predição de epítopos descontínuos ou conformacionais em

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
PROGRAMA DE POS-GRADUACAO EM
BIOINFORMATICA
PREDIÇÃO DE EPÍTOPOS DESCONTÍNUOS OU
CONFORMACIONAIS EM PROTEÍNAS ATRAVÉS DA
BIOINFORMÁTICA ESTRUTURAL
Ricardo Andrez Machado de Avila
BELO HORIZONTE
Abril -2011
Ricardo Andrez Machado de Ávila
PREDIÇÃO DE EPÍTOPOS DESCONTÍNUOS OU
CONFORMACIONAIS EM PROTEÍNAS ATRAVÉS DA
BIOINFORMÁTICA ESTRUTURAL.
Projeto de tese apresentado ao Curso de
Pós-Graduação em Bioinformática da
Universidade Federal de Minas Gerais
como requisito parcial para a obtenção do
grau de Doutor em Bioinformática.
ORIENTADOR: DR. CARLOS CHAVEZ OLÓRTEGUI
Laboratório de Imunoquímica de Proteínas Departamento de BioquímicaImunologia, Instituto de Ciências Biologicas – ICB, Universidade Federal de
Minas Gerais – UFMG, Belo Horizonte – MG. Brasil.
CO- ORIENTADOR: DR. Franck Molina
Laboratoire Sysdiag, UMR3145 - CNRS / Bio-Rad - Cap Delta, Montpellier France
BELO HORIZONTE
Abril- 2011
II
Este trabalho foi realizado:
no Laboratório de Imunoquímica de Proteinas, ICB, UFMG;
no Laboratoire Sysdiag , UMR3145 - CNRS / Bio-Rad, Montpellier, França.
E, contou com o apoio financeiro do:
Da Pós-graduação em Bioinformática;
Programa CAPES-COFECUB;
FAPEMIG, CAPES e CNPq
“Quem dorme sonha quem trabalha conquista. Meu trabalho é minha
conquista” [autor desconhecido]
III
AGRADECIMENTOS
A realização desta tese só foi possível graças ao apoio e colaboração de
varias pessoas. Dentre estas pessoas algumas merecem uma menção
especial, então gostaria de agradecer:
Ao Doutor Carlos Chávez, não só pela orientação do doutorado, mas
principalmente pela orientação e amizade em todo o tempo que trabalhamos
juntos. São 12 anos de convivência diária que acarretam numa profunda
admiração fazendo com que hoje ele deixe de ser um orientador e um chefe
para ser visto como um pai científico. Aprendi muito com sua pessoa, com seus
ensinamentos e com a forma de visualizar os experimentos. Obrigado por tudo.
Ao Doutor Franck Molina pela oportunidade, pela amizade e por me
receber em seu laboratório em Montpellier na França. Obrigado por aceitar a
co-orientação e pelo incentivo e confiança.
A Doutora Violaine Moreau, que me acolheu em seu projeto na França e
que desde o primeiro dia se mostrou prestativa, disposta e atenciosa comigo e
com meu futuro como pesquisador. Obrigado pelos puxões de orelhas, pelas
cobranças nos scripts e por toda confiança e mim prestada. Sem sua
orientação esta tese não seria concluída.
Ao Doutor Claude Granier pelos ensinamentos, pelas inúmeras reuniões
cientifica e por todo o carinho depositado em mim.
Ao Dr. Dung Nguyen e Ms. Christophe Nguyen, pela amizade que agora
será para a vida inteira, por me receber tão bem em seu escritório, pelo
carinho, pela atenção, pelos ensinamentos químicos e por fazer de minha
estadia na França muito mais agradável e feliz.
Ao Dr. Eladio Flores Sanchez, pela amizade de anos e pelo veneno de
Lachesis muta muta e proteína LHF-II. Obrigado pela atenção e gentileza. Ao
Dr. Adriano Pimenta por sempre me receber bem em seu laboratório e me deu
total liberdade e confiança em utilizar seus espectrofotométricos de massas.
Ao Dr. Marcelo Santoro pela amizade e por toda intercessões com os
vários problemas burocráticos do departamento e ao Dr. Marcos Augusto pela
IV
enorme ajuda com a disciplina de algoritmos. Obrigado e espero que as
colaborações continuem. Ao Dr. Paulo Beirão pela ajuda na obtenção da bolsa
para o estágio no exterior. Ao Dr. Miguel Ortega e Dr. Carlos Henrique da
Silveira por todas as sugestões durante a qualificação.
Ao grande amigo Dr. Tomaz Haroldo, pela calma e sabedoria
transmitidas durante conversas agradáveis e inesquecíveis. Agradeço a
oportunidade de aprender com você.
A Paula Castanheira pela gentileza e informações dos dados de phage
display.
As minhas eternas ICs, Melina, Balu, Fabiola, Stephanie, Carol, Mariana
e Jéssica que trabalharam arduamente em meus projetos, sempre com
amizade e dedicação, mesmo nos dias de TPM ( ). Esta tese também é de
vocês.
Ao meu grande amigo Chico Franguinho, também conhecido por PetitPoulet. Obrigado por toda amizade, ajuda, discussões e ensinamentos com os
experimentos, revisão da tese e principalmente pelos vários momentos de
lazeres.
A Christina (Querida), Clara (coração) e Maria Clara (Caca) pela revisão
da tese, amizade e discussões dos resultados durante esta jornada. A Liza pela
ajuda no projeto de seleção do doutorado.
A todos os colegas e ex-colegas do Laboratório de Imunoquímica de
Proteínas, entre eles, Camila, Gabi, Fernanda Melo, Fernanda Costa, Marina
Costal, Karen, Julia, Daysi, Thais, Betânia, Poly, Paula Henriques, Paula
Batista, Larissa, Dulcilene, Diogo, Eric, Michelle, Rafaela, PC, Lu, Fabiola,
Marina, Mariana, Juju, Tutu e Julio por todos este tempo trabalhando juntos.
A todos os amigos do SysDiag que foram muito importantes na minha
formação. Em especial, agradeço aos estimados Daniel, Vincent, David,
Sandrine, Leticia, Sandra, Caroline, Christopher, Sabine, Eva, Dominique,
Nicolas, Leonel e Pascal.
V
Aos amigos professores e colegas da Bioinformática e do departamento
de Bioquímica-Imunologia.
Aos amigos que fiz em Montpellier, Rebeca, Manolo, Sara, Thais, Julia,
Kaká, Fernanda, Thiago, Fred, Pedro, David, Cristina, José, Carla, Fernando,
Ali, Denise, Frederic, Nani, Maria, Riscardim e Lu pelos momentos especiais
durante minha estadia na França.
Aos grandes amigos da turma do café e do buteco da bio, Gianne,
Gancho, Jamil, Vandeca, Miguelito, Jáder, Wanderson (Mamão) pelos
momentos de distrações e pelas diversas discussões cientificas em torno de
um copo de cerveja.
Aos meus amigos Mario, Agenor, Lu e Carol, por todos os conselhos,
amizades e paciência em me ouvir.
Aos The Kaflankos por sempre ser a solução.
E mais que especial a minha família, minha mãe e meu pai que sempre
apoiaram meus estudos, em muitos momentos me ajudando financeiramente e
que sempre me ensinaram a crescer sem precisar passar por cima de outras
pessoas. Obrigado por tudo.
Aos meus irmãos Dedei e Rafael e cunhadas Cris e Fabiana por todo
carinho e incentivo. A Carol pela enorme paciência, principalmente no mau
humor fruto desta loucura que é escrever uma tese. A Aline por ser a sapeca
do titio
E principalmente ao meu querido filho André por sempre entender e
aceitar meus momentos de ausência, sendo sempre um filho atencioso,
carinhoso e respeitador. Esta tese é para você.
VI
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS........................................IX
LISTA DE TABELAS.......................................XII
RESUMO................................................XIII
ABSCTRAT...............................................XIV
1 - INTRODUÇÃO..........................................01
1.1 - Proteínas e Aminoácidos.......................02
1.2 - Interações Proteínas-Anticorpos...............09
1.3 - A evolução da Bioinformática..................11
1.4 – Proteômica....................................17
1.5 - Epítopos......................................19
1.6 - Mapeamentos de Epítopos.......................23
2
– CONTRIBUIÇÕES......................................27
3
– OBJETIVOS..........................................32
3.1 - Objetivos gerais..............................33
3.2 - Objetivos específicos.........................33
4
– MATERIAIS E MÉTODOS................................35
4.1 - Moléculas alvo para o mapeamento de epítopos..36
4.2 - Animais e proteínas...........................36
4.3 - Anticorpos monoclonais........................36
4.4 - Modelagem Molecular...........................37
4.5 - Classificações das estruturas modeladas.......38
4.6 - Predições por PEPOP...........................38
4.7 - Predições pelo STING Millennium...............41
4.8 - Predições pelo MIMOP..........................42
4.9 - SPOT..........................................43
4.9.1 - Sínteses...............................43
VII
4.9.2 - Sintese - ALA-Scan.....................44
4.9.3 - Ensaio Imunoquímico....................44
4.9.4 - Revelação Fosfatase Alcalina...........45
4.9.5 - Revelação ECL..........................45
4.9.6 - Regeneração da Membrana................45
4.10 - Síntese Química de Peptídeos.................46
4.11 - Purificações dos peptídeos sintéticos........47
4.12 - Espectrometria de massa......................47
4.13 - Preparação de Lipossoma......................48
4.14 - Protocolos de Imunização.....................48
4.15 - Determinação da atividade hemorrágica........49
4.16
-
Caracterizações
bioquímicas
dos
epítopos/
mimotopos identificados.................................49
5 - Resultados e Discussões.............................50
5.1 - AaH-II........................................52
5.2 - GM-CSF........................................60
5.3 – DNF...........................................72
5.4 - LHF-II........................................79
5.5
-
Caracterizações
bioquímicas
dos
epítopos/
mimotopos identificados.............................99
6 - CONCLUSÕES.........................................108
7 - PERSPECTIVAS.......................................110
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................112
9 – ANEXOS.............................................137
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Número de estruturas depositadas no PDB desde sua
criação.................................................15
Figura 2: Interação antígeno-anticorpo..................21
Figura 3: Ilustração dos tipos de epítopos..............22
Figura 4: Métodos de extensão para design de peptídeos
utilizados pelo programa PEPOP. ........................40
Figura 5: Escorpião Androctonus australis Hector........52
Figura 6: Resultado do teste de SPOT dos 73
peptídeos
preditos por PEPOP contra o anticorpo monoclonal mAb 4C1
neutralizante da toxina AaH-II..........................54
Figura
7:
Visualização
na
estrutura
3D
dos
peptídeos
reativos ao mAb 4C1 da AaH-II (1AHO.pdb)................56
Figura
8:
Visualização
na
estrutura
3D
do
epitopo
descontinuo da Lmm-VIII contra anticorpos policlonais antiLmm-VIII................................................58
Figura 9: Alinhamento linear das toxinas AaH-II e AmmVII.....................................................58
Figura 10: Membrana de celulose contendo os 175 peptídeos
preditos por PEPOP......................................64
Figura 11: Peptídeos predito por PEPOP reconhecidos pelo
mAb 2C4F10..............................................66
Figura 12: Visualização dos resíduos pertencente aos dois
motivos
reativos
ao
anticorpo
monoclonal
mAb
2C4F10
na
estrutura 3D da GM-CSF (2GMF.pdb).......................67
IX
Figura 13: Resultado do ALA-Scan dos peptídeos reativos ao
mAb 2C4F10..............................................70
Figura 14: Foto da aranha marrom (Loxosceles intermedia)72
Figura
15:
Membrana
de
celulose
com
os
456
peptídeos
propostos pelo PEPOP para a DNF.........................76
Figura
16:
Visualização
do
peptídeo
624
(KYNPDPGN)
na
estrutura 3D da DNF.....................................77
Figura 17: Resultado não reativo do Ala Scan do peptídeo KY-N-P-D-P-G-N...........................................78
Figura 18 – Serpente Lachesis muta muta.................79
Figura 19: Membrana de SPOT dos mimotopos selecionado por
Phage Display...........................................83
Figura 20: Possíveis resíduos da LHF-II que são mimetizados
pelos mimotopos selecionados por Phage Display..........84
Figura
21:
Estrutura
da
LHF-II
modelada
a
partir
da
Atrolisina C (1ATL.pdb).................................86
Figura
22:
Membrana
Linear
da
LHF-II
testada
com
o
anticorpo LmmAbB2D4.....................................87
Figura
23:
Visualização
dos
resíduos
selecionados
pelo
STING Millennium como epítopos..........................90
Figura
24:
Ensaio
Hemorrágico
no
dorso
dos
coelhos
imunizados com os oito peptídeos da Tabela 10...........92
Figura 25: Composição dos peptídeos reativos ao anticorpo
monoclonal LmmAbB2D4....................................96
Figura
26:
Freqüência
de
reatividade
de
cada
segmento
predito pelo PEPOP......................................97
X
Figura 27: Visualização dos segmentos mais reativos para o
monoclonal LmmAbB2D4 a partir dos resultados obtidos pela
predição do PEPOP na estrutura da LHF-II................98
Figura 28: Ponto Isoelétrico para os 76 peptídeos reativos
aos anticorpos utilizados nesta tese...................100
Figura
29:
Distribuição
dos
76
peptídeos
reativos
aos
anticorpos utilizados nesta tese em função dos pI......101
Figura 30: Formulário HTML para cálculo do pI..........102
Figura 31: Equação de Henderson-Hasselbach.............103
Figura 32: Script do arquivo calculerpI.php para calculo do
pI das seqüências digitas no formulário HTML...........104
Figura
33:
Script
para
visualização
das
Tabelas
de
seqüências preditas pelo programa PEPOP e da freqüência que
cada segmento é predito................................106
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Lista dos 20 Aminoácidos protogênicos.........04
Tabela 2: Número de estruturas depositadas no PDB de acordo
com o método no qual elas foram determinadas............16
Tabela
3:
Peptídeos
preditos
pelo
programas
PEPOP
para
diferentes proteínas....................................29
Tabela
4:
Segmentos
acessíveis
da
toxina
AaH-II
identificado pelo PEPOP e sua posição no PDB (1AHO.pdb).54
Tabela 5: Peptídeos reativos contra o anticorpo monoclonal
mAb 4C1 pela técnica de SPOT............................55
Tabela 6: Segmentos acessíveis da GM-CSF identificado por
PEPOP e sua posição no PDB (2GMF.pdb)...................63
Tabela 7: Freqüência de predição de cada segmento nos 175
peptídeos...............................................68
Tabela 8: Segmentos acessíveis identificado pelo PEPOP e
sua posição no modelo da DNF............................75
Tabela 9: Mimotopos selecionados por Phage Display......82
Tabela 10: Peptídeos sintetizados pela técnica de Sínteses
Química de Peptídeo.....................................88
Tabela 13: Esquema de imunização e sangria dos coelhos..91
Tabela 12: Segmentos acessíveis identificado pelo PEPOP e
sua posição no modelo da LHF-II.........................95
Tabela
13:
Valores
macromoléculas
de
Ka
consideradas
de
diversas
importantes
fontes
no
para
as
calculo
do
pI.....................................................105
XII
Resumo
Epítopos descontínuos para as proteínas AaH-II, GM-CSF, DNF e LHF-II foram
preditos através do programa de bioinformática PEPOP. Este programa utiliza
a estrutura 3D das proteínas para mapear e agrupar segmentos de
aminoácidos acessíveis na superfície da proteína. Em seguida, através de
diferentes metodologias, peptídeos são propostos a partir da combinação
destes segmentos. Estes peptídeos foram sintetizados em uma membrana de
SPOT e tiveram sua reatividade testada frente a anticorpos monoclonais
neutralizantes
destas
proteínas.
Os
peptídeos
reativos
tiveram
seus
aminoácidos visualizados na estrutura 3D de suas proteínas de origem. Estes
resultados indicaram que os peptídeos reativos mimetizam os epítopos
descontínuos encontrados na estrutura 3D de suas proteínas. Outros dois
programas de bioinformática MIMOP e STING foram também utilizados para
predizer epítopos descontínuos da LHF-II. O STING funciona como uma
combinação de conjuntos de dados disponíveis na internet e de dados por ele
calculados. A partir da combinação de três parâmetros físico-químicos do
STING, resíduos de aminoácidos foram selecionados evidenciando duas
regiões na estrutura 3D. Dois peptídeos foram, então, propostos a partir dos
aminoácidos que se encontravam na superfície destas regiões. O MIMOP
utilizou dos mimotopos selecionados pela técnica de phage display e da
seqüência e estrutura 3D da LHF-II para localizar na proteína as regiões que
foram mimetizadas por estes mimotopos. Duas regiões foram encontradas e
um peptídeo foi proposto a partir da combinação dos aminoácidos selecionados
das mesmas. Estes peptídeos juntamente com os mimotopos selecionados por
phage display foram sintetizados por síntese química e utilizados como
imunógeno em coelhos. Os imunoensaios mostraram que esses peptídeos
induziam a produção de anticorpos capazes de neutralizar o veneno de
Lachesis muta muta e que o anticorpo monoclonal anti-veneno de LHF-II se
liga a uma região antigênica na porção C-terminal da toxina.
Palavras chave: Epítopos
Bioinformática estrutural
descontínuos,
PEPOP,
MIMOP,
STING,
XIII
Abstract
In this study we realized the prediction of discontinuous epitopes for the
proteins AaH-II, GM-CSF, DNF and LHF-II. For this, we use the PEPOP
bioinformatics tool. This program uses the 3D structure of the proteins to search
and cluster segments of amino acids accessible on the surface of the protein.
Peptides are proposed through of the combinations of these segments by
different method. These peptides were synthesized on a SPOT membrane and
their reactivity tested against monoclonal antibodies neutralizing these proteins.
The amino acids of the reactive peptides were visualized in the 3D structure of
proteins of origin. These results indicated that the reactive peptides mimic the
discontinuous epitopes region visualized in the 3D structure of the protein. Two
other bioinformatics programs, MIMOP and STING, were also employed to
predict discontinuous epitopes of the LHF-II protein. The STING tools make the
combination of data accessible on internet and date calculated by it. Through
the use three physico-chemical parameters combined of the STING, amino acid
residues were then selected. Two regions are shown evidenced in 3D structure.
Two peptides were proposed with the amino acids of the surface of these
regions. MIMOP uses the mimotope selected by phage display technique and
the sequence and 3D structure of LHF-II to visualize the protein regions
mimicked by these mimotope. Two regions were also found and one peptide
was proposed by combination of the amino acids selected in these regions.
These peptides and mimotopes selected by phage display were synthesized by
the technique of chemical synthesis of peptides and used as an immunogen in
rabbits. Immunoassays showed that these peptides were neutralizing the
venom of Lachesis muta muta and that the monoclonal anti-venom LHF-II was
coupled to an antigenic region in C-terminal of the protein.
Keywords: discontinuous epitopes, PEPOP, MIMOP, STING, Structural
Bioinformatics.
XIV
Página | 1
1 – INTRODUÇÃO
1.1 - Proteínas e Aminoácidos
Proteína é uma palavra que vem do grego “proteíos" que significa “que
tem prioridade, o mais importante". As proteínas são consideradas junto com o
DNA e RNA, as macromoléculas mais importantes das células. Em muitos
organismos, correspondem a quase 50% de suas massas secas. No organismo
humano existem pelo menos 30.000 proteínas diferentes localizadas dentro de
células realizando diversas funções [1-2].
Os primeiros estudos com proteínas aconteceram ainda no início do
século XIX, quando o holandês Gerhardus Mulder (1802-1880) e o famoso
químico sueco Jons Jakob Berzelius (1779–1848), desenvolviam trabalhos
pioneiros na composição química dos seres vivos. Mulder, em artigo publicado
em 1839 no Journal fur Praktische Chemie, escrevia que ele e Berzelius
vinham se comunicando sobre resultados encontrados no estudo de moléculas
essenciais à vida animal, como albumina, fibrinas e gelatinas [3]. A
comunicação na qual Mulder referia-se é provavelmente uma carta enviada a
ele por Berzelius, no ano anterior a essa publicação, datada de 10 de Julho de
1838, onde encontramos essa passagem histórica:
“Le nom protéine que je vous propose pour l’oxyde organique de la fibrine et
del’albumine, je voulais le dériver de (protêios)1 parce qu’il paraît être la
substance primitive ou principale de la nutrition animale.
“O nome proteína que eu vos proponho para o oxido orgânico da fibrina
e da albumina, eu gostaria derivá-lo de (protêios), já que ela
se parece ser a substância primitiva ou a principal na nutrição
animal.”
Hoje, sabemos que Mulder e Berzelius estavam certos, já que as
proteínas são uma das mais importantes moléculas dos seres vivos. Elas estão
envolvidas em uma série de processos bioquímicos e possuem diversas
Página | 2
funções nos mais diversos organismos. As informações genéticas, por
exemplo, são expressas por proteínas. Além disso, elas estão envolvidas nas
reações
enzimáticas,
contração
muscular,
divisão
celular,
respostas
imunológicas, auto-reconstituição e reparação de tecidos, controle hormonal,
transporte de substâncias pelos fluidos corporais e transporte celular
intermembrana, na construção das membranas, transmição ou condução de
impulso nervoso, reserva e armazenagem de nutrientes, em outras funções
não inclusas ou não delimitadas pelas categorizações acima, como nos
venenos e toxinas, agentes antimicrobianos, substâncias anticongelantes, etc.
Não é surpresa que elas sejam a segunda substância mais encontradas nos
seres vivos, ficando atrás apenas da água [2].
Embora
toda
essa
enorme
rede
de
funções
viesse
sendo
gradativamente descoberta desde a época de Mulder e Berzelius, até o início
do século XX pouco se sabia sobre a natureza química das proteínas, no que
diz respeito aos avanços feitos na identificação de seus blocos construtores, os
aminoácidos, e na caracterização da ligação peptídica, realizada em 1902 por
Emil Ficher (1852-1919) e Franz Hofmeister (1850-1922) [4]. É interessante
notar que o primeiro aminoácido primário (também chamado de proteogênico
por estar integrado ao código genético padrão), a Asparagina, foi isolado por
Pierre Jean Robiquet (1780 - 1840) em 1806 [5], bem antes de Berzelius
pensar em “protêios”.
Entretanto, o último dos 20 aminoácidos primários
codificados na síntese biológica, a Treonina, somente foi descrito em 1938, por
William Cumming Rose (1887 – 1985) [6].
A Tabela 1 mostra os 20
aminoácidos primários e suas principais características.
O que mais intrigava os pesquisadores naquela época era o fato de
longas cadeias poliméricas de aminoácidos formarem cristais e também das
proteínas se desnaturarem, perdendo sua função sob ação de certos agentes
físicos ou químicos tais como calor, pressão, agitação mecânica, luz
ultravioleta, pH e osmólitos [7].
Página | 3
Tabela 1: Lista dos 20 Aminoácidos protogênicos quanto ao símbolo,
abreviação e nomenclatura
Nome
Símbolo
Abreviação
Nomenclatura
Glicina
Gly
G
Ácido 2-aminoacético ou Ácido 2-aminoetanóico
Alanina
Ala
A
Ácido 2-aminopropiônico ou Ácido 2amino-propanóico
Leucina
Leu
L
Ácido 2-aminoisocapróico ou Ácido 2amino-4-metil-pentanóico
Valina
Val
V
Isoleucina
Ile
I
Prolina
Pro
P
Fenilalanina
Phe
F
Serina
Ser
S
Treonina
Thr
T
Ácido 2-aminovalérico ou Ácido 2amino-3-metil-butanóico
Ácido 2-amino-3-metil-n-valérico ou
ácido 2-amino-3-metil-pentanóico
Ácido pirrolidino-2-carboxílíco
Ácido 2-amino-3-fenil-propiônico ou
Ácido 2-amino-3-fenil-propanóico
Ácido 2-amino-3-hidroxi-propiônico ou
Ácido 2-amino-3-hidroxi-propanóico
Ácido 2-amino-3-hidroxi-n-butírico
Ácido 2-bis-(2-amino-propiônico)-3dissulfeto ou Ácido 3-tiol-2-aminopropanóico
Ácido 2-amino-3-(phidroxifenil)propiônico ou
paraidroxifenilalanina
Ácido 2-aminossuccionâmico
Cisteina
Cys
C
Tirosina
Tyr
Y
Asparagina
Asn
N
Glutamina
Gln
Q
Aspartato ou
Ácido aspártico
Asp
D
Ácido 2-aminossuccínico ou Ácido 2amino-butanodióico
Glutamato ou
Ácido glutâmico
Glu
E
Ácido 2-aminoglutárico
Arginina
Arg
R
Lisina
Lys
K
Histidina
His
H
Triptofano
Trp
W
Ácido 2-aminoglutarâmico
Ácido 2-amino-4-guanidina-n-valérico
Ácido 2,6-diaminocapróico ou Ácido 2, 6diaminoexanóico
Ácido 2-amino-3-imidazolpropiônico
Ácido 2-amino-3-indolpropiônico
Página | 4
A capacidade das proteínas cristalizarem-se, formando diferentes
cristais conforme a molécula indicava que sua função dependia de uma
organização espacial rigorosa [2]. De maneira geral, a formação de um cristal
exige um arranjo coerente e repetitivo de unidades estruturalmente
semelhantes.
A elucidação da cristalização das proteínas começou a fazer sentido
com Linus Pauling e Robert Corey, no final dos anos 40. Com base em dados
de cristalografia por raios X, eles previram o papel das pontes de hidrogênio na
formação de estruturas secundárias como as alfas hélices [8] e folhas betas [9].
Dez anos mais tarde, Max Perutz (1914-2002) e John C. Kendrew (1917-1997)
pela da técnica de difração de raios-X para proteínas confirmaram as previsões
de Pauling e Corey, a partir da primeira resolução estrutural completa da
hemoglobina humana [10] e a mioglobina de cachalote [11] respectivamente.
Enquanto o estudo sobre as formações de cristais direcionava as idéias
sobre proteínas para um mundo estruturado e organizado, o curioso fenômeno
da desnaturação levava ao caminho inverso. Entre 1935 e 1940, Alfred Mirsky
(1900-1974) e Mortimer Louis Anson (1901–1968) levaram de forma
convincente ao mundo científico evidências contrárias ao consenso da época
sobre desnaturação das proteínas. Na época, era postulado que este processo
era um fenômeno irreversível. Em seus artigos Mirsky e Anson mostraram que
era
possíveis
recuperar
hemoglobinas
desnaturadas
ou
coaguladas,
preservando as mesmas propriedades de uma hemoglobina intacta [12].
Outro pesquisador que tentou elucidar a desnaturação de proteínas foi o
chinês Hsien Wu (1893-1959) [13]. Ainda em 1931, era levado em
consideração que as proteínas eram compostas por longos polímeros de
aminoácidos, induzindo à constatação de que sua cadeia deveria estar dobrada
ou enovelada em si mesma. Wu recomendou enxergar a desnaturação como
um
processo
de
desorganização
estrutural
em
decorrência
do
desempacotamento da cadeia. Ele acreditava que os agentes desnaturantes
destruiriam uma proteína pelo enfraquecimento das interações polares e/ou
Página | 5
Coulombicas.
Na
ausência
do
agente
desnaturante,
essas
forças
reconduziriam a proteína ao seu estado nativo e funcional.
Esta idéia de enovelamento, hoje bem trivial, também foi utilizada por
Alfred Mirsky e Linus Pauling, em 1936, para propor uma teoria parecida com a
de Wu. No entanto eles se basearam nas interações entre cadeias das pontes
de
hidrogênio
como
base
deste
processo
[14].
Pauling
estudava
exaustivamente a importância das pontes de hidrogênio nas interações
moleculares e com o seu posterior sucesso da previsão das alfa-hélices,
matematicamente confirmadas pelas coordenadas atômicas das globinas por
Perutz e Kendrew nos anos 60, dogmatizaria o papel das pontes de hidrogênio
não só em proteínas, mas em toda bioquímica [13].
Na década de 50, outra interação importante das proteínas começa a ser
elucidada. Inicialmente Walter Kauzmann começa a estudar os fatores
entrópicos da água na estabilidade da cadeia, criando um dos mais importantes
conceitos da físico-química de proteínas: a interação hidrofóbica [15].
Ao longo das décadas de 50 e 60 o problema da desnaturação é
invertido e passa a ser o problema do enovelamento, como relembra Irving
Klotz [16]. Os avanços da nascente biologia molecular contribuíram para essa
inversão principalmente o processo de elucidação da síntese protéica in vivo
iniciada por Paul Zamecnik (1913-2009), em 1950 [17]. Afinal, se uma proteína
é linearmente montada, aminoácido a aminoácido, a partir da informação
codificada em ácidos nucléicos, a última etapa da decodificação genética teria
de ser seu correto enovelamento numa molécula funcional.
Partindo dessa inversão, Christian B. Anfinsen (1916-1995) trabalhando
na renaturação da ribonucleases A, entre 1955 e 1962, reuniria uma grande
quantidade de evidências. Ele postulou algo que hoje parece evidente, porém
até aquele momento ninguém ainda havia evidenciado, que a reversibilidade da
desnaturação in-vitro sugeria que toda informação que uma proteína de baixo
peso precisava para se reenovelar estaria codificada na seqüência de seus
resíduos de aminoácidos [18]. Desta forma ele unificou as teorias de Wu,
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Mirsky-Pauling e Kauzmann, numa abrangente hipótese termodinâmica do
enovelamento, ao considerar todos os tipos de interações como parte do
processo, dando-lhe o prêmio Nobel de 1972.
Entretanto, essa hipótese criava um sério problema de otimização para a
cinética do enovelamento: como era possível uma proteína conseguir orientar
seu próprio processo de enovelamento de modo que todas suas cadeias
convertam em um conjunto homogêneo nativamente estruturado?
Por exemplo, para uma proteína de apenas 100 aminoácidos e
considerando que cada resíduo adote uma de duas conformações de maior
estabilidade, teríamos um espaço conformacional representado por 10 30
estruturas [19]. Desta forma, Cyrus Levinthal (1922-1990), em 1969, assinalava
que o processo de renaturação não poderia envolver uma busca por força bruta
das conformações com menor energia livre nesse espaço estrutural [20]. No
exemplo dado, assumindo que a mudança de uma conformação para outra
demanda até 10 picosegundos (10-11 segundos), a pequena proteína de 100
resíduos levaria em torno de 100 bilhões de anos para enovelar-se. Para efeito
de comparação, acredita-se que o universo possua a idade por volta de 14
bilhões de ano. Entretanto dados experimentais indicam que o enovelamento
ocorre na faixa de milissegundos a segundos [21].
Assim, contrapondo o resultado absurdo desta conta, Levinthal
hipotetizou que, para a cinética do enovelamento fazer sentido, na seqüência
dos resíduos de uma proteína deveriam ser também codificados os caminhos e
as etapas que conduziriam à estrutura nativa, e não somente a informação
para produzir (a qualquer custo) as estruturas mais termodinamicamente
estáveis, como havia colocado Anfinsen [22].
Além disto, Levinthal reconhecia que sua hipótese não abrangia a
possibilidade de que nem sempre o caminho mais eficiente (de melhor cinética)
conduziria às melhores estruturas (de menor energia livre) [23]. Assim, ele viu a
importância tanto da cinética quanto da termodinâmica no enovelamento.
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Entretanto, ainda faltava compor uma teoria completa que explicasse o
enovelamento de proteínas.
Ao assistir, em 1968, um seminário de Levinthal em Stanford sobre o
enovelamento, o químico Paul Flory (1910-1985) disse que a solução para o
resultado absurdo da conta de enovelamento de Levinthal estaria na presença
de enovelamentos intermediários [24]. Com esta idéia de intermediários, aquela
mesma proteína hipotética de 100 resíduos mencionada, caso tivesse quatro
intermediários obrigatórios no seu processo de enovelamento, reduziria o
espaço de busca de 1030 para 4 x (225) ou seja por volta de 108 conformações,
e a estrutura nativa poderia ser encontrada em alguns milissegundos [25] .
Esta observação de Flory levou todos a uma busca por estes
intermediários.
Além
disto,
de
1970
em
diante,
as
técnicas
de
seqüenciamentos, a resolução de estruturas, o controle e a manipulação
gênica, além dos aparatos físico-químicos de monitoramento estrutural e os
poderes de cálculos e armazenamentos computacionais cresciam rapidamente.
Este crescimento permitiu que pesquisadores fizessem análises comparativas
de seqüências e estruturas [26]; reengenharia de proteínas [27] tanto pela
síntese química [28], quanto pela expressão de mutantes [29]; identificação de
intermediários [30]; estados de transição [31]; rotas de enovelamento [32]; e
simulações de dinâmica molecular [33]. Todos estes avanços, além da idéia de
intermediários, foram se conectando, se afrontando e levando a modelos
teóricos cada vez mais arrojados. Dentre eles, dois destacam-se e confrontamse: o modelo do funil, proposto por Ken Dill [19]; e o enovelamento in concert
defendido por Thomas Creighton [34]. O primeiro modelo está baseado em um
colapso hidrofóbico que restringe o espaço conformacional, produzindo
estruturas cada vez mais compactas e muitas rotas possíveis para se alcançar
o estado nativo. No segundo, as conformações não-enoveladas estão em
equilíbrio, e somente uma rota de máxima cooperatividade conduz ao estado
funcional com o enovelamento correto.
Os avanços são muitos, mas parece que ainda não há uma teoria de
consenso sobre o enovelamento. Atualmente, é crescente o sucesso de
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técnicas que se valem em maior ou menor grau do empirismo na predição de
estruturas a partir de seqüências. Entretanto, como a seqüência codifica a
estrutura de uma proteína, continua a ser uma das maiores questões em aberto
da ciência moderna e um problema central da biologia estrutural.
1.2 - Interações Proteínas-Anticorpos
Paralelamente a estes avanços, à medida que as proteínas eram
decodificadas e suas funções e estruturas eram conhecidas, outros
pesquisadores estudavam como elas se ligavam tanto internamente, por
ligações entre os seus resíduos ou entre os átomos que as compunham, como
também externamente, por ligações com outras proteínas, com moléculas ou
mesmo com um átomo que não faz parte de sua seqüência primária.
Os estudos destas ligações proporcionam um conhecimento estrutural e
energético das proteínas, tais como: densidade de empacotamento [35],
similaridade funcional [36], relações evolucionárias [27], classificações
topológicas [37], alinhamentos estruturais [38], avaliação estrutural [39],
predição de estrutura terciária [40], análise de redes de contatos [41],
potenciais empíricos, [42], previsão de estabilidade termodinâmica [43],
inferências sobre o processo de enovelamento [44], interações proteínaproteína e proteína-ligante [45] dentre outros.
As interações proteína-proteína adquiriram um caráter importante na
área medicinal. O conceito de Imunologia já era amplamente difundido no
mundo acadêmico, desde a famosa observação do biólogo russo Elie
Metchnikoff (1845-1916) em 1882, quando, ao espetar uma larva transparente
de uma estrela-do-mar com a ponta de uma roseira, viu um acúmulo de células
cercando a ponta afiada 24 horas após a injeção. Metchnikoff chamou este
fenômeno de Fagocitose. Embora o fenômeno de endocitose pelos leucócitos
(mais relacionada à pinocitose) havia sido descrito 30 anos antes, foi
Metchnikoff que explicou a sua função, e alertou a comunidade científica para a
importância da fagocitose na imunidade. Ele dedicou a maior parte de sua vida
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a estudar os diferentes aspectos da fagocitose e outros fenômenos
imunológicos afins. Somente depois de 25 anos de intenso esforço, ele teve o
reconhecimento da teoria da fagocitose, classificada hoje como a primeira
teoria experimental com base em imunologia. Essa sua luta culminou em 1908,
com a atribuição ao Prêmio Nobel junto com o bacteriologista alemão Paul
Ehrlich (1854-1915) devido as suas duas teorias da imunidade, "celular" e
"humoral". Isso foi um reconhecimento oficial da existência e da importância da
imunologia. [46].
Outro dois contemporâneos de Metchnikoff, o fisiologista alemão Emil
Von Behring (1854-1917), e o bactereologista japonês Kitasato Shibasaburo
(1852-1931), descreveram em 1890, pela primeira vez, as atividades de
anticorpos contra as toxinas de difteria e tétano. Behring e Kitasato utilizaram
da teoria da imunidade humoral para propor que um mediador no soro poderia
reagir com um antígeno estranho. [47-48]. Entretanto o termo anticorpo
somente foi descrito um ano depois por Paul Ehrlich. O termo “Antikörper” (a
palavra alemã para anticorpos) aparece na conclusão de seu artigo "Estudos
Experimentais sobre Imunidade", publicado em Outubro de 1891, que
estabelece que "se duas substâncias dão origem a dois Antikörper diferentes,
então eles mesmos devem ser diferentes". A palavra anticorpo teria uma
analogia formal com a palavra antitoxina [49].
Inicialmente, o termo anticorpo não foi aceito. Ao tomar conhecimento
dos resultados de Behring e Kitasato, Ehrlich, numa tentativa de confirmar suas
proposições, sugeriu, em 1897, a teoria da cadeia lateral de anticorpos e
interação com antígeno. Sua hipótese era de que os receptores (descrito como
"cadeias laterais") na superfície das células poderiam se ligar especificamente
às toxinas, em uma interação chave-fechadura, e que esta reação de ligação
seria o disparo para a produção de anticorpos. [50].
Apesar desta teoria, a grande maioria dos pesquisadores acreditava
que os anticorpos já existiam livremente no sangue. Apenas em 1920, a teoria
de Ehrlich começou a ser mais aceita, principalmente depois que o
imunologista americano Michael Heidelberger (1888-1991) e o médico
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canadense Oswald Avery (1877-1955) observaram que os antígenos poderiam
ser precipitados por anticorpos, o que os levou a demonstração de que os
anticorpos eram compostos protéicos. [51]. Desta forma, começava uma linha
de pesquisa voltada para a elucidação das propriedades bioquímicas da
interação antígeno-anticorpo, como a análise detalhada da ligação de um
antígeno com seu anticorpo, realizada pelo médico americano John Marrack
(1886 – 1976) na década de 30. [52]. O avanço principal se deu em 1940,
quando Linus Pauling confirmou a teoria de chave-fechadura proposta por
Ehrlich, mostrando que as interações entre antígenos e anticorpos dependiam
mais da sua forma do que da sua composição química. [53].
Em 1948, Astrid Fagreaus descobriu que as células B, sob a forma de
células plasmáticas, eram as responsáveis pela geração de anticorpos. [54].
Outro grande avanço nos estudos estruturais foi a descoberta da cadeia leve
dos anticorpos, no início da década de 60 pelo biólogo americano Gerald
Edelman (1929- ) [55]. Em seu trabalho, ele descobriu que os anticorpos são
compostos formados por cadeias leves e pesadas unidas por pontes dissulfeto
lingando-as. Na mesma época, as regiões Fab e Fc da IgG foram
caracterizadas pelo bioquimico inglês Rodney Porter (1917-1995). Juntos,
esses brilhantes cientistas deduziram a estrutura completa de aminoácidos na
seqüência da IgG, uma façanha para a qual foram premiados, em 1972, com
Prêmio Nobel de Medicina [56].
1.3- A evolução da Bioinformática
Com os avanços das ciências biológicas, os pesquisadores começaram
a catalogar os seres vivos em nível molecular. À medida que estas informações
eram obtidas, fazia-se necessário a criação de repositórios referenciais para o
armazenamento da crescente onda de dados que inundava os periódicos. As
décadas de 70 e 80 marcavam o início das operações dos que viriam a serem
os grandes bancos de dados moleculares da atualidade. Com isto, os níveis
das pesquisas biológicas nos dias de hoje ser impossíveis sem os recursos da
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computação, tendo em vista que as informações produzidas necessitavam de
armazenamento, distribuição, validação, atualização e análises estatísticas.
Desta forma, em todas as esferas da ciência, fez-se necessário a utilização de
equipamentos computacionais, cada vez mais sofisticados, sobretudo na área
científica de química, biologia, estatística, física e medicina. Nascia assim, a
Bioinformática. Essa nova ciência surgiu da necessidade de tratar as
informações produzidas pela biologia com equipamentos de alta precisão, no
caso, computadores sofisticados.
O desenvolvimento da bioinformática pode ser relacionado com o início
da biologia estrutural, em 1953, a partir da famosa descrição da estrutura de
dupla hélice do DNA realizada pelos biólogos americanos James Dewey
Watson (1928) e Francis Harry Compton Crick (1916-2004) [57] e também ao
magnífico trabalho de 22 anos do químico do Reino Unido, John Kendrew
(1917-1997) publicado em 1957 que utilizou raios-X para determinar a estrutura
tridimensional (3D) da molécula de mioglobina, sendo esta a primeira proteína
com estrutura decifrada [58].
Mas o grande avanço da bioinformática se deu a partir de 1971, com a
necessidade de se criar um local de armazenamento das informações de todas
as proteínas que iam sendo decifradas. Surgiu assim, o primeiro banco de
dados de Proteínas, o PDB – Protein Data Bank, que em 1977 entrou em
produção para acesso internacional [59]. Na época de sua fundação, o PDB
apresentava menos de uma dúzia de estruturas cadastradas, hoje são mais de
70.000 estruturas. Em 1975, o PDB continha apenas 37 estruturas, mas já se
via um interesse pela análise estrutural de proteínas usando os métodos
computacionais e gráficos, como o trabalho pioneiro desenvolvido na descrição
de estruturas secundárias de proteínas realizadas pelo físico-químico
americano Peter Y. Chou e pelo bioquímico canadense Gerald Fasman (19252003) [60].
O trabalho de Chou e Fasman chamou a atenção para um campo da
ciência que estava em aberto, a utilização de características físico-químicas
para predizer estruturas. Além disto, a computação estava também em franca
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evolução com computadores e algoritmos cada vez mais modernos e
elaborados. Inicialmente, os primeiros algoritmos utilizavam gráficos de
hidrofobicidade como os vários trabalhos do bioquímico americano David
Eisenberg (1939- ) [61].
Em 1981, o engenheiro biomédico americano Temple Smith e o
matemático americano Michael Waterman desenvolveram pela primeira vez um
algoritmo capaz de comparar seqüências protéicas. O algoritmo de SmithWaterman serve como base para comparações de seqüência múltipla,
identificando o segmento com a seqüência de similaridade local máxima, e
fazendo assim o alinhamento das seqüências. Este algoritmo é utilizado para
identificar seqüências similares de DNA, RNA e segmentos de proteínas [62].
Em 1983, o biólogo americano David Lipman desenvolveu um algoritmo
de busca das seqüências em bancos de dados [63]. Este trabalho, junto com
os de Waterman e Smith, foram extremamente importantes para a classificação
das proteínas, que se encontravam em bancos de dados cada vez maiores.
Vários trabalhos de alinhamentos de seqüências e de busca em banco de
dados foram desenvolvidos a partir daí, até que em 1988 o americano
W.R.Taylor publicou um trabalho que caracterizava padrões de conservação
dos aminoácidos [64]. Quase em paralelo, vieram os bancos de seqüências
nucleotídicas, mantidos por europeus (EMBLDL– European Molecular Biology
Laboratory - Data Library) [65] e por americanos (GenBank do NCBI - National
Center for Biotechnology Information) [66], ambos com raízes no início dos
anos 80. Logo após, vieram PIR (Protein Information Resource) [67], em 1984
e SwissProt [68], em 1986, concentrando dados bem anotados de seqüências
protéicas. A partir daí, muitos outros foram criados, incluindo versões
colaborativas ou unificadas deles, como INSDC (International Nucleotide
Sequence Databases Collaboration) [62], Uniprot [69] e wwPDB [70].
Outros dois trabalhos envolvendo algoritmos ainda tiveram destaque
nos anos 80. O do americano Michael L. Connolly, que em 1983 criou um
algoritmo que calculava a superfície molecular de uma proteína [71] e o do
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britânico e biofísico Michael Levitt, que por sua vez, elaborou um algoritmo de
minimização de energia e dinâmica molecular [72].
Com a abrangência mundial da internet, a partir da década de 90, houve
um aumento nas pesquisas relacionadas às estruturas de proteínas,
acarretando um aumento exponencial no número de estruturas depositadas no
PDB. Juntamente com os surgimentos de novos algoritmos, culminou em 1990
a criação do BLAST [73], um programa de busca local e comparação de
similaridades entre as seqüências protéicas. Neste mesmo ano, o PDB teve
144 estruturas depositadas, chegando ao total de 509 desde o início das
operações
Em 1992, o casal americano Jane e David Richardson produziu o
primeiro software para visualização molecular, o Kinemage, disponibilizado
pela Macintosh e que fez com que um largo espectro de usuários pudesse
observar as estruturas protéicas e nucleotídicas. [74]. O Kinemage juntamente
com outros softwares como o Rasmol [75] e o SPDBViewer [76] facilitaram os
estudos das
estruturas protéicas, promovendo, além dos alinhamentos de
seqüências, os alinhamentos estruturais. Com tudo isto, no final da década de
90, o PDB já continha 10.991 estruturas em seu banco de dados, sendo que
2.359 estruturas teriam sido depositadas somente naquele ano. Este
crescimento exponencial continua até os dias de hoje. Somente nos meses de
janeiro e fevereiro de 2011, foram depositadas em seu banco de dados 1.442
estruturas, contabilizando um total de 71.635, sejam elas de ácidos nucléicos,
proteína, complexos ou outros, como mostra a Tabela 2 e a Figura 1 [77].
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Figura 1: Número de estruturas depositadas no PDB desde sua criação
em 1972. Em azul a quantidade de estruturas depositadas no ano, e em
vermelho o valor global de estruturas depositadas ate o final daquele período.
Fonte: PDB Statistics de fevereiro de 2011 (http://www.rcsb.org/)
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Tabela 2: Número de estruturas depositadas no PDB de acordo com o
método no qual elas foram determinadas desdes do ano de sua criação
em 1972
Método
Proteína
Ácido
Nucléico
Proteína/
Complexos
Outros
Total
Raios-X
58192
1262
2822
17
62293
RMN
7686
941
168
7
8802
Elétron microscopia
245
22
86
0
353
Hibrido
28
3
1
1
33
Outro
132
4
5
13
154
Total
66283
2232
3082
38
71635
Fonte: PDB Statistics de fevereiro de 2011 (http://www.rcsb.org/)
Uma grande mudança coroaria os últimos anos do século passado: O
surgimento da era “ômica”, consagrada em 1995 pelo primeiro seqüenciamento
completo do DNA de um ser vivo de replicação autônoma, a bactéria
Haemophilus influenzae [78]. Logo vieram as sequências do primeiro eucarioto
em 1996, com a levedura Saccharomyces cerevisiae [79]; a bactéria
Escherichia coli [80], em 1997; o primeiro ser vivo pluricelular em 1998, com o
verme nematódeo Caenorhabditis elegans [81]; a Drosophila melanogaster
[82], como primeiro inseto em 2000; a Arabidopsis thaliana [83], como primeira
planta também em 2000; até chegarmos ao seqüenciamento do Homo sapiens
[84], em 2001.
Se antes o foco era estudar de forma isolada determinados genes e
proteínas, agora o objetivo é não só o mapeamento de todos eles, mas
também saber de suas evoluções no tempo e conexões com as diversas
instâncias do organismo. Deixava de existir uma visão compartimentada e
hierárquica
dos
processos
biológicos,
para
uma
visão
holística
e
interdisciplinar. Desta interdisciplinaridade e da busca pelo mapeamento dos
códigos genéticos e protéicos, nascia a genômica e seu genoma, a proteômica
e seu proteoma, a transcriptômica e seu transcriptoma, a metabolômica e seu
metaboloma, e tantas outras “ômicas” e “ômas”.
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Com a popularização da internet, a WEB tornou-se uma ferramenta
extremamente útil. Diferentes bancos de dados podem ser sincronizados e
integrados, os lançamentos de novas entradas e consultas aos registros feitos
remotamente e instantaneamente a partir de qualquer computador conectado.
Tudo isto ocasionou uma explosão não só em quantidade de informações,
como também em disponibilidade. É neste fervoroso momento que cresce a
Bioinformática como uma ferramenta auxiliar ao limitado cérebro humano,
essencial na estruturação e manipulação dessa gigantesca abundância de
dados.
1.4 - Proteômica
Duas áreas se sobressaem na Bioinformática, a Genômica e a
Proteômica. A Proteômica foi definida pelo americano Junmim Peng como uma
análise sistemática do maior número possível de proteínas buscando sua
identidade, quantidade e função [85].
Depois da explosão inicial da genômica principalmente no final do
milênio, provocado pela corrida do mapeamento genético das espécies, o início
do novo milênio também esta sendo marcado pela explosão da Proteômica.
Aparelhos e técnicas cada vez mais modernos e precisos, como espectrometria
de massas, eletroforese bidimensional, cromatografias de alta pressão,
seqüenciamentos de aminoácidos, cristalografia, entre outros, fizeram com que
diversos trabalhos na área Proteômica fossem publicados. Estudos das
diferenças entre os perfis protéicos de proteínas, provenientes da mesma
espécie, como por exemplo, a do chinês Song-Ping Liang em 2000, vem
gerando importantes informações sobre os aspectos estruturais e funcionais
das proteínas [86].
Por outro lado, a Proteômica vem se mostrando muito mais complexa
que a genômica, principalmente porque enquanto o genoma de um organismo
Página | 17
é mais ou menos constante, seu proteoma difere de célula para célula e
também conforme a cronologia e o ambiente no qual esta célula está inserida
[87].
Mesmo assim, através da Proteômica, imunologistas vêm adquirindo
informações cada vez mais precisas sobre como os anticorpos se ligam aos
antígenos. Para estes pesquisadores, a Proteômica seria como uma lupa
apontada ao complexo chave-fechadura de Ehrlich. Juntos aos bioinformatas e
físico-químicos, as características físico-químicas destas interações de
antígenos-anticorpos vêm sendo decifradas, como o trabalho do italiano Lucca
Simonelli que tenta localizar um conjunto de regras estruturais nas interações
de um antígeno viral com um anticorpo [88].
Outros grupos de bioinformatas, bioquímicos, químicos e imunologistas
vêm utilizando as informações obtidas na Proteômica para encontrar peptídeos,
ou pequenas moléculas que realizariam as mesmas funções das proteínas de
onde a seqüência desses peptídeos foi derivada. A busca por estes peptídeos
têm um caráter econômico, já que os estes são mais fáceis de serem
conservados, são quimicamente mais estáveis, menores e mais flexíveis que
uma proteína. Além disto, em comparação às proteínas, sua síntese é mais
barata, simples e fácil de ser monitorada quanto à sua qualidade, além do fato
de não serem infecciosos ou tóxicos.
Dada a sua facilidade de obtenção, inúmeros trabalhos vêm surgindo
nos últimos anos, utilizando peptídeos sintéticos para diferentes fins na área
Proteômica. Esses peptídeos têm sido utilizados como inibidores de doenças
alérgicas [89], no tratamento de pacientes com Câncer [90], na terapia de
diabéticos do tipo II [91], no desenvolvimento de biomateriais [92] como drogas
terapêuticas em doenças cardiovasculares [93], como antiinflamatórios [94], no
tratamento de doenças auto-imunes [95], como adjuvantes [96], no tratamento
de distúrbios de coagulação [97] como agentes anti-microbianos [98], em
doenças reumáticas [99], como ferramentas de estudo em diferentes campos
da biologia [100], na biologia sintética [101], no estudo da diferenciação e
renovação de células tronco [102] e na produção de vacinas [103].
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Uma das áreas da Proteômica que vem se mostrando ser muito
promissora é a identificação de possíveis novas drogas para o tratamento de
doenças. A partir das informações obtidas pelo Proteoma, as proteínas
associadas a uma doença são localizadas, e com a utilização de um software,
utilizam-se estas proteínas como alvos para testes com novas drogas. Por
exemplo, se uma determinada proteína está envolvida em uma doença, a sua
estrutura 3D fornece a informação para formular drogas que interferem com a
ação da proteína. Uma molécula que se encaixa no sítio ativo de uma enzima,
mas não pode ser liberada deste sítio, irá inativar a enzima [104].
Toda esta gama de opções de pesquisas e esta interdisciplinaridade da
Proteômica vêm transformando esta em uma das mais importantes áreas de
estudos da ciência moderna. Trabalhos utilizando as estruturas 3D‟s de
proteínas visualizadas em computadores potentes para analisar as interações
com outras moléculas, proteínas, peptídeos ou átomos estão cada vez mais
presentes nos dias de hoje.
1.5 - Epítopos
Outra linha de pesquisa que teve um grande avanço com a Proteômica
foi à busca por epítopos, também conhecido como determinantes antigênicos.
A médica americana Anne Searls de Groot definiu epítopo como um grupo de
aminoácidos derivado de um antígeno protéico que interagem com receptores
de células B (imunoglobulinas) ou com receptores de células T, resultando na
ativação de uma resposta imune [105]. Do ponto de vista de reconhecimento
de padrões no sistema imunológico, a característica mais importante das
células B e T é que ambas possuem moléculas receptoras (reconhecedoras)
em suas superfícies capazes de reconhecer antígenos. Os receptores das
células B e T reconhecem antígenos com características distintas. O receptor
da célula B pode interagir com moléculas antigênicas livres em solução,
enquanto o receptor das células T reconhece antígenos processados e ligados
Página | 19
a
uma
molécula
de
superfície
denominada
de
complexo
de
histocompatibilidade principal (MHC) [106].
O receptor de antígeno da célula B é o anticorpo ligado à membrana,
que será secretado quando a célula for ativada. As principais funções da célula
B incluem a produção e secreção de anticorpos como resposta aos agentes
patogênicos. O reconhecimento imunológico ocorre em nível molecular e é
baseado na complementaridade entre a região de ligação do receptor e uma
porção do antígeno, o epítopo. [106]. Enquanto os anticorpos possuem um
único tipo de receptor, os antígenos podem possuir múltiplos epítopos,
significando que um único antígeno pode ser reconhecido por diferentes
moléculas de anticorpo como mostra a Figura 2B.
As interações antígeno-anticorpo (Ag-Ac), ilustradas na Figura 2A, são
realizadas quando o paratopo do anticorpo (Ac) se liga ao epítopo de um
antígeno (Ag)
[107]. Essas interações são mantidas por forças fracas
(interações não-covalentes), do mesmo tipo que mantêm o complexo enzimasubstrato, como forças iônicas, pontes de hidrogênio, van der Waals e
hidrofóbicas. O fato de essas forças terem baixa energia livre (<20 Kcal/mol),
ao contrário da ligação covalente (>40 Kcal/mol), garante o fenômeno da
especificidade antígeno-anticorpo [106].
A célula T é assim chamada devido ao fato de que sua maturação ocorre
no timo [108]. Suas funções incluem a regulação das ações de outras células e
o ataque direto às células infectadas do organismo hospedeiro. O receptor de
antígeno da célula T possui algumas diferenças estruturais em relação aos
receptores das células B, já que enquanto os receptores de células B
reconhecem epítopos de antígenos livres, protéicos ou não, os de células T
reconhecem apenas epítopos de antígenos processados (fragmentados sob a
forma de peptídeos) e ligados a uma molécula de superfície, o MHC. [106].
Página | 20
2A
2B
Figura 2: Representação esquemática da interação antígeno-anticorpo.
Em 2A: Ilustração de interação do epítopo de um antígeno com o paratopo de
uma IgG. Em 2B, ilustração dos anticorpos monoespecíficos, os antígenos
podem apresentar vários epítopos distintos.
Foto retirada do site http://www.inflammation.dk/iir/05ig/_igx.htm
Um epítopo de uma proteína pode ser classificado como contínuo ou
descontínuo. O epítopo contínuo, também chamado seqüencial ou linear, é um
fragmento contínuo da seqüência protéica. Já um epítopo descontínuo,
igualmente chamado de epítopo conformacional, é composto de diversos
fragmentos dispersos ao longo da seqüência da proteína e reunidos na
proximidade espacial quando a proteína é enovelada. [109]. A Figura 3
apresenta os dois tipos de epítopos. Na Figura 3A, a seqüência de
aminoácidos que fazem parte do epítopo representado pelas letras E-P-I-T-OP-O, seguem a seqüência primária da proteína, sendo assim classificado de
epítopo contínuo ou linear. Na Figura 3B, a seqüência representada pelo
mesmo conjunto de letras, não está seguindo a seqüência primária da proteína.
Neste caso, os aminoácidos que formam o epítopo estão próximos devido à
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conformação estrutural da proteína e por isso o epítopo é classificado como
descontínuo ou conformacional.
A maioria dos epítopos são do tipo descontínuo, embora sejam
freqüentemente compostos de pequenos elementos contínuos da seqüência. A
identificação dos epítopos é de grande importância para compreender e
reconhecer molecularmente a proteína analisada. Esses epítopos podem ser
úteis em diagnóstico de doenças, na formulação de drogas, projetos de
vacinas, entre outros [107].
3A
3B
Figura 3: Representação esquemática dos diferentes tipos de epítopos.
Cada círculo representa um aminoácido seguindo a seqüência primária da
proteína. Os círculos destacados são os aminoácidos que fazem parte do
epítopo. 3A mostra a representação esquemática de um epítopo linear e 3B a
representação esquemática de um epítopo conformacional
Para uma vacina ser efetiva, ela precisa, por exemplo, desencadear uma
forte resposta de células B
ou de células T. Por isso, para a escolha de
peptídeos com potencial vacinal, o mapeamento de epítopos é de fundamental
importância [105].
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1.6 - Mapeamentos de Epítopos
O método mais adequado para encontrar um epítopo é resolver a
estrutura 3D do complexo Ag-Ac por cristalografia de Raios-X ou RNM [110]. A
primeira resolução por cristalografia de raios-X de um complexo Ag-Ac indicou
que um epítopo é composto de cerca de 10 a 20 aminoácidos, o que foi
confirmado por diversos estudos subseqüentes como a do grupo francês de
Pierre Tougard do Instituto Pasteur com seus trabalhos com difração de raios-X
dos complexos antígenos-anticorpos [111] e mais recentemente com o trabalho
sobre a identificação de epítopos na superfície do vírus Ebola do ex-estudante
de doutorado do microbiologista americano Paul Bates, o americano Joseph
Francica [112].
A análise de 103 epítopos em 1988 pelo químico australiano Hendrik
Mario Geysen revelou que na maioria dos casos de epítopos contínuos,
somente entre 4 a 5 resíduos são implicados na energia de ligação e
determinam especificidade da interação com o anticorpo, enquanto que os
outros resíduos da região epitópica desempenham um papel de espaçador e
podem ate serem substituídos por outros aminoácidos [113].
Outro grande destaque foi dado pelo grupo do médico imunologista
francês Jean-Pierre Revillard que em 1988 observou que toda a superfície
acessível de uma proteína é tida como potencialmente antigênica e que as
proteínas são formadas por um mosaico de epítopos virtuais, sendo
complicado estimar a quantidade de epítopos que uma proteína apresenta, já
que essa varia de acordo com a existência de anticorpos contra as várias
regiões da proteína. Essa diversidade de epítopos reconhecidos em um mesmo
antígeno ao longo da resposta imunológica é um fator essencial para a eficácia
da resposta do anticorpo que levará à neutralização ou destruição do patógeno
[114]. Estas descobertas só foram possíveis após o início dos anos 80, mais
precisamente no ano de 1982, quando os métodos para a localização
sistemática de epítopos começaram a ser desenvolvidos e empregados.
Atualmente, estes métodos englobam diferentes domínios do conhecimento,
como a biofísica, a bioquímica, a biologia molecular a estatística e até mesmo a
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síntese química [115]. Mas a localização experimental destes epítopos é ainda
hoje um processo difícil e complexo. A utilização de peptídeos representativos
de antígenos protéicos combinados à análise através de ferramentas de
bioinformática é uma alternativa interessante e promissora.
Os principais métodos de identificação de epítopos são: métodos
imunoquímicos, como o método de SPOT, estudos de cristalografia de raios-X
e métodos de predição computacional. Apesar da técnica de cristalografia ser a
mais eficiente na identificação de epítopos, ela é uma técnica cara, que
necessita de uma grande quantidade de amostra com um alto grau de pureza,
além de ser uma técnica geralmente demorada.
Em 1986 o americano John Mark Carter e mais tarde em 1997, a
também americana Grazyna D. Szklarz, utilizaram métodos alternativos na
identificação de epítopos por mutagêneses sítio dirigida. Por essa técnica,
aminoácidos da cadeia protéica sofrem mutações e esses mutantes são
avaliados experimentalmente com intuito de verificar se a ausência do
aminoácido é importante para ligação com o anticorpo, ou seja, se esses
aminoácidos pertencem a um epítopo [116-117]. Entretanto, esta técnica
também é trabalhosa e relativamente cara.
Devido a todas essas dificuldades, nos últimos 30 anos, uma série de
algoritmos foram desenvolvidos no intuito de determinar esses epítopos. A
identificação de epítopos por programas de computadores seria enormemente
mais
barata,
sendo
necessário
apenas
um
computador
e
alguns
conhecimentos das proteínas a serem analisadas. No entanto, para isto,
algoritmos mais elaborados e precisos devem ser idealizados. Estes algoritmos
seriam baseados em diferentes características físico-químicas da proteína alvo,
como hidrofobicidade, flexibilidade, acessibilidade, e estrutura secundária, de
acordo com o francês Jean-LucPellequer em um de seus artigos [118]. Estes
algoritmos conduziram ao desenvolvimento de diversos softwares como o
SUPERFICIAL do grupo alemão da Universidade de Medicina de Berlin [119].
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Em 1999, outro grupo alemão da mesma Universidade de Medicina de
Berlin, liderado pelo Dr Ulrich Reineke já havia adaptado a técnica de Sínteses
Química de Peptídeos do famoso químico americano Robert Bruce Merrifield
[120], ganhador do Prêmio Nobel de 1984 por este trabalho em 1969, para
sintetizar automaticamente uma série de peptídeos que poderiam ser utilizados
de forma a mapear uma proteína e verificar quais eram reativos a um anticorpo.
Esta técnica foi chamada de Spots-Síntese. [121].
O método de Spot-Síntese abriu inúmeras oportunidades para sintetizar
peptídeos. Em 2002 o químico alemão Ronald Frank adaptou esta síntese
automatizada para uma matriz (membrana de nitrocelulose). O método permitia
a síntese rápida e paralela de um grande número de peptídeos. Outras
vantagens estariam relacionadas com a fácil adaptação a uma ampla gama de
métodos de análise e seleção, tais como ensaios de ligação, enzimáticos e
celulares, que permitem o diagnóstico in situ de bibliotecas químicas devido às
propriedades especiais da membrana. Por exemplo, pode-se realizar um
ensaio imunoquímico de western-blot na própria membrana e testar assim
quais peptídeos são reativos para um determinado anticorpo. [122].
Um peptídeo ou uma molécula que reconhece o mesmo paratopo de um
anticorpo é chamado de mimotopo. Este nome foi dado por Hendrik Mario
Geysen em 1985 que definiu mimotopo como sendo uma molécula ou peptídeo
que mimetiza um epítopo [123]
Nesta investigação pelo conhecimento das interações de um paratopo
de um anticorpo com o epítopo de um antígeno ou mesmo com um mimotopo,
vários programas de bioinformática vêm sendo desenvolvidos. E é nesta busca
por estes conhecimentos que esta tese se encaixa. Seu objetivo inicial era
estudar uma região epitopica de uma proteína do veneno de aranha marrom
(Loxosceles intermedia), mas durante seu desenvolvimento, ela acabou por se
deparar com um problema que pareceu-nos mais promissor que a proposta
original. Ao invés de estudar uma única proteína, passamos a analisar várias
proteínas e alguns programas de bioinformática podendo assim fazer um
estudo criterioso que poderia repercutir nas diversas aplicações destes
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programas e em conceitos e características dos epítopos. Resolvemos ainda
estudar os epítopos descontínuos que, apesar da dificuldade nas predições e
validações, são os que acreditamos corresponder as interações antígenosanticorpos.
Esta introdução fez um rápido e panorâmico vôo sobre a história das
proteínas. Agora em que os fatos estão mais contextualizados, veremos o que
essa tese tem a fornecer para a evolução desse novo paradigma.
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2 - CONTRIBUIÇÕES
Esta tese é fruto de experimentos e análises desenvolvidos no
Laboratório de Imunoquímica de Proteínas do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais sob a orientação do Dr. Carlos
Chávez Olortegui e do doutorado sanduiche no Laboratoire SysDiag ,
UMR3145 - CNRS/Bio-Rad na cidade de Montpellier, França sob a corientação
do Dr. Franck Molina.
Durante minha estadia na França fiz parte do projeto PRESED –
PREdiction et Synthèse d'Epitopes Discontinus – Predição e Sínteses de
Epítopos Descontínuos - coordenado pela Dra. Violaine Moreau. Este projeto
tem
como
objetivo
desenvolver
metodologias
para
predizer
epítopos
descontínuo que seriam utilizados no programa PEPOP, desenvolvido pela
própria Dra. Violaine Moreau. Minha parte no projeto era de validação dos
epítopos descontinuos preditos pelo programa de bioinformática PEPOP, ou
seja, através das metodologias desenvolvidas, eu fazia as predições destes
epítopos descontínuos, sintetizava-los na forma de peptídeos e testava contra
anticorpos monoclonais para validar a predição. Sistematicamente o grupo
PRESED se reunia para avaliações dos resultados encontrados e proposições
de melhoria tanto na forma de metodologias de predições, como na forma de
visualizações dos resultados encontrados pelo programa PEPOP.
Neste período avaliei a predições de seis proteínas, apresentadas na
Tabela 3. As proteínas são: AaH-II, uma toxina do veneno do escorpião
Androctonus australis hector-II;
GM-CSF, uma citocina que funciona como
fator estimulante de colônias de granulocitos e monócitos; C2FVIII, uma
proteína do domínio C2 do fator de coagulação; DNF, uma toxina do veneno da
aranha Loxosceles intermédia. GAD-65, uma enzima que catalisa a
descarboxilação do glutamato para ácido gama-aminobutírico e CO; e LHF-II,
uma toxina do veneno da serpente Lachesis muta-muta.
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A LHF-II merece uma atenção especial, pois apesar de ela ter seus
peptídeos preditos pelo PEPOP durante minha estadia na França, os
experimentos de testes destes peptídeos foram todos realizados no Brasil. Esta
proteína teve ainda a predição de peptídeos através de outros programas de
bioinformática, como o MIMOP, também desenvolvido pela Dra Violaine
Moreau e o STING, desenvolvido pelo Dr. Goran Neshich da Embrapa de
Campinas.
Nesta tese então, serão apresentados os resultados obtidos pelas
predições das proteínas AaH-II, GM-CSF, DNF e LHF-II.
Apesar dos
resultados preliminares para a GAD-65 e C2FVIII parecerem promissores, pois
os peptídeos encontrados como reativos aparentam mimetizar regiões de
epítopos já descrito na literatura, achamos por melhor não apresentá-los, já
que as membranas contendo estes peptídeos foram também reativas aos
anticorpos secundários e desta forma proporcionou certa dúvida na real
reatividade dos peptídeos com os monoclonais testados. Assim teremos que
refazer
estes
experimentos,
provavelmente
trocando
os
anticorpos
secundários.
Os resultados encontrados com LHF-II renderam um artigo que foi
submetido à revista Peptides e pode ser visto no anexo VI. Estamos também
terminando de escrever dois artigos referentes ao trabalho com a AaH-II e GMCSF. O trabalho com a AaH-II ganhou no ano passado o prêmio de melhor
pôster no congresso da Sociedade Brasileira de Toxinologia, como pode ser
visto no anexo VII.
Além disto, durante a minha tese participei em outros projetos do
laboratório que renderam ainda outros cinco artigos. Os resultados destes
artigos não serão apresentados nesta tese, mas podem ser vistos nos anexos
de I a V.
O Anexo I apresenta o artigo intitulado The co-purification of a lectin
(BJcuL) with phospholipases A2 from Bothrops jararacussu snake venom by
immunoaffinity chromatography with antibodies to crotoxin publicado na revista
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Toxicon no ano de 2007. Neste artigo encontramos uma fração do veneno da
serpente Bothrops jararacussu que mostrou ser um eficiente antígeno na
preparação de anticorpos neutralizantes contra as atividades dos venenos
letais das serpentes Bothrops jararacussu e Crotalus durissus terrificus.
O Anexo II mostra o artigo intitulado Antigenic, microbicidal and
antiparasitic properties of an l-amino acid oxidase isolated from Bothrops
jararaca snake venom publicado na revista Toxicon no ano de 2009. Nestes
trabalhos
caracterizamos
as
propriedades
antigênicas,
microbianas
e
antiparasitárias de L-aminooxidase do veneno da serpente Bothrops jaracaca
O Anexo III exibe o artigo intitulado Immunodiagnosis of human
neurocysticercosis using a synthetic peptide selected by phage display
publicado na revista Clinical Immunology no ano de 2010. Neste artigo um
peptídeo originário de um mimotopo da proteína Cysticercus cellulosae
selecionado pela técnica de Phage Display foi sintetizado e apresentado para o
imunodiagnóstico da neurocisticercose humana.
O Anexo IV apresenta o artigo intitulado In vivo protection against Tityus
serrulatus scorpion venom by antibodies raised against a discontinuous
synthetic epitope publicado na revista Vaccine no ano de 2009. Neste artigo
identificamos um epítopo descontinuo da proteína TsNTxP do veneno do
escorpião Tityus serrulatus, verificamos alem da capacidade protetora do
peptídeo, sua exposição na estrutura 3D da proteína e que apesar de seus
aminoácidos serem proveniente das regiões C e N-Terminal estavam dentro de
um raio de 10 Å.
Já o Anexo V mostra o artigo intitulado Mapping of a highly immunogenic
linear B cell epitope within Plasmodium vivax apical membrane antigen 1 (AMA1) recentemente submetido e aceito para publicação na revista PLOS One,
agora no ano de 2011. Neste artigo, identificamos a partir da seqüência
primária da PvAMA-1 um epítopo linear altamente imunogênico da Plasmodium
vivax apical se tornando um antígeno candidato a vacina contra malaria.
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Então, nas próximas páginas será apresentos os resultados e as
discussões para AaH-II, DNF, GM-CSF e LHF-II. Ainda, ao final é feito um
apanhado geral das características dos epítopos e dos métodos utilizados para
encontrá-los.
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3- OBJETIVOS
3.1- Objetivos gerais
Predizer
por
bioinformática
estrutural
e
caracterizar
epítopos
descontínuos das toxinas, AaH-II (principal neurotoxina do veneno do
escorpião Androctulus Australis Hector, LHF-II, uma toxina hemorrágica do
veneno da serpente Lachesis muta muta, DNF uma toxina dermonecrótica do
veneno da aranha L. intermedia e da citocina humana GM-CSF.
3.2- Objetivos específicos

Predizer, utilizando o programa de bioinformática PEPOP, peptídeos
referentes a epítopos descontínuos da proteína AaH-II, GM-CSF, DNF e
LHF-II.

Predizer, utilizando o programa de bioinformática MIMOP, peptídeos que
foram mimetizados por peptídeos selecionados pela técnica de Phage
Display

Predizer, utilizando o programa de bioinformática STING, Millennium
peptídeos referentes a epítopos descontínuos da proteína LHF;

Encontrar características físico-químicas para a predição de epítopos
descontínuos.

Sintetizar todos os peptídeos preditos em membranas de celulose

Testar a reatividade de todos os peptídeos sintetizados nas membranas
contra anticorpos monoclonais.

Sintetizar quimicamente os peptídeos reativos ao monoclonal anti-veneno
de Lachesis muta muta;
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
Avaliar a capacidade destes peptídeos sintéticos induzirem a produção
de anticorpos com atividade biológica anti-hemorrágica.

Verificar as características dos peptídeos reativos aos monoclonais que
descrevem regiões epitopicas

Propor idéias que melhorem a utilidade do programa PEPOP.
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4 – MATERIAIS E MÉTODOS
4.1- Moléculas alvo para o mapeamento de epítopos
As moléculas escolhidas para este estudo são uma toxina (AaH-II,
GenBank: AAA29949.1) do veneno
do veneno do escorpião Androculus
Australis Hector, uma proteína (DNF, GenBank: AAQ16123.1 ) da família das
dermonecróticas
do
veneno
da
aranha
Loxosceles
intermedia,
uma
metaloproteinase (LHF-II, Swiss-Prot: P22796.1) do veneno da serpente
Lachesis
muta
muta
e
uma
citocina
humana
(GM-CSF,
GenBank:
AAA52578.1).
4.2 - Animais e proteínas
A toxina LHF-II do veneno da serpente Lachesis muta muta foi
gentilmente cedida pelo Dr. Eládio Sanchez do Centro de Pesquisa e
Desenvolvimento da Fundação Ezequiel Dias de Belo Horizonte/MG, Brasil. Ela
foi purificada a partir do veneno de Lachesis muta muta de acordo com
Sanchez et.al, 1991 [124].
Foram utilizadas Coelhas fêmeas da raça New Zealand, na média de 2 kg
de peso vivo. Os animais foram mantidos no Centro de Bioterismo, ICB-UFMG
(Belo Horizonte, MG), e receberam água e alimentos sob condições ambientais
controladas. O tratamento e a manipulação dos animais utilizados foi
acompanhado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da
UFMG.
4.3- Anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais mAb 4C1 neutralizante da toxina AaH-II e antiGM-CSF (mAb 2C4F10) foram produzido previamente pelo laboratório Sysdiag,
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UMR3145 - CNRS/Bio-Rad em Montpellier - França, de acordo com Yahi et.al,
2002 [125] e Piquer et.al, 2006 [126] respectivamente.
Os anticorpos monoclonais anti-LHF-II (LmmAbB2D4) e anti-L.intermedia
(LimAb7), foram produzidos e purificados anteriormente em nosso laboratório,
como descrito por Estevão-Costa et.al., 2000 [127] e Alvarenga, et.al. 2003
[128] respectivamente.
4.4 - Modelagem Molecular
4.4.1- Análise de similaridade
As análises de similaridade das proteínas a serem modeladas foram
realizadas utilizando a ferramenta BLAST [73]. O BLAST está disponível na
internet e é composto por cinco programas: Protein-BLAST, NucleotideBLAST, BLASTx, tBLASTn e o tBLASTp. Estes programas têm como função
procurar similaridades de seqüência primárias de proteínas e nucleotídeos.
O Protein-BLAST, empregado neste trabalho, utiliza a seqüência protéica
fornecida pelo usuário para fazer uma busca em banco de dados de
proteínas por similaridade. Ele é composto por três algoritmos, o BLASTP,
PSI-BLAST, PHI-BLAST.
4.4.2- Modelagem de proteína
O modelo 3D da LHF-II foi obtido por modelagem por similaridade
utilizando os dados de cristalografia por raios-X da Atrolisina C (1ATL.PDB,
resolução: 1,80Å) como molde. Para isto, utilizou o Protein-BLAST para
encontrar a proteína depositada no PDB com maior similaridade a LHF-II. O
modelo molecular tridimensional da LHF-II foi construído sobrepondo
estruturalmente a sua seqüência sobre a da Atrolisina C no programa de
modelagem SwissModel [129-131]. Para validação da estrutura modelada,
foram utilizados os programas ANOLEA [132] e Verify 3D [133].
Da mesma forma, a modelagem da DNF ocorreu por modelagem por
similaridade desta vez utilizando como molde os dados de cristalografia por
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raios-X da SMASE-D (1XX1. PDB, resolução de 1,75). O Protein-BLAST foi
também o responsável por encontrar a proteína (SMASE-D) depositada no
PDB com maior similaridade com a DNF. O modelo molecular tridimensional da
DNF foi construído sobrepondo estruturalmente a sua seqüência sobre a da
SMASE-D no programa de modelagem SwissModel A validação da estrutura
modelada também ocorreu com auxilio dos programas ANOLEA e Verify 3D.
Todas as estruturas moldes e modelada foram visualizadas no
SwissPDBViewer [76].
4.5- Classificações das estruturas modeladas
Para classificação estrutural das proteínas modeladas, utilizou-se o
programa de bioinformática disponível na internet, CATH [134]. O CATH é uma
classificação hierárquica do domínio das estruturas das proteínas do PDB.
Apenas estruturas cristalizadas com resolução de no máximo 4,0 angstroms
são consideradas. A classificação ocorre em quatro principais níveis de
hierarquia: Classe, Arquitetura, Topologia e Superfamília.
4.6- Predições por PEPOP
PEPOP é um programa de bioinformática desenvolvido para guiar
experimentalistas que a partir da estrutura 3D de uma proteína desejam
localizar epítopos descontínuos ou desenhar peptídeos imunogênicos que
serviriam na criação de anticorpos que têm como alvo as proteínas ou sítios
específicos [135]. O algoritmo utilizado pelo programa, a partir da estrutura 3D
resolvida ou do modelo da proteína, é capaz de identificar e agrupar segmentos
de aminoácidos contíguos que sejam acessíveis ao solvente. Esses segmentos
são também avaliados quanto às características físico-químicas compatíveis
com as observadas em interações proteína-proteína, como hidrofobicidade,
presença de aminoácidos freqüentes nesse tipo de ligação e presença de
voltas β.
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Para o desenho de um peptídeo que possa representar um epítopo
descontínuo predito, um “segmento de referência” entre os agrupamentos
previamente citados é escolhido e outros segmentos são adicionados a ele de
modo a gerar um peptídeo do tamanho desejado. O usuário do programa pode
escolher a região da proteína que deve ser privilegiada nesse processo bem
como diferentes métodos de extensão para criar o peptídeo. São eles:

Nearest Neighbours (NN)– Ajunta os segmentos mais próximos ao Cterminal do segmento referência;

Optimized Nearest Neighbour – (ONN) Adiciona os segmentos mais
próximos ao C-terminal do segmento referência, mas em uma ordem
que faça com que a distância percorrida entre os segmentos seja a
menor possível;

Nearest Flanking (NF) – Ajunta os segmentos tanto do lado C-terminal
como do N-terminal do peptídeo de referência, alternadamente;

Optimized Nearest Flanking (ONF) – Liga os segmentos tanto do lado Cterminal como do N-terminal do peptídeo de referência, alternadamente,
mas em uma ordem que faça com que a distância percorrida entre os
segmentos seja a menor possível;

Raio de 10 Å (10AR)– Junta segmentos que se encontram num raio de
10 Å do segmento referência;

Adição de Linkers – Esse método pode ser combinado a qualquer outro
e consiste na adição de aminoácidos extras entre os segmentos
escolhidos para formar o peptídeo, para mimetizar a distância real entre
eles na estrutura tridimensional da proteína. Ele esta dividido em dois
submétodos, o ALA-Linkers e o Structural Alfabet.
# ALA-Linkers – Acrescenta alaninas entre os segmentos
combinados. O número de alanina vária de acordo com a
distância entre os segmentos
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# Structural Alfabet (SA) – Acrescenta o(s) aminoácido(s) que
melhor se encaixaria entre os segmentos de forma que o peptídeo
final tenha a estrutura mais próxima da estrutura na proteína.

Sentido dos segmentos – Nesse método, o sentido dos segmentos (Nterm para C-term) não é levado em consideração, sendo que eles
podem ser adicionados na ordem inversa que se encontram na estrutura
primária, a fim de aperfeiçoar o mimetismo com a estrutura
tridimensional.
A Figura 4 ilustra os sete métodos de extensão utilizados pelo programa
PEPOP no designer do peptídeo que possa representar o epitopo descontínuo
predito pelo programa.
Figura 4: Representação esquemática dos métodos de extensão para
design de peptídeos utilizados pelo programa PEPOP.
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4.7- Predições pelo STING Millennium
STING Millennium é uma base disponível na web de bancos de dados
fornecendo uma visualização e uma análise complexa de seqüências
moleculares e estruturais para os dados depositados no Protein Data Bank
(PDB). O STING funciona como uma combinação dos conjuntos de dados
publicamente disponíveis (por exemplo, PDB, HSSP, Prosite) e com os dados
por ele calculados (por exemplo, contato e acessibilidade na superfície) é
possível o acoplamento bidirecional entre a seqüência e as informações
estruturais de uma dada proteína. [136]. O STING fornece assim uma série de
parâmetros físico-químicos e biológicos que, através deles, torna-se possível
descrever e analisar a estrutura, a função, a seqüência, a estabilidade e as
interações de uma dada proteína [137]. Tais combinações de parâmetros estão
disponíveis em um único local, o Java Protein Dossier [138].
Java Protein Dossier (JPD) é um módulo do STING Millennium que
reúne ferramentas de visualização de base de dados, fornecendo uma coleção
de parâmetros físico-químicos e biológicos para descrever a estrutura, a
estabilidade,
a
função
e
as
interações
das
proteínas
com
outras
macromoléculas. A coleta de parâmetros em uma única base de dados, além
da possibilidade de agrupá-los, permite que sejam gerados parâmetros
diferentes com o potencial de fornecer introspecções novas na relação da
seqüência-estrutura-função de uma proteína. No JPD, a seleção do resíduo
pode ser executada de acordo com critérios múltiplos. O JPD pode,
simultaneamente, indicar e analisar todos os parâmetros físico-químicos de
quaisquer estruturas, usando-se alinhamentos pré-calculados e, desta forma,
permitir a comparação direta dos parâmetros nas posições correspondentes
aos aminoácidos entre estruturas homólogas. Além disto, pode-se focalizar o
perfil físico-químico das proteínas e, conseqüentemente, o farmacológico.
[138].
Para a LHF-II o módulo do JPD foi utilizado para identificar os resíduos
pertencentes à região imunogênica através de parâmetros pré-selecionados.
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4.8- Predições pelo MIMOP
MIMOP é uma ferramenta computacional desenvolvida com o objetivo
de prever epítopos contínuos e descontínuos, auxiliar experimentalistas a
analisar um conjunto de seqüências mimotopicas e orientá-los na identificação
da região imitada na proteína. Estas informações são apresentadas através de
uma interface web acessível, de fácil utilização, permitindo, entre outras coisas,
a visualização interativa das previsões diretamente sobre a estrutura 3D da
proteína O programa utiliza de duas abordagens diferentes, o MimAlign que
prevê regiões de potenciais epítopos a partir das seqüências dos mimotopos,
seqüências do antígeno e da estrutura 3D do antígeno caso esta esteja
disponível, e o MimCons que prevê as regiões de potenciais epítopos a partir
de seqüências dos mimotopos, mas requer necessariamente a estrutura 3D do
antígeno para encontrar as regiões mimetizadas. [139].
O MimAlign combina o alinhamento das seqüências de mimotopos e da
proteína usando quatro programas diferentes de alinhamento múltiplo de
seqüência (DIALIGN [140], T-COFFEE [141], Multalin [142] e DCA [143]). Para
cada posição destes alinhamentos combinados, uma freqüência e uma
pontuação
são
calculadas.
Em
seguida,
posições
convergentes
são
selecionadas e agrupadas com base na sua topologia. Os agrupamentos
obtidos são considerados como regiões de potenciais epítopos e são
pontuadas e ranqueadas.
O MimCons, analisa as seqüências dos mimotopos classificando-as de
acordo com sua similaridade. Em seguidas, padrões de consenso são
identificados usando o algoritmo de PRATT [144]. Então, verifica-se na
superfície acessível do antígeno os resíduos que se encontram nela e que
possuam o mesmo padrão de consenso (a acessibilidade é calculada por
DSSP [37]). Por fim, estes resíduos mais os aminoácidos vizinhos
espacialmente são identificados e considerados como regiões de potenciais
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epítopos. As diferentes regiões encontradas recebem pontuações e são
ranqueadas.
Em uma última etapa opcional, as interseções dos dois métodos são
calculadas comparando os conjuntos selecionados pelo primeiro com as
regiões selecionadas pelo segundo. Para a predição de epítopo de LHF-II
reconhecida pelo LmmAbB2D4, utilizou-se dos mimotopos selecionados por
Phage Display.
4.9- SPOT
4.9.1- Sínteses
A síntese paralela de peptídeos sobre membrana de celulose ocorreu-se
por permitir a síntese rápida e eficiente de um grande número de peptídeos
(816 peptídeos), em delimitações pontuais por volume de deposição de cada
resíduo. Assim, as membrana de celulose contendo os peptídeos preditos pelo
programa de bioinformática PEPOP foram preparadas de acordo Laune et.al.
2002 [145]. Os aminoácidos protegidos por um grupamento FMOC foram
depositados em um volume de aproximadamente 0,6 L no sintetizador
automático (Multipep Automatic Spot synthesizer – Intavis), permitindo obter
aproximadamente 50 nanomoles de peptídeo por ponto na membrana.
A síntese dos peptídeos iníciou-se sempre pelo C-terminal do último
aminoácido das seqüências estabelecidas para cada ponto. Após a retirada do
grupo FMOC que se encontrava acoplado á função amina do aminoácido pela
adição de piperidina 20% em dimetilformamida (DMF), esta se tornou
disponível para reação com o próximo aminoácido a ser acoplado. A eficiência
deste passo pode ser monitorada pela reação com o azul de bromofenol, que
apresenta coloração azul quando em contato com grupamentos amina livres.
Os aminoácidos a serem acoplados foram ativados por DIPC/HOBT
(diisopropilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol) e depositados sobre a membrana.
Para cada aminoácido foram realizados dois ciclos de acoplamento. As funções
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NH2 que permaneceram livres após o acoplamento foram acetiladas com
anidrido acético 10% em DMF, a fim de se evitar reações colaterais com os
aminoácidos posteriormente adicionados.
O grupo protetor FMOC do aminoácido recém-acoplado foi novamente
eliminado em meio básico pela piperidina a 20%. A membrana foi lavada com
metanol e, após secagem desta, foi reposicionada no sintetizador para outro
ciclo. Os ciclos se sucederam desta forma até completar a sequência do
peptídeo desejado.
Ao final da síntese, os grupos laterais protetores dos aminoácidos foram
retirados pelo tratamento da membrana com ácido trifluoracético (TFA)
associado a diclorometano e trietilsilano.
Nesta tese, todos os peptídeos sintetizados nas membranas que
continham o aminoácido cisteína e sua seqüência foram substituídos por serina
na síntese. Esta substituição ocorreu para evitarmos a formação de ponte de
dissulfetos entre os peptídeos. A serina diferencia da cisteína apenas pela
presença do grupo OH no lugar do grupo SH na cadeia lateral. Como estes
peptídeos não fazem ponte de dissulfetos entre eles, acreditamos que esta
substituição melhor representa a região que foi mimetizada.
4.9.2- Sintese - ALA-Scan
Para determinação dos aminoácidos importantes para a ligação
peptídeo-anticorpo foi realizado o ALA-Scan. Este ensaio consiste na síntese
de uma membrana contendo uma série de peptídeos onde cada aminoácido da
seqüência do peptídeo original é substituído por uma alanina. No caso de
alaninas presentes na seqüência inicial, esta é substituída por uma glicina. A
síntese é realizada como descrita acima.
4.9.3- Ensaio Imunoquímico
As membranas contendo os peptídeos sintéticos foram lavadas três
vezes com tampão TBS pH 7.4 e então saturadas em solução contendo 1 ml
de tampão de bloqueio (coating buffer, Sigma) e 0,5 g de sacarose, em 20 ml
Página | 44
de tampão TBS-Tween 0,1%, overnight. Em seguida, a membrana foi lavada
com o tampão TBS-Tween 0,1% e incubada com o 15 g do anticorpo
monoclonal a ser testado, diluído na mesma solução bloqueio, durante 1h e 30
min sob agitação constante. Após a incubação, a membrana foi lavada com
TBS-Tween 0,01% por 10 min. A partir deste momento, dois processos foram
utilizados: a revelação com anticorpo secundário ligado a fosfatase alcalina ou
com anticorpo secundário ligado a peroxidase
4.9.4- Revelação Fosfatase Alcalina
O anticorpo secundário ligado à fosfatase alcalina, diluído no tampão de
bloqueio, foi incubado com a membrana por 1h. Após nova lavagem sob
agitação de 10 minutos com TBS-Tween 0,1% e mais duas lavagens de
também 10 minutos cada, com CBS pH 7 sob agitação, foi adicionado o
substrato contendo MTT, BCIP e MgCl2 (Sigma).
Vinte minutos depois, a
reação foi parada com água destilada e os spots reativos foram detectados
pelo método de colorimetria direta. Para isto, a membrana foi fotografada e a
intensidade da coloração dos spots foram quantificadas pelo software ImageJ
[146].
4.9.5- Revelação ECL
O anticorpo secundário ligado á peroxidase, diluído em tampão de
bloqueio, foi incubado com a membrana por 1h. Após nova lavagem de 10
minutos com TBS-Tween 0,1% sob agitação, a membrana foi incubada com o
Kit ECL Western Blotting Detection Reagents (GE) numa câmara escura por 5
minutos e a detecção dos spots reativos foi realizada em filme Kodak Biomax
Light Film com auxilio de um cassete, dentro de uma câmara escura.
4.9.6 - Regeneração da Membrana
Para reutilizações posteriores, as membranas foram submetidas a um
tratamento de regeneração. Primeiramente efeituou-se 3 lavagens de 10
minutos cada com dimetilformamida (DMF), em seguida, mais 3 lavagens de 10
minutos cada com reagente A (uréia 8M + 1% de SDS + 0.1% de 2Página | 45
mercaptoetanol) e finalmente outras 3 lavagens de 10 minutos cada com
reagente B (etanol / água / ácido acético nas proporções 50:40:10 vol/vol/vol).
Como controle, realizou o teste do conjugado, ou seja, após o bloqueio
incubou-se a membrana com o cojugado. Realzou-se ainda a incubação da
membrana com o soro pré-imune. Realizando em seguida nos dois casos a
revelação de acordo com o protocolo descrito acima.
4.10- Sínteses Química de Peptídeos
Foi utilizado o método desenvolvido por Merrifield, 1969 [120]. Ele
consiste em fixar o aminoácido C-terminal do peptídeo sobre um suporte sólido
insolúvel e depois alongar a cadeia peptídica por adições sucessivas de
resíduos da porção C-terminal para N-terminal. Estes aminoácidos possuem o
grupamento
amina
protegido
pelo
grupamento
FMOC
(fluorenil-metil-
oxicarbonila), sua cadeia lateral também esta protegida por um grupo protetor
para evitar reações indesejadas. O suporte sólido insolúvel normalmente é uma
resina que também se encontra protegida pelo FMOC.
Foi utilizada a resina Rink Amide com suporte sólido, o protocolo
utilizado para formação do peptídeo é semelhante ao utilizado para a síntese
em membrana de celulose. O tubo de síntese contendo a resina foi lavado 3
vezes com 5ml de DMF e em seguida foi adicionada piperidina 20% , deixando
sob agitação por 20 minutos para eliminar o FMOC da resina. Após novas 3
lavagem com DMF,
iníciou-se a etapa de acoplamento. Nesta etapa, o
primeiro aminoácido (100M) a ser acoplado foi adicionado junto com os
ativadores da sua função carboxila, o HOBt (100M) e o DIPC (100M) e
deixado por 30 minutos sob agitação.
Após acoplagem, três novas lavagens com DMF são realizadas e é
iniciada a etapa de desproteção. Nesta etapa o grupamento FMOC do
aminoácido acoplado é removido com a presença de piperidina 20%, por 20
minutos. Ao final desta etapa, nova 3 lavagens com DMF são realizadas o
protocolo de acoplagem do segundo aminoácido é reiniciado. Este ciclo de
Página | 46
acoplagem/desproteção é feito até que todos os aminoácidos do peptídeo a ser
sintetizado estejam acoplados.
Após o término do último ciclo, o peptídeo já sem o grupamento FMOC
do último aminoácido então é removido da resina por uma etapa chamada de
clivagem. Nesta etapa também se elimina os grupamentos protetores da cadeia
lateral. Para isto, o peptídeo é incubado por 3 horas com uma solução de
clivagem contendo 2.5% de EDT (etanoditiol - Fluka) + 2.5% de água destilada
+ 2,5% de TES (trietilsilano - Fluka) em TFA (ácido trifluoracético). Em seguida
esta solução é filtrada A solução filtrada é precipitada com éter etílico gelado
obtendo assim o peptídeo. Após centrifugação o éter é eliminado e o peptídeo
é ressuspendido em água mili-Q e liofilizado.
4.11- Purificações dos peptídeos sintéticos
Os peptídeos sintetizados foram solubilizados em água mili-Q e
submetido a uma cromatografia líquida de alta pressão (HPLC- shimadzu)
acoplada à coluna VYDAC-C18. A coluna foi previamente equilibrada com
0,1% de solução aquosa de TFA e eluida em gradiente linear de TFA 0,1% em
acetonitrila (1% / min). Os picos obtidos foram submetidos à espectrometria de
massa para a análise pelo instrumento Autoflex-III MALDI-TOF-TOF™ (Bruker
Daltonics).
4.12- Espectrometria de massa
As análises por espectrometria de massa foram realizadas no Núcleo de
Estudo de Estrutura e Função de Biomoléculas do Departamento de
Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas na Universidade
Federal de Minas Gerais utilizando o instrumento Autoflex-III MALDI-TOFTOF™ (Bruker Daltonics) no modo refletor/positivo controlado pelo software
FlexControl™. A calibração do instrumento foi obtida usando o
Peptide
Página | 47
Calibration
Standard
II
(Bruker
Daltonics)
como
referência
e
ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico como matriz.
Uma gota da mistura contendo a amostra a ser analisada e a matriz
ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico, na proporção de 1:1 foi colocada numa placa
MTP AnchorChip™ 400/384 (Bruker Daltonics). Após a secagem da gota, a
placa foi levada ao aparelho para análise.
4.13- Preparação de Lipossoma
O filme lipídico de lipossomas foi preparado de acordo com Gomes et. al
2010[147]. A solução contendo Esfingomielina mais lipossomas multilamelar de
Colesterol (razão molar de 2:1) foi preparada pela dissolução de 25 mg de
esfingomielina (altamente purificada, a partir de cérebro de bovinos, Sigma) e
6,5 mg de colesterol (Sigma) em 20 ml de clorofórmio, juntamente com traços
de metanol. A solução foi colocada em um balão de fundo redondo e o solvente
foi removido por evaporação em um evaporador rotativo a 37°C, em sistema de
de pressão reduzida por 80 min Em seguida, foi adicionado ao frasco 3 ml
contendo 4 mg de HRP [tipo VI-A, Sigma, em 0,05 M de tampão fosfato salina,
pH 7,4]. Um filme lipídico foi formado e desalojado do vidro pelo uso de um
misturador vortex. Os lipossomas foram recuperados por meio de uma pipeta
Pasteur e, em seguida, tratados com vibração ultra-sônica três vezes durante
20 s cada. A suspensão de lipossomas foi centrifugado a 8000 × g por 10 min a
4°C para remover o excesso de HRP.
Os lipossomas foram então
ressuspendidos e lavados e centrifugados por três vezes com PBS e
armazenados a 4°C.
Peptídeos purificados foram acoplados aos lipossomas através da
hidratação com 10 ml de água destilada dos lipossomas. 0,1 g de peptídeos
previamente dissolvido em 0,5 ml de tampão fosfato salina, pH 7,4 foram
misturado com 1 ml do lipossoma hidratado. Em seguida a mistura foi liofilizada
e resuspendida em PBS para imunização.
Página | 48
4.14- Protocolos de Imunização
Após a coleta do soro pré-imune, coelhas fêmeas da raça New Zealand
pesando em torno de 2 kg receberam injeções subcutâneas (s.c.) de 0,1 mg de
peptídeo acoplado ao lipossoma (dia 1). Sete reforços foram dados em
intervalos de 14 dias, via subcutânea, com 0,1 mg de peptídeo acoplado ao
lipossoma rLiD1. Um grupo controle recebeu lipossoma vazio (sem peptídeo
acoplado) nas mesmas condições. O soro imune foi coletado uma semana
após o ultimo reforço (dia 105).
4.15- Determinação da atividade hemorrágica
A atividade hemorrágica foi determinada através do método de Kondo
et.al. 1960 [148] e modificado por Gutierrez, et.al 2002 [149]. Foi inoculado
14,28 μg do veneno da serpente Lachesis muta muta em 0,1 ml de NaCl 0,9%,
via subcutânea no dorso da pele raspada dos coelhos imunizados com os
peptídeos. Após vinte quatro horas, os coelhos foram sacrificados e o dorso foi
totalmente removido, a fim de se medir e fotografar a lesão hemorrágica. A
atividade hemorrágica foi determinada como aquela que causa uma lesão no
local da injeção de pelo menos 1 cm2.
4.16- Caracterizações bioquímicas dos epítopos/mimotopos identificados
Para identificar os pontos isoelétricos (pI) dos epítopos ou mimotopos
identificados nesta tese utilizou-se o programa “Compute pI/Mw tool” disponível
no site do EXPASY (http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html) e pelo programa
escrito nesta tese na linguagem de PHP.
Página | 49
Página | 50
5- RESULTADOS E DISCUSSÕES
Com a crescente necessidade de anticorpos monoclonais e vacinas, a
predição de epítopos de células B se tornou fundamental, especialmente para
novas proteínas isoladas de patógenos. Estudos cristalográficos têm
demonstrado que a maioria dos epítopos de antígenos protéico são
descontínuos [150]; entretanto, devido a dificuldade na produção e validação,
existem poucos programas de bioinformática desenvolvidos para predição de
epítopos descontínuos, sendo a maioria dos programas existentes voltados
para identificar apenas epítopos contínuos [151]. Os parâmetros para
identificação destes epítopos variam de programa para programa. Por exemplo,
o CEP avalia a acessibilidade dos resíduos em função da estrutura 3D dos
antígenos protéicos [152], o DiscoTope combina uma escala de matrizes de
propensão com a proximidade espacial e exposição na superfície [150]. Já o
SEPPA, utiliza de uma rede formada por triângulos de resíduos para descrever
a superfície espacial local do antígeno [151].
Embora essas ferramentas forneçam ajuda no planejamento de
experimentos moleculares, várias revisões vêm demonstrando que a predição
de epítopos descontínuos persiste em ser um método difícil para os antígenos
protéicos [153-154]. A vantagem do PEPOP, programa que escolhemos utilizar
na predição de epítopos descontínuos, é que este software, além da predição
dos epítopos, propõe uma série de peptídeos antigênicos. Vimos que as
combinações das metodologias descritas no item 4.6 são outra vantagem do
programa, já que os peptídeos reativos encontrados nesta tese foram preditos
por metodologias diferentes deste programa. Assim não podemos falar que
uma metodologia é melhor que a outra e que a utilização de todas se faz
necessário. Outra ferramenta que utilizamos foi o STING, que nos proporcionou
a liberdade nas escolhas dos parâmetros físico-químicos dentro do modulo
Java Protein Dossier, assim pudemos utilizar os parâmetros que julgamos ser
mais importantes numa determinação de epítopos.
O MIMOP foi utilizado
graças a sua capacidade de localizar na região da superfície do antígeno
protéico a região imitada pelo mimotopos do phage display. Aproveitamos
Página | 51
ainda a capacidade do método do SPOT para fazermos centenas de peptídeos
paralelos que permitiu testar a sua capacidade de ligação de uma forma
simples, porém sensível com o anticorpo.
5.1- AaH-II
O escorpião Androctonus australis Hector (Figura 5) é considerado uma
das espécies de escorpião mais perigosas no mundo. Escorpiões do gênero
Androctonus produzem um veneno muito tóxico que pode provocar hipotermia
maligna, miocardite, edemas pulmonares e até mesmo a morte dos
acidentados. A toxina AaH-II representa cerca de 1,5% do total de proteínas do
veneno e é responsável por aproximadamente 50% da atividade tóxica do
mesmo. [155]. Todos os resíduos que parecem ser considerados importantes
na toxina apresentam-se agrupados em um lado da toxina, indicando a região
como uma superfície hidrofóbica exposta.
A toxicidade, portanto, está nos
resíduos que compõem esta superfície hidrofóbica conservada, bem como nas
regiões C- e N-Terminais [156].
Figura 5: Fotografia do escorpião Androctonus australis Hector
Fonte: http://www.aurga.com/androctonus_australis_hector.htm
O tratamento dos acidentes humanos com estes animais consiste no uso
de antivenenos específicos preparados a partir da hiperimunização de animais
Página | 52
de grande porte com o veneno [157]. A metodologia tradicional utiliza o veneno
total nas imunizações. No entanto, novas técnicas vêm sendo desenvolvidas a
partir da imunização com peptídeos identificados em epítopos [158].
O programa de bioinformática PEPOP foi utilizado para mapear e
agrupar segmentos de aminoácidos acessíveis na proteína, que seriam parte
de regiões epitópicas e através das metodologias descritas no item 4.6
proporem peptídeos desenhados a partir das combinações destes segmentos e
respeitando algumas restrições como, por exemplo, a distância espacial de
10A. Esta distância é devida ao tamanho máximo descrito para uma região
epitopica [159]. Utilizando a estrurura cristalografada da AaH-II (1AHO.pdb), o
PEPOP propôs 73 peptídeos, como mostra a Tabela 3. Estes peptídeos são os
resultados das combinações dos 16 segmentos preditos e apresentados na
Tabela 4.
Tabela 3: Dados das predições pelo programa PEPOP para diferentes
proteínas.
Antígenos
Números de
Segmentos
Números de seqüências de
peptídeos únicos preditos
AaHII
16
73
GM-CSF
28
175
C2FVIII
33
236
DNF
57
456
GAD65
96
648
*
40
608
LHF-II
* Os testes com a LHF-II foram realizados no Brasil.
A fim de verificar a reatividade destes peptídeos, os mesmos foram
sintetizados quimicamente como pontos (spots) em uma membrana de celulose
e analisados através da tecnologia SPOT como descrito no item 4.9, para isto
utilizou-se do anticorpo monoclonal mAb 4C1 neutralizante da toxina AaH-II
produzido pelo laboratório Sysdiag, UMR3145 - CNRS/Bio-Rad de acordo com
Yahi et.al, 2002 [125]. A Figura 6 mostra o resultado para este ensaio
imunoquímico de SPOT. Quatros seqüências peptídicas foram reconhecidas
Página | 53
pelo anticorpo monoclonal mAb 4C1. Dois destes foram com intensidade forte e
são formados pelos segmentos
17
GRNAY21 mais os segmentos
37
QWA39 e
41
PYGN44. Dois foram com intensidade mais fraca e são também formados
pelos mesmos segmentos 37QWA39, 41PYGN44 mais o segmento 60PGRCH64.
Tabela 4: Segmentos acessíveis da AaH-II do escorpião Androctonus
australis Hector identificado pelo PEPOP e a posição no PDB (1AHO.pdb)
Segmento de
referência
Comprimento do
segmento (em aa)
Seqüência
Posição no arquivo
PDB
Segmento 1
3
VKD
1a3
Segmento 2
1
Y
5a5
Segmento 3
3
DDV
8 a 10
Segmento 4
3
TYF
13 a 15
Segmento 5
5
GRNAY
17 a 21
Segmento 6
2
NE
23 a 24
Segmento 7
4
TKLK
27 a 30
Segmento 8
2
ES
32 a 33
Segmento 9
1
Y
35 a 35
Segmento 10
3
QWA
37 a 39
Segmento 11
4
PYGN
41 a 44
Segmento 12
1
Y
47 a 47
Segmento 13
2
YK
49 a 50
Segmento 14
2
DH
53 a 54
Segmento 15
3
RTK
56 a 58
Segmento 16
5
PGRCH
60 a 64
Figura 6: Resultado do teste de SPOT dos 73 peptídeos preditos por
PEPOP contra o monoclonal mAb 4C1 neutralizante da toxina AaH-II.
Página | 54
Estes quatro peptídeos estão apresentados na Tabela 5. Nota-se que
eles são formados pelos mesmos segmentos (37QWA39,
41
PYGN44) indicando
que estas são regiões antigênicas importantes. A presença das alaninas entre
os segmentos nos 3 primeiros peptídeos da Tabela 5 foi devida a metodologia
empregada pelo PEPOP. A alanina funcionou como espaçador entre os seus
segmentos preditos e a quantidade de alaninas utilizadas entre cada segmento
varia de acordo com a distância entre eles na estrutura 3D. A Tabela 5 ainda
mostra que cada peptídeo foi predito por um método diferente. Enquanto o
peptídeo 198 foi predito pelo método de ONNI, os peptídeos 225 e 227 foram
predito tanto pelo método NFI, quanto pelo método ONFI já o peptídeo 228 foi
predito pelos métodos NFsa e ONFsa
Tabela 5: Peptídeos reativos contra o anticorpo monoclonal mAb 4C1 pela
técnica de SPOT
Número
Composição
Métodos
Comprimento
do
Peptídeos
em
Preditos
em aa
SPOT
segmento
198
Q-W-A-A-A-P-Y-G-NA-A-G-R-N-A-Y
ONNI
225
Y-A-A-Q-W-A-A-A-PY-G-N-A-A-G-R-N-A-Y
NFI
ONFI
9+10+11+5
227
P-G-R-S-H-A-A-A-PY-G-N-A-A-Q-W-A
NFI
ONFI
16+11+10
228
P-G-R-S-H-P-Y-G-NQ-W-A
NFsa
ONFsa
16+11+10
10+11+5
16
19
17
12
A Figura 7 mostra os peptídeos reativos contra a mAb 4C1 na estrutura
3D da AaH-II (1AHO.pdb). Observa-se nas Figuras 7A, 7B, 7C e 7D que os 2
peptídeos de reatividade forte estão localizados na mesma região da toxina. O
segmento
segmento
37
Q-W-A39 e
41
P-Y-G-N44 se situa numa região de loop enquanto o
G-R-N-A-Y21 se encontra no final da -Hélice e próximo
17
espacialmente do loop. O peptídeo 225, em 7C e 7D, contém ainda um resíduo
de Y relativa à Y35 que também se encontra próxima espacialmente ao loop e
ao final da -Hélice. Já os dois peptídeos de reatividade mais fraca possuem o
mesmo
37
Q-W-A39 e
41
P-Y-G-N44 situado no loop mais o segmento
60
PGRCH64
relativo à região N-terminal da toxina, como mostra a Figura 7E e 7F.
Página | 55
7A
7B
7C
7D
7E
7F
Figura 7: Visualização na estrutura 3D dos peptídeos reativos ao mAb
4C1 da AaH-II (1AHO.pdb). Em 7A e 7B a visualização em dois ângulos
diferentes do peptídeo 198 (Q-W-A-A-A-P-Y-G-N-A-A-G-R-N-A-Y) de reatividade
forte. Em 7C e 7D a visualização em dois ângulos diferentes do peptídeo
225 (Y-A-A-Q-W-A-A-A-P-Y-G-N-A-A-G-R-N-A-Y) de reatividade forte. Em 7E e 7F
a visualização em dois ângulos diferentes dos peptídeos 227 (P-G-R-S-H-A-AA-P-Y-G-N-A-A-Q-W-A) e 228 (P-G-R-S-H-P-Y-G-N-Q-W-A) de reatividade fraca.
Página | 56
Estes dados estão de acordo com a literatura. O resíduo W 38, presente
nos quatro peptídeos, foi identificado como resíduo-chave na ligação da AaH-II
com o canal de sódio e na atividade tóxica em ratos. [160]. Recentemente,
através da técnica de mutagênese, definiu-se que o W 38 e N44 fazem parte de
uma região chamada de “domínio de núcleo conservado”. Este domínio forma
uma rede de interações químicas com resíduos da cauda C-terminal
estabilizando a estrutura e formando uma superfície bioativa nas -toxinas de
escorpiões [161]. Desta forma a ligação do anticorpo 4C1 nestes resíduos
sugere que o anticorpo neutralize esta região e desta forma, neutralize a
atividade tóxica da toxina, o que comprovaria que esta região seria uma região
epitopica.
Mais recentemente, a Amm-VIII, uma toxina isolada do veneno do
escorpião Andoctonus mauretanicus mauretanicus com uma identidade de 89%
com a AaH-II, teve uma região de epítopo descontinuo descrita quando testada
contra um anticorpo policlonal anti-Amm-VIII. Esta região era composta pelos
segmentos da Amm-VIII
segmentos
23
17
G-R-N-A-Y21,
N-E24 e os segmentos
37
Q-W-A39 e
41
P-Y-G-43 mais os
27
I-K-L-T30 ilustrados na Figura 8 [162].
Uma simples comparação mostra que os mesmos segmentos
37
Q-W-A39 e
41
P-
Y-G43 que fazem parte da região epitopica para a Amm-VIII foram encontrados
na AaH-II, apesar de serem testado contra anticorpos diferentes. Estes dados
estão em acordo com trabalho de Martin-Eauclaire et al, que descobriram por
meio de radioimunoensaio, que anticorpos policlonais anti-Amm-VIII impediram
a associação da AaH-II ao seu sítio receptor sinaptossomal e provocaram um
efeito protetor em camundongos indicando mais uma vez que estes resíduos
fazem parte da zona epitopica da AaH-II. [163].
Página | 57
8A
8B
Figura 8: Visualização na estrutura 3D do epitopo descontinuo da
Lmm-VIII contra anticorpos policlonais anti-Lmm-VIII. 8A e 8B a
visualização em angulos diferentes dos resíduos 37Q-W-A39 e 41P-Y-G-43,
23
NE24 e 27IKLT30 referente a este epítopo descontinuo.
A Figura 9 apresenta o alinhamento das duas toxinas AaH-II e Amm-VIII
utilizando o algoritmo do programa SIM - Alignment Tool for protein sequences
[164]. Este alinhamento apresentou 89.1% de identidade em 64 resíduos
sobrepostos, sem presença de gap’s. Os resíduos da AaH-II que foram reativos
para o anticorpo monoclonal 4C1 e os resíduos descritos por Alvarenga et.al,
2010 [162] que foram reativos para o anticorpo policlonal anti-Amm-VIIII, estão
destacados com as mesmas cores da Figura 8. A região central contendo os
resíduos
17
G-R-N-A-Y21,
37
Q-W-A39 e
41
P-Y-G43 é a mesma evidenciando sua
importância como uma região epitopica.
AaH-II
Amm-VIII
0
1
2
3
4
5
6
6
1
0
0
0
0
0
0
4
VKDGYIVDDVNCTYFCGRNAYCNEECTKLKGESGYCQWASPYGNACYCYKLPDHVRTKGPGRCH
LKDGYIVNDINCTYFCGRNAYCNELCIKLKGESGYCQWASPYGNSCYCYKLPDHVRTKGPGRCN
****** * ************** * ***************** ******************
Figura 9: Alinhamento linear das sequencias de aminoácidos das toxinas
AaH-II e Amm-VIII. Em destaque os resíduos das prováveis região epitopica
para a AaH-II e para Amm-VIII [162].
Página | 58
Outro resultado que comprova que estes resíduos da AaH-II são parte
de um epítopo descontinuo, é o resultado encontrado pela aluna de doutorado
de bioquímica de nosso laboratório, Clara Guerra Duarte. Em sua tese, ela
trabalha na produção e análises de anticorpos monoclonais e em um dos seus
experimentos com o anticorpo monoclonal mAb 4C1, ela observou a
reatividade do anticorpo mAb 4C1 contra um peptídeo. Este peptídeo era
composto
pelos
resíduos
P-Y-G-N-A-A-W-Q-A-A-Y.
Comparando
esta
seqüência com a os peptídeos de PEPOP reativos, surpreende-se com a
presença dos resíduos
41
P-Y-G-N44, mais os resíduos
37
Q-W-A39, invertidos
nesta seqüência do peptídeo, alem de uma Y que pode ser identificada como a
Y35 presente em um dos peptídeos de forte reatividade contra o monoclonal.
[Duarte C,G comunicação pessoal]. Desta forma, a sobreposição destes
resíduos na estrutura 3D da AaH-II apresenta praticamente a mesma
localização estrutural mostrada na Figura 7, apresentando-se como mais um
fator que comprovaria a suposição que estes resíduos são epítopos.
Para testar a especificidade destes peptídeos reativos ao monoclonal, a
membrana contendo os 73 peptídeos foi testada pelo ensaio de SPOT contra
um anticorpo monoclonal anti-GMCSF, mAb 2C4F10. Nenhum peptídeo foi
reativo contra este monoclonal, indicando que a interações dos peptídeos
reativos com o mAb 4C1 foram especificas para este anticorpo. Além disto, a
membrana foi testada contra o conjugado anti-camundongo-peroxidase, e
nenhum peptídeo também se apresentou reativo. Este resultados comprovam
que os 4 peptídeos 198, 225, 227 e 228 foram reativos ao mAb 4C1 e não ao
conjugado, evidenciando mais uma vez a especificidade das interações destes
peptídeos com o mAb 4C1. Outro teste controle realizado foi de verificar a
especificidade do anticorpo monoclonal mAb 4C1. Sua reatividade foi testada
contra outros peptídeos (peptídeos preditos por PEPOP para a proteína GMCSF) pela mesma técnica de SPOT. Nenhum dos peptídeos foi reativo,
comprovando a especificidade do anticorpo monoclonal. Por fim, testou-se este
anticorpo monoclonal mAb 4C1 contra os peptídeos construídos a partir da
seqüência linear da AaH-II. Estes peptídeos foram construídos com intuito de
verificar a presença de epítopos contínuos [158]. Baseado na seqüência linear
Página | 59
da AaH-II, foram construídos 52 peptídeos com 12 aminoácidos. Cada peptídeo
possui 11 aminoácidos sobrepostos quando comparado com o peptídeo
anterior, ou seja, o primeiro peptídeo tem os 12 primeiros aminoácidos da
seqüência linear da AaH-II, o segundo peptídeo tem do resíduo
2 ao 13
resíduo da seqüência linear e assim por diante ate completar a sequência
inteira da proteína.. Desta forma, pode-se testar a reatividade do monoclonal
4C1 contra regiões contínuas da AaH-II. Nenhum dos peptídeos testados foi
reativo ao monoclonal 4C1, indicando que o monoclonal não é reativo a uma
seqüência linear da proteína AaH-II e que o epítopo é conformacional.
Assim, concluímos que o PEPOP foi capaz de predizer peptídeos a partir
de regiões descontínuas da proteína que sejam reativos ao monoclonal mAb
4C1 e, pelo que tudo indica, estes peptídeos contendo os resíduos
37
Q-W-A39 e
41
P-Y-G-N44 mimetizam uma região epitopica da toxina AaH-II.
Este trabalho foi premiado no ano de 2010 durante o Congresso da
Sociedade Brasileira de Toxinologia como melhor pôster (anexoVII) e sua
publicação como artigo em revista indexada está em fase de elaboração.
5.2- GM-CSF
O fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos,
“Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor” também chamado pelo seu
nome abreviado, GM-CSF é uma citocina pertencente a um grupo de
glicoproteínas que regula a proliferação e a diferenciação de células
hematopoiéticas, mais especificamente macrófagos e granulócitos. Ela é uma
proteína secretada por macrófagos, células-T, mastócitos, células endoteliais e
fibroblastos. A GM-CSF estimula as células-tronco para produzir granulócitos
(neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e monócitos [165].
Página | 60
O GM-CSF humano é uma proteína de 14,5 kDa constituída de 127
aminoácidos e possui 52% de similaridade com a proteína homologa de rato. A
proteína humana possui 4 resíduos de cisteína formando duas pontes
dissulfeto, porém apenas as cisteínas 54 e 96 são requeridas para a atividade
biológica da mesma. [166].
GM-CSF vem sendo usado como um medicamento para estimular a
produção de glóbulos brancos após a quimioterapia [167] .Recentemente
também tem sido avaliado em ensaios clínicos para o seu potencial como uma
vacina adjuvante em pacientes infectados pelo HIV. [168]. Este biofármaco tem
sido usado em pacientes que receberam altas doses de quimioterapia ou
transplantados. Além disso, o GM-CSF é usado para restabelecer disfunções
hematopoiéticas, estimular a hiper-produção de células efetoras pré-induzidas
(“primed”) funcionalmente e promover a defesa do hospedeiro contra doenças
infecciosas e malignas. [169]
Ainda, GM-CSF é encontrado em altos níveis em articulações com artrite
reumatóide, sendo o bloqueio do GM-CSF importante para reduzir a inflamação
ou danos. Alguns medicamentos (por exemplo, MOR103) estão sendo
desenvolvidos para bloquear esta citocina [169].
Leukine é o nome comercial do sargramostim, medicamento baseado
em uma proteína recombinante derivada do GM-CSF expressa em leveduras e
desenvolvido pela empresa Immunex (agora Amgen) e foi administrado pela
primeira vez a seis seres humanos em 1987 como parte de um protocolo de
uso compassivo para as vítimas do acidente de radiação com césio em
Goiânia. Atualmente este medicamento é fabricado pela Berlex Laboratories,
subsidiária da Schering AG. Seu uso foi aprovado pelos EUA Food and Drug
Administration (FDA) para a aceleração da produção de glóbulos brancos de
pacientes com leucemia linfóide aguda, ou da doença de Hodgkin. Em 1996, a
FDA também aprovou sargramostim para o tratamento de infecções fúngicas e
reposição dos glóbulos brancos após a quimioterapia. [170]. Este medicamento
Página | 61
é vendido no Brasil como um biofármaco importado, o qual, desta forma, tornase muito custoso para o governo brasileiro.
Por tudo isto, descobrir os epítopos do GM-CSF pode proporcionar um
estudo de docking mais detalhado desta região e assim encontrar
medicamentos economicamente mais viáveis.
Assim, utilizamos o PEPOP e a estrutura 3D da GM-CSF (2GMF.pdb)
para predizerem as seqüências de peptídeos que trazem os segmentos
acessíveis na proteína GM-CSF e agrupá-los em função de sua distância
espacial. A Tabela 6 mostra os 28 segmentos identificados pelo PEPOP. Uma
pequena biblioteca de 175 peptídeos foi proposta pelo PEPOP através da
combinação destes segmentos. Em seguida esta biblioteca foi sintetizada
quimicamente como pontos (spot) em uma membrana de celulose e analisados
imunoquímicamente pelo uso da da tecnologia SPOT como descrito no item
4.9.
Para a análise imunoquímica por SPOT destes 175 peptídeos, utilizouse o anticorpo monoclonal anti-GM-CSF (mAb 2C4F10), produzido pelo
laboratório Sysdiag, UMR3145 - CNRS/Bio-Rad de acordo com [126]. A Figura
10 apresenta a membrana com os 175 peptídeos sintetizados. Na Figura 10A
dentro dos retângulos pretos estão os 42 peptídeos que foram reconhecidos
pelo anticorpo monoclonal mAb 2C4F10. Destes 42 peptídeos, 26 tiveram forte
reatividade e 16 reatividade mais fraca.
Página | 62
Tabela 6: Segmentos acessíveis da GM-CSF identificado por PEPOP e sua
posição no PDB (2GMF.pdb)
Posição no
Segmento de
Comprimento do
Seqüência
arquivo PDB
referência
segmento (aa)
Segmento 1
3
VKD
1a3
Segmento 2
1
Y
5a5
Segmento 3
3
DDV
8 a 10
Segmento 4
3
TYF
13 a 15
Segmento 5
5
GRNAY
17 a 21
Segmento 6
2
NE
23 a 24
Segmento 7
4
TKLK
27 a 30
Segmento 8
2
ES
32 a 33
Segmento 9
1
Y
35 a 35
Segmento 10
3
QWA
37 a 39
Segmento 11
4
PYGN
41 a 44
Segmento 12
1
Y
47 a 47
Segmento 13
2
YK
49 a 50
Segmento 14
2
DH
53 a 54
Segmento 15
3
RTK
56 a 58
Segmento 16
5
PGRCH
60 a 64
Página | 63
10 A
10 B
10 C
10D
Figura 10: Membrana de celulose contendo os 175 peptídeos preditos
por PEPOP para GM-CSF humana. Em 10A, dentro dos retângulos estão
os 42 peptídeos que foram positivo ao monoclonal mAb 2C4F10. Em 10B, o
resultado do teste com o conjugado, mostrando que todos os peptídeos
foram negativos. Em 10C o resultado do teste com a incubação dos
anticorpos mAb 2C4F10 com 3X mais NaCl no tampão. Em 10D resultado
negativo do teste do anticorpo mAb 2C4F10 numa membrana contendo
peptídeos lineares da seqüência da proteína GM-CSF.
Página | 64
Experimentos controles para a determinação da especificidade destes
peptídeos reconhecidos pelo mAb 2C4F10 foram realizados. O anticorpo
secundário (conjugado anti-camundongo-fosfatase) utilizado para revelar o
reconhecimento antigênico não foi reativo contra qualquer peptídeo. Outra
indicação da especificidade foi que estes peptídeos não apresentaram
reatividade contra o anticorpo monoclonal LimAb7, que reconhece o fator
dermonecrótico do veneno da aranha Loxosceles intermedia), como pode ser
visualizado na Figura 10B, sugerindo que as interações entre mAb 2C4F10
com os peptídeos reativos são específicas.
Na Figura 10C, pode ser ver o resultado da incubação do mAb 2C4F10
em alta força iônica. O anticorpo foi incubado com concentrações 3 vezes
maior de NaCl, um perfil de reatividade idêntico ao obtido nas condições
normais foi adquirido mostrando que a ligação destes peptídeos com o
monoclonal não é dependente de interações iônicas não-específicas. Verificouse ainda que o anticorpo mAb 2C4F10 reconhece apenas regiões descontínuas
da proteína GM-CSF, pois como pode ser visto na Figura 10D, o anticorpo
mAb 2C4F10 não foi reativo com nenhum peptídeo linear desta proteína. Estes
peptídeos foram construídos com intuito de verificar a presença de epítopos
continuos [158].
A Figura 11 mostra as seqüências destes 42 peptídeos reativos. Em
cinza escuro estão marcados os segmentos que formam cada um dos 26
peptídeos de forte reatividade e em cinza claro os segmentos dos 16 peptídeos
de fraca reatividade.
Página | 65
Figura 11: Peptídeos preditos para GM-CSF humana por PEPOP
reconhecidos pelo mAb 2C4F10. Com a cor cinza escuro estão os
segmentos que compõem os peptídeos de maior reatividade e em cor cinza
claro estão os segmentos que compõem os peptídeos de menor reatividade.
Os retângulos azul e vermelho marcam duas regiões que apresentaram seus
segmentos reconhecidos.
Página | 66
Uma análise acurada da Figura 11, evidencia que os peptídeos reativos
ao mAb 2C4F10 são formados basicamente por duas regiões, indicadas pelos
retângulos azul e vermelho. Desta forma, em uma observação preliminar podese dizer que existem duas regiões (motivos) da proteína GM-CSF que são
reativas ao mAb 2C4F10.
A Figura 12 apresenta estas duas regiões na
estrutura 3D da GM-CSF (2GMF.pdb). O motivo 1, composto pelos resíduos
W13, E14, V16, N17, Q20, E21, R23, R24 está apresentado com a coloração
vermelha e o motivo 2, composto pelos resíduos K63, Q64, R67, G68, S69,
T71, K72, K74, G75 está apresentado com a coloração azul.
HELIX-2
Q64 K63
HELIX-1
HELIX -C
R67
G68
S69
K74
T71
HELIX -3
G75
K72
Q20
R23
R24
G75
E21
V16 E14
N17
W13
HELIX -N
Figura 12: Visualização dos resíduos pertencente aos dois motivos
reativos ao anticorpo monoclonal mAb 2C4F10 na estrutura 3D da GMCSF. Em vermelho os resíduos correspondentes ao motivo 1 e em azul os
resíduos correspondentes ao motivo 2.
Página | 67
Tabela 7: Freqüência da predição dos segmentos reativos nos 175
peptídeos da GM-CSF frente ao mAb 2C4F10
o
Posição na
n do
Seqüência
segmento
seqüência da
Reativa
GM-CSF
Freqüência
TOTAL (reativo
Não reativo
+ não reativo)
%
(Reatividade/Total)
1
RSPSPSTQ
4 a 11
3
7
10
30,00%
2
WE
13 a 14
7
8
15
46,67%
3
VN
16 a 17
6
11
17
35,29%
4
QE
20 a 21
7
8
15
46,67%
5
RR
23 a 24
7
7
14
50,00%
6
NL
27 a 28
3
9
12
25,00%
7
RDTAAEMNET 30 a 39
3
28
31
9,68%
8
E
41 a 41
6
25
31
19,35%
9
EM
45 a 46
0
28
28
0,00%
10
DLQE
48 a 51
0
49
49
0,00%
11
T
53 a 53
6
48
54
11,11%
12
QT
56 a 57
6
30
36
16,67%
13
E
60 a 60
15
28
43
34,88%
14
KQ
63 a 64
22
24
46
47,83%
15
RGS
67 a 69
17
3
20
85,00%
16
TK
71 a 72
30
0
30
100,00%
17
KG
74 a 75
29
1
30
96,67%
18
TM
78 a 79
12
2
14
85,71%
19
S
82 a 82
9
4
13
69,23%
20
KQH
85 a 87
5
13
18
27,78%
21
PP
22
PETSCATQIIT
23
89 a 90
2
16
18
11,11%
92 a 102
0
53
53
0,00%
ES
104 a 105
0
20
20
0,00%
24
E
108 a 108
0
17
17
0,00%
25
KD
111 a 112
0
16
16
0,00%
26
LVN
115 a 116
0
18
18
0,00%
27
FDC
119 a 121
0
15
15
0,00%
28
EP
123 a 124
0
21
21
0,00%
A Tabela 7 apresenta o número de vezes em que cada segmento
compôs os peptídeos preditos do PEPOP, o número de vez que eles foram
reativos, e negativos e a porcentagem de reatividade de cada segmento. De
acordo com estes valores, observa-se que os dois motivos (destacado na
Tabela 7 e Figura 11 pelos retângulos azul e vermelho) são os que tiveram
maior reatividade. A reatividade do motivo 2 foi superior a 85% para todos os
Página | 68
segmento e a do motivo 1 foi superior a 35%. Entretanto estes segmentos de
alta reatividade, não foram os mais preditos, indicando assim que a
positividade destes segmentos não esta relacionada a maior predição dos
mesmo. Então, desta forma, estas duas regiões apresentam-se como
importantes na interação com o mAb 2C4F10.
Uma análise combinatória da Figura 11 com a Tabela 7 e com as
seqüências dos 175 peptídeos preditos e testados mostram que toda vez que o
segmento 16 (71T-K72) e o segmento 17 (74K-G75) estão presentes em um
mesmo peptídeo, ele é reativo. Da mesma forma, toda a vez que um peptídeo
contém os segmentos 4 (20Q-E21)
e 5
(23-R-R24) juntos em um mesmo
peptídeo, eles também são positivos. A única exceção para a reatividade dos
segmentos 4 e 5 é quando o segmento 7 (30RDTAAEMNET39) está no mesmo
peptídeo, o que ocorreu quatro vezes. Nestes casos, os peptídeos não foram
reativos. Esta perda da reatividade é provavelmente atribuída ao tamanho do
segmento sete, que devido ao seu tamanho (10 aminoácidos) que de alguma
forma deve alterar o reconhecimento do mAb 2C4F10. Também pela presença
deste segmento 7 combinado com outros segmentos do motivo 1 que se atribui
um reatividade mais baixa deste motivo, já que há oito casos, no qual o
peptídeo pertencente ao motivo 1 e contendo também o segmento 7 não foi
reativo e nos três casos no qual o segmento 7 foi positivo, ele não estava
combinado com os segmentos do motivo 1 e sim com os segmentos do motivo
2.
Baseado nestas informações e com o objetivo de reconhecer os
resíduos considerados essenciais nas interações com mAb2C4F10, foram
selecionados aleatoriamente três peptídeos reativos do motivo 1 e cinco do
motivo 2 para serem testado pela técnica de ALA-Scan descrita por Alvarenga,
et.al, 2002. Nesta técnica, um conjunto de peptídeos análogos ao original é
sintetizado numa membrana de celulose, substituindo em cada peptídeo um
aminoácido por ALA. Quando na seqüência já existe ALA, este é substituído
por uma GLY. Em seguida eles são testados por ensaio imunoquímico de
SPOT em relação à reatividade de cada aminoácido. Desta maneira, então,
Página | 69
pode ser avaliada com base na diminuição ou aumento da capacidade de
ligação do anticorpo ao antígeno em relação às seqüências do peptídeo
modificado e do peptídeo original. [171].
Na Figura 13 pode ser visto o resultado do ALA-Scan destes oito
peptídeos selecionados. A reatividade de cada aminoácido em cada peptídeo
esta apresentada em escala de cinza: quanto mais escuro o cinza, mais forte é
a reação. Observou-se
segmento
que a troca das duas argininas (R23 e R24) do
23
R-R24 por alaninas no Motivo 1, fizeram com que os peptídeos
perdessem a reatividade com o mAb 2C4F10. Da mesma forma, a troca das
duas lisinas (K72 e K74) dos segmentos
71
T-K72 e o segmento
74
K-G75 por
alaninas no motivo 2, fizeram com que a reatividade com o mAb 2C4F10
diminuisse. Estes dados indicam que estes quatros resíduos são essenciais
para a ligação com mAb 2C4F10.
Posição no
spot
Seqüência
Controle
Seqüência
Peptídeos
4
C+
WE A A V NA QE A A RRA NL
Alascan
85
C+
R S P S P S T QWE V N Q E R R
Motivo 1
124
C+
WE V NQE R R
Peptídeos
16
C+
K QRGS T K K G
35
C+
R GS T K K G TMS
146
C+
E EKQTKKG
153
C+
K QA A RGS A A T K A A K G
155
C+
K QTKKGTM
Alascan
Motivo 2
Figura 13: Resultado do ALA-Scan de oito peptídeos reativos da GM-CSF
humana ao mAb 2C4F10. A força de reatividade está em escala de cinza
sobre cada aminoácido, sendo a reatividade mais escuro for o cinza
Vários trabalhos vêm estudando as interações e atividade do GM-CSF
com outras citocinas (por exemplo: interleucinas IL-2, IL-3 IL-4 e IL-5). [172]. As
atividades da proteína GM-CSF são exercidas quando a mesma encontra-se
ligada a seus receptores [173]. Estes receptores são heterodímeros
Página | 70
constituídos por uma subunidade alfa ligante-específica e uma subunidade
beta-c que é compartilhada com os receptores das interleucinas IL-3 e IL-5.
Estes receptores ligam em duas regiões da GM-CSF chamada de domínio 1 e
2 [174]. Rozwarski et.al, 1996, definiu a partir do cristal da GM-CSF e da
técnica de mutagênese que os resíduos E21, R23, R24, T71 K72 K74 e G75 são
parte de sítio de ligação ao receptor [175], ou seja, praticamente os mesmos
resíduos
que
encontramos
como
epítopos
descontínuos
nesta
tese,
principalmente os resíduos R23, R24, K72, K74 mostrados como essenciais na
interação com mAb 2C4F10. Isto nos leva a acreditar que este anticorpo se liga
na mesma região da GM-CSF que interage com seus receptores funcionando
como um inibidor destas interações.
Ogerro et.al, 2004, testou 5 anticorpos monoclonais contra uma proteína
recombinante de GM-CSF humana e viu que os resíduos A1, P2, A3, R4, W 13,
E14, N17, A18,
E21, R23, R24, P118, F119 formam uma região de epítopo
descontínuo para estes anticorpos. [176]. Estes resíduos são praticamente os
mesmos encontrados para o motivo 1 e a presença das duas argininas mais
uma vez é prova de suas importâncias neste motivo. Já Dey et. al, 2009,
recentemente afirmoram que os resíduos E14, V16, N17, Q20, R23, R24 do motivo
1, mais os resíduos K72 do motivo 2 interagiam com receptor da subunidade b
da IL-3 [177], mostrando que o anticorpo mAb2C4F10 pode funcionar como
inibidor da interações do GM-CSF com seus receptores e que os resíduos
encontrados nos dois motivos são epítopos descontínuos da GM-CSF.
Dois outros experimentos com o mAb 2C4F10 e os peptídeos
selecionados foram realizados mas não forão mostrados nesta tese, por
estarem em fase iniciais. Realizamos a Citrometria de Fluxo e ensaios de
competição entre os peptídeos e o GM-CSF. O objetivo destes experimentos
foi de comprovar a característica inibitória do anticorpo e local na proteína onde
ele se liga. Por tudo isso, acreditamos que o PEPOP foi capaz de predizer
peptídeos que mimetizam a região epitopica do GM-CSF. O anticorpo
mAb2C4F10 atuaria como inibidor das interações do GM-CSF com seus
receptores. Um artigo com estes resultados está sendo produzido.
Página | 71
5.3 - DNF
Os acidentes causados por aranhas do gênero Loxosceles, também
conhecidos como loxoscelismo, são responsáveis, não só pela maior incidência
de casos de araneísmo, como também pelos casos mais graves no Brasil.
Somente no ano de 2010 foram registrados 14.142 casos, sendo que quase a
metade destes foi diagnosticada como causados por acidentes com aranhas do
gênero Loxosceles.
As principais espécies causadoras do loxoscelismo no Brasil são L.
intermedia, L. gaucho e L. laeta, sendo a primeira responsável pela grande
maioria dos acidentes [178]. A Figura 14 mostra uma espécie de Loxosceles
intermédia, também conhecida como aranha marrom.
Tamanho: entre 6 a 12 mm
Figura 14: Fotografia da aranha marrom (Loxosceles intermedia)
Fonte: foto retirada do site http://www.thefullwiki.org/Loxosceles
Página | 72
As aranhas do gênero Loxosceles não são agressivas e a mordedura
normalmente é indolor. [179]. O quadro clínico do loxoscelismo se apresenta
sob duas formas, a cutânea e a viscero-cutânea. A forma cutânea é a menos
grave e após algumas horas da mordedura ela pode se tornar dolorosa, com
eritema e edema podendo evoluir para equimose, palidez e necrose. A viscerocutânea é a forma mais grave e é caracterizada por hemólise intravascular,
coagulação disseminada e insuficiência renal aguda, podendo, inclusive, levar
a óbito. [180].
Não existe um diagnóstico laboratorial eficaz e de baixo custo, assim
como não há um tratamento específico para estes acidentes, já que o soro antiaracnídeo não é muito eficiente em neutralizar as atividades dermonecrótica e
letal do veneno das espécies deste gênero, entre elas a Loxosceles intermedia.
[181]. No entanto, sabe-se que as principais toxinas, responsáveis pela
necrose, hemólise e letalidade nos acidentes envolvendo estas aranhas, são as
esfingomielinases-D (SMASE-D). Algumas esfingomielinases-D, já foram
descritas, entre elas a do veneno de Loxosceles intermedia, a LiD-1, também
conhecida fator dermonecrótico, ou DNF [182]. Há uma necessidade urgente
de desenvolver soros específicos contra L. intermedia que podem revelar-se
muito mais eficientes do que o anti-soro polivalente.
Anticorpos
policlonais
contra
a
DNF
neutralizam
a
atividade
dermonecrótica e os efeitos letais de todos os venenos do gênero Loxosceles,
indicando que esta proteína é um bom candidato na produção de um antiveneno específico para ser usado no tratamento de acidentes com estas
aranhas. No entanto, a imunização de animais para a produção do anti-veneno
com a DNF tem um problema, já que esta toxina é muito tóxica ao animal que
será imunizado [183]. Uma boa alternativa seria produzir um peptídeo a partir
da região epitopica da DNF. O peptídeo não apresentaria toxicidade, podendo
ser usado como imunógeno na produção do anti-veneno.
Página | 73
Para encontrar estes peptídeos, empregamos mais uma vez a
metodologia de busca por epítopos descontínuos pelo uso do programa de
bioinformática PEPOP. Para tal, utilizamos a estrutura da DNF modelada por
similaridade. Como estrutura molde, utilizamos a SMASE-D [184] do veneno de
Loxosceles Laeta (1XX1. PDB, resolução de 1,75) que possui 60 % de
identidade com a DNF. O modelo da DNF, visualizada na Figura 15, recebe a
classificação no CATH como sendo da classe das Tim Barril do domínio
Fosfatidilinositol fosfodiesterase (número do CATH: 3.20.20.190).
O PEPOP propôs a partir de 57 segmentos acessíveis na estrutura, 456
peptídeos que foram sintetizados em uma membrana de celulose e testados
pela técnica imunoquímica de SPOT para verificar a reatividade deles contra
um anticorpo monoclonal anti-DNF. A Tabela 8 mostra estes 57 segmentos e
sua posição na seqüência da DNF.
A Figura 15 mostra os testes SPOT dos peptídeos sintetizados. Apenas
um peptídeo (peptídeo chamado de 624) se mostrou reativos a este
monoclonal LimAb7 produzido no laboratório Sysdiag, UMR3145 - CNRS/BioRad de acordo com Alvarenga, et.al., 2003 [128], como mostra a Figura 15A.
Na Figura 15B, observamos que nenhum dos peptídeos foi reativo ao anticorpo
secundário (anticorpo camundongo-peroxidase). Na Figura 15C, os peptídeos
não foram reativos contra o anticorpo monoclonal anti-GM-CSF mAb 2C4F10.
Estes resultados apresentados nas Figuras 15B e 15C comprovam a
especificidade na ligação do peptídeo 624 com o LimAb7. Na Figura 15D,
observa-se o resultado do teste do anticorpo LimAb7 contra a membrana
contendo os peptídeos de GM-CSF. O resultado negativo da reatividade
reforça a especificidade do LimAb7.
Página | 74
Tabela 8: Segmentos acessíveis identificado pelo PEPOP e sua posição
no modelo da toxina DNF do veneno da aranha Loxoceles intermedia
Segmento de
referência
Comprimento do
segmento
Seqüência
Posição no arquivo
PDB
Segmento 1
4
AGNR
1 to 4
Segmento 2
2
IG
17 to 18
Segmento 3
2
DE
21 to 22
Segmento 4
3
NLG
25 to 27
Segmento 5
2
DD
38 to 39
Segmento 6
1
N
42 to 42
Segmento 7
2
EY
44 to 45
Segmento 8
2
YH
47 to 48
Segmento 9
8
IPCDCGRN
50 to 57
Segmento 10
5
KKYEN
59 to 63
Segmento 11
2
ND
65 to 66
Segmento 12
1
K
69 to 69
Segmento 13
1
R
72 to 72
Segmento 14
9
PGNSKYQEK
77 to 85
Segmento 15
1
K
94 to 94
Segmento 16
2
GS
96 to 97
Segmento 17
4
YDNQ
99 to 102
Segmento 18
2
ND
104 to 105
Segmento 19
2
KK
108 to 109
Segmento 20
2
KN
112 to 113
Segmento 21
2
QH
116 to 117
Segmento 22
5
NNGNN
120 to 124
Segmento 23
1
R
127 to 127
Segmento 24
2
PD
135 to 136
Segmento 25
1
N
138 to 138
Segmento 26
1
Y
140 to 140
Segmento 27
1
K
144 to 144
Segmento 28
2
KD
147 to 148
Segmento 29
4
TKDG
151 to 154
Segmento 30
2
PE
156 to 157
Segmento 31
3
MDK
159 to 161
Segmento 32
2
GN
168 to 169
Página | 75
624
Figura 15: Membranas de celulose contendo os 456 peptídeos propostos
pelo PEPOP para a toxina DNF do veneno da aranha Loxoceles
intermedia. Em 15A o resultado do teste da membrana contra o anticorpo
LimAb7.. Em 15B, o teste do conjugado. Em 15C a especidficidade dos
peptídeos ao LimAb7 foi testada contra o anticorpo monoclonal anti-GM-CSF
mAb 2C4F10. Em 15D, o resultado do teste do anticorpo LimAb7 contra a
membrana
A Figura 16 localiza o peptídeo 624 na estrutura 3D da DNF. Este
peptídeo foi predito pelo método 10AR+sa do PEPOP. Este método é
combinação de duas metodologias: 10AR‟ (Raio de 10Å) e „sa‟ (structural
alphabet = alfabeto estrutural) descrita por Alexandre de Brevern [185]. A 10AR
utiliza cada segmento selecionado por PEPOP e traça um raio imaginário de
10Å em torno dele, identificando todos os segmentos dentro deste raio. Em
seguida, o „sa‟ constrói um peptídeo baseado nestes segmentos. Para isto,
analisa a posição de cada um destes segmentos na estrutura 3D, adicionando
caso julgue necessário o(s) aminoácido(s) que melhor se encaixaria entre estes
segmentos de forma que o peptídeo final tenha a estrutura mais próxima da
estrutura na proteína. O peptídeo 624 positivo ao LimAb7 é composto pelo
segmento 34 (K177) mais o segmento 26 (Y140), mais segmento 25 (N138), mais
Página | 76
segmento 24 (135P-D136) e mais segmento 32 (168G-N169). Entretanto o
programa adicionou uma P entre os segmentos 24 e 32, para que todos os
seus segmentos do peptídeo 624 tenham a mesma configuração estrutural que
eles adotam na proteína DNF.
Figura 16: Visualização do peptídeo 624 (KYNPDPGN) na estrutura
3D da DNF. O segmento 34 (K177) está em vermelho, o segmento 26
(Y140) está em amarelo, o segmento 25 (N138) está em laranja, o
segmento 24 (135P-D136) esta em verde e o segmento 32 (168G-N169)
está em azul.
Estranhamente, os resíduos que compõem este peptídeo 624 na
estrutura 3D estão distantes do sítio catalítico da proteína. O sítio catalítico da
DNF é composto pelos aminoácidos H12, D91, D52, W 230, C233, e N252 [184]
destacado em rosa na Figura 15 e na literatura não existem nenhuma
informação quanto esta região reconhecida pelo anticorpo. Mesmo assim, a fim
de conhecer melhor a interação de cada resíduo do peptídeo com o anticorpo
Página | 77
LimAb7, utilizamos a técnica de ALA-SCAN para determinar os aminoácidos
importantes nesta inteação antígeno-anticorpo.
Entretanto, como mostra a
Figura 17, agora todos os peptídeos foram não reativos ao anticorpo LimAb7,
inclusive o peptídeo controle (peptídeo 624 re-sintetizado). Apesar de o mesmo
peptídeo na da primeira membrana (membrana da Figura 15) continuar
apresentando resultado positivo. A reatividade vista na primeira membrana
descarta um possível problema de desnaturação do anticorpo. Então
acreditamos que o problema esteja em uma das duas membranas, sendo
necessário re-sintetiza-las. Assim, ate o presente o momento, não se pode
afirmar se o peptídeo 456 é ou não um epítopo da LHF-II e sua sequencia e
realmente a apresentanda nesta tese, ou seja, nossos resultados para esta
toxina não são ainda conclusivos, sendo necessário refazermos alguns dos
experimentos aqui mostrados.
Figura 17: Resultado não reativo do Ala Scan do peptídeo K-Y-N-P-D-P-G-N
Página | 78
5.4- LHF-II
A serpente Lachesis muta muta, também conhecida popularmente como
surucucu (Figura 18), é o maior Crotalídeo brasileiro e uma das maiores cobras
peçonhentas do mundo, podendo medir até 4,5m de comprimento. [186]. A
surucucu possui um poderoso veneno com variadas atividades, como a
hemorrágica, proteolítica e coagulante. A manifestação de dano tecidual no
local da mordida, como a hemorragia, está entre os mais dramáticos e
pronunciados efeitos do envenenamento por L. muta muta [187]. Na literatura
há relatos de sangramento persistente nas marcas da mordida, sangramento
do intestino. [187], equimose local [188], epistase e hematúria [189].
Figura 18 – Fotografia da serpente Lachesis muta muta.
Fonte: http://rpg_ficcao.sites.uol.com.br/Bestiario/Jararaca.htm
As
toxinas
hemorrágicas
no
veneno
destes
crotalídeos
foram
caracterizadas como sendo metaloproteinases ligadas a um íon zinco em seus
sítios ativos [190]. O veneno da surucucu contém duas classes de
metaloproteinases (Classe P-I, que apresenta somente domínio proteinase e
classe P-III, apresentando um domínio proteinase, um domínio semelhante à
Página | 79
desintegrina e um domínio rico em cisteína) e elas são diferenciadas pelos
domínios que apresentam. Essas metaloproteinases são conhecidas como
mutalisina-I (classe P-III) [191] e mutalisina-II (classe P-I) [124].
A mutalisina-II, também chamada de mut-II ou LHF-II (Lachesis
hemorrhagic
factor),
é
uma
zinco-metaloproteinase
de
cadeia
única,
apresentando um mol de zinco e dois moles de cálcio por mol de proteína e
200 resíduos de aminoácidos, cuja extremidade N-terminal é bloqueada por um
resíduo de glutamina ciclizada. A LHF-II apresenta uma massa molecular de
22,5 kDa, ausência de glicosilações e ponto isoelétrico de 6.6. Baseado em seu
domínio estrutural, esta enzima está agrupada nas metaloproteinases de
classe P-I, membro da família das reprolisinas de metzincinas [187, 192-193]. A
LHF-II apresenta baixa atividade hemorrágica e alta atividade proteolítica sobre
vários
substratos,
o
que
está
de
acordo
com
relatos
das
outras
metaloproteinases de baixa massa molecular [187]. Testes in vivo e in vitro
demonstraram que uma quantidade significante de LHF-II é necessária para
induzir uma hemorragia evidente. [194].
Souza et.al 2001, viram que um anticorpo anti-LHF-II produzido em
coelhos imunizados com LHF-II foi capaz de neutralizar a sua atividade
proteolítica. Este mesmo anticorpo policlonal também foi capaz de neutralizar
50% da atividade proteolítica do veneno bruto de Lachesis muta muta,
Trimeresurus flavoviridis, Bothrops alternatus e B. atrox, se tornando um
terapêutico promissor no tratamento com acidentes destas serpentes. [195]. Já
Estevão-Costa,
et.al.
2000
produziram
um
anticorpo
monoclonal
em
camundongos imunizados com veneno total de L. muta muta. Este anticorpo
monoclonal, chamado de LmmAbB2D4, foi testado para avaliar a sua
reatividade cruzada e capacidade de neutralizar a atividade hemorrágica de
venenos de várias serpentes do gênero Bothrops. O LmmAbB2D4 não somente
apresentou uma forte reação cruzada com os venenos de Bothrops alternatus,
B. atrox, B. itapetiningae e L. muta. muta como também foi capaz de neutralizar
a atividade hemorrágica da LHF-II e destes venenos. Este LmmAbB2D4, no
entanto, não apresentou reatividade alguma com o veneno de Micrurus frontalis
Página | 80
ou Crotalus durissus terrificus que, sabidamente, não apresentam atividade
hemorrágica [127].
Entretanto, até o presente momento, o único tratamento específico
recomendado pela Organização Mundial de Saúde para o envenenamento por
serpentes é o uso do soro antiofídico [196]. Para isto, cavalos são imunizados
com veneno total da serpente utilizando adjuvante de Freund (completo e
incompleto) ou hidróxido de alumínio, em alguns casos. Os anticorpos do
cavalo são parcialmente digeridos com pepsina e os fragmentos F(ab´)2 são
purificados e usados como antivenenos. Este produto contém fragmentos
F(ab´)2 irrelevantes, que requerem o uso de grandes quantidades de
antivenenos para neutralizar os efeitos do veneno [197]. Portanto, seria
vantajoso obter antígenos que consistam principalmente de epítopos
específicos neutralizantes de modo a produzir soros mais específicos e mais
eficientes [198].
Castanheira, 2006, verificou que LmmAbB2D4 contra a LHF-II se ligou a
19 peptídeos selecionados pela técnica de phage display. Ela seqüenciou estes
peptídeos encontrando 17 seqüências de aminoácidos distintas, já que dois
destes 19 peptídeos continham a mesma seqüência de aminoácidos. A Tabela
9 apresenta essas 19 seqüências peptídicas sendo dezessete peptídeos de
doze aminoácidos. Os peptídeos 3 e 4 e os peptídeos 5 e 6 apresentam a
mesma seqüência peptídica [199]. Estes peptídeos podem ser chamados de
mimotopos da LHF-II. O termo mimotopo foi definido por Mario Geysen em
1985, como um peptídeo, grupos de aminoácidos o ou uma molécula que
reconhece o mesmo paratopo de um anticorpo [123].
Estes 17 peptídeos foram sintetizados numa membrana de celulose e
tiveram sua reatividade avaliada contra o anticorpo monoclonal LmmAbB2D4
pela metodologia imunoquímica de SPOT, como descrito no item 4.9.
O
resultado encontrado está apresentado na Figura 19. A reatividade foi medida
de acordo com a intensidade de cor pelo programa ImageJ e valores acima de
100.000 pixels considerados positivos. Este limite de 100.000 pixels foi
escolhido arbritariamente com intuito de selecionar os peptídeos mais reativos.
Página | 81
Os peptídeos 4, 7, 8, 14 e 15 tiveram valores acima deste leitura e foram
considerados reativos ao monoclonal LmmAbB2D4, eles estão destacados em
azul na Figura 19.
Tabela 9 Mimotopos da toxina LHF-II do veneno da serpente Lachesis
muta muta selecionados por Phage Display
Números
Seqüência de mimotopos
1
SCQLEGSRLRSP
2
QCKLEGSRLRCV
3
QCALEGARIRCS
4
QCALEGARIRCS
5
QCTMDQGRLRCR
6
QCTMDQGLRLCR
7
GCITEQGRSRCI
8
SCKLEGSRLRCP
9
TCATDQGRLRCT
10
HCFHDQGRVRCA
11
TCEMTQGRLRCV
12
ACRSDQGRARCT
13
NCTLEGTRFRCS
14
RCKPDQGRLRCG
15
SCMKDPSSPRCL
16
HCTMDQGRLRCR
17
SCMLDQGRSRCR
18
TCRQTLTPAVCH
19
QCQEDQGRRRCS
Página | 82
Intensidade dos SPOT’s
Posição
no SPOT
Q
K
A
T
I
K
A
F
E
R
T
K
M
T
M
R
Q
L
L
L
M
T
L
T
H
M
S
L
P
K
M
L
Q
E
E
E
E
D
E
E
D
D
T
D
E
D
D
D
D
T
D
G
G
G
Q
Q
G
Q
Q
Q
Q
G
Q
P
Q
Q
L
Q
S
S
A
G
G
S
G
G
G
G
T
G
S
G
G
T
G
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
P
R
L
L
I
L
S
L
L
V
L
A
F
L
P
L
S
A
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
V
R
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
P
V
S
R
I
P
T
A
V
T
S
G
L
R
R
H
S
42,128
61,152
88,158
134,543
30,945
67,817
111,640
108,902
83,957
68,957
97,268
57,628
38,091
**
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
*
S
Q
Q
Q
G
S
T
H
T
A
N
R
S
H
S
T
Q
Membrana
**
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
11
12
13
14
15
16
17
Seqüências
153,384
150,976
48,695
38,128
Figura 19: Membrana de SPOT dos 17 mimotopos da toxina LHF-II do
veneno da serpente Lachesis muta muta selecionado por Phage
Display. Em azul estão os peptídeos reativos ao monoclonal LmmAbB2D4.
As intensidades dos SPOT‟s foram calculada pelo programa ImageJ.
Figura 18: Membrana de SPOT dos mimotopos selecionado por
Phage Display. Em azul estão os peptídeos reativos ao monoclonal
Estes peptídeos não apresentam similaridades
LmmAbB2D4
com a seqüência
primária da LHF-II, entretanto eles se ligaram ao anticorpo monoclonal
LmmAbB2D4 mimetizando a região de epítopos da proteína. Desta forma,
utilizamos o programa de bioinformática MIMOP [139], para visualizarmos a
região na proteína que estes peptídeos estão mimetizando. MIMOP é um
programa que a partir da seqüência e estrutura 3D da proteína, analisa, por
duas metodologias diferentes, os mimotopos (em nosso caso, os peptídeos
selecionado por Phage Display), encontrando regiões de consensos entre eles.
Estes consensos são então examinados na estrutura 3D da proteína (LHF-II)
encontrando, assim, os resíduos na proteína que foram mimetizados pelos
mimotopos.
Assim, para as 17 seqüências de mimotopos, o programa MIMOP
encontrou 38 resíduos da LHF-II que possivelmente mimetizam a região de
Página | 83
epítopo da proteína. Estes resíduos podem ser vistos na Figura 20A. Da
mesma forma, utilizando somente os 5 mimotopos que foram reativos ao
LmmAbB2D4 pela técnica de SPOT, o programa selecionou 40 resíduos que
podem está mimetizando a região epitopica da LHF-II. Estes resíduos estão
destacados na Figura 20B. Combinando os dois resultados, temos então, 48
resíduos que podem estar mimetizando a região epitopica da LHF-II, estes
resíduos são destacados na Figura 20C. Duas regiões, destacadas dentro dos
retângulos na Figura 20.C tiveram alta taxa de resíduos selecionados pelo
MIMOP sendo indicadas como possíveis regiões mimetizadas pelos peptídeos.
20A
FSQKYIELVVVADHGMFTKYNGNLNTIRTRVHEIVNTLNGFYRSLNILISLTDLEI
WSNQDLINVQSAANDTLKTFGEWRERVLLNRISHDNAQLLTAIDLADNTIGIAYTG
GMCYPKNSVGIVQDHSPKTLLIAVTMAHELGHNLGMKHDENHCHCSASFCIMPPSI
SEGPSYEFSDCSKDYYQMFLTKRKPQCILNK
20B
SEGPSYEFSDCSKDYYQMFLTKRKPQCILNKP
20C
SEGPSYEFSDCSKDYYQMFLTKRKPQCILNKP
Figura 20: Possíveis resíduos da LHF-II que são mimetizados pelos
mimotopos do veneno da serpente Lachesis muta muta selecionados por
Phage Display. 20A estão destacados os 38 residuos indicados por MIMOP a
partir 17 das sequencias selecionadas. Em 20B estão os resíduos identificados
pelo MIMOP para 5 peptídeos reativos por SPOT. Em 20C estão em
destaques os resíduos da combinação nos dois casos. Dentro dos retângulos,
duas possíveis regiões de epítopos que podem ter sido mimetizadas.
Página | 84
Para visualizar estes resíduos na estrutura da LHF-II utilizou-se a técnica
de modelagem de proteínas por homologia. A proteína com a estrutura
resolvida que apresentou maior similaridade em bancos utilizando o programa
BLAST foi a Atrolisina C (69% de identidade), sendo então utilizada como
molde. A Atrolisina C também é uma metaloproteinase das famílias das
reprolisin-like do veneno da espécie Crotalus atrox [200]. Assim, a partir dos
dados de cristalografia de raios-X da Atrolisina C (1ATL.PDB, resolução: 1,80),
construiu-se o modelo molecular tridimensional da LHF-II utilizando os
programas SwissModel [129-131] para etapa de modelagem, ANOLEA [132] e
Verify 3D [130] para validação do modelo e SwissPDBViewer [76] para
visualizar o modeloA Figura 20 apresenta a estrutura 3D da LHF-II modelada.
Ela contêm 5 alfa-hélices e 6 folhas-beta e está classificada pelo CATH [134]
como pertencente à classe das Alfas-Betas no domínio catalítico 3-layer(aba)
sandwich. (numero do CATH: 3.40.390).
Na Figura 21, estão destacados todos os 48 resíduos selecionados pela
combinação dos dois resultados do MIMOP. Em azul, observa-se os resíduos
próximos da região N-terminal, destacados no retângulo azul da Figura 20C e
em verde observa-se resíduos próximos da C-terminal, destacados no
retângulo verde da Figura 20C. Os demais resíduos selecionados por MIMOP
estão destacados em azul-claro. Em 2006, Ferreira et.al. encontraram três
epítopos lineares para LHF-II, em ensaios utilizando anticorpos policlonais de
coelho. Um destes epítopos é formado pelos resíduos
10
V-V-A-D-H-G-M-F-T-K-
Y-N21 [158]. Os resíduos marcados em azul na Figura 21 e destacados no
retângulo da Figura 20C contêm oito (14H-G-M-F-T-K-Y-N21) dos doze resíduos
afirmados por Ferreira et.al., 2006 como epítopos. Desta forma, em uma
análise preliminar, poderíamos supor que os resíduos sintetizados por Phage
Display estariam mimetizando esta região da LHF-II.
Página | 85
Figura 21: Estrutura da LHF-II modelada a partir da Atrolisina C
(1ATL.pdb). Em azul escuro estão os resíduos próximos a região N-Terminal e
em verde os resíduos próximos da região C-Terminal, destacados nos
retângulos da Figura 20C. Em azul claro estão os demais resíduos
selecionados.
Na Figura 22 testamos a reatividade do anticorpo LmmAbB2D4 contra 63
peptídeos referentes a seqüências linear da LHF-II. Estes peptídeos foram
construídos com um tamanho de 15 aminoácidos cada, seguindo a seqüência
linear da proteína e sobrepondo de 3 em 3 aminoácidos em cada peptídeo até
que toda a proteína tenha sido percorrida. Como pode ser visto pela Figura 22,
o anticorpo LmmAbB2D4 não reconheceu nenhum peptídeo da seqüência
linear. Estes dados indicam que o epítopo para a interação deste anticorpo com
Página | 86
a LHF-II é descontínuo já que nenhuma região continua foi reconhecida na
membrana.
x
x x
Figura 22: Membrana Linear da LHF-II testada com o anticorpo
LmmAbB2D4
De posse dessas informações, utilizamos a técnica de Síntese Química
de Peptídeos descrita no item 4.10, para sintetizar o peptídeo indicado no
retângulo azul da Figura 20C predito por MIMOP. Os resíduos G15, Y20, G22, I27,
V31 que não foram selecionados pelo MIMOP mas estavam dentro da
seqüência, sendo então substituído por alaninas. Como sabemos que esta
região não é reconhecida linearmente pelo anticorpo LmmAbB2D4, ou seja o
epítopo é descontinuo. Assim, a presença destes resíduos nos peptídeos
devem interferir de forma perturbadora na reação com o LmmAbB2D4.
Portanto a substituição destes resíduos por alaninas seria uma alternativa para
tentar evitar estas perturbações. A alanina é um aminoácido não muito reativo
devido ao grupo metila na sua cadeia lateral, e também não tão flexivel quanto
a glicina, servindo como um ótimo espaçador para os resíduos preditos. Este
peptídeo foi chamado de peptídeo 8, como pode ser visto na Tabela 10.
Além deste peptídeo, outros sete peptídeos foram também sintetizados,
com intuito de testá-los, junto com o peptídeo 8, a capacidade de neutralizar o
veneno das serpente Lachesis muta muta. Os cinco primeiros peptídeos
(peptídeos de 1 a 5) da Tabela 10 são os peptídeos selecionados por Phage
Display e que foram positivos na membrana de SPOT estão destacados em
azul na Figura 19. Os peptídeos 6 e 7 são peptídeos preditos a partir do
programa STING Millennium. Para isto, de posse do modelo da LHF-II no
formato TGZ e utilizando o modulo do Java Protein Dossier do STING
Millennium, selecionou-se um grupo de parâmetros físico-químicos que
Página | 87
serviriam para identificar os resíduos pertencentes ao epítopos da LHF-II. Estes
parâmetros foram selecionados a partir de características que julgamos
importante e/ou que outros programas vêm utilizando. Desta forma os
parâmetros utilizados foram: acessibilidade, energia de contato não utilizada e
hidrofilicidade. [201] [202].
Tabela 10: Dados dos peptídeos da LHF-II do veneno da Lachesis muta
muta sintetizados pela técnica de Sínteses Química de Peptídeo
Número Massa
Peptídeo Seqüência do Peptídeo
Método Predito
de aa
(Da)
1
TCATDQGRLRCT
6
PKLAGPSFSA
10
974,12
PHAGE
Peptídeo
PHAGE
peptídeo
PHAGE
peptídeo
PHAGE
peptídeo
PHAGE
peptídeo
STING
2
HCFHDQGRVRCA
7
PYCQCLNKPYL
11
1341,61
STING
8
HAMFTKANANLNTARTRAH
19
2259,57
MIMOP
3
4
5
HCTMDQGRLRCR
QCTMDQGRLRCR
SCMLDQGRSRCR
12
12
12
12
12
1324,49
1428,61
1475,72
1466,71
1411,63
7
8
13
4
14
O parâmetro “acessibilidade” foi utilizado para selecionar os resíduos
que estão expostos na proteína, já que é uma característica dos epítopos,
estarem sempre expostos na proteína para que ocorra interação com o
anticorpo. Assim, o programa seleciona resíduos que apresentem um alto valor
de acessibilidade na proteína. O parâmetro “energia de contato não utilizado”
foi utilizado para selecionar apenas os resíduos que possuam alta energia de
contato livre, ou seja, aqueles resíduos que possuam um alto valor de energia
de contato e que esta não esteja sendo utilizada em contatos com outros
resíduos internos da proteína, induzindo assim a supor que esta energia esteja
sendo gasta com resíduos externos da proteína (entre outros, resíduos dos
Página | 88
anticorpos). O terceiro parâmetro utilizado foi o de “hidrofilicidade”. Este
parâmetro já vem sendo amplamente utilizados em algoritmos para prever
quais os resíduos de aminoácidos são antigênicas. [201]. Desta maneira,
selecionamos apenas resíduos com um valor de alta hidrofilicidade.
Dezesseis resíduos foram então selecionados pelo STING a partir da
combinação destes parâmetros, são eles: L24, L48, L62, D88, A102, C115, P117,
P129, A139, A159, P166, P172, M186, C195, L197, P200. Estes resíduos estão
visualizados na estrutura 3D da LHF-II com a coloração verde (Figuras 23A e
23B). Duas regiões apresentaram-se destacadas, como mostra os círculos das
Figuras 23A e 23B, como duas possíveis regiões de epítopos descontínuos.
Com intuito de confirmar se elas são realmente epítopos descontínuos,
propusemos sintetizar dois peptídeos relacionados a cada uma destas regiões
e testar sua imunogenicidade. Para projetar os dois peptídeos a serem
sintetizados, utilizamos a estrutura 3D da LHF, para analisar manualmente
cada uma destas regiões. A construção dos peptídeos se baseou em ligar os
resíduos em verde, selecionado pelo STING, utilizando dos resíduos adjacente
superficialmente, destacado em vermelho para a primeira região e amarelo
para a segunda. Para ligarmos, adicionamos os aminoácidos visíveis
espacialmente entre eles na estrutura 3D. Assim o peptídeo 6 da Tabela 10,
mostrado na Figura 23A foi formado pelos resíduos em verde, A139, A159, P129,
P172, propostos pelo STING, mais os resíduos em vermelho K 130, L132, G143,
S160, E161, S173, utilizados como resíduos-ligantes, obtendo assim o peptídeo
P129-K130-L132-A139-G143-P172-S173-F161-S160-A159 de 10 aminoácidos. Da mesma
forma o peptídeo 7 da Tabela 10, mostrado na Figura 23B, foi formado pelos
resíduos em verde L48, C115, P117, C195, L197, P200 selecionados pelo STING,
com o acréscimo dos resíduos em amarelos Y5, Y114, Q194, N198, K199, utilizados
como resíduos-ligantes, obtendo então o peptídeo de 11 aminoácidos P117Y114-C115-Q194-C195-L197-N198-K199-P200-Y5-L48.
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M186
Y5 P200
K199
A159
F161
S160
S173
P172
G143 A139
L132 K130
P129
P129
K130
L132
A139
G143
P172
S173
F161
S160
A159
L24
L62
I88
K130
L132 Y5
P172
S173
S160
A159
P200
K199 N198
C195
L48
L197
P117
C115
Y114
Q194
P117
Y114
C115
Q194
C195
L 197
N198
K199
P200
Y5
L48
M186
Figura 23: Visualização dos resíduos selecionados pelo STING Millennium
como epítopos da LHF-II, toxina do veneno de Lachesis muta muta. Em
verde estão os resíduos selecionados pelo STING. Dentro dos círculos estão as
duas regiões escolhidas como epitopicas. Em 23A, dentro do circulo vermelho
estão os resíduos selecionados para formar o peptídeo 6. Em vermelho os
resíduos utilizados como ligantes. Em 23B, dentro do circulo amarelo estão os
resíduos utilizados para formar o peptídeo 7, em amarelo, os resíduos utilizado
como ligante.
Estes oito peptídeos foram sintetizados, e tiveram sua massa confirmada
por espectrometria de massa (MALDI-TOF-TOF). Após verificação de sua
massa, utilizamos esses peptídeos para imunizações de 8 coelhos. As
imunizações dos coelhos desta vez foram feitas com auxílio de lipossomas,
como descrito no item 4.14. Os lipossomas são sistemas de transporte
compostos por substâncias relativamente biocompatíveis e biodegradáveis e
consistem de uma ou mais bicamadas lipídicas. Tais partículas são
consideradas uma excelente forma de sistema de liberação controlada de
substâncias biologicamente ativas ou medicamentos.
[203]. Assim, acoplar
peptídeos aos lipossomas é uma forma eficiente para liberar de maneira
gradativa estes peptídeos no organismo. Esta liberação gradativa seria
essencial para aumentar o tempo de vida do peptídeo o que proporcionaria ao
sistema imunológico mais tempo para a produção anticorpos contra estes
peptídeos [204]. Como controle desta imunização, um nono coelho foi
imunizado somente com o lipossoma, sem o acoplamento de algum peptídeo.
Página | 90
Tabela 14: Esquema de sangria e imunização dos coelhos com os
peptídeos sintetizados da LHF-II do veneno Lachesis muta muta
Dia
Dose
Imunização
0
----
----
1ª (pré-imune)
1
100 g de peptídeo
1ª
----
14
2ª
----
28
3ª
----
42
4ª
----
56
5ª
----
70
6ª
----
84
7ª
----
98
8ª
----
105
----
----
2ª
Sangria
Desta forma foram imunizados oito coelhos de acordo com o item 4.10
Cada coelho foi imunizado com um peptídeo acoplado ao lipossoma. Um
coelho recebeu apenas o lipossoma vazio como controle. Além disto, antes do
início do protocolo de imunizações, estes coelhos foram sangrados para se
obter o soro pré-imune. Ao total foram realizadas oito imunizações cada uma
contendo 100 g de peptídeos e em intervalos de 14 dias, como mostra a
Tabela 11. Sete dias após a última imunização os coelhos foram sangrados e
seus soros foram obtidos através de centrifugação a 3000 rpm .
Vimos até aqui que estes peptídeos são reativos ao anticorpo
monoclonal anti-veneno total de Lachesis muta muta (LmmAbB2D4) pela
técnica de SPOT e sabemos que o LmmAbB2D4 é neutralizante do efeito
hemorrágico do veneno de Lachesis muta muta [127]. Então, realizamos um
ensaio hemorrágico, como descrito no item 4.15, para verificar se estes
peptídeos seriam também capazes de produzir anticorpos que neutralizassem
o veneno de Lachesis.
Deste modo, 30 dias após a última imunização
injetamos nos coelhos, 20ug de veneno de Lacheis muta muta e após 24
Página | 91
horas sacrificamos os coelhos, retirando o dorso para analisarmos as lesões
hemorrágicas provocadas pelo veneno.
A Figura 24 mostra o lado visceral das peles removidas do dorso dos 9
coelhos. O coelho controle, que recebeu apenas o lipossoma sem peptídeos
em suas imunizações, foi o que apresentou uma lesão hemorrágica maior. Em
contrapartida, os coelhos imunizados com os peptídeos 1, 4, 5 e 7 não
apresentaram qualquer sinal de hemorragias, indicando, assim, que as
imunizações foram eficientes para a produção de anticorpos neutralizantes dos
efeitos hemorrágicos do veneno de L. muta muta. Os coelhos imunizados com
os peptídeos 2 e 6 apresentaram lesões menores em comparação com a lesão
do coelho controle, indicando que estes peptídeos protegeram parcialmente o
efeito hemorrágico do veneno. Os coelhos imunizados com os peptídeos 3 e 8
apesar de apresentaram lesões hemorragias menores que as do controle, os
tamanhos destas lesões eram bem maiores que
nos demais coelhos,
indicando que estes peptídeos não foram capazes de produzir anticorpos que
neutralize completamente o efeito hemorrágico deste veneno.
Pept 1
Pept 2
Pept 3
Pept 4
Pept 5
Pept 6
Pept 7
Pept 8 Controle
Figura 24: Ensaio Hemorrágico no dorso dos coelhos imunizados com os
oito peptídeos sintetizados da LHF-II do veneno Lachesis muta muta
Página | 92
Com a exceção do peptídeo 3, os outros cinco peptídeos selecionados
por phage display ( peptídeos 1, 2, 4 e 5) foram capazes de produzir anticorpos
neutralizantes do veneno. Estes resultados eram esperados, já que eles foram
selecionados a partir da sua reatividade com o anticorpo monoclonal
neutralizante LmmAbB2D4. Contudo o peptídeo 8, que foi selecionado pelo
MIMOP como sendo a possível região mimetizada por este cinco peptídeos
não se apresentou neutralizante do veneno. Deste modo, acreditamos que este
peptídeo não foi mimetizado pelos cinco peptídeos selecionados por phage
display. Assim, resta-nos testar o outro peptídeo indicado pelo MIMOP.
Os dois peptídeos desenhados a partir das análises in silico pelo STING
mostraram ser neutralizantes do veneno, sendo que o peptídeo 7 se mostrou
completamente neutralizante. Estes dados sugerem que os parâmetros
acessibilidade, energia de contato não utilizada e hidrofilicidade e a forma
como o peptídeo foi desenhado são suficientes para encontrar epítopos
descontínuos em uma proteína. Tais informações apresentam-se como
facilitadores para a escolha dos parâmetros ideais nas predições de epítopos
descontínuos, já que atualmente não existe um consenso na identificação dos
parâmetros
necessários
para
estas
predições.
Cada
programa
de
bioinformática utiliza de um grupo de parâmetros diferentes, variando entre
hidrofilicidade,
antigenicidade,
flexibilidade,
acessibilidade,
aminoácidos
considerados como especiais nas interações com o anticorpos, mobilidade
segmental. Assim, a escolha do parâmetro ideal faz com que a previsão destes
epítopos varie em sua precisão (hoje em dias os programas tem uma faixa de
acerto que varia entre 35-75%) [152].
A pouca capacidade de induzir a produção de anticorpos neutralizantes
do peptídeo 3 pode ser atribuída a um possível erro no acoplamento dele ao
lipossoma. Mas também não descartamos a possibilidade da presença da
Histidina na sua porção N-Terminal inibir indiretamente a produção destes
anticorpos. Este peptídeo 3 apresenta apenas uma Histidina no lugar de uma
Glutamina na porção N-terminal quando comparado com o peptídeo 4. Desta
forma, a característica básica desta Histidina pode ter influenciando de alguma
Página | 93
forma na interação do peptídeo com o Lipossoma e assim menos peptídeo
seria liberado durante as imunizaçõe, acarretando na produção de menos
anticorpos e na baixa capacidade neutralizante deles contra o veneno de
Lachesis. De qualquer forma, para uma conclusão melhor, será necessário
refazer este protocolo de ligação do peptídeo ao lipossoma, sendo que talvez
neste ponto, acrescentemos experimentos controles, para confirmar esta
ligação e para depois refazermos o teste de neutralização.
Estes resultados fazem parte do artigo: “Mimotopes selected a
neutralizing mAb against mutalysin-II from Lachesis muta snake venom induce
hemorrhage inhibitory antibodies in rabbits upon vaccination” sob a autoria de
R. A. Machado de Avila, S. Stransky, M. O. Velloso, P. Castanheira, F.S.
Schneider, C. Nguyen, F. Molina, E. Sanchez, C. Granier, C. Chávez-Olórtegui,
submetido à revista Peptides e disponível no anexo VI.
Adicionamente, com intuito de verificar se o programa PEPOP também
poderia ser capaz de predizer epítopos descontínuos para a LHF-II, realizamos
o mesmo estudo já mostrado para as proteínas AaH-II, DNF e GM-CSF. Desta
forma o PEPOP encontrou 40 segmentos como estando acessíveis na
superfície da LHF-II. Estes segmentos e sua posição na seqüência primária da
LHF-II estão mostrados na Tabela 12.
Estes segmentos foram então combinados pelo PEPOP resultando em
608 peptídeos que foram sintetizados em uma membrana de SPOT para terem
sua reatividade testada contra o anticorpo monoclonal LmmAbB2D4.
Vinte e dois peptídeos foram reativos ao LmmAbB2D4. Destes, 7
apresentaram forte reatividade e 15, reatividade mais fraca. Eles podem ser
visualizados juntos com os segmentos que os compõem na Figura 25 estando
em preto os sete peptídeos de forte reatividade. Já os segmentos dos quinze
peptídeos com a reatividade mais fraca estão marcados com a coloração cinza.
É nítido um conjunto de segmentos que se mostrou presente nos peptídeos
reativos, como pode ser visto dentro do retângulo vermelho da Figura 35, Este
conjunto é formado principalmente pelos segmentos 37 e 38.
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Tabela 12: Dados dos segmentos acessíveis identificado pelo PEPOP e
sua posição na LHF-II, toxina do veneno da serpente Lachesis muta muta
Segmento de
referência
Comprimento do
segmento (aa)
Seqüência
Posição na
seqüencia
segmento 1
segmento 2
segmento 3
segmento 4
segmento 5
segmento 6
segmento 7
segmento 8
segmento 9
segmento 10
segmento 11
segmento 12
segmento 13
segmento 14
segmento 15
segmento 16
segmento 17
segmento 18
segmento 19
segmento 20
segmento 21
segmento 22
segmento 23
segmento 24
segmento 25
segmento 26
segmento 27
segmento 28
segmento 29
segmento 30
segmento 31
segmento 32
segmento 33
segmento 34
segmento 35
segmento 36
segmento 37
segmento 38
segmento 39
segmento 40
3
1
1
10
3
2
2
1
2
1
1
4
1
5
4
2
2
1
3
5
3
5
1
2
5
1
4
2
3
4
1
5
2
1
2
3
2
5
2
4
QKY
E
H
FTKYNGNLNT
RTR
HE
NT
N
RS
N
L
SLTD
E
SNQDL
NVQS
ND
KT
E
ERV
LNRIS
AID
ADNTI
I
YT
CYPKN
H
PKTL
KH
ENH
HCSA
F
PSISE
PS
E
DC
KDY
QM
LTKRK
QC
LNKP
3-5
7
14
17-26
28-30
32-33
36-37
39
43-44
46
48
50-53
55
58-62
64-67
70-71
74-75
78
81-83
85-89
98-100
102-106
108
110-111
115-119
127
129-132
149-150
152-154
156-159
161
166-170
172-173
175
178-179
181-183
185-186
188-192
194-195
197-200
Página | 95
Segmentos
QKYLNKP
QMAALTKRK
SYPKNKT
LKRKTMQ
LTKRKAAQS
QMAALTKRKAAQS
K18
L5
I7
C6
D15
L6
QMTKRKL
LTKRKTQS
D22
L14
LTKRKQM
D21
QMLTKRKTQS
LTKRKQS
D18
L13
LTKRKMQ
D17
QMKRKTL
SQLTKRK
I2
L9
SDKDYMQLTKRK
QMLTKRK
L10
I1
KDYSQMSLTKRK
A18
QMLTKRKQS
HERTRPKTL
O23
L11
QMSLTKRK
L7
A17
KDYAAMQAALTKR
K
KDYAAQMAALTKR
K
A16
número
do spot
seqüência
peptídeos
1 QKY
2E
3H
4 FTKYNGNLNT
5 RTR
6 HE
7 NT
8N
9 RS
10 N
11 L
12 SLTD
13 E
14 SNQDL
15 NVQS
16 ND
17 KT
18 E
19 ERV
20 LNRIS
21 AID
22 ADNTI
23 I
24 YT
25 CYPKN
26 H
27 PKTL
28 KH
29 ENH
30 HCSA
31 F
32 PSISE
33 PS
34 E
35 DC
36 KDY
37 QM
38 LTKRK
39 QC
40 LNKP
Figura 25: Composição dos peptídeos toxina LHF-II do veneno da
serpente Lachesis muta muta reativos ao anticorpo monoclonal
LmmAbB2D4. Em preto estão marcados os segmentos relativos aos peptideo
de forte reatividade. Em cinza estão os segmentos de reatividade mais fraca.
O retângulo vermelho marca os dois segmentos que tiveram maior reatividade.
Uma análise mais detalhada destes segmentos que compõem os
peptídeos reativos pode ser visto na Figura 26. Observa-se que os segmentos
185
Q-M186 e majoritariamente o segmento 38,
37, composto pelos resíduos
compostos pelos resíduos
188
L-T-K-R-K192 estão presentes em praticamente
todos os peptídeos reativos. O segmento 38 só não se faz presente em três
dos peptídeos, como se pode ser visto na Figura 26.
Página | 96
22
20
18
Número de predições
16
14
12
10
8
6
4
2
QKY
E
H
FTKYNGNLNT
RTR
HE
NT
N
RS
N
L
SLTD
E
SNQDL
NVQS
ND
KT
E
ERV
LNRIS
AID
ADNTI
I
YT
CYPKN
H
PKTL
KH
ENH
HCSA
F
PSISE
PS
E
DC
KDY
QM
LTKRK
QC
LNKP
0
Segmentos
Figura 26: Freqüência de reatividade de cada segmento da toxina LHF-II
do veneno da serpente Lachesis muta muta predito pelo PEPOP
Estes dois segmentos estão localizados no final da alfa-hélice na região
C-Terminal da LHF-II como pode ser visto na Figura 27. Na cor verde estão o
segmento 38 (188L-T-K-R-K192) e na cor rosa o segmento 37 (185Q-M1860). Esta
região é a mesma proposta pelo MIMOP que não foi sintetizada e que
acreditamos ser a região onde os cinco peptídeos selecionados por phage
display foram mimetizados. Ainda analisando estes aminoácidos, vimos certas
similaridade com os resíduos dos peptídeos selecionados por phage display,
principalmente na característica básica de seus aminoácidos. Um exemplo é o
peptídeo 4 que contêm em sua seqüência os resíduo “Q”, “M” e “T” alem de
sua poção C-terminal ser composta pelos resíduos “R-L-R-C-R” bem parecidos
em termos de cargas com o segmento 38 (L-T-K-R-K).
Tanjoni et.al. 2003, relataram a ligação de um anticorpo monoclonal com
o domínio das disintegrin-like da toxina jararhagin, uma metaloproteinase de
classe-PIII e que neutralizou totalmente a atividade hemorrágica da toxina. Eles
supuseram que o mecanismo de neutralização deste efeito hemorrágico se
deve graças ao anticorpo monoclonal se ligar no domínio da disistegrin-like,
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localizado na porção C-terminal da toxina. A proximidade deste domínio com o
sítio catalítico da proteína provavelmente impediu estericamente a interação do
sítio com o substrato e desta forma neutralizando-o. [205] Então, o também
reconhecimento da porção C-terminal da LHF-II pelo LmmAbB2D4 nos leva a
supor um mecanismo de inibidor alostérico parecido ao da jararhagin, onde a
ligação do anticorpo na porção C-terminal da LHF-II provoca a uma blindagem
estérica do sítio catalítico da toxina, impedindo sua ligação com o substrato e
desta forma a inibindo a produção do efeito hemorrágico da toxina.
Figura 27: Visualização dos segmentos mais reativos para o
monoclonal LmmAbB2D4 a partir dos resultados obtidos pela predição
do PEPOP na estrutura da toxina LHF-II do veneno da serpente
Lachesis muta muta. Em rosa estão o resíduos do segmento 37 (185QM1860) e em verde os resíduos (188L-T-K-R-K192) do segmentos 38 que
apresentaram maior taxa de incidência nas composição dos peptídeos
reativos.
Página | 98
5.5- Caracterizações bioquímicas dos epítopos/mimotopos identificados
Analisando todos os peptídeos preditos e identificados como mimotopos
de AaH-II, GM-CSF, DNF e LHF-II observamos que o ponto isoelétrico de
praticamente todos é acima de 9,0, como mostra a Figura 28. Foram 76
peptídeos reativos, destes, apenas nove peptídeos possuem pI abaixo de 7,
representando 12 % dos peptídeos reativos, como pode ser visto em vermelho
na Figura 29. Destes nove peptídeos, oito são peptídeos da GM-CSF e sete
são de baixa reatividade com os anticorpos monoclonais. Estes oito peptídeos
ainda encontravam-se no primeiro domínio da GM-CSF, sendo posteriomente
verificado R23 e R24, os essenciais a ligação com mAB2C4F10. O nono
peptídeo de baixo pI é o único peptídeo identificado como reativo ao
monoclonal LimAb7
para a DNF. Entretanto como já mencionado estes
experimentos precisam ser refeitos e resta ainda a dúvida que este peptídeo é
ou não reativo.
Os outros 88 % corresponderam aos peptídeos com pI acima de 7,
sendo que 76 % possuiram um pI acima de 9, como mostra a Figura 29. O
caráter básico destes peptídeos mostra que esta é uma variável importante na
determinação dos epítopos. Esta basicidade é ocasionada principalmente pela
presença dos resíduos de lisinas, argininas e histidinas. Estes aminoácidos
possuem uma capacidade parra realizar ligações de hidrogênios e as
presenças das cargas positivas favorecem a ligação com regiões carregadas
negativamente nos anticorpos. Além disto, vimos que a presença da Arg 23 e
Arg 24 ou da Lys 72 ou Lys 74 nos peptídeos da GM-CSF são essenciais nas
ligações com anticorpo anti-GM-CSF. Da mesma forma, vimos que os
peptídeos reativos ao monoclonal anti-Lachesis muta muta, eram ricos em
lisinas e argininas.
Página | 99
AaH-II PEPOP
Fraco forte
reatividade
GM-CSF PEPOP
Forte reatividade
GM-CSF PEPOP
Fraca reatividade
LHF-II
PHAGE
LHF-II LHF-II PEPOP
Forte
STING
reatividade
LHF-II PEPOP
Fraca reatividade
QMTKRKL
QMLTKRKTQS
QMKRKTL
QMAALTKRKAAQS
LTKRKAAQS
LKRKTMQ
SYPKNKT
QMAALTKRK
QKYLNKP
LTKRKTQS
LTKRKQM
LTKRKQS
LTKRKMQ
SQLTKRK
SDKDYMQLTKRK
QMLTKRKQS
QMLTKRK
KDYSQMSLTKRK
HERTRPKTL
QMSLTKRK
KDYAAQMAALTKRK
KDYAAMQAALTKRK
PYCQCLNKPYL
PKLAGPSFSA
SCMLDQGRSRCR
QCTMDQGRLRCR
HCTMDQGRLRCR
HCFHDQGRVRCA
TCATDQGRLRCT
KYNPDPGN
SAKQHAAPP
TMASAKQH
KGATMAS
RDTAAEMNETPRGSTK
RDTAAEMNETAAARGSAATK
RDTAAEMNETRGSTK
QEAARRANL
WEAAVNAQEAARR
WEVNQERR
TKAAKGAAAKQAAEAAQTAAT
KGTMSKQHPP
TKAAKGATMASAKQH
TKKGTMSKQH
RGSAATKAAKGATMAS
WEVNQERRNL
RSPSPSTQAAWE
KQAAATKAAKGATM
KQTKKGTM
KQQGRGSTKKG
KQAARGSAATKAAKG
KQRGSTKKG
EPQEKQTKKG
EAAAEAAKQAAATKAAKG
EEKQTKKG
TGQQTEKQTKKG
TAAQTAEAAKQAAATKAAKG
TQTEKQTKKG
KQQGRGSTKKGTM
KQAARGSAATKAAKGATM
KQRGSTKKGTM
EKQQGRGSTKKG
EAAKQAARGSAATKAAKG
EKQRGSTKKG
TKKGKQEQTQFT
TKKGKQEQTT
RSPSPSTQAAWEAAVNAQEAARR
RSPSPSTQWEVNQERR
RGSTKKGTMS
EPQEKQQGRGSTKKG
EAAAEAAKQAARGSAATKAAKG
EEKQRGSTKKG
WEAAVNAQEAARRANL
PGRSHPYGNQWA
PGRSHAAAPYGNAAQWA
YAAQWAAAPYGNAAGRNAY
QWAAAPYGNAAGRNAY
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
pI
Figura 28:
28:PIo
Ponto
dos 76
Isoelétrico
peptídeos dos
reativos
76 aos
peptídeos
Acm utilizados
reativos nesta
aos
tese para as
Anticorpos
monoclonais
proteínas AaH-II,
utilizados
GM-CSF,
nesta tese
DNF para
e LHF-II.
as proteínas
As diferentes
AaHcores
indicamDNF
ondee aLHF-II.
forma As
e adiferentes
reatividade
de como
estes
peptídeos
II,
GM-CSF,
cores
indicam
a proteína
e
foram encontradas.
reatividade
destes peptídeos.
Página | 100
12%
14%
46%
pI
0-7
7-9
9-10
11-14
28%
Figura 29: Distribuição do percentual dos 76 peptídeos reativos das
proteínas AaH-II, GM-CSF, DNF e LHF-II frente aos anticorpos
monoclnais utilizados nesta tese em função dos pI.
Com todas estas informações, dois scripts foram propostos para serem
incrementados no programa PEPOP, o primeiro tem a função de calcular o pI
dos peptídeos reativos ao anticorpo. O segundo script tem a função de fornecer
duas Tabelas a primeira contendo a seqüência dos peptídeos preditos, a
referencia dele, o tamanho, os segmentos utilizados para sua formação e os
métodos que o propuseram, já a segunda Tabela fornece a freqüência de
predição de cada segmento.
Estes scripts foram escritos em linguagem PHP (acrônimo recursivo para
Personal Hypertext PreProcessor). A lingaguem PHP foi desenvolvida para
produzir paginas dinâmicas na web. Para este efeito o código PHP é embutido
no HTML e interpretado por um servidor web que gerará a página da Web do
documento PHP [206].
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<!DOCTYPE HTML PUBLIC '-//W3C//DTD HTML 4.01 Transitional//EN'
'http://www.w3.org/TR/html4/loose.dtd'>
<html>
<head>

30A
<title>Calcule du PI des peptides</title>
</head>
<body>
<FORM name="calculepI" method="post" action="calculerpI.php">
<B>Calcule du PI des peptides</B>
<PRE><PRE>
<TABLE BORDER=0>
<TR>
<TD> Nombre des peptides à calculer le pI <INPUT type=text
name="nombre"></TD>
</TR>
<TR>
<TD> Entrez les séquences séparées par ";" <TEXTAREA
rows="3" name="sequence"></TEXTAREA></TD>
</TR>
<TR>
<TD><INPUT type="submit" value="envoyer"></TD>
</TR>
</TABLE>
</FORM>
</body>
</html>
30B
Figura 30: Formulário HTML para cálculo do pI. Em 30A o script do
formulário em HTML. Em 30B a pagina HTML visualizada pelo usuário.
Para o cálculo do pI dos peptídeos reativos, fizemos um formulário em
HTML para entrada dos dados das seqüências que seriam calculadas. O script
para este formulário pode ser visualizado na Figura 30A. A Figura 30B mostra
a página resultante deste script. Como pode ser visto, o usuário digita as
seqüências separadas por ponto e vírgula (;), daí o script irá chamar pelo
arquivo “calculerpI.php” que calculará o ponto isoelétrico de cada seqüência
retornando o valor associado a sua seqüência numa página da web.
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O script do arquivo “calculerpI.php” está apresentado na Figura 32. No
script temos a presença dos comandos str_replace para eliminar possíveis
espaços dentro das seqüências digitadas pelos usuários e strtoupper para
formatar todas as seqüências em letras maiúsculas. Para encontrar o pI das
sequencias, primeiro o script computa a quantidade de cada aminoácido na
seqüência,
em seguida utiliza esses valores para calcular a carga dos
aminoácido variando o pH 0 a 14 numa taxa de pH de 0.001. Após esta etapa,
ele calcula a carga do peptídeo somando a carga individual dos aminoácidos
em cada pH. Depois, o script irá procurar o valor de carga do peptídeo mais
próximo de zero. O pH neste valor representa o pI do peptídeo, ou seja, o valor
do pH quando a carga liquida do peptídeo é zero. Ao final este resultado é
retornado ao usuário de forma associada a seqüência digitada.
Para cálculo dos valores do ponto isoelétrico utilizou a equação de
Henderson-Hasselbach [207]. Esta equação assume que o ponto isoelétrico
depende da carga de sete aminoácidos (glutamato, aspartato, cisteína, tirosina,
lisina, histidina e arginina) e da carga dos grupos terminais (NH2 e COOH).
[208]. Além disso, a carga líquida do peptídeo está em estreita relação com o
pH. Assim, a partir do pka destes aminoácidos e dos grupos terminais utilizou a
equação de Henderson-Hasselbach, mostrada na Figura 31, para encontrar a
carga líquida dos aminoácidos e grupos terminais, onde o Kp (Figura 31A) é a
constante
de
dissociação
ácida
(Ka)
das
macromoléculas
carregado
positivamente, Kn (figur 31B) é a constante de dissociação ácida (Ka) das
macromoléculas carregado negativamente.
31A
31B
Figura 31: Equação do Calculo da carga liquida. Em 31A, a fórmula para as
macromoléculas positivamente carregadas. Em 31B, a fórmula para as
macromoléculas negativamente carregadas.
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<html>
<head>

<title>Résultat PEPOP - Calcul pI</title>
</head>
<body>
<?php
//ATTENTION: Pour le calcul du pI j'ai utilisé les constants du Lehninger
$sequence = $_POST["sequence"];
//mise en forme
$sequence = str_replace(" ","",$sequence);//Elimine les espace des séquences
$sequpept = split (";", $sequence);
foreach ($sequpept as $seq)
{
$sequenceformat[] = strtoupper($seq);//Met en majuscule
}
foreach ($sequenceformat as $seq2)
{
$D = substr_count($seq2, "D");
//conter le quantité
$E = substr_count($seq2, "E");
$C = substr_count($seq2, "C");
$Y = substr_count($seq2, "Y");
de
de
de
de
D
E
C
Y
$H = substr_count($seq2, "H");
//conter le quantité de H
$K = substr_count($seq2, "K");
//conter le quantité de K
$R = substr_count($seq2, "R");
//conter le quantité de R
$NH2 = 1;
//Nterminal
$COOH = 1;
//Cterminal
//calcul de la charge des acides amines importantes
for ($i = 0; $i <= 14; $i+=0.001)
{
$pH = $i;
//pH entre 0 à 14
$charge_D = -$D/(1+pow(10,(3.86-$pH)));
//charge des D
$charge_E = -$E/(1+pow(10,(4.25-$pH)));
//charge des E
$charge_C =
$charge_Y =
$charge_H =
$charge_K =
$charge_R =
$charge_NH2
-$C/(1+pow(10,(8.33-$pH)));
-$Y/(1+pow(10,(10.0-$pH)));
$H/(1+pow(10,($pH-6.00)));
$K/(1+pow(10,($pH-10.5)));
$R/(1+pow(10,($pH-12.4)));
= $NH2/(1+pow(10,($pH-9.69)));
//charge
//charge
//charge
//charge
//charge
//charge
des
des
des
des
des
des
C
Y
H
K
R
NH2-
terminal
$charge_COOH= -$COOH/(1+pow(10,(2.34-$pH)));
//charge des C-
terminal
// Calcule charge du peptide
$charge_peptide = $charge_D + $charge_E + $charge_C + $charge_Y +
$charge_H + $charge_K + $charge_R + $charge_NH2 + $charge_COOH;
//passe les charges en valeur absolu
$charge_abs{$pH*1000} = abs($charge_peptide); // tableau = clé = phH
et valeur = charges du peptide dans ce pH
}
$charge_min = array_keys ($charge_abs, min($charge_abs));//Sélectionne la
clé(pH) correspondent la plus petite valeur de chargé absolue (prochaine de zéro)
foreach ($charge_min as $key => $pH_min)
{
$pI = $pH_min/1000; //pI est le valeur de pH quand la chargé du
peptide est zéro (ici, le valeur plus prochain de zéro).
}
//Résultat du calcul du pI
{
$enum = $enum+1; // Énumère les séquences donné pour l'utilisateur
echo("<B>Sequence $enum:</B> $seq2<B> ----- pI = </B>$pI<BR>");
}
}
echo ("<br><br><br><br><br><br><br><br><br><H3><center>Merci d'avoir utilisé notre
programme</center></H3></CENTER>");
?>
</body>
</html>
Figura 32: Script do arquivo calculerpI.php para calculo do pI das
seqüências digitadas no formulário HTML
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O momento mais crítico durante a determinação do ponto isoelétrico é o
uso de valores de pK adequado. Infelizmente, não há nenhum acordo neste
assunto. Cada fonte fornece pK‟s diferente. Algumas delas são apresentadas
na Tabela 13. Em nosso script utilizamos das constantes fornecidas pelo
Lehninger, o critério de escolha desta fonte foi devido a semelhança com os
dados do Solomon e por consideramos estas duas fontes
confiáveis e
bastantes utilizadas no mundo acadêmico .
Tabela 13: Valores de Ka de diversas fontes para as macromoléculas
consideradas importantes no calculo do pI.
Aminoácido NH2 COOH
C
D
E
H
K
R
Y
EMBOSS
8.6
3.6
8.5
3.9
4.1
6.5
10.8
12.5
10.1
DTASelect
8.0
3.1
8.5
4.4
4.4
6.5
10.0
12.0
10.0
Solomon
9.6
2.4
8.3
3.9
4.3
6.0
10.5
12.5
10.1
Sillero
8.2
3.2
9.0
4.0
4.5
6.4
10.4
12.0
10.0
Rodwell
8.0
3.1
8.33
3.68
4.25
6.0
11.5
11.5
10.07
Patrickios
11.2
4.2
-
4.2
4.2
-
11.2
11.2
-
Wikipedia
8.2
3.65
8.18
3.9
4.07
6.04
10.54 12.48 10.46
Lehninger
9.69
2.34
8.33
3.86
4.25
6.00
10.5
12.4
10.00
Fonte: fields.scripps.edu/DTASelect/20010710-pI-Algorithm.pdf
O segundo script produzido está mostrado na Figura 33. Este script abre
um arquivo txt fornecido pelo PEPOP e encontra as seqüências preditas. Em
seguida, a partir das seqüências ele encontra a composição em segmentos de
cada seqüência, a referencia, o tamanho e o método pelo qual ele foi predito.
Retornando estes valores em forma de uma Tabela HTML. Ainda, o script
calcula o número de vezes que cada segmento participa no designer do
peptídeo predito. Retornando também estes valores em forma de uma Tabela
HTML.
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<html>
<head>

<title>Résultat PEPOP - Analyses</title>
</head>
<body>
<?php
//Déclaration des variables
$ligne = "";
$tmp = array();
$tmp2 = array();
$tmp3 = array();
$tmp4 = array();
$seg = array();
$tab1 = array();
$tab2 = array();
$tab3 = array();
$tabsegm = array();
//tab1 = tableau des donnés du ficher
if ($fp= fopen("arq_1GMF.txt","r"))
{
while (!feof($fp))
{
$tmp = split(": ", fgets($fp, 4096)); // $tmp[0] = clé et
tmp[1] = autres values
$tab1{$tmp[0]} = $tmp[1];
}
}
//tableaux: clé = séquences, values = autres informations
foreach ($tab1 as $key => $val)
{
$tmp2 = split (", ", $val); // $tmp2[0] = séquences et tmp2[1] =
composition en segments
$tmp3 = split ("_", $key); // $tmp3[0] = méthode et tmp3[1] =
segment de référence
$tmp4 = split ("\+", $tmp2[1]); //tmp4 = segments
$tmp4 = preg_replace("/\n/", "", $tmp4);//$tmp4 = variable segments
formaté
$tab2{$tmp2[0]}[] = array($tmp3[0], $tmp3[1], implode(",", $tmp4),
strlen($tmp2[0]));
//clé = séquence, valeur = méthode, segment référence, composition
en segment, quantité d'acide amine de chaque séquence
$tabsegm{$tmp2[0]} = $tmp4; //clé = séquence e valeur = segments
}
//tableau3 = fréquence qui chaque segments a été prédits
foreach ($tabsegm as $key2 => $val2)
{
foreach ($val2 as $seg)
{
if(!isset($tab3{$seg}))
{
$tab3{$seg}=1; //initialise le tableau
}
else
{
$tab3{$seg}++; //incremente +1 la quantidade
fois qui le segmenta été predit
}
}
}
Continua na próxima página
Página | 106
Continuação do script
//Présentation du tableau2 dans un tableau HTML
echo "
<table witdh=50% border=2>
<Caption Align=Botton><H2><B>TABLEAU 1: Séquences prédits par
PEPOP</B></H2></Caption>
<TR><TH><b>SEQUENCE</b></TH>
<TH><b>METHODE</b></TH>
<TH><b>SEGMENT DE REFERENCE</b></TH>
<TH><b>COMPOSITION EN SEGMENTS</b></TH>
<TH><b>TAILLE DE LA SEQUENCE</b></TH>
</TR>";
foreach ($tab2 as $key3 => $val3)
{
$numligne = count($val3); //$numligne = quantité de fois qui
chaque sequence a été predite
echo "
<TR><TH Rowspan=$numligne> $key3</TH>"; //format la colonne
séquence: Fusionne les séquences pareils
foreach ($val3 as $val4)
{
echo "
<TD><CENTER>$val4[0]</CENTER></TD>
</TR>";
}
}
echo "</table></CENTER>";
//Tableau 2: Fréquence des segments prédits
echo
"
<BR><BR><BR>
<CENTER><table witdh=100% border=10>
<Caption Align=MIDDLE></<h5><B>TABLE 2: Fréquence de fois que chaque
segment a été prédit</</B></h5></Caption>
<TR><TH><b>SEGMENT</b></TH>
<TH><b>FREQUENCE</b></TH>
</TR>";
foreach ($tab3 as $key5 => $val5)
{
echo "
<TR><TD><CENTER>$key5</CENTER></TD>
<TD><CENTER>$val5</CENTER></TD>
</TR>";
}
echo "</table></CENTER>";
?>
Figura
33: Script para visualização das tabelas de seqüências de peptídeos
</body>
</html> pelo programa PEPOP e da freqüência predição de cada segmento
preditas
Página | 107
Página | 108
6- CONCLUSÕES
A predição de epítopos descontínuos pelo método de PEPOP mostrouse eficiente para todas as quatro proteínas estudadas (AaH-II, GM-CSF, DNF e
LHF-II).
Os parâmetros acessibilidade, energia de contato não utilizada e
hidrofilicidade foram suficiente para predizer epítopos da proteína LHF-II.
O STING Millennium mostrou ser uma ferramenta eficiente para
encontrar resíduos participantes das regiões de epítopos da proteína LHF-II.
MIMOP encontrou duas possíveis regiões que mimetizam as sequências
selecionadas por phage display. Uma delas aparenta não ser a região
mimetizada, faltando testar a outra região.
Os peptídeos da LHF-II selecionados por Phage Display mostraram ser
eficientes antígenos para produção de anticorpos neutralizantes da atividade
hemorrágica do veneno de Lachesis muta muta.
Os peptídeos da LHF-II selecionados pelo STING mostraram ser
eficientes antígenos para produção de anticorpos neutralizantes da atividade
hemorrágica do veneno de Lachesis muta muta.
O alto pI dos peptídeos reativos aparentam ser um fator importante na
interações com anticorpos
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Página | 110
7- PERSPECTIVAS

Refazer as análises da identificação dos epítopos descontínuos para a
DNF.

Substituir os anticorpos secundários que foram reativos para as
membranas da C2FVIII e GAD-65 e terminar os estudos sobre os seus
epítopos.

Aprofundar os estudos sobre a importância do alto valor nos pI dos
peptídeos reativos aos monoclonais.

Fazer as predições de epítopos para outras proteínas, aumentando
assim, o número de proteínas com epítopos descontínuos encontrados
e desta forma podendo fazer uma mineração mais apurada dos dados
encontrados. Já temos o projeto de encontrar os epítopos descontínuos
para as principais proteínas do escorpião Tityus serrulatus e para a
família das metaloproteinases dos venenos de serpentes.

Publicar os artigos sobre o trabalho da GM-CSF e AaH-II.
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Página | 112
8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.
Claverie, J.M. Gene number. What if there are only 30,000 human
genes? Science, 2001; 291(5507):1255-7.
2.
Lehninger, A.L., Nelson, D.L, Cox, M.M. Lehninger princípios de
bioquímica. Tradução Simões, A.A., Navega, W.R. Lodi. 3. ed., 2002.
3.
Teich, M., Needham, D. Documentary History of Biochemistry, 17701940. New York: Continuum International Publishing Group 1991; 275277.
4.
Ramos, C.H.I. Historia - Proteinas II. CBME Informação 2004; 3:3.
5.
Warolin, C. Pierre Jean Robiquet (1780-1840). Revue d'historie de la
pharmacie 1999; 47(321):97-110 .
6.
McCoy, R.H., Meyer, C.E., Rose, W.C. Feeding experiments wit[3h
mixtures of highly purified amino acides VIII: isolation and identification of
a new essential amino acid. Journal of Biological Chemistre 1935;
12(1):283-302.
7.
Wu, H. Studies on Denaturation of Proteins XIII. A Theory of
Denaturation. 1931. Advanced Protein Chemistry 1995; 46:6-26.
(Reprinted from the Chinese Journal of Physiology 1931; 5(4):321-344.
8.
Pauling, L., Corey, R.B. Atomic coordinates and structure factors for two
helical configurations of polypeptide chains. Proceedings of the National
Academy of Sciences – PNAS 1951; 37(5):235-240.
9.
Pauling, L., Corey, R.B. The pleated sheet, a new layer configuration of
polypeptide chains.Proceedings of the National Academy of Science –
PNAS 1951; 37(5):251-256.
10.
Perutz, M.F.
Biography In: Nobel Lectures, Chemistry 1942-1962,
Amsterdam: Elsevier publishing company, 1964.
11.
Kendrew, J.C.Biography In: Nobel Lectures, Chemistry 1942-1962,
Amsterdam: Elsevier publishing company, 1964.
12.
Anson, M.L., Mirsky, A.E. On some general properties of proteins.
Journal of General Physiology 1925; 9:169-179.
13.
Tanford, C. How protein chemists learned about the hydrophobic factor.
Protein Science 1997; 6:1358-1366.
Página | 113
14.
Mirsky, A.E., Pauling, L. On the structure of native, denatured and
coagulated proteins. Proceeding of National Academy of Sciences –
PNAS 1936; 22(7):439-447.
15.
Kauzmann, W. Some factors in the interpretation of protein denaturation.
Advances in Protein Chemistry, 1993; 14:1-63.
16.
Klotz, I. Solvent water and protein behavior. Protein Science, 1993;
2:1992-1999.
17.
Horowitz,
N.H.
One-gene-one-enzyme:
remembering
biochemical
genetics. Protein Science, 1995; 4:1017-1019.
18.
Moudrianakis, E.N. From protein coagulation and reversible denaturation
to the protein foldingproblem: Chris Anfisen defining the transition. The
FASEB Journal, 1996; 10:179-183.
19.
Dill, K.A. Polymer principles and protein folding. Protein Science, 1999;
8:1166-1180.
20.
Levinthal, C. How to fold graciously? Proceeding of Mössbauer
spectroscopy in biological systems meeting, Illinois: University of Illinois
Press, 1969; p. 22-24.
21.
Dobson, C.M. The nature and significance of protein folding. In: Pain ,
R.H. (Org.). Mechanisms of protein folding. 2 ed. New York: Oxford
University Press, 2000; p. 1-33.
22.
Honig, B. Protein folding: from the Levinthal paradox to structure
prediction. Journal of Molecular Biology, 1999; 293:283-293.
23.
Baldwin, R. L. Protein folding from 1961 to 1982. Nature Structural
Biology, 1999; 6(9):814-817.
24.
Baldwin, R.L. The problem was to find the problem. Protein Science,
1997; 6:2031-2034.
25.
Feng, H., Zhou, Z., Bai, Y. A protein folding pathway with multiple folding
intermediates at atomic resolution. Proceeding of the National Academy
of Sciences – PNAS, 2005; 102(14):5026-5031.
26.
Lesk, A.M., Chothia, C. How different amino acids sequences determine
similar protein structures: the structure and evolutionary dynamics of the
globins. Journal of Molecular Biology, 1980; 136:225-270.
Página | 114
27.
Leatherbarrow,
R.J.,
Fersht,
A.R.
Protein
engineering.
Protein
Engineering Design and Selection, 1986; 1:7-16.
28.
Kochendoerfer, G.G., Salon, D., Lear, J.D., Wilk-Orescan, R., Stephen,
B., Kent, H., DeGrado, W.F. Total chemical synthesis of the integral
membrane protein influenza a virus M2: role of its c-terminal domain in
tetramer assembly. Biochemistry, 1999; 38:11905-11913.
29.
Ribeiro, E.A, Ramos, C.H.I. Circular Permutation and Deletion Studies of
Myoglobin Indicate that the Correct Position of Its N-Terminus Is
Required for Native Stability and Solubility but Not for Native-like Heme
Binding and Folding. Biochemistry, 2005; 44:4699-4709.
30.
Creighton, T.E., Darby, N.J., Kemmink, J. The roles of partly folded
intermediates in protein folding. FASEB Journal, 1996; 10:110-118.
31.
Matouschek, A., Kellis, J.T., Serrano, L., Fersht, A.L. Mapping the
transition state and pathway of protein folding by protein engineering.
Nature, 1989; 340:122-126.
32.
Tsui, V., Garcia, C., Cavagnero, S., Stuzdak, G., Dyson, H.J., Wright,
P.E. Quenchflow experiments combined with mass spectometry show
apomyoglobin folds through an obligatory intermediate. Protein Science,
1998; 8:45-49.
33.
Brooks, B.R., Bruccoleri, R.E., Olafson, B.D., States, D.J., Swaminathan,
S., Karplus, M. CHARMM: a program for macromolecular energy
minimization and dynamics calculations. Journal of Computational
Chemistry, 1983; 4:187-217.
34.
Creighton, T.E. The protein folding problem. Science, 1988; 240:267344.
35.
Liang, J., Dill, K.A. Are proteins well-packed? Biophysical Journal, 2001;
81:751-766.
36.
Lisewsky, A.M., Lichtarge, O. Rapid detection of similarity in protein
structure and function through contact metric distances. Nucleic Acids
Research, 2006; 34:1-10.
Página | 115
37.
Kabsch, W., Sander, C. Dictionary of protein secondary structure: pattern
recognition hydrogenbonded and geometrical features. Biopolymers,
1983; 22:2577-2637.
38.
Holm, L., Sander, C. Protein structure comparison by alignment of
distance matrix. Journal of Molecular Biology, 1993; 233:123-138.
39.
Word, J.M., Lovell, S.C., Labean, T.H., Taylor, H.C., Zalis, M.E., Presley,
B.K., Richardson, J.S., Richardson, D.C. Visualizing and quantifying
molecular goodness-of-fit: smallprobe contact dots with explicity
hydrogen atoms. Journal of Molecular Biology, 1999; 285:1711-1733.
40.
Samudrala, R., Moult, J. An all-atom distance-dependent conditional
probability discriminatory function for protein structure prediction. Journal
of Molecular Biology, 1988; 275:895-916.
41.
Veloso, C., Silveira, C.H., Melo, R.C; Ribeiro, C., Lopes, C.E.R., Santoro,
M.M., Meira, JR,W. On the characterization of energy network of
proteins. Genetics and Molecular Research, 2007; 6(4);799-820.
42.
Bahar, I., Jernigan, R.L. Inter-residue potentials in globular protein and
the dominance of highly specific hydrophilic interaction at close
separation. Journal of Molecular Biology, 1997; 266:195-214.
43.
Richards, F.M. Protein stability: still an unsolved problem. Cell Molecular
Life Science - CMLS, 1997; 53:790-802.
44.
Ptitsyn, O.B., Ting, K.H. Non-functional conserved residues in globins
and their possible role as a folding nucleus. Journal of Molecular Biology,
1999; 291:671-682.
45.
Melo, R.C., Ribeiro, C., Murray, C.S., Veloso, C.J.M., Silveira, C.H.,
Neshich, G., Meira, JR.W., Carceroni, R.L., Santoro, M.M. Finding
protein-protein interactions patterns by contact-maps matching: BPTISerine protease complexes as a case study. Genetic and Molecular
Research, 2007; 6:946-963.
46.
Heifets, L. Centennial of Metchnikoff's discovery. J Reticuloendothel Soc.
1982; 31(5):381-91.
47.
Nobel Lectures Physiology or Medicine 1901-1921, Emil Von Behring, Biography", Elsevier Publishing Company, Amsterdam, 1967.
Página | 116
48.
A G N. The Late Baron Shibasaburo Kitasato. Canadian Medical
Association Journal, 1931; 25(2):206.
49.
Lindenmann, J. Origin of the Terms „Antibody‟ and „Antigen‟. Scand. J.
Immunol. 1984; 19(4):281–285
50.
Winau, F., Westphal, O., Winau, R. Paul Ehrlich--in search of the magic
bullet. Microbes Infect. 2004; 6(8):786–789.
51.
Van Epps, H.L. Michael Heidelberger and the demystification of
antibodies. J. Exp. Med. 2006; 203(1):5.
52.
Marrack, J.R. Chemistry of antigens and antibodies (2nd ed.). London:
His Majesty's Stationery Office. 1938
53.
Profiles in Science National Library of Medicine. The Linus Pauling
Papers: How Antibodies and Enzymes Work". Archived from the original
on 2010-11-17. http://www.webcitation.org/5uK0FQBmR.
54.
Silverstein, A.M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic
markers and magic bullets. Nat. Immunol. 2004; 5(12):1211-1217.
55.
Edelman, G.M., Gally, J.A. The nature of Bence-Jones proteins.
Chemical similarities to polypetide chains of myeloma globulins and
normal gamma-globulins". J. Exp. Med. 1962; 116(2):207-227.
56.
Raju, T.N. The Nobel chronicles. 1972: Gerald M Edelman (1929) and
Rodney R Porter (1917-85)". Lancet, 1999; 354(9183):1040.
57.
Watson, J.D., Crick, F.H. Genetical implications of the structure of
deoxyribonucleic acid. Nature, 1953; 171(4361):964-967.
58.
Kendrew, J.C. Perutz, M.F. X-ray studies of compounds of biological
interest. Annu. Rev. Biochem. 1957; 26:327-372.
59.
Bernstein, F.C., Koetzle, T.F; Williams, G.J., Meyer JR, E.F., Brice, M.D.,
Rodger, J.R., Kennard, O., Shimanouchi, T., Tasumi, M. The Protein
Data Bank: a computer-based archivalfile for macromolecular structures.
Journal of Molecular Biology, 1977; 112(3):535-542.
60.
Chou,
P.Y.,
Fasman,
G.D.
Prediction
of
protein
conformation.
Biochemistry, 1974; 13(2):222-245.
Página | 117
61.
Eisenberg, D., Weissm R.M., Terwilligerm T.C. The helical hydrophobic
moment: a measure of the amphiphilicity of a helix. Nature, 1982;
299(5881):371-374.
62.
Smith, T.F., Waterman, M.S., Fitch, W.N. Comparative biosequence
metrics. J. Mol. Evol. 1981; 18(1):38-46.
63.
Lipman, D.J., Wilburm W.J. Contextual constraints on synonymous
codon choice. J. Mol. Biol. 1983; 163(3):363-376.
64.
Taylor, W.R. A flexible method to align large numbers of biological
sequences. J.Mol.Evol. 1989; 28(1-2):161-169.
65.
Stoesser, G., Baker, W., Van den Broek, A., Camon, E., Garcia-Pastor,
M., Kanz, C., Kulikova, T., Leinonen, R., Lin, Q., Lombard, V., Lopez, R.,
Redaschi, N., Stoehr, P., Tuli, M.A., Tzouvara, K., Vaughan, R. The
EMBL Nucleotide Sequence Database. Nucleic Acids Research, 2002;
30: 21-26.
66.
Benson, D.A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D.J., Ostell, J., Wheeler, D.L.
GenBank. Nucleic Acids Research, 2003; 31:23-27.
67.
Wu, C.H., Nikolskaya, A., Huang, H., Yeh, L.S., Natale, D.A., Vinayaka,
C.R., Hu, Z.Z., Mazumder, R., Kumar, S., Kourtesis, P., Ledley, R.S.,
Suzek, B.E., Arminski, L., Chen, Y., Zhang, J., Cardenas, J.L., Chung,
S., Castro-Alvear, J., Dinkov, G., Barker, W.C. The protein information
resource. Nucleic Acids Research, 2003; 31:345–347.
68.
Boeckmann B, Bairoch A, Apweiler R, Blatter MC, Estreicher A,
Gasteiger E, Martin MJ, Michoud K, O'Donovan C, Phan I, Pilbout S,
Schneider M. The Swiss-Prot protein knowledgebase and its supplement
TrEMBL in 2003. Nucleic Acids Research, 2003; 31(1):365-370.
69.
Apweiler, R., Bairoch, A., Wu, C.H., Barker, W.C., Boeckmann, B., Ferro,
S., Gasteiger, E., Huang, H., Lopez, R., Magrane, M., Martin, M.J.,
Natale, D.A., O'Donovan, C., Redaschi, N., Yeh, L.S.. UniProt: the
Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 2004; 32:D115119.
70.
Berman, H.M., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide
Protein Data Bank. Nature Structural Biology, 2003; 10(12):980
Página | 118
71.
Connolly, M.L. Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids.
Science, 1983; 221(4612):709-713.
72.
Levitt, M. Protein folding by restrained energy minimization and
molecular dynamics. J. Mol. Biol. 1983; 170(3):723-764.
73.
Gertz,
E.
M.,
BLAST
Scoring
Parameters,
16
March
2005.
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/documents/developer/scoring.pdf.
74.
Richardson, D.C., Richardson, J.S. The kinemage: a tool for scientific
communication. Protein Sci. 1992; 1(1):3-9.
75.
Sayle, R., Bissell, A. RasMol: A Program for Fast Realistic Rendering of
Molecular Structures with Shadows, in Proceedings of the 10th
Eurographics UK '92 Conference , University of Edinburgh, Scotland,
1992.
76.
Guex, N., Peitsch, M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An
environment
for
comparative
protein
modeling. Electrophoresis,
1997; 18:2714-2723.
77.
PDB Statistics. Archived from the original PDB site on 2011-02-01.
http://www.rcsb.org/pdb/static.do?p=general_information/pdb_statistics/in
dex.htm.
78.
Fleischmann, R.D., Adams, M.D., White, O., Clayton, R.A., Kirkness,
E.F., Kerlavage, A.R., Bult, C.J., Tomb, J.F., Dougherty, B.A., Merrick,
J.M., McKenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fields, C., Gocayne, J.D.,
Scott, J., Shirley, R. Liu, L.I., Glodek, A., Kelley, J.M., Weidman, J.F.,
Phillips, C.H. Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M.D., Utterback, T.R.,
Hanna, M.C. Nguyen, D.T., Saudek, D.M., Brandon, R.C. Fine, L. D.,
Fritchman, J.L., Fuhrmann, J.L., Geoghagen, N.S.M., Gnehm, C.L.,
McDonald, L.A., Small, K.V., Fraser, C.M., Smith, H.O., Venter, J.C.
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus
influenzae Rd. Science. 1995; 269(5223):496-512.
79.
Goffeau, A., Barrell, B.G., Bussey, H., Davis, R.W., Dujon, B., Feldmann,
H., Galibert, F., Hoheisel, J.D., Jacq, C., Johnston, M., Louis, E.J.,
Mewes, H.W., Murakami, Y., Philippsen, P., Tettelin, H., Oliver, S.G. Life
with 6000 genes. Science, 1996; 274:563-567.
Página | 119
80.
Blattner, F.R., Plunkett, G. 3rd., Bloch, C.A., Perna, N.T., Burland, V.,
Riley, M., Collado-Vides, J., Glasner, J.D., Rode, C.K., Mayhew, G.F.,
Gregor, J., Davis, N.W., Kirkpatrick, H.A., Goeden, M.A., Rose, D.J.,
Mau, B., Shao, Y. The complete genome sequence of Escherichia coli K12. Science, 1997; 277:1453- 1474.
81.
C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode
C. elegans: a platform for investigating biology, Science, 1998; 282:20122018.
82.
Adams, M.D., Celniker, S.E., Holt, R.A., Evans, C.A., Gocayne, J.D.,
Amanatides, P.G., Scherer, S.E., Li, P.W., Hoskins, R.A., Galle, R.F.,
George, R.A., Lewis, S.E., Richards,S., Ashburner, M.,Henderson, S.N.,
Sutton, G.G., Wortman, J.R., Yandell, M.D. Zhang, Q., Chen, L.X.,
Brandon, R.C., Rogers, Y.H.C., Blazej, R.G., Champe, M.,Pfeiffer, B.D.,
Wan, K.H., Doyle, C., Baxter, E.G., Helt, G., Nelson, C.R., Miklos,G.L.G.,
Abril, J.F., Agbayani, A., An, H.J., Andrews- Pfannkoch, C., Baldwin,
D.,Ballew, R.M., Basu, A., Baxendale, J., Bayraktaroglu, L., Beasley,
E.M., Beeson, K.Y., Benos, P.V., Berman, B.P., Bhandari, D., Bolshakov,
S., Borkova, D., Botchan,M.R., Bouck, J., Brokstein, P., Brottier, P.,
Burtis, K.C., Busam, D.A., Butler, H.,Cadieu, E., Center, A., Chandra, I.,
Cherry, J.M., Cawley, S., Dahlke, C., Davenport,L.B., Davies, A., De
Pablos, B., Delcher, A., Deng, Z.M., Mays, A.D., Dew, I., Dietz, S.M.
Dodson, K., Doup, L.E., Downes, M., Dugan-Rocha, S., Dunkov, B.C.,
Dunn, P., Durbin,K.J., Evangelista, C.C., Ferraz, C., Ferriera, S.,
Fleischmann, W., Fosler, C., Gabrielian, A.E., Garg, N.S., Gelbart, W.M.,
Glasser, K., Glodek, A., Gong, F.C., Gorrell, J.H., Gu, Z.P., Guan, P.,
Harris, M., Harris, N.L., Harvey, D., Heiman, T.J., Hernandez, J.R.,
Houck, J., Hostin, D., Houston, D.A., Howland, T.J., Wei, M.H., Ibegwam,
C., Jalali, M., Kalush, F., Karpen, G.H., Ke, Z.X., Kennison, J.A.,
Ketchum, K.A., Kimmel, B.E., Kodira, C.D., Kraft, C., Kravitz, S., Kulp, D.,
Lai, Z.W., Lasko, P., Lei, Y.D., Levitsky, A.A., Li, J.Y., Li, Z.Y., Liang, Y.,
Lin, X.Y., Liu, X.J., Mattei, B., Mcintosh, T.C., Mcleod, M.P., Mcpherson,
D., Merkulov, G., Milshina, N.V., Mobarry, C., Morris, J., Moshrefi, A.,
Página | 120
Mount, S.M., Moy, M., Murphy, B., Murphy, L.,Muzny, D.M., Nelson, D.L.,
Nelson, D.R., Nelson, K.A., Nixon, K., Nusskern, D.R., Pacleb, J.M.,
Palazzolo, M., Pittman, G.S., Pan, S.,Pollard, J., Puri, V., Reese, M.G.,
Reinert, K., Remington, K., Saunders, R.D.C., Scheeler, F., Shen,H.,
Shue, B.C., Sidenkiamos, I., Simpson, M., Skupski, M.P., Smith, T.,
Spier, E., Spradling, A.C., Stapleton, M., Strong, R., Sun, E., Svirskas,
R., Tector, C., Turner, R., Venter, E., Wang, A.H.H., Wang, X., Wang,
Z.Y., Wassarman, D.A., Weinstock, G.M., Weissenbach, J., Williams,
S.M., Woodage, T., Worley, K.C., Wu, D., Yang, S., Yao, Q.A., Ye, J.,
Yeh, R.F., Zaveri, J.S., Zhan, M., Zhang, G.G., Zhao, Q., Zheng, L.S.,
Zheng, X.Q.H., Zhong, F.N., Zhong, W.Y., Zhou, X.J., Zhu, S.P., Zhu,
X.H., Smith, H.O., Gibbs, R.A., Myers, E.W., Rubin, G.M., Venter, J.C.
The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science, 2000;
287:2185-2195.
83.
Arabidopsis Genome Initiative, Analysis of the genome sequence of the
flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 2000; 408:796-815.
84.
Venter, J.C., Adams, M.D., Myers, E.W., Li, P.W., Mural, R.J., Sutton,
G.G., Smith, H.O., Yandell, M., Evans, C.A., Holt, R.A., Gocayne, J.D.,
Amanatides, P., Ballew, R.M., Huson, D.H., Wortman, J.R., Zhang, Q.,
Kodira, C.D., Zheng, X.Q.H., Chen, L., Skupski, M., Subramanian, G.,
Thomas, P.D., Zhang, J.H., Miklos, G.L.G., Nelson, C., Broder, S., Clark,
A.G., Nadeau, C., Mckusick, V.A., Zinder, N., Levine, A.J., Roberts, R.J.,
Simon,M., Slayman, C., Hunkapiller, M., Bolanos, R., Delcher, A., Dew,
I., Fasulo, D., Flanigan, M., Florea, L., Halpern, A., Hannenhalli,
S.,Kravitz,S., Levy, S., Mobarry, C., Reinert, K., Remington, K., AbuThreideh, J., Beasley, E., Biddick, K.,Bonazzi, V., Brandon, R., Cargill,
M., Chandramouliswaran, I., Charlab, R., Chaturvedi, K., Deng, Z.M., Di
Francesco, V., Dunn, P., Eilbeck, K., Evangelista, C., Gabrielian, A.E.,
Gan, W., Ge, W.M., Gong, F.C., Gu, Z.P., Guan, P., Heiman, T.J.,
Higgins, M.E., Ji, R.R., Ke, Z.X., Ketchum, K.A., Lai, Z.W., Lei, Y.D., Li,
Z.Y., Li, J.Y., Liang, Y., Lin, X.Y., Lu, F., Merkulov, G.V., Milshina, N.,
Moore, H.M., Naik, A.K., Narayan, V.A., Neelam, B., Nusskern, D.,
Página | 121
Rusch, D.B., Salzberg, S., Shao, W., Shue, B.X., Sun, J.T., Wang, Z.Y.,
Wang, A.H., Wang, X., Wang, J., Wei, M.H., Wides, R., Xiao, C.L., Yan,
C.H., Yao, A., Ye, J., Zhan, M., Zhang, W.Q., Zhang, H.Y., Zhao, Q.,
Zheng, L.S., Zhong, F., Zhong, W.Y., Zhu, S.P.C., Zhao, S.Y., Gilbert, D.,
Baumhueter, S., Spier, G., Carter, C., Cravchik, A., Woodage, T., Ali, F.,
An, H.J., Awe, A., Baldwin, D., Baden, H., Barnstead, M., Barrow, I.,
Beeyson, K., Busam, D., Carver, A., Center, A., Cheng, M.L., Curry, L.,
Danaher, S., Davenport, L., Desilets, R., Dietz, S., Dodson, K., Doup, L.,
Ferriera, S., Garg, N., Gluecksmann, A., Hart, B., Haynes, J., Haynes,
C., Heiner, C., Hladun, S., Hostin, D., Houck, J., Howland, T., Ibegwam,
C., Johnson, J., Kalush, F., Kline, L., Koduru, S., Love, A., Mann, F.,
May, D., Mccawley, S., Mcintosh, T., Mcmullen, I., Moy, M., Moy, L.,
Murphy, B., Nelson, K., Pfannkoch, C., Pratts, E., Puri, V., Qureshi, H.,
Reardon, M., Rodriguez, R., Rogers, Y.H., Romblad, D., Ruhfel, B.,
Scott, R., Sitter, C., Smallwood, M., Stewart, E., Strong, R., Suh, E.,
Thomas, R., Tint, N.N., Tse, S., Vech, C., Wang, G., Wetter, J., Williams,
S., Williams, M., Windsor, S., Winn-Deen, E., Wolfe, K., Zaveri, J.,
Zaveri, K., Abril, J.F., Guigo, R., Campbell, M.J., Sjolander, K.V., Karlak,
B., Kejariwal, A., Mi, H.Y., Lazareva, B., Hatton, T., Narechania, A.,
Diemer, K., Muruganujan, A., Guo, N., Sato, S., Bafna, V., Istrail, S.,
Lippert, R., Schwartz, R., Walenz, B., Yooseph, S., Allen, D., Basu, A.,
Baxendale, J., Blick, L., Caminha, M., Carnes-Stine, J., Caulk, P.,
Chiang, Y.H., Coyne, M., Dahlke, C., Mays, A.D., Dombroski, M.,
Donnelly, M., Ely, D., Esparham, S., Fosler, C., Gire, H., Glanowski, S.,
Glasser, K., Glodek, A., Gorokhov, M., Graham, K., Gropman, B., Harris,
M., Heil, J., Henderson, S., Hoover, J., Jennings, D., Jordan, C., Jordan,
J., Kasha, J., Kagan, L., Kraft, C., Levitsky, A., Lewis, M., Liu, X.J.,
Lopez, J., Ma, D., Majoros, W., Mcdaniel, J., Murphy, S., Newman, M.,
Nguyen, T., Nguyen, N., Nodell, M. The sequence of human genome.
Science, 2001; 291: 1304-1351.
85.
Peng, J., Gygi, S.P. Proteomics: the move to mixtures. J. Mass
Spectrom, 2001; 36(10):1083-1091.
Página | 122
86.
Liang, S.P., Chen, X.D. , Shu, Q., Zhang, Y., Peng, K. The presynaptic
activity of huwentoxin-I, a neurotoxin from the venom of the chinese bird
spider Selenocosmia huwena. Toxicon, 2000; 38(9):1237-1246.
87.
Dhingra, V., Gupta, M., Andacht, T., Fu, Z.F. New frontiers in proteomics
research: A perspective. International Journal of Pharmaceutics 2005;
299(1-2): 1-18.
88.
Simonelli, L., Beltramello, M., Yudina, Z., Macagno, A., Calzolai, L.,
Varani, L. Rapid structural characterization of human antibody-antigen
complexes through experimentally validated computational docking. J.
Mol. Biol. 2010; 396(5):1491-507.
89.
Worm, M., Lee, H.H., Kleine-Tebbe, J., Hafner, R.P., Laidler, P., Healey,
D., Buhot, C., Verhoef, A., Maillère, B., Kay, A.B., Larché, M.
Development
and
preliminary
clinical
evaluation
of
a
peptide
immunotherapy vaccine for cat allergy. J. Allergy. Clin. Immunol. 2011;
127(1):89-97, 97.e1-14.
90.
Wolf, E., Milazzo, S., Boehm, K., Zwahlen, M., Horneber, M. Thymic
peptides for treatment of cancer patients. Cochrane Database Syst. Rev.
2011; 16:2.
91.
Chilton, R., Wyatt, J., Nandish, S., Oliveros, R., Lujan, M. Cardiovascular
comorbidities of type 2 diabetes mellitus: defining the potential of
glucagonlike peptide-1-based therapies. Am. J. Med. 2011; 124(1
Suppl):S35-53.
92.
Cen, L., Liu, W., Cui, L., Zhang, W., Cao, Y. Collagen tissue engineering:
development of novel biomaterials and applications. Pediatr. Res, 2008;
13.
93.
Desai, N., Sajjad, J., Frishman, W.K.. Urotensin II: a new pharmacologic
target in the treatment of cardiovascular disease. Cardiol. Rev. 2008;
16(3):142-153.
94.
Romani, L., Zelante, T., De Luca, A., Fallarino, F., Puccetti, P. IL-17 and
therapeutic kynurenines in pathogenic inflammation to fungi. J. Immunol.
2008, 180(8):5157-5162.
Página | 123
95.
Mozes, E., Sela, U., Sharabi, A. A novel synthetic peptide for the specific
treatment of lupus: clinical effects and mechanism of action. Isr. Med.
Assoc. J. 2008; 10(1):40-42.
96.
Zeng, W., Horrocks, K.J., Robevska, G., Wong, C.Y., Azzopardi, K.,
Tauschek, M., Robins-Browne, R.M., Jackson, D.C. A modular approach
to assembly of totally synthetic self-adjuvanting lipopeptide-based
vaccines allows conformational epitope building. J. Biol. Chem. 2011 Feb
14. [Epub ahead of print].
97.
Kessel, C., Kreuz, W., Klich, K., Becker-Peters, K., Vorpahl, F., Dietrich,
U., Klingebiel, T., Königs, C. Multimerization of peptide mimotopes for
blocking of factor VIII neutralizing antibodies. ChemMedChem. 2009;
4(8):1364-1370.
98.
Pérez-Cordero,
J.J.,
Lozano,
J.M.,
Cortés,
J.,
Delgado,
G.
Leishmanicidal 8activity of synthetic antimicrobial peptides in an infection
model with human dendritic cells. Peptides. 2011 Jan 22. [Epub ahead of
print]
99.
Kessenbrock, K., Raijmakers, R., Fritzler, M.J., Mahler, M. Synthetic
peptides: the future of patient management in systemic rheumatic
diseases? Curr. Med. Chem., 2007; 14(26)2831-2838.
100. Berger, E.A. Alkhatib, G. HIV gp120 interactions with coreceptors:
insights from studies with CCR5-based peptides. Eur. J. Med. Res.,
2007; 12(9):.403-407.
101. Bromley, E.H., Channon, K., Moutevelis, E., Woolfson, D.N.. Peptide and
protein building blocks for synthetic biology: from programming
biomolecules to self-organized biomolecular systems. ACS Chem. Biol.
2008; 3(1):38-50.
102. Melkoumian, Z., Weber, J.L., Weber, D.M., Fadeev, A.G., Zhou, Y.,
Dolley-Sonneville, P., Yang, J., Qiu, L., Priest, C.A., Shogbon, C., Martin,
A.W., Nelson, J., West, P., Beltzer, J.P., Pal, S., Brandenberger, R.
Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and
cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat.
Biotechnol. 2010; 28(6):606-610.
Página | 124
103. Miller, D., Finnie, J., Bowden, T., Scholz, A., Oh, S., Kok, T., Burrell, C.,
Trinidad, L., Boyle, D., Li, P. Preclinical efficacy studies of influenza A
haemagglutinin precursor loop peptides as a potential vaccine.
J.Gen.Virol. 2011 Feb 2. [Epub ahead of print]
104. Kitchen, D.B., Decornez, H., Furr, J.R., Bajorath, J. Docking and scoring
in virtual screening for drug discovery: methods and applications. Nature
reviews. Drug discovery, 2004; 3(11):935-949.
105. De Groot, A.S. Immunomics: discovering new targets for vaccines and
therapeutics. Drug Discov. Today, 2006; 11(5-6):203-209.
106. Mendel, I. Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. Delineation of the minimal
encephalitogenic epitope within the immunodominant region of myelin
oligodendrocyte glycoprotein: diverse V beta gene usage by T cells
recognizing the core epitope encephalitogenic for T cell receptor V beta b
and T cell receptor V beta a H-2b mice. Eur. J. Immunol. 1996;
26(10):2470-2479
107. Van Regenmortel, M.H. Antigenicity and immunogenicity of synthetic
peptides. Biologicals, 2001; 29(3-4):209-213.
108. Dreher, D., Vargas, J.R., Hochstrasser, D.F., Junod ,A.F. Effects of
oxidative stress and Ca2+ agonists on molecular chaperones in human
umbilical vein endothelial cells. Electrophoresis. 1995; 16(7):1205-1214.
109. Huang, J., Honda, W. CED: a conformational epitope database. BMC
Immunol. 2006; 7(7):7.
110. Edwards, A.M., Arrowsmith, C.H., Christendat, D., Dharamsi, A.,
Friensen, J.D., Greenblatt, J.F., Vedadi, M.. . Protein production: feeding
the crystallographers and NMR spectroscopists. Nat. Struct. Biol. 2000;
7(Suppl):970-972.
111. Amit, A.G., Boulot, G., Comarmond, M.B., Harper, M., Mariuzza, R.A.,
Phillips, S.E., Saludjian, P., Saul, F.A., Souchon, H., Tougard, P. X-ray
diffraction studies of an anti-azophenylarsonate antibody and of an
antigen-antibody
complex.
Ann.
Inst.
Pasteur
Immunol.
1985;
136(1).121-129.
Página | 125
112. Francica, J.R., Varela-Rohena, A., Medvec, A., Plesa, G., Riley, J.L.,
Bates, P. Steric shielding of surface epitopes and impaired immune
recognition induced by the ebola virus glycoprotein. PLoS Pathog. 2010;
6(9) e1001098.
113. Geysen, H.M., Mason, T.J., Rodda, S.J. Cognitive features of continuous
antigenic determinants. J. Mol. Recognit. 1988; 1(1):32-41.
114. Revillard, J.P., Adorini, L., Goldman, M., Kabelitz, D., Waldmann, H.
Apoptosis: potential for disease therapies. Immunol. Today, 1998;
19(7):291-293.
115. Meloen, R.H., Puijk, W.C., Slootstra, J.W. Mimotopes: realization of an
unlikely concept. J.Mol.Recognit, 2000; 13(6):352-359.
116. Carter, J.M. Production of anti-peptide antisera. Curr. Protoc. Immunol,
2003; (9)9.3.
117. Szklarz, G.D., Halpert, J.R. Use of homology modeling in conjunction
with
site-directed
mutagenesis
for
analysis
of
structure-function
relationships of mammalian cytochromes P450. Life Sci. 1997;
61(26):2507-2520.
118. Pellequer, J.L., Westhof, E.
PREDITOP: a program for antigenicity
prediction. J. Mol. Graph. 1993; 11(3):204-210,191-192.
119. Goede, A., Jaeger, I.S., Preissner, R. SUPERFICIAL-surface mapping of
proteins via structure-based peptide library design. BMC Bioinformatics,
2005; 6:223.
120. Merrifield, R.B. Solid-phase peptide synthesis. Adv. Enzymol. Relat.
Areas Mol. Biol. 1969; (32):221-296.
121. Reineke, U., Kramer, A., Schneider-Mergener, J. Antigen sequence- and
library-based mapping of linear and discontinuous protein-proteininteraction sites by spot synthesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999;
243:23-36.
122. Frank, R. Spot-synthesis: na easy technique for the positionally
addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.
Tetrahedron, 1992; 48:9217-9232.
Página | 126
123. Geysen, H.M., Barteling, S.J., Meloen, R.H. Small peptides induce
antibodies with a sequence and structural requirement for binding
antigen comparable to antibodies raised against the native protein. Proc.
Natl. Acad. Sci. U S A. 1985; 82(1):178-178.
124. Sanchez, E.F., Diniz, C.R., Richardson, M. The complete amino acid
sequence of the haemorrhagic factor LHFII, a metalloproteinase isolated
from the venom of the bushmaster snake (Lachesis muta muta). FEBS
Lett, 1991; 282:178–182.
125. Yahi, N., Devaux, C., Mansuelle, P., Defendini, M.L., Granier, C.
Monoclonal antibodies to toxin II from the scorpion Androctonus australis
Hector: further characterization of epitope specificities and neutralizing
capacities. Toxicon, 1992; 30(7):723-731.
126. Piquer, S., Valera, L. Lampasona, V., Jardin-Watelet, B., Roche, S.,
Granier, C., Roquet, F., Christie, M.R., Giordano, T., Malosio, M.L.,
Bonifacio, E., Laune, D. Monoclonal antibody 76F distinguishes IA-2 from
IA-2beta and overlaps an autoantibody epitope. J Autoimmun. 2006;
26(3):215-222.
127. Estêvão-Costa, M.I., Martins, M.S., Sánchez, E.F., Diniz, C.R., ChávezOlórtegui, C. Neutralization of the hemorrhagic activity of Bothrops and
Lachesis snake venoms by a monoclonal antibody against mutalysin-II.
Toxicon. 2000; 38(1):139-144.
128. Alvarenga, L.M., Martins, M.S., Moura, J.F., Kalapothakis, E., Oliveira,
J.C., Mangili, O.C., Granier, C., Chávez-Olórtegui. C.Production of
monoclonal antibodies capable of neutralizing dermonecrotic activity of
Loxosceles intermedia spider venom and their use in a specific
immunometric assay. Toxicon. 2003; 42(7):725-731.
129. Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., and Schwede T. The SWISS-MODEL
Workspace: A web-based environment for protein structure homology
modelling. Bioinformatics, 2006: 22,195-201.
130. Kiefer, F., Arnold, K., Künzli, M., Bordoli, L., Schwede, T. The SWISSMODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Research,
2009; 37,D387-D392.
Página | 127
131. Peitsch, M. C. Protein modeling by E-mail Bio/Technology, 1995; 13:658660.
132. Melo, F., Feytmans, E. ANOLEA - Assessing protein structures with a
non-local atomic interaction energy. J. Mol. Biol. 1998; 277(5):11411152.
133. Eisenberg, D., Luthy, R. VERIFY3D: assessment of protein models with
three-dimensional profiles. Methods Enzymol, 1997; 277:396-404.
134. Orengo, C.A., Michie, A.D., et.al. CATH--a hierarchic classification of
protein domain structures. Structure, v.5, n.8, Aug 15, p.1093-108. 1997.
135. Moreau, V., Fleury, C., Piquer, D., Nguyen, C., Novali, N., Villard, S.,
Laune, D., Granier, C., Molina, F. PEPOP: computational design of
immunogenic peptides. BMC Bioinformatics. 2008; 9(71):1-15.
136. Neshich, G., Togawa, R.C., Mancini, A.L., Kuser, P.R., Yamagishi, M.E.,
Pappas, G., Jr, Torres, W.V., Fonseca ,Campos, T., Ferreira, L.L., Luna,
F.M., Oliveira, A.G., Miura, R.T., Inoue, M.K., Horita, L.G., de, Souza,
D.F., Dominiquini, F., Alvaro, A., Lima, C.S., Ogawa, F.O., Gomes, G.B.,
Palandrani, J.F., Dos Santos, G.F., De Freitas, E.M., Mattiuz, A.R.,
Costa, I.C., De Almeida, C.L., Souza, S., Baudet ,C., Higa, R.H. Sting
Millennium: A web-based suite of programs for comprehensive and
simultaneous analysis of protein structure and sequence. Nucleic Acids
Res, 2003; 31(13):3386-3392.
137. Borro, L.C., Oliveira, S.R., Yamagishi, M.E., Mancini, A.L., Jardine, J.G.,
Mazoni, I., Santos, E.H., Higa, R.H., Kuser, P.R. Neshich G.Predicting
enzyme class from protein structure using Bayesian classification. Genet
Mol Res., 2006; 5(1):193-202.
138. Neshich, G., Rocchia, W., Mancini, A.L., Yamagishi, M.E., Kuser, P.R.,
Fileto, R., Baudet, C., Pinto, I.P., Montagner, A.J., Palandrani, J.F.,
Krauchenco, J.N., Torres, R.C., Souza, S., Togawa, R.C., Higa, R.H.
JavaProtein Dossier: a novel web-based data visualization tool for
comprehensive analysis of protein structure. Nucleic Acids Res.,
2004;32(Web Server issue):W595-601.
Página | 128
139. Moreau, V., Granier, C., Villard, S., Laune, D., Molina, F. Discontinuous
epitope prediction based on mimotope analysis. Bioinformatics,2006;
22(9):1088-1095
140. Morgenstern, B., Frech, K. Dress, A., Werner, T. DIALIGN: finding local
similarities
by
multiple
sequence
alignment.
Bioinformatics,1998;
14(3):290-4.
141. Notredame, C., Higgins, D. G. Herigan, J. T-Coffee: A novel method for
fast and accurate multiple sequence alignment. J Mol Biol, 2000;
302(1):205-17.
142. Corpet, F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering.
Nucleic Acids Res., 1988; 16(22):10881-10890.
143. Stoye, J., Moulton, V. Dress, A.W. DCA: an efficient implementation of
the divide-and-conquer approach to simultaneous multiple sequence
alignment. Comput Appl Biosci, 1997; 13(6):625-626.
144. Jonassen, I., Collins, J. F. Higgins, D.G. Finding flexible patterns in
unaligned protein sequences. Protein Sci,1995; 4(8):1587-1595.
145. Laune, D., Molina, F., Ferrières, G., Villard, S., Bès, C., Rieunier, F.,
Chardès, T., Granier. C. Application of the Spot method to the
identification of peptides and amino acids from the antibody paratope that
contribute to antigen binding. J Immunol Methods. 2002; 267(1):53-70.
146. ImageJ Programa disponivel no site http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html.
147. Gomes, M.T., Guimarães, G., Frézard, F., Kalapothakis, E., Minozzo,
J.C., Chaim, O.M., Veiga, S.S., Oliveira, S.C., Chávez-Olórtegui, C.
Determination of sphingomyelinase-D activity of Loxosceles venoms in
sphingomyelin/cholesterol liposomes containing horseradish peroxidase.
Toxicon, 2011; 57(4):574-579.
148. Kondo, H., Kondo, S., Ikezawa, H., Murata, R. Studies on the quantitative
method for determination of hemorrhagic activity of Habu snake
venom.Jpn J Med Sci Biol. 1960; 13:43-52.
149. Gutiérrez, J.M., Gené, J.A., Rojas, G., Cerdas, L. Neutralization of
proteolytic and hemorrhagic activities of Costa Rican snake venoms by a
polyvalent antivenom. Toxicon. 1985; 23(6):887-893.
Página | 129
150. Haste Andersen, P., Nielsen, M., Lund, O. Prediction of residues in
discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci.,
2006; 15:2558–2567.
151. Sun, J., Wu, D., Xu, T., Wang, X., Xu, X., Tao, L., Li, Y.X., Cao, Z.W.
SEPPA: a computational server for spatial epitope prediction of protein
antigens.Nucleic Acids Res., 2009; 37(Web Server issue):W612-616.
152. Kulkarni-Kale, U., Bhosle, S., Kolaskar, A.S. CEP: a conformational
epitope prediction server. Nucleic Acids Res., 2005; 33(Web Server
issue):W168-171.
153. Ponomarenko,
J.V.,
Bourne,
P.E.
Antibody–protein
interactions:
benchmark datasets and prediction tools evaluation. BMC Struct. Biol.
2007; 7:64.
154. Negi, S., Braun, W. Automated detection of conformational epitopes
using phage display peptide sequences, Bioinform Biol Insights 3, 2009:
71-81.
155. Housset, D., Habersetzer-Rochat, C., Astier, J.P., Fontecilla-Camps, J.C.
Crystal structure of toxin II from the scorpion Androctonus australis
Hector refined at 1.3 A resolution. J. Mol. Biol. 1994 22;238(1):88-103.
156. Devaux, C., Clot-Faybesse, O., Juin, M., Mabrouk, K., Sabatier, J.M.
Rochart, H. Monoclonal antibodies neutralizing the toxin II from
Androctonus australis hector scorpion venom: usefulness of a synthetic,
nontoxic analog. FEBS Lett, 1997; 412(3):456-60.
157. Ait-Amara, D., Chavez-Olortegui, C., Romi, R., Mery, J., Brugidou, J.,
Albericio, F., Devaux, C., Granier, C. Antibodies cross-reactive with the
scorpion-toxin II from Androctonus australis Hector elicited in mice by a
synthetic peptide. Nat Toxins, 1993;1(4):255-262.
158. Ferreira, R.N., Machado de Ávila, R.A. Sanchez E.F., Maria, W.S.,
Molina, F., Granier, C., Chávez-Olórtegui, C. Antibodies against synthetic
epitopes inhibit the enzymatic activity of mutalysin II, a metalloproteinase
from bushmaster snake venom. Toxicon, 2006; 48(8):1098-1103.
159. Chakrabarti, P. Janin, J., Dissecting protein–protein recognition sites,
Proteins, 2002; 47(3):334–343.
Página | 130
160. Kharrat, R., Darbon, H., Rochat, H. and Granier, C. Structure/activity
relationships of scorpion alpha-toxins. Multiple residues contribute to the
interaction with receptors. Eur. J. Biochem.1989; 181:381-390.
161. Kahn, R., Karbat, I., Ilan, N., Cohen, L., Sokolov, S., Catterall, W.A.,
Gordon, D. Gurevitz, M. Molecular Requirements For Recognition Of
Brain Voltage-Gated Sodium Channels By Scorpion Alpha-Toxins. J.
Biol. Chem, 2009; 284:20684-20691.
162. Alvarenga, L., Moreau, V., Felicori, L., Nguyen, C., Duarte, C., ChavezOlortegui, C., Molina, F., Martin-Eauclaire, M.F., Granier, C. Design of
antibody-reactive peptides from discontinuous parts of scorpion toxins.
Vaccine. 2010; 28(4):970-980.
163. Martin-Eauclaire, M.F. Alami, M. Giamarchi, A. Missimilli, V. Rosso J.P.;
Bougis, P.E.
A natural anatoxin, Amm VIII, induces neutralizing
antibodies
against
the
potent
scorpion
alpha-
toxins. Vaccine:2006; 24(12):1990-1996.
164. Huang, X., Miller, W. A Time-Efficient, Linear-Space Local Similarity
Algorithm. Advances in Applied Mathematics, 1991; 12:337-357.
165. Scian, R., Barrionuevo, P., Giambartolomei, G.H., Fossati, C.A., Baldi,
P.C., Delpino, M.V. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factorand tumor necrosis factor alpha-mediated matrix metalloproteinase
production by human osteoblasts and monocytes after infection with
Brucella abortus. Infect. Immun. 2011; 79(1):192-202.
166. Walter, M.R., Cook, W.J., Ealick, S.E., Nagabhushan, T.L., Trotta, P.P.,
Bugg,
C.E.
Three-dimensional
structure
of
recombinant
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.
human
Mol. Biol. 1992;
224(4):1075-1085.
167. Marturana, F., Timmins, N.E., Nielsen, L.K. Short-term exposure of
umbilical cord blood CD34(+) cells to granulocyte-macrophage colonystimulating factor early in culture improves ex vivo expansion of
neutrophils. Cytotherapy. 2011; 13(3):366-377.
168. Fu, J., Sha, B.E., Thomas, L.L. HIV-1-infected peripheral blood
mononuclear cells enhance neutrophil survival and HLA-DR expression
Página | 131
via increased production of GM-CSF: implications for HIV-1 infection. J
Acquir Immune Defic Syndr. 2011; 56(1):16-25.
169. Plater-Zyberk, C., Joosten, L.A., Helsen, M.M., Koenders, M.I., Baeuerle,
P.A., van den Berg, W.B. Combined blockade of granulocytemacrophage colony stimulating factor and interleukin 17 pathways
potently suppresses chronic destructive arthritis in a tumour necrosis
factor alpha-independent mouse model. Ann Rheum Dis. 2009;
68(5):721-728.
170. Korzenik, J., Dieckgraefe, B., Valentine, J., Hausman, D., Gilbert, M.
"Sargramostim for active Crohn's disease". N. Engl. J. Med. ,2005;
352(21): 2193–2201
171. Alvarenga, L.M., Diniz, C.R., Granier, C., Chávez-Olórtegui, C. Induction
of neutralizing antibodies against Tityus serrulatus scorpion toxins by
immunization with a mixture of defined synthetic epitopes. Toxicon. 2002;
40(1):89-95.
172. Rossjohn, J., McKinstry, W.J., Woodcock, J.M., McClure, B.J., Hercus,
T.R., Parker, M.W., Lopez, A.F., Bagley, C.J. Structure of the activation
domain of the GM-CSF/IL-3/IL-5 receptor common beta-chain bound to
an antagonist. Blood, 2000; 95:2491-2498.
173. Griffin, J.D., Cannistra, S.A., Sullivan, R., Demetri, G.D., Ernest,T.J.,
Kanakura, Y. The biology of GM-CSF: regulation of production and
interaction with its receptors. Int. J.Cell. Cloning. 1990; 8(1):35-44.
174. Hansen, G., Hercus, T.R., McClure, B.J., Stomski, F.C., Dottore, M.,
Powell, J., Ramshaw, H., Woodcock, J.M., Xu, Y., Guthridge, M.,
McKinstry, W.J., Lopez, A.F., Parker, M.W. The structure of the GM-CSF
receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation.
Cell. 2008; 134(3):496-507.
175. Rozwarski, D.A., Diederichs, K., Hecht, R., Boone, T., Karplus, P.A.
Refined crystal structure and mutagenesis of human granulocytemacrophage colony-stimulating factor. Proteins, 1996; 26(3):304-313.
Página | 132
176. Oggero, M., Frank, R., Etcheverrigaray, M., Kratje, R. Defining the
antigenic structure of human GM-CSF and its implications for receptor
interaction and therapeutic treatments. Mol. Divers. 2004; 8(3):257-69.
177. Dey, R., Ji, K., Liu, Z., Chen, L. A cytokine-cytokine interaction in the
assembly of higher-order structure and activation of the interleukine3:receptor complex. PLoS One. 2009; 4(4):e5188.
178. Sinan, Net 2011 - Ministério Da Saúde Do Brasil, Brasília. Sistema de
Informação
de
Agravo
de
Notificações.
2011.
Disponível
em
http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/.
179. Vetter, R.S., Visscher, P.K. Bites and stings of medically important
venomous arthropods. International Journal of dermatology, 1998; 37:
481-496.
180. Swanson, D.L., Vetter, R.S. Loxocelism. Clinics in Dermatology, 2006;
24: 213-221.
181. Braz, A., Minozzo, J., Abreu, J.C., Gubert, I., ,.Chávez-Olórtegui, C.
Desenvolvimento e avaliação da capacidade de neutralização do
antiveneno cavalo contra a aranha brasileira Loxosceles intermedia .
Toxicon, 1999; 37:1323-1328.
182. Murakami,
M.T.,
Fernandes-Pedrosa,
M.F.,
Andrade,
S.A.,
Gabdoulkhakov, A., Betzel, C., Tambourgi, D.V., Arni, R.K. Structural
insights into the catalytic mechanism of sphingomyelinases D and
evolutionary Relationship to glycerophosphodiester phosphodiesterases.
Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006; 342:
323-329
183. Kalapothakis, E., Araujo, S.C., de, Castro, C.S., Mendes, T.M., Gomez,
M.V., Mangili, O.C., Gubert, I.C., Chávez-Olórtegui, C. Molecular cloning,
expression and immunological properties of LiD1, a protein from the
dermonecrotic family of Loxosceles intermedia spider venom. Toxicon.
2002; 40(12):1691-1699.
184. Murakami, M.T., Fernandes-Pedrosa, M.F., Tambourgi, D.V., Arni, R.K.
Structural basis for metal ion coordination and the catalytic mechanism of
sphingomyelinases D. J Biol Chem, 2005; 280(14):13658-13664.
Página | 133
185. De, Brevern, A.G., Etchebest, C., Hazout, S. Bayesian probabilistic
approach for predicting backbone structures in terms of protein blocks.
Proteins. 2000; 41(3):271-287.
186. FUNASA - Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais
peçonhentos--Fundação Nacional de Saúde/Coordenação de Controle
de Zoonoses e Animais Peçonhentos. 2001.
187. Bjarnason, J.B. Fox, J.W. Hemorrhagic metalloproteinases from snake
venoms. Pharmacol Ther., 1994; 62(3):325-72.
188. Torres, J.R., Torres, M.A., Arroyo-Parejo, M.A. Coagulation disorders in
bushmaster envenomation. Lancet,1995; 346(8972):449-450.
189. Otero, R., Furtado, M.F. Gonçalves C, Núñez, V., García, M.E., Osorio,
R.G., Romero, M., Gutiérrez, J.M. Comparative study of the venoms of
three subspecies of Lachesis muta (bushmaster) from Brazil, Colombia
and Costa Rica. Toxicon,1998; 36(12): 2021-2027.
190. Sanchez, E.F., Santos, C.I., Magalhaes, A., Diniz, C.R., Figueiredo, S.,
Gilroy, J., Richardson, M. Isolation of a proteinase with plasminogenactivating activity from Lachesis muta muta (bushmaster) snake venom.
Arch Biochem Biophys, 2000; 378(1):131-41.
191. Sánchez, E.F., Magalhães, A., Diniz, C.R. Purification of a hemorrhagic
factor (LHF-I) from the venom of the bushmaster snake, Lachesis muta
muta. Toxicon. 1987; 25(6):611-619.
192. Sanchez, E.F., Souza, C.T., Bello, C.A., Richardson, M., Oliveira, E.B.,
Magalhaes,
A.
Resolution
of
isoforms
of
mutalysin
II,
the
metalloproteinase from bushmaster snake venom. Toxicon. 2003;
41(8):1021-1031.
193. Stöcker, W., Grams, F., Baumann, U., Reinemer, P., Gomis-Rüth, F.X.,
McKay, D.B., Bode, W. The metzincins--topological and sequential
relations between the astacins, adamalysins, serralysins, and matrixins
(collagenases) define a superfamily of zinc-peptidases. Protein Sci.
1995; 4(5):823-840.
194. Rucavado, A., Flores-Sánchez, E., Franceschi, A., Magalhaes, A.,
Gutiérrez, J.M. Characterization of the local tissue damage induced by
Página | 134
LHF-II, a metalloproteinase with weak hemorrhagic activity isolated from
Lachesis muta muta snake venom. Toxicon, 1999; 37(9):1297-1312.
195. Souza, C.T., Moura, M.B., Magalhaes, A., Heneine, L.G., Olortegui, C.C.,
Diniz, C.R., Sanchez, E.F. Inhibition of mutalisyn II, a metalloproteinase
from bushmaster snake venom by human a 2-macroglobulin and rabbit
immunoglobulin. Comp. Biochem. Physiol, 2001; 130:155–68.
196. Theakston, R.D., Kamigut, A.S. A list of animal toxins and some other
natural products with biological activity. Toxicon. 2002; 40(5):579-651.
197. Calderon-Aranda, E. S., Olamendi-Portugal, Possani, L.D. The use of
synthetic peptides can be a misleading approach to generate vaccines
against scorpion toxins. Vaccine, 1996; 13(13):1198-206.
198. Calderon-Aranda, E. S., Selisko, B., York, E.J., Gurrola, G.B., Stewart,
J.M., Possani, L.D. Mapping of an epitope recognized by a neutralizing
monoclonal antibody specific to toxin Cn2 from the scorpion Centruroides
noxius, using discontinuous synthetic peptides. Eur J Biochem, 1999;
264(3):746-55.
199. Castanheira, P. Tese de mestrado intitulada: Uso da técnica de Phage
Display na Identificação de Epítopos da LHF-II, uma metaloproteinase do
veneno da serpente Lachesis muta muta.Orientador Carlos Chávez
Olortegui. Pós graduação de Farmocologia Bioquímica e Molecular –
ICB - Universidade Federal de Minas Gerais. 2006.
200. Zhang, D., Botos, I., Gomis-Rüth, F.X., Doll, R., Blood, C., Njoroge, F.G.,
Fox, J.W., Bode, W., Meyer, E.F. Structural interaction of natural and
synthetic inhibitors with the venom metalloproteinase, atrolysin C (form
d). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1994; 91(18):8447-8451.
201. Parker, J.M., Guo, D., Hodges, R.S.New hydrophilicity scale derived from
high-performance
liquid
chromatography
peptide
retention
data:
correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-rayderived accessible sites. Biochemistry. 1986; 25(19):5425-5432.
202. Jameson, B.A., Wolf, H. The antigenic index: a novel algorithm for
predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci. 1988; 4(1):181186.
Página | 135
203. Taneichi, M., Ishida, H., Kajino, K., Ogasawara, K., Tanaka, Y., Kasai,
M., Mori, M., Nishida, M., Yamamura, H., Mizuguchi, J., Uchida, T.
Antigen chemically coupled to the surface of liposomes are crosspresented to CD8+ T cells and induce potent antitumor immunity. J
Immunol. 2006; 177(4):2324-2330.
204. Taneichi, M., Tanaka, Y., Kakiuchi, T., Uchida, T. Liposome-coupled
peptides induce long-lived memory CD8 T cells without CD4 T cells.
PLoS One. 2010; 5(11):e15091.
205. Tanjoni, I., Butera, D., Bento, L., Della-Casa, M.S., Marques-Porto, R.,
Takehara, H.A., Gutiérrez, J.M., Fernandes, I., Moura-da-Silva, A.M.
Snake venom metalloproteinases: structure/function relationships studies
using monoclonal antibodies. Toxicon, 2003; 42(7):801-808.
206. PHP Manual, disponivel no site: http://www.php.net/manual/en/index.php
207. Henriksson, G., Englund, A.K., Johansson. G,. Lundahl Calculation of the
isoelectric points of native proteins with spreading of pKa values.
Electrophoresis. 1995; 16(8):1377-1380.
208. Sillero, A., Maldonado, A. Isoelectric point determination of proteins and
other macromolecules: oscillating method. Comput Biol Med., 2006;
36(2):157-166.
Página | 136
.
Página | 137

predição de epítopos descontínuos ou conformacionais em

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