Ana H. Januário - Universidade de Franca

Transcrição

UNIVERSIDADE DE FRANCA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO
PARA A QUANTIFICAÇÃO DE EGONOL E HOMOEGONOL NOS
EXTRATOS DE Styrax (STYRACACEAE) POR CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ANA CAROLINA GONZALES MORAES
FRANCA
2012
UNIVERSIDADE DE FRANCA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO
PARA A QUANTIFICAÇÃO DE EGONOL E HOMOEGONOL NOS
EXTRATOS DE Styrax (STYRACACEAE) POR CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ANA CAROLINA GONZALES MORAES
Dissertação apresentada à Universidade de
Franca, como exigência parcial para a
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Patrícia Mendonça
Pauletti.
FRANCA
2012
Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca
M818d
Moraes, Ana Carolina Gonzales
Desenvolvimento e validação de método analítico para a quantificação de
egonol e homoegonol nos extratos de Styrax (Styracaceae) por cromatografia
líquida de alta eficiência / Ana Carolina Gonzales Moraes ; orientador: Patrícia
Mendonça Pauletti. – 2012
76 f. : 30 cm.
Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca
Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu – Mestre em Ciências
1. Styrax camporum. 2. Controle de qualidade. 3. Validação. 4. CLAEDAD. 5. Nor-neolignanas. I. Universidade de Franca. II. Título.
CDU – 54:615.32
Dedico
Aos meus pais, Moacyr e Regina, por
todo amor e dedicação. Por me ensinarem
os verdadeiros valores da vida. Aos meus
irmãos, Leonardo e Ana Luísa, e ao meu
namorado, Ubirajara, por estarem
presentes na minha vida, dando apoio e me
incentivando. À minha avó por todas as
orações e acolhimento.
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela vida, esperança, por todas oportunidades incríveis e conforto nos
momentos difíceis.
Aos meus pais, pelo amor e compreensão. A vocês toda a minha gratidão,
vocês são um exemplo para mim.
Aos meus irmãos, pelo carinho, incentivo e companheirismo.
Ao Ubirajara, amor da minha vida, pela sua paciência, respeito e compreensão.
Sem você nada disso seria possível.
A toda minha família, inclusive, Ângela, Bira, Carol, minha avó Zélia, por
estarem do meu lado, dando-me apoio e força e por me acolherem sempre.
À Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti, que com sua imensa sabedoria,
colaborou para meu crescimento profissional, por toda sua dedicação, confiança e amizade.
Estou imensamente grata.
A todos os companheiros de laboratório que contribuíram para a execução
deste trabalho. Em especial, pelos grandes amigos, Murilo, Thaís, Carol, Camila, Karen e
Eveline.
Aos professores do grupo de pesquisa da Universidade de Franca por
colaborarem para o meu crescimento profissional durante as disciplinas cursadas.
À CAPES pelo suporte financeiro.
E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para execução deste
trabalho.
Meus sinceros agradecimentos.
“Começa a aceitar suas derrotas com a cabeça erguida e olhos radiantes,
com a graça de um adulto – e não com a tristeza de uma criança. E aprende a construir
todas as suas estradas no hoje, pois o terreno do amanhã é incerto demais para os
planos”
William Shakespeare
SUMÁRIO
ABREVIAÇÕES E SÍMBOLO.................................................................................................. I
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. III
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. IV
LISTA DE FLUXOGRAMA .................................................................................................... V
RESUMO ................................................................................................................................. VI
ABSTRACT ............................................................................................................................VII
1
INTRODUÇÃO............................................................................................................ 2
1.1
USO DE PLANTAS COM FINS TERAPÊUTICOS .................................................. 2
1.2
CONTROLE DE QUALIDADE DAS PLANTAS MEDICINAIS ............................. 4
1.3
VALIDAÇÃO DO MÉTODO ..................................................................................... 6
1.4
FAMÍLIA STYRACACEAE ..................................................................................... 10
1.5
LIGNÓIDES ............................................................................................................... 12
2
OBJETIVOS ............................................................................................................... 17
3
PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................................ 19
3.1
EQUIPAMENTOS ..................................................................................................... 19
3.2
MATERIAIS .............................................................................................................. 19
3.3
MATERIAL VEGETAL ............................................................................................ 20
3.4
OBTENÇÃO DOS PADRÕES .................................................................................. 20
3.5
PREPARO DOS PADRÕES E AMOSTRA .............................................................. 22
3.5.1
Preparo da solução estoque de egonol e homoegonol ................................................ 22
3.5.2
Preparo do extrato padrão dos caules de S. camporum .............................................. 23
3.5.3
Preparo das amostras .................................................................................................. 23
3.6
CONDIÇÕES DE ANÁLISE EM CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA
EFICIÊNCIA ACOPLADO A DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-DAD) ... 23
3.7
VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO............................................................. 24
3.7.1
Curva analítica por padronização externa .................................................................. 24
3.7.2
Curva de adição de padrão ......................................................................................... 24
3.7.3
Seletividade ................................................................................................................ 25
3.7.4
Recuperação ............................................................................................................... 25
3.7.5
Precisão (inter e intra-dia) .......................................................................................... 26
3.7.6
Exatidão ...................................................................................................................... 26
3.7.7
Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) ................................................ 26
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 29
4.1
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS DE
Styrax ....................................................................................................................................29
4.2
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DO EGONOL
E HOMOEGONOL NO GÊNERO Styrax ............................................................................... 34
4.3
VALIDAÇÃO DO MÉTODO ................................................................................... 38
4.3.1
Seletividade e Especificidade ..................................................................................... 38
4.3.2
Linearidade ................................................................................................................. 39
4.3.3
Precisão ...................................................................................................................... 40
4.3.4
Exatidão ...................................................................................................................... 40
4.3.5
Recuperação ............................................................................................................... 41
4.3.6
Limite de Detecção (LOD) ......................................................................................... 41
4.3.7
Limite de Quantificação (LOQ) ................................................................................. 42
4.4
APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA QUANTIFICAR O
EGONOL E HOMOEGONOL EM S. camporum, S. ferrugineus e S. pohlii .......................... 42
5
CONCLUSÕES .......................................................................................................... 45
6
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 47
7
ANEXO ...................................................................................................................... 55
I
ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS
ACN
Acetonitrila
ANVISA
Agência de Vigilância Sanitária
C 18
Sílica Octadecilsilano
CCDC
Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CCDP
Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
CLAE (HPLC)
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CV
Coeficiente de variação
DAD
Detector de arranjo de diodos
DPR
Desvio padrão relativo
EEJ
Estação ecológica do Jataí
EM (MS)
Espectrometria de massas
GPNUF
Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais da UNIFRAN
IC
Inclinação da curva de calibração
ICH
International Conference on Harmonization
INMETRO
Instituto Nacional de Metrologia
LC
Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida)
LOD
Limite de detecção
LOQ
Limite de quantificação
MeOH
Metanol
MS
Ministério da Saúde
OMS
Organização Mundial de Saúde
p.
Página
PVDF
Fluoreto de polivinilideno
r
Coeficiente de correlação
RDC
Resolução da Diretoria Colegiada
Fator de retenção
Rf
1
RMN H
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
s
Slope
II
S
Desvio padrão
SUS
Sistema Único de Saúde
tR
Tempo de Retenção
USP
United States Pharmacopeia
UV-Vis
Ultravioleta-Visível
V inj
Volume de injeção
λ
Comprimento de onda
(MPP)-1
Matriz metaloproteinase
III
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 –
Styrax camporum Pohl.
10
Figura 2 –
Estrutura química da unidade fenilpropanoídica, lignana,
neolignana, nor-lignana e nor-neolignana.
13
Figura 3 –
Lignanas isoladas de Styrax.
14
Figura 4 –
Estruturas químicas de egonol (1) e homoegonol (2).
29
Figura 5 –
Espectro de RMN 1H de 1 (CDCl 3 , 200 MHz).
32
Figura 6 –
Espectro de RMN 1H de 2 (CDCl 3 , 200 MHz).
33
Figura 7 –
Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do
caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 5 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 60
min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, V inj = 20 μL, [ ] = 1,0
mg/mL.
36
Figura 8 –
Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do
caule de S. camporum. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 50 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 30
min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, V inj = 20 μL, [ ] = 1,0
mg/mL.
36
Figura 9 –
Cromatogramas obtidos por CLAE do (a) extrato padrão do
caule de S. camporum; (b) extrato das folhas de S.
camporum; (c) extrato das partes aéreas de S. pohlii; e (d)
extrato das partes aéreas de S. ferrugineus. Condições
cromatográficas: metanol-água-ácido acético (73:26.9:0.1,
v/v/v) e detecção em 311 nm.
37
Figura 10 –
Curva de calibração padrão externo X linearidade padrão 1.
39
Figura 11 –
Curva de calibração padrão externo X linearidade padrão 2.
40
Figura 12 –
Espectro de UV-Vis dos padrões (a) egonol (1) e (b)
homoegonol (2).
42
IV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 –
Dados de RMN 1H (200 MHz) das substâncias 1 e 2 e
comparação com a literatura (CDCl 3 , 200 MHz).
31
Tabela 2 –
Valores de seletividade para egonol (1) e homoegonol
(2).
39
Tabela 3 –
Exatidão (%) e precisão (CV%) intra e inter-dia para o
egonol (1) e homoegonol (2).
41
Tabela 4 –
Recuperação para o egonol (1) e homoegonol (2).
41
Tabela 5 –
Quantidade (μg/mL) de egonol (1) e homoegonol (2)
em espécies de Styrax.
43
V
LISTA DE FLUXOGRAMA
Fluxograma 1 –
Fracionamento da fração hexânica de S. pohlii.
22
VI
RESUMO
MORAES, Ana Carolina Gonzales. Desenvolvimento e validação de método analítico para a
quantificação de egonol e homoegonol nos extratos de Styrax (Styracaceae) por cromatografia
líquida de alta eficiência. 2012. 76f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade de
Franca, Franca.
A crescente utilização das plantas para fins terapêuticos têm-se destacado em todo o
mundo nas últimas décadas. Em vários países, essa forma de terapia constitui o único recurso
disponível para o tratamento primário da saúde. Portanto, há necessidade de se desenvolver e
comprovar a qualidade das análises químicas desses produtos. Devido à ampla utilização na
medicina popular de Styrax camporum em tratamentos de transtornos gastroduodenais, os
objetivos deste trabalho foram desenvolver e validar uma metodologia analítica para a
detecção e a quantificação dos marcadores químicos da espécie S. camporum por CLAEDAD, visando o controle de qualidade dessa espécie vegetal e de outras desse gênero. A
cromatografia líquida de alta eficiência, no modo reverso de eluição, foi utilizada para
obtenção de um cromatograma fringerprinting representativo do extrato padrão de S.
camporum e para o desenvolvimento de uma condição isocrática para quantificar as norneolignanas presentes em espécies de Styrax. Os padrões egonol e homoegonol foram
isolados de S. pohlii e usados no preparo das soluções padrão e controle de qualidade, as quais
foram utilizadas para atender os requisitos: linearidade, seletividade, precisão e exatidão,
limite de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) e recuperação. Tendo em vista a
comprovação da aplicabilidade do método desenvolvido, dois extratos brutos etanólicos de
espécies Styrax, previamente preparados, S. pohliin e S. ferrugineus e o extrato das folhas
secas de S. camporum foram utilizados para quantificar os padrões egonol (1) e homoegonol
(2). A resposta do detector de UV a 311 nm foi linear de 0,36 - 42,00 µg/mL para 1 e 2 e as
equações da reta encontradas foram y = 123.000 x – 2.743 e y = 93.490 x – 10.630 (r =
0.9999 e 0,9998, CV < 2 %), respectivamente. O método desenvolvido mostrou-se seletivo,
específico, linear, preciso e exato para os dois marcadores propostos, sendo, portanto, passível
de utilização no controle de qualidade de S. camporum e também de outras espécies deste
gênero.
Palavras-chave: Controle de qualidade, validação, CLAE-DAD, Styrax camporum,
Styracaceae, nor-neolignanas.
VII
ABSTRACT
MORAES, Ana Carolina Gonzales. Development and validation of an analytical method for
the quantification of egonol and homegonol in extracts of Styrax (Styracaceae) by high
performance liquid chromatography. 2012. 76f. Dissertação (Mestrado em Ciências) –
Universidade de Franca, Franca.
The increasing use of plants for therapeutic purposes has been highlighted in
worldwide in last decades. In several countries, this kind of therapy is the only available
resource for primary care treatment. Thus, there is a requirement to develop and demonstrate
the quality of chemical analysis of these products. Due to extensive use in folk medicine of
Styrax camporum in the treatment of gastrointestinal disorders, the objectives of this study
were to develop and validate an analytical methodology for detection and quantification of
chemical markers of the species S. camporum by HPLC-PAD, aiming to control quality of
this species and others from this genus. The high performance liquid chromatography reverse
elution mode was used to obtain a fingerprinting chromatogram representative of the standard
extract of S. camporum and to development an isocratic condition to quantify the norneolignans present in species of Styrax. The standards egonol and homoegonol were isolated
from S. pohlii and used to meet the parameters: linearity, selectivity, precision and accuracy,
limit of quantification (LOQ) and detection (LOD) and recovery. In order to prove the
applicability of the developed method, two crude ethanolic extracts of Styrax species,
previously prepared, S. pohlii and S. ferrugineus, and the extract form the leaves of S.
camporum were used to quantify the standards egonol (1) and homoegonol (2). The response
of the UV detector at 311 nm were linear from 0.36 to 42.00 μg/mL for 1 and 2. The
regression equations found were y = 123,000 x – 2,743 and y = 93,490 x – 10,630 (r = 0.9999
and 0.9998, CV < 2%), respectively. The method developed proved to be selective, specific,
linear, precise and accurate for both markers proposed, therefore, that can be used to control
quality of S. camporum and also in other species of this genus.
Keywords: Quality control, validation, HPLC-PAD, Styrax camporum, Styracaceae, norneolignans.
Introdução 1
Introdução
Introdução 2
1
INTRODUÇÃO
1.1
USO DE PLANTAS COM FINS TERAPÊUTICOS
Pela observação e experimentação das plantas, os povos primitivos
propagaram, de geração em geração, as propriedades terapêuticas de determinadas plantas,
que se tornaram parte da cultura popular (Calixto, 2000; Turolla e Nascimento, 2006). Essas
informações populares contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes
terapêuticas dos vegetais e podem orientar pesquisas na área de produtos naturais, já que
muitas espécies são usadas empiricamente, sem respaldo científico quanto à eficácia e
segurança (Foglio et al., 2006).
As plantas medicinais constituem uma alternativa medicamentosa bem aceita e
acessível devido às vantagens em relação aos medicamentos obtidos por síntese química,
como menores efeitos adversos comparadas com os fármacos sintéticos, preferência dos
consumidores por tratamentos de origem natural e, principalmente, pelo custo mais baixo
comparado com os medicamentos sintéticos (Cañigueral et al., 2003; Melo et al., 2007).
A fitoterapia tem ressurgido como opção terapêutica e sua crescente utilização
têm-se destacado em todo o mundo. Nos países em desenvolvimento, essa forma de terapia se
constitui, muitas vezes, no único recurso disponível para o atendimento primário à saúde
(Melo et al., 2007).
A OMS (Organização Mundial de Saúde) vem, desde 1978, valorizando o uso
da medicina tradicional em países em desenvolvimento. A OMS tem estimulado os países a
identificar e explorar os aspectos da medicina tradicional que fornecem remédios ou práticas
seguras e eficazes para a obtenção da saúde, os quais devem ser recomendados nos programas
voltados para cuidados primários de saúde (Tomazzoni et al., 2006).O Brasil possui a maior
biodiversidade do planeta, sendo estimada entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial.
Dados estatísticos indicam que existam 55 mil espécies de plantas (Barreiro e Bolzani, 2009).
O uso de parte dessa biodiversidade com fins terapêuticos é uma prática antiga e, atualmente,
Introdução 3
encontra-se em expansão. Dentro desse contexto, o Ministério da Saúde (MS) aprovou a
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde
(SUS), portaria nº 971 de 03/05/2006, com o intuito de valorizar a utilização de plantas
medicinais no SUS. Entre as diretrizes dessa política, tem-se a elaboração da Relação
Nacional de Plantas Medicinais e da Relação Nacional de Fitoterápicos, incentivo à pesquisa
e desenvolvimento de plantas medicinais e fitoterápicos, priorizando a biodiversidade do país,
e também, a garantia do monitoramento da qualidade dos fitoterápicos pelo Sistema Nacional
de Vigilância Sanitária (Ministério da Saúde, Portaria nº 971, 2006).
As pesquisas na área de produtos naturais contribuem também para o
desenvolvimento de novos fármacos, sendo que, muitos dos medicamentos alopáticos, foram
originalmente sintetizados para mimetizar ou otimizar a ação de seu precursor natural. O
grande impacto recente de fármacos derivados de plantas foi, provavelmente, na área dos
quimioterápicos com a introdução de vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®),
podofilotoxina e os análogos etoposídeo (VP-16-213; Vepeside®) e teniposídeo (VM-26;
Vumon®), camptotecina e taxol (plaxitaxel; Taxol®) (Montanari e Bolzani, 2001). Cerca de
60 % dos medicamentos em ensaios clínicos, para diferentes tipos de câncer, são produtos
naturais ou contém farmacóforos derivados de produtos naturais (Cragg et al., 1997; Cragg e
Newman, 2000).
No mercado mundial de medicamentos, estimado em cerca de 300 bilhões de
dólares, aproximadamente 40 % destes são originados, direta ou indiretamente, de fontes
naturais (sendo 75 % de origem vegetal e 25 % de origem animal e de micro-organismos).
Estima-se que o mercado brasileiro de fitoterápicos movimente cerca de 22 bilhões de dólares
por ano (Zuanazzi e Mayorga, 2010).
Tendo em vista a crescente difusão e utilização das plantas medicinais, poucos
estudos foram feitos a fim de se comprovar a garantia da eficácia, segurança e qualidade para
a maioria desses produtos, dificultando a comercialização de fitoterápicos e a possibilidade de
exportação destes (Pinto et al., 2002; Barnes, 2003).
A falta de qualidade de um produto fitoterápico ou droga vegetal pode
interferir na eficácia e segurança do produto. Portanto, é indispensável o desenvolvimento de
métodos analíticos eficazes para o controle da qualidade destes produtos e também das
análises químicas, pois, dados analíticos não confiáveis podem levar a decisões desastrosas e
a prejuízos financeiros irrecuperáveis (Ribani et al., 2004).
Introdução 4
1.2
CONTROLE DE QUALIDADE DAS PLANTAS MEDICINAIS
As plantas possuem centenas de constituintes químicos e alguns deles estão
presentes em baixas concentrações. Normalmente, tem mais de um composto ativo e, muitas
vezes, o princípio ativo é desconhecido. Apesar dos procedimentos analíticos modernos,
raramente, é possível uma investigação fitoquímica de sucesso, pelo isolamento e
caracterização de todos os metabólitos secundários presentes no extrato vegetal (Calixto,
2000). Nesse contexto, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro
de massas (LC-MS) é uma técnica de grande valia no processo de identificação de substâncias
conhecidas, pois permite comparar a amostra analisada com os principais bancos de dados de
substâncias orgânicas (Bugni et al., 2008; Rodrigues et al., 2006).
O acúmulo das substâncias presentes nas plantas é consideravelmente
dependente de vários fatores que dificultam o controle de qualidade dos fitoterápicos. Fatores
como o uso de plantas frescas, temperatura, luz, exposição à água, disponibilidade de
nutrientes, variações sazonais, período da colheita, secagem, embalagem, armazenamento,
transporte, parte da planta coletada, método de extração e preparação, etc., podem afetar
significativamente a qualidade e, conseqüentemente, o efeito terapêutico. Todos esses fatores
explicam a composição química variável da planta (Calixto, 2000; Li et al., 2008; Liang et al.,
2004).
Dessa forma, a normalização e o controle de qualidade de matérias-primas e
preparações fitoterápicas devem ser permanentemente realizados.
Os avanços que ocorreram nos processos de purificação e isolamento
permitiram estabelecer estratégias apropriadas para a análise da qualidade e padronização das
plantas medicinais, a fim de manter quanto possível à homogeneidade do extrato vegetal
(Calixto, 2000).
O emprego de técnicas cromatográficas hifenadas que possibilitam a separação,
identificação e o isolamento de substâncias de um extrato vegetal mostra-se necessário, tanto
para a determinação da composição química do princípio ativo e/ou de uma substância tóxica
de uma planta, como também para a determinação de uma substância, ou grupo de
substâncias, que sirva como marcadora daquela espécie, para controle qualitativo e
Introdução 5
quantitativo, propiciando a padronização do material vegetal e produtos relacionados (SouzaMoreira, 2010; Calixto, 2000).
Dentre as técnicas mais importantes, a cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) pode ser utilizada para a padronização e controle de qualidade da matéria-prima e
fitoterápicos (Calixto, 2000). A CLAE é o método freqüentemente utilizado devido a sua
versatilidade, facilidade de execução, alta resolução na separação, não é limitado pela
volatilidade ou estabilidade do composto analisado, pode-se trabalhar em escala analítica e
preparativa, é um método eficiente, rápido e reprodutível (Liang et al., 2004; McMaster,
2007).
A CLAE combinada ao detector de arranjo de diodos (DAD) é uma técnica
útil, pois pode fornecer numerosas informações sobre os metabólitos, antes mesmo do seu
isolamento, permite otimizar a condição cromatográfica, diminuindo o tempo de análise,
possui uma boa capacidade de separação cromatográfica, fornece o espectro de UltravioletaVisível (UV-Vis) (Espada et al., 2008; Liang et al., 2004).
Essa técnica é amplamente utilizada na análise de produtos naturais que
apresentem grupos cromóforos que propiciam a absorção de luz na região do UV-Vis. Este
detector realiza uma varredura que se estende de 200-800 nm e permite a obtenção de
espectros de UV-Vis das bandas cromatográficas. O baixo preço deste equipamento em
relação aos outros detectores foi a principal causa para seu sucesso, contudo, a necessidade de
maiores informações sobre as estruturas moleculares de cada substância na amostra analisada
levou ao desenvolvimento de técnicas hifenadas mais modernas, como o acoplamento da
CLAE com o espectrômetro de massa e com a ressonância magnética nuclear (Pinto et al.,
2002; Rodrigues et al., 2006).
Desse modo, a CLAE pode ser usada para análise quali e quantitativa de
extratos de origem vegetal, pois sua alta resolução permite a separação de misturas complexas
de substâncias, oferece uma caracterização completa da planta ou do produto analisado e
permitir a distinção entre espécies vegetais próximas. Auxilia ainda na detecção de
adulterantes e na identificação de drogas vegetais baseada no Fingerprint químico (impressão
digital) da amostra analisada pela comparação com padrões e/ou marcadores (Liang et al.,
2004; Liang et al., 2010; Souza-Moreira, 2010).
A técnica de Fingerprint químico é amplamente utilizada no controle de
qualidade de medicamentos fitoterápicos. A “impressão digital” química gerada nesses
Introdução 6
experimentos fornece uma medida da semelhança e da abundância de componentes
específicos entre as amostras, além de definir rapidamente a composição química do extrato
vegetal e gerar pontuações de similaridade (Liang et al., 2004).
Os extratos, nessa técnica, são analisados normalmente por CLAE acoplada a
diferentes detectores que geram perfis químicos únicos, que são usados para comparar a
qualidade e composição da amostra em relação a extratos padrões. Os dados são processados
com o auxílio de algoritmos que permitem a comparação precisa e reprodutível de amostras
analisadas em ocasiões diferentes. Então, é possível detectar a presença de marcadores
químicos dentro de uma amostra e estes são, então, selecionados para a quantificação. (Sahoo
et al., 2010; Li et al., 2008).
1.3
VALIDAÇÃO DO MÉTODO
A validação analítica é um método dinâmico e imprescindível para demonstrar,
através de evidências experimentais, que o método atende às exigências das aplicações
analíticas, assegurando atingir os padrões adequados de exatidão, precisão e confiabilidade
(Silva et al., 2006; Alencar et al., 2004). Deve ser demonstrado que o método é apropriado
para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou
quantitativa de fármacos e outras substâncias em laboratório de produtos farmacêuticos
(Randau et al., 2005).
Para tanto, alguns parâmetros devem ser analisados: especificidade,
linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequado à
análise, demonstrando confiabilidade do método. Esses procedimentos estão descritos em
vários guias de agências reguladoras (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003; ICH,1996; USP,
2005). Entretanto, nenhum desses guias especifica as regulamentações para fitoterápicos e
matérias-primas vegetais. Desta forma, os parâmetros de qualidade estão fundamentados
naqueles recomendados para medicamentos.
I.
Especificidade / Seletividade: capacidade de detectar, de forma inequívoca, a
presença de uma substância na presença de componentes, tais como impurezas, produtos de
Introdução 7
degradação e componentes da matriz, que podem interferir com a sua determinação em uma
amostra complexa. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do
composto de interesse (USP,1999; Vessman et al., 2001; ANVISA, 2003).
Diversos métodos podem ser empregados no estudo da seletividade. Através da
comparação da matriz isenta da substância de interesse e a matriz adicionada com esta
substância, sendo que, nenhum interferente deve sofrer eluição juntamente com a substância
de interesse. Por meio de detectores modernos (DAD, arranjo de diodos) pode-se
correlacionar a área de pico da substância de interesse com a pureza do mesmo. E também,
pelo método de adição de padrão, a partir do qual se constrói uma curva analítica com adição
da substância de interesse na amostra e compara-se com a curva analítica sem a presença da
matriz, caso elas sejam paralelas, pode-se dizer que o método é seletivo (Ribani et al., 2004).
II.
Linearidade: refere-se à capacidade da metodologia analítica gerar resultados
diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de uma faixa de
confiança para qual o método é satisfatório (ANVISA, 2003; INMETRO, 2003).
A fórmula matemática que relaciona a resposta do detector (y) e a concentração
do analito (x) na amostra é a equação da reta:
y = ax + b
Onde:
y: resposta medida (absorbância, altura ou área do pico)
x: concentração do analito
a: inclinação da reta (coeficiente angular)
b: intersecção da curva no eixo y (coeficiente linear)
Para estimar a qualidade da curva analítica obtida utiliza-se o coeficiente de
correlação r. Quanto mais próximo de 1 for esse parâmetro, menor a dispersão do conjunto de
pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. O critério
mínimo aceitável pela ANVISA deve ser igual a 0,99 e o INMETRO recomenda um valor
acima de 0,90 (ANVISA, 2003; INMETRO, 2003).
Introdução 8
III.
Precisão: avalia a proximidade dos resultados obtidos entre ensaios
independentes, repetidos de uma mesma amostra semelhantes ou padrões, em condições
definidas, sendo usualmente expressa como desvio padrão (S) ou desvio padrão relativo
(DPR), também conhecido como coeficiente de variação (CV %).
Desvio padrão: S =
Coeficiente de variação: CV % =
Onde:
: média aritmética de um pequeno número de determinações
: valor individual de uma medição
: número de medições
: desvio padrão
A precisão pode ser medida em três níveis (ANVISA, 2003; ICH, 1996):
a) Repetibilidade: concordância dos resultados dentro de um pequeno espaço
de tempo com as mesmas condições de operação (analista, equipamento, reagentes).
Recomenda-se a análise de no mínimo nove determinações com três concentrações, baixa,
média e alta ou seis determinações a 100% da concentração do teste.
b) Reprodutibilidade: variação inter-laboratorial dos resultados obtidos.
Exigida em casos de inclusão da padronização de procedimentos analíticos nos compêndios e
farmacopéias.
c) Precisão intermediária: concordância dos resultados obtidos no mesmo
laboratório, porém com alguma variação, podendo ser diferentes dias ou diferentes analistas
ou diferentes equipamentos ou uma combinação destes fatores. Segue as mesmas
recomendações para o cálculo de repetitividade descrita acima.
Introdução 9
IV.
Exatidão: demonstra o grau de proximidade entre os resultados experimentais e
um valor de referência aceito como verdadeiro, obedecendo a intervalos de segurança. São
necessárias nove análises com três concentrações diferentes (baixa, média e alta) (ANVISA,
2003; ICH, 1996). Geralmente, os métodos utilizados para avaliar a exatidão são: uso de
materiais de referência, participação em comparações inter-laboratoriais e execução de
ensaios de recuperação (INMETRO, 2003; Thompson et al., 2002). A expressão matemática
utilizada é a seguinte:
Exatidão =
V.
Recuperação: utilizada para avaliar a quantidade de determinado analito
recuperado no processo, em relação à quantidade real presente na amostra. Este parâmetro
permite avaliar a perda da substância devido à baixa recuperação da extração, medidas
volumétricas imprecisas ou interferentes na amostra. Através da comparação da resposta de
uma amostra enriquecida com a não enriquecida, é possível determinar o percentual
recuperado pelo processo. São desejáveis valores próximos de 100 %, porém se aceita uma
variação de até 15 % sendo mais importante o enriquecimento ser preciso, exato e
reprodutível (ANVISA, 2003; Chasin et al.,1998; Causon, 1997; Brito et al., 2003). Para
cálculo da porcentagem faz-se uso da seguinte fórmula:
% Recuperação =
VI.
Limite de Detecção (LOD): refere-se à menor quantidade da substância em
análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, sob as condições
experimentais estabelecidas, segundo a seguinte fórmula (ANVISA, 2003; Ribani et al.,
2004).
LOD =
Introdução 10
VII.
Limite de Quantificação (LOQ): é definido como a menor concentração do
analito de interesse em uma amostra, que pode ser quantitativamente determinado com
valores aceitáveis de precisão e exatidão (Cassiano et al., 2009). O LOQ pode ser calculado
por meio do sinal/ruído, do desvio-padrão e por processos estatísticos.
LOQ =
1.4
FAMÍLIA STYRACACEAE
As Styracaceae são plantas arbustivas ou arbóreas, as quais possuem 160
espécies agrupadas em 11 gêneros (Dickison, 1993; Fritsch et al., 2001). O gênero Styrax L.
possui 130 espécies, que compreende cerca de 80 % do total de espécies da família
Styracaceae, as quais estão distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais, como no Sudeste
da Ásia, Oeste da Malásia e Américas (Hutchinson, 1973; Nakajima e Monteiro, 1986;
Dickison, 1993). No Brasil, são encontradas cerca de 25 espécies desse gênero, sendo que
quatro estão presentes nos cerrados brasileiros: Styrax camporum Pohl., S. ferrugineus Nees
et Mart., S. pohlii A. DC. e S. martii Seub. (Nakajima e Monteiro, 1986; Saraiva et al., 1988).
Figura 1. Styrax camporum Pohl.
Fonte: Lorenzi, 1982.
Introdução 11
Styrax distingue-se dos outros gêneros de Styracaceae, devido à produção de
material resinoso, vulgarmente chamado como resina de benjoim, normalmente secretada
quando se fere a casca da árvore. Essa resina tem sido utilizada em várias partes do mundo em
produtos de perfumaria, cosméticos e na medicina popular como expectorante (Costa, 1996),
pois possui atividade fungicida, bacteriostática e é utilizada nas preparações inalatórias para
bronquite, asma, e outras doenças respiratórias (Steiner e Leifer, 1949; Hjorth, 1961). Por
outro lado, a alergia à tintura de benjoim tem sido reportada, embora não seja de forte
sensibilização (Scardamaglia et al., 2003).
As plantas desse gênero acumulam diversas classes de compostos como
saponinas, triterpenos, lignanas e neolignanas (Pauletti et al., 2006). Estas substâncias
apresentam diversas atividades biológicas, as saponinas, por exemplo, possuem atividade
fungistática (Zehavi et al., 1986; Segal et al., 1966) e antiinflamatória (Min et al., 2004a).
Dentre os efeitos farmacológicos dos triterpenos, destacam-se a atividade no sistema
complemento, sendo um indicativo de atividade na terapia de doenças inflamatórias (Min et
al., 2004a), citotóxica (Kim et al., 2004), efeitos inibitórios contra a matriz metaloproteinase
(MPP)-1 (Moon et al., 2005; Kim et al., 2004) e antiinflamatória (Yun et al., 2007).
Em especial as lignanas e neolignanas têm atraído a atenção de pesquisadores
devido às diversas atividades biológicas apresentadas (Simões, 2004), dentre elas, destacamse se as atividades antibacteriana e antifúngica (Pauletti et al., 2000), antioxidante (Min et al.,
2004b), antihipertensiva (Kakie et al., 1994) e antiinflamatória (Min et al., 2004a).
A espécie Styrax camporum Pohl (Figura 1, p. 10), conhecida como "estoraque
do campo", "cuia de brejo" e "benjoeiro'', amplamente utilizada em doenças gastroduodenais
na medicina popular, teve seu potencial antiulcerativo e toxicidade avaliados. A administração
oral a ratos, durante 30 dias, do extrato seco dos seus galhos (70 % etanol), diminuiu o
tamanho da úlcera induzida por ácido acético e o volume da secreção ácida e aumentou o
número de fibras colágenas. Esses estudos confirmaram a sua eficácia no combate de úlceras
estomacais (Bacchi e Sertie, 1994; Bacchi et al., 1995).
Outras espécies de Styrax, como S. pohlii e S. ferrugineus também são
empregadas na medicina popular no tratamento de febres (Lorenzi, 1982; Rodrigues e
Carvalho, 2008). Na indústria de perfumes e cosméticos, a resina balsâmica conhecida como
benjoim, é a matéria-prima principal para a obtenção do ácido benzóico. Na medicina
Introdução 12
tradicional é utilizado como adjuvante para inalação das vias respiratórias devido às suas
propriedades expectorantes e é comercializada no Brasil (Pauletti et al., 2002).
1.5
LIGNÓIDES
O termo lignóide é uma designação genérica, que caracteriza um grupo de
metabólitos secundários, cujo esqueleto é formado exclusivamente pelo grupo fenilpropânico
(C 6 -C 3 ) n (Figura 2, p. 13), sendo n restrito a poucas unidades (Ward, 1999). Dentre os
lignóides, destacam-se as lignanas e neolignanas.
As lignanas são dímeros, derivados da condensação por acoplamento
oxidativo, de álcoois cinamílicos entre si ou destes com ácidos cinâmicos, cujo carbono γ ou 8
(C3) da cadeia lateral encontra-se oxidado (Ward, 1999). Assim, as lignanas são
biossintetizadas através da dimerização, por acoplamento oxidativo, de unidades
fenilpropanoídicas (C 6 C 3 ), através da ligação do C 8 -C 8’ formando uma variedade de
subclasses estruturalmente bem distintas (Figura 2, p. 13).
Já as neolignanas são dímeros, derivados da condensação por acoplamento
oxidativo de alil e/ou propenil fenóis e, ao contrário das lignanas, são isentas de oxidação no
carbono γ ou 8 (Figura 3, p. 14) (Gottlieb, 1978).
Quando há perda de um ou mais átomos de carbono na estrutura química de
uma lignana ou neolignana, é representado pelo prefixo nor (Moss, G.P., 2000).
Introdução 13
6
5
9
8
7
4
1
2
3
Fenilpropanóide
9
2
3
5
8'
8
1
4
9'
7
6
2'
1'
7'
7'
1
9
4'
6'
Lignana
7
8
3'
2'
2
9'
3 3'
6
5'
6
2
3
8
8'
2'
1
4
9'
7
5
2
1'
7'
N or-lignana
2'
6'
6'
9
7'
3
4'
1'
8
4
3'
5'
7
1
5
9
6'
4
4'
Neolignana
5
8'
1'
5'
3'
4'
N or-neolignana
5'
Figura 2. Estrutura química da unidade fenilpropanoídica, lignana , neolignana, nor-lignana e
nor-neolignana.
Os lignóides são amplamente distribuídas no reino vegetal e podem ser
encontradas nas raízes, hastes, cascas, frutas e sementes de muitas espécies de plantas
(Macrae e Towers, 1984; Gottlieb e Yoshida, 1989), possuindo diferentes níveis de oxidação,
modo de substituição e estrutura química.
No gênero Styrax, a classe de lignóides mais encontrados são as norneolignanas benzofurânicas: egonol (1), homoegonol (2) (Figura 3, p. 14) e seus derivados.
Em 1915, foi isolado pela primeira vez o egonol a partir de sementes de S. japonicum (Okada,
1915) e Kawai e Sugiyama identificaram sua estrutura como sendo 5-(3´´-hidroxipropil)-2(3´,4´-metilenodioxifenil)-7-metoxibenzofurano
(Kawai
e
Sugiyama,
1939).
Foram
identificadas outras substâncias como: o homoegonol, isolado de S. officinalis (Segal et al.,
1967), desmetoxi egonol (1a) de S. obassia (Takanashi et al., 1974), glicosídeos
benzofurânicos (1d-1e; 2a) de S. officinalis (Anil, 1980), e ésteres benzofurânicos (1b-1c) de
S. obassia (Takanashi et al., 1988).
Introdução 14
R3
R1
O
O
O
R2
R1
R2
R3
(1) Egonol
CH2OH
OCH3
H
(1a) Desmetoxi egonol
CH2OH
H
H
OCH3
H
H
H
(1b) Egonol 2-metilbutanoato
H2CO
O
(1c) Desmetoxi egonol 2-metilbutanoato
H2CO
O
(1d) Egonol-β-gentiobiosídeo
CH2O- Gentiobiosil
OCH3
H
(1e) Egonol-β-gentiotriosídeo
CH2OH- Gentiotriosil
OCH3
H
CH2O-Glucose
OCH3
H
(1f ) Egonol-β-glicosídeo
R2
OCH3
R1O
OCH3
O
R3
(2) Homoegol
(2a) Homoegonol-β-gentiobiosídeo
(2b) Homoegonol-β-glicosídeo
R1
R2
R3
H
H
OCH3
Gentiobiosil
H
OCH3
Glucosil
H
OCH3
Figura 3. Lignanas isoladas de Styrax.
O egonol, homoegonol e seus derivados juntamente com o egonol-β-glicosídeo
(1f) e o homoegonol-β-glicosídeo (2b) apresentaram atividade antibacteriana e antifúngica
contra Staphylococcus aureus e Candida albicans (Pauletti et al., 2000). A citotoxicidade do
egonol e homoegonol foi avaliada frente a três linhagens celulares Hep-2, HeLa, e C6, sendo
que apresentaram atividade moderada (Teles et al., 2005). Adicionalmente, o egonol inibiu a
Introdução 15
atividade hemolítica do sistema complemento, este tipo de inibição é benéfico na terapia das
doenças inflamatórias (Min et al., 2004a). Assim, devido a ampla ocorrência das norneolignanas benzofurânicas em espécies de Styrax estas podem ser consideradas os
marcadores quimiossistemáticos do gênero (Pauletti et al, 2006).
A necessidade de determinação e conhecimento dos principais constituintes
químicos (padrões ou marcadores), bem como a padronização desses constituintes
(responsáveis ou não pela atividade terapêutica) para se assegurar a qualidade, a repetibilidade
e minimizar os efeitos adversos promovidos por extratos de plantas medicinais e fitoterápicos
torna-se fundamental o desenvolvimento de métodos analíticos confiáveis (Hosttettman e
Marston, 2002).
Deste modo, devido à ampla utilização, na medicina popular, de espécies de
Styrax faz-se necessário desenvolver e validar uma metodologia analítica para detecção e
quantificação de egonol (1) e homoegonol (2), os principais compostos encontrados nas
espécies de Styrax, S. camporum, S. ferrugineus e S. pohlii.
Objetivos 16
Objetivos
Objetivos 17
2
OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e
validação de um método analítico para o controle de qualidade de extratos vegetais de
espécies de Styrax, principalmente, S. camporum. Para esse propósito, os objetivos
específicos foram:
•
Extração e isolamento dos marcadores químicos, egonol e homoegonol, do
extrato etanólico de S. pohlii;
•
Avaliação do perfil químico do extrato padrão de S. camporum por CLAE-
•
Identificação dos marcadores químicos por DAD;
•
Otimização da condição cromatográfica para detecção e quantificação dos
DAD;
compostos;
•
Preparo dos padrões para obtenção da curva analítica por padronização externa
e por adição de padrão;
•
Validação da metodologia analítica desenvolvida de tal forma que sejam
satisfeitos os requisitos: linearidade, seletividade, precisão e exatidão, limite de quantificação
(LOQ) e detecção (LOD) e Recuperação.
•
Análise e quantificação dos extratos obtidos, caules e folhas de S. camporum,
partes aéreas de S. ferrugineus e S. pohlii.
•
Aplicação da metodologia analítica desenvolvida.
Parte Experimental 18
Parte Experimental
3
PARTE EXPERIMENTAL
3.1
EQUIPAMENTOS
• Evaporador rotativo (Büchi, Switzerland )
• Speed Vac (Thermo Electron Corporation, Waltham, EUA);
• Banho ultrassônico (Unique, modelo USC-1400, Indaiatuba, Brasil);
• Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear de 1H (Bruker, modelo
Ac-200, Billerica, EUA) - IQ-USP - São Carlos;
• Sistema Direct-Q-UV (Millipore, Billerica, USA);
• Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência de sistema binário (LC-6AD),
equipado com um injetor manual Rheodyne com alça de amostragem de 20 µL,
desgaseificador DGU-20A5, e acoplado a um detetor PDA série SPDM-20A, com aquisição
de dados através de um microcomputador, com software LCsolution (Shimadzu, São Paulo,
Brasil);
• Lâmpada UV (Spectroline, modelo ENF-240C, USA)
• Balança analítica (UMark, 250A Bel Engineering, São Paulo, Brasil)
3.2
MATERIAIS
•
Solventes grau P.A. (Synth, São Paulo, Brasil);
•
Clorofórmio deuterado (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA);
•
Metanol grau HPLC (J.T. Baker);
•
Filtro de membrana de Nylon 66, 0,45 µm x 47 mm (Supelco);
•
Filtro de membrana de PVDF, 0,45 µm x 13 mm (Supelco);
•
Sílica gel 60, 230-400 mesh, (ASTM, Sigma-Aldrich, St Louis, USA),
Sílica GF254 (Sigma-Aldrich) e G (Sigma-Aldrich);
•
Coluna ODS, 5 μm, 250 mm x 4,60 mm (Shimadzu Shim-pack)
equipada com pré-coluna do mesmo material;
•
Solução de vanilina preparada da seguinte forma: pesou-se 0,3 g de
vanilina dissolveu-se em 30 mL de uma solução de água (450 mL), ácido sulfúrico (400 mL)
e metanol (450 mL).
3.3
MATERIAL VEGETAL
As partes aéreas das espécies S. pohlii A. DC., S. camporum Pohl e S.
ferrugineus Ness et Mart. foram coletadas na Estação Ecológica do Jataí (EEJ), no município
de Luis Antônio (21°33’ a 21°37’ sul e 47°45’ a 47°57’ oeste, em outubro de 2008 e abril de
2009,
respectivamente).
As
exsicatas
(SPFR12168,
SPFR12170,
SPFR12169,
respectivamente) foram identificadas pela Profa. Valéria Maria Melleiro Gimenez e pelo Prof.
Milton Groppo e depositadas no Herbário do Departamento de Biologia, Laboratório de
Sistemática Vegetal, da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil (SPFR).
3.4
OBTENÇÃO DOS PADRÕES
Para reisolamento dos padrões egonol (1) e homoegonol (2) utilizou-se a
espécie S. pohlii. Assim, após o processo de secagem (40° C) e trituração em moinho de
facas, 2,4 kg das partes aéreas foram submetidas à extração ambiente, por maceração com
etanol durante, aproximadamente, três dias, com três repetições. Em seguida, o extrato obtido
foi filtrado em papel de filtro e o solvente foi removido sob pressão reduzida, o que resultou
em 87 g de extrato bruto.
O extrato etanólico (40 g) foi dissolvido em metanol-água (2:8, v/v) e
submetido à partição líquido-líquido com n-hexano. Após evaporação do solvente, através de
evaporador rotativo, a partição rendeu 2,8 g. Desta fração n-hexânica, 1,39 g foi submetido a
cromatografia em coluna com 28,1 g de sílica gel 70-230 Mesh-ASTM (60 Å, Sigma-Aldrich)
em coluna de 1,5 cm de diâmetro e 47 cm de altura. A fase móvel n-hexano-AcOEt foi
utilizada em ordem crescente de polaridade: n-hexano (300 mL), n-hexano:AcOEt (9:1, 300
mL; 8:2, 400 mL; 7:3, 300 mL; 6:4, 200 mL; 5:5, 100 mL; 3:7, 200 mL; v/v) AcOEt (100
mL) e MeOH (100 mL). Deste procedimento, foram obtidas 111 subfrações, de 20 mL cada,
que após análise por CCDC [n-hexano-AcOEt, 8:2 e 7:3 (v/v)] foram agrupadas em 31
subfrações (Fluxograma 1, p. 21).
Nas subfrações 69-80 e 92-100 identificou-se a presença de duas substâncias
diferentes sendo, assim, purificadas por CCDP com fase móvel DCM-MeOH (98:2, v/v),
sendo que, da subfração 69-80, originou-se a substância 2 (m= 22 mg) que foi analisada por
CLAE-UV e apresentou t R de 25,60 min, sendo identificada por RMN 1H. Na subfração 92100 foi identificada a presença de 1 (m= 27 mg) que ao ser analisada por CLAE-UV, gerou
uma banda cromatográfica com t R de 22,02 min. Essa substância foi identificada por
experimentos de RMN 1H.
Fração n-hexano
m=1,39g
CC (n-hexano:AcOEt)
111 Subfrações
Agrupamento em
31 Subfrações
CCDC (n-hexano:AcOEt)
Subfr. 92-100
Subfr. 69-80
CCDP(DCM:MeOH)
Subfr. 1
m = 27 mg
1
Subfr. 1
m = 22 mg
2
Fluxograma 1. Fracionamento da fração hexânica de S. pohlii.
3.5
PREPARO DOS PADRÕES E AMOSTRA
3.5.1 Preparo da solução estoque de egonol e homoegonol
Preparou-se uma solução dos padrões 1 e 2 (5,0 mg/mL cada) em metanol (1
mL). A partir desta solução, uma solução estoque (84 μg/mL) foi preparada em metanol-água
(95:5, v/v) em balão volumétrico.
A partir dessa solução, sete soluções padrão nas concentrações de 0,36, 1,47,
5,25, 10,50, 21,00, 33,60 e 42,00 μg/mL foram obtidas.
Para o preparo das soluções controle de qualidade foram feitas soluções nas
concentrações de 10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL a partir da solução estoque.
3.5.2 Preparo do extrato padrão dos caules de S. camporum
Pesou-se exatamente 1 g de pó seco dos caules de S. camporum e extraiu-se
com 10 mL de diclorometano através de banho ultrasônico. Depois de 10 minutos, a solução
foi filtrada em papel de filtro e concentrada em Speed Vac. Em seguida, o material foi
ressuspendido em 3 mL de metanol-água (95:5, v/v).
3.5.3 Preparo das amostras
O pó das folhas secas de S. camporum (1 g) foi extraído em 10 mL de
diclorometano com o banho ultrasônico. Depois de 10 minutos, a solução foi filtrada em papel
de filtro e concentrada usando Speed Vac. O material foi ressuspendido em 3 mL de metanolágua (95:5, v/v). Os extratos brutos etanólicos das partes aéreas de S. ferrugineus e S. pohlii
(4,0 mg/mL de cada), anteriormente produzidos pelo nosso grupo de pesquisa, foram
preparados em 1,0 mL de metanol-água (95:5, v/v).
3.6
CONDIÇÕES DE ANÁLISE EM CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA
EFICIÊNCIA ACOPLADO A DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-DAD)
Estudos preliminares foram feitos utilizando um gradiente exploratório
contendo metanol-água (+ 0,1 % de ácido acético) de 5 % a 100 % de metanol em 50 minutos,
100 % de metanol durante 10 min. O tempo de análise total foi de 78 min, incluindo 3 min
para retornar a condição inicial e 15 min de equilíbrio. A detecção feita em 311 nm com um
fluxo de 1,0 mL/min.
Na tentativa de melhorar as condições de análise, o seguinte gradiente foi
empregado: metanol-água (+ 0,1 % de ácido acético) de 50 % a 100 % de metanol em 30 min,
100 % de metanol durante 5 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial e 15 min de
equilíbrio. A detecção feita em 311 nm com um fluxo de 1,0 mL/min.
A fase móvel usada no desenvolvimento e validação do método para
quantificação de 1 e 2 foi composta de metanol-água-ácido acético (73:26,9:0,1, v/v/v) e fluxo
de 1,0 mL / min. Os espectros de UV foram registrados entre 200-400 nm e a detecção feita
em 311 nm.
3.7
VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
A validação do método analítico foi realizada de acordo com os requisitos do
Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos publicados pela Agência Nacional
de Vigilância Sanitária (ANVISA, RE 899, 2003).
3.7.1 Curva analítica por padronização externa
Para a construção da curva de calibração por padrão externo utilizou-se sete
concentrações diferentes de cada padrão, obtidas através de diluições da solução estoque (84
μg/mL) em metanol-água (95:5, v/v).
As soluções contendo 0,36, 1,47, 5,25, 10,5, 21,0, 33,6 e 42,0 μg/mL de 1 e 2,
foram injetadas em triplicata para obter a curva de calibração e, assim, determinar a
linearidade do método. A curva de calibração foi obtida plotando a área do pico versus a
concentração em μg/mL do composto, com a ajuda do programa GraphPad Prism. A
linearidade foi obtida a partir do valor do coeficiente de correlação (r).
3.7.2 Curva de adição de padrão
Alíquotas de 300 µL das soluções-padrão nas concentrações de 10,5, 21,0,
33,6, 42,0, 50,4 e 67,2 μg/mL de 1 e 2 foram transferidas para tubo Falcon com o auxílio de
uma micropipeta, concentradas utilizando um concentrador Speed Vac. Em seguida, foi
adicionada uma quantidade constante de 50 µL do extrato padrão dos caules de S. camporum
e 250 µL de metanol-água (95:5, v/v). As soluções foram injetadas em triplicata. A curva de
calibração por adição de padrão foi construída pelo programa GraphPad Prism. A linearidade
foi obtida através do valor do coeficiente de correlação (r).
3.7.3 Seletividade
Para avaliar a seletividade do método, o detector de arranjo de fotodiodo
(DAD) foi usado para identificar o egonol e o homoegonol e verificar a pureza desses padrões
nos extratos a partir das áreas dos picos correspondentes. Os tempos de retenção dos padrões
1 e 2 foram empregados para a identificação dos mesmos no cromatograma obtido para os
extratos.
3.7.4 Recuperação
A eficiência da extração do egonol e homoegonol foi determinada a partir das
três soluções de controle de qualidade, 10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL que foram adicionadas a
amostras de 1 g de pó seco dos caules de S. camporum, extraídas com 10 mL de DCM em
banho ultrassônico por 10 min. O solvente foi evaporado em Speed Vac e o material
ressuspendido em 3 mL de metanol-água (95:5, v/v), para então serem analisadas em
quintuplicata. O percentual de recuperação foi determinado comparando-se as áreas das
bandas cromatográficas das amostras que foram tratadas com os resultados obtidos a partir da
análise das amostras que não foram tratadas.
% Recuperação =
3.7.5 Precisão (inter e intra-dia)
A precisão do método foi determinada avaliando-se em quintuplicata as três
soluções controle de qualidade (10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL), em três dias não consecutivos. A
precisão e repetibilidade foram confirmadas pelo valor do desvio padrão relativo (DPR) ou
coeficiente de variação (CV %) dos ensaios intra e interdias.
O DPR foi calculado pelo desvio padrão (s) sobre o valor médio medido
multiplicado por 100 sendo admitidos valores de CV % menores ou iguais a 5 % (ANVISA,
2003).
Coeficiente de variação: CV % =
3.7.6 Exatidão
A exatidão do método foi verificada a partir da análise em quintuplicata das
soluções controle de qualidade (10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL). A exatidão foi expressa pela
relação entre o valor médio das concentrações encontradas e o valor da concentração teórica
multiplicado por 100. Para a exatidão foram aceitos valores menores ou iguais a 20 %
(ANVISA, 2003).
Exatidão =
3.7.7 Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ)
O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) foram
determinados de acordo com a curva de calibração, como LOD = 3 x (s/IC) e LOQ = 10 x
(s/IC), onde s é o desvio padrão do branco e IC é a inclinação da curva de calibração.
LOD =
LOD =
Resultados e Discussão 28
Resultados e
Discussão
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS DE Styrax
Os compostos egonol (1) e homoegonol (2) (Figura 4, p. 29) foram eleitos
como marcadores químicos dos extratos de Styrax, pois, até o momento da realização deste
trabalho não havia relatos na literatura sobre qual substância, em particular, poderia estar
relacionada à propriedade antiulcerativa atribuída à espécie S. camporum (Moraes et al.,
2011). Assim, devido à ampla ocorrência das nor-neolignanas benzofurânicas em espécies de
Styrax estas foram escolhidas como padrão externo no desenvolvimento e validação de um
método cromatográfico para análise de extratos de Styrax.
Com base nos R f das cromatoplacas, nos tempos de retenção (t R1 12,07 min e
t R2 20,92 min) dos cromatogramas preliminares obtidos por CLAE-DAD, nos espectros de
UV-Vis e em comparação com padrões disponíveis no nosso laboratório, constatou-se que o
egonol e homoegonol, compostos de média polaridade, eram acessíveis em maior quantidade
e facilidade no extrato bruto etanólico de S. pohlii. Assim, este extrato foi submetido a
processo de partição líquido-líquido e a fração hexânica rica nesses compostos foi purificada
por coluna cromatográfica seguida de uma CCDP.
Os compostos isolados foram identificados por análise de RMN 1H e suas
estruturas foram confirmadas por comparação com dados espectrais disponíveis na literatura
(Schreiber e Stevenson, 1976; Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000).
1"
3'
HO
2'
4
9
3
2''
5
6
7
8
O
2
OCH3
1
3''
O
1
6''
4''
5''
1"
3'
O
HO
2'
4
9
3
2''
5
6
7
O
8
2
6''
OCH3
3''
OCH3
1
4''
5''
2
Figura 4. Estruturas químicas de egonol (1) e homoegonol (2).
OCH3
O espectro de RMN 1H de 1 (Figura 5, p. 32, Tabela 1, p. 31) apresentou sinais
na região correspondente a hidrogênio de anel aromático. O sinal em δ 7,39 foi atribuído ao
H-6′ (dd, J = 8,1 e 1,7, 1H) e os valores das constantes de acoplamento indicaram
acoplamentos em posição orto e meta respectivamente com o H-5′ (δ 6,86, d, J = 8,1, 1H) e o
H-2′ (δ 7,32, d, J = 1,7, 1H), revelando um anel aromático trissubstituído. Os sinais dos
hidrogênios H-4 (δ 6,96, d, J = 1,4, 1H) e H-6 (δ 6,63, d, J = 1,4, 1H) indicaram a presença de
um acoplamento meta e a presença de um anel aromático tetrassubstituído. Os sinais em δ
2,77 (t, J = 7,6, 2H), δ 1,95 (m, 2H) e δ 3,70 (t, J = 6,2, 2H) indicaram a presença de uma
cadeia alifática.
Os singletos em δ 6,78 (H-3) e em δ 6,00 (s, 2H) e δ 4,03 (s, 3H) indicaram a
presença de anel benzofurânico, um grupamento metilenodioxi e uma metoxila ligados a anel
aromático, respectivamente. Esses dados confirmaram a presença de uma nor-neolignana tipo
benzofurânica comumente encontrada em espécies de Styrax, o egonol (1).
O espectro de RMN 1H de 2 (Figura 6, p. 33, Tabela 1, p. 31), apresentou sinais
semelhantes aos da substância 1. Sendo que o sinal em δ 7,45 foi atribuído ao H-6′ (dd, J= 8,5
e 2,0, 1H) e os valores das constantes de acoplamento indicaram o mesmo tipo de
acoplamentos, isto é, em posição orto e meta com o H-5′ (δ 6,93, d, J= 8,5, 1H) e o H-2′ (δ
7,37, d, J=2,0, 1H) revelando um anel aromático trisubstituído. Adicionalmente, os sinais dos
hidrogênios H-4 (δ 6,98,d, J= 1,5, 1H) e H-6 (δ 6,65, d, J=1,5, 1H) e os valores das constantes
de acoplamento evidenciaram acoplamento em meta e indicaram a presença de outro anel
aromático tetrasubstituído. O singleto em δ 6,83 (1H), foi atribuído ao hidrogênio do anel
benzofurano. Os sinais em δ 3,71 (t, J=6,4, 2H), δ 2,79 (t, J=7,6, 2H) e δ 1,96 (m, 2H)
indicaram uma cadeia alifática. Os singletos integrados para 3H em δ 4,03, δ 3,98 e δ 3,93
confirmaram a presença de três metoxilas. Esses dados quando analisados em conjunto com
os valores disponíveis na literatura (Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000; Schreiber e
Stevenson, 1976) permitiram identificar a estrutura do homoegonol, uma nor-neolignana de
ampla ocorrência em espécies de Styrax.
Tabela 1. Dados de RMN 1H (200 MHz) das substâncias 1 e 2 e comparação com a literatura
(CDCl 3 , 200 MHz).
1
1*
2
2**
δ, m, J (Hz)
δ, m, J (Hz)
δ, m, J (Hz)
δ, m, J (Hz)
3
6,78 s
6,76 s
6,83 s
6,75s
4
6,96 d (1,4)
6,91 d (2,0)
6,98 d (1,5)
6,90 d (2,0)
6
6,63 d (1,4)
6,57 d (2,0)
6,65 d (1,5)
6,60 d (2,0)
2´
7,32 d (1,7)
7,29 d (2,0)
7,37 d (2,0)
7,29 d (2,0)
5´
6,86 d (8,1)
6,83 d (2,0)
6,93 d (8,5)
6,80 d (8,0)
6´
7,39 dd (8,1 e 1,7)
7,39 dd (2,0; 8,0)
7,45 dd (8,5 e 2,0)
7,35 dd (2,0; 8,0)
1´´
2,77 t (7,6)
2,82 t (8,0)
2,79 t (7,6)
2,79 t (8,0)
2´´
1,95 m
2,02 m
1,96 m
1,97 m
3´´
3,70 t (6,2)
3,78 t (7,8)
3,71 t (6,4)
3,78 t (7,8)
7-OCH 3
4,03 s
4,01 s
4,03 s
3,99 s
OCH 2 O
6,00 s
5,94 s
-
-
3´-OCH 3
-
-
3,98 s
3,97 s
4´-OCH 3
-
-
3,93 s
3,85 s
H
*
Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000
** Schreiber e Stevenson, 1976; Pauletti et al., 2000
PPM
7.2
6.8
6.4
6.0
5.6
5.2
4.8
7.2
4.4
00
4.0
3.6
3.2
2.8
1.829
7.30
2.069
7.40
2.072
2.999
1.819
0.873
0.822
0.939
0.793
0.993
0.785
6.90
2.4
6.80
2.0
Figura 5. Espectro de RMN 1H de 1 (CDCl 3 , 200 MHz).
6.6334
6.6265
6.7857
6.8432
6.8845
6.9719
6.9686
6.9650
7.2589
7.3228
7.3144
7.3808
7.3722
7.4216
7.4130
6.70
1.6
0.0000
1.9799
1.9483
1.9405
1.9360
1.9038
2.8131
2.7771
2.7369
3.7386
3.7066
3.6747
4.0304
6.0011
7.4216
7.4130
7.3808
7.3722
7.3228
7.3144
7.2589
6.9719
6.9686
6.9650
6.8845
6.8432
6.7857
6.6334
6.6265
SpinWorks 2.5: PADRAO P/ PROTON 0.1% ET. BENZ. EM CDCL3 TMS 21/10/01
6.60
1.2
0.8
0.4
-0.0
PPM
6.8
6.4
6.0
5.6
5.2
4.8
4.4
4.0
3.6
3.2
2.8
2.044
PM
2.161
2.141
3.319
3.240
2.927
0.976
0.974
1.027
0.960
0.998
0.936
2.4
2.0
Figura 6. Espectro de RMN 1H de 2 (CDCl 3 , 200 MHz).
1.6
1.2
0.976
0.960
1.027
0.974
0.936
0.998
6.6434
6.6363
6.8383
6.9051
6.9473
6.9880
6.9834
6.9810
7.2632
7.3723
7.3624
7.4807
7.4705
7.4387
7.4290
0.0014
1.2546
1.9929
1.9613
1.9533
1.9490
1.9167
2.8267
2.7907
2.7504
4.0410
3.9891
3.9314
3.7515
3.7196
3.6879
3.6672
7.4807
7.4705
7.4387
7.4290
7.3723
7.3624
7.2632
6.9880
6.9834
6.9810
6.9473
6.9051
6.8383
6.6434
6.6363
SpinWorks 2.5: PADRAO P/ PROTON 0.1% ET. BENZ. EM CDCL3 TMS 21/10/01
7.447.407.367.327.287.247.207.167.127.087.047.006.966.926.886.846.806.766.726.686.64
0.8
0.4
-0.0
4.2
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DO EGONOL E
HOMOEGONOL NO GÊNERO Styrax
A exigência cada vez maior da qualidade nos produtos de origem vegetal
requer o emprego de técnicas seletivas e eficientes que garantam a segurança na identificação
e quantificação de diferentes substâncias presentes na matriz. A cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) tem sido muito utilizada para a padronização e o controle de qualidade de
materiais vegetais (matéria-prima) e produtos fitoterápicos em processos acabados (He,
2000).
As impressões digitais químicas (fringerprinting) obtidos por técnicas
cromatográficas, especialmente pelas hifenadas, são recomendadas para o controle de
qualidade de medicamentos fitoterápicos, uma vez que podem representar adequadamente a
integridade do produto e, portanto, a autenticidade das plantas medicinais (Giri et al., 2010;
Gong et al., 2003). Através da hifenação é possível combinar uma técnica de separação com
outra técnica de determinação estrutural e identificação de compostos, permitindo uma análise
completa da amostra.
De acordo com Snyder e Dolan (1996), para desenvolvimento de um método
cromatográfico empregando CLAE no modo reverso, é indicado iniciar utilizando uma
eluição gradiente exploratória, a qual tem por objetivo determinar se uma condição gradiente
ou isocrática é a mais apropriada para a análise de uma amostra em estudo. Nessa eluição,
emprega-se uma mistura de H 2 O (solvente A) e um solvente orgânico (solvente B - MeOH ou
ACN) como constituintes da fase móvel, sendo que ocorre a variação da concentração de % B
em um tempo definido (1 hora), sob condições de vazão determinadas e constantes (2,0
mL/min).
O modo isocrático é preferível quando se tem valores baixos de t R e uma boa
resolução dos picos. Assim, a eluição gradiente exploratória indicará qual a porcentagem do
solvente B a ser empregado na análise para se obter os valores de t R desejados (Snyder e
Dolan, 1996).
No caso do modo gradiente, a escolha se dará com base nos valores elevados
de t R e na grande diversidade química ou ainda se não for possível uma boa separação
cromatográfica. A eluição exploratória permite avaliar qual a melhor percentual do solvente B
a ser empregada (concentração inicial e final), reduzindo assim, a faixa de gradiente
empregado e o tempo de análise (Snyder e Dolan, 1996).
A fim de se avaliar o perfil químico do extrato vegetal padrão dos caules de S.
camporum
e identificar a fase móvel mais eficiente para separação dos compostos da
amostra, foi realizada uma análise em gradiente exploratório por CLAE-DAD.
As condições de análise propotas por Snyder e Dolan (1996) foram adaptadas
neste estudo, como a redução da vazão visando avaliar a melhor interação dos compostos da
amostra com a fase estacionária.
Utilizou-se uma coluna C 18 , inicialmente eluída com gradiente MeOH-H 2 O
(0,1% de ácido acético) (Figura 7, p. 36) de 5 % a 100 % de MeOH em 50 min, e 100 %
MeOH durante 10 min, sendo o total da análise 78 min, incluindo 3 min para retornar a
condição inicial, e 15 min para condicionar a coluna, com vazão de 1,0 mL/min. O perfil
cromatográfico inicial do extrato padrão de S. camporum mostrou vários picos menores e dois
picos mais intensos em 311 nm relativos aos compostos 1 e 2. Foi possível notar nesse
cromatograma a presença de poucas bandas cromatográficas no início da análise.
Assim, com intuito de melhorar esses dados o gradiente anterior foi modificado
para MeOH-H 2 O (0,1 % de ácido acético) (Figura 8, p. 36) de 50 % a 100 % de MeOH em 30
min, e 100 % MeOH durante 5 min, incluindo 3 min para retornar a condição inicial, e 15 min
para condicionar a coluna, com vazão de 1,0 mL/min. Nesta nova condição as bandas
cromatográficas relativas aos compostos 1 e 2 eluidas em t R menores, o que é importante em
termos de análise, pois, nesta condição tem-se um tempo de corrida menor.
Com base também nas eluições com gradiente foi possível confirmar que
ambos os padrões possuíam média polaridade, e que seria possível quantificar os padrões
egonol e homoegonol na matriz de forma mais rápida e eficiente, através da otimização das
condições cromatográficas no modo de eluição isocrático. Assim, algumas condições
isocráticas empregando MeOH-H 2 O e ácido acético foram testadas. A resolução adequada e
pureza dos extratos, avaliada pelo detector DAD, foram obtidas com a fase móvel composta
de metanol-água-ácido acético (73:26,9:0,1, v/v /v) (Figura 9, p. 37).
125
mAU
1
100
2
75
50
25
0
0
10
20
30
40
50
min
Figura 7. Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S. camporum.
Condições cromatográficas: eluição gradiente de 5 % a 100 % de MeOH (solvente B) em 60
min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, V inj = 20 μL, [ ] = 1,0 mg/mL.
mAU
1
250
200
2
150
100
50
0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
Figura 8. Cromatograma obtido por CLAE do extrato padrão do caule de S.
camporum. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 50 % a 100 % de MeOH
(solvente B) em 30 min, vazão 1,0 mL/min, λ = 311 nm, V inj = 20 μL, [ ] = 1,0 mg/mL.
mAU
(a)
100
1
50
2
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
min
mAU
(b)
150
100
50
1
2
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
min
mAU
(c)
100
2
1
50
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
min
mAU
(d)
200
150
1
100
50
2
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
min
Figura 9. Cromatogramas obtidos por CLAE do (a) extrato padrão do caule de S. camporum;
(b) extrato das folhas de S. camporum; (c) extrato das partes aéreas de S. pohlii; e (d) extrato
das partes aéreas de S. ferrugineus. Condições cromatográficas: metanol-água-ácido acético
(73:26.9:0.1, v/v/v) e detecção em 311 nm.
4.3
VALIDAÇÃO DO MÉTODO
Os parâmetros de “performance” avaliados foram: seletividade, especificidade,
linearidade, precisão, exatidão, recuperação, limite de detecção e limite de quantificação,
seguindo como referência os limites aceitáveis propostos pelo Guia para Validação de
Métodos Analíticos e Bioanalíticos (ANVISA, 2003).
4.3.1 Seletividade e Especificidade
A curva de calibração (Figura 10, p. 39) pelo método de adição de padrão foi
realizada para avaliar a interferência da matriz. Esta curva de calibração foi estabelecida pela
análise na faixa de 10,5 a 67,2 μg/mL para 1 e 2. As equaçes de regressão encontradas foram
y = 138.900 x + 234.200 e y = 103200 x - 316.100, com um coeficiente de correlação (r) de
0,9986 e 0,9994, respectivamente, e com CV < 2 % para a análise em triplicata. Os resultados
mostraram que não houve diferença significativa nos resultados obtidos pela curva de adição
de padrão e os obtidos pela curva de calibração externa.
O software LCsolution do CLAE-DAD indicou também que os picos referentes
aos compostos 1 e 2 eram exclusivamente destes e que não havia coeluição de nenhum outro
componente da matriz vegetal. Desse modo, com base na curva de calibração por adição de
padrão e pelos dados gerados pelo DAD (Tabela 2, p. 39), concluiu-se que o método
desenvolvido apresenta seletividade e especificidade adequadas para os padrões em cada um
dos extratos analisados, com boa resolução.
A pureza dos padrões isolados, 1 e 2, foi determinada pelas áreas dos picos
detectados por CLAE-DAD como sendo 100% e 98,7%, respectivamente (Tabela 2, p. 39).
Tabela 2. Valores de seletividade para egonol (1) e homoegonol (2).
Pureza do padrão
Similaridade
1
100 %
0.999
2
98,7 %
0.998
4.3.2 Linearidade
O método de padronização foi com padrão externo, sendo que a resposta do
detector DAD a 311 nm apresentou-se linear nas concentrações de 0,36 a 0,42 μg/mL para 1 e
2. As equações de regressão encontradas foram y = 123.000 x - 2.743 e y = 93.490 x - 10.630,
com um coeficiente de correlação (r) de 0,9999 e 0,9998, respectivamente, e com um CV de
< 2 % para a análise em triplicata (Figura 11, p. 40).
Padrão 1 - Egonol
1.5×10
7
Linearidade
Adição de Padrão
Área
1.0×10 7
5.0×10 6
0
0
20
40
60
80
concentração [µg/mL]
Figura 10. Curva de calibração padrão externo x linearidade padrão 1.
Padrão 2 - Homoegonol
8.0×10
6
Linearidade
Adição de Padrão
Área
6.0×10 6
4.0×10 6
2.0×10 6
0
0
20
40
60
80
concentração [µg/mL]
Figura 11. Curva de calibração padrão externo x linearidade padrão 2.
4.3.3 Precisão
A precisão desenvolvida no método foi a de repetibilidade através da análise em
quintuplicata de três soluções padrão com concentração baixa (10,5 μg/mL), média (33,6
μg/mL) e outra alta (67,2 μg/mL) em relação às concentrações da curva de calibração, em três
dias não consecutivos. Os resultados para as replicatas das amostras apresentou CV % de 0,26
a 0,57 para o padrão 1 e de 0,27 a 0,73 para o padrão 2. As análises apresentaram dentro dos
limites de aceitação estabelecidos para o método, não excedendo 5 % (Tabela 3, p. 41).
4.3.4 Exatidão
A exatidão do método também foi avaliada através da análise em quintuplicata
das concentrações baixa, média e alta. Os valores estão de acordo com os critérios de
aceitação estabelecidos para o método, contemplando valores de 99,3 a 104,0 para o padrão 1
e de 105,9 a 110,0 para o padrão 2, ou seja, com variabilidade menores ou igual a 20 %
(Tabela 3, p. 41).
Tabela 3. Exatidão (%) e precisão (CV%) intra e inter-dia para o egonol (1) e homoegonol
(2).
Padrões
1
2
º
Concentração
3º dia (n = 5)
2º dia (n = 5)
1 dia (n = 5)
[µg/mL]
CV (%)
Exatidão
CV (%)
Exatidão
CV (%)
Exatidão
10,5
0,31
100,2
0,56
102,5
0,40
102,8
33,6
0,57
99,3
0,27
100,5
0,35
101,0
67,2
0,26
100,4
0,54
102,0
0,48
104,0
10,5
0,46
107,3
0,39
110,0
0,47
106,1
33,6
0,55
106,2
0,73
107,8
0,35
108,6
67,2
0,43
107,5
0,27
109,5
0,45
105,9
4.3.5 Recuperação
A recuperação de egonol e homoegonol foi determinada através da análise das
soluções padrão em três concentrações: 10,5, 33,6 e 67,2 μg/mL, em quintuplicata. A média
das áreas dos picos das amostras tratada foi comparada com as amostras não tratadas para
obter a porcentagem de recuperação. Os resultados obtidos (Tabela 4, p. 41) ficaram entre
89,6 a 96,2 % e com CV < 2 %, demonstrando que o procedimento de extração empregado
não interfere nas análises.
Tabela 4. Recuperação para o egonol (1) e homoegonol (2).
Concentração
Padrões
[µg/mL]
1
2
Media (%) s (%) Media (%) s (%)
Recuperação (%)
n=5
10,5
93,1
0,82
89,6
0,74
33,6
94,4
0,40
92,7
0,53
67,2
96,2
0,24
94,5
0,21
4.3.6 Limite de Detecção (LOD)
O limite de detecção do método foi calculado mediante a equação abaixo e assim
obteve-se o valor de 0,25 μg/mL para o padrão 1 e de 0,22 μg/mL para o padrão 2.
LOD =
4.3.7 Limite de Quantificação (LOQ)
O limite de detecção do método foi calculado mediante a fórmula abaixo,
obtendo-se o valor de 0,83 μg/mL para o padrão 1 e de 0,73 μg/mL para o padrão 2.
LOQ =
4.4
APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO PARA QUANTIFICAR O
EGONOL E HOMOEGONOL EM S. camporum, S. ferrugineus e S. pohlii
O método desenvolvido por CLAE-DAD mostrou-se, seletivo, específico,
linear, preciso e exato para os dois marcadores propostos para o gênero Styrax. Portanto pode
ser indicado para quantificar o egonol e homoegonol em amostras de S. camporum.
Visando comprovar a aplicabilidade do método desenvolvido, dois extratos
brutos etanólicos de espécies Styrax, previamente preparados (S. pohlii e S. ferrugineus) e o
extrato das folhas secas de S. camporum (Figura 9b-9d, p. 37) foram utilizados para
quantificar os padrões 1 e 2, os quais foram confirmados pelo tempo de retenção (t R1 12,07
min e t R2 20,92 min, aproximadamente) e espectros de UV-Vis (Figura 12, p. 43), sendo o
λ máx em torno de 311 nm (Tabela 5, p. 43). Estes dados confirmaram a presença destes
compostos em diferentes concentrações no gênero Styrax. Além disso, também indicam que o
método poderia ser aplicado para quantificar o material fornecido in natura ou na forma
processada. Além disso, esse método seletivo, específico e simples permite a identificação e
quantificação de egonol e homoegonol em S. camporum e também nas espécies S. ferrugineus
e S. pohlii, as quais acumulam estas nor-neolignanas.
O
presente
trabalho
gerou
uma
publicação
na
revista
Biomedical
Chromatography, sendo que o mesmo encontra-se em anexo (Anexo, p. 55).
(a)
(b) mAU
mAU
150
316
311
215
100
50
216
150
100
50
0
0
200
250
300
350
nm
200
250
300
350
nm
Figura 12. Espectro de UV-Vis dos padrões (a) egonol (1) e (b) homoegonol (2).
Tabela 5. Quantidade (μg/mL) de egonol (1) e homoegonol (2) em espécies de Styrax.
2 [μg/mL] ± sa (%)
Amostras
1 [μg/mL] ± sa (%)
Extrato padrão do caule de S. camporum
12,68 ± 0,06 (0,004)b
2,40 ± 0,04 (0,001)b
Extrato das folhas de S. camporum
2,17 ± 0,04 (0,001)b
1,92 ± 0,02 (0,001)b
Extrato das partes aéreas de S. pohlii
13,77 ± 0,12 (0,34)c
21,96 ±0,09 (0,55)c
Extrato das partes aéreas S. ferrugineus
16,72 ± 0,09 (0,42)c
7,65 ± 0,03 (0,19)c
a
n= 3
porcentagem em relação ao material vegetal seco
c
porcentagem em relação ao extrato bruto etanólico seco
b
Conclusões 44
Conclusões
Conclusões 45
5
CONCLUSÕES
Os padrões egonol e homoegonol, que possuem ampla distribuição em Styrax,
foram extraídos, isolados e identificados de S. pohlii.
O cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado ao detector de arranjo de
diodos (CLAE-DAD), equipado com coluna C 18 , no modo reverso de eluição permitiu, num
primeiro momento, a obtenção de cromatogramas fingerprinting do extrato padrão de S.
camporum, fundamentais para a obtenção do perfil químico do extrato, na escolha da fase
móvel e também na identificação dos marcadores químicos propostos.
Com base nas análises iniciais de LC uma condição analítica isocrática foi
determinada para a quantificação dos padrões no extrato padrão de S. camporum.
O método desenvolvido foi então validado e apresentou seletividade,
especificidade, precisão e exatidão, parâmetros que interferem na qualidade e segurança do
produto. Outros parâmetros foram avaliados, como a linearidade, limite de detecção e
quantificação.
O método desenvolvido permitiu a quantificação de 1 e 2 em outros extratos
vegetais in natura ou na forma processada (S. pohlii e S. ferrugineus e nas folhas S.
camporum.
Referências 46
Referências
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officinalis L. on plant pathogens. Journal of Phytopathology, v. 116, p. 338-343, 1986.
ZUANAZZI, J.A.S.; MAYORGA, P. Fitoprodutos e desenvolvimento econômico. Química
Nova, v. 33, p. 1421-1428, 2010.
Anexo 54
Anexo
Anexo 55
7
ANEXO
Artigo publicado: MORAES, A.C.G; BERTANHA, C.S., GIMENEZ, V.M.M.;
GROPPO, M.; SILVA, M.L.A; CUNHA, W.R.; JANUÁRIO, A.H.; PAULETTI, P.M.
Development and validation of a high-perfomance liquid chromatography method for
quantification of egonol and homoegonol in Styrax species. Biomedical Chromatography,
(wileyonlinelibrary.com) DOI 10.1002/bmc.1744, p. 2011.
Research article
Received: 4 August 2011,
Accepted: 18 September 2011
Published online in Wiley Online Library
(wileyonlinelibrary.com) DOI 10.1002/bmc.1744
Development and validation of a
high-performance liquid chromatography
method for quantification of egonol and
homoegonol in Styrax species
Ana C. G. Moraesa, Camila S. Bertanhaa, Valéria M. M. Gimenezb,
Milton Groppoc, Márcio L. A. Silvaa, Wilson R. Cunhaa, Ana H. Januárioa and
Patrícia M. Paulettia*
ABSTRACT: Styrax camporum Pohl, known in Brazil as ‘estoraque do campo’ or ‘cuia de brejo’, has been used in the treatment
of gastrointestinal diseases. The therapeutic action of S. camporum has been attributed to the ethyl acetate fraction, although
the chemical composition of this fraction has not yet been analyzed. In this study, a high-performance liquid chromatography
photodiode array detection (HPLC-PAD) method for analysis of Brazilian Styrax species has been developed. The compounds
egonol (1) and homoegonol (2) were found to be present in all the samples investigated by HPLC. These compounds were
isolated by open column chromatography followed by preparative TLC, and were identified by 1H NMR. Compounds 1 and
2 were thus proposed as phytochemical markers for Styrax, owing to their biological properties and presence in other
Styrax species. The developed method has been validated and successfully applied for quantification of 1 and 2 in S.
camporum dried leaves and crude ethanolic extracts from S. ferrugineus and S. pohlii aerial parts. Copyright © 2011 John
Wiley & Sons, Ltd.
Keywords: HPLC-PAD; quantitative determination; egonol; homoegonol; Styrax camporum
Introduction
Herbal medicines, or phytomedicines, are medicinal products
existing in plant organs (roots, leaves, barks, seeds, berries or
flowers) that can be used to promote health and treat diseases.
Plants have long found medicinal applications and continue to
be a source of efficacious medications (Li et al., 2008).
The literature describing Brazilian traditional herbal medicine
contains references to the use of plant species belonging to
Styrax (Styracaceae), such as S. camporum Pohl, S. pohlii A. DC.,
and S. ferrugineus Ness et Mart., all of which have been mainly
employed in the treatment of gastrointestinal diseases and
fevers (Lorenzi, 1982; Rodrigues and de Carvalho, 2008). This
genus is also well known for the production of a resinous material that is usually secreted when the barks and trunks of the
plant are injured by sharp objects. This resin is utilized as a
substitute for the benzoin resin, which is remarkable for its
anti-inflammatory properties (Lorenzi, 1982).
The reported use of S. camporum, known in Brazil as ‘estoraque
do campo’ or ‘cuia do brejo’, for the treatment of gastrointestinal diseases has prompted studies on the antiulcer activity
of the stem extract and fractions of this plant (Bacchi and
Sertie, 1994; Bacchi et al., 1995). It has been established that
the ethyl acetate fraction is responsible for the antiulcer activity, and that the crude extract does not display subchronic
toxicity. These studies have supported utilization of the
S. camporum hydroalcoholic extract as an antiulcer phytomedicine in folk medicine.
Biomed. Chromatogr. 2011
Phytochemical investigations of Styrax species have revealed
predominant occurrence of shikimate derivatives such as lignan
derivatives of 3,7-dioxabicyclo [3.3.0] octane, butanolide and
tetrahydrofuran; neolignan derivatives of dihydrobenzofuran;
norneolignan derivatives of benzofuran, phenylpropanoids and
phenolic acids; and pentacyclic saponins and triterpenes
(Pauletti et al., 2006). From a theoretical viewpoint, the therapeutic effects of S. camporum have been attributed to the presence
of tannins and saponins, since these classes of natural
compounds have been identified in the crude extract. However,
a detailed analysis of the chemical composition of the bioactive
ethyl acetate fraction has not yet been accomplished.
In addition, biological investigations have shown that the norneolignans from Styrax, particularly egonol (1) and homoegonol
* Correspondence to: P. M. Pauletti, Universidade de Franca, Av. Dr Armando
Salles de Oliveira, 201, 14404–600, Franca, São Paulo, Brazil. E-mail:
[email protected]
a
Universidade de Franca, Av. Dr Armando Salles de Oliveira, 201, 14404-600,
Franca, São Paulo, Brazil
b
Centro Universitário Claretiano, Rua Dom Bosco, 466, 14.300-000, Batatais,
São Paulo, Brazil
c
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras, Universidade de São Paulo,
Av. Bandeirantes, 3900, 14040-901, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil
Abbreviations used: PAD, photodiode array detection.
Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.
A. C. G. Moraes et al.
(2; Fig. 1) and their derivatives, display moderate antimicrobial
and cytotoxic actions (Pauletti et al., 2000; Teles et al., 2005;
Hirano et al., 1994; Öztürk et al., 2008). Moreover, egonol has
been shown to inhibit the hemolytic activity of the complement
system, which should be beneficial in the therapy of inflammatory diseases (Min et al., 2004).
Quality control and standardization of phytomedicines are
crucial to therapy efficacy (Kroll and Cordes, 2006; Li et al.,
2008). Thus, it is very important to quantify and identify the
active principles in the preparation. In cases where the active
principles are unknown, appropriate phytochemical markers
must be established for analytical purposes according to the
requirements of the Brazilian National Agency of Sanitary
Vigilance and other regulatory agencies (Anvisa, 2004; Li et al., 2008).
In this sense, we now report a high-performance liquid chromatographic photodiode array detection (HPLC-PDA) method
for the quantitative determination of the markers egonol (1)
and homoegonol (2) in S. camporum, S. ferrugineus and S. pohlii
for quality control. These compounds have been selected for application as external standards owing to their wide distribution
in Styrax species and biological properties.
Experimental
Materials
The methanol employed in the experiments was HPLC grade (J.T. Baker,
Phillipsburg, NJ, USA) and was filtered through a 0.45 mm 47 mm Nylon
66 membrane filter prior to use. Ultrapure water was obtained by passing redistilled water through a Direct-Q UV3 system, Millipore (Billerica,
MA, USA). Silica gel 60 (230–400 mesh, Sigma-Aldrich, St Louis, MO,
USA) was used for column chromatography. Thin-layer chromatography
(TLC) was accomplished using silica on TLC Alu foils with fluorescent indicator at 254 nm (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Preparative TLC
was carried out on silica gel type G (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).
(PDA) detector SPDM-20A series, a communication bus module CBM-20A,
and a Reodyne manual injector with a 20 mL loop. HPLC data acquisition
was accomplished with the aid of LCsolution software. Separation of the
micromolecules was carried out on a Shimadzu Shim-pack Octadecyl
silane (ODS) (particle diameter 5 mm, 250 4.60 mm) column equipped
with a pre-column of the same material. For the preliminary studies, the
elution condition was: methanol–water (+ 0.1% acetic acid) gradient from
5 to 100% methanol for 50 min, followed by elution with 100% methanol
for 10 min. The total analysis time was 78 min, including 3 min for return
to the initial condition and 15 min of equilibration. For further experiments, methanol–water (+ 0.1% acetic acid) gradient from 50 to 100%
methanol was used for 30 min, followed by elution with 100% methanol
for 5 min, including 3 min for return to the initial condition and 15 min
of equilibration. The isocratic mobile phase used for development
and validation of the method for quantification of 1 and 2 consisted of
methanol–water–acetic acid (73:26.9:0.1, v/v/v). The flow-rates were set
at 1.0 mL/min UV spectra were recorded between 200 and 400 nm, and
the detection was accomplished at 311 nm.
Isolation of egonol and homoegonol
The air-dried, powdered aerial parts (2.4 kg) of S. pohlii were extracted
with ethanol. After filtration, the solvent was removed under reduced
pressure, to yield 87 g of the extract. The ethanolic extract (40 g) was
then dissolved in methanol–water (2:8, v/v) and successively partitioned
with n-hexane, ethyl acetate and n-butanol. After solvent evaporation
using a rotary evaporator, 2.8, 8.9, 7.6 and 8.2 g of each phase were
obtained, respectively. The n-hexane fraction (1.4 g) was chromatographed over silica eluted with a gradient of n-hexane-ethyl acetate, to
afford 111 fractions. Compounds 1 (27 mg) and 2 (22 mg) were isolated
from fractions 92–100 and 69–80, respectively, after a prep-TLC silica
eluted with dichloromethane–methanol (98:2, v/v). The spectral data of
1 and 2 were in agreement with previously published data (Schreiber
and Stevenson, 1976; Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000). The purity
was determined by means of the HPLC-PAD peak area.
Preparation of standards and samples
Plant material
Aerial parts of Styrax pohlii A. DC., Styrax camporum Pohl and Styrax
ferrugineus Ness et Mart. were collected in the city of Luis Antonio (21 33’
to 21 37’ S and 47 45’ to 47 57’ W, in October 2008 and April 2009,
respectively) and identified by Professor V. M. M. Gimenez and Professor
M. Groppo. Voucher specimens (SPFR12168, SPFR12170 and SPFR12169,
respectively) were deposited in the Herbarium of the Department of
Biology, Laboratory of Plant Systematics, Faculdade de Filosofia Ciências e
Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil (Herbarium
SPFR).
HPLC-PAD analyses
HPLC analyses were conducted on a Shimadzu LC-6 AD system
(Kyoto, Japan) equipped with a degasser DGU-20A5, a Photo diode array
HO
O
Preparation of the stock solution. A solution of egonol and homoegonol (5.0 mg/mL each) was prepared in methanol (1.0 mL). From this
solution, a stock solution (84 mg/mL) was prepared in methanol–water
(95:5, v/v).
Preparation of the standard S. camporum stem extract. The airdried powdered stems of S. camporum (1 g) were accurately weighed
and extracted in 10 mL dichloromethane using an ultrasonic bath. After
10 min, the solution was filtered and concentrated using SpeedVac
concentrator (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA). The
material was then resuspended in 3 mL methanol–water (95:5, v/v).
Sample preparation. The air-dried powdered leaves of S. camporum
(1 g) were accurately weighed and extracted in 10 mL dichloromethane
using an ultrasonic bath. After 10 min, the solution was filtered and
concentrated using a SpeedVac concentrator (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA). The material was then resuspended in 3 mL
methanol–water (95:5, v/v). A solution of the crude ethanolic extracts
of the aerial parts of S. pohlii and S. ferrugineus (4.0 mg/mL each) was
prepared in 1.0 mL methanol–water (95:5, v/v).
OR1
Method validation
OCH3
OR2
-CH2CH3
CH3
Validation of the analytical method was performed according to the
requirements of the Validation Guide for analytical and bioanalytical
methods published by the Brazilian National Agency of Sanitary
Vigilance (Anvisa, 2003).
Figure 1. The structure of egonol (1) and homoegonol (2) isolated from
S. pohlii.
External standard curve. Dilutions of the stock egonol and homoegonol solution (84 mg/mL) were carried out using methanol–water
R1
1
2
wileyonlinelibrary.com/journal/bmc
R2
HPLC method for quantification of egonol and homoegonol in Styrax
(95:5, v/v), to obtain solutions containing 0.36, 1.47, 5.25, 10.50, 21.00,
33.60 and 42.00 mg/mL of 1 and 2, which were injected in triplicate. A
seven-point calibration curve was constructed, to determine the linearity
of the method. The calibration curve was obtained by plotting the peak
area vs the compound concentration in micrograms per milliliter.
Standard addition curve. Aliquots (300 mL) of the standard solutions
with concentrations of 10.5, 21.0, 33.6, 42.0, 50.4 and 67.2 mg/mL of 1 and
2 were concentrated using a SpeedVac concentrator, and were added to
a constant amount (50 mL) of S. camporum standard extract preparation
and 250 mL methanol–water (95:5, v/v). Solutions were injectd in triplicate. The calibration curve was constructede by plotting the peak area
vs the concentration of the added compound in micrograms per
milliliter.
Selectivity. The photo diode array detector was used for identification
of egonol and homoegonol and also for verification of peak purity
during the analytical run of the extracts. The retention times of the
standards egonol and homoegonol were employed for identification at
the analytical chromatogram profile.
Recovery, accuracy and precision. The relative recovery was examined using three quality control solutions prepared in methanol–water
(95:5, v/v), namely at concentrations of 10.5, 33.6 and 67.2 mg/mL. Five
replicate analyses were performed. The peak area ratios at each concentration were compared with those of the three standard solutions, to
obtain the percentage recovery. To measure the assay precision and
repeatability, the intra- and interday tests were done by analyzing three
different concentrations, which were then employed in the recovery
experiment. The tests were carried out on three nonconsecutive days.
Precision and repeatability were confirmed by the relative standard
deviation (RSD) value of the intra- and interday assays. The RSD was calculated by standard deviation over the measured amount multiplied by
100. Accuracy was estimated on the basis of the standard solutions of
the analytes using the three above-mentioned concentration levels
and the percentage accuracy for each concentration.
Limits of detection and quantification. The limit of detection (LOD)
and the limit of quantification (LOQ) were determined according to the
calibration curve, as LOD = 3 (SD/slope) and LOQ = 10 (SD/slope),
where SD is the standard deviation of the response and slope is the
slope of the calibration curve.
Results and discussion
In order to obtain a preliminary idea of the complexity of the
extracts, a combined HPLC-PAD analysis was performed. The
separation was carried out using an ODS column eluted with a
methanol–water (+ 0.1% acetic acid) gradient from 5 to 100%
methanol for 50 min, followed by elution with 100% methanol
for 10 min. The total analysis time was 78 min, including 3 min
for return to the initial condition and 15 min of equilibration.
The initial HPLC profile of the standard extract of S. camporum
(Fig. 2) displayed several minor peaks and two more intense
peaks at 311 nm. To improve this profile, the gradient condition
was modified to methanol–water (+ 0.1% acetic acid) from 50 to
100% methanol for 30 min, followed by elution with 100%
methanol for 5 min, including 3 min for return to the initial
condition, and 15 min of equilibration (Fig. 3). On the basis of
these analyses, the S. pohlii ethanolic crude extract was submitted to the described isolation process, since both standards have
medium polarity and are present in larger quantities in this
crude extract.
The isolated compounds 1 and 2 were identified by 1H NMR
analysis, and results were compared with spectral data available
in the literature. This procedure was necessary since 1 and 2 are
not commercially available (Schreiber and Stevenson, 1976;
Hopkins et al., 1967; Pauletti et al., 2000). Their structures are
depicted in Fig. 1. After complete characterization, the compounds were used as external standards for the development
mAU
125
1
100
2
75
50
25
0
0
10
20
30
40
50
min
Figure 2. HPLC-PAD chromatogram of the standard extract from S. camporum stems. Chromatographic conditions: methanol–water (+ 0.1% acetic
acid) linear gradient from 5 to 100% methanol for 50 min, and 100% methanol for 10 min. The total analysis time was 78 min, including 3 min for return
to the initial condition and 15 min of equilibration and detection at 311 nm. The flow-rate was 1.0 mL/min.
mAU
250
1
200
2
150
100
50
0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
Figure 3. HPLC-PAD chromatogram of the standard extract from S. camporum stems. Chromatographic conditions: methanol–water (+ 0.1% acetic
acid) linear gradient from 50 to 100% methanol for 30 min, and 100% methanol for 5 min, including 3 min for return to the initial condition and
15 min of equilibration and detection at 311 nm. The flow-rate was 1.0 mL/min.
(a)
mAU
100
1
50
2
0
0.0
(b)
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
min
mAU
150
100
50
1
2
0
0.0
(c)
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
min
mAU
100
2
1
50
0
0.0
(d)
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
min
mAU
200
150
100
1
50
2
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
min
Figure 4. HPLC-PAD chromatogram of (a) the standard extract from S. camporum stems; (b) S. camporum leaves extract; (c) S. pohlii aerial parts extract;
and (d) S. ferrugineus aerial parts extract. Chromatographic conditions: methanol–water–acetic acid (73:26.9:0.1, v/v/v) and detection at 311 nm. The
flow-rate was 1.0 mL/min.
and validation of a chromatographic method for the qualitative
and quantitative analysis of the analytes present in Styrax extracts.
Purities were 100 and 98.7% for 1 and 2, respectively, as determined by means of the peak areas detected by HPLC-PAD.
On the basis of the employed gradient elution conditions, an
isocratic analysis for the quantification of egonol and homoegonol chromatographic bands was estimated and tested for a
more rapid and efficient separation of 1 and 2 from the other
matrix compounds. The appropriate resolution and purity of
the peaks were obtained by using the mobile phase methanol–
water–acetic acid (73:26.9:0.1, v/v/v; Fig. 4). The selectivity and
specificity of the analytical method were confirmed using the
PAD software for the standards and for each of the assayed
extracts.
The response of the UV detector at 311 nm was linear from
0.36 to 42.00 mg/mL for both 1 and 2. The obtained regression
equations were y = 123,000x – 2,743 and y = 93,490x – 10,630,
with a correlation coefficient (r2) of 0.9999 and 0.9998, respectively, and an RSD of <2% for the triplicate analysis. The LOD
and LOQ obtained for the standards 1 and 2 were 0.25 and
0.22, and 0.83 and 0.73 mg/mL, respectively. Calibration curves
were constructed by means of the standard addition method,
to evaluate matrix interference. These calibration curves were
Table 1. Extraction recovery of egonol (1) and homoegonol
(2)
Recovery (%), n = 5
Concentration
Standards
(mg/mL)
10.5
33.6
67.2
1 (RSD%) 2 (RSD%)
93.1 (0.82) 89.6 (0.74)
94.4 (0.40) 92.7 (0.53)
96.2 (0.24) 94.5 (0.21)
HPLC method for quantification of egonol and homoegonol in Styrax
Table 2. Accuracy and intra- and inter-day precision of egonol (1) and homoegonol (2)
Standards
1
2
Concentration
(mg/mL)
10.5
33.6
67.2
10.5
33.6
67.2
Day 1 (n = 5)
RSD (%)
0.31
0.57
0.26
0.46
0.55
0.43
Accuracy (%)
100.2
99.3
100.4
107.3
106.2
107.5
established by analysis of 1 and 2 in the 10.5 to 67.2 mg/mL
range. The regression equations were y = 138,900x – 234,200
and y = 103,200x – 316,100, with a correlation coefficient (r2) of
0.9986 and 0.9994, respectively, and an RSD of <2% for the
triplicate analysis. The results showed that there was no significant difference between the mean results determined by the
external calibration curve and the standard addition curve.
The recoveries of egonol and homoegonol were determined
by analyzing the standard solutions at three concentrations:
10.5, 33.6 and 67.2 mg/mL. The peak/area ratios of five treated
samples at each concentration were compared with those of five
injections of untreated samples, to derive a percentage recovery.
The recoveries are summarized in Table 1 and lie in the range
89.6–96.2%, with RSD < 2%.
The intra- and inter-day precision and accuracy of the method
were determined by analyzing five replicates of three standard
solutions at concentrations of 1 and 2 equal to 10.5, 33.6 and
67.2 mg/mL on three nonconsecutive days. Precision is expressed
as coefficient of variation (RSD, %); accuracy was evaluated by
back-calculation and is expressed as the percentage deviation
between the experimentally detected amount and the real
amount for the three evaluated concentrations. Results are
shown in Table 2 and reveal reasonable intra- and inter-assay
precision, with RSD <2%, whereas accuracy varied from 99.3 to
110.0%. Typical chromatograms of the analysis obtained during
the validation study are presented in Fig. 4(a).
The validated method was employed for the quantitative
analysis of egonol and homoegonol in crude ethanolic extracts
of two Styrax species previously prepared in our laboratory
Table 3. Amounts (mg/mL) of egonol (1) and homoegonol
(2) in Styrax species
1 (mg/mL) RSDa (%)
2 (mg/mL) RSDa (%)
S. camporum stem standard 12.68 0.06
extract
(0.004)b
S. camporum leaves
2.17 0.04
(0.001)b
S. pohlii aerial parts
13.77 0.12
(0.34)c
S. ferrugineus aerial parts
16.72 0.09
(0.42)c
2.40 0.04
(0.001)b
1.92 0.02
(0.001)b
21.96 0.09
(0.55)c
7.65 0.03
(0.19)c
Samples
a
n = 3.
Percentage relative to the dried plant material.
c
Percentage relative to the dried crude ethanolic extract.
b
Day 2 (n = 5)
Day 3 (n = 5)
RSD (%)
Accuracy (%)
RSD (%)
Accuracy (%)
0.56
0.27
0.54
0.39
0.73
0.27
102.5
100.5
102.0
110.0
107.8
109.5
0.40
0.35
0.48
0.47
0.35
0.45
102.8
101.0
104.0
106.1
108.6
105.9
(S. pohlii and S. ferrugineus) and in S. camporum dried leaves
(Fig. 4b–d). The presence of 1 and 2 was confirmed by the retention time and UV–vis spectra obtained from authentic samples,
at lmax around 311 nm (Table 3). The data demonstrate that
the investigated plant species accumulate compounds 1 and 2
in different concentrations. The results also indicate that the
method developed herein could be applied for quantification
of material supplied in natura or in process form. This selective,
specific and simple method thus allows for identification and
quantification of egonol and homoegonol in S. camporum and
also in other Styrax species that accumulate these compounds.
Conclusion
The therapeutic effects of S. camporum have not been attributed
to a specific compound; however, biological investigations have
shown that egonol and homoegonol display antimicrobial and
cytotoxic actions (Pauletti et al., 2000; Teles et al., 2005; Hirano
et al., 1994; Öztürk et al., 2008). In addition, egonol has been
shown to inhibit the hemolytic activity of the complement system, which should be beneficial in the therapy of inflammatory
diseases (Min et al., 2004). The developed method can be successfully applied for quantification of 1 and 2 in S. camporum
dried leaves and crude ethanolic extracts from S. ferrugineus
and S. pohlii aerial parts. Thus, these neolignans could be used
as phytochemical markers for the quality control of this traditional herbal medicine.
Acknowledgment
The authors are grateful to Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP), Coordenadoria de Aperfeiçoamento
de Pessoal do Ensino Superior and Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico for fellowships.
FAPESP is also acknowledged for financial support (grant no.
2008/10.283-1).
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Ana H. Januário - Universidade de Franca

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