtos de DNA que são o resultado de contaminação exógena
(Loeffler et. al., 1999). Nossos protocolos de extração de DNA foram realizados
em fluxo laminar e controles negativos foram introduzidos para minimizar a taxa
de falso positivo, tanto quanto possível. No entanto, vários estudos evidenciaram
a contaminação exógena de amostras clínicas com fungos (Weems et. al.,
1987).
A aplicação de um método molecular para o diagnóstico direto de
amostras clínica apresenta como principal objetivo uma redução no tempo de
liberação do resultado final, para permitir uma escolha adequada da terapia
antimicrobiana em menor tempo, obtendo como resultado uma maior sobrevida
dos pacientes. A padronização aqui apresentada, leva em média 8 horas para
ser executada, desde o recebimento da hemocultura positiva ou negativa pelo
sistema automatizado BACTEC® até o resultado dos genes de resistência por
PCR em Tempo Real. Considerando que, no momento em que o método
molecular é realizado direto do frasco de hemocultura já foi realizada a coloração
de Gram pelo laboratório de análises clínicas, o resultado de Gram positivo e
Gram negativo pelo método molecular pode não colaborar na rapidez do
resultado. No entanto, para as amostras de sangue em tubo de EDTA K2 gel, o
tempo de liberação do resultado seria de aproximadamente 8 horas, muito
superior ao do sistema automatizado Phoenix®.
123
DISCUSSÃO
A detecção de bactérias Gram negativas e Gram positivas pelo método
molecular podem ser realizadas no mesmo dia em que é feita a PCR em Tempo
Real para pesquisar de genes que conferem resistência. Desta forma, o método
molecular poderia ser útil na antecipação do resultado do gene de resistência,
uma vez que a liberação do resultado final da hemocultura levou de 3 a 4 dias
para ser liberado pelo laboratório clínico. No entanto, os testes por PCR em
Tempo Real para a detecção dos genes de resistência não é capaz de detectar
todos os mecanismos de resistência que os microrganismos podem expressar.
De acordo com os dados clínicos baseados nos critérios das fichas dos
pacientes do nosso estudo, o tratamento empírico foi inadequado em 66,6 % dos
casos em que houve ICS causada por bactérias, e 33,3% foram considerados
inadequados após a liberação do Gram, porém, foram corrigidos, e apenas
6,66% mantiveram-se inadequados após o resultado final da hemocultura pelo
laboratório clínico (Tabela 15). Na literatura há relatos de taxas de até 23,5% de
tratamentos empíricos inadequados, sendo que 54% são em ICS por bactérias
Gram negativas (Zaragoza et. al., 2003).
Nas hemoculturas com detecção de Gram positivos observamos uma
inadequação antimicrobiana empírica em 50% dos pacientes na coleta da
hemocultura, este resultado diminuiu para 20% quando foi liberado o resultado
do Gram da hemocultura pelo laboratório clínico. A liberação final da
hemocultura incluindo o antibiograma modificou a inadequação restante (Tabela
15).
No presente estudo não foi observado resultados positivos para detecção
e identificação de S. aureus pelos métodos fenotípicos e moleculares. A
concordância entre os métodos fenotípicos e PCR em Tempo Real para
identificação de SCoN e detecção do gene mecA em frascos de hemocultura
124
DISCUSSÃO
BACTEC® traria pouca contribuição na adequação antimicrobiana. Observamos
uma sensibilidade à oxacilina pelo método fenotípico com detecção do gene
mecA por PCR em Tempo Real nos três frascos de hemocultura BACTEC®
provenientes de um episódio de ICS (Tabela 15). Nos critérios baseados pelas
fichas clínicas, este episódio apresentou adequação antimicrobiana e o nosso
resultado molecular traria pouca contribuição para a adequação antimicrobiana
nessa população de pacientes.
A discordância encontrada entre sistema automatizado Phoenix® e PCR
em Tempo Real para detecção de sensibilidade à oxacilina mostrou que mesmo
com a resistência à oxacilina detectada pelos testes fenotípicos com a não
detecção do gene mecA por PCR, o teste molecular traria pouca contribuição na
adequação antimicrobiana. Cattoir e colaboradores (2011) relataram em um
estudo a concordância de 100% entre o método fenotípico e molecular para
detecção do gene mecA em isolados do gênero Staphylococcus. No entanto,
muitos dos casos foram definidos como uma possível contaminação da amostra
pelo microrganismo isolado. Cattoir e colaboradores (2011) avaliou a
possibilidade de interferência do método molecular na adequação da
antibióticoterapia e concluiu que a rápida identificação de S. aureus e
determinação de suscetibilidade à oxacilina usando uma técnica de PCR não
obteve impacto clínico.
Nos três pacientes com identificação de Enterococcus spp. (dois E.
faecium e um E. faecalis) com resistência à vancomicina pelo sistema
automatizado Phoenix®, os resultados da PCR positiva para gene vanA
ocasionaria benefício na adequação antimicrobiana (Tabela 15). Estes pacientes
estavam em tratamento com vancomicina e tiveram o tratamento corrigido para o
uso de linezolida.
125
DISCUSSÃO
No
presente
estudo
avaliamos
também
o
descalonamento
da
antibioticoterapia. De acordo com os resultados apontados, a PCR poderia ser
benéfica em um paciente com cultura positiva para Enterococcus faecium
sensível à vancomicina com uso de linezolida, no qual houve o descalonamento
para teicoplanina (Tabela 15). Este caso poderia ter sido beneficiado pelo
resultado negativo para o gene vanA e a antibioticoterapia poderia ter sido
modificada para glicopeptídio antes do resultado do sistema automatizado
Phoenix®.
Para os bacilos Gram negativos observamos 50% de inadequação
antimicrobiana empírica nos pacientes na coleta da hemocultura e para os
bacilos Gram negativos não fermentadores esta inadequação foi de 100%. Na
liberação do resultado do Gram da hemocultura pelo laboratório clínico, este
resultado diminuiu para 0% para os bacilos Gram negativos e 50% para os
bacilos Gram negativos não fermentadores, correspondente aos 6,66% da
inadequação antimicrobiana dos Gram negativos (Tabela 15).
Para enterobactérias, observamos uma inadequação no momento da
coleta da hemocultura que foi totalmente corrigida no resultado final da
hemocultura. Para os bacilos Gram negativos não fermentadores manteve esta
inadequação após o resultado final da hemocultura. Não houve detecção de
metalo-β-lactamase
nas
amostras
estudadas,
no
entanto,
não
foram
pesquisados os genes OXA que conferem resistência aos carbapenens.
Em algumas amostras, não houve a detecção do mecanismo de
resistência, ou porque como sugerido anteriormente, o método da PCR para
alguns genes estudados não foi sensível o suficiente para detectá-los direto da
hemocultura, ou porque se tratava de outro mecanismo. Em bactérias Gram
negativas há uma extensa gama de mecanismos que podem levar a resistência
126
DISCUSSÃO
nessas bactérias. Entre eles, outras carbapenemases além das que foram
estudas como, por exemplo, as carbapenemases do tipo OXA, além de
alterações em porinas, outras ESβL além das estudadas (Bush & Jacoby, 2010)
e aumento da expressão de bombas de efluxo (Lister et. al., 2009). Em Gram
negativos fica difícil a possibilidade de o teste colaborar em descalonamento do
tratamento, pois quando a PCR for negativa para os genes estudados, poderá
haver outro mecanismo e sendo assim, a bactéria poderá ser resistente ao
antibiótico de escolha.
Para as amostras avaliadas, houve uma considerável redução da
inadequação do tratamento após o resultado do Gram na hemocultura. Assim
sendo, o teste realizado diretamente em amostras extraídas do sangue por
EDTA K2 gel, provavelmente poderia contribuir muito para que fosse alterado o
tratamento empírico.
A liberação do resultado final obteve um tempo mediano de quatro dias
para os testes fenotípicos. A detecção molecular dos genes de resistência pela
técnica de PCR pode reduzir o tempo de liberação dos resultados e assim
permitir um reajuste na terapia empírica. Apesar de existir poucos dados de
literatura, acreditamos que o ajuste precoce da terapia empírica utilizando testes
moleculares rápidos pode contribuir no tratamento adequado do paciente.
Estamos dando continuidade aos estudos de detecção “in house” por
PCR em Tempo Real em amostras coletadas em EDTA K2 gel dos pacientes
oncológicos (IOP/GRAACC) para analises de resultados com uma maior
casuística.
127
CONCLUSÕES
7. CONCLUSÕES
O desempenho dos ensaios moleculares determinados pela curva ROC foi
satisfatório para os genes em estudo. Observamos uma alta especificidade e
uma sensibilidade baixa apenas para os genes de resistência com grandes
produtos de amplificação.
A concordância pelo coeficiente Kappa foi boa para detecção e
identificação dos microrganismos com os iniciadores espécie-específicos. A
detecção com sondas Gram positiva e Gram negativa apresentaram maior
divergência quando comparados com o teste fenotípico
Observamos uma concordância de 100% para resistência fenotípica à
vancomicina e a detecção do gene vanA. A concordância entre a sensibilidade
aos antimicrobianos e PCR em Tempo Real para detecção dos genes de
resistência foi melhor em microrganismos Gram positivos em relação aos Gram
negativos
Quanto à adequação antimicrobiana a detecção e identificação molecular
de microrganismos Gram positivos traria pouca contribuição em relação aos
testes fenotípicos, mas seria útil na adequação precoce do tratamento de
bacteremia antecipando o resultado dos genes de resistências tanto para
microrganismos Gram positivos quanto Gram negativos.
128
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Al-Khaldi SF, Mossoba MM, Allard MM, Lienau EK, Brown ED. Bacterial
identification and subtyping using DNA microarray and DNA sequencing.
Methods Mol Biol. 2012; 881:73-95.
Al Naiemi N, Duim B, Bart A. A CTX-M extended-spectrum betalactamase in Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia. J
Med Microbiol. 2006; 55:1607-1608.
Al-Soud WA and Radstrom P. Purification and characterization of PCRinhibitory components in blood cells. J Clin Microbiol. 2001; 39:485–493.
Ambler RP. The structure of beta-lactamases. Philos Trans R Soc Lond B
Biol Sci 1980; 289:321-331.
Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky
MR. Epidemiology of severe sepsis in the United State: Analysis of incidence,
outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 2001; 29:1303-1310.
Arnan M, Gudiol C, Calatayud L, Liñares J, Dominguez MÁ, Batlle
M, Ribera JM, Carratalà J, Gudiol F.. Risk factors for, and clinical relevance of,
faecal extended-spectrum β-lactamase producing Escherichia coli (ESBL-EC)
carriage in neutropenic patients with haematological malignancies, Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 2011; 30:355–60.
Aubron C, Poirel L, Fortineau N, Nicolsa P, Collet L, Nordmann P.
Nosocomial spread of Pseudomonas aeruginosa isolates expressing the
metallobeta-lactamase VIM-2 in a hematology unit of a French hospital. Microb
Drug Resist. 2005;11:254–9.
Badiee P, Kordbacheh P, Alborzi A. Study on invasive fungal infections in
immunocompromised patients to present a suitable early diagnostic procedure.
Int J Infect Dis. 2009;13:97-102.
Baron F, Sandmaier BM. Chimerism and outcomes after allogeneic
hematopoietic cell transplantation following nonmyeloablative conditioning.
Leukemia. 2006; 20:1690-1700.
129
Bayram A, Kocoglu E, Balci I, Filiz A, Eksi F. Real-time polymerase chain
reaction assay for detection of Streptococcus paneumoniae in sputum samples
from patients with community-acquired pneumonia. J Microbiol Immunol Infect.
2006; 39:452-457.
Bebrone
C.
Metallo-β-lactamases
(classification,
activity,
genetic
organization, structure, zinc coordination) and their superfamily. Biochem
Pharmacol. 2007; 74:1686-1701.
Bellais S, Poirel L, Naas, T, Girlich D, Nordmann P. Genetic-biochemical
analysis and distribution of the Ambler class A beta-lactamase CME-2,
responsible
for
Chryseobacterium
extendedspectrum
(Flavobacterium
cephalosporin
meningosepticum).
resistance
Antimicrob
in
Agents
Chemother. 2000; 44:1-9.
Bert F, Larroque B, Paugam-Burtz C, Janny S, Durand F, Dondero F.
Microbial epidemiology and outcome of bloodstream infections in liver transplant
recipients: an analysis of 259 episodes. Liver Transpl. 2010; 16:393-401.
Bhavnani SM, Drake JA, Forrest A, Deinhart JA, Jones RN, Biedenbach
DJ. A nationwide, multicenter, case-control study comparing risk factors,
treatment, and outcome for vancomycin-resistant and -susceptible enterococcal
bacteremia. Diagn Microbiol Infect Dis. 2000; 36:145–158.
Bispo PJ, de Melo GB, Hofling-Lima A, and Pignatari AC. Detection and
gram discrimination of bacterial pathogens from aqueous and vitreous humor
using real-time PCR assays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52:873-881.
Blazquez J, Morosini MI, Negri MC, and Baquero F. Selection of naturally
occurring extended-spectrum TEM beta-lactamase variants by fluctuating betalactam pressure. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44:2182-2184.
Bochud PY, Eggiman P, Calandra T, Van Melle G, Saghafi L, Francioli P.
Bacteremia due to Streptococcus viridans in neutropenic patients with cancer:
clinical sprectrum and risk factors. Clin Infect Dis. 1994;18:25-31.
Bodey GP, Buckley M, Sathe YS, Freireich EJ. Quantitative relationships
between circulating leukocytes and infection in patients with acute leukemia. Ann
Intern Med. 1966; 64:328-340.
130
Bodey GP, Jadeja L, Elting L. Pseudomonas bacteremia. Retrospective
analysis of 410 episodes. Arch Intern Med. 1985; 145:1621-1629.
Bodey GP. Management of persistent fever in the neutropenic patient. Am
J Med. 2000; 108:343-345.
Boeckh M, Marr KA. Infection in hematopoietic stem cell transplantation.
In: Rubin RH, Young LS, editors. Clinical Approach to Infection in the
Compromised Host 4th ed. New York: Klumer Academic/Plenum Publishers;
2002; 527-570.
Bogaerts P, Hujer AM, Naas T, Castro RR, Endimiani A, Nordmann P,
Glupcznski, Bonomo RA. Multicenter evaluation of a new DNA microarray for
rapid detection of clinically relevant bla genes from b-lactam-resistant Gramnegative bacteria. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55:4457–4460.
Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger RP, Fein AM, Knaus WA .
Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative
therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee.
American College of Chest Physicians/Society of Crit Care Med Chest. 1992;
101:1644-1655.
Bonnet R, De Champs C, Sirot D, Chanal C, Labia R, and Sirot J.
Diversity of TEM mutants in Proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother.
1999; 43:2671-2677.
Bonnet R. Growing group of extended-spectrum beta-lactamases: the
CTX-M enzymes. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48:1-14.
Bouza ED, Sousa M, Rodriguez-Creixems JG, Lechuz, and Munoz P. Is
the volume of blood cultured still a significant factor in the diagnosis of
bloodstream infections? J Clin Microbiol. 2007; 45:2765–2769.
Bradford PA. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century:
characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat.
Clin Microbiol Rev. 2001; 14:933-951.
Bratu S, Tolaney P, Karumudi U, Quale J, Mooty M, Nichani S and
Landman D. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY:
131
molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. J
Antimicrob Chemother. 2005; 56:128-132.
Broccolo F, Scarpellini P, Locatelli G, Zingale A, Brambilla MA, Cichero P,
Sechi AL, Lazzarin A, Lusso P, Malnati SM. Rapid Diagnosis of Mycobacterial
Infections and Quantitation of Mycobacterium tuberculosis Load by Two RealTime Calibrated PCR Assays J Clin Microbiol. 2003, 41:4565–4572.
Bure A, Legrand P, Arlet G, Jarlier V, Paul G, and Philippon A.
Dissemination in five French hospitals of Klebsiella pneumoniae serotype K25
harbouring a new transferable enzymatic resistance to third generation
cephalosporins and aztreonam. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1988; 7:780-782.
Burns M, Valdivia H. Modelling the limit of detection in real-time
quantitative PCR. Eur Food Res Technol. 2008; 226:1513–1524.
Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for
betalactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents
Chemother. 1995; 39:1211-1233.
Bush,K. New beta-lactamases in gram-negative bacteria: diversity and
impact on the selection of antimicrobial therapy. Clin Infect Dis. 2001; 32:10851089.
Bush K, Jacoby GA. Updated functional classification of beta-lactamases.
Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54:969-976.
Carroll NM, Adamson P, Okhravi N. Elimination of Bacterial DNA from
Taq DNA Polymerases by Restriction Endonuclease Digestion. J Clin Microbiol.
1999; 37:3402-3404.
Cartelle M, del Mar TM, Molina F, Moure R, Villanueva R and Bou G.
High-level resistance to ceftazidime conferred by a novel enzyme, CTX-M-32,
derived from CTX-M-1 through a single Asp240-Gly substitution. Antimicrob
Agents Chemother. 2004; 48:2308-2313.
Castanheira M, Toleman MA, Schmidt JF, Jones RN, Walsh TR.
Molecular characterization of a β-lactamase gene, blaGIM-1, encoding a new
132
subclass of metallo-β-lactamase. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48:46544661.
Cattaneo C, Quaresmini G, Casari S. Recent changes in bacterial
epidemiology and the emergence of fluoroquinoloneresistant Escherichia coli
among patients with haematological malignancies: results of a prospective study
on 823 patients at a single institution, J Antimicrob Chemother. 2008; 61:721–
728.
Cattoir V, Merabet L, Djibo N, Rioux C, Legrand P, Girou E and Lesprit P.
Clinical impact of a real-time PCR assay for rapid identification of Staphylococcus
aureus and determination of methicillin resistance from positive blood cultures.
Clin Microbiol Infect. 2011; 17:425-431.
Celenza G, Pellegrini C, Caccamo M, Segatore B, Amicosante G, Perilli
M..Spread of blaCTX-M-type and blaPER-2 beta-lactamase genes in clinical
isolates from Bolivian hospitals. J Antimicrob Chemother. 2006 57:975-978.
Cetinkaya Y, Falk P, Mayhall CG. Vancomycin-Resistant Enterococci.
Clin Microbiol Rev. 2000; 13:686–707.
Challier S, Boyer S, Abachin E, Berche P. Development of a SerumBased Taqman Real-Time PCR Assay for Diagnosis of Invasive Aspergillosis. J
Clin Microbiol. 2004; 42:844–846.
Chamilos G, Kontoyiannis DP, Update on antifungal drug resistance
mechanisms of Aspergillus fumigates. Drug Resist Updat. 2005; 8:344–58.
Chanawong A, M’Zali FH, Heritage J, Lulitanond A, Hawkey PM. SHV-12,
SHV-5, SHV-2a and VEB-1 extended-spectrum B-lactamases in gram negative
bacteria isolated in a university hospital in Thailand. J Antimicrob Chemother.
2001; 48:924-925.
Chandelier A, Planchon V and Oger R. Determination of cycle cut off in
real-time PCR for the detection of regulated plant pathogens. Bulletin
OEPP/EPPO Bulletin. 2010; 40:52–58.
Chang S, Sievert DM, Hageman JC, Boulton ML, Tenover FC, Downes
FP, Shah S, Rudrik JT, Pupp GR, Brown WJ, Cardo D, Fridkin SK. Infection with
133
vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance
gene. N Engl J Med. 2003; 348:1342-1347.
Chen SCA, Kontoyiannis DP. New molecular and surrogate biomarkerbased tests in the diagnosis of bacterial and fungal infection in febrile neutropenic
patients. Curr Opin Infect Dis. 2010; 23:567–577.
Chen TL, Siu LK, Wu R CC, Shaio MF, Huang LY, Fung CP, Lee CM, and
Cho WL. Comparison of one-tube multiplex PCR, automated ribotyping and
intergenic spacer (ITS) sequencing for rapid identification of Acinetobacter
baumannii . Clin Microbiol Infect. 2007; 13:801–806.
Chiquet C, Lina G, Benito Y, Cornut PL, Etienne J, Romanet JP.
Polymerase chain reaction identification in aqueous humor of patients with
postoperative endophthalmitis. J Cataract Refract Surg. 2007; 33:635-641.
Chiquet C, Cornut PL, Benito Y, Thuret G, Maurin M, Lafontaine PO.
Eubacterial PCR for bacterial detection and identification in 100 acute
postcataract surgery endophthalmitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008; 49:19711978.
Chong Y, Yakushiji H, Ito Y, Kamimura T, Clinical impact of
fluoroquinolone
prophylaxis
in
neutropenic
patients
with
hematological
malignancies, Int J Infect Dis, 2011; 15:277–81.
Clinical and Laboratory Standards Institute Molecular Diagnostic Methods
for Infectious Diseases; Approved Guideline - Second Edition. CLSI document
MM03-A2. Wayne PA: Clinical and Laboratory Standard Institute; 2006.
Clinical and Laboratory Standards Institute. User protocol for evaluation
of qualitative test performance. Approved Guideline - Second Edition. CLSI
document EP12-A2. Wayne PA: Clinical and Laboratory Standards Institute;
2008.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Assessment of the Clinical
Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristics (ROC)
Plots. Approved Guideline. NCCLS Document GP10-A. Wayne PA: NCCLS;
1995.
134
Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for
Antimicrobial Susceptibility Testing. Eigtheenth Informational Supplement.
Approved Standard. CLSI document M100-S18. Wayne PA: Clinical and
Laboratory Standards Institute; 2008.
Antimicrobial Susceptibility Testing. Nineteenth Informational Supplement.
Antimicrobial Susceptibility Testing. Twenty Informational Supplement. Approved
Standard. CLSI document M100-S20. Wayne PA: Clinical and Laboratory
Standards Institute; 2010.
Antimicrobial Susceptibility Testing. Twenty First Informational Supplement.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Protocols for determination of
limits of detection and limits of quantitation. Approved Guideline. NCCLS
document EP17-A. Wayne PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2004.
Cockerill FR, Wilson JW, Vetter EA, Goodman KM, Torgerson CA,
Harmsen WS, Schleck CD, Ilstrup DM, Washington JA II, and Wilson WR.
Optimal testing parameters for blood cultures. Clin Infect Dis. 2004; 38:1724–
1730.
Cohen J, Drage S. How I manage haematology patients with septic
shock, Br J Haematol, 2011; 152:380–391.
Collin BA, Leather HL, Wingard JR, Ramphal R. Evolution, incidence, and
susceptibility of bacterial bloodstream isolates from 519 bone marrow transplant
patients. Clin Infect Dis. 2001; 33:947-953.
Cordonnier C, Buzyn A, Leverger G, Herbrecht R, Hunault M, Leclercq R.
Epidemiology and risk factors for gram-positive coccal infections in neutropeia:
toward a more targeted antibiotic strategy. Clin Infect Dis. 2003; 36:149-158.
135
Cordonnier C, Ribaud P, Herbrecht R. Prognostic factors for death due to
invasive aspergillosis after hematopoietic stem cell transplantation: a 1-year
retrospective study of consecutive patients at French transplantation centers, Clin
Infect Dis. 2006; 42:955–63.
Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Kaczmarski EB, Fox
AJ. Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rDNA
PCR. J Clin Microbiol. 2000; 38:1747-52.
Costa SF, Barone AA, Miceli MH, van der Heijden IM, Soares RE, Levin
AS.
Colonization
and
molecular
epidemiology
of
coagulase-negative
Staphylococcal bacteremia in cancer patients: a pilot study. Am J Infect Control.
2006; 34:36-40.
Cunha ML, Sinzato YK, Silveira LV. Comparison of methods for the
identification of coagulase-negative staphylococci. Mem Inst Oswaldo Cruz.
2004; 99:855-860.
Cutler
C,
Antin
JH.
An
overview
of
hematopoietic
stem
cell
transplantation. Clin Chest Med. 2005; 26:517-27.
Davies JK, Guinan EC. An update on the management of severe
idiopathic aplastic anaemia in children. Br J Haematol. 2007; 136:549-564.
Dekker JP and Branda JA. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical
Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newsletter. 2011; 33:87-93.
DesJardin JA, Falagas ME, Ruthazer R, Griffith J, Wawrose D, Schenkein
D. Clinical utility of blood cultures drawn from indwelling central venous catheters
in hospitalized patients with cancer. Ann Intern Med. 1999; 131:641–647.
Desjardin LE, Chen Y, Perkins MD, Teixeira L, Cave MD, Eisenach KD.
Comparison of the ABI 7700 system (TaqMan) and competitive PCR for
quantification of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis. J Clin
Microbiol. 1998; 36:1964-8.
Dhiman N, Hall L, Wohlfiel SL, Buckwalter SP, Wengenack NL.
Performance and cost analysis of matrix-assisted laser desorption ionization-time
136
of flight mass spectrometry for routine identification of yeast. J Clin Microbiol.
2011; 49:1614–1616.
Dierkes C, Ehrenstein B, Siebig S, Linde HJ, Reischl U, Salzberger B.
Clinical impact of a commercially available multiplex PCR system for rapid
detection of pathogens in patients with presumed sepsis. BMC Infect Dis. 2009;
9:126.
Dini G, Castagnola E, Comoli P, van Tol MJ, Vossen JM. Infections after
stem cell transplantation in children: state of the art and recommendations. Bone
Marrow Transplant. 2001; 28:18-21.
Donnely JP, De Paum B. Infections in immunocompromised host: general
principles. In: Mandell L, Bennett J, Doli R, editors. Mandell, Bennett, & Doli:
Principles and practice of infectious diseases. 6th ed. Philadelphia: Churcill
Livingstone. 2005; 3421-3432.
Dorak, MT. Real Time PCR. New Yorh: Taylor & Francis Group. 2006
Cap 5: 93-106.
Doumith M, Warner M, Weinbren M, Livermore DM, Woodford N.
Dissemination of a novel metallo-β-lactamase, NDM-1 (MIM-1) in diverse
Enterobacteriaceae in the UK. 49th Interscience Conference in Antimicrobial
Agents and Chemotherapy (ICAAC). San Francisco - CA, USA. Setembro 12-15,
2009. Poster C1-058.
Dreger P, Corradini P, Kimby E, Michallet M, Milligan D, Schetelig
J,Wiktor-Jedrzejczak W, Niederwieser D, Hallek M, Montserrat E. Indications for
allogeneic stem cell transplantation in chronic lymphocytic leukemia: the EBMT
transplant consensus. Leukemia. 2007; 21:12-17.
Dropa M, Balsalobre LC, LincopanN, Mamizuka EM, Cassettari VC, Matte
GR, Matte MH. Emergence of Klebsiella pneumoniae carrying the novel
extended-spectrum beta-lactamase gene variants bla(SHV-40), bla(TEM-116)
and the class 1 integron-associated bla(GES-7) in Brazil. Clin Microbiol Infect.
2010; 16:630-632.
Dubois V, Arpin C, Noury P, Andre C, Coulange L. and Quentin C.
Prolonged
outbreak
of
infection
due
to
TEM-21-producing
strains
of
137
Pseudomonas aeruginosa and enterobacteria in a nursing home. J. Clin.
Microbiol. 2005; 43:4129-4138.
Dubois D, Grare M, Prere MF, Segonds C, Marty N, Oswald E.
Performances of the MALDI-TOF Mass Spectrometry system VITEK MS for the
Rapid Identification of Bacteria in Routine Clinical Microbiology. J Clin Microbiol.
2012; May 16 [Epub ahead of print].
Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P. Detection of Glycopeptide
Resistance Genotypes and Identification to the Species Level of Clinically
Relevant Enterococci by PCR. J Clin Microbiol. 1995: 33:24–7.
Ecker DJ, Drader JJ, Gutierrez J, Gutierrez A, Hannis JC, Schink A. The
Ibis T5000 Universal Biosensor: An automated platform for pathogen
identification and strain typing. JALA. 2006; 11:341-351.
Eggert US, Ruiz N, Falcone BV, Branstrom AA, Goldman RC, Silhavy TJ,
Kahne D. Genetic basis for activity differences between vancomycin and
glycolipid derivatives of vancomycin. Science. 2001; 294: 361-364.
Einsele H, Hebart H, Roller G, Ffler LRJ, Fer R I, Ller MAC, Bowden AR,
Burik VAJ, Engelhard D, Kanz L, Schumacher U. Detection and Identification of
Fungal Pathogens in Blood by Using Molecular Probes. J Clin Microbiol. 1997;
35:1353–1360.
El Salabi A, Tolemam M, Walsh TR. Novel subclass of a group B1
metallo-β- lactamase, TMB-1, in clinical and non-clinical Gram-negative bacteria
from
Libya.
49th Interscience Conference in Antimicrobial Agents and
Chemotherapy (ICAAC). San Francisco - CA, USA. Setembro 12-15, 2009.
Poster C1-1365.
Engel C, Brunkhorst FM, Bone HG, Brunkhorst R, Gerlach H, Grond S.
Epidemiology of sepsis in Germany: results from a national prospective
multicenter study. Intensive Care Med. 2007; 33:606-618.
Erdem I, Ozgultekin A, Sengoz IA, Ozturk ED, Senbayrak AS, Turan G,
Dincer E, Oguzoglu N, and Goktas P. Bloodstream infections in a medicalsurgical intensive care unit: incidence, aetiology, antimicrobial resistance patterns
138
of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Clin Microbiol Infect. 2009; 15:943946.
Espinel-Ingroff A, Mechanisms of resistance to antifungal agents: yeasts
and filamentous fungi, Rev Iberoam Micol, 2008; 25:101–106.
Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, Yao
JD, Wengenack NL, Rosenblatt JE. Cockerill FR 3rd, Smith TF. Real-Time PCR in
clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol
Rev. 2006; 19:165-256.
Everitt, BS. The Analysis of Contingency Tables. London: Chapman &
Hall. 1992; 136-150.
Exner MM, Lewinski MA. Sensitivity of multiplex real-time PCR reactions,
using the LightCycler and the ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, is
dependent on the concentration of the DNA polymerase. Mol Cell Probes. 2002;
16:351-357.
Fätkenheuer G, Buchheidt D, Cornely OA. Central venous catheter (CVC)
-related infections in neutropenic patients. Ann Hematol. 2003; 82:149–157.
Feinstein AR, Cicchetti DV. High agreement but low kappa: I. The
problems of two paradoxes. J Clin Epidemiol. 1990; 43:543-9.
Fenollar F, and Raoult D. 2007. Molecular diagnosis of bloodstream
infections caused by non-cultivable bacteria. Int. J. Antimicrob. Agents 2007;
30:S7–S15.
Ferraresso M, Berardinelli L. Nosocomial infection in kidney transplant
recipients: a retrospective analysis of a single-center experience. Transplant
Proc. 2005; 37:2495-2496.
Fluit AC, Jones ME, Schimtz FJ, Acar J, Gupta R. Verhoef J and the
SENTRY Participants Group. Antimicrobial susceptibility and frequency of
occurence of clinical blood isolates in Europe from the SENTRY Antimicrobial
Surveillance Program, 1997 and 1998. Clin Infect Dis. 2000; 454-460.
139
Forbes BA, Bombicinob K, Platab K. Unusual form ofoxacillin resistance
in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strains. Diagn Microbiol
Infect Dis. 2008; 61:387–395
Fredricks DN, and Relman DA. Improved amplification of microbial DNA
from
blood
cultures
by
removal
of
the
PCR
inhibitor
sodiumpolyanetholesulfonate. J Clin Microbiol. 1998; 36:2810–2816.
Freifeld AG, Bow EJ, Sepkowitz KA, Michael J. Boeckh JM, Ito IJ, Mullen
CA, Raad II, Rolston VK, Yong JAH, Wingard RJ.Clinical practice guideline for
the use of antimicrobial agents in neutropenic patients with cancer: 2010 update
by the infectious diseases society of America. Clin Infect Dis. 2011; 52:56–93.
Gales AC, Menezes LC, Silbert S, Sader HS. Dissemination in distinct
Brazilian regions of an epidemic carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa
producing SPM metallo-β-lactamase. J Antimicrob Chemother. 2003; 52:699702.
Gales AC, Sader HS, Ribeiro J, Zoccoli C, Barth A, Pignatari AC.
Antimicrobial susceptibility of gram-positive bacteria isolated in Brazilian hospitals
participating in the SENTRY Program (2005-2008). Braz J Infect Dis. 2009;
13:90-98.
Gebert S, Siegel D, and Wellinghausen N. Rapid detection of pathogens
in blood culture bottles by real-time PCR in conjunction with the pre-analytic tool.
MolYsis J Infect. 2008; 57:307–316.
Ghanem G, Hachem R, Jiang Y, Chemaly RF, Raad I. Outcomes for and
risk factors associated with vancomycin-resistant Enterococcus faecalis and
vancomycin-resistant Enterococcus faecium bacteremia in cancer patients. Infect
Control Hosp Epidemiol. 2007; 28:1054–1059.
Giakoupi P, Maltezou H, Polemis M, Pappa O, Saroglou G, Vatopoulos A.
The Greek System for the Surveillance of Antimicrobial Resistance. KPC-2producing Klebsiella pneumonia infections in Greek hospitals are mainly due to a
hyperepidemic clone. Euro Surveill. 2009; 14:1-5.
140
Giesbrecht P, Kersten T, Maidhof H, Wecke J. Staphylococcal cell wall:
morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiol Mol
Biol Rev. 1998; 62:1371-1414.
Giralt S. Allogeneic hematopoietic progenitor cell transplantation for the
treatment of chronic myelogenous leukemia in the era of tyrosine kinase
inhibitors: lessons learned to date. Clin Lymphoma Myeloma. 2007; 7:S102-104.
Girmenia C, Finolezzi E, Federico V, Santopietro M, Perrone S. Invasive
Candida
Infections
in
Patients
With
Haematological
Malignancies
and
Hematopoietic Stem Cell Transplant Recipients: Current Epidemiology and
Therapeutic Options. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2011; 3:013-016.
Goodrich JM, Reed EC, Mori M. Clinical features and analysis of risk
factors for invasive candidal infection after marrow transplantation. J Infect Dis.
1991; 164:731-740.
Goto MJ, Bergamasco DDM, Gonçalves TB, Souza KM, Fermino AF,
Cappellano P, Pereira PAC, Oliveira RDJ. Evolução Epidemiológica das
Bacteremias em Transplante de Células Tronco-Hematopoiéticas. Congresso de
Hematologia. XI Congresso da Sociedade Brasileira de Transplante de Medula
Óssea, 2007, Gramado. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. 2007;
28:84-85.
Gudiol C, Calatayud L, Garcia-Vidal C, Lora-Tamayo J, Cisnal M, Duarte
R, Arnan M, Marin M, Carratalà J, Gudiol F. Bacteraemia due to extendedspectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli (ESBL-EC) in cancer
patients: clinical features, risk factors, molecular epidemiology and outcome, J
Antimicrob Chemother. 2010; 65:333–41.
Gudiol C, Tubau F, Calatayud L, Garcia-Vidal C, Cisnal M, SánchezOrtega I, Duarte R, Calvo M, Carratalà J. Bacteraemia due to multidrug-resistant
Gram-negative bacilli in cancer patients: risk factors, antibiotic therapy and
outcomes, J Antimicrob Chemother. 2011; 66:657–63.
Guiver M, Levi K, Oppenheim B. Rapid identification of Candida species
by TaqMan PCR. J Clin Pathol. 2001; 54:362–366.
141
Hackbarth CJ, Chambers HF. Methicillin-resistant staphylococci: detection
methods and treatment of infections. Antimicrob Agents Chemother. 1989;
33:995-999.
Harada S, Ishii Y, Yamaguchi K. Extended-spectrum beta-lactamases:
implications for the clinical laboratory and therapy. Korean J Lab Med 2008;
28(6):401-412.
Hathon JW, Lyke K. Empirical treatment of febrile neutropenia evolution of
current therapeutic approaches. Clin Infect Dis. 1997; 24:S256-S265.
Hayden RT. In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques. In: Persing
DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang Y-W, Unger ER, Relman DA, White TJ.
Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington DC:
ASM Press; 2004.
Hebart H, Löffler J, Reitze H, Engel A, Schumacher U, Klingebiel T, Bader
P, Böhme A, Martin H, Bunjes D, Kern WV, Kanz L, Einsele H. Prospective
screening by a panfungal polymerase chain reaction assay in patients at risk for
fungal infections: implications for the management of febrile neutropenia. Br J
Haematol. 2000; 111:635-640.
Hernandez JR, Martinez-Martinez L, Canton R, Coque TM, and Pascual
A. Nationwide study of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing
extended-spectrum beta-lactamases in Spain. Antimicrob. Agents Chemother
2005; 49:2122-2125.
Hindiyeh M, Smollan G, Grossman Z, Ram D, Robinov J, Belausov N,
Ben-David D, Tal I, Davidson Y, Shamiss A, Mendelson E, Keller N.Rapid
Detection of blaKPC Carbapenemase Genes by Internally Controlled Real-Time
PCR Assay Using Bactec Blood Culture Bottles. J Clin Microbiol. 2011; 49:24802484.
Hindiyeh, M., Smollen G, Grossman Z, Ram D, Davidson Y, Mileguir F,
Vax M, Ben David D, Tal I, Rahav G, Shamiss A, Mendelson E, Keller N. Rapid
detection of blaKPC carbapenemase genes by real-time PCR. J Clin Microbiol.
2008, 46:2879–2883.
142
Hirakata Y, Izumikawa K, Yamaguchi T, Takemura H, Tanaka H, Yoshida
R, Matsuda J, Nakano M, Tomono K, Maesaki S, Kaku M, Yamada Y, Kamihira
S, and Kohno S. Rapid detection and evaluation of clinical characteristics of
emerging multiple-drug-resistant gram-negative rods carrying the metallo-betalactamase gene blaIMP. Antimicrob Agents Chemother. 1998; 42:2006-2011.
Horan T, Gaynes R. Hospital Epidemiology and Infection Control. 3.
Lippincott, Williams & Wilkeins; Philadelphia: Surveillance of nosocomial
infections. 2004; 1659-1702.
Horn DL, Neofytos D, Anaissie EJ, et al., Epidemiology and outcomes of
candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy
alliance registry, Clin Infect Dis, 2009; 48:1695–703.
Hossain A, Ferraro MJ, Pino RM, Dew RB, III, Moland ES, Lockhart TJ,
Thomson KS, Goering RV, and Hanson ND. Plasmid-mediated carbapenemhydrolyzing enzyme KPC-2 in an Enterobacter sp. Antimicrob Agents Chemother.
2004; 48:4438-4440.
Huang W, Petrosino J, Hirsch M, Shenkin PS, and Palzkill T. Amino acid
sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J. Mol.
Biol.1996; 258:688-703.
Hue FX, Huerre M, Rouffault MA, de Bievre C. Specific detection of
Fusarium species in blood and tissues by a PCR technique. J Clin Microbiol.
1999; 37:2434-2438.
Huletsky A, Knox JR and Levesque RC. Role of Ser-238 and Lys-240 in
the hydrolysis of third-generation cephalosporins by SHV-type beta-lactamases
probed by site-directed mutagenesis and three-dimensional modeling. J of Biol
Chem 1993; 268:3690-3697.
Huss R, Deeg HJ, Gooley T, et al. Effect of mixed chimerism on graftversus-host disease, disease recurrence and survival after HLA-identical marrow
transplantation for aplastic anemia or chronic myelogenous leukemia. Bone
Marrow Transplant. 1996; 18:767-776.
Ikegaya S, Iwasaki H, and Ueda T. Clinical significance of coagulasenegative Staphylococci isolated from blood culture samples of patients with
143
hematological disorders; true bacteremia or contamination. Rinsho Ketsueki.
2010; 51:398-401.
Iwaya A, Nakagawa S, Iwakura N, Tanaeike I, Kurihara M, Kuwano T,
Gondaira F, Endo M, Hatakeyama K, Yamamoto T. Rapid and quantitative
detection of blood Serratia marcescens by real-time PCR assay: Its clinical
application and evaluation in a mouse infection model. FEMS Microbiology
Letters. 2005; 248:163–170.
Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, and Philippon A. Extended broadspectrum beta-lactamases conferring transferable resistance to newer betalactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility
patterns. Rev Infect Dis. 1988; 10:867-878.
Jones RN. Contemporary antimicrobial susceptibility patterns of bacterial
pathogens commonly associated with febrile patients with neutropenia. Clin Infect
Dis. 1999; 29:495-502.
Jordan JA. and Durso MB. Real-Time Polymerase Chain Reaction for
Detecting Bacterial DNA Directly from Blood of Neonates Being Evaluated for
Sepsis. J Mol Diagn. 2005; 7:575-581.
Kaditis AG, O’Marcaigh AS, Rhodes KH, Weaver AL, and Henry NK. Yield
of positive blood cultures in pediatric oncology patients by a new method of blood
culture collection. Pediatr Infect Dis J. 1996; 15:615–620.
Kalogianni PD, Goura S, Aletras JA, Christopoulos KT, Chanos G,
Christowdou M, Skoutelis A, Ioannou CP, Panagiotopoulus E. Dry reagent
dipstick test combined with 23S rRNA PCR for molecular diagnosis of bacterial
infection in arthroplasty. Anal Biochem. 2007; 361:169–175.
Katayama Y, Ito T, and Hiramatsu K. Genetic organization of the
chromosome region surrounding mecA in clinical staphylococcal strains: role of
IS431-mediated mecI deletion in expression of resistance in mecA-carrying, lowlevel methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents
Chemother. 2001; 45:1955-1963.
144
Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K. A new class of genetic element,
staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in
Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44:1549-1555.
Kellogg JA, Manzella JP, Bankert DA: Frequency of low-level bacteriemia
in children from birth to fifteen years of age. J Clin Microbiol 2000, 38(6):21812185.
Klaschik S, Lehmann LE, Raadts A, Book M, Gebel J, Hoeft A, Stuber F.
Detection and diVerentiation of in vitro-spiked bacteria by real-time PCR and
melting-curve analysis. J Clin Microbiol. 2004; 42:512–517.
Klaschik S, Lehmann LE, Raadts A, Book M, Hoeft A, Stuber F. RealTime PCR for Detection and Differentiation of Gram-Positive and Gram-Negative
Bacteria. J Clin Microbiol. 2002b; 40:4304-07.
Klaschik S, Lehmann LE, Raadts A, Hoeft A, Stuber F. Comparison of
different decontamination methods for reagents to detect low concentrations of
bacterial 16S DNA by real-time-PCR. Mol Biotechnol. 2002a; 22:231-42.
Klausegger A, Hell M, Berger A, Zinober K, Baier S, Jones N, et al. Gram
type-specific broad-range PCR amplification for rapid detection of 62 pathogenic
bacteria. J Clin Microbiol. 1999; 37:464-6.
Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and
limitations. TRENDS in Molecular Medicine. 2002; 8:257-60.
Klouche M, Schröder U. Rapid methods for diagnosis of bloodstream
infections. Clin Chem Lab Med. 2008; 46:888-908.
Knothe H, Shah P, Krcmery V, Antal M, and Mitsuhashi S. Transferable
resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical
isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection. 1983;
11:315-317.
Konenan, E. et al. Diagnóstico Microbiológico, Guanabara koogan SA, 6ª
edição, capitulo 12, parte 1, 2006; 618-651.
145
Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, et al., Prospective surveillance for
invasive fungal infections in hematopoietic stem cell transplant recipients, 20012006: overview of the Transplant-Associated Infection Surveillance Network
(TRANSNET) Database, Clin Infect Dis, 2010; 50:1091–100.
Kreger BE, Craven DE, Carling PC, McCabe WR. Gramnegative
bacteremia. III. Reassessment of etiology, epidemiology and ecology in 612
patients. Am J Med. 1980; 68:332–343.
Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, Forootan A, Jonák J, Lind K, et al.
The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspect Med. 2006; 27:95-125.
Kuehnert MJ, Jernigan JA, Pullen AL, Rimland D, Jarvis WR. Association
between mucositis severity and vancomycin-resistant enterococcal bloodstream
infection in hospitalized cancer patients. Infect Control Hosp Epidemiol. 1999;
20:660-663.
Kurupati P, Chow C, Kumarasinghe G, and Poh CL. Rapiddetection of
Klebsiella pneumoniae from blood culture bottles by real-time PCR. J Clin
Microbiol. 2004; 42:1337–1340.
Kuwahara-Araik K, Kondo N, Hori S, Tateda-Suzuki E, Hiramatsu K.
Suppression of methicillin resistance in a mecA containing pre-methicillinresistant Staphylococcus aureus strains caused by the mecI-mediated repression
of PBP 29 production. Antimicrob Agents Chemother. 1996, 40:2680–2685
Laraki N, Franceschini N, Rossolini GM, Santucci P, Meunier C, Pauw E,
Amicosante G, Frere JM, Galleni M. Biochemical characterization of the
101/1477 metallo-β-lactamase IMP-1 produced by
Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother.1999; 43:902-906.
Larianov A, Krause A, Miller W. A standard curve based method for
relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 2005; 6:1–16.
LaRosa DF, Rahman AH, Turka LA. The Innate Immune System in
Allograft Rejection and Tolerance. J Immunol. 2007; 178:7503–7509.
Lauretti L, Riccio ML, Mazzariol A, Cornaglia G, Amicosante G, Fontana
R, Rossolini GM. Cloning and characterization of blaVIM, a new integronborne
146
metallo-betalactamase gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate.
Lee DY, Shannon K, Beaudette LA. Detection of bacterial pathogens in
municipal wastewater using an oligonucleotide microarray and real-time
quantitative PCR. J Microbiol Methods. 2006; 65:453-67.
Lee K, Yum JH, Yong D, Lee HM, Kim HD, Docquier JD, Rossolini GM,
Chong Y. Novel acquired metallo-beta-lactamase gene, blaSIM-1, in a class 1
integron from Acinetobacter baumannii clinical isolates from Korea. Antimicrob
Lehmann LE, Hunfeld KP, Emrich T, Haberhausen G, Wissing H, Hoeft A,
and Stuber F.
A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and
differentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole blood samples.
Med Microbiol Immunol. 2008; 197:313-324.
Leggieri N, Rida A, Franc¸ois P, Schrenzel J. Molecular diagnosis of
bloodstream infections: planning to (physically) reach the bedside. Curr Opin
Infect Di. 2010; 23: 311–319.
Leibovici L, Shraga I, Drucker M, Konigsberger H, Samra Z, Pitlik SD: The
benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream
infection. J Intern Med. 1998; 244:379-386.
Linares L, Cervera C, Hoyo I, Sanclemente G, Marco F, Cofan F, Ricart
MJ, Navasa M, and Moreno A. Klebsiella pneumoniae infection in solid organ
transplant recipients: epidemiology and antibiotic resistance. Transplant Proc.
2010; 42:2941-2943.
Linares L, Garcia-Goez JF, Cervera C, Almela M, Sanclemente G, Cofan
F. Early bacteremia after solid organ transplantation. Transplant Proc. 2009;
41:2262-2264.
Lincopan N, McCulloch JA, Reinert C, Cassettari VC, Gales AC,
Mamizuka EM. First isolation of metallo-β-lactamase-producing multiresistant
Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil. J Clin Microbiol 2005; 43: 516519.
147
Lister PD, Wolter DJ, Hanson ND. Antibacterial-resistant Pseudomonas
aeruginosa: clinical impact and complex regulation of chromosomally encoded
resistancemechanisms. Clin Microbiol Rev. 2009; 22: 582-610.
Livermore DM. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics.
Scand J Infect Dis. 1991; Suppl 78:7-16.
Livermore DM. Cellular location of β-lactamases in relation to antibiotic
resistance. In:Symposium: New horizons in β-lactamases. 6th European
Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Sevilha. 1993; p21.
Livermore DM. Beta-Lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin
Microbio.1995; 8:557-584.
Livermore DM, and Hawkey PM. CTX-M: changing the face of ESBLs in
the UK. J Antimicrob Chemother. 2005; 56:451-454.
Livermore DM. Defining an extended-spectrum beta-lactamase. Clin.
Microbiol. Infect. 2008; 14S1:3-10.
Lodise TP, McKinnon PS, Tam VH, Rybak MJ. Clinical outcomes for
patients with bacteremia caused by vancomycin-resistant Enterococcus in a level
1 trauma center. Clin Infect Dis. 2002; 34:922–929.
Loeffler J, Hebart H, Bialek R, Hagmeyer L, Schmidt D, Serey FP,
Hartmann M, Euckler J, Einsele H. Contaminations occurring in fungal PCR
assays. J Clin Microbiol. 1999; 37:1200-1202.
Loonen AJ, Jansz AR, Kreeftenberg H, Bruggeman CA, Wolffs PF, van
den Brule AJ. Acceleration of the direct identification of Staphylococcus aureus
versus coagulase-negative staphylococci from blood culture material: a
comparison of six bacterial DNA extraction methods. Eur J Clin Microbiol Infect
Dis. 2011; 30:337-42.
Louie RF, Tang Z, Albertson TE, Cohen S, Tran NK, Kost GJ: Multiplex
polymerase chain reaction detection enhancement of bacteremia and fungemia.
Crit Care Med. 2008, 36:1487-1492.
148
Love LJ, Shimpff SC, Schiffer CA, Wiernik PH. Improved prognosis for
granulocytopenic patients with gram-negative bacteremia. Am J Med. 1980;
68:643-648.
Luong ML, Clancy CJ, Vadnerkar A, Kwak EJ, Silveira FP, Wissel MC,
Grantham KJ, Shields RK, Crespo M, Pilewski J, Toyoda Y, Kleiboeker SB,
Pakstis D, Reddy SK, Walsh TJ, Nguyen MH. Comparison of an Aspergillus realtime polymerase chain reaction assay with galactomannan testing
of
bronchoalvelolar lavage fluid for the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis
in lung transplant recipients. Clin Infect Dis. 2011; 52:1218-26.
Maaroufi Y, Bruyne MJ, Duchateau V, Georgala M, Crokaert F. Early
Detection and Identification of Commonly Encountered Candida Species from
Simulated Blood Cultures by Using a Real-Time PCR-Based Assay. J Mol Diagn.
2004; 6:108-114.
Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol
Infect. 2004; 10:190-212.
Mancini N, Carletti S, Ghidoli N, Cichero P, Burioni R, Clementi M. The
Era of Molecular and Other Non-Culture-Based Methods in Diagnosis of Sepsis.
Clin Microbiol Rev. 2010; 23:235-251.
Mancini N, Clerici D, Diotti R, Perotti M, Ghidoli N, De Marco D, Pizzorno
B, Emrich T, Burioni R, Ciceri F, et al. Molecular diagnosis of sepsis in
neutropenic patients with haematological malignancies. J Med Microbiol. 2008,
57:601-604.
Marchandin H, Carriere C, Sirot D, Pierre HJ, and Darbas H. TEM-24
produced by four different species of Enterobacteriaceae, including Providencia
rettgeri, in a single patient. Antimicrob Agents Chemother. 1999; 43:2069-2073.
Martin GS, Mannino DM, Eaton S, and Moss M. The epidemiology of
sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl J Med. 2003;
348:1546–1554.
Martino R, et al. Invasive fungal infections after allogeneic peripheral
blood stem cell transplantation: incidence and risk factors in 395 patients. Br J
Haematol. 2002; 116:475–82.
149
Maschmeyer G, Haas A, The epidemiology and treatment of infections in
cancer patients. Int J Antimicrob Agents. 2008; 31:193–7.
Maschmeyer G, Invasive fungal disease: better survival through early
diagnosis and therapeutic intervention, Expert Rev Anti Infect Ther. 2011; 9:279–
81.
McComas CC, Crowley BM, Boger DL. Partitioning the loss in
vancomycin binding affinity for D-Ala-D-Lac into lost H-bond and repulsive lone
pair contributions. J Am Chem Soc. 2003; 125:9314 -9315.
Meier A, Persing DH, Finken M, Bottger EC. Elimination of contaminating
DNA within polymerase chain reaction reagents: implications for a general
approach to detection of uncultured pathogens. J Clin Microbiol. 1993; 31:646–
652.
Mendes ER, Kiyota AK, Monteiro J, Castanheira M, Andrade SS, Gales
CA, Pignatari CCA, Tufik S. Rapid Detection and Identification of Metallo-βLactamase-Encoding Genes by Multiplex Real-Time PCR Assay and Melt Curve
Analysis. J Clin Microbiol. 2007a; 45:544–547.
Mendes ER, Castanheira M, Toleman MA, Sader HS, Jones RN, Walsh
TR. Characterization of an integron carrying blaIMP-1 and a new aminoglycoside
resistance gene, aac(6')-31, and its dissemination among genetically unrelated
clinical isolates in a Brazilian hospital. Antimicrob Agents Chemother. 2007b;
51:2611-2614.
Mendes ER, Toleman MA, Ribeiro J, Sader HS, Jones RN, Walsh TR.
Integron carrying a novel metallo-beta-lactamase gene, blaIMP-16, and a fused
form of aminoglycosideresistant gene aac(6')-30/aac(6')-Ib': report from the
SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Antimicrob Agents Chemother.
2004; 48:4693-4702.
Miriagou V, Tzouvelekis LS, Rossiter S, Tzelepi E, Angulo FJ, and
Whichard JM.
Imipenem resistance in a Salmonella clinical strain due to
plasmid-mediated
class
A
carbapenemase
KPC-2.
Antimicrob
Agents
Chemother. 2003; 47:1297-1300.
150
Monstein H-J, Östholm-Balkhed, Å, Nilsson V M, Nilsson M, Dornbusch K,
Nilsson E L. Multiplex PCR amplification assay for the detection of blaSHV, blaTEM
and blaCTX-M genes in Enterobacteriaceae. APMIS. 2007; 115:1400–1408.
Monteiro J, Santos AF, Asensi MD, Peirano G, and Gales AC. First report
of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrob Agents
Chemother. 2009; 53:333-334.
Moreno A, Cervera C, Gavald ´a J, et al. Bloodstream infections among
transplant recipients: results of nationwide surveillance in Spain. Am J Trans.
2007; 7:2579-2586.
Morfin-Otero R, Rodriguez-Noriega E, Deshpande LM, Sader HS, and
Castanheira M. Dissemination of a bla(VIM-2)-Carrying Integron Among
Enterobacteriaceae Species in Mexico: Report from the SENTRY Antimicrobial
Surveillance Program. Microb Drug Resist. 2009; 15:33-35.
Morosini MI, Canton R, Martinez-Beltran J, Negri MC, Perez-Diaz JC,
Baquero F, and Blazquez J. New extended-spectrum TEM-type beta-lactamase
from Salmonella enterica subsp. enterica isolated in a nosocomial outbreak.
Morris PG, Hassan T, McNamara M. Emergence of MRSA in positive
blood cultures from patients with febrile neutropenia-a cause for concern, Support
Care Cancer, 2008; 16:1085–8.
Mothershed EA, Wh itney AM. Nucleic acid-based methods for the
detection of bacterial pathogens: present and future considerations for the clinical
laboratory. Clin Chim Acta. 2006; 363:206-20.
Mugnier P, Dubrous P, Casin I, Arlet G, and Collatz E. A TEM-derived
extended-spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob.
Mühl H, Kochem AJ, Disqué C, Sakka SG. Activity and DNA
contamination of commercial polymerase chain reaction reagents for the
universal 16S rDNA real-time polymerase chain reaction detection of bacterial
pathogens in blood. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010; 66:41-49.
151
Muldrew KL, Molecular diagnostics of infectious diseases. Curr Opin
Pediatr. 2009; 21:102–111.
Munday CJ, Xiong J, Li C, Shen D, and Hawkey PM. Dissemination of
CTX-M type beta-lactamases in Enterobacteriaceae isolates in the People's
Republic of China. Int. J Antimicrob Agents. 2004; 23:175-180.
Mylotte JM, Tayara A. Blood cultures: clinical aspects and controversies.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19:157–63.
Nachman JB, Honig GR. Fever and neutropenia in children with
neoplastic disease: an analysis of 158 episodes. Cancer. 1980; 45:407-412.
Naas T, Cuzon G, Truong H et al. Evaluation of a DNA microarray, the
Check-Points ESBL/KPC array, for rapid detection of TEM, SHV, and CTX-M
extended-spectrum b-lactamases and KPC carbapenemases. Antimicrob Agents
Chemother 2010; 54: 3086–3092.
Naas T, Cuzon G, Bogaerts P et al. Evaluation of a DNA microarray
(Check-MDR CT102) for rapid detection of TEM, SHV, and CTX-M extendedspectrum b-lactamases and of KPC, OXA-48, VIM, IMP, and NDM-1
carbapenemases. J Clin Microbiol. 2011; 49:1608–1613.
Navon-Venezia S, Chmelnitsky I, Leavitt A, Schwaber MJ, Schwartz D,
and Carmeli,Y. Plasmid-mediated imipenem-hydrolyzing enzyme KPC-2 among
multiple carbapenem-resistant Escherichia coli clones in Israel. Antimicrob
Neofytos D, Horn D, Anaissie E, et al., Epidemiology and outcome of
invasive fungal infection in adult hematopoietic stem cell transplant recipients:
analysis of Multicenter Prospective Antifungal Therapy (PATH) Alliance registry,
Clin Infect Dis, 2009; 48:265–73.
Neonakis IK, EV Scoulica, SK Dimitriou, AI Gikas, YJ Tselentis. Molecular
epidemiology of extended-spectrum beta-lactamases produced by clinical
isolates in a university Hospital in Greece: detection of SHV-5 in Pseudomonas
aeruginosa and prevalence of SHV-12. Microbial Drug Resistance. 2003; 9:161165.
152
Neuburger S, Maschmeyer G, Update on management of infections in
cancer and stem cell transplant patients, Ann Hematol, 2006; 85:345–56.
Nivoix Y, Velten M, Letscher-Bru V, et al., Factors associated with overall
and attributable mortality in invasive aspergillosis, Clin Infect Dis, 2008; 47:1176–
84.
Nolte FS, Williams JM, Jerris RC, Morello JA, Leitch, Matushek S,
Schwabe LD; Dorigan F, kocka FE. Multicenter Clinical Evaluation of a
Continuous Monitoring Blood Culture System Using Fluorescent-Sensor
Technology (BACTEC 9240). J Clin Microbiol. 1993; 31:552-557.
Nordmann P, and Poirel L. Emerging carbapenemases in Gram-negative
aerobes. Clin Microbiol Infect. 2002; 8:321-331.
Nouér SA, Nucci M, Oliveira MP, Pellegrino FLPC, Moreira BM. Risk
factors for acquisition of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa producing
SPM metallo-β-lactamase. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49:3663-3667.
Nusair A, Jourdan D, Medcalf S et al. Infection control experience in a
cooperative care center for transplant patients. Infect Control Hosp Epidemiol.
2008; 29:424–429.
O’Sullivan EC, Kasai M, Francesconi A, Petraitis V, Petraitiene R, Kelaher
AM, Sarafandi AA, Walsh JT. Development and Validation of a Quantitative RealTime PCR Assay Using Fluorescence Resonance Energy Transfer Technology
for Detection of Aspergillus fumigatus in Experimental Invasive Pulmonary
Aspergillosis J Clin Microbiol. 2003; 5676–5682.
Ohlin A, Bäckman A, Björkqvist M, Mölling P, Jurstrand M, Schollin J.
Real-time PCR of the 16S-rRNA gene in the diagnosis of neonatal bacteraemia.
Acta Paediatr. 2008; 97:1376-80.
Okhravi N, Adamson P, Carroll N, Dunlop A, Matheson MM, Towler HM,
Lightman S. PCR-based evidence of bacterial involvement in eyes with
suspected intraocular infection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000; 41:3474-9.
Oliansky DM, Rizzo JD, Aplan PD. The role of cytotoxic therapy with
hematopoietic stem cell transplantation in the therapy of acute myeloid leukemia
153
in children: an evidencebased review. Biol Blood Marrow Transplant. 2007; 13:125.
Oliveira AL, de Souza M, Carvalho-Dias VM, et al.,Epidemiology of
bacteremia and factors associated with multidrug- resistant gramnegative
bacteremia in hematopoietic stem cell transplant recipients, Bone Marrow
Transplant, 2007; 39:775–81.
Ortega M, Rovira M, Almela M, Marco F, de la Bellacasa JP, Martinez JA.
Bacterial and fungal bloodstream isolates from 796 hematopoietic stem cell
transplant recipients between 1991 and 2000. Ann Hematol. 2005; 84:40-6.
Osano E, Arakawa Y, Wacharotayankun R, Ohta M, Horii T, Ito H,
Yoshimura F, Kato N. Molecular characterization of an enterobacterial metallo βlactamase found in a clinical isolate of Serratia marcescens that shows imipenem
resistance. Antimicrob Agents Chemother. 1994; 38:71-78.
Paganini H, Staffolani V, Zubizarreta P, Casimir L, Lopardo H, Luppino V.
Viridans streptococci bacteraemia in children with fever and neutropenia: a casecontrol study of predisposing factors. Eur J Cancer. 2003; 39:1284-1289.
Pagano L, Caira M, Candoni A. The epidemiology of fungal infections in
patients with hematologic malignancies: the SEIFEM-2004 study, Haematologica,
2006; 91:1068–75.
Pagano L, Caira M, Nosari A. Fungal infections in recipients of
hematopoietic stem cell transplants: results of the SEIFEM B-2004 studySorveglianza Epidemiologica Infezioni Fungine Nelle Emopatie Maligne, Clin
Infect Dis, 2007; 45:1161–70.
Palzkill T, Thomson KS, Sanders CC, Moland ES, Huang W, and Milligan
TW. New variant of TEM-10 beta-lactamase gene produced by a clinical isolate
of proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39:1199-1200.
Parody R, Martino R, Sanchez F, et al., Predicting survival in adults with
invasive aspergillosis during therapy for hematological malignancies or after
hematopoietic stem cell transplantation: Single-center analysis and validation of
the Seattle, French, and Strasbourg prognostic indexes, Am J Hematol. 2009;
84:571–8.
154
Patel R, Paya CV. Infections in solid organ transplantation recipients. Cli
Microbiol Ver. 1997; 10:86-124.
Patel R, Uhl RJ, Kohner P, Hopkins KM, Cockerill RF. Multiplex PCR
Detection of vanA, vanB, vanC-1, and vanC-2/3 Genes in Enterococci. J Clin
Microbiology. 1997; 35:703–707.
Paterson DL, and Bonomo RA. Extended-spectrum beta-lactamases: a
clinical update. Clin Microbiol Rev. 2005; 18:657-686.
Pavez M, Mamizuka EM, Lincopan N. Early dissemination of KPC-2producing Klebsiella pneumonia strains in Brazil. Antimicrob Agents Chemother.
2009; 53:2702.
Payne DJ, Bateson JH, Gasson BC, Khushi T, Proctor D, Pearson SC,
Reid R. Inhibition of metallo-β-lactamases by a series of thiol ester derivatives of
mercaptophenylacetic acid. FEMS Microbiol Lett. 1997a; 157:171-175.
Payne DJ, Bateson JH, Gasson BC, Proctor D, Khushi T, Farmer TH,
Tolson DA, Bell D, Skett PW, Marshall AC, Reid R, Ghosez L, Combret Y,
Marchand- Brynaery J. Inhibition of metallo-β-lactamases by a series of
mercaptoacetic acid thiol ester derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 1997b;
41:135-140.
Peirano G, Seki LM, Val PV, Pinto MC, Guerra LR, and Asensi MD.
Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in Klebsiella pneumoniae
isolated in Rio de Janeiro, Brazil. J Antimicrob Chemother. 2009; 63:265-268.
Pellegrino FLPC, Teixeira LM, Carvalho MGS, Nouér AS, Oliveira MP,
Sampaio JLM, Freitas ADF, Ferreira ALP, Amorim ELT, Riley LW, Moreira BM.
Ocurrence of a multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa clone in different
hospitals in Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol. 2002; 40:2420-2424.
Pereira, CAP. Impacto da Implementação de métodos automatizados em
hemoculturas na evolução clínica de pacientes com infecções de corrente
sanguínea. 109f. Tese (Doutorado em Medicina) – Disciplina de Doença
Infecciosas e Parasitárias, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo. 1997.
155
Perilli M, Segatore B, de Massis MR, Riccio ML, Bianchi C, Zollo A,
Rossolini GM, and Amicosante G. TEM-72, a new extended-spectrum betalactamase detected in Proteus mirabilis and Morganella morganii in Italy.
Person AK, Kontoyiannis DP, Alexander BD. Fungal Infections in
Transplant and Oncology Patients. Infect Dis Clin North Am. 2010; 24:439–459.
Pfaller MA, Jones RN, Doern GV, Kugler K. Bacterial pathogens isolated
from patients with bloodstream infection: frequencies of occurrence and
antimicrobial susceptibility patterns from the SENTRY antimicrobial surveillance
program (United States and Canada, 1997). Antimicrob Agents Chemother.
1998; 42:1762-70.
Pfaller MA, Messer SA, Boyken L. In vitro survey of triazole crossresistance among more than 700 clinical isolates of Aspergillus species, J Clin
Microbiol, 2008; 46:2568–72.
Picão RC, Fehlberg LCC, Barbosa PP, Girardello R, Bauab KC, Gales
AC. Cefotaximases (CTX-M) em Pseudomonas aeruginosa: devemos nos
preocupar? XXV Congresso Brasileiro de Microbiologia. Porto de Galinhas, PE.
Novembro, 8-12. Poster 2009b; A03- 090.
Picão RC, Poirel L, Gales AC, Nordmann P. Further identification of CTXM-2 extended-spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob
Agents Chemother. 2009a; 53:2225-2226.
Picazo JJ. Management of the febrile neutropenic patient: a consensus
conference. Clin Infect Dis. 2004; 15.
Pittet D. Nosocomial bloodstream infections. In: WENZEL, R.P.
Prevention and control of nosocomial infections. 2a ed. Maryland, Willians &
Wilkins. 1993; cap.23:512-55.
Pizzo PA, Hathon JW, Hiemenz J, Browne M, Commers J, Cotton D, et.
al. A randomized trial comparing ceftazidime alone with combination antibiotic
therapy in cancer patients with fever and neutropenia. N Engl J Med. 1986;
315:552-558.
156
Pizzo PA, Robichaud KJ, Wesley R, Commers JR. Fever in the pediatric
and young adult patient with cancer. A prospective study of 1001 episodes.
Medicine (Baltimore). 1982; 61:153-165.
Pizzo PA. Fever in immunocompromised patients. N Engl J Med. 1999;
16:893-900.
Pizzo PA. Granulocytopenia and cancer therapy. Past problems, current
solutions, future challenges. Cancer. 1984; 54:2649-2661.
Poirel L, Lebessi E, Castro M, Fevre C, Foustoukou M, Nordmann P.
Nosocomial outbreak of extended-spectrum beta-lactamase SHV-5 producing
isolates of Pseudomonas aeruginosa
in Athens, Greece. Antimicrob Agents
Chemother. 2004a; 48:2277- 2279.
Poirel L, Magalhaes M, Lopes M, Nordmann P. Molecular analysis of
metallobeta-
lactamase
gene
blaSPM-1-surrounding
disseminated Pseudomonas aeruginosa
sequences
from
isolates in Recife, Brazil. Antimicrob
Agents Chemother. 2004b; 48:1406-1409.
Poirel L, Rodriguez-Martinez J, al Naiemi N, Debets-Ossenkopp Y,
Nodmann P. Characterization of DIM-1, an integrin-encoding metallo-betalactamase from a Pseudomonas stutzeri clinical isolate in the Netherlands.
Poirel L, Rodriguez-Martinez J, Naiemi NA, Debets-Ossenkopp Y,
Nordmann P. Characterization of blaDIM-1, a novel integron-located metallo-βlactamase gene from a Pseudomonas stutzeri clinical isolate in the Netherlands.
Abstracts of the Nineteenth European Congress of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases, 2009: Helsinki, Finland. Basel, Switzerland: European
Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Abstract O-309, p. S69.
Poutsiaka DD, Price LL, Ucuzian A, Chan GW, Miller KB, Snydman DR.
Blood stream infection after hematopoietic stem cell transplantation is associated
with increased mortality. Bone Marrow Transplant. 2007; 40:63–70.
Queenan AM and Bush K. Carbapenemases: the versatile betalactamases. Clin Microbiol Rev. 2007; 20:440-458.
157
Quental B, Luiz CR, Cappellano P, Correa L, Pereira CAP. Epidemiologia
das
infecções
de
corrente
sanguínea
em
pacientes
com
neoplasias
hematológicas em um hospital universitário de São Paulo. VI Congresso PanAmericano e X Congresso Brasileiro de Infecção e Epidemiologia Hospitalar.
Porto Alegre (RS); 2006.
Ramphal R. Changes in the etiology of bacteremia in febrile neutropenic
patients and the susceptibilities of the currently isolated pathogens. Clin Infect
Dis. 2004; 39:S25-31.
Reilly AP, Mcavin CJ, Roudabush MR, Barnes JW, Salmen A, Jackson
WG, Beninga KK, Astorga A, Mccleskey KF, Huff B W, Niemeyer D, Lohman LK.
Sensitive and Specific Method for Rapid Identification of Streptococcus
pneumoniae Using Real-Time Fluorescence PCR. J Clin Microbiol. 2001; 3446–
3451.
Rintala E, Incidence and clinical significance of positive blood cultures in
febrile episodes of patients with hematological malignancies, Scand J Infect Dis,
1994; 26:77–84.
Rocchetti TT. Detecção bacteriana e de genes de resistência a
antimicrobianos pela técnica de PCR em Tempo Real em infecções de corrente
sanguínea de pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos [Mestrado].
São Paulo: Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina;
2011.
Rogers TR, Antifungal drug resistance: limited data, dramatic impact?, Int
J Antimicrob Agents, 2006; 27:7–11.
Rosenau A, Cattier B, Gousset N, Harriau P, Philippon A, and Quentin R.
Capnocytophaga ochracea: characterization of a plasmid-encoded extendedspectrum TEM-17 beta-lactamase in the phylum Flavobacter-bacteroides.
Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44:760-762.
Rossetti ML; da Silva CMD; Rodrigues JJS. Doenças InfecciosasDiagnóstico Molecular. Rio de janiero: Ed Guanabara koogan. 2006 Cap:3:41-46.
Rossolini GM, D'Andrea MM, and Mugnaioli C. The spread of CTX-M-type
extended-spectrum beta-lactamases. Clin Microbiol Infect. 2008; 14:33-41.
158
Rubin M, Hathorn JW, Marshall D, Gress J, Steinberg SM, Pizzo PA.
Gram-positive infections and the use of vancomycin in 550 episodes of fever and
neutropenia. Ann Intern Med. 1998; 108:30-35.
Sabath LD, Abraham EP. Zinc as a cofactor for cephalosporinase from
Bacillus cereus 569. Biochem J. 1966; 98:11C-13C.
Sabet SN, Subramaniam G, Navaratnam P, Sekaran DS . Detection of
mecA and ermA genes and simultaneous identification of Staphylococcus aureus
using triplex real-time PCR from Malaysian S. aureus strain collections
International. J Antimicrobial Agents. 2007; 29:582-585.
Sacha P, Ostas A, Jaworowska J, Wieczorek P, Ojdana D, Ratajczak J,
and Tryniszewska E. The KPC type beta-lactamases: new enzymes that confer
resistance to carbapenems in Gram-negative bacilli. Folia Histochem Cytobiol.
2009; 47:537-543.
Sadelain M, Rivella S, Lisowski L, Samakoglu S, Riviere I. Globin gene
transfer for treatment of the beta-thalassemias and sickle cell disease. Best Pract
Res Clin Haematol. 2004; 17:517-534.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT et al.
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science 1988; 239:487-491.
Saino Y, Kobayashi F, Inoue M, Mitsuhashi S. Purification and properties
of inducible penicillin beta-lactamase isolated from Pseudomonas maltophilia.
Sakai H, Procop GW, Kobayashi N, Togawa D, Wilson DA, Borden L,
Krebs V, Bauer TW. Simultaneous detection of Staphylococcus aureus and
coagulase negative staphylococci in positive blood cultures by real-time PCR with
two fluorescence ressonance energy transfer probe sets. J Clin Microbiol. 2004;
42:5739-5744.
Sakr Y, Sponholz C, Tuche F. The role of procalcitonin in febrile
neutropenic patients: review of the literature. Infection. 2008; 36:396–407.
159
Salabi AE, Toleman M, Walsh TR. Novel subclass of a group B1 metalloβ- lactamase, TMB-1, in clinical and non-clinical Gram-negative bacteria from
Libya. In: Annual Intescience Conference on Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 49., 2009, San Francisco. Anais. Washington: American Society
for Microbiology, 2009.
Salabi AE, Toleman MA, Weeks J, Bruderer T, Frei R, Walsh TR. First
report of the metallo-β-lactamase SPM-1 in Europe. Antimicrob Agents
Chemother. 2010; 54:582.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 1977; 74:5463-5467.
Sautter RL, Bills AR, Lang DL, Ruschell G, Heiter BJ, and Bourbeau PP.
Effects of delayed-entry conditions on the recovery and detection of
microorganisms from BacT/ALERT and BACTEC blood culture bottles. J. Clin.
Microbiol. 2006; 44:1245–1249.
Schabereiter-Gurtner
C,
Rotter
LMSB,
Hirschl
MA, Willinger
B.
Development of Novel Real-Time PCR Assays for Detection and Differentiation of
Eleven Medically Important Aspergillus and Candida Species in Clinical
Specimens. J Clin Microbiol. 2007; 906–914.
Schimpff SC, Young V, Greene E, et al., Origin of infection in acute
nonlymphocytic leukemia: significance of hospital acquisition of potential
pathogens, Ann Intern Med, 1972; 77:707–15.
Schimpff SC. Overview of empiric antibiotic therapy for the febrile
neutropenic patient. Rev Infect Dis. 1985; 7 Suppl 4: S734-S740.
Schwetz I, Hinrichs G, Reisinger EC, Krejs GJ, Olschewski H, and
Krause. Delayed processing of blood samples influences time to positivity of
blood cultures and results of Gram stain-acridine orange leukocyte Cytospin test.
J. Clin. Microbiol. 2007; 45:2691–2694.
Sekiguchi J, Morita K, Kitao T, Watanabe N, Okazaki M, Miyoshi-Akiyama
T, Kanamori M, Kirikae T. KHM-1, a Novel Plasmid-Mediated Metallo-βLactamase from a Citrobacter freundii Clinical Isolate. Antimicrob Agents
Chemother. 2008; 52:4194-4197.
160
Sesso RCC; Lopes AA; Thomé FS; Lugon JR; Burdmann EA. Censo
Brasileiro de Diálise, 2009. J Bras Nefro. 2010; 32:380-384.
Shang S, Chen Z, Yu X. Detection of bacterial DNA by PCR and reverse
hybridization in the 16S rRNA gene with particular reference to neonatal
septicemia. Acta Paediatr. 2001; 90:179-83.
Shannon K, King A, Phillips I. Beta-lactamases with high activity against
imipenem and Sch 34343 from Aeromonas hydrophila. J Antimicrob Chemother.
1986; 17:45-50.
Sharma VK, Hackbarth CJ, Dickinson TM, and Archer GL. Interaction of
native and mutant MecI repressors with sequences that regulate mecA, the gene
encoding penicillin binding protein 2a in methicillin-resistant staphylococci. J.
Bacteriol. 1998; 180:2160-2166.
Shigei JT, Shimabukuro JA, Pezzlo MT, de la Maza LM, and Peterson
EM. Value of terminal subcultures for blood cultures monitored by BACTEC 9240.
J Clin Microbiol. 1995; 33:1385–1388.
Shigemura K, Shirakawa T, Okada H, Tanaka K, Kamidono S, Arakawa
S, Gotoh A. Rapid detection and differentiation of Gram-negative and Grampositive pathogenic bacteria in urine using TaqMan probe. Clin Exp Med. 2005;
4:196-201.
Shore AC, Deasy EC, Slickers P, Brennan G, O'Connell B, Monecke S,
Ehricht R, Coleman DC. Detection of staphylococcal cassette chromosome mec
type XI carrying highly divergent mecA, mecI, mecR1, blaZ, and ccr genes in
human clinical isolates of clonal complex 130 methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55:3765-73.
Siegman-Igra Y, Ravona R, Primerman H e Gillardi M. Pseudomonas
aeruginosa bacteremia: an analysis of 123 episodes, with particular emphasis on
the effect of antibiotic therapy. Int J Infec Dis. 1998; 2:211-5.
Silkie SS, Tolcher MP, Nelson KL. Reagent decontamination to eliminate
false-positives in Escherichia coli qPCR. J Microbiol Methods. 2008; 72:275-82.
161
Silveira GP, Nome, F, Gesser JC, Sá, MM. Estratégias utilizadas no
combate a resistência bacteriana. Quim Nova 2006; 29:844-855.
Singh N, Paterson DL, Gayowski T, Wagner MM, Marino IR. Predicting
bacteremia and bacteremic mortality in liver transplantation recipients. Liver
Transpl 2000; 6:54-61.
Smith JA, Bryce EA, Ngui-Yen JH, and Roberts FJ. Comparison of
BACTEC 9240 and BacT/Alert blood culture systems in an adult hospital. J Clin
Microbiol. 1995; 33:1905–1908.
Sosa V, Schlapp G and Zunino P. Proteus mirabilis isolates of different
origins do not show correlation with virulence attributes and can colonize the
urinary tract of mice. Microbiology. 2006; 152:2149–2157.
Sougakoff W, Goussard S, Gerbaud G, and Courvalin P. Plasmidmediated resistance to third-generation cephalosporins caused by point
mutations in TEM-type penicillinase genes. Rev Infect Dis. 1988; 10:879-884.
Spanik S, Krupova I, Trupi J, Kunová A, Novotny J, Mateicka F, Pichnova
E, Sulcova M, Sabo A, Jurga L, Krcmery Jr. Bacteremia due to multiresistant
Gram-negative bacilli in neutropenic cancer patients: a case-controlled study. J
Infect Chemother. 1999; 5:180-84.
Speers DJ. Clinical applications of molecular biology for infectious
diseases. Clin. Biochem. Rev. 2006; 27:39-51.
Spees EK, Light JA, Oakes DD, and Reinmuth B. Experiences with
cadaver renal allograft contamination before transplantation. Br J Surg. 1982;
69:482-485.
Stals A, Werbrouck H, Baert L, Botteldoorn N, Herman L, Uyttendaele M,
and Van Coillie E. Laboratory efforts to eliminate contamination problems in the
real-time RT-PCR detection of noroviruses. J Microbiol Methods. 2009; 77:72-76.
Stratidis J, Bia FJ, and Edberg SC. Use of real-time polymerase chain
reaction for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly
from positive blood culture bottles. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2007; 58:199–
202.
162
Tenney JH, Reller LB, Mirrett S, Wang WL, and Weinstein MP. Controlled
evaluation of the volume of blood cultured in detection of bacteremia and
fungemia. J Clin Microbiol. 1982; 15:558–561.
Tenover FC. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: a perfect but
geographically limited storm? Clin Infect Dis 200; 46: 675-7.
Tessier F, Arpin C, Allery A, and Quentin C. Molecular characterization of
a TEM-21 beta-lactamase in a clinical isolate of Morganella morganii. Antimicrob
Therese KL, Anand AR, Madhavan HN. Polymerase chain reaction in the
diagnosis of bacterial endophthalmitis. Br J Ophthalmol. 1998; 82:1078-1082.
Thomas ED, Dlume KG, Formam SJ, Appelbaum FR. A history of bone
marrow transplantation In Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Oxford:
Blackwell Publishing; 2004; 3-8.
Timmers GJ, Van der Zwet WC, Simoons-Smit IM. Outbreak of
vancomycin-resistant Enterococcus faecium in a haematology unit: risk factor
assessment and successful control of the epidemic. Br J Haematol. 2002;
116:826–833.
Toleman MA, Simm AM, Murphy TA, Gales AC, Biedenbach DJ, Jones
RN, and Walsh TR. Molecular characterization of SPM-1, a novel metallo-betalactamase isolated in Latin America: report from the SENTRY antimicrobial
surveillance programme. J. Antimicrob Chemother. 2002; 50:673-679.
Trecarichi EM, Tumbarello M, Caira M. Multidrug resistant Pseudomonas
aeruginosa
bloodstream
infection
in
adult
patients
with
hematologic
malignancies, Haematologica. 2011; 96:1–3.
Trecarichi EM, Tumbarello M, Spanu T. Incidence and clinical impact of
extended-spectrum-beta-lactamase (ESBL) production and fluoroquinolone
resistance in bloodstream infections caused by Escherichia coli in patients with
hematological malignancies, J Infect, 2009; 58:299–307.
Tumbarello M, Spanu T, Sanguinetti M, Citton R, Montuori E, Leone F,
Fadda G, and Cauda R. Bloodstream infections caused by extended-spectrum163
beta-lactamase-producing
Klebsiella
pneumoniae:
risk
factors,
molecular
epidemiology, and clinical outcome. Antimicrob Agents Chemother. 2006,
50:498-504.
Turlej A, Hryniewicz W, Empel J. Staphylococcal Cassette Chromosome
mec (SCCmec) Classification and Typing Methods: an Overview. Polish J
Microbiol. 2011; 60:95–103.
Turner PJ. Extended-spectrum beta-lactamases. Clin Infect Dis. 2005;
4:273-275.
Tzouvelekis LS, and Bonomo RA. SHV-type beta-lactamases. Curr
Pharm. 1999; 5:847-864.
Tzouvelekis LS, Tzelepi E, Tassios PT, and Legakis NJ. CTX-M-type
beta-lactamases: an emerging group of extended-spectrum enzymes. Int. J.
Antimicrob. Agents. 2000; 14:137-142.
Upton A, Kirby KA, Carpenter P, et al., Invasive aspergillosis following
hematopoietic cell transplantation: outcomes and prognostic factors associated
with mortality, Clin Infect Dis, 2007;44:531–40.
Vakulenko SB, Toth M, Taibi P, Mobashery S, and Lerner SA. Effects of
Asp-179 mutations in TEMpUC19 beta-lactamase on susceptibility to betalactams. Antimicrob. Agents Chemother. 1995; 39:1878-1880.
Valones MAA, Guimarães RL, Brandão LAC, Souza PRE, Carvalho AAT,
Crovela S. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical
diagnostic fields: a review. Braz J Microbiol. 2009; 40:1-11.
Van Burik JA, Myerson D, Schreckhise RW, and Bowden RA. Panfungal
PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens. J Clin
Microbiol. 1998; 36:1169–1175.
Van de Peer Y, Chapelle S, De Wachter R. A quantitative map of
nucleotide substitution rates in bacterial rRNA. Nucleic Acids Res. 1996;
24:3381-3391.
164
Varani S, Stanzani M, Paolucci M, Melchionda F, Castellani G, Nardi L,
Landini M P, Baccarani M, Pession A, Sambri Vittorio. Diagnosis of bloodstream
infections in immunocompromised patients by real-time PCR. J Infect. 2009
58:346-351.
Vardiman J.W, Brunning RD, Harris NL. Chronic myeloptroliferative
diseases: Introduction. In: Who Health Organization classification of tumours.
Pathology and genetics of tumours of haemopoietic and lymphoid tissues/
editors, edited by J Jaffe et. al. IARC Press: Lyon 2001; 17-19.
Velasco E, Byington R, Martins CSA, Schirmer M, Dias LCM, Gonçalves
VMSC. Bloodstream infection surveillance in a cancer centre: a prospective look
at clinical microbiology aspects. Clin Microbiol Infection. 2004; 10:542-549.
Verweij
PE,
Mellado
E,
Melchers
WJ,
Multiple-triazole-resistant
aspergillosis, N Engl J Med, 2007; 356:1481–3.
Verweij PE, Snelders E, Kema GH. Azole resistance in Aspergillus
fumigatus: a side-effect of environmental fungicide use?, Lancet Infect Dis, 2009;
9:789–95.
Vieira VV, Fonseca EL, Vicente ACP. Metallo-β-lactamases produced by
carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in Brazil. Clin Microbiol Infect.
2005; 11:937.
Vignoli R, Varela G, Mota MI, Cordeiro NF, Power P, Ingold E, Gadea P,
Sirok A, Schelotto F, Ayala JA, Gutkind G. Enteropathogenic Escherichia coli
strains carrying genes encoding the PER-2 and TEM-116 extended-spectrum
beta-lactamases isolated from children with diarrhea in Uruguay. J Clin Microbiol.
2005; 43:2940-2943.
Villegas MV, Lolans K, Correa A, Kattan JN, Lopez JA, and Quinn JP.
First identification of Pseudomonas aeruginosa isolates producing a KPC-type
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase. Antimicrob Agents Chemother. 2007;
51:1553-1555.
Viscoli C, Bruzzi P, Castagnola E, Boni L, Calandra T, Gaya H, et. al.
Factors associated with bacteraemia in febrile, granulocytopenic câncer patients.
The International Antimicrobial Therapy Cooperative Group (IATCG) of the
165
European Organization for Research and Treatment of Câncer (EORTC). Eur J
Cancer. 1994; 30A:430-437.
Viscoli C, Castagnola E. Treatment of febrile neutropenia: what is new?
Curr Opin Infect Dis. 2002; 15:377-82.
Viscoli
C,
EORTC
International
Antimicrobial
Therapy
Group.
Management of infection in cancer patients. studies of the EORTC International
Antimicrobial Therapy Group (IATG), Eur J Cancer, 2002 ;38:S82–7.
Vogelsang GB. Huff CA. Higman MA. Stem cell transplantation. American
Society of Hematology Self-Assessment Program Oxford: Blackwell Publishing.
2005; 273-96.
Walsh TR, Hall L, Assinder SJ, Nichols WW, Cartwright SJ, MacGowan
AP, and Bennett PM. Sequence analysis of the L1 metallo-beta-lactamase from
Xanthomonas maltophilia. Biochim Biophys Acta 1994; 1218:199-201.
Walsh TR, Toleman MA, Poirel L, Nordmann P. Metallo-betalactamases:
the quiet before the storm? Clin Microbiol Rev. 2005; 18: 306-325.
Walsh TR. Clinically significant carbapenemases: an update. Curr Opin
Infect Dis. 2008; 21:367-371.
Walter EA, Bowden RA. Infection in the bone marrow transplant recipient.
Infect Dis Clin North Am. 1995; 9:823-847.
Walther-Rasmussen J, and Hoiby N. Class A carbapenemases. J.
Antimicrob. Chemother. 2007; 60:470-482.
Wang SS, Lee NY, Hsueh PR. Clinical manifestations and prognostic
factors in cancer patients with bacteremia due to extended-spectrum betalactamase-producing Escherichia coli or Klebsiella pneumoniae, J Microbiol
Immunol Infect. 2011; 44:282–8.
Weems JJ, Andremont A, Davis BJ, Tancrede CH, Guiguet M, Padhye
AA, Squinazi F, Martone WJ. Pseudoepidemic of aspergillosis after development
of pulmonary infiltrates in a group of bone marrow transplant recipients. J Clin
Microbiol. 1987; 25:1459-1462.
166
Weinstein MP, Towns ML, Quartey SM, Mirret S, Reimer LG, Parmigiani
G, Reller LB. The clinical significance of positive blood cultures in the 1990s: a
prospective comprehensive evaluation of the microbiology, epidemiology and
outcome of bacteremia and fungemia in adults. Clin Infect Dis. 1997; 24:584-602.
Weinstein MP. Current blood culture methods and systems: clinical
concepts, technology, and interpretation of results. Clin. Infect. Dis. 1996; 23:40–
46.
Weinstock DM, Conlon M, Iovino C, et al., Colonization, bloodstream
infection, and mortality caused by vancomycinresistant Enterococcus early after
allogeneic hematopoietic stem cell transplant, Biol Blood Marrow Transplant,
2007;13:615–21.
Wellinghausen N, Wirths B, Franz AR, Karolyi L, Marre R, Reischl U.
Algorithm for the identification of bacterial pathogens in positive blood cultures by
real-time LightCycler polymerase chain reaction (PCR) with sequence-specific
probes. Diagn Microbiol Infect Dis. 2004; 48:229-41.
Welniak LA, Blazar BR, Murphy WJ. Immunobiology of allogeneic
hematopoietic stem cell transplantation. Annu Rev Immunol. 2007; 25:139-170.
Werner AS, Cobbs CG, Kaye D, Hook EW. Studies on the bacteremia of
bacterial endocarditis. JAMA. 1967; 202:199–203.
Werner G, Coque TM, Hammerum AM, Hope R, Hryniewicz W, Johnson
A, Klare I, Kristinsson KG, Leclercq R, Lester CH, Lillie M, Novais C, OlssonLiljequist B, Peixe LV, Sadowy E, Simonsen GS, Top J, Vuopio-Varkila J,
Willems RJ, Witte W, Woodford N. Emergence and spread of vancomycin
resistance among enterococci in Europe. Euro Surveill 2008; 13: pii19046.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. in PCR Protocols: A guide to methods
and applications, ed. M. A. Innis, Gelfand, DH, Sninsky JJ, With TJ. Academic
Press, San Diego, 1990, :315-322.
Winokur PL, Canton R, Casellas JM, and Legakis N. Variations in the
prevalence
of
strains expressing
an extended-spectrum
beta-lactamase
phenotype and characterization of isolates from Europe, the Americas, and the
Western Pacific region. Clin Infect Dis. 2001; 3:94-103.
167
Wisplinghoff H, Seifert H, Wenzel RP. Current trends in the epidemiology
of nosocomial bloodstream infections in patients with hematological malignancies
and solid neoplasms in hospitals in the United States, Clin Infect Dis. 2003;
36:1103–10.
Witte T, Suciu S, Brand R, Muus P, Kroger N. Autologous stem cell
transplantation in myelodysplastic syndromes. Semin Hematol. 2007; 44:274277.
Woo PC, Lau SK, Teng JL, Tse H, Yuen KY. Then and now: use of 16S
rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria
in clinical microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. 2008; 14:908-934.
Woodford N, Tiemo PM, Young K, Tysall L, Palepou MFI, Ward E, Painter
RE, Suber DF, Shungu D, Silver LL, Inglima K, Komblum J, Livermore DM.
Outbreak of Klebsiella pneumonia producing a new carbapenem-hydrolyzing
class A β-lactamase, KPC-3, in a New York Medical Center. Antimicrob Agents
Chemother. 2004; 48:4793-4799.
Wu YD, Chen LH, Wu XJ, Shang SQ, Lou JT, Du LZ, Zhao ZY. Gram
stain-specific-probe-based real-time PCR for diagnosis and discrimination of
bacterial neonatal sepsis. J Clin Microbiol. 2008; 46:2613-9.
Xavier DE, Gales AC, Mendes RE, Pignatari ACC, Filho LS, Cirilo LF,
Castanheira M. IMP-18-Producing Pseudomonas aeruginosa (PSA): increasing
diversity of mobile metallo-beta-lactamase (MBL) in Brazil. 46th Intescience
Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC). San Francisco
- CA. Setembro, 27-30, 2007. Poster C2-419.
Yanagihara K, Kitagawa Y, Tomonaga M, Tsukasaki K, Kohno S, Seki M,
Sugimoto H, Shimazu T, Tasaki O, Matsushima A, Ikeda Y, Okamoto S, Aikawa
N, Hori S, Obara H, Ishizaka A, Hasegawa N, Takeda J, Kamihira S, Sugahara K,
Asari S, Murata M, Kobayashi Y, Ginba H, Sumiyama Y, and Kitajima M.
Evaluation of pathogen detection from clinical samples by real-time polymerase
chain reaction using a sepsis pathogen DNA detection kit. Crit Care. 2010;
14:R159.
168
Yang S, Ramachandran P, Hardick A, Hsieh YH, Quianzon C, Kuroki M
et. al. Rapid PCR-based diagnosis of septic arthritis by early Gram-type
classification and pathogen identification. J Clin Microbiol. 2008;46:1386-90.
Yigit, H, Queenan AM, Anderson GJ, Domenech-Sanchez A, Biddle JW,
Steward CD, Alberti S, Bush K, Tenover FC. Novel carbapenem-hydrolyzing
betalactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella
pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45:1151–1161. (Erratum,
52(2): 809, 2008.).
Yong D, Bell JM, Ritchie B, Pratt R, Toleman MA, Walsh T R. A novel
subgroup
metallo-β-lactamase
aeruginosa
(MBL),
AIM-1
emerges
in
Pseudomonas
(PSA) from Australia. In: Annual Intescience Conference on
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47, 2007, Chigaco. Anais Washington:
American Society for Microbiology, 2007a.
Yong D, Bell JM, Ritchie B, Pratt R, Toleman MA, Walsh TR. A Novel
Sub- Group Metallo-β-Lactamase (MβL), AIM-1 Emerges in Pseudomonas
aeruginosa (PSA) from Australia. 47th Interscience Conference in Antimicrobial
Agents and Chemotherapy (ICAAC). Chicago, IL, USA. Setembro 17-20, 2007b.
Poster C1-539.
Yong D, Toleman MA, Giske CG, Cho HS, Sundman K, Lee K, Walsh TR.
Characterization of a new metallo-β-lactamase gene, blaNDM-1, and a novel
erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella
pneumoniae Sequence Type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother. 2009;
53: 5046-5054.
Zaragoza R, Artero A, Camarena JJ, Sancho S, Gonzalez R, and
Nogueira JM. The influence of inadequate empirical antimicrobial treatment on
patients with bloodstream infections in an intensive care unit. Clin Microbiol
Infect. 2003; 9:412-418.
Zavascki AP, Carvalhaes CG, Picão RC, Gales AC. Multi-drug resistant
Pseudomonas
aeruginosa
and
Acinetobacter
baumannii
:
resistance
mechanisms and implications for therapy. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010;
8:71-93.
169
Zavascki AP, Gaspareto PB, Martins AF, Gonçalves AL, Barth AF.
Outbreak of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa producing SPM-1
metallo-β- lactamase in a Teaching Hospital in Southern Brazil. J Antimicrob
Chemother. 2005; 56:1148-1151.
Zavascki AP, Machado AB, Oliveira KR, Superti SV, Pilger DA, Cantarelli
W, Pereira PR, Lieberkmecht AC, Barth AL. KPC-2-producing Enterobacter
cloacae in two cities from Southern Brazil. Int J Antimicrob Agents. 2009; 34:286288.
Zhang K, McClure JA, Elsayed S, Louie T, and Conly JM. Novel multiplex
PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal
cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. J Clin Microbiol. 2005; 43:5026-5033.
Zhu W, Clark NC, McDougal LK, Hageman J, McDonald LC, Patel JB.
Vancomycin resistant Staphylococcus aureus isolates associated with inc18-like
vanA plasmids in Michigan. Antimicrob Agents Chemother. 2008; 52: 452-457.
Ziegler R, Johnscher I, Martus P, Lenhardt D, and Just. HM. Controlled
clinical laboratory comparison of two supplemented aerobic and anaerobic media
used in automated blood culture systems to detect bloodstream infections. J Clin
Microbiol. 1998; 36:657–661.
Zinner SH, Changing epidemiology of infections in patients with
neutropenia and cancer: emphasis on gram-positive and resistant bacteria, Clin
Infect Dis, 1999; 29:490–4.
Zirakzadeh A, Patel R. Vancomycin-Resistant Enterococci: Colonization,
Infection, Detection, and Treatment. Clin Proc. 2006; 81:529-36.
170
ABSTRACT
9. ABSTRACT
Early identification of pathogens and antimicrobial resistance of bloodstream
infections
(BSI)
decrease
morbidity
and
mortality,
particularly
in
immunocompromised patients. The study was design to detect 17 pathogens and
10 antimicrobial resistance genes from blood cultures bottles (BC) by real time
polymerase chain reaction (qPCR). Methods: The limit of detection (LoD) and
cutoff were evaluated according to CLSI documents EP-17, EP-12 and GP-10.
The clinical sensitivity and specificity were calculated in a receiver operating
characteristic (ROC) curve. A total of 160 BC and 33 whole blood collected from
bone marrow transplant patient were screened with Gram-specific probes by
multiplex real time and seventeen genus-specific sequences using TaqMan
probes and blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB and
mecA resistance genes by SYBR Green method. Results: The assays were able
to detect the target genes to a corresponding dilution of 15 to 1.5 CFU for
reaction. For microorganism such as coagulase negative Staphylococcus (ConS),
(30,9), Stenotrophomonas maltophilia (31,6) and Escherichia coli (32,6) lower
LoD Ct values were detected. The area under the ROC curve showed a
satisfactory performance above 0.70 for most genes studied. The sensitivity by
ROC curve was above 80% for blaKPC and 16S rDNA Gram positive genes and
below 60% for blaTEM, blaSHV and vanB genes. Twenty four of 33 samples were
concordantly positive by BC and real time PCR. Pathogens identification were
discordant in 13 cases. In 12 of 15 CoNS the mecA gene was detected and 4
Enterococcus spp. were positive for vanA. Two blaCTX and three blaSHV genes
were detected by qPCR. The blaKPC and metallo-β-lactamase genes were not
detected. Five fungi species were identified only in qPCR. Considering the
phenotypic results the empirical antimicrobial treatment was inadequate in 66.6%
of BSI, 33.3% were still inappropriate after the result of the Gram stain, and
171
ABSTRACT
6.66% remained inadequate after the final blood culture with the antibiogram.
Conclusion: The real time PCR could be a valuable complementary tool in the
management of BSI in bone marrow transplants patients allowing early
identification of pathogens and antimicrobial resistance genes.
172
ANEXOS
10. ANEXOS
ANEXO I – Ficha médica preechida pelo serviço de racionalização de
antimicrobianos de vigilância de hemoculturas do HSP e IOP/GRAACC
FICHA EPIDEMIOLÓGICA - HSP
Nome do Paciente:
DN:
Sexo:
Hospital:
RH:
Data da Bacteremia :
Unidade de Internação:
Data da Internação:
RG LAB:
Co-morbidades:
□ DM
□ HAS
□ Dça Pulmonar
□ Dça Cardíaca
□ Dça Neurológica
□ Dça Ap. gastrointestinal □ Dça ap genito-urinário
□ Neoplasias
□ outras:
Doença de Base:
Fatores de Risco: □ Cateter Intravasc. □ IFI □ Infecção Viral □ Proc. Cirúrgicos □ Diálise
Foco da Infecção: □ ICSRC □ ICS primaria □ ICS secundaria:
Tipo de Tx: □ Autólogo □ Alogênico
Data do Tx:
Profilaxia GVHD:
Uso de Corticóide:
Sim □ Não
Neutropenia (NT< 500):
Condicionamento:
GVHD: □ Sim □ Não Data:
□
Internação prévia recente: □ Sim □ Não (<30 dias)
UTI: □ Sim □ Não
Paciente estava em uso de antibiótico antes da HMC positiva? □ SIM
□ NÃO
Antibioticoterapia em uso por 48 horas antes do resultado da HMC:
Adequação da Antibioticoterapia após GRAM
Data da entrada do exame:
Data da entrada do exame
Data da validação:
Data do recebimento do resultado pelo
médico:
Data do recebimento do resultado pelo
médico:
Resultado:
Houve Adequação da antibioticoterpia após GRAM? □ SIM
□ NÂO
Qual (s) antibiótico (s)?
Houve Adequação da antibioticoterpia após HMC?
□ SIM
□ NÂO
Qual (s) antibiótico (s)?
Terapia após resultado da HMC? : □ ADEQUADA
□ INADEQUADA
Óbito
Data:
□ SIM □ NÃO
Alta □ SIM □ NÃO
□ CORRIGIDA
Data:
173
ANEXOS
IOP/GRAACC – VIGILÂNCIA DE INFECÇÕES DA CORRENTE SANGUÍNEA:
Nome:______________________________________________RG:______________
Data de nascimento: ___/___/___
Sexo: M
ENF AMB  UTI H. Dia
F
TMO
Data da Internação: ___/___/___
Doença de base:



Leucemia Linfóide Aguda

Doença de Hodgkin I
IV
Leucemia Mielóide Aguda
Linfoma Não Hodgkin I
III IV
II
II
III





Osteossarcoma
Sarcoma de Ewing
Tu do SNC
Outros:___________________
TMO:______________________
________________________
 Sim
 Não
QT:______ dias
Cateteres:  Sim  Não Qual?  Intracath  Port-a-cath  Duplo lúmen outros_____
Neutropenia
Cirurgia Prévia (até 30 dias antes da bacteremia)?
 Sim
 Não
Uso prévio de Antimicrobianos antes da bacteremia:
Sim
 Não
Qual?______________________________ PQ?_____________________________
Antibióticos em uso:
 Ceftriaxona
 Ceftazidima
 Cefepime
 Vancomicina
 Amicacina
 Metronidazol
 Meropenem
 Anfotericina B
Outros: (especificar)___________________________________________________
Quadro Clínico:
 Febre
 Diarréia
 Mucosite
 Vomitos
 Outros (especificar)___________________________________
Análise da Bacteremia:  <72h  >72h (em relação à internação)
 Sepse
 Choque séptico
 Sepse grave  Vigilância
Data da coleta:___/___/____
Data da avaliação: ___/___/____
Resultado parcial:  BG-  BG+  CG+  leveduras
 outros : _____________
Conduta:  alterada
 mantida
 não avaliada
Se foi alterada:
 iniciar  substituir  associar  alterar a dose  suspender
Qual antibiótico?_______________________________________________________
 Bacteremia primária Associada a cateter  Sim  Não
 Bacteremia secundária:  pulmonar  urinária  sítio cirúrgico  pele  outros:_____
Bacteremia polimicrobiana  Sim
 Não
Agente:
1___________________________
2___________________________
3___________________________
4___________________________
 G+
 G+
 G+
 G+




GGGG-




fungo
fungo
fungo
fungo
Tempo de cresc_____
Tempo de cresc_____
Tempo de cresc_____
Tempo de cresc_____
Status: (até 30 dias)  Vivo

óbito: ___/___/____
Terapia  correta  corrigida inadequada
174
ANEXOS
ANEXO II - Tabela 16.
Tabela 16: Resultados das técnicas de PCR para 160 amostras dos frascos de hemocultura e 33 amostras de sangue total, identificação pela
34,36
I
R
R
R
I
S
S
R
S
I
ND
29
1013699
04/12/2008
13:49
P
N
N
N
31,9
I
R
R
R
I
S
S
R
S
I
ND
37
1013699
04/12/2008
13:50
P
N
N
30,2
16,6
I
R
R
R
I
S
S
R
S
I
blaSHV
14 EDTA
1013699
04/12/2008
NI
NT
P
N
N
N
38
61GR
2839699
26/03/2011
NI
E. coli
P
N
N
31,2
E. coli
34,50
S
S
R
R
S
S
S
66GR
2858507
31/03/2011
NI
S. epidermidis
P
N
24,6
N
SCoN
6,19
S
S
7GR
2864253
04/11/2010
NI
A. baumannii
P
N
N
N
A. baumannii
S
S
68GR EDTA
2876050
11/04/2011
NI
NT
P
N
N
N
89GR
2876050
11/04/2011
NI
NHCBA
P
N
N
N
47GR EDTA
2898156
11/04/2011
NI
NT
P
N
N
N
77GR EDTA
2913837
NI
NI
NT
P
N
N
N
94GR
2921521
12/04/2011
NI
NHCBA
P
N
N
N
36
R
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
23,3
91,4
11,5
72,17
ND
mecA
R
Tm Gene Resistência PCR SYBR
Green
Ct Gene Resistência PCR SYBR
Green
N
Gene Resistência PCR SYBR
Green
AMIC
AMX+CL
N
TIG
PIP/TAZ
N
AZT
IMI
MER
P
AMP/SUL
CEFP
ESTR
CEFT
13:50
CLOR
CIP
CEFAZ
04/12/2008
FOX
GEN
1013699
VAN
24
LINZ
N
TEIC
N
CLIN
Ct PCR Real Time GN
N
PEN
Ct PCR Real Time GP
P
AMP
Ct Fungo PCR SYBR Green C
NHCBA
OXA
Controle Interno PCR SYBR
Green
20:43
Ct PCR Real Time Especifico
Hora
02/11/2008
PCR Real Time Especifico
Data
1013699
Tm Fungo PCR SYBR Green
RHHSP
11
Cultura/ PHOENIX®
Nº Amostra
cultura e antibiograma pelo sistema automatizado, PCR em Tempo Real para os genes estudados.
ND
175
10080394
18/12/2008
22:18
NHCBA
P
N
N
N
ND
57
10080394
18/12/2008
22:17
NHCBA
P
N
N
22,2
16
10080394
21/12/2008
15:36
NHCBA
P
N
N
N
ND
12 EDTA
10080394
21/12/2008
NI
NT
P
N
N
N
ND
26
10080394
21/12/2008
15:37
NHCBA
P
N
N
22,5
418
10080394
21/02/2009
19:18
NHCBA
P
N
N
N
5 EDTA
10080394
21/02/2009
NI
NT
P
38,9
33,6
N
SCoN /Candida sp
33,05 /5,5
421
10080394
21/02/2009
19:19
NHCBA
P
N
36,5
N
SCoN /Candida sp
33,0 /7,84
423
10080394
21/02/2009
19:17
NHCBA
P
N
34,5
N
SCoN/ND
45
10101119
01/03/2009
20:33
NHCBA
P
N
11
10
SCoN
49
10101119
01/03/2009
20:33
NHCBA
P
N
N
N
ND
41
10101119
06/03/2009
23:56
NHCBA
P
N
N
N
445
10101119
09/10/2009
01:26
SCoN
P
28,1
27,3
N
84
83,4
K. pneumoniae
K. pneumoniae
SCoN / SI
20,01
21,0
34,0
9,34
Green
34
Green
ND
Green
N
TIG
N
AZT
N
AMP/SUL
P
AMIC
NHCBA
AMX+CL
22:18
PIP/TAZ
18/12/2008
ESTR
10080394
33
CLOR
N
IMI
N
MER
N
FOX
P
CEFP
NHCBA
CEFT
23:10
10080394
CIP
09/12/2008
36
CEFAZ
N
GEN
N
VAN
N
09/12/2008
LINZ
P
10080394
TEIC
NHCBA
28
CLIN
23:11
19/05/2011
PEN
N
2921521
AMP
N
88GR
OXA
N
NI
Ct PCR Real Time GN
P
12/04/2011
Ct PCR Real Time GP
NHCBA
2921521
N
49GR EDTA
Cultura/ PHOENIX®
N
Hora
N
Data
P
RHHSP
NT
Nº Amostra
Green
ANEXOS
-
-
-
blaCTX
38,8
92,39
-
-
-
blaCTX
36
88,61
blaSHV
35,7
92,23
-
-
-
mecA
35,8
71,3
ND
S
S
S
S
S
S
176
83,4
11/10/2009
19:28
NHCBA
P
10101119
11/10/2009
19:29
NHCBA
560
10101119
20/12/2009
17:39
568
10101119
20/12/2009
570
10101119
559
Green
27,3
Green
P
Cultura/ PHOENIX®
SCoN
Green
553
01:28
S
S
S
S
S
S
mecA
36,5
71,12
S
S
R
R
mecA
12,7
72,17
-
-
-
-
-
-
-
-
-
N
Aspergillus sp
33,4
27
N
SCoN / SI
9,77
N
N
N
P
N
N
N
Citrobacter freundii
P
N
28,2
21,6
SCoN
8
17:40
SCoN
P
N
29
N
SCoN
9,33
01/01/2010
23:05
NHCBA
P
N
N
N
10101119
09/01/2010
11:22
NHCBA
P
33
N
N
Aspergillus sp
31,8
591
10101119
09/01/2010
22:30
NHCBA
P
N
N
N
ND
440
10104167
23/08/2009
18:00
NHCBA
P
32,9
N
N
ND SI
533
10104167
23/08/2009
18:01
NHCBA
P
N
N
N
ND
498
10104167
31/08/2009
12:34
NHCBA
P
N
N
N
499
10104167
31/08/2009
12:33
NHCBA
P
N
N
N
503
10104167
25/09/2009
15:44
NHCBA
P
N
N
N
500
10104167
28/09/2009
07:11
NHCBA
P
N
N
N
84,7
82,9
R
R
S
R
S
S
S
S
S
S
TIG
10101119
N
AZT
548
86,9
AMP/SUL
09/10/2009
23,6
AMIC
10101119
P
AMX+CL
450
NT
71,09
PIP/TAZ
NI
N
34,9
ESTR
26/01/2009
N
mecA
CLOR
10101119
N
S
IMI
16 EDTA
P
S
MER
NHCBA
S
FOX
14:04
S
CEFP
26/01/2009
N
S
CEFT
10101119
N
CIP
23
N
S
CEFAZ
P
GEN
NHCBA
VAN
19:19
8,35
SCoN / SI
LINZ
29/11/2008
N
TEIC
10101119
27,6
CLIN
25
83,4
PEN
26,5
AMP
P
OXA
SCoN
Green
01:27
Hora
09/10/2009
Ct PCR Real Time GN
Data
10101119
Ct PCR Real Time GP
RHHSP
446
Nº Amostra
ANEXOS
ND
177
Green
Green
Green
N
ND
-
-
-
404
10167776
06/05/2009
13:57
NHCBA
P
N
N
N
ND
-
-
-
327
10167776
06/06/2009
22:57
P
N
N
N
ND
R
R
R
S
R
vanA
-
-
337
10167776
06/06/2009
22:59
P
N
N
N
ND
R
R
R
S
R
vanA
340
10167776
06/06/2009
18:49
P
N
N
N
Enterococcus spp
R
R
R
R
R
vanA
324
10167776
09/06/2009
10:41
NHCBA
P
N
N
N
ND
19 EDTA
10167776
09/06/2009
NI
NT
P
N
N
N
Enterococcus spp
328
10167776
09/06/2009
11:14
NHCBA
P
N
35,5
N
ND
-
-
-
334
10167776
09/06/2009
11:15
NHCBA
P
N
N
N
ND
17
10176141
05/12/2008
14:34
NHCBA
P
N
N
N
-
-
-
24 EDTA
10176141
05/12/2008
NI
NT
P
N
N
N
22:20
Streptococcus
pneumoniae
P
N
N
N
ND
N
N
N
N
474
10176141
02/08/2009
30,15
37,06
TIG
N
AZT
39,8
AMP/SUL
P
AMIC
NHCBA
AMX+CL
13:51
PIP/TAZ
06/05/2009
ESTR
10167776
CLOR
397
IMI
N
MER
N
FOX
N
CEFP
P
CEFT
NHCBA
CIP
07:12
CEFAZ
28/09/2009
GEN
10104167
VAN
510
LINZ
N
TEIC
N
CLIN
Ct PCR Real Time GN
N
PEN
Ct PCR Real Time GP
P
AMP
NHCBA
OXA
Green
07:11
Hora
28/09/2009
Data
10104167
RHHSP
502
Cultura/ PHOENIX®
Nº Amostra
ANEXOS
ND
S
S
S
S
S
ND
S
ND
-
-
483
10176141
02/08/2009
22:17
Streptococcus
pneumoniae
7
10195656
23/10/2008
18:10
NHCBA
P
35,8
83,1
N
N
ND
-
-
-
10
10195656
23/10/2008
18:09
NHCBA
P
34,9
86,4
N
N
ND
-
-
-
23 EDTA
10195656
23/10/2008
NI
NT
P
25,5
86,7
N
N
SI
29,31
S
S
S
S
178
48
10195656
22/11/2008
15:25
NHCBA
P
N
N
N
42
10209754
30/01/2009
17:27
NHCBA
P
N
N
N
30
10209754
04/02/2009
18:48
NHCBA
P
N
N
N
18 EDTA
10209754
04/02/2009
NI
NT
P
N
N
N
39
10209754
04/02/2009
18:50
NHCBA
P
N
N
N
40
10209754
04/02/2009
18:49
NHCBA
P
N
N
N
27
10209754
08/02/2009
23:27
NHCBA
P
N
N
N
ND
32
10209754
08/02/2009
23:28
NHCBA
P
N
N
N
ND
8 EDTA
10209754
08/02/2009
NI
NT
P
N
N
N
ND
46
10209754
08/02/2009
23:29
NHCBA
P
N
7,04
N
ND
Klebsiella
pneumoniae
P
N
N
21
ND
NT
P
30,2
86,3
N
N
Aspergillus sp
31,21
86,6
N
N
Enterococcus sp/ SI
18,32
ND
8
10209754
02/03/2009
07:23
21 EDTA
10209754
02/03/2009
NI
501
10211977
28/09/2009
16:30
P
37,4
515
10211977
28/09/2009
16:29
N
N
N
N
47
10214056
23/02/2009
14:50
NHCBA
P
N
N
N
R
R
R
R
S
S
S
S
Green
ND
Green
N
Green
N
84,8
TIG
38,9
AZT
P
AMP/SUL
NHCBA
AMIC
16:47
AMX+CL
20/11/2008
PIP/TAZ
10195656
ESTR
22
CLOR
ND
IMI
N
MER
N
FOX
N
CEFP
P
CEFT
NHCBA
CIP
16:46
CEFAZ
20/11/2008
GEN
10195656
VAN
20
LINZ
N
TEIC
N
CLIN
Ct PCR Real Time GN
N
PEN
Ct PCR Real Time GP
P
AMP
NHCBA
OXA
Green
13:43
Hora
14/11/2008
Data
10195656
RHHSP
35
Cultura/ PHOENIX®
Nº Amostra
ANEXOS
-
-
-
blaSHV
35,3
92,07
R
R
S
S
S
S
S
S
N
R
S
S
S
S
S
S
N
179
Green
Green
N
-
-
-
23/04/2009
19:32
NHCBA
P
N
N
N
10214884
01/05/2009
23:05
NHCBA
P
N
N
N
ND
-
-
-
410
10214884
01/05/2009
23:04
NHCBA
P
34,7
N
N
NT
-
-
-
419
10214884
01/05/2009
23:05
NHCBA
P
N
N
N
ND
-
-
-
412
10214884
02/05/2009
18:51
NHCBA
P
32,7
N
N
Candida albicans
26,99
-
-
-
424
10214884
02/05/2009
18:50
NHCBA
P
N
N
N
ND
396
10214884
04/05/2009
20:18
NHCBA
P
38,1
82,9
N
N
Candida albicans
17,11
-
-
-
398
10214884
04/05/2009
19:53
NHCBA
P
36,4
84,4
N
N
NT
-
-
-
413
10214884
04/05/2009
19:57
NHCBA
P
36,1
84,4
N
N
ND/SI
331
10214884
11/05/2009
16:35
NHCBA
P
N
N
N
-
-
-
59
10214056
07/03/2009
01:10
NHCBA
P
N
370
10214056
04/05/2009
19:59
NHCBA
P
542
10214056
02/07/2009
13:58
NHCBA
415
10214884
23/04/2009
19:32
420
10214884
23/04/2009
430
10214884
400
N
Cultura/ PHOENIX®
N
84,9
86,6
TIG
N
P
AZT
N
NHCBA
AMP/SUL
P
01:13
AMIC
NHCBA
07/03/2009
AMX+CL
19:32
10214056
PIP/TAZ
-
52
ESTR
-
N
CLOR
-
N
IMI
N
N
MER
N
P
FOX
N
NHCBA
CEFP
P
22:13
CEFT
NHCBA
01/03/2009
CIP
N
10214056
CEFAZ
N
43
GEN
N
N
VAN
P
N
LINZ
N
N
TEIC
N
P
CLIN
N
NHCBA
PEN
-
14:53
AMP
-
23/02/2009
OXA
-
10214056
N
55
N
Ct PCR Real Time GN
-
Ct PCR Real Time GP
-
-
Green
N
Hora
-
Data
-
RHHSP
-
Nº Amostra
Green
ANEXOS
180
S
S
S
S
409
10218246
25/01/2009
15:33
SCoN
P
N
N
N
ND
R
S
S
S
S
6
10218402
08/03/2009
15:44
NHCBA
P
N
N
N
04 EDTA
10218402
08/03/2009
NI
NT
P
N
N
N
09 EDTA
10218402
08/03/2009
NI
NT
P
N
N
N
14
10218402
14/03/2009
15:17
NHCBA
P
N
N
N
ND
2 EDTA
10218402
14/03/2009
NI
NT
P
N
N
N
ND
508
10226726
20/06/2009
00:01
NHCBA
P
N
N
N
511
10226726
20/06/2009
00:02
NHCBA
P
N
N
N
19
10228083
02/12/2008
16:09
NHCBA
P
N
N
N
20 EDTA
10228083
02/12/2008
NI
NT
P
N
N
N
4
10228083
14/12/2008
20:11
NHCBA
P
N
N
N
13 EDTA
10228083
14/12/2008
NI
NT
P
N
N
N
38
10228083
14/12/2008
20:13
NHCBA
P
N
N
N
13
10228083
30/12/2008
23:32
NHCBA
P
N
N
N
15 EDTA
10228083
30/12/2008
NI
NT
P
N
N
N
Green
R
Green
ND
Green
N
R
N
-
-
R
N
36
88,61
TIG
N
AZT
N
AMP/SUL
P
AMIC
SCoN
AMX+CL
15:31
PIP/TAZ
25/01/2009
ESTR
10218246
CLOR
407
IMI
N
MER
N
FOX
N
CEFP
P
-
CEFT
NHCBA
-
CIP
16:24
-
CEFAZ
11/05/2009
GEN
10214884
VAN
339
LINZ
N
TEIC
N
CLIN
Ct PCR Real Time GN
N
PEN
Ct PCR Real Time GP
P
AMP
NHCBA
OXA
Green
16:34
Hora
11/05/2009
Data
10214884
RHHSP
332
Cultura/ PHOENIX®
Nº Amostra
ANEXOS
blaCTX
181
Green
Green
P
N
N
N
-
-
-
BGNF
P
N
N
24,8
Acinetobacter sp.
N
N
N
N
ND
NT
P
N
N
N
40
ND
NHCBA
P
N
N
N
35,93
ND
N
N
Enterococcus spp
18
10228848
09/12/2008
15:10
NHCBA
P
N
N
N
ND
31
10228848
09/12/2008
15:10
NHCBA
P
N
N
N
Enterococcus spp
38,45
9
10228848
12/12/2008
12:12
P
N
28,4
N
Enterococcus spp
20,92
5
10230898
30/12/2008
11:59
NHCBA
P
N
N
N
10 EDTA
10230898
30/12/2008
NI
NT
P
N
N
N
1
10231902
09/10/2008
09:57
NHCBA
P
N
N
N
17 EDTA
10231902
09/10/2008
NI
NT
P
N
N
N
60
10231902
09/10/2008
09:59
NHCBA
P
N
N
51
10236817
02/03/2009
13:11
NHCBA
P
N
62
10236817
02/03/2009
13:11
NHCBA
P
469
10236817
17/06/2009
21:47
NHCBA
429
10237468
18/01/2009
09:23
12
10237468
31/01/2009
07:16
11 EDTA
10237468
31/01/2009
NI
21
10237468
31/01/2009
07:38
N
P
NT
Cultura/ PHOENIX®
NI
TIG
-
09/12/2008
AZT
-
10228848
AMP/SUL
-
22 EDTA
AMIC
N
ND
AMX+CL
N
N
PIP/TAZ
N
N
ESTR
-
N
CLOR
-
P
IMI
-
NHCBA
MER
N
15:09
FOX
N
09/12/2008
CEFP
-
10228848
CEFT
-
2
CIP
-
N
CEFAZ
N
N
GEN
-
N
VAN
-
P
LINZ
-
NHCBA
TEIC
-
23:34
CLIN
-
30/12/2008
PEN
-
10228083
AMP
-
15
OXA
-
Ct PCR Real Time GN
vanA
Ct PCR Real Time GP
-
-
Green
-
Hora
-
Data
-
RHHSP
-
Nº Amostra
Green
ANEXOS
32,663
ND
R
R
R
S
S
R
34,8
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
ND
182
Green
Green
-
-
S
I
mecA
17,3
71,99
S
I
mecA
15,8
72,17
N
338
10239410
06/05/2009
18:16
NHCBA
P
N
N
N
3
10239410
08/05/2009
15:15
Pseudomonas putida
N
N
N
N
ND
402
10239410
08/05/2009
15:22
SCoN
P
N
38,1
N
SCoN
12,48
R
R
S
S
R
403
10239410
08/05/2009
15:22
SCoN
P
N
23,7
N
SCoN
8,89
R
R
S
S
R
348
10239410
10/05/2009
18:36
NHCBA
P
N
N
N
387
10239410
13/05/2009
19:52
NHCBA
P
N
N
N
391
10239410
13/05/2009
19:50
NHCBA
P
39,1
N
N
349
10239410
15/05/2009
21:37
NHCBA
P
N
N
N
353
10239410
15/05/2009
21:38
NHCBA
P
N
N
N
346
10239410
25/05/2009
07:29
NHCBA
P
N
N
N
341
10239410
29/05/2009
19:34
NHCBA
P
N
N
N
1 EDTA
10239410
29/05/2009
NI
NT
P
N
N
N
50
10243457
05/03/2009
22:26
SCoN
P
N
N
N
SCoN
30,0
R
R
S
S
S
53
10243457
05/03/2009
22:24
SCoN
P
N
N
N
SCoN
18,49
R
R
S
S
56
10243457
05/03/2009
22:18
SCoN
P
N
29,1
N
SCoN
13,91
R
R
S
S
83,3
GEN
N
VAN
N
LINZ
P
TEIC
NHCBA
CLIN
18:15
PEN
06/05/2009
AMP
10239410
OXA
335
N
N
N
Cultura/ PHOENIX®
P
N
TIG
-
NHCBA
AZT
I
18:16
AMP/SUL
-
06/05/2009
AMIC
-
10239410
AMX+CL
-
326
PIP/TAZ
-
N
ESTR
-
N
CLOR
-
N
IMI
-
P
MER
-
NHCBA
FOX
-
06:48
CEFP
71,99
04/05/2009
CEFT
13,8
10239410
CIP
mecA
426
CEFAZ
S
Ct PCR Real Time GN
71,99
Ct PCR Real Time GP
14,8
mecA
Green
S
Hora
-
Data
-
RHHSP
-
Nº Amostra
Green
ANEXOS
183
Green
Green
Green
05/02/2009
17:44
NHCBA
P
N
N
N
-
-
-
422
10245731
05/02/2009
17:36
NHCBA
P
N
N
N
427
10245731
05/02/2009
17:41
NHCBA
P
N
36,4
N
425
10245731
06/02/2009
18:23
NHCBA
P
N
N
N
54
10248405
06/03/2009
23:58
NHCBA
P
N
N
N
-
-
-
355
10248405
14/05/2009
20:18
NHCBA
P
29,1
N
N
343
10248405
23/05/2009
22:59
NHCBA
P
N
N
N
344
10248405
23/05/2009
22:57
NHCBA
P
N
N
N
345
10248405
23/05/2009
01:43
NHCBA
P
N
N
N
428
10254268
07/05/2009
09:54
NHCBA
P
N
N
N
44
10254268
09/05/2009
10:40
NHCBA
P
N
N
N
ND
329
10254268
09/05/2009
07:11
NHCBA
P
N
N
N
ND
-
-
-
3 EDTA
10254268
09/05/2009
NI
NT
P
30,9
N
N
ND/SI
333
10254268
09/05/2009
07:13
NHCBA
P
N
N
N
ND
350
10254268
11/05/2009
09:23
NHCBA
P
N
N
N
351
10254268
11/05/2009
07:22
NHCBA
P
N
N
N
87
86,9
Aspergillus sp
TIG
10245731
AZT
401
AMP/SUL
-
AMIC
-
AMX+CL
-
PIP/TAZ
N
ESTR
N
CLOR
N
IMI
P
MER
NHCBA
FOX
16:39
CEFP
14/02/2009
CEFT
10245611
CIP
61
CEFAZ
-
GEN
-
VAN
-
LINZ
N
TEIC
N
CLIN
Ct PCR Real Time GN
N
PEN
Ct PCR Real Time GP
P
AMP
NHCBA
OXA
Green
16:38
Hora
14/02/2009
Data
10245611
RHHSP
58
Cultura/ PHOENIX®
Nº Amostra
ANEXOS
40
184
Green
Green
P
N
N
N
SCoN/ND
72 EDTA
10287215
28/03/2011
NT
P
30,9
N
N
SCoN / Aspergillus sp
622
10300200
20/03/2011
NHCBA
P
N
N
N
623
10300200
20/03/2011
NHCBA
P
N
N
N
621
10300200
23/03/2011
NHCBA
P
N
N
N
626
10300200
29/03/2011
NHCBA
P
N
N
N
619
10300200
08/04/2011
S. epidermidis
P
N
27,8
N
SCoN
6,29
43 EDTA
10300200
08/04/2011
P
N
N
N
SCoN
30,36
620
10300200
08/04/2011
P
N
24,9
N
SCoN
5,96
44 EDTA
10300200
08/04/2011
P
N
N
N
SCoN
30,47
625
10300200
08/04/2011
P
N
34,2
N
SCoN
45 EDTA
10300200
08/04/2011
NI
NT
P
N
N
N
SCoN
73 EDTA
10300200
08/04/2011
NI
NT
P
N
N
N
ND
74 EDTA
10300200
29/04/2011
NI
NT
P
N
N
N
SCoN
NI
86,8
TIG
NHCBA
AZT
28/03/2011
AMP/SUL
10287215
AMIC
624
AMX+CL
N
PIP/TAZ
N
ESTR
N
CLOR
P
IMI
NHCBA
21:32
15/05/2009
10254268
347
Cultura/ PHOENIX®
N
Hora
N
Data
N
RHHSP
P
Nº Amostra
NHCBA
MER
70,51
00:23
10254268
FOX
40
12/05/2009
336
CEFP
mecA
N
CEFT
30,08
N
CIP
72,07
N
CEFAZ
11,9
P
11/05/2009
GEN
mecA
NHCBA
10254268
VAN
5,39
07:21
354
LINZ
72,52
N
TEIC
11,5
N
NI
CLIN
mecA
N
11/05/2009
PEN
72,52
P
10254268
AMP
11,4
NT
6 EDTA
OXA
mecA
Ct PCR Real Time GN
-
Ct PCR Real Time GP
-
-
Green
Green
ANEXOS
30,6
ND
30,03 / 37,18
ND
R
NI
NT
R
S. epidermidis
NI
NT
R
S. epidermidis
30,64
185
ANEXOS
RHHSP - Registro hospitalar Hospital São Paulo; NHCBA - Não houve crescimento bactéria aeróbia; SCoN - Staphylococcus coagulase-negativa; AMIC – Amicacina; AMOX+CL – Amoxacilina/ácido clavulânico; AZT – Aztreonam; AMP – Ampicilina; CEFT – Ceftazidima;
CEFAZ – Cefazolina; CIP – Ciprofloxacino; CLIN – Clindamicina; FOX – Cefoxitina; GEN – Gentamicina; IMI – Imipenem; LINZ – Linezolida; MER – Meropenem; OXA – Oxacilina; PEN – Penicilina; PIP/TAZ –
Piperacilina/Tazobactam; TEIC – Teicoplanina; TIG –
Tigeciclina; VAN – Vancomicina; NI – não informado; NT – não testado; SI – seqüenciamento inconclusivo; Gr – Graacc;; P – positivo; N – negativo; ND- Não Detectado.
186
ANEXOS
ANEXO III – Manuscritos submetidos à publicação
Diagnosis of Pathogens and Antimicrobial Resistance Genes of
Bloodstream Infections in Bone Marrow Transplants Patients by Real Time
PCR
Liana Carballo Menezes1,2,Talita Trevizani Rocchetti1,2, Karen de Castro Bauab1,2, Paola Cappellano2,
Milene Gonçalves Quiles1,2, Fabianne Carlesse3, Jose Salvador Rodrigues de Oliveira4, Antonio Carlos
Campos Pignatari1,2*
1
Special Clinical Microbiology Laboratory (LEMC), Federal University of São Paulo/UNIFESP;
2
Division of Infectious Diseases, Federal University of São Paulo/UNIFESP and
3
GRAACC - Grupo de Apoio ao Adolescente e à Criança com Câncer (Support Group for Children and
Adolescents with Cancer);
4
Division of Hematology, Federal University of São Paulo/UNIFESP.
Email addresses:
LCM: [email protected];
TTR: [email protected];
KCB: [email protected];
PC: [email protected];
MGQ: [email protected];
FC: [email protected];
JSRO: [email protected];
ACCP*: [email protected];
*Corresponding Author
Abstract
Background: Early identification of pathogens and antimicrobial resistance of
bloodstream infections (BSI) decrease morbidity and mortality, particularly in
immunocompromised patients. The study was design to detect 17 pathogens and
10 antimicrobial resistance genes from blood cultures bottles (BC) by real time
187
ANEXOS
polymerase chain reaction (qPCR). Methods: A total of 160 BC collected from
bone marrow transplant patient were screened with Gram-specific probes by
multiplex real time and seventeen genus-specific sequences using TaqMan
probes and blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB and
mecA genes by SYBR Green. Results: Twenty four of 33 samples were
concordantly positive by BC and real time PCR. Pathogens identification were
discordant in 13 cases. In 12 of 15 CoNS the mecA gene was detected and 4
Enterococcus spp. were positive for vanA. Two blaCTX and three blaSHV genes
were found by qPCR. The blaKPC and metallo-β-lactamase genes were not
detected. Five fungi species were identified only in qPCR. Conclusion: The real
time PCR could be valuable complementary tool in the management of BSI in
bone marrow transplants patients allowing early identification of pathogens and
antimicrobial resistance genes.
Keywords: bone marrow transplants; real time PCR; resistance genes;
bloodstream infections.
Background
Approximately 60% of episodes of fever in patients with neutropenia are
frequently correlated with documented bloodstream infections (ICS). Bloodstream
infections are associated with high rates of morbidity and mortality, with a
mortality rate ranging from 20% to 70%. The SENTRY Antimicrobial Surveillance
Program (1997-2002) described that ten bacterial species accounted for 89-92%
of all isolates in 659.935 cases of sepsis reported in the USA in 2000. The
ranking of microorganism was very similar across North America, Latin America,
and Europe [1]. The rank of the five major pathogens in Brazilian SCOPE
(Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance) were S.
188
ANEXOS
aureus (15.4%), followed by coagulase-negative staphylococci (CoNS) (13.4%),
Klebsiella spp. (13.2%), Acinetobacter spp. (12.5%), and P. aeruginosa (8.9%)
[2].
The most dangerous clinical manifestations of bloodstream infectious,
sepsis and shock, are the 10th leading cause of death in the United States,
accounting for 6% of all deaths (50.37 deaths per 100,000 individuals in the
overall population) [3]. Early diagnosis of sepsis and provision of appropriate
antimicrobial therapy correlate with positive clinical outcomes [4]. Blood cultures
are considered to be the “gold standard” for detecting microorganisms in the
bloodstream, including those that encode resistance genes [5].Molecular
amplification techniques have been utilized to detect microbial in bloodstream
infectious. Automated blood culture systems take approximately 1 to 2 days, on
average, to signal a positive blood culture and another 1 to 2 days to finalize
bacterial identification and antimicrobial testing. Rapid detection of bacterial
resistance mechanisms in blood culture bottles can assist the physician in both
patient management and infection control.
Material and Methods
Patients
During October 2008 to July 2011 a total of 160 blood cultures from Bactec
bottles were analyzed from 33 immunocompromised patients (31 adults and 2
children) with hematological malignancies submitted to bone marrow transplant
(7 acute myeloid leukemia, 6 multiple myeloma, 6 Non-Hodgkin’s lymphoma, 4
acute lymphoblastic leukemia, 2 Hodgkin’s disease, 2 chronic myeloproliferative
disorders, 1 chronic lymphoblastic leukemia, 1 Adeno dystrophia, 1 Ewing
syndrome, 1 pineal carcinoma and 1 testicular cancer). Patients were admitted
at the Institute of Pediatric Oncology (GRAACC) and at the adult Hematology
189
ANEXOS
Unit of São Paulo Hospital, Federal University of São Paulo, Brazil. The study
was approved by the Clinical Research Ethics Committee.
Sample collection and bacteria identification
The samples were collected from patients suspected of bloodstream
infections in the pre-transplant mobilization phase of hematopoietic stem cells,
transplanted patients and also patients admitted with clinical complications after
transplantation. Blood cultures were performed using the Bactec 9240 (Becton
Dickinson, Microbiology Systems, Coceysville, Md). The identification to species
level and susceptibility testing were performed using the automated system
Phoenix 100 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Coceysville, Md).
DNA Extraction
Total DNA was extracted from the 500 µL blood cultures used phenol
chloroform method (Brazol®, LGC, Brazil) with 300 mg of glass beads (diameter
0,3 mm; Scientific Industries) and processed in a disruptor Genie (Scientific
Industries) for 10 minute to achieve cell lysis.
Primers and TaqMan probe
The
primers to detected the resistance genes: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M,
blaIMP, blaSPM, blaVIM, blaKPC, vanA, vanB and mecA
have been previously
described by Menezes et al. and Mendes et al. [6, 7]. The TaqMan probes for
Gram positive and Gram negative bacteria have been previously described by
Bispo et al. and specific specie TaqMan probe for detection Enterococcus spp.,
CoNS, S. aureus, S. pneumoniae, E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae, P.
190
ANEXOS
mirabilis, Salmonella spp., S. marcescens, A. baumannii,
P. aeruginosa, S.
maltophilia, M. tuberculosis, Aspergillus spp., Candida spp. and Fusarium spp.
have been previously described Menezes et al. [8, 9]. All the primers and probes
were selected from public database and synthesized by a commercial institution.
The primers were checked for specificity in a BLAST search available through the
National Centre for Biotechnology Information website (www.ncbi.nlm.nih.gov). A
primer set for the hemochromatosis gene was designed to be used as an internal
control.
Real time PCR
The detection of bacterial DNA was screened using universal primers of
16S rDNA gene. The differentiation between Gram-positive and Gram-negative
bacteria was done by multiplex real time TaqMan (Bispo et al., 2011) [8].
Amplifications for TaqMan probes reactions were performed in a 20 ul reaction
volume, using 10 µL TaqMan Universal Master Mix 2X (Applied Biosystems, CA),
5 uL of template DNA, 0,5 µM each primers, 0.3 µM probe. The real time PCR
conditions were follow as: 50°C for 2 min and 95°C for 10 min; 40 cycles of 95°C
for 15 s and 60°C for 60 s. The resistance genes amplifications by real time
SYBR Green were performed in a 25 µL reaction containing 12.5 µL Kit Platinum
SYBR Green PCR em Tempo Real Super Mix (Invitrogen, California, EUA), 0,5
uM each primer and 5 uL of purified DNA extracted from samples. The real time
PCR conditions were follow as: 50°C for 2 min and 95°C for 10 min; 40 cycles of
95°C for 15 s and 60°C for 60 s; and a melting curve step (from 68°C to 95°C in
increments of 0.5°C /s). The ABI 7500 real time PCR System (Applied
Biosystems, Foster City, CA) instrument automatically was quantified on-line and
at the end point with the sequence detection system software (version 2.0,
Applied Biosystems).
191
ANEXOS
Data analysis
Data collection and statistical analysis were performed using SSPS version
17.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL) and Microsoft Office Excel® version 2007
(Microsoft Corporation, Redmond, USA).
Results
Sample collection and bacterial identification
A total of 160 blood samples collected from 33 patients were evaluated for
bloodstream infectious (BSI). Thirty three samples, representing 15 febrile
episodes, tested positive by Blood Culture (BC).
The culture performed in
automated Phoenix 100 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Coceysville,
Md.) identified 23 Gram positive bacteria (15 CoNS, 4 Enterococcus faecium, 2
Enterococcus faecalis and 2 Streptococcus pneumoniae) and 10 Gram negative
bacteria (1 Pseudomonas putida, 2 Acinetobacter spp., 3 Enterobacter cloacae, 1
Klebsiella pneumoniae, 1 E. coli , 1 BGNF and 1 Citrobacter freundii).
Real time PCR
Twenty four of 33 samples were concordantly positive by BC and real time
PCR (Table1). Thirteen samples were discordant in both methods. Six BCpositive samples were negative by real time PCR and seven BC-negative were
positive by PCR.
For Gram positive bacteria, 15 CoNS were positive BC and of these, 13
were detected by real time PCR. Three CoNS were detected by real time PCR
but did not grow in culture. Three of 6 Enterococcus spp. positive BC were
negative by real time PCR while BC not detected one sample positive for real
192
ANEXOS
time PCR. In two samples, BC identified S. pneumoniae while real time PCR did
not detect one of the samples.
For Gram negative bacteria, all E. cloacae and E. coli samples were
concordant by both methods (Table 1). In three samples growth of Citrobacter
freundii, Acinetobacter spp. and Pseudomonas putida were detected by blood
culture and by Gram negative probe, however specific primer and probes were
not designed for these pathogens, therefore they were not considered discrepant.
Two samples were positive for K. pneumoniae by real time PCR and negative by
BC while one BC positive was negative by real time PCR. Three samples
identified as A. baumannii by real time PCR and these, one were positive by BC
for A. baumannii, one were BC positive for BGNNF and one were not detected by
BC.
The overall concordance level was 72,7% for phenotypic and real time PCR
methods with and a Cohen Kappa’s coefficient of 0,7 (95% CI, 0.61–0.80).
For resistance genes, the real time PCR detected 12 CoNS with mecA
gene. Nine samples were concordant in detecting mecA gene compared with the
phenotypic resistance to methicillin. The vanA gene was detected in 4
Enterococcus spp (E. faecalis and E. faecium) and none were positive for the
vanB gene. The concordance was 100% between two Vancomycin resistance
methods (Table1).
For Gram negative bacteria, five samples detected ESβL gene by real time
PCR. The blaSHV gene was detected in three samples and blaCTX-M gene in two
samples (Table 1). Only two samples of the five positive ESβL real time PCR
were identified by phenotypic method as ESβL producers, other two samples
were identified ESβL producers by phenotypic method and negative by real time
PCR (Table1).
193
ANEXOS
The blaKPC and metallo-β-lactamase genes were not detected. The
Acinetobacter baumannii samples showed carbapenem phenotypic resistance,
however the carbapenemase genes studies were not detected.
Three Candida spp. were detected from two patients in real time PCR but
not by the BC. In one patient, two samples were positive by real time PCR. Two
samples were positive for Aspergillus spp. by real time PCR with negative
galactomanana antigenemia. Fusarium spp. was not detected in the analyzed
samples.
The real time PCR assays performance was adjusted as follows: sensitivity,
78%; specificity, 93%; negative predictive value (NPV), 95%; positive predictive
value (VPP), 72% when compared to phenotypic method.
Table 1 – Results of real time PCR, culture identification and antimicrobial
susceptibility of positive samples from blood culture bottles.
Patients
01
02
03
04
05
Age
49
28
34
37
44
Bacterial isolated
from blood culture
(Phoenix®)
Bacterial detected
with the PCR test
Antimicrobial
susceptibility
(Phoenix®)
S. epidermidis
CoNS
S*
Oxacilin
mecA
S. epidermidis
CoNS
S
Oxacilin
mecA
S. epidermidis
CoNS
S
Oxacilin
mecA
ND
Resistance genes by
real time PCR
C.freundii
CoNS
S
Cephalosporins and
Carbapenems
S. epidermidis
CoNS
R*
Oxacilin
mecA
ND
CoNS and GN
NA
NA
blaSHV
ND
Aspergillus spp.
NA
NA
NA
E. cloacae
E. cloacae
R
Cephalosporins
ND
E. cloacae
E. cloacae
R
Cephalosporins
ND
E. cloacae
E. cloacae
R
Cephalosporins
blaSHV
CoNS
CoNS
R
Oxacilin
mecA
CoNS
CoNS
R
Oxacilin
mecA
CoNS
CoNS
R
Oxacilin
ND
P. putida
ND
NA
NA
ND
S. epidermidis
CoNS
R
Oxacilin
mecA
S. epidermidis
CoNS
R
Oxacilin
mecA
S. pneumoniae
ND
S
Penicilin
ND
194
ANEXOS
06
07
49
53
08
38
09
50
10
11
12
S. pneumoniae
S. pneumoniae
S
Penicilin
ND
E. faecium
Enterococcus spp.
R
Glycopeptide
vanA
E. faecium
ND
R
Glycopeptide
vanA
E. faecium
ND
R
Glycopeptide
vanA
Cephalosporins and
Carbapenems
Cephalosporins and
Carbapenems
BGNNF
A. baumannii
R
ND
Acinetobacter spp.
ND
R
ND
A. baumannii
NA
NA
ND
K. pneumoniae
ND
R and
S
Cephalosporins and
Carbapenems
ND
E. faecalis
ND
S
Glycopeptide
ND
E. faecalis
Enterococcus spp.
S
Glycopeptide
ND
E. faecium
Enterococcus spp.
R
Glycopeptide
vanA
ND
Enterococcus spp.
NA
NA
ND
ND
K. pneumoniae
NA
NA
blaCTX-M
ND
K. pneumoniae
NA
NA
ND
ND
CoNS and GN
NA
NA
blaCTX-M
ND
CoNS
NA
NA
ND
ND
Candida spp.
NA
NA
NA
S. epidermidis
CoNS
R
Oxacilin
mecA
S. epidermidis
CoNS
R
Oxacilin
mecA
S. epidermidis
CoNS
R
Oxacilin
mecA
ND
56
23
27
13
64
ND
ND
NA
NA
blaSHV
14
13
A. baumannii
A. baumannii
S
Cephalosporins
ND
mecA
15
01
E. coli
E. coli
S
16
14
S. epidermidis
CoNS
R
Cephalosporins and
Carbapenems
Oxacilin
51
CoNS
ND
R
Oxacilin
ND
CoNS
ND
R
Oxacilin
ND
ND
Aspergillus spp.
NA
NA
NA
ND
Candida albicans
NA
NA
NA
17
18
19
23
23
ND
ND
Candida albicans
NA
NA
NA
R: Resistant; S: Susceptible; * CLSI 2010; NA: results not available; ND: Not Detected; CoNS: coagulase negative
Staphylococcus
Discussion
Early identification of the causative pathogen in bloodstream infection is
crucial, especially in cases of transplant patients achieving greater chance of
survival and successful post-transplant. In addition, rapid detection of resistance
genes in the bloodstream can contribute to the adequacy of antimicrobial
treatment with reduced morbidity / mortality [10,11,12].
The use of PCR for diagnostic purposes establishes a new era in the
detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples.
195
ANEXOS
Several protocols based on PCR amplification of 16S rDNA for differentiation of
gram-positive and gram-negative bacteria have been used from samples
collected from different infectious sites [13, 14].
Commercially available multiplex real time PCR assay kits have been
evaluated in adult patients with hematological malignancies and compared with
blood cultures (BC) only for microorganism identification [15]. Our study reports
the clinical application for identification bacterial and detection resistance genes
in adult and pediatric patients with hematological malignancies.
The PCR assays showed six negative results that tested positive by BC
and seven positive for real time PCR with negative BC. The negative real time
PCR results with positive BC reported in our study failed to detect frequent
bloodstream pathogens such as coagulase-negative staphylococci, enterococci,
streptococci and K. pneumoniae. Varani et al. reported in their study positive BC
whereas CoNS and Streptococcus mitis were not detected by real time PCR
[16]. Louie et al. detected positive BC for Enterococcus faecalis while real time
PCR failed to identify this microorganism [17]. This difference allowed us to
establish a LoD to distinguish between infection and contamination. The low
sensitivity
of
real
time
PCR
for
coagulase-negative
Staphylococcus,
Enterococcus sp. and S. pneumoniae was possibly associated with the Ct and
LoD Ct specifically set analytical cutoff
values in order to distinguish
contamination from infection in bone marrow transplants patients. Lehmann et al.
reported the importance to determinate cut off value to discriminate between
significant bacterial loads of such microorganism in clinical samples and low
amounts of bacterial DNA [18]. In addition, the presence of high bacterial DNA
concentration bacterial might have resulted in inhibition of the molecular detection
[19].
In seven samples where bacteria were only detected with the real time
PCR the microorganism detected were 1 A. baumannii, 2 K. pneumoniae, 1
196
ANEXOS
Enterococcus spp. and 3 CoNS (Table1). Varani et al. detected Gram negative
bacteria more than BC and Enterococcus spp. did not not grow in culture [16].
Louie et al. observed 17 cases where PCR identified a organism not found by
BC [17]. Positive cases of K. pneumoniae suggested that the bacteria recovered
were truly because 19 days after PCR results the microorganism was detected in
another culture not available by real time PCR. Authors suggested that the
detection of circulating bacterial DNA and presence of unviable DNA bacterial
detected by real time PCR should be considered contaminants [20, 18].
The real time PCR detected Candida DNA in three samples from two
patients of probable or possible bloodstream infection, while BC showed negative
results. Differences among BC systems for detection of Candida spp. do not
explain the disagreement with the real time PCR [21, 22]. Mancini et al described
Aspergillus sp. in samples blood by LightCycler SeptiFast (Roche Diagnostics,
GmbH, Mannheim, Germany) [15]. The identification by real time PCR was
consistent with the presence of unviable fungal components or of very low viable
fungal loads [23,24].
The proposal of our study was to detect 10 resistance genes. We found
samples with blaSHV, blaCTX-M, vanA, and mecA genes by real time PCR. The
identification of these genes together with clinical context could be an important
tool to help in the management of the appropriate therapy. One of the limitations
of commercially kit for identifying bacteria and fungi in blood using PCR is the
failure to provide antimicrobial susceptibility patterns and resistance genes [16].
The nonexistence of a gold standard regular diagnostic is a major limitation
for the evaluation of new molecular techniques. The positive BC results due to
contamination correspond to a limitation for the interpretation of positive or
negative real time PCR results [25]. Karahan et al. study showed that the false
positive blood bottles were detected with automated systems and suggests
197
ANEXOS
assessment of the microorganism DNA in these bottles [26]. Accordingly, a
negative result by real time PCR cannot exclude the presence of a bloodstream
infection in neutropenic patients, study by Nakamura et al and Peters
recommended the interpretation of real time PCR results conform to the clinical
context [27,25].
Conclusion
The blood cultures remains the gold standard for microbial diagnostic.
However, real time PCR could be a valuable diagnostic tool. Every effort should
be made to improve the yield of this diagnostic new modality, principally in
critically ill patients. The results obtained should be interpreted together of clinical
and other laboratory data. A large controlled study is in progress to further
evaluate the clinical benefits of using the real time PCR in this patient setting.
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Authors' contributions
LCM participated in the design and coordination of the study, data analysis and
drafted the manuscript.
TTR participated in the design of the study and carrier out the PCR.
KCB participated in the clinical data acquisition and carrier out the Bactec®
samples.
CP participated in the design of the study.
MGQ participated in the design of the study and carrier out the PCR.
FC participated in the design of the study.
JSRO participated in the design of the study.
198
ANEXOS
ACCP participated in the design, coordination of the study and helped draft the
manuscript.
Acknowledgements
This study was supported by a grant from “Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado
de
São
Paulo
–
FAPESP”,
Brazil.
Conselho
Nacional
de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico - "National Counsel of Technological
and Scientific Development" gave a grant to LCM (protocol 141636/2008-4),
Brazil.
References
1. Biedenbach DJ, Moet GJ, Jones RN: Occurrence and antimicrobial
resistance pattern comparisons among bloodstream infection
isolates from the Sentry Antimicrobial Surveillance Program (19972002). Diagn Microbiol Infect Dis 2004, 50:59-69.
2. Marra AR, Camargo LF, Pignatari AC, Sukiennik T, Behar PR, Medeiros
EA, Ribeiro J, Girão E, Correa L, Guerra C, Brites C, Pereira CA,
Carneiro I, Reis M, de Souza MA, Tranchesi R, Barata CU, Edmond MB:
Nosocomial bloodstream infections in Brazilian hospitals: analysis
of 2,563 cases from a prospective nationwide surveillance study. J
Clin Microbiol 2011, 49(5):1866-1871.
3. Kung HC, Hoyert DL, Xu J, Murphy SL: Deaths: final data for 2005. Natl
Vital Stat Rep. 2008, 56(10):1-120.
4. Tsalik EL, Jones D, Nicholson B, Waring L, Liesenfeld O, Park LP,
Glickman SW, Caram LB, Langley RJ, Van Velkinburgh JC, Cairns CB,
Rivers EP, Otero RM, Kingsmore SF, Lalani T, Fowler VG, Woods CW:
Multiplex PCR to diagnose bloodstream infections in patients
199
ANEXOS
admitted from the emergency department with sepsis. J Clin Microbiol
2010, 48(1):26-33.
5. Washington
JA,
II,
DM:
Ilstrup.
Blood
cultures:
issues
and
controversies. Rev. Infect. Dis 1986, 8:792–802.
6. Menezes LC, Rocchetti TT, Filho LRC, Bauab KD, Cappellano P, Oliveira
JSR,
Pignatari
ACC:
Detection
of
Bacterial
Pathogens
and
Antimicrobial Resistance genes by real-time polymerase chain
reaction in blood cultures of patients undergoing hematopoietic
stem cells transplant. 110th General Meeting of the American Society for
Microbiology 23-27 May 2010, San Diego, USA.
7. Mendes RE, Kiyota KA, Monteiro J, Castanheira M, Andrade SS, Gales
AC, Pignatari ACC, Tufik S: Rapid Detection and Identification of
Metallo-β-Lactamase Encoding Genes by Multiplex Real-Time PCR
Assay and Melt Curve Analysis. J Clin Microbiol 2007, 45:544–547.
8. Bispo PJ,
Melo GB, Hofling-Lima AL, Pignatari ACC: Detection and
gram discrimination of bacterial pathogens from aqueous and
vitreous humor using real-time PCR assays. Invest Ophthalmol Vis Sci
2011, 52:873-881.
9. Menezes LC, Rocchetti TT, Filho LRC, Bauab KD, Cappellano P,
Carlesse F, Oliveira JSR, Pignatari ACC: Analytical and clinical
validation of the 16S gene and antimicrobial resistance genes by
real-time
PCR
in
blood
cultures
of
patients
undergoing
haematopoietic stem cells transplant. 22nd European Congress of
Clinical Microbiology and Infectious Diseases 31 March – 03 April, 2012,
London, England.
10. Carrigan SD, Scott G, Tabrizian M: Toward resolving the challenges of
sepsis diagnosis. Clin Chem 2004, 50(8):1301-1314.
200
ANEXOS
11. Garnacho-Montero J, Garcia-Garmendia JL, Barrero-Almodovar A,
Jimenez-Jimenez FJ, Perez-Paredes C, Ortiz-Leyba C: Impact of
adequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients
admitted to the intensive care unit with sepsis. Crit Care Med 2003,
31(12):2742-2751.
12. Leibovici L, Shraga I, Drucker M, Konigsberger H, Samra Z, Pitlik SD: The
benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with
bloodstream infection. J Intern Med 1998, 244(5):379- 386.
13. Wu YD, Chen LH, Shang SQ, Lou JT, Du LZ, Zhao ZY: Gram stain
specific probe based real-time PCR for diagnosis and discrimitation
of bacterial neonatal sepsis. J Clin Microbiol 2008, 46(8):2613-2619.
14. Ohlin A, Bäckman A, Björkqvist M, Mölling P, Jurstrand M, Schollin J:
Real-time PCR of the 16S-rRNA gene in the diagnosis of neonatal
bacteraemia. Acta Paediatr 2008, 97(10):1376–1380.
15. Mancini N, Clerici D, Diotti R, Perotti M, Ghidoli N, De Marco D:
Molecular diagnosis of sepsis in neutropenic patients with
haematological malignancies. J Med Microbiol 2008, 57(Pt 5):601-604.
16. Varani S, Stanzani M, Paolucci M, Melchionda F, Castellani G, Nardi L,
Landini M P, Baccarani M, Pession A, Sambri V: Diagnosis of
bloodstream infections in immunocompromised patients by realtime PCR. Journal of Infection 2009, 58:346-351.
17. Louie RF, Tang Z, Albertson TE, Cohen S, Tran NK, Kost GJ: Multiplex
polymerase chain reaction detection enhancement of bacteremia
and fungemia. Crit Care Med 2008, 36(5):1487-1492.
18. Lehmann LE, Hunfeld KP, Emrich T, Haberhausen G , Wissing H, Hoeft
A, Stuber F: A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and
differentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole
blood samples. Med Microbiol Immunol 2008, 197:313-324.
201
ANEXOS
19. Lamoth F, Jaton K, Prod'hom G, Senn L, Bille J, Calandra T, Marchetti O:
Multiplex blood PCR in combination with blood cultures for
improvement of microbiological documentation of infection in
febrileneutropenia. J Clin Microbiol 2010; 48(10):3510-3516.
20. Ikegaya S, Iwasaki H, Ueda T: Clinical significance of coagulasenegative Staphylococci isolated from blood culture samples of
patients
with
hematological
disorders;
true
bacteremia
or
contamination. Rinsho Ketsueki 2010; 51: 398-401.
21. Hebart H, Löffler J, Reitze H, et al.: Prospective screening by a
panfungal polymerase chain reaction assay in patients at risk for
fungal infections: implications for the management of febrile
neutropenia. Br J Haematol 2000, 111(2):635-640.
22. Badiee P, Kordbacheh P, Alborzi: A Study on invasive fungal
infections in immunocompromised patients to present a suitable
early diagnostic procedure. Int J Infect Dis 2009, 13:97-102.
23. Horvath LL, George BJ, Murray CK, Harrison LS, and Hospenthal DR:
Direct comparison of the BACTEC 9240 and BacT/ALERT 3D
automated blood culture systems for candida growth detection. J
Clin. Microbiol 2004, 42:115–118.
24. Sandven P, Bevanger L, Digranes A, Haukland HH, Mannsaker T,
Gaustad P: Candidemia in Norway (1991 to 2003): results from a
nationwide study. J Clin Microbiol 2006, 44:1977–1981.
25. Peters RP, van Agtmael MA, Danner SA, Savelkoul PH, and
Vandenbroucke-Grauls CM: New developments in the diagnosis of
bloodstream infections. Lancet Infect Dis 2004, 4:751–760.
26. Karahan ZC, Mumcuoglu I, Guriz H, Tamer D, Balaban N, Aysev D, Akar
N: PCR evaluation of false-positive signals from two automated
blood-culture systems. J Med Microbiol 2006, 55:53-57.
202
ANEXOS
27. Nakamura A, Sugimoto Y, Ohishi K, Sugawara Y, Fujieda A, Monma F,
Suzuki K, Masuya M, Nakase K, Matsushima Y, Wada H, Katayama N,
and Nobori T: Diagnostic value of PCR analysis of bacteria and fungi
from blood in empiric-therapy-resistant febrile neutropenia. J Clin
Microbiol 2010, 48:2030–2036.
Standardization of a Real-Time PCR Test for Detection and Identification of
Multiple Pathogens and Resistance Genes Directly from Whole Blood Samples
L. C. Menezes1,2, T.T. Rocchetti1,2, K. C. Bauab1,2, L. R.C. Filho1,2, M. G. Quiles1,2, C. Kiffer1,2, A. C. C. Pignatari1,2,*.
1. Special Clinical Microbiology Laboratory (LEMC), Federal University of São Paulo/UNIFESP
2. Division of Infectious Diseases, Federal University of São Paulo/UNIFESP
* Corresponding Author. Division of Infectious Diseases, Federal University of São Paulo, Rua Leandro Dupret,
188, São Paulo, SP, Brazil. Zip Code: 04025-010. Phone: (55-11) 5081-2965. Fax: (55-11) 5571-5180.
E-mail address:[email protected]
Grant: This study was supported by a grant from “Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo –
FAPESP And Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPQ.
Key words: real-time PCR; resistance genes; bloodstream infections, Bacterial pathogens
Abstract
Rapid detection of microorganisms in bloodstream infections (BSI) is important for
diagnosis and treatment. Molecular diagnostic tools are resource-saving and could help
implementing early appropriate antibiotic therapy. The aim of this study was to detect and
identify by real-time PCR (qPCR) the main BSI causative agents directly from blood
cultures bottles and whole blood samples and their related antimicrobial resistance genes.
The limit of detection (LoD) and cutoff were evaluated according to CLSI documents EP17, EP-12 and GP-10. The clinical sensitivity and specificity were calculated by a
receiver operating characteristic (ROC) curve. The qPCR was design to identify 17
203
ANEXOS
species using specific primers and Taqman probes. The resistance genes blaSHV, blaTEM,
blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB and mecA were detected using specific
primers by qPCR SYBR Green. The assays were able to detect the target genes in a
corresponding dilution of 15 to 1.5 CFU for reation. For coagulase negative
Staphylococcus (ConS) (30,9), Stenotrophomonas maltophilia (31,6) and Escherichia
coli (32,6) lower Cycle threshold (Ct) cutoff values were detected. The area under the
ROC curve showed a satisfactory performance above 0.70 for most genes studied. The
sensitivity by ROC curve was above 80% for blaKPC and 16S rDNA Gram positive genes
and below 60% for blaTEM, blaSHV and vanB genes. The assays provide a good option for
a rapid diagnosis of BSI.
Introduction
Clinical manifestations of bloodstream infections (BSI), sepsis and shock, are the
10th leading cause of death in the United States, accounting for 6% of all deaths (50.37
deaths per 100,000 individuals in the overall population) (1). Early detection of causative
pathogens and adequate treatment within the first 6-12 hours is critical for favorable
outcomes in patients with BSI (2).
Despite all advances in Blood Cultures (BC) techniques, culture results are
usually not available before 24-72 h. On the one hand, it has been shown that nucleicacid-based technology, such as polymerase chain reaction (PCR), could be more sensitive
and also shorten the time to result when compared with conventional BC techniques (3).
On the other hand, PCR based on the automated fluorescence detection of amplicons
(real-time PCR, qPCR) is usually more robust, less labor-intensive, and less prone to
contamination than conventional PCR techniques (4). Rapid detection of bacterial
resistance mechanisms in BC bottles can assist the physician in both patient management
and infection control.
204
ANEXOS
The aim of this study was to standardize a real-time PCR (qPCR) protocol for
direct detection and identification from BC bottles and whole blood samples of 17
bacterial species, amongst the commonest BSI causative organisms, and 10 resistance
genes, amongst the commonest associated to antimicrobial resistances in hospital
infections.
Material and Methods
Specimen preparation and clinical samples
A total of 160 blood cultures and 51 whole blood samples obtained from bone
marrow transplant patients and from 30 healthy volunteers were used for the present
study, in order to be analyzed to determine the relative microorganism loads. Blood
cultures and K-EDTA samples for PCR were collected in parallel directly from central
lines or indwelling arterial catheters. The negative controls were obtained from 30
volunteers selected among healthcare professional from the Division of Infectious
Diseases, Federal University of São Paulo/UNIFESP. The study was approved by
UNIFESP ethics committee. The standardization was evaluated using well characterized
samples and ATCC control (Table 1). Spiked specimens were prepared by spiking targetnegative K-EDTA blood, blood cultures and DNase/RNase-free milliQ water tubes from
bacterial and fungal reference strains to a density corresponding to 0.5 McFarland
turbidity scale (1,5 x 108 CFU/mL) for each gene studied. These specimen preparation
were used to prepare serial 10-fold dilutions.
DNA Extraction
Five hundred (500) µL were sampled from blood culture bottles and submitted to
mechanical lysis with 300 mg of glass beads (0.3 mm diameter, Scientific Industries,
LOCAL?) for 10 minutes in a disruptor Genie® (Scientific Industries, LOCAL?). The
total DNA was extracted using phenol chloroform method (Brazol®, LGC, Brazil)
according to manufacturer’s recommendations.
205
ANEXOS
In 1.5 mL whole blood sample from the K-EDTA tube, it was added 300 mg of
glass beads (diameter 0,3 mm, Scientific Industries) and processed in a disruptor Genie
(Scientific Industries) by 10 minutes to achieve cell lysis. A volume of 1 mL was
transferred to a new tube and the DNA extraction was performed using the QIAamp DNA
Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), according to the manufacturer's instructions.
Bacterial samples controls were suspended in DNase/RNase-free milliQ water to a
density corresponding to 0.5 McFarland turbidity scale (1,5 x 108 CFU/mL). These
suspensions were used to prepare serial 10-fold dilutions to construct a standard curve. to
Primers and probes
The primers and TaqMan probes were developed for this study by Primer Express
software v2.0 (Applied
Biosystems, Foster City, CA) and
have been described
previously for 18S rDNA in different microorganism (5, 6, 7, 8, 9). The specific Gram
probes were designed by Bispo et al. (10). The resistance genes were as previously
described elsewhere (11, 12, 13, 14, 15, 16). All the primers and probes were selected
from public database and were checked for specificity in a BLAST search available
through
the
National
Centre
for
Biotechnology
Information
website
(www.ncbi.nlm.nih.gov). A primer set for the HFE-hemochromatosis gene was designed
to be used as an internal control.
Real-time PCR amplification
The eluate was submitted to three different qPCR reactions using three 5 µL
aliquots of the prepared specimen and one aliquot of clinical samples DNA added to the
master mix. The differentiation between Gram-positive and Gram-negative bacteria was
done by multiplex real-time Taqman (10). The specific species qPCR reactions were set
up as single PCR for each individual target, performed in a 20 µL reaction volume, with
10 µL TaqMan Universal Master Mix 2X (Applied Biosystems, Foster City, CA), 0,5
µM each primers, 0,3 µM probe. The resistance genes qPCR reactions used a 25 µL
206
ANEXOS
reaction volume containing 12,5 µL Kit Platinum SYBR Green qPCR Super Mix
(Invitrogen, California, EUA), 0,5 uM each primer. Amplification was performed under
the following conditions: 50°C for 2 minutes and 95°C for 10 minutes (UDG) followed
by 40 cycles of 95°C for 15 seconds and 60°C for 60 seconds. Melting curve analysis was
performed after amplification by heating samples from 68°C to 95°C with 0.5°C /s
increments for SYBR Green qPCR. Genes blaSPM, blaVIM, blaIMP were detected by
multiplex real-time SYBR Green (16). Fluorescence was quantified on-line and at the end
point with the sequence detection system software (version 2.0, Applied Biosystems,
Foster City, CA). Reactions were performed with an ABI 7500 Real-Time PCR System
(Applied Biosystems, Foster City, CA). The cycle threshold was determined after
reaction by setting the threshold line in the linear phase of the amplification plot. The
intersection of the amplification curve and threshold line was defined as the cycle
threshold value by the thermocycler software.
Determination of LoD, specificity and efficiency
The assay determined the lower limit of detection (LoD) or minimal analytical
sensitivity for each gene analyzed, based on CLSI document EP-17 (17). Control samples
representative of each studied gene were suspended in DNase/RNase-free water to a
density corresponding to a McFarland turbidity standard of 0,5 for bacterial (1,5 x 108
CFU/mL) and Candida spp. (1 to 5 x 106 cells per mL). The fungi were suspended using
9,3 ng/µL and 8,9 ng/µL DNA from Aspergillus fumigatus and Fusarium solani,
respectively. These suspensions were used to prepare serial 10-fold dilutions using
DNase/RNase-free milliQ water. The analytical specificity and sensitivity of the test
were established by receiver operating characteristic (ROC) Curve, which used a 95%
confidence interval.
Test reproducibility and efficiency were assessed by three repeated tests with each
detection genes series of serial 10-fold dilutions (ranging from 1,5 x 107 CFU/mL to 1,5 x
101 CFU/mL). The results obtained with the dilutions series were used to evaluated the
linearity of response, the PCR efficiency, represented by the equation:
207
ANEXOS
Efficiency = [−1+10(−1/slope)]×100.
Cutoff values and performance evaluation (Accuracy)
The Cycle threshold (Ct) cutoff values were determined (?)according to CLSI
documents EP-12 (18) and GP-10 (19). Positivity rates in these blood specimens of
coagulase negative Staphylococcus (ConS),
Streptococcus spp. and E. coli upon
application at establishing optional cutoff values Ct for qPCR.
Conventional blood
cultures and PCR samples were then analyzed in parallel. Moreover, all PCR results were
further re-analyzed for potential cross-contaminating by examining the raw data without
using the automatic software threshold. Blood cultures were performed using the Bactec
9240 (Becton Dickinson, Microbiology Systems, Coceysville, Md).
Statistics
Data were analyzed using SSPS version 17.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL).
The receiver operating characteristic (ROC) curve analysis was performed to calculate the
area under the curve (AUC) and to assess the accuracy of the tests for each gene by realtime PCR assays.
Results
DNA extraction and real-time PCR amplification
The DNA of all 10 resistance genes and 17 microorganism pathogen strains (Table
2) was effectively extracted directly from spiked whole blood samples. Clinical samples
were then further analyzed by PCR using DNA free reagents. Microorganisms of each
gene were identified by Taqman® probes and resistance genes as well as the internal
controls were determined by their specific melting points. The melting curve registrations
of resistance genes and the internal control detection by respective melting temperature
(Tm) analysis are shown in Table 4. Using eight triplicates per sample a maximal intraassay Standard Desvio (SD) was observed in Aspergillus spp. (0,86°C), 18S rDNA gene
(0,69°C) and E. cloacae (0,41°C). The assay precision of the Tm determination was
tested for all detection genes with reference organisms at eight different sample
concentrations and in triplicate. The overall inter-assay precision was calculated from
208
ANEXOS
three independent experiments (data not shown). There was no cross-reaction between the
PCR. All control samples amplified only the gene designated and were negative for the
presence of other genes.
Determination of LoD, specificity and efficiency
The Ct LoD as revealed from analysis of reference strains is shown in Table 3.
ConS, (30,9), S. maltophilia (31,6) and E. coli (32,6) obtained lower Ct values. Due to
the application of our predefined cross-contamination threshold, the detection limit for
ConS, S. maltophilia and E. coli throughout our experiments was limited for several
species and generally ranged of 10-fold dilution at a concentration 10-6 and 10-7 by 0,5
MacFarland the spiked samples. The specificity of microorganism identifications was
evaluated by the qPCR test based on target-especific Taqman probes and resistance
genes was based on different melting peak temperatures. The specificity was around
100% for all genes evaluated by ROC curve. The PCR efficiency was acceptable for all
genes (Table 3). The sensitivity and specificity for each gene varied according to the Ct
LoD determined according to the CLSI document (REF) and was shown in Table 3. The
sensitivity was above 80% for blaKPC and 16S rDNA Gram positive genes and below 60%
for blaTEM, blaSHV and vanB genes.
Cutoff values and performance evaluation (Accuracy)
Statistical analysis of experimental data as obtained from 160 blood culture and 51
whole blood samples drawn from fresh veni-puncture sites and from 30 healthy
volunteers revealed significant cross-contamination of the clinical samples with ConS and
E. coli. In order to reduce the positivity rate caused by potential cross-contamination,
application of a Ct cutoff value was evaluated for all genes, mainly ConS and E. coli
(Table 3). A Ct cutoff value reduced the positivity rate for ConS and E.coli. According
to these experimental results a Ct cutoff value seemed suitable to potentially discriminate
between significant microorganisms loads of such organisms in clinical samples and low
amounts of bacterial DNA (background reactivity) resulting from cross-contamination
209
ANEXOS
during the initial blood draw or contamination of PCR reagents. The area under the ROC
curve shown in Table 4 was above 0.70 for most genes studied, showing a satisfactory
performance. Areas under the ROC curve of 0.60 were observed for A. baumannii genes,
18S rDNA for Fungi and 16S rDNA for Gram positive and Gram-negative. .
Discussion
The use of PCR for diagnostic purposes establishes a new era in the detection and
characterization of microorganisms directly from clinical samples. Several protocols
based on PCR amplification of 16S rDNA for differentiation of gram-positive and gramnegative bacteria have been used from samples collected from different infectious sites
(20,21).
The real-time PCR approach has gained increasing acceptance as a laboratory
technique suitable for diagnostic purposes, however, the interpretation of the results can
be called into question. The sample could be considered as negative while it contains the
pathogen (false negative result) or it could be considered as positive while it does not
contain the pathogen (false positive result) (22) These problems can be minimized by the
determination of cycle cutoff (Limit of Detection White-LoB) and limit of detection
(LoD) of the method to make a reliable interpretation. The introduction of a new
diagnostic method requires an analytical and clinical validation to ensure greater
reliability to the chosen protocol. Each molecular diagnostic protocol, after its analytical
parameters tested must also have certain clinical validation in the intended population
(23).
The PCR assays showed excellent analytical specificity when tested for the most
common bacterial pathogens in bloodstream infection. No cross-reaction was detected
using human and fungal DNA. The area under the ROC curve was above 0,82 for all
genes studied showing a satisfactory performance, except E. coli (0,73).
210
ANEXOS
The nonexistence of a regular diagnostic gold standard is a major limitation for the
evaluation of new molecular techniques. The positive BC results due to contamination
correspond to a limitation for the interpretation of positive or negative real-time PCR
results (3). A current study showed that the false positive blood bottles were detected with
automated systems and suggests assessment of the microorganism DNA in these bottles
(24).
A major limitation of commercially kits for identifying bacteria and fungi in blood
using PCR is its failure to provide antimicrobial susceptibility patterns. Our study
detected the most prevalent and clinically relevant resistance genes, however, BC remains
an important diagnostic tool, providing essential information about the antimicrobial drug
resistance of pathogens (25).
The blood cultures remains gold standard for microbial diagnostic. However, realtime PCR could be a valuable diagnostic tool. Every effort should be made to improve the
yield of this diagnostic new modality, principally in critically ill patients. The results
obtained should be interpreted together of clinical and other laboratory data. A large
controlled study is in progress to further evaluate the clinical benefits of using the realtime PCR en blood stream infection.
Acknowledgments
Research supported by FAPESP and CNPq.
Table 1. Species tested for standardization of the Real Time PCR
reactions. in real-time
Microorganism
Reference Strains
ATCC 19606
Acinetobacter calcoaceticus
ATCC 33305
Aspergillus flavus
Clinical isolate
Aspergillus fumigatus
Clinical isolate
Aspergillus parasiticus
Clinical isolate
211
ANEXOS
Burkholderia cepacia
Clinical isolate
Candida albicans
ATCC 90028
Candida krusei
ATCC 6258
Candida parapsilosis
ATCC 22019
Candida tropicalis
ATCC 750
ATCC 13048
blaVIM Control
Enterococcus avium
ATCC 35665
Enterococcus casseliflavus
ATCC 700327
Enterococcus durans
ATCC 6056
ATCC 29212
ATCC 700802
ATCC 93011
Escherichia coli
ATCC 25922
Fusarium solani
Clinical isolated
ATCC 700603
blaTEM, SHV, CTX, KPC control (A28005)
Proteus mirabilis
ATCC 29245
ATCC 27853
blaSPM control (P1088)
blaIMP control
blaVIM control
Rhizopus sp
Clinical isolate
Rhodotorula sp
Clinical isolate
Salmonella spp.
Clinical isolate
Serratia marcescens
Clinical isolate
Shigella flexineri
ATCC 12022
ATCC 25923
ATCC 43300
ATCC 12228
ATCC 29968
Staphylococcus saprophyticus
ATCC 15305
Clinical isolate
Stenotrophomonas maltophilia
Clinical isolate
Streptococcus mitis
Clinical isolate
212
ANEXOS
ATCC 49619
ATCC 18615
Clinical isolate
ATCC – American Type Culture Collection
213
ANEXOS
Table 2. List of primers for amplification of the coding region of genes for antimicrobial resistance, internal control, generic fungi and TaqMan probes for
amplification of the coding region of genes that identify the major microorganisms and efficient access number in GenBank.
Sequence (5’3’)
Primer and Probe
Acinet-F
TGGACTCGGTAGCTGCACTTAC
Acinet-R
CCCATATGAGAGTCACCCATCTC
Acinet-PB
CCTAAAGCAGAAATC
Enteroco-F
TGTGGCAACAGGGATCAAGA
Enteroco-R
TTCAGCGATTTGACGGATTG
Enteroco-PB
TCGTTCGTGCATTAGA
Ecoli-F
GCCGGGAAAAGTGTACGTATCA
Ecoli-R
CGGGATAGTCTGCCAGTTCAG
Ecoli-PB
CGTTTGTGTGAACAACGA
Enterob-F
CATGATGGAGCTGATCCGTAAC
Enterob-R
CCCGCAAATACGGAGTAACC
Enterob-PB
TCGCGATCGAGCACT
Kpneu-F
GATTTAATCGCAACACGCATGA
Kpneu-R
TTCTCCCGAAAATGAGACACTTC
Kpneu-PB
CCTGGGTATGCTATATC
Paer-F
TGCTGGTGGCACAGGACAT
Paer-R
TTGTTGGTGCAGTTCCTCATTG
Paer-PB
CAGATGCTTTGCCTCAA
Microorganism or Antimicrobial
Resistance
Gene
GenBank Accession
number and references
recA
GU 942487.1
This study
AF 35185
Enterococcus spp.
groES
This study
uidA
AM 180568.1
Escherichia coli
This study
atpD
DQ 859777.1
hemolysin
AF 293352.1
This study
This study
regA
EU 342000.1
This study
214
ANEXOS
Primer and Probe
Sal-F
Resistance
CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATT
AGACGGCTGGTACTGATCGATAA
Sal-PB
CCACGCTCTTTCGTCT
Saur-F
AGCTGGCTTAGCGTATATTTATGCT
Saur-R
GCAACTTTAGCCAAGCCTTGA
Saur-PB
AATGGTAAACAAAGCTTTAG
SCN-F
GCGATTTC(CT)GAA(CT)GGGG(AG)AACCC
coagulase
SCN-R
TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT
negative
SCN-PB
ACGGCTAGCTCCAAAT
Spneu-F
ACGCAATCTAGCAGATGAAGC
Spneu-R
TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC
Spneu-PB
TTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGG
Smarc-F
GGTGAGCTTAATACGTTCATCAATTG
Smarc-R
GCAGTTCCCAGGTTGAGCC
Smarc-PB
TGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGA
Steno-F
TGCCACTGCGCGTGTAGT
Steno -R
CTGGCGCTTGTTGC
Steno -PB
CTTGTTGCCGAAGCC
Mtuber-F
GGCTGTGGGTAGCAGACC
CGGGTCCAGATGGCTTGC
Mtuber-PB
TGTGGGTAGCAGACCTCACCTATGTGTCGA
Pmira-PR
GCGCGTAAAGCACGTGAGATGA
Pmira1-F
ATTTCAGGAAACAAAAGATG
Pmira1-R
TTCTTACTGATAAGACATTG
GenBank Accession
invA
U 43272
Salmonella spp.
Sal-R
Mtuber-R
Gene
This study
nuc
EF 529608.1
This study
rrs
Staphylococcus
gi 281296180
This study
GU 968411.1
ply
This study
crp
AF 276243.1
Serratia marcescens
This study
metB
6365181
S. maltophilia
This study
IS 6110
X 52471
Mycobacterium tuberculosis
(6)
Proteus mirabilis
mrpA
Z 32686
This study
215
ANEXOS
Primer and Probe
Resistance
Gene
GenBank Accession
Aspergillus spp.
18S rDNA
AF 548061
Asperg-F
GTGGAGTGATTTGTC TGC TTA ATT G
Asperg -R
TCTAAGGGCATCACA GAC CTG TT
Asperg -PB
CGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCG
Fusar-F
AGTATTCTGGCGGGC ATG CCT GT
Fusar-R
ACAAATTACAACTCG GGC CCG AGA
Calbic-F
GGGTTTGCTTGAAAGACGGTAGT
Calbic-R
TTGAAGATATACGTGGTGGACGTTTG
Calbic-PB
TAAGCCATTGTCAAAGCGATC
Candsp-F
CTCGTAGTTGAACCTTGG
Candsp-R
GCCTGCTTTGAACACTCT
Candsp-PB
TTTTGATGCGTACTGGACCC
NFW-F
GACTCCTACGGGAGGC
522Rv-R
GCGGCTGCTGGGAC
GP-PB
CTGAYSSAGCAACGCCGCG
Gram-positive
GN-PB
CCTGAYSCAGCMATGCCGCG
Gram-negative
HFE_ F
GATGACCAGCTGTTCGTGTTC
HFE_R
CCACATCTGGCTTGAAATTCT
NS5
AACTTAAAGGAATTGACGGAAG
NS6
GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC
blaSHV-F
ATGCGTTATACGCCTGTG
blaSHV-R
TGCTTTGTATTCGGGCCAA
blaTEM-F
TGCCGCATACACTATTCTCAGAATGA
blaTEM-R
ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT
blaCTX-F
ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC
(7)
Fusarium spp.
(8)
FJ 159679.1
Candida albicans
18S rDNA
This study
18S rDNA
GU 562348.1
Candida spp.
This study
16S rDNA
(10)
HFE
NM 139004.2
This study
18S rDNA
(5)
blaSHV
(12,13)
blaTEM
(12,13)
blaCTX
(12,13)
Fungi
Cephalosporin
Cephalosporin
216
ANEXOS
Primer and Probe
blaCTX-R
TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG
blaKPC-F
ATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTC
blaKPC-R
CAATCCCTCGAGCGCGAGTC
blaIMP-F
GAATAG(A\G) (A\G)TGGCTTAA(C\T)TCTC
blaIMP-R
CAAAC(C\T)ACTA(G\C)GTTATC
blaVIM-F
GTTTGGTCGCATATCGCAAC
blaVIM-R
AATGCGCAGCACCAGGATAG
blaSPM-F
CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG
blaSPM-R
CCTTTTCCGCGACCTTGATC
mecA-F
AAAACTAGGTGTTGGTGAAGATATACC
mecA-R
GAAAGGATCTGTACTGGGTTAATCAG
vanA-F
GGGAAAACGACAATTGC
vanA-R
GTACAATGCGGCCGTTA
vanB-F
ATGGGAAGCCGATAGTC
vanB-R
GATTTCGTTCCTCGAC
Resistance
Gene
GenBank Accession
blaKPC
EU 784136
Cephalosporin
Carbapenem
(12,13)
blaIMP
(16)
blaVIM
(16)
blaSPM
AJ 492820
Carbapenem
Carbapenem
(16)
mecA
(15)
vanA
(11)
vanB
(11)
Methilicin
Glycopeptide
Glycopeptide
F- Forward; R- Reverse; PB- TaqMan Probes; IS- Insertion sequence
217
ANEXOS
Table 3 – Determined Ct values for LoD and cutoff, Tm, efficiency, sensibility, specificity and area under curve calculated by ROC curve for qPCR.
Microorganism or
Resistance gene
Cutoff
Efficiency %
Area under
curve ROC
Sensibility
(%)
Especificity
(%)
GP 16S rDNA a
40
38,6
109,1
0,995
87,5
99,97
GN 16S rDNAb
36,6
34,4
94,73
0,998
76,5
99,99
S. aureus
38
36,9
123,4
1,00
80,30
100,00
CoNS
34
30,9
125,5
0,872
48,60
100,00
Enterococcus spp.
40
37,1
135,4
0,957
89,10
99,85
S. pneumoniae
39,1
37,4
103,3
0,99
91,70
100,00
E. coli
33,1
32,6
121,0
0,734
40,40
100,00
K. pneumoniae
40
33,9
121,9
0,961
50,00
100,00
P. mirabilis
38,1
37
104,2
0,843
82,60
99,65
S. marcescens
40
38,58
83,8
0,893
81,50
99,80
Salmonella spp.
36,3
33
105,0
0,825
41,20
99,90
P. aeruginosa
40
38,8
99,4
0,994
97,60
100,00
S. maltophilia
31,9
31,6
136,6
0,997
71,4
100,00
LoD
Tm
SD Tm
218
ANEXOS
100,00
99,59
80,00
100,00
72,7
100,00
0,00
100,00
0,976
77,1
99,95
93,7
0,990
74,5
100,00
0,14
116,91
0,961
57,9
99,96
91,31
0,07
81,2
0,984
82,7
99,96
34,53
85,85
0,22
81,9
0,996
67,3
99,96
34,1
33,26
91,67
0,22
81,4
0,863
25,7
100,00
blaCTX
33,7
32,62
88,85
0,09
86,4
0,896
70,8
99,97
blaIMP
33,23
28,49
76,27
0,10
100,0
0,954
67,6
100,00
blaSPM
33,23
30,99
84,85
0,10
80,0
0,981
73,7
98,30
blaVIM
33,23
31,82
89,43
0,10
128,7
0,938
72,2
98,30
Fungi 18S rDNA
36,1
34,4
83,3/85,13
0,69/0,24
103,8
0,953
76,8
99,95
E. cloacae
36,2
37,47
0,41
129,4
0,958
95,8
100,00
Aspergillus spp.
37,2
38,0
0,86
108,5
0,947
94,7
100,00
A. baumannii
40
38,9
124,0
0,973
C. albicans
39
36
121,0
0,983
Cândida spp.
39
36,5
116,9
0,985
M. tuberculosis
39
34
128,8
1,00
mecA
34,9
33,91
71,92
0,29
108,9
vanA
35,5
33,67
85,48
0,08
vanB
33,3
32,29
74,41
blaKPC
37,9
36,67
blaTEM
36,4
blaSHV
80,27
85,59
219
ANEXOS
Fusarium spp.
36,9
33,01
90,86
0,22
97,3
0,700
70,0
100,0
GP- Gram-positive; GN- Gram-negative; CoNS – coagulase negative Staphylococcus; LoD – Limite of detection , Tm, - temperature meling; SDstandard desvio; ROC- Receiver operating characteristic.
220
ANEXOS
References
1. Kung HC, Hoyert DL, Xu J, Murphy SL. Deaths: final data for 2005. Natl Vital Stat
Rep 2008; 56(10): 1-120.
2. Lehmann,L.E., Hunfeld,K.P., Emrich,T., Haberhausen,G., Wissing,H., Hoeft,A. et al.
A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of 25 bacterial
and fungal pathogens from whole blood samples. Med Microbiol Immunol 2008; 197:
313-324.
3. Peters, RP, Van Agtmael MA., Danner SA, Savelkoul PH, Vandenbroucke-Grauls CM.
New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect Dis 2004;
4:751–760.
4. Klouche M, Schröder U. Rapid methods for diagnosis of bloodstream infections. Clin
Chem Lab Med 2008; 46(7): 888-908.
5. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. In: M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J.
White (Editors), PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications. San Diego:
Academic Press; 1990. p. 315–322.
6. Desjardin LE, Chen Y, Perkins MD, Teixeira L, Cave MD, Eisenach KD. Comparison
of the ABI 7700 system (TaqMan) and competitive PCR for quantification of IS6110
DNA in sputum during treatment of tuberculosis. J Clin Microbiol 1998; 36(7): 19641968.
7. Luong ML, Clancy CJ, Vadnerkar A, Kwak EJ, Silveira FP, Wissel MC, et al.
Comparison of an Aspergillus real-time polymerase chain reaction assay with
galactomannan testing of bronchoalvelolar lavage fluid for the diagnosis of invasive
pulmonary aspergillosis in lung transplant recipients. Clin Infect Dis 2011; 52(10): 121826.
221
ANEXOS
8.
Hue FX,
Huerre
M, Rouffault
MA, de
Bievre
C.
Specific
detection
of Fusarium species in blood and tissues by a PCR technique. J Clin Microbiol 1999;
37(8): 2434-2438.
9. Metwally L, Fairley DJ, Coyle PV, Hay RJ, Hedderwick S, McCloskey B, et al.
Improving molecular detection of Candida DNA in whole blood: comparision of seven
fungal DNA extraction protocols using real-time PCR. J Med Microbiol 2008; 57: 296303.
10. Bispo PJ,
Melo GB, Hofling-Lima AL, Pignatari ACC. Detection and gram
discrimination of bacterial pathogens from aqueous and vitreous humor using real-time
PCR assays. Invest Ophthalmol Vis Sci 2011; 52: 873-881.
11. Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P. Detection of Glycopeptide Resistance
Genotypes and Identification to the Species Level of Clinically Relevant Enterococci by
PCR. J Clin Microbiol 1995; 33(1): 24–27.
12. Monteiro J, Santos AF, Asensi MD, Peirano G, Gales AC. First report of KPC-2producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrob Agents Chemother 2009,
53(1): 333-334.
13. Monstein H-J, Ostholm-Balkhed, A, Nilsson V M, Nilsson M, Dornbusch K ,Nilsson
E L. Multiplex PCR amplification assay for the detection of blaSHV, blaTEM and blaCTX-M
genes in Enterobacteriaceae. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 2007; 115: 1400–
1408.
14. Patel R, Uhl R J, Kohner P, Hopkins KM, Cockerill R F. Multiplex PCR Detection of
vanA, vanB, vanC-1, and vanC-2/3 Genes in Enterococci. J Clin Microbiol
1997;
35:703–707.
222
ANEXOS
15. Zhang,K, McClure,J.A, Elsayed,S, Louie,T, Conly,JM: Novel multiplex PCR assay
for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome
mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2005;
43: 5026-5033.
16. Mendes RE, Kiyota KA, Monteiro J, Castanheira M, Andrade SS, Gales AC, et al.
Rapid Detection and Identification of Metallo-β-Lactamase
Encoding Genes by
Multiplex Real-Time PCR Assay and Melt Curve Analysis. J Clin Microbiol 2007; 45:
544–547.
17. CLSI. Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation;
Approved Guideline - Second Edition. CLSI document EP17-A. Wayne PA: Clinical and
Laboratory Standard Institute; 2004.
18. CLSI. User protocol for evaluation of qualitative test performance; Approved
Guideline - Second Edition. CLSI document EP12-A2. Wayne PA: Clinical and
Laboratory Standard Institute; 2008.
19. CLSI. Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver
Operating Characteristics (ROC) Plots; Approved Guideline - Second Edition. CLSI
document GP10-A. Wayne PA: Clinical and Laboratory Standard Institute; 1995.
20. Wu YD, Chen LH, Shang SQ, Lou JT, Du LZ, Zhao ZY: Gram stain specific probe
based real-time PCR for diagnosis and discrimitation of bacterial neonatal sepsis. J Clin
Microbiol 2008; 46(8): 2613-2619.
21. Ohlin A, Bäckman A, Björkqvist M, Mölling P, Jurstrand M, Schollin J: Real-time
PCR of the 16S-rRNA gene in the diagnosis of neonatal bacteraemia. Acta Paediatr 2008,
97(10):1376–1380.
223
ANEXOS
22. Stals,A., Werbrouck,H., Baert,L., Botteldoorn,N., Herman,L., Uyttendaele,M. et al.
Laboratory efforts to eliminate contamination problems in the real-time RT-PCR
detection of noroviruses. J Microbiol Methods 2009; 77: 72-76.
23. CLSI. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline Second Edition. CLSI document MM03-A2. Wayne PA: Clinical and Laboratory
Standard Institute; 2006.
24. Karahan ZC, Mumcuoglu I, Guriz H, Tamer D, Balaban N, Aysev D, et al. PCR
evaluation of false-positive signals from two automated blood-culture systems. J Med
Microbiol 2006, 55: 53-57.
25. Varani S, Stanzani M, Paolucci M, Melchionda F, Castellani G, Nardi L, et al.
Diagnosis of bloodstream infections in immunocompromised patients by real-time PCR.
J Infect 2009; 58: 346-351.
224

Clique para visualizar o trabalho completo. - LEMC

Transcrição

Documentos relacionados

pcr para clonalidade t infiltração do snc

pcr gama para clonalidade t

Nota Técnica nº001/2015 - Laboratório Central do Estado do

3º Troféu SEIXALIADA-F3-PCR-1 e 2

Lâmina _ HLA-B27 - Diagnósticos do Brasil

Reportagem do 1º Troféu CRO

DIETAS PERSONALIZADAS, PREDIÇÃO DO RISCO DE DOENÇAS

ROTINA PARA CONTROLE DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA E SAÚDE

Antígeno HLA-B27, pesquisa PCR Chlamydophila pneumoniae