Aus dem Institut für Rechtsmedizin

Transcrição

Aus dem Institut für Rechtsmedizin
der Medizinischen Fakultät
der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg
Kartierung der forensischen Marker in der Rechtsmedizin
- eine Datenbankanalyse
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
Dr. med.
(doctor medicinae)
an der Medizinischen Fakultät
der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg
vorgelegt von Sebastian Lieske aus Magdeburg
Magdeburg 2004
Meinen Eltern in Dankbarkeit gewidmet
2
INHALTSVERZEICHNIS
I3
Inhaltsverzeichnis ...................................................................................................................... I
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................ II
1
Einleitung ........................................................................................................................... 7
1.1
1.1.2
Blutgruppen, Erythrozyten ................................................................................ 9
1.1.1
Serumpolymorphismen ................................................................................... 10
1.1.2
Erythrozytäre Enzympolymorphismen ............................................................ 11
1.1.3
HLA.................................................................................................................. 12
1.1.4
DNA- Polymorphismen ................................................................................... 13
1.1.4.1
Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) ................................................. 14
1.1.4.2
Short-Insertions/ Deletions Polymorphismen (SIDPs) ................................ 14
1.1.4.3
Repetetive DNA und damit assoziierte Polymorphismen............................ 14
1.1.5
Übersicht zur forensischen DNA-Analyse....................................................... 17
1.1.6
Untersuchung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen ................... 18
1.1.7
Mitochondrien Polymorphismen...................................................................... 22
1.2
Zur Lokalisierung von Genen und molekularen Markern auf den Chromosomen .. 24
1.3
Richtlinien der ISFHG ……………………………………………………………. 26
1.4
Lokalisation von Markern/Kopplung …………………………………………….. 28
1.4.1
Bedeutung der Kartierung von Markern ......................................................... 28
1.4.2
Radio-Hybrid-Mapping.................................................................................... 29
1.4.3
Contig- Datenbanken ....................................................................................... 31
1.5
2
Polymorphe genetische Marker ……………………………………………………. 9
Zielstellung ……………………………………………………………………….. 32
Material und Methoden ................................................................................................... 33
2.1
Gendatenbanken ………………………………………………………………….. 34
2.1.1
Genome Database: GDB .................................................................................. 34
2.1.2
National Center for Biotechnology Information: NCBI .................................. 35
2.1.3
Center for Medical Genetics: CFMG .............................................................. 35
2.1.4
Cooperative Human Linkage Center: CHLC .................................................. 36
2.2
Medline- Recherche ………………………………………………………………. 36
2.3
Darstellung der Befunde ………………………………………………………….. 36
2.4
Erstellung von Retentionsprofilen ausgewählter Marker ………………………… 37
2.4.1
Amplifikation mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ........................ 37
2.4.2
PCR-Reaktionsansätze .................................................................................... 37
4
3
Ergebnisse ........................................................................................................................ 41
3.1
4
Rh-Mapping ………………………………………………………………………. 42
3.1.1
Das Rh-Mapping des Markers D3S1758 ........................................................ 42
3.1.2
Das Rh-Mapping des Markers D7S1517 ......................................................... 44
3.1.3
Das Rh-Mapping des Markers Se33................................................................. 46
3.2
Die forensischen Marker des Chromosom 1 ……………………………………... 49
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
Die forensischen Marker des Chromosom 10 ……………………………………. 58
3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
3.17
3.18
3.19
3.20
3.21
3.22
3.23
Diskussion ........................................................................................................................ 66
4.1
Demonstrationsbeispiel …………………………………………………………... 69
4.2
Zusammenfassung und Aussicht ………………………………………………..... 72
5
Literatur ........................................................................................................................... 74
6
Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... 89
7
Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 91
5
Danksagung ........................................................................................................................... III
Eidesstattliche Erklärungen ................................................................................................... IV
Curriculum Vitae .................................................................................................................... V
Publikationsverzeichnis …….................................................................................................. VI
6
1 EINLEITUNG
7
Die Aufgabe dieser Dissertationsschrift besteht darin, eine Übersicht zur genetischen
Lokalisation der zurzeit bekannten genetischen Marker, die in der forensischen Wissenschaft
genutzt werden, zu erstellen.
Im Aufgabenspektrum des Faches Rechtsmedizin nimmt die Entwicklung und Anwendung
von Identifizierungsmethoden einen breiten Raum ein. Die Skala der dazu genutzten
Arbeitsgebiete ist breit. Anatomisch-morphologische, anthropologische, radiologische,
odontologische und einige andere Techniken der forensischen Medizin sollen hier nicht
berücksichtigt werden. Diese Arbeit soll einen Beitrag zum Arbeitsgebiet der Identifizierung
von Spuren, Personen, Leichen und Leichenteilen durch Analyse von biochemischen,
immunologischen und molekularen Markern leisten. All diesen in Betracht gezogenen
Markern ist ihre genetische Determiniertheit gemeinsam. Aus diesem Zusammenhang ergibt
sich, dass die gleichen Marker auch für forensische Abstammungsuntersuchungen von
Bedeutung sind. Molekulare Identifizierungsstrategien und Abstammungsuntersuchungen
nutzen die gleichen Marker. Diese sind in neuerer Zeit fast ausschließlich DNA-Marker
unterschiedlicher Natur.
Für die Analyse der verschieden gearteten DNA-Polymorphismen steht eine große Anzahl
unterschiedlicher Hilfsmittel und Techniken zur Verfügung. Diese werden in Tabelle 1 - 1 in
einer Übersicht dargestellt.
Bevor es jedoch zur Etablierung der DNA-Analyse kam, bediente sich die Rechtsmedizin der
Untersuchung der so genannten klassischen Marker. Karl Landsteiner beschrieb 1901 („Über
Agglutinationserscheinungen normalen menschlichen Blutes“) den ersten bekannt
gewordenen genetischen Polymorphismus des Menschen, das AB0-Blutgruppensystem.
Infolgedessen kam es zu einer rasanten Entwicklung auf dem Gebiet der
Blutgruppenserologie, die zu einer Vielzahl bestimmbarer Blutgruppenmerkmale führte. Bis
zur Einführung der Stärkegelelektrophorese durch Smithies (1955) waren jedoch neben dem
AB0-System nur einige wenige, ebenfalls auf den Antigeneigenschaften der
Erythrozytenmembran beruhende, Polymorphismen bekannt. Smithies gelang es nun den
Polymorphismus des Haptoglobins darzustellen. Nachfolgend konnten durch die
Weiterentwicklung elektrophoretischer Trennverfahren zahlreiche Polymorphismen von
Serumproteinen und erythrozytären Enzymen gefunden werden. Eine herausragende Rolle
erlangte die isoelektrische Fokussierung als Methode der Trennung von Proteinen. Hierdurch
konnten Allele, die zuvor durch die konventionelle Elektrophorese nicht zu unterscheiden
waren, in verschiedene Subtypen differenziert werden. Zunächst wenig informativ
erscheinende Serumproteinpolymorphismen wurden so zu wertvollen Markern.
8
Die Bestimmung von Blutgruppenmerkmalen ist seit vielen Jahren Bestandteil der
Abstammungs- und Identitätsbegutachtung. Mittlerweile sind zahlreiche Untersuchungen über
die Allelverteilung von Blutgruppensystemen für weltweit untersuchte Populationen
zugänglich.
Obwohl die Analyse der klassischen Marker zunehmend durch die DNA-Analyse verdrängt
wird, sind die traditionellen Untersuchungsmethoden auch heute noch im Gebrauch und nicht
bedeutungslos.
1.1
1.1.2
Polymorphe genetische Marker
Blutgruppen, Erythrozyten
1901 erkannte K. Landsteiner erstmals, dass die Blutseren bestimmter Menschen die
Eigenschaft haben, die Erythrozyten anderer zu agglutinieren. Nach weiterer intensiver
Forschung beschrieb er die Blutgruppen des klassischen AB0-Systems. Dafür erhielt er 1930
den Nobelpreis.
Bereits 1910 gelang Dungern und Hirszfeld der Nachweis der Erblichkeit der Blutgruppen.
Jedoch wurde ihr Erbgang erst im Jahre 1924 durch die 3-Gen-Theorie des Göttinger
Mathematikers Bernstein geklärt. Die Einführung der internationalen Nomenklatur (A, B, AB
und 0) erfolgte 1928. Das bis dahin entdeckte Blutgruppensystem war über 20 Jahre hindurch
als ein einfaches, leicht zu überschauendes System mit multipler Allelie von 3 Allelen
beschrieben worden. In den folgenden Jahren fand man bei Arbeiten mit Seren von
Menschen, Kaninchen und Affen weitere polymorphe Blutgruppen-Systeme, welche sich gut
für rechtsmedizinische Zwecke eigneten. Einen Überblick über die zeitliche Abfolge der
Entdeckungen soll Tabelle 1 - 1 verschaffen (Krause, D. 1999).
Die Blutgruppen spielen in der Rechtsmedizin schon lange eine wichtige Rolle. Eine
wissenschaftlich begründete Vaterschaftsfeststellung mit hoher Aussagesicherheit war lange
Zeit Domäne der Blutgruppengutachten. Derzeit werden die klassischen Systeme der
Serogenetik allerdings zunehmend durch DNA-Techniken ergänzt, bzw. sogar ersetzt. Bis
zum heutigen Zeitpunkt wurden mehr als 600 Erythrozytenantigene gefunden, wobei einige
von ihnen häufig vorkommen, andere jedoch nur sehr selten und nur in einer Familie (Daniels
et al. 1996).
9
Erytrozytäre, durch Antigen-Antikörper-
1900
Jahr
Reaktion nachweisbare Merkmale
A, B, 0
AB
1902
A1 A2
1911
2 Allel-Theorie
1924
MN
1927
P
RH
1940
CcCW D Ee
1945
Kk
1946
Lu
S
1947
Se/se Le a/b
1948
s
1951
Fy(a) Fy (b)
1953
Jk(a) Jk (b)
1953
2000
Erythrozyten- Systeme
Tabelle 1 - 1: Zur zeitlichen Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der Blutgruppensysteme
1.1.1
Serumpolymorphismen
Fast fünfzig Jahre waren Abstammungsgutachten Domäne der Blutgruppenmerkmale. Zu
einem bedeutendem Durchbruch kam es 1955, als die von Smithies entwickelte
Serumelektrophorese in Stärkegel erstmals die Bestimmung weiterer Serum-Systeme
ermöglichte. Der erste entdeckte Serummarker war das Haptoglobin- (Hp) mit zunächst zwei
Allelen (Hp1, HP2), wobei inzwischen 5 häufige, und zahlreiche seltene Allele durch
Subtypisierung mittels isoelektrischer Fokussierung bekannt geworden sind.
Sukzessive wurde ein Duzend polymorpher Serumgruppen- Systeme in die serogenetische
Begutachtung eingeführt, von denen die wichtigsten in Tabelle 1 - 2 dargestellt sind (Krause,
D. 1999).
10
Protein- Systeme
1900
Jahr
HP
1955
Gm
1956
Gc (Tf)
(1957)
1959
Ag Lp
C3 = Pt
1968/69
Or
Km
1973
C2/4/6/8 Bf Pi
Gc, Tf, Pi (IEF) PLG
Protein- Systeme
2000
Tabelle 1 - 2: Zur zeitlichen Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der Proteinsysteme
1.1.2
Erythrozytäre Enzympolymorphismen
Neben der Entdeckung der Serumgruppen hat sich der Nachweis erblicher Enzymsysteme im
Blut als bedeutende Erweiterung der Untersuchungs- und Ausschlussmöglichkeiten in der
forensischen Serologie erwiesen.
Durch Hämolyse der Erythrozyten, zum Teil auch von Lymphozyten, werden die Enzyme
freigesetzt und können nach elektrophoretischer Auftrennung in einzelne Isoenzyme
entsprechend ihrer Wanderungsgeschwindigkeit typisiert werden. Den größten Fortschritt in
der Bestimmungstechnik erbrachte die Anwendung der Isoelektrofokussierung (IEF), wobei
die einzelnen Komponenten entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt im Gel zu schmalen
Zonen fokussieren. Häufig angewendete erythrozytäre Enzymsysteme sind in Tabelle 1 - 3 in
der Reihenfolge ihrer Entdeckung aufgelistet (Krause, D. 1999).
11
1900
Erythrozytäre Enzympolymorphismen
Jahr
SEP
1963
6 PDG
PGM
1964
ADA, AK
GPT
1971
PGM (IEF) ESD
1973
GLO
1975
Enzym- Systeme
2000
Tabelle 1 - 3: Zur zeitlichen Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der Enzymsysteme
1.1.3
HLA
Die Bedeutung der Entdeckung von Leukozytenantigenen für die gesamte Medizin wurde
durch die Verleihung des Nobelpreises an Dausset gewürdigt, der 1958 das Antigen MAC,
nach neuer Nomenklatur HLA A2 fand. Mit der Entdeckung von Isoantigenen, die als
sogenannte Transplantationsantigene im Bereich der Histokompatibilitätsgene kodiert
werden, begann mit der Verwertung der Kenntnisse des HLA- Genkomplexes auch eine neue
Ära für die Transplantationsmedizin, weil nunmehr durch Gewebetypisierung die
Verträglichkeit der übertragenen Organe geprüft werden konnte. Für die forensische Medizin
brachte die Anwendung des HLA-Systems eine ungewöhnliche Ausweitung der
Ausschlussmöglichkeiten, wie sie zuvor von keinem anderen System auch nur annähernd
erreicht wurde. Für Österreich errechnete Mayr bereits 1971 bei alleiniger Anwendung des
HLA-Systems eine Ausschlussquote von 80%. Sie liegt heute theoretisch bei 96%.
Einen entwicklungsgeschichtlichen Überblick soll Tabelle 1 - 4 verschaffen (Krause, D.
1999).
12
1900
Das HLA-System
Jahr
HLA
1965
HLA A, B, C
D, DR
2000
HLA- System
Tabelle 1 - 4: Zur zeitlichen Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der HLA-Systeme
1.1.4
DNA- Polymorphismen
Die DNA des menschlichen haploiden Chromosomensatzes besteht aus ca. 3 Milliarden
Basenpaaren. Sichtbare und versteckte Unterschiede zwischen Menschen erklären sich durch
die Variabilität der DNA sowohl in den kodierenden Bereichen als auch in den genetisch
stummen Polymorphismen. Nur eineiige Zwillinge bilden hier eine Ausnahme.
Nur ein Bruchteil (2 - 3%) der chromosomalen DNA codiert für Eiweiße und wird in eine
Aminosäurefolge übersetzt. Deshalb sind die meisten Mutationen im Genom
Selektionsneutral und akkumulieren sich im Laufe der Evolution.
Daraus resultieren Struktur- und Längenunterschiede zwischen homologen DNA- Sequenzen.
Sie werden als Polymorphismen bezeichnet, wenn sie mit einer Häufigkeit > 1% in einer
Bevölkerung in Erscheinung treten.
Die Polymorphismen werden im Allgemeinen nach ihrer DNA Struktur bezeichnet [z.B.
Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs), Variable Number of Tandem Repeat
13
Polymorphismen (VNTR) usw.]. Teilweise gingen aber auch die Nachweistechniken in die
Namensgebung mit ein, so dass gelegentlich auch ein und derselbe Polymorphismus unter
verschiedenen Rubriken geführt wird (z. B. SNP und Restiktions-Längen-Polymorphismus).
Natürlich lassen sich all diese Polymorphismen auch durch Sequenzierung bestimmen, hier
sollen aber nur Techniken aufgeführt werden, die auf die spezifische Situation abzielen.
Entsprechend ihrer Struktur und Nachweistechnik kann man folgende Systematik aufstellen:
1.1.4.1 Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs)
Hier sind einzelne Nucleotide ausgetauscht. SNPs sind gewöhnlich diallel. Die Allele sind
meist A/G bzw. C/T. Aber auch andere Allelkombinationen sind möglich. Sie wurden
ursprünglich durch Dot- Hypridisierung oder Restriktionstechnik (RFLPs) analysiert.
Neuerdings kommen weitere Techniken wie Real-Time-PCR, Pyrosequenzierung und
Minisequencing hinzu. Als Nachweistechnik der Zukunft entwickelt sich zurzeit die DNAChip-Technologie.
1.1.4.2 Short-Insertions/ Deletions Polymorphismen (SIDPs)
Wie der Name sagt, sind kurze Nucleotidfolgen deletiert bzw. insertiert. Die alternativen
Allele sind die Gegensätze „short“ und „long“ (s / l). Zu diesen Polymorphismen gehört der
Amelogenin-Dimorphismus der Gonosomen X und Y.
Er wird durch PCR-Amplifikation und Elektrophorese dargestellt. Es gibt zahlreiche andere
SIDPs auf allen Chromosomen, die aber in der forensischen Medizin bisher nicht etabliert
sind.
1.1.4.3 Repetetive DNA und damit assoziierte Polymorphismen
Das Vorkommen von Sequenzwiederholungen innerhalb der DNA werden als repetetive
DNA bezeichnet. Sie tragen auch den Namen Satelliten, Minisatelliten und Mikrosatelliten.
Sie bilden einen hohen Anteil in den nicht kodierenden Abschnitten des Genoms. Sie werden
eingeteilt in verstreut liegende Sequenzwiederholungen (interspersed repeats) und strukturell
hintereinander geschaltete Wiederholungseinheiten (tandem repeats). Ihr Vorkommen in der
Struktur der Kern-DNA ist aus der Abbildung 1 (übernommen aus Strachan 1994) ersichtlich.
14
menschliches Genom
3 000 000 kb
20-30%
70-80%
extragene DNA
Gene und genähnliche
Sequenzen
70-80%
<10%
20-30%
>90%
codierende
DNA
nichtcodierende
DNA
Einzelkopie
oder niedrige
Kopienzahl
schwach- und
hochrepetitiv
40%
Pseudogene
Introns, Leader,
Trailer usw.
60%
Verstreut liegende
Wiederholungen
gehäuft liegende
Sequenzwiederholungen
Genfrag mente
SINEs
LINEs
klassische
Satelliten- DNA
MikosatellitenDNA
Minisatelliten
DNA
Abbildung 1: Die Organisation des menschlichen Genoms (Nach Strachan, T.)
Tandem-repetetive DNA-Bereiche werden als Satelliten-DNA bezeichnet. Diese Bezeichnung
ergibt sich aus ihrer Eigenschaft, charakteristische Banden in der
Dichtegradientenzentrifugation zu bilden. Satelliten-DNA findet sich zu einem großen Teil in
den Centromeren der Chromosomen. Entsprechend ihrer Größe unterscheidet man
Minisatelliten mit einer Repeatlänge von ca. 9 bis 100 Basenpaaren und Mikrosatelliten mit
kürzeren Repeats (vorwiegend 2-5 bp Repeats). Minisatelliten-Strukturen bezeichnet man
auch als VNTR’s (variable number of tandem repeats). Mikrosatelliten werden auch Short
Tandem Repeats (STR’s) genannt.
Die Entstehung der hochpolymorphen DNA-Bereiche wird durch eine hohe Mutabilität dieser
Bereiche während der Meiose verursacht. Als hauptsächlichen Mechanismus bei der
Herausbildung von VNTR- Polymorphismen gelten ungleiches Crossing over und
Fehlpaarung durch Strangverschiebung (slippage Mutationen) (Krawczak und Schmidtke
1994).
15
Satelliten, Minisatelliten [auch Variable Number of Tandem Repeat Polymorphismen
(VNTR’s)] und Mikrosatelliten tragen zur Ausbildung von Polymorphismen bei, die nach
DNA-Restriktion und Elektrophorese durch Hybridisierung mit Multilocussonden (MLS) und
Singlelocussonden (SLS) nachgewiesen werden können. Wenn VNTR’s mittels PCR
amplifiziert werden (z.B. D1S80, ApoB, YNH22 u. a), werden sie meist zu AmpFLPs.
Mikrosatelliten werden auch als Short Tandem Repeats (STRs) bezeichnet. Sie werden durch
PCR-Amplifikation und anschließender Elektrophorese analysiert.
Polymorphismen, die auf einer variablen Anzahl von Repeats beruhen sind normalerweise
durch eine multiple Allelie gekennzeichnet. Der Übergang zu den SIDPs ist fließend, weil die
molekulare Grundlage für einen SIDPs oft ein einfacher Repeat ist. Danach könnte man die
SIDP-Allele s / l auch nach der üblichen der STR- Nomenklatur 1 / 2 bezeichnen.
16
1.1.5
Übersicht zur forensischen DNA-Analyse
Abstammungsuntersuchungen und Identitätsnachweise für nichtidentifizierte Leichen,
Skelette u.ä., sowie für Spuren sind ein wichtiges Aufgabengebiet für die Rechtsmedizin. In
der Vergangenheit wurden für diese Tätigkeiten häufig Blutgruppen- und
Proteinpolymorphismen (soweit möglich) untersucht. Seit etwa 15 Jahren zählt die
Anwendung der DNA-Analyse zu den effektivsten Techniken.
Die unterschiedlichen Polymorphismen werden mit der Nennung der Darstellungstechnik in
der Tabelle 1 - 5 aufgeführt.
Sotherntechnik zum Nachweis von RFLPs
(Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen)
VNTR (variable number of tandem-repeats)
Sotherntechnik mit MLS (Multilocussonden)
Sotherntechnik mit MLS (Multilocussonden)
Sotherntechnik SLS (Singlelocussonden)
PCR (Polymerasekettenreaktion)
Amplifikation von Fragmentlängenpolymorphismen
(AmpFLP)
Amplifikation von STR (Short-Tandem-Repeats,
Mikrosatelliten)
Amplifikation des Amelogenindimorphismus zum:
Geschlechtsnachweis
Amplifikation von STRs auf Gonosomen
Multiplex-PCR zur Amplifikation multipler Loci
Mitochondriale D-Loop Sequenzierung
Sequenzpolymorphismen-Oligotyping
Heteroduplex-Analyse
SSCP-Analyse (single strand conformation
polymorphism)
RAPD-Amplifikation (random amplified polymorphic
DNA)
Genotypisierung von klassischen Blutgruppenmerkmalen mittels PCR
Digitale DNA-Typisierung (MVR)
SNP(single nucleotide polymorphisms)Analyse mittels
dot-Hybridisierung (und anderer Techniken)
Tabelle 1 - 5: Methoden und Techniken in der Rechtsmedizin
17
Botstein et al. 1980
Nakamura et al. 1987a
Jeffreys et al. 1985, 1985a
Schäfer et al. 1988
Wong et al. 1987, Nakamura 1987
Saiki et al. 1985, 1988, Mullis et al 1986,
Mullis und Faloona 1987
ApoB: Boerwinkel et l. 1989
D1S80: Nakamura et al. 1988
Weber und May 1989, Edwarts et al. 1991
Nakahori et al 1991
HPRT: Hearne und Todd 1991
Y-Chromosom: de Knijff et al. 1997
Kimpton et al. 1993
Anderson et al. 1981, Lutz et al. 1998
Saiki et al. 1989, Herrin et al. 1994
Wilkin et al. 1993, Szibor et al. 1996a
Orita et al. 1989, Lucas et al. 1997
Williams et al. 1990
AB0: Lee und Chang 1992
MN: Nakayashiki und Sasaki 1996
Jeffreys et al. 1990, 1991
Chakraborty et al. 1999
Gill et al. 2000
DNA-Chips : Chee et al. 1996
1.1.6
Untersuchung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen in der
Rechtsmedizin
Der Nachweis einzelner Punktmutationen anhand des Verlustes oder der Entstehung von
Restriktionsschnittstellen (Wyman und White I980 [239]) war für die rechtsmedizinische
Anwendung nur von untergeordneter Bedeutung. Mit Hilfe von Restriktionsenzymen können
die aus diesen Mutationen resultierenden Längenpolymorphismen im menschlichen Genom
nachgewiesen werden.
Der Nachweis der Restriktionsfragmente erfolgt mittels elektrophoretischer Auftrennung
restringierter DNA im Southernverfahren und Sondenhybridisierung. Die
Restriktionspolymorphismen können mit Singlelocussonden als so genannte
Restrikionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) detektiert werden.
Die untersuchten RFLPs sind jedoch häufig mit VNTR (Variable Number of Tandem
Repeats)-Polymorphismen vergesellschaftet. Hierbei handelt es sich ebenfalls um
Längenpolymorphismen. Sie werden hervorgerufen durch eine Variabilität der Anzahl von
Repeats in Satteliten- bzw. Minisatelliten-DNA. Der Nachweis erfolgt ebenfalls durch die
Hybridisierung von Singlelocussonden auf elektrophoretisch aufgetrennten DNAFragmenten. Als Singlelocussonden fungieren längere DNA-Sequenzen, die man durch
Klonierung oder auch durch PCR gewinnt und die im Genom singulär vorkommen. Sie
detektieren demzufolge auch nur einen einzigen Locus.
Wenn Oligonucletidsequenzen wie z. B. (CAC)5 als Sonden eingesetzt werden, so
hybridisieren diese an vielen Loci. Sie werden deshalb Multilocussonden genannt. Sie bilden
bei der Hybridisierung auf einem Southern-Blot ein strichcodeähnliches Muster das
personenspezifisch ist. Für solche Muster wurde der Begriff „genetischer Fingerabdruck“
eingeführt. In der Entwicklungszeit dieser Techniken wurden von Wong et al. 1987
Multilocussonden eingesetzt, um aus menschlicher DNA locusspezifische Sonden (SLS) zu
selektieren. Sie weisen eine höhere Sensitivität auf.
Durch diese definierten Loci waren formalgenetische Überprüfungen und exakte statistische
Auswertungen bei der Anwendung in der Rechtsmedizin möglich.
MLS- Verfahren werden in der Rechtsmedizin nicht mehr eingesetzt, weil die Genetik der
dadurch detektierten Marker unübersichtlich ist.
18
Die Variabilität der Minisatelliten kann auf dem Wege der Southerntechnik durch Einsatz der
SLS oder durch Amplifikation der AmpFLP untersucht werden. Beide Verfahren sind sehr
aussagekräftig.
Identitäts- und Abstammungsuntersuchungen in der Rechtsmedizin können aus prinzipiellen
Gründen nur Ausschlussverfahren sein. Werden in einem Abstammungsfall keine Ausschlusskonstallationen sondern nur Einschlüsse gefunden, so folgt eine biostatistische Bewertung der
Analysenergebnisse. Dabei wird eine Abstammungswahrscheinlichkeit errechnet. Sie gibt
darüber Auskunft , wie hoch die Wahrscheinlichkeit ist, dass eine bestimmte Konstellation
durch Abstammung bedingt ist (alternativ ausgedrückt, wie hoch die Wahrscheinlichkeit ist,
dass das Ergebnis durch Zufall eingetreten ist). Grundlage der biostatistischen Berechnung
sind populationsgenetische Datenbanken. Diese geben Auskunft darüber, wie häufig die im
Test bestimmten Allele in der Vergleichspopulation vorkommen. Im Spurenfall wird für die
Zuordnung eines DNA-Musters zu dem Muster einer Vergleichsperson (z.B. Opfer oder
Tatverdächtiger) ein analoges biostatistisches Verfahren angewandt.
Zur Erstellung von Datenbanken müssen für jedes DNA-System anhand einer ausreichenden
Stichprobe von Individuen einer ethnisch einheitlichen lokalen Population Allel- und
Genotypenfrequenzen bestimmt werden. Voraussetzung für die Anwendung der ermittelten
Daten ist, dass in Bezug auf die Allelverteilung keine Abweichungen vom
Hardy-Weinberg-Gleichgewicht vorliegen. Die ermittelten Daten sind daher mit
entsprechenden Testverfahren zu prüfen.
In der Abstammungsbegutachtung ist die Möglichkeit von Keimbahnmutationen zu
berücksichtigen. Bei hochpolymorphen DNA-Systemen ist damit zu rechnen, dass es zum
Auftreten neuer Mutationen kommt. Zur Bestimmung von Mutationsraten sollte eine
möglichst große Zahl von Meiosen untersucht werden.
Die Einführung der Polymerasekettenreaktion (PCR) als eine Methode zur Vervielfältigung
von ausgewählten DNA-Abschnitten eröffnete eine neue Dimension in der forensischen
DNA-Analyse. RFLP-Systeme konnten mit dieser Technik fortgeführt werden.
Bei den amplifizierten Fragmentlängenpolymorphismen (AmpFLP) handelt es sich um
VNTR- Systeme mit Repeatgrößen von etwa 10 bis 70 Basenpaaren und Fragmentlängen bis
zu etwa 1200 Basenpaaren.
Mikrosatelliten sind Tandem- Repeats mit einer Länge von 1 bis 6 Basenpaaren (Tautz 1993)
19
bzw. es wird nach Edwards et al. (199I) bei Größen der Repeatelementen von 2 bis 7
Basenpaaren von Short-Tandem-Repeats (STR) gesprochen. Die Häufigkeit von tri- und
tetrameren Repeatpolymorphismen im Genom wird auf ca. 200000 geschätzt (Puers et al.
1993). Es sind Systeme verschiedenster Fragmentlängen und Polymorphiegrade etabliert und
weltweit Populationsdaten gesammelt worden (Huckenbeck et al. 1997).
Die PCR-Technik ermöglichte eine beachtliche Sensitivitätssteigerung. Mussten für die aufwendige Sondenhybridisierung mehrere Mikrogramm DNA eingesetzt werden, so können
mittels PCR und anschließender Laserfluoreszenzdetektion Mengen von weniger als 100
Pikogramm typisiert werden. Diese DNA-Polymorphismen sind auch für archäologische
Fragestellungen interessant geworden (Pääbo et al. 1989).
Neben der Möglichkeit des Geschlechtsnachweises mittels PCR (Amelogenin-System) finden
für spezielle Fragestellungen zunehmend gonosomale STR-Systeme Anwendung. MultiplexSysteme können den Arbeitsaufwand bei DNA-Typisierungen erheblich minimieren.
Die kombinierte Analyse einzelner DNA-Loci und damit die Erstellung eines sogenannten
DNA-Profiles wird aufgrund ihrer hohen Aussagekraft wieder als DNA-Fingerprinting
bezeichnet und hat in mehreren Ländern zum Aufbau von DNA-Datenbanken zur besseren
Verbrechensbekämpfung geführt.
Neben der weit verbreiteten STR-Analyse gibt es noch andere Möglichkeiten DNAPolymorphismen für forensische Fragestellungen zu nutzen. Sequenzpolymorphismen können
auch über eine Hybridisierung (Dot-Blot) mit allelspezifischen Oligonukleotiden
nachgewiesen werden. Das ist allerdings in jüngerer Zeit kaum noch üblich. Die
Heteroduplex-Analyse und Einzelstrangkonformationsanalyse (SSCP) ermöglicht ein
Screening von Sequenzvarianten und Punktmutationen. Während die STR-Systeme
weitgehend artspezifisch sind (Crouse und Schumm 1995), kann man mit Hilfe der
RAPD-PCR (Zufallsprimer, arbitrarily primed PCR) unter anderem Artnachweise
durchführen.
Mittels PCR lassen sich auch klassische Blutgruppensysteme typisieren. lm ABO-System ist
damit eine direkte Genotypisierung möglich. Auf DNA-Ebene wurde hier eine größere
Variabilität gefunden als bisher mit Hilfe von Antiseren und Agglutinationstechniken
nachweisbar war.
Eine kombinierte Untersuchung hochvariabler Fragmentlängen- und Sequenzpolymorphismen
stellt das digitale DNA-Fingerprinting (MVR-PCR: minisatellite variant repeat mapping) dar.
Die Zukunft liegt möglicherweise in der semiautomatischen Multiplex-Typisierung von SNPs
(Krawczak 1999). Es handelt sich um die häufigste Sequenzvariation im menschlichen
20
Genom, die durchschnittlich aller 1000 Nucleotide auftritt. Damit sind im menschlichen
Genom 106 - 107 SNPs zu erwarten.
Die Anwendung von DNA-Polymorphismen in der Rechtsmedizin erfordert eine gründliche
Validierung der Systeme.
Die Vielzahl polymorpher DNA-Marker im menschlichen Genom erlaubt es, die geeignetsten
auszuwählen. Zu den Auswahlkriterien zählen in erster Linie eine gute methodische
Handhabbarkeit sowie hohe forensische Effizienz. Das heißt, es sollten in dem
anzuwendenden System möglichst viele verschiedene Allele mit niedrigen Einzelhäufigkeiten
existieren. Für die Charakterisierung der Polymorphismen werden u.a. die Heterozygotierate
(Het) bzw. der polymorphic information content (PIC), Diskriminationskraft (power of
discrimination, PD) für Individualisierungen in Spurenfällen und die Allgemeine
Vaterschaftsausschlusschance (AVACH bzw. MEC [englischer Begriff]) im
Abstammungsfall angegeben.
Tetranukleotidmarker sind die am häufigsten eingesetzten STR-Marker in der Rechtsmedizin.
Sie sind relativ unanfällig für das Auftreten von Stotterbanden und die Fragmente lassen sich
sicher auftrennen. Zunehmend werden Polymorphismen angewandt, die Zwischenallele (das
sind unvollständige Repeats) enthalten, und sich nur um 1 bis 2 Basenpaare von den
“regulären" Repeats unterscheiden. Sie stellen höhere Anforderungen an die Analysetechnik
und erfordern eine gewisse Erfahrung bei der Typisierung. Sequenzvarianten innerhalb von
Fragmenten gleicher Repeatgröße können besonders unter nichtdenaturierenden
Elektrophoresebedingungen unterschiedliche Trennverhalten zeigen. Daher müssen die
Polymorphismen auch auf ihre Sequenzstruktur untersucht werden, um eine internationale
Standardisierung zu ermöglichen. Um den Einsatz verschiedener Primer und damit
unterschiedlich langer Fragmente vergleichbar zu machen, werden die Allele entsprechend
internationalen Nomenklaturfestlegungen nach ihrer Repeatanzahl bezeichnet.
Wichtige Kriterien für den forensischen Einsatz von STR-Systemen sind die Sensitivität und
ihre Effektivität bei der Typisierung degradierter DNA. So können z.B. für stark degradierte
DNA aus biologischen Spuren nur noch Systeme mit kurzen Fragmenten (ca. 90 bis 150 bp)
eingesetzt werden, dabei muss meist ein geringer Polymorphiegrad in Kauf genommen
werden. Hochpolymorphe STR-Systeme weisen in der Regel auch längere variable Regionen
auf, so dass die PCR-Produkte entsprechend größer sind (ca. 200 bis 350 bp).
21
1900
DNA-Polymorphismen
Jahr
Jeffreys MLS
1985 Minisatelliten
SLS: MS43/ 31/ 1
1987
YNH24
1990
PCR für VNTRs und STRs
STR: TH0
VWA
Amp FLP’s: Apo B
SE33 D21S11
D1S80, YNH22
X- und Y- chromos. Syst.
2000
Tabelle 1 - 6: Zur zeitlichen Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der DNA-Systeme
1.1.7
Mitochondrien Polymorphismen
Das humane Mitochondrien-DNA-Molekül wurde erstmalig von Anderson et al. 1981
sequenziert und ausführlich charakterisiert. Diese so genannte Anderson-Sequenz gilt seither
als Referenzsequenz für die Beschreibung von individuellen mt-Sequenzen. In der
forensischen Praxis ist es üblich, nur die Abweichungen zur Referenzsequenz anzugeben.
Diese wird auch als CRS (Cambridge Reference Sequence) bezeichnet. Die
Mitochondrienanalyse konnte sich für den rechtsmedizinischen Gebrauch erst mit der
Entwicklung der Direktsequenzierung und der Verbreitung von automatischen Genscannern
etablieren. Erste größere Populationsstudien geben einen Eindruck von der Variabilität von
mtDNA-D-Loop-Sequenzen. Die ausschließlich mütterliche Vererbung gehört zu den
Eigentümlichkeiten der mtDNA. In der forensischen Anwendung bildet sie die Grundlage für
außerordentlich effiziente Abstammungsnachweise, die sich in mütterlichen Linien auch über
viele Generationen ausführen lassen. Die im Vergleich zur Kern-DNA höhere Mutationsrate
22
bedingt eine "zügige" mitochondriale Evolution. Durch diesen Umstand ist die Brauchbarkeit
der mt-Analyse für die Untersuchung von Evolutionsfragen begünstigt. Die humane
mitochondriale DNA ist ringförmig und umfasst 16.569 Basenpaare. Die nicht kodierende
Kontrollregion (D-Loop) mit etwa 1.300 Basen enthält drei hypervariable Regionen, in denen
sich in evolutionären Zeiträumen Punktmutationen angesammelt haben. Da sich in jeder Zelle
1.000 bis 10.000 Mitochondrien befinden, erhöht sich die Sensivität der DNA-Spurenanalytik
gegenüber den PCR-Systemen der Kern-DNA um eine Zehnerpotenz. Die höhere Stabilität
gegenüber Degradationseinflüssen bedingt die hervorragende Eignung auch bei extrem alten
oder ungünstig gelagerten Spuren und Knochen. Mitochondriale DNA ist neben
STR-Polymorphismen auf dem Y-Chromosom ausgezeichnet für evolutionsbiologische
Studien geeignet (Stoneking et al. 1990).
Die bisher umfangreichste Datensammlung mitteleuropäischer mtDNA-Sequenzen ist die "DLoop-Base". Sie enthält über 1.700 forensisch sichere Sequenzen, die von 15
Universitätsinstituten Deutschlands, Österreichs und der Schweiz analysiert und autorisiert
wurden. Datenbankrecherchen zur Komplettierung von mtDNA-Spurengutachten werden auf
Anforderungen innerhalb von Tagen zur Verfügung gestellt (http://d-Loop-Basen.de).
Die Mitochondrienpolymorphismen werden an dieser Stelle der Vollständigkeit halber
aufgeführt. Sie sind nicht Gegenstand der Kartierung.
23
1.2
Zur Lokalisierung von Genen und molekularen Markern auf den Chromosomen Grundlagen der ungekoppelten und gekoppelten Vererbung
Gregor Mendel erkannte als erster die Grundprinzipien der Vererbung und formulierte sie als
Postulate in den nach ihm benannten „Mendelschen Regeln“. Der Schlüssel zu seinem Erfolg
waren seine Kreuzexperimente an Pflanzen die zwar relativ einfach, jedoch auch mühevoll
waren. Er war der erste, der die Nachkommen eines Kreuzungspaares nach ihren
Eigenschaften gruppierte und quantitativ erfasste. Mendel gilt daher nicht nur als Vater der
Genetik, er ist auch derjenige, der den Einzug der Mathematik in die Biologie vorbereitete.
Die materielle Basis für die Mendelschen Regeln wurden erst durch die Entdeckung der
Chromosomen verständlich.
Abbildung 2: Gregor Johann Mendel (1822-1884)
Das experimentelle Vorgehen Mendels diente als Grundlage für anspruchsvollere Methoden,
die, die Thomas Hunt Morgan und seine Kollegen entwickelten. Thomas Hunt Morgan
erkannte, dass die Erbanlagen (Gene) offenbar in Form von perlschnurartigen Reihen auf den
Chromosomen angeordnet sind. Morgan beschrieb auch die Mechanismen der gekoppelten
und ungekoppelten Vererbung. Gene, die auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind
werden ungekoppelt vererbt. Merkmale, die auf dem gleichen Chromosom liegen, werden
umso häufiger gekoppelt vererbt, je dichter sie benachbart sind. Mit zunehmender Entfernung,
nimmt die Häufigkeit einer Entkopplung zu. Der Mechanismus der Entkopplung ist das
„Crossing over“. Die Lockerung der Kopplung kann mit zunehmender bis zur völligen
Entkopplung führen. Diese ist dann erreicht, wenn die gemeinsame Vererbung zweier
Merkmale ebenso häufig vorkommt, wie es nach dem freien Zufall bei ungekoppelten
24
Merkmalen der Fall wäre. Dies geschieht dann in 50% der Meiosen und entspricht
definitionsgemäß dem einer genetischen Distanz von 50 Zentimorgan (cM).
Werden gekoppelte Loci beispielsweise in 1% der beobachteten Meiosen getrennt, so
entspricht die genetische Entfernung definitionsgemäß 1cM. Die genetische Entfernung
gemessen in cM steht mit der physischen Entfernung gemessen in bps (kb und Mb) in einem
Zusammenhang. Als grobe Faustregel lässt sich angeben, dass die physische Distanz von 1Mb
etwa einem Zentimorgan (cM) entspricht. Allerdings ist die Beziehung nicht streng
proportional und richtet sich auch nach der Lage der Marker auf dem Chromosom.
Morgan erarbeitete Chromosomenkarten, in denen jedem Gen eine spezifische Position
zugeordnet wurde. Er erhielt für die Aufklärung von genetischer Kopplung und die
Entdeckung des Crossing-overs 1933 den Nobelpreis für Medizin.
Abbildung 3: Thomas Hunt Morgan (1866-1945)
25
1.3
Richtlinien der ISFHG
Die Richtlinien für die Erstattung von Abstammungsgutachten, herausgegeben vom Robert
Koch-Institut (Bundesinstitut für Infektionskrankheiten und nicht übertragbare Krankheiten),
wenden sich an den in einem gerichtlichen Verfahren gem. §§ 144, 404 ZPO oder § 73 stopp
beauftragten Sachverständigen und gelten auch für andere Abstammungsgutachten in
behördlichem oder privatem Auftrag. Die Richtlinien stellen für die bei der
Abstammungsbegutachtung anzuwendenden Untersuchungen Mindestanforderungen auf.
So darf ohne richterlichen Beschluss die Abstammung eines Menschen nur mit seiner
Einwilligung oder bei Geschäftsunfähigkeit der seines Sorgeberechtigten untersucht und
festgestellt werden. Ebenso muss die Identität der zu untersuchenden Person eindeutig
feststellbar sein.
Das Untersuchungsgut (Blutprobe, Mundschleimhautabstrich) muss durch einen Arzt
entnommen werden. Eine Blutprobe erlaubt hierbei die maximalen Analysemöglichkeiten.
Hierbei muss auf eine eventuelle Blutübertragung in einem Zeitraum von drei Monaten
geachtet werden. Bei Neugeborenen sollte eine Altersgrenze von 8 Monaten eingehalten
werden, insofern Systeme untersucht werden, die erst nach der Geburt ausreifen.
Auch für Probenentnahme und Transport wurden Standarts eingeführt, welche beachtet
werden müssen. Hierbei stehen der Schutz vor Verunreinigung und die Identitätssicherung im
Vordergrund.
Die Untersuchungen werden in doppelten, getrennt durchzuführenden Testansätzen
durchgeführt und das Mitführen einer bekannten Kontrollprobe ist in allen Ansätzen
vorgeschrieben.
Für die Analytik werden nur hinreichend evaluierte Systemkategorien benutzt. Dazu zählen
(einzeln oder in Kombination) Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLP),
Mikrosatelliten-Polymorphismen (mindestens Tetramere) (STR), das HLA-System
und Kombinationen aus: Erythrozyten- Membranantigenen, Serum-Proteinen und
Erythrozyten-Enzymen . Beweiswert und Beweissicherheit haben dabei höchste Priorität.
Dabei ist unerlässlich, dass die eingesetzten analytischen Verfahren eine kombinierte
Allgemeine Vaterschafts- Ausschluss-Chance (AVACH) von mindestens 99,99 Prozent
erreichen. Die AVACH spiegelt die Effizienz eines Systems wieder.
Negativkriterien sind u.a.: ungünstige Reproduzierbarkeit, hohe Neumutationsraten, hohe
Frequenz stummer Merkmale, Hinweise auf Abweichen des Hardy-Weinberg-
26
Gleichgewichtes, Systeme mit unbekannten chromosomalen Positionen (z.B. DNA-MultiLocus-Systeme und Single-Locus-Systeme mit unbekanntem Genort.
Hier ist noch einmal besonders zu erwähnen, dass nur solche Systeme mit bekannten
chromosomalen Positionen untersucht werden sollen.
Die Richtlinien empfehlen eine Kombination der konventionellen Blutgruppensysteme mit
HLA- oder DNA-Systemen: Das Gutachten soll mindestens zehn Loci mit unabhängigem
Erbgang umfassen. HLA-System oder DNA-Polymorphismen sind im Grundsatz nur in
Verbindung mit (weiteren) herkömmlichen Systemen einsetzbar. Das Standardgutachten
sollte aus einer Auswahl von mindestens je zwei Loci aus mindestens vier der folgenden
Systemkategorien bestehen:
Erythrozyten-
Serum- Proteinsysteme
Membranantigene
Erythrozyten-
HLA-
DNA-Single-Locus-
Enzymsysteme
System
Polymorphismen
AB0
GC (Group-specific
PGM1 (Phospho-
Serologisch
MNSs
component)
glucomutase-1)
nachweisbare
RH (Rhesus)
PI (Alpha-1-Antitrypsin)
ACP (Acid
Antigene der
JK (Kidd)
F13B (Faktor-13B)
phosphatase)
weissen Blut-
FY (Duffy)
HP (Haptoglobin)
GPT (Glutamat-
körperchen
A2HS (Alpha-2-HS)
Pyruvat-
ORM (Orosomucoid)
Transaminase)
TF (Transferrin)
GLO (Glyoxalase)
PLG (Plasminogen)
ESD (Esterase D)
BF (Properidin-Faktor B)
C3 (3. Komplementkomponente)
Eine Erweiterung des Gutachtens verstößt nicht gegen die Richtlinien, wenn die
Untersuchung im Einvernehmen mit dem Auftraggeber erfolgt und es sich um Systeme
handelt, die unter Beachtung der in den Richtlinien dargelegten Grundsätze untersucht
worden sind.
27
1.4
Lokalisation von Markern/Kopplung
Bei der Anwendung autosomaler DNA-Marker in der Rechtsmedizin werden in den meisten
Fällen Marker kombiniert, die auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind und
demzufolge unabhängig voneinander segregieren. Für die statistischen Berechnungen ist
somit die Anwendung der Multiplikationsregel statthaft. Sollen jedoch mehrere Marker des
gleichen Chromosoms eingesetzt werden, so ist eine Klärung der Lokalisation unumgänglich.
Die Richtlinien für die Erstattung von Abstammungsgutachten (Robert-Koch-Institut 1996)
erfordern für eng gekoppelte Marker die Testung auf Kopplungsungleichgewicht. Erst wenn
bekannt ist, welche Marker innerhalb der Chromosomen so weit voneinander entfernt sind,
dass keine Kopplung vorliegt und eine unabhängige Vererbung gesichert gilt, können diese
Marker kombiniert angewendet werden. Andererseits wäre es günstig, ein Set von eng
gekoppelten Markern zu finden und zu charakterisieren, die in der Meiose in Form von
Haplotypen erhalten bleiben. Ein solches Beispiel ist bereits mit dem Rh-Locus mit den
Allelpaaren Cc/ Dd/ Ee gegeben. Wenn sich solche Konstellationen fänden, bei dem jedes
Einzellocus viele Allele hat, ließen sich damit bei entsprechenden Personenkonstellationen
Defizienzfälle über mehrere Generationen aufklären.
1.4.1
Bedeutung der Kartierung von Markern für die Richtigkeit forensischer
Aussagen
Die Bedeutung möglicher Kopplung zwischen forensischen Markern für die Richtigkeit
forensischer Aussagen ist im Prinzip bekannt, wird aber zu häufig nicht beachtet. Befinden
sich genetische Marker im Genom dicht benachbart, so ergibt sich nicht nur die Möglichkeit
der gekoppelten Vererbung sondern in dessen Folge können sich für eine gegebene
Population auch Kopplungsungleichgewichte (linkage disequilibrium = LDE) ausgebildet
haben. In diesem Falle bilden manche Allele der gekoppelten Marker vorzugsweise
miteinander Haplotypenkombinationen, deren Frequenz sich nicht aus den
Einzelallelfrequnzen der involvierten Systeme herleiten lassen. Bei Existenz eines LDE sind
die Allelfreqenzen der beteiligten Systeme keine voneinander unabhängigen Variablen. Die
Häufigkeit eines im Spurenfall vorgefundenen Genotyps ließe sich dann nicht wie üblich aus
der Allelfrequenz der einzelnen Systeme berechnen. Es gilt das Prinzip, dass der gleichzeitige
Gebrauch von enggekoppelten Markern einen Test auf die Existenz eines möglichen LDE
voraussetzt. Die Spurenkunde ist in der Praxis vom Fehlerpotenzial dieser Problematik nur
28
wenig betroffen. In Hinsicht auf die Materialökonomie werden heute zur Spurenanalyse
ausschließlich amplifizierbare Polymorphismen eingesetzt. Hier sind die Verhältnisse meist
überschaubar. Trotzdem gilt die getroffene Aussage prinzipiell auch für die Spurenkunde. Die
Systemauswahl sollte immer dann kritisch geprüft werden, wenn Marker des gleichen
Chromosoms zum Einsatz kommen. Ob sie als Kandidaten für die Existenz eines LDE in
Frage kommen, kann schon vorab entschieden werden, wenn Informationen zur genetischen
Distanz zwischen den Markern eingeholt werden können.
Im Abstammungstest ist die Notwendigkeit, Kopplung genetischer Marker zu beachten, viel
gravierender als in der Spurenkunde. Die Einbeziehung von Kopplungsgruppen in
Abstammungsgutachten gebietet nicht nur Fragen eines eventuellen LDE zu beachten,
sondern man muss sich bewusst sein, dass Merkmale eines Markerclusters auch vorzugsweise
gemeinsam vererbt werden. Selbst bei Fehlen eines LDE sind somit die erhaltenen
Informationen nicht als voneinander unabhängig zu werten. Dieses Problem kann sich in
sogenannten Verwandten- bzw. Defizienszfällen so stark auswirken, dass eine
Nichtbeachtung dieser Zusammenhänge zu groben Fehlern führt. Dieser Sachverhalt wird an
einem Fallbeispiel demonstriert.
1.4.2
Radio-Hybrid-Mapping
Beim Radio- Hybrid-(RH)-Mapping (Cox et al. 1990) werden durch radioaktive Strahlung
erzeugte Chromosomenfragmente in Hybridzellen kloniert. Aus solchen Hybridzellen werden
Zelllinien generiert aus denen letztlich ein Set an DNA-Extrakten zusammengestellt wird.
Diese stehen zur Durchführung von PCR-Versuchen mit Primern aus der zu prüfenden DNASequenz zur Verfügung.
Ein Vergleich der Retentionsmuster verschiedener DNA-Marker erlaubt Aussagen über ihre
physische Kopplung.
29
Abbildung 4: Herstellung von Mensch-Hamster-Hybridzellkulturen
Das Stanford G3 Radiation Hybrid Panel RH01 enthält 83 DNA-Proben von
Hybridzellkulturen Mensch-Hamster. Dafür wurde eine humane diploide LymphoblastoidDonorzelllinie Röntgenstrahlung in einer Dosis von 10000 rad ausgesetzt (Abbildung 1-4).
Die resultierenden DNA-Fragmente weisen eine durchschnittliche Größe von 4 Mb auf. Nach
einer Fusion der humanen Donorzellen mit den Thyminkinase-negativen Hamsterzellen
erfolgt eine HAT-Selektion der Hybridzellen. Die menschlichen DNA-Fragmente können in
den Hybridzellen als separate Minichromosomen vorliegen oder mit den HamsterChromosomen rekombinieren. Der Anteil des menschlichen Genoms, der in den einzelnen
Hybridzellen erhalten bleibt, wird mit 18% angegeben. Mit mehrfachen PCR-Ansätzen
werden die Hybridzellen auf das Vorhandensein des zu untersuchenden Markers getestet, man
erhält ein Retentionsprofil. Dieses Retentionsprofil wird mit dem bereits bekannten Marker
durch die Anwendung einer 2-Punkt-LOD-Score-Auswertung verglichen. Zwischen Markern,
die im menschlichen Genom eng beieinander lokalisiert sind, werden statistisch seltener
DNA-Brüche beobachtet als in entfernteren.
Die Maßeinheit [cR] ist damit ein Maß für die Anzahl der Brüche zwischen zwei Markern.
Die Wahrscheinlichkeit von DNA-Brüchen pro physischer Entfernung (in Basenpaaren)
steigt, wenn die Bestrahlungsdosis erhöht wird. Mit TNG4 ist ein weiteres Panel erhältlich,
das infolge einer Strahlendosis von 50000 rad eine höhere Auflösung ermöglicht.
Mittlerweile wird die Kartierung des menschlichen Genoms mit verschiedenen Methoden
durchgeführt, die sich gegenseitig ergänzen. Dies erlaubt die Integration genetischer,
30
physischer und zytogenetischer Karten (Cohen et al. 1993). Eine Basisstrategie wurde von
Hudson et al. (1995) beschrieben, der mittels STS-content-Mapping (Green und Green 1991),
RH-Mapping und genetic-linkage-Mapping (Murray et al. 1994) erstellte Karten kombinierte.
Ausgehend von großen sich überlappenden Klonen (Olson et al. 1986) wie YACs (yeast
artificial chromosomes, ca. 0,5 bis 1 Mb groß) bzw. BACs (bacterial artificial chromosomes,
ca. 50 kb groß) erfolgt eine so genannte Sequenzetikettierung anhand von im Genom einmalig
vorkommenden Sequenzen (STS = sequence tagged sites) bzw. ESTS = expressed sequence
tagged sites, aus codierenden DNA-Sequenzen, cDNA).
Während RH-Mapping und genetische Kartierung Aussagen zur Kopplung über große
Entfernungen erlauben, können mit Hilfe von STS-Markern kurze Abschnitte charakterisiert
werden.
1.4.3
Contig- Datenbanken
Im Human Genom Projekt wurde bis auf minimale Restbestände das gesamte Humangenom
sequenziert. Die Sequenziertemplates waren große DNA-Fragmente, die meist in Hefen
kloniert worden waren. Die so hergestellten Fragmente waren überlappend, so dass eine
kontinuierliche Sequenzschreibung gelang. Viele forensische Marker lassen sich in zwischen
direkt in einer Contig- Datenbank auffinden und somit genau lokalisieren. Da die Bank
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/ erst nach Abschluss der hier vorgelegten Recherche
ins Netz kam, wurden hier noch 3 Marker mit Hilfe des dem Rh-Mappings zugeordnet.
31
1.5
Zielstellung
Die Entwicklung der DNA-Technologie hat uns eine praktisch unbegrenzte Anzahl von
genetischen Markern beschert, die für forensische Fragen angewendet werden können. Diese
Marker lassen sich verschiedenen Kategorien zuordnen: klassische Systeme, HLA-Systeme,
SLS, AmpFLP's, STR's, SNP's und neuerdings SIDP's (Short Insertion Detection
Polymorphisms). In Deutschland wird vielfach dafür plädiert, bei Abstammungsfragen
Marker aus verschiedenen Systemkategorien einzusetzen. Die Zuordnung ist aber weitgehend
willkürlich und in manchen Fällen nur historisch bzw. methodisch bedingt. Zum Beispiel
ließen sich manche klassische Marker ihrer Natur nach auch als SNP's bezeichnen, manche
SLS-Loci können als AmpFL's dargestellt werden u. manche SIDP's sind eigentlich ZweiAllel-STR's. Für forensische Belange sollten ausschließlich Fragen der analytischen
Sicherheit sowie biologische Parameter wie zum Beispiel Mutabilität, Allelverteilung und die
gesicherte Lokalisation als Auswahlkriterien dienen. Die Bedeutung der genauen Kartierung
für die Richtigkeit einer Aussage wird nicht selten unterschätzt. Man kann beobachten, dass in
komplizierten Abstammungsgutachten Marker kombiniert werden, deren Lokalisation nicht
bzw. nur ungenau bekannt ist. Die Datenbankrecherchen sind aufwändig und führen für
manche Marker auch nur zu unzureichenden Resultaten.
Diese Arbeit soll eine Übersicht zur Lokalisation der in der forensischen Medizin
angewendeten Marker erstellen und die Basis für eine übersichtliche Darstellung (Poster)
bilden. Die meisten Informationen lassen sich durch eine Internetstudie erarbeiten. Dazu
sollen die einschlägigen Gen-Datenbanken benutzt werden. Für einige Marker ist die genaue
Lokalisation auf diese Weise nicht zu erheben. Deshalb sollte in einigen solchen Fällen ein
Radio- Hybrid- Mapping (RH-Mapping) durchgeführt werden.
32
2 MATERIAL UND METHODEN
33
2.1
Gendatenbanken
Gendatenbanken sind seit dem Ende der achtziger Jahre über das Internet zugänglich. Sie
werden seitdem ständig ausgebaut und ergänzt. Durch den schnellen Zugriff und die
vielfältigen Inhalte sind sie eine wertvolle und geschätzte Informationsquelle für viele
Wissenschaftler.
Diese Arbeit zeigt die Ideogramme der 22 Autosomen, die zytogenetische, physikalische und
genetische Lokalisation der im forensischen Schriftgut genannten Marker. Es berücksichtigt
unabhängig von der Systemkategorie aller Marker, die ab 1990 in den Abstracts von drei
führenden forensischen Journalen und in den Proceedings der ISFH Kongresse genannt sind.
Die Lokalisation wurde durch Recherche Datenbanken und in einigen Fällen mit dem RHMapping ausgeführt.
Im folgenden Teil werden die in dieser Arbeit genutzten Datenbanken aufgeführt.
2.1.1
Genome Database: GDB
(http://www.gdb.org)
Eine zentrale Sammelstelle für Genomdaten ist die 1990 an der „John Hopkins University“ in
Baltimore gegründete „Genome Database“. Sie ging aus der „Humane Genome“-Initiative
hervor und wurde im Frühjahr 1999 vom „Bioinformatics Supercomputing Centre“ (BiSC)
am „Hospital for Sick Children“ in Toronto, Kanada, übernommen.
Die „Human Genome“-Initiative ist ein weltweites Forschungsprojekt, dessen Ziel es ist, die
Struktur der humanen DNA zu analysieren und die Lokalisationen und Sequenzen von über
100.000 menschlichen Genen zu ermitteln. Dies erfolgt in enger Zusammenarbeit mit dem
„Human Genome Project“ (HGP).
Die GDB stellt eine ständig überarbeitete und aktualisierte Enzyklopädie des menschlichen
Genoms zur Verfügung, um so den gegenwärtigen Wissensstand zu reflektieren. Das
Spektrum wird ständig erweitert und ergänzt. Heute enthält die Datenbank Informationen über
Sequenzen, Variationen, Beschreibungen von Variationen und Phenotypen.
Für jeden ist eine Veröffentlichung von Daten möglich. Weiterhin kann man Änderungen zu
bereits bekannten Daten hinzufügen oder „Links“ zu anderen Datenbanken herstellen.
Zur Zeit enthält die GDB Beschreibungen zu folgenden Objekten: „Regions of the human
genom“ (Gene, Klone, Amplimere, PCR Marker, zytogenetische Marker, ESTs und Repeats),
„Maps of the human genome“ (zytogenetische Lokalisationen, physikalische Kartierungen,
34
„Linkage Maps“, „Radiation Hybrid Maps“, „Contig Maps“) und „Variations within the
human genome“ (Mutationen, Polymorphismen, Allelfrequenzen).
2.1.2
National Center for Biotechnology Information: NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
Gegründet wurde diese Datenbank 1988 von Claude Pepper als ein Teil der “National Library
of Medicine” (NLM) am “National Institute of Health” (NIH). Ziel war die Entwicklung einer
neuen Informationstechnologie und die Hilfestellung beim Verständnis von
molekulargenetischen Prozessen. Dazu stehen verschiedene Datenbanken und Software zur
Verfügung. Ein Informationsaustausch besteht mit internationalen Sequenzdatenbänken wie:
„European Molecular Biologie Laboratory“ (EMBL) und der „DNA Database of Japan“
(DDBJ). Weiterhin unterstützt und verteilt die NCBI wissenschaftliche Informationen von
medizinischen und wissenschaftlichen Organisationen, z.B. die „Online Mendelian
Inheritance in Man“ (OMIM), die „Molecular Modeling Database“ (MMDB), die „Unique
Human Gene Sequence Collection“ (UniGene), die „Gen Map of the Human Genome“, den
„Taxonomy Browser“ und das „Cancer Genome Project“ (CGAP). „Entrez“ ist das NCBISuchsystem, das dem Benutzer Zugang zu Sequenzen, Taxonomie, Karten und Strukturdaten
verschafft und welches auch Grafiken zu Sequenzen und Chromosomenmappen enthält.
Eine weltweite Literatursuche ist mit „PubMed“ möglich.
2.1.3
Center for Medical Genetics: CFMG
(http://www.marshfieldclinic.org/)
Als ein Teil der privaten „Marshfield Medical Research Foundation“ wurde 1994 das „Center
for Medical Genetics“ gegründet, dessen Forschungsschwerpunkte die Suche nach
krankheitsverursachenden Genen ist. Ihr Angebot umfasst eine Datenbank mit über 8.000
STR- Loci. Eine wichtige Möglichkeit innerhalb dieser Datenbank stellt die „build your own
map“-Funktion dar, wodurch man in der Lage ist bereits kartierte Marker abzurufen.
35
2.1.4
Cooperative Human Linkage Center: CHLC
(http://www.chlc.org)
CHLC ist ein staatlich unterstütztes Genom-Zentrum unter der Leitung von Jeffrey C.
Murray. Es wurde eine Vielzahl von heterozygoten Genkarten entwickelt, die zahlreiche
PCR-formatierte Mikrosatellitenmarker enthalten.
Die Betonung liegt auf der Einbeziehung von Tri- und Tetranukleotidrepeats in
Genotypdaten.
2.2
Medline- Recherche
Die Übersicht berücksichtigt im wesentlichen Marker, die ab dem Jahre 1990 in den Abstracts
der Journale Int J Legal Med , J Forensic Sci und Forensic Sci Int und in den Proceedings der
ISFG (vormals ISFH) genannt sind und mit dem Medline-Suchsystem aufgefunden werden
konnten. Die Daten zur Kartierung wurden hauptsächlich den Datenbanken entnommen, die
ohne Zugangsbeschränkungen über das World Wide Web zugänglich sind. Diese sind
untereinander „verlinkt“ und integrieren wiederum Daten verschiedener Institute wie
Genethon, Sanger Centre, Stanford usw. Allen Gendatenbanken ist leider gemeinsam, dass sie
nicht alle gewünschten Marker enthalten.
2.3
Darstellung der Befunde
Die hier wiedergegebene Übersicht zur Kartierung forensischer Marker ist eine
Zusammenstellung von Daten und Darstellungen aus den im World Wide Web verbundenen
Datenbanken sowie den wissenschaftlichen Printmedien und enthält nur in wenigen Fällen
eigene Untersuchungsergebnisse. Die Gesamtlänge der einzelnen Chromosomen ist in den
Ideogrammen jeweils unter dem q-Telomer eingetragen. Die senkrecht eingetragenen Linien
geben den Bereich der zytogenetischen Kartierungen von NCBI und GDB wieder. Die in den
Ideogrammen angegebenen genetischen Lokalisationen in Cosambi cM beziffern für die
genannten Marker die Distanz zum p-Telomer. Häufig wird in Datenbanken nur ein
Referenzintervall angegeben. Dieses beschreibt die Lage des Markers im Bereich zwischen
zwei Ankermarkern. Das Referenzintervall lässt sich dann durch Angaben in derselben, ggf.
auch einer anderen Datenbank beziffern. Die Herkunft der Information von einer anderen
Datenbank wird durch ein Buchstabensymbol in Klammern angezeigt. Lagebezeichnungen
aus verschiedenen Datenbanken sind meist nicht ganz identisch, gelegentlich sogar durch
36
größere Differenzen gekennzeichnet. Die Tatsache, dass die Crossing-over-Raten in
männlichen und weiblichen Meiosen differieren, wird in der Marshfield Datenbank
angegeben. Marshfield präsentiert auch Diagramme, die den Quotient der genetischen Lage
weiblich/männlich angeben. Diese Darstellung wurde als Abbildung 8 in diese Übersicht
übernommen, um das Verständnis der hier zusammengetragenen Daten zu erleichtern.
2.4
2.4.1
Erstellung von Retentionsprofilen ausgewählter Marker
Amplifikation mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur selektiven in- vitroAmplifikation ausgewählter DNA-Abschnitte. Oligonucleotid-Primer lagern sich unter
stringenten Bedingungen an geschmolzene DNA und werden von einer DNA-Polymerase als
Starter zur Synthese eines neuen Stranges verwendet. Grundvoraussetzung für eine
erfolgreiche PCR ist die Spezifität der Primer, eine optimale Konzentration Nucleotide und
eine die Optimierung des Reaktionspuffers. Die optimale Konzentration der Magnesiumionen
ist von besonderer Bedeutung. Da der Vorgang der DNA-Verdoppelung zyklisch wiederholt
wird, kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung des gewünschten DNA-Abschnittes
(Mullis und Faloona, 1987). Für die Amplifikation der etablierten forensischen Marker stehen
Standardprotokolle zur Verfügung. Eine große Anzahl von STR-Systemen können auch in so
genannten Multiplex-Ansätzen amplifiziert werden. Dabei werden mehrere Loci parallel in
einem Ansatz amplifiziert. Die Industrie bietet heute Test-Kits im Handel an, die bis zu 16
Loci kombinieren (z.B. Powerplex 16 der Firma Promega).
Wenn die PCR im Zuge des Rh-Mappings verwendet wird, kommt jeweils nur ein Primerpaar
für den zu untersuchenden Genort zum Einsatz (single-PCR set- up).
Wegen einer unklaren Datenlage zur Lokalisierung wurden die folgenden drei STRs dem RHmapping Prozess unterworfen:
SE33 (Synonyme: ACTBP2, ACTBP8), D3S1358 und D7S1517.
2.4.2
PCR-Reaktionsansätze
Für jeden getesteten Locus wurden die 83 DNA Proben des Rh-Panels als Templates in die
PCR-Ansätze aufgenommen. Zusätzlich wurde drei Kontrollen (2x Aqua dest. als
Kontaminationskontrollen und eine Positiv-Kontrolle) mitgeführt. Das Ergebnis wurde als
37
eine Kombination aus 83 Zeichen aufgeführt. Dabei stand „1“ für einen Amplifikationserfolg,
„0“ für keinen Amplifikationserfolg. Wenn Banden an der erwarteten Stelle im Gel sehr
schwach ausfielen, wurde anstatt der „1“ bzw der „0“ ein „R“ eingegeben. Kein
Amplifikationserfolg bedeutet, dass die DNA-Probe kein Amplifikations-Template enthielt.
Um methodisch bedingte Zufallsausfälle zu erkennen wurden für jeden Locus 3 Versuche mit
dem gesamten DNA-Panel ausgeführt. Nachdem ein reproduzierbares Ergebnis erreicht
worden war, wurde das Muster per E-Mail an den RH-Server des Stanford Human Genome
Center eingesandt. Als Ergebnis erhält man nach kurzer Zeit einen Bericht, der über die
Kopplung zu bekannten (bereits kartierten) Markern Auskunft erteilt. Man kann nun den noch
nicht kartieren Marker in einen Bereich (Bin) einordnen, von dem die Lokalisation bekannt
ist.
D3S1358
Der PCR-Prozess folgte den Empfehlungen von Li et al. (1994).
Der Gesamtansatz umfasste 25 µl. Die Endkonzentrationen im Test betrugen:
Ca. 10 ng DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl (pH 9.0), 200µM dNTPs, 1,5 mM MgCl2,
0,25 µM jedes Primers, 0,6 U Taq- Polymerase (Goldstar, Eurogentec).
Die Primersequenzen sind:
5‘ ACTGCAGTCCCAATCTGGGT-3‘
5‘ ATGAAATCAACAGAGGCTTG-3‘
Temperatur
Zeit
1.
Initiale Denaturierung
94oC
5 min
2.
Denaturierung
94 oC
50 s
3.
Annealing
58 oC
60 s
4.
Extension
72 oC
60 s
5.
Finale Extension
72oC
5 min
34x Amplifikationszyklen
Tabelle 2 - 1: PCR-Bedingungen für D3S1358
Die amplifizierten DNA Fragmente wurden in 0.7 mm dicken nativen horizontalen
Elektrophoresegelen nach Möller et al. (1994) getrennt.
Die Polyacrylamid-Gele (7.5%T, 3% C) enthielten Piperazinediacrylamide als Crosslinker
a 28 mM, CHES (Cyclohexylaminomethane sulfonic acid) und 81 mM Formate (pH 9.0). Die
Banden wurden durch Silberfärbung visualisiert (nach Budowle et al 1991).
38
Das erhaltene Retentionsmuster wurde als eine Symbolfolge aus 0, 1 und R ausgedrückt und
zum RH Server eingesandt.
D7S1517
Ca. 5 ng DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl (pH 9.0), 200µM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 0,25
µM jedes Primers, 1 U Taq- Polymerase (Goldstar, Eurogentec).
5’- GTGACCAACTGAATTATGTTTTG - 3’
5’- CATCTTGCCAGCTGCCT - 3’.
Temperatur
Zeit
1.
94oC
3 min
2.
Denaturierung
94 oC
30 s
3.
Annealing
51 oC
30 s
o
4.
Extension
72 C
75 s
5.
Finale Extension
72oC
6 min
Tabelle 2 - 2: PCR-Bedingungen für D7S1517
SE33 (ACTBP2)
Der PCR-Prozess folgte den Empfehlungen von Polymeropoulos et al. (1992).
Ca. 5 ng DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl (pH 9.0), 200µM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 0,25
µM jedes Primers, 1 U Taq- Polymerase (Goldstar, Eurogentec).
5'-AATCTGGGCGACAAGAGTGA-3'
5'-ACATCTCCCCTACCGCTATA-3'
39
1.
Temperatur
Zeit
94oC
3 min
o
2.
Denaturierung
94 C
30 s
3.
Annealing
58 oC
30 s
4.
Extension
72 oC
75 s
5.
Finale Extension
72oC
6 min
Tabelle 2 - 3: PCR-Bedingungen für SE33 (ACTBP2)
40
3 ERGEBNISSE
41
3.1
3.1.1
Rh-Mapping
Das Rh-Mapping des Markers D3S1758
Die dreimalige Ausführung der PCR unter den angegebenen Bedingungen ergab das folgende
Retentionsmuster. Dieses Muster wurde an den SHGC-Rh-Server eingesandt:
Vector:000001000000000000010000000000000010000001000110001000000000000101000
0100R001000000
Die Antwort des RH-Servers lautete: (gekürzte Kopie)
This email message has been sent automatically by the Stanford
Human Genome Center RHserver in response to your submission.
Duplicate markers are indicated with a (D) after the marker name,
a LOD score is now given for duplicates.
Reference Number: D3s1558
Stanford RH Panel:
G3
Lowest LOD Reported:
4
Chromosome Value: 0
Results for G3.exampl
----------------------------------------Submitted
Vector:00000100000000000001000000000000001000000100011000100000000000010100
00100R001000000
#
SHGCNAME
CHROM#
LOD_SCORE
DIST.(cRs)
1
SHGC-79299(D)
3
14.04
0
Vector:00000100000000000001000000000000001000000100011000100000000000010100
001001001000000
2
SHGC-21606(D)
3
14.04
0
Vector:00000100000000000001000000000000001000000100011000100000000000010100
00100R001000000
3
SHGC-10592(D)
3
14.04
0
Vector:00000100000000000001000000000000001000000100011000100000000000010100
001001001000000
The number of markers searched was 9817.
Thank you for using the SHGC RHSERVER.
42
Ergebnis der Suche nach SHGC-21606 in der NCBI-Database:
Damit ist D3S1358 in den Bereich von Chromosome 3: D3S1260-D3S3582 kartiert worden.
Das entspricht den folgenden Angaben (Dargestellt als Kopie von der NCBI Seite):
About This Interval
Top of interval:
D3S1260 (57.8 cM)
Bottom of interval:
D3S3582 (65.1 cM)
Genetic size of bin:
7 cM
Physical size of bin:
334 cR10000
Abbildung 5: NCBI-Ideogram
43
3.1.2
Das Rh-Mapping des Markers D7S1517
Vector:000001100000000000000000001010001000000000000001000010000000000101000
10000000000000
Die Antwort des RH-Servers lautete: (gekürzte Kopie)
Reference Number:
Stanford RH Panel:
Chromosome Value: 0
G3
4
Results for D7S1517
----------------------------------------Submitted
Vector:00000110000000000000000000101000100000000000000100001000000000010100
010000000000000
#
SHGCNAME
CHROM#
LOD_SCORE
DIST.(cRs)
1
SHGC-22049 7
6.38
32
Vector:00000110000000000000000000101000100000000000000100100000R00000010101
00000R000000010
2
SHGC-1916
7
6.28
29
Vector:000000100000000000000000001010001000000000000001R0000000000000010100
000000000000100
3
SHGC-772
7
5.51
46
Vector:00000110000000000000000000101000100001000000000110101000100000010101
000001000000010
Thank you for using the SHGC RHSERVER.
Die Lokalisierung der gekoppelten Marker erfolgte mit Hilfe der NCBI Datenbank.
Der gekoppelte Marker SHGC-1916 erzielte hier einen Treffer.
44
Das Ergebnis ist in der Abbildung 6 dargestellt. Damit kann der Marker dem Chromosom 7
q31 zu geordnet werden.
NCBI gibt für diesen Abschnitt die folgenden Werte zur Lokalisation an:
About This Interval
Top of interval:
D7S655 (126.5 cM)
Bottom of interval:
D7S686 (131.7 cM)
Genetic size of bin:
5 cM
Physical size of bin:
460 cR10000
45
3.1.3
Das Rh-Mapping des Markers Se33
Vector:010000010000000011000000001000000000000000000000011000000011000101100
10111001000000
Die Antwort des Antwort vom RH-Servers lautete:
Reference Number:
Stanford RH Panel:
Chromosome Value: 0
G3
4
Results for G3.se33
----------------------------------------Submitted
Vector:01000001000000001100000000100000000000000000000001100000001100010110
010111001000000
#
SHGCNAME
CHROM#
LOD_SCORE
DIST.(cRs)
1
RH111861
6
13.79
9
Vector:01000001000000001100000000000000000000000000000001100000001000010110
010111001000000
2
SHGC-103889 6
12.69
13
Vector:01000001000000001100000000000000000000000000000001100000001001010110
010111001000000
3
SHGC-79338 6
12.10
13
Vector:01000001000000001100000000000000000000000000000001100000001000010110
010111000000000
Thank you for using the SHGC RHSERVER
SHGC-79338 wird von NCBI dem Chromosom 6 zugeordnet. Die Lokalisation wird
89776278-89776563 (bp) angegeben. Eine Angabe in cM vom p-Telomer ist auf direkte
46
Weise nicht zu erhalten. Der NCBI-Map-Viewer lokalisiert den Marker zu Chromosom 6
q15-16. Das entspricht einem Abstand vom p-Telomer von ca. 100-110 cM. Dieser Bereich
kann zusätzlich als NCBI-Ideogram dargestellt werden (Abbildung 7). Dieses Ergebnis
stimmt überein mit Angaben in der GDB die den Marker mit den Synonymen ACTPBP8 und
ACTPBP2. Somit ist SE33 zweifelsfrei dem Chromosom 6 zugeordnet.
47
Die Abbildung 8 zeigt die chromosomalen Plots genetischer Distanz weiblich / männlich in
ihrer Beziehung zur physischen Position auf der Chromosomenkarte nach Broman et al. 1998
[26].
Diese Darstellung ermöglicht in Fällen, in denen nur ein Geschlechtdurchschnittswert
angegeben ist, die Spannweite der Differenz grob abzuschätzen.
Abbildung 8: Distanzratio weiblich/männlich der
genetischen Lage von Markern entlang der
Chromosomen 1-22 (nach Brodman et al.).
Abszisse: 0 = Position des p-Telomers
▼ = Lage des Centromers.
48
3.2
Die forensischen Marker des Chromosom 1
D1S80 [27, 101, 114, 217], D1S339 [56], PGD [21, 162, 178], RHD [178], D1S7 [35, 147, 202], PGM1 [83, 105, 178, 205],
Penta I [9], FY [178], D1S518 [226], D1S1656 [78, 120, 235], D1S549 [121], F13B (klassischer Eiweißmarker) [178], F13B
(PCR Marker) [44, 50, 128, 140, 157, 228], REN [186], D1S8 [103, 153, 213]
49
3.3
ACP1 [54, 115, 205], TPO [5, 51, 101, 173], D2S92 [159], APOB [79, 181, 194, 220], D2S11 [46], pYNH24 [43, 41, 42],
D2S436 [121], D2S1338 [17, 48, 204]
50
3.4
D3S1358 [129, 204, 209], plxn5 [2], HVR [64, 164, 242], D3S1359 [129, 174, 188], D3S1217 [102], TF [36, 42, 49, 167],
D3S1744 [67, 199, 203], D3S1545 [88], D3S1754 [121]
51
3.5
D4S95 [98], D4S43 [84], GC [30, 57, 101, 231], FABP2.PCR2 [175, 229], FGA [34, 65, 77, 101, 142], GYPA [30, 101,
150], D4S243 [169], D4S163 [56, 158], D4S139 [35, 80, 143, 210]
52
3.6
D5S818 [6, 45, 101], D5S110 [28, 43, 56], ACTBP2 [95, 93, 94], D5S373 [47, 55], PM [39], CSF1PO [33, 58, 101], CSF1R
[4], D5S2360 [94], D5S43 [56]
53
3.7
D6S477 [14, 68], F13A1 [97, 101, 176, 185], BF [73, 74, 214], HLA-A [86, 137, 187], HLA-B [132, 137], HLA-C [137,
187], HLA-DNA [61, 62, 161], HLA-DQa [60, 195, 232], GLO1 [22, 178, 207], RHAG [99, 107, 135], ACTBP8 [148],
DHFRP2 [3, 101, 168, 177], D6S366 [165, 191, 192], Penta F [9], D6S132 [182, 198]
54
3.8
D7S21 [90, 93, 211], D7S460 [136], D7S809 [212], D7Z2 [118, 233], D7S820 [87, 101, 183], Penta B [9], D7S1517 [149],
D7S8 [30, 101], D7S480 [102], D7S467 [198]
55
3.9
LIPOL [101, 141], D8S639 [196], D8S384 [139], D8S306 [15, 155], D8S1132 [218, 236], D8S320 [104, 184], Penta A [9],
D8S1179 [12, 34, 101], D8S358 [56, 191], D8S344 [53, 224], D8S345 [134], D8S347 [134, 172], GPT [91, 230], D8S323
[53, 134]
56
3.10 Die forensischen Marker des Chromosom 9
ak3 [178, 240], D9S157 [102], Penta C [9], D9S302 [121], D9S926 [169], AB0 [117, 178], ak1 [110, 163, 178, 179]
57
D10S2325 [8, 234, 235], D10S28 [19, 89, 95]
58
TH01 [34, 101], D11S2010 [169], D11S554 [1, 78, 171], D11S35 [66], APOA1 [7, 41, 106], D11S488 [25, 196, 227]
59
VWF [101, 108, 145, 190], cd4 [59, 101, 113], D12S391 [81, 122, 123], COL2A1 [16, 23, 181], D12S375 [38, 121],
D12S1090 [199, 203, 245], PAH [124, 125], PLA2A1 [166], D12S11 [31, 85, 92]
60
D13S325 [126], ESD [22, 29, 178, 244], D13S153 [102], D13S317 [69, 70, 146], D13S767 [169]
D14S608 [40], D14S306 [18, 226], D14S299 [243], PI [217, 218, 219, 8], D14S543 [160], D14S13 [11, 96, 151], D14S118
[160], IGHG3 [75, 76, 100]
61
D15S233 [243], CYP19 [101, 138, 229], Penta E [9, 63], FES/FPS [13, 101, 111, 177]
D16S85 [229], D16S83 [237], D16S309 [153, 189], D16S537 [222], D16S310 [169], D16S543 [131], D16S3253 [40], HP
[82, 178, 215, 216], D16S539 [32, 130, 191], D16S422 [102]
62
D17S5 [133, 208, 217], D17S976 [112], D17S795 [144], D17S26 [96, 152, 156], D17S79 [10, 11, 35], D17S766 [217]
D18S535 [119, 193, 235], D18S51 [12, 101, 200, 201, 206], D18S849 [199], D18S1270 [40], D18S848 [169], D18S17
[170], MBP [127, 154, 225]
63
LDLR [26, 30, 101], D19S253 [24, 52, 71], D19S433 [17, 68, 204], Lu [178], D19S246 [197]
D20S470 [126], ADA [21, 37, 238], D20S85 [109, 221, 223], D20S161 [8], D20S15 [170]
64
D21S11 [32, 101, 219], Penta D [9], D21S1437 [40], D21S168 [66]
p1 [72, 178, 180, 241], Penta H [9], D22S683 [14, 20], Penta G [9]
65
4 DISKUSSION
66
Die Kartierung genetischer Merkmale des Menschen war schon früh ein Gegenstand der
humangenetischen Forschung. Ursprünglich war damit das Ziel verbunden, Kopplungsdaten
bei der Erstellung von Erbprognosen zu nutzen. Die klassische Genetik der Schule von
Thomas H. Morgan hatte durch die Forschungen an Drosophila das Phänomen der
gekoppelten Vererbung gezeigt. Man konnte nachweisen, dass bestimmte Merkmale immer,
bzw. statistisch gehäuft, miteinander vererbt wurden. Die Genetiker um Morgan erkannten,
dass dieses durch die physische Nähe der entsprechenden Gene bedingt ist. Somit war die
Möglichkeit gegeben, auf der Basis der Ermittlung von Rekombinationshäufigkeiten
genetische Karten zu erstellen. Auch in der Humangenetik wurden bald darauf die ersten
Kopplungsgruppen gefunden. So fand man schon mit den Methoden der klassischen Genetik
die Kopplung des Nagel-Patella-Syndroms mit der AB0-Blutgruppe auf dem Chromosom 9.
Die Kopplung zwischen der dominanten Eliptozytose und dem Rh-System, der Hämophilie A
mit den Rot-Grün-Sehstörungen sind weitere Beispiele. In einer späteren Phase der
Humangenetik versuchte man, das Phänomen der Kopplung zur Verbesserung von
Erbprognosen zu nutzen. Für die meisten rezessiv vererbten Erkrankungen bestand die
Schwierigkeit, heterozygote Genträger zu erkennen. Solche Personen tragen natürlich ein
erhöhtes Risiko, Kinder mit der betreffenden Erkrankung zu bekommen. Es bestand daher ein
Bedarf, die Heterozygoten zu erkennen, die Risiken zu ermitteln und die Betroffenen zu
beraten. Diese Strategie entwickelte sich erfolgreich, als es gelang, DNA-Polymorphismen zu
analysieren. Erst jetzt war man in der Lage, für Gene die für schwere genetische
Erkrankungen von Bedeutung sind, gekoppelte Polymorphismen zu finden und diese im
beschriebenen Sinne zu nutzen. Solche Polymorphismen wurden nun als Kopplungsmarker
sowohl für die Heterozygotenerkennung als auch für die pränatale Diagnostik genutzt. Als
besonderer Vorteil erwies sich, dass die Diagnostik nicht mehr an die Untersuchung
bestimmter Gewebe gebunden war, sondern dass als Voraussetzung die Gewinnung von DNA
ausreichte. Auf diese Weise wurden pränatale Diagnosen und Hetererozygotentests auch für
solche Erkrankungen möglich, für die der Basisdefekt noch unbekannt war. In der
Anfangsphase der genomischen Dignostik waren hier Erkrankungen wie die Cystische
Fibrose, die Phenylketonurie, die Duchenne Muskeldystrophie, die Chorea Huntington u.a.m.
zu nennen. Inzwischen kann man für eine große Anzahl der monogen bedingten
Erkrankungen schon eine direkte Mutationsbestimmung vornehmen, so dass die Frage der
Lokalisierung von genetisch bedingten Erkrankungen und geeigneten Kopplungsmarkern in
den Hintergrund rückt.
67
Große Bedeutung hat dieses Feld jedoch nach wie vor für die forensische Genetik. Während
für die normale Vaterschaftsbestimmung, bei der man Proben von der Mutter, dem strittigen
Kind und dem Eventualvater untersuchen kann, die Lokalisation der Marker kaum eine Rolle
spielt, liegen die Verhältnisse bei der Erstellung schwieriger Defizienzgutachten
komplizierter. Das Prinzip besteht hier ja darin, dass anstatt des Eventualvaters dessen
Verwandte in die Untersuchung einbezogen werden (z.B. bei Tod des betreffenden
Eventualvaters). Die Häufigkeit der Übereinstimmung von Merkmalen zwischen dem Kind
und den Verwandten dient dann als Berechnungsgrundlage für die
Verwandtschaftswahrscheinlichkeit. Wenn man bedenkt, dass die Übereinstimmung von
Merkmalen zwischen dem verstorbenen Putativvater und dessen Verwandten nicht nur
hinsichtlich einzelner Marker sondern auch in Bezug von ganzen Kopplungsgruppen
betrachtet werden kann, muss die Kopplung der Marker beachtet werden. Dieses Problem soll
im Folgenden durch ein Beispiel illustriert werden.
Zuvor soll hier noch darauf hingewiesen werden, dass den Forensischen Gutachtern die
Lokalisation der von ihnen benutzten Marker oft gar nicht bekannt ist. Inzwischen ist es aber,
nicht zuletzt durch die Erfolge des Human Genom Projekts möglich, die Lokalisation der
genomischen Marker in den geeigneten Gendatenbanken aufzufinden und deren Lokalisierung
genau zu bestimmen. Während der Erarbeitungsphase zu dieser Arbeit war dies jedoch nur in
eingeschränkter Weise zutreffend und für manche Marker war lediglich die chromosomale
Zuordnung, aber keine genauere Lagebestimmung möglich. Für drei wichtige Marker wurde
deshalb im Rahmen dieser Arbeit die Kartierung mittels der RH-Mapping-Methoden
vorgenommen: D7S1517, D3S1358 und SE 33.
Die schnelle Entwicklung auf dem Gebiet der Genomanalyse und der InternetKommunikation haben dazu geführt, dass eine solche Arbeit zum jetzigen Zeitpunkt nicht
mehr nötig gewesen wäre. Man kann jetzt die entsprechenden Marker in der Bank
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/ auffinden. Das gibt uns die Möglichkeit die eigenen
Kartierungsergebnisse zu überprüfen.
Die Gründe für die hier erfolgte Überprüfung der Lage des Markers SE33 sind anders geartet.
SE 33 ist ein besonders hochpolymorphes System. Für die deutsche Population sind 79 Allele
aufgeführt worden. Dementsprechend ist die Diskriminationskraft (PD) und die AVACH sehr
hoch. SE 33 wird vor allem in Deutschland eingesetzt. Der eigentliche Name ist ACTBP2
(human beta-actin related pseudogene H-beta-Ac-psi-2). Unglücklicherweise wird das Gen in
der GDB aber unter ACTBP8 geführt und unter ACTBP2 erscheint eine Sequenz, die dem
68
Chromosom 5 zugeordnet werden muss. Daraus folgt eine komplette Verwirrung. Die
Lokalisation SE 33 wird deshalb nach wie vor sowohl auf Chromosom 5 [251] als auch auf
Chromosom 6 [252] angegeben. Es kam deshalb darauf an, die Lage endgültig durch eigene
Untersuchung zu klären. Das hier gefundene Resultat zeigt SE 33 auf dem Chromosom 6.
Abschließend konnte dieses Resultat auch durch die Datenbankarbeit bestätigt werden: Die
SE33-Primer passen in eine Sequenz die GDB ACTBP8 nennt und dem Chromosom 6
zuordnet.
4.1
Demonstrationsbeispiel
Zur Illustration der Tragweite der unkritischen Verwendung gekoppelter Marker im
Abstammungsgutachten wird ein realer Fall aus der Praxis gezeigt. Hier war die VaterschaftsWahrscheinlichkeit eines defizienten Putativvaters zu bestimmen, von dem aber beide Eltern
zur Untersuchung zur Verfügung standen. Es werden die hypothetischen aber praxisnahen
Situationen berechnet, in denen jeweils nur einer von den Putativgroßeltern untersucht werden
kann. Gekoppelte Marker werden alternativ einbezogen bzw. eliminiert. Zur Berechnung der
Verwandtschaftswahrscheinlichkeit kam das Programm DNA-View von C. Brenner
(www.dna-view.com) zum Einsatz. Die Tabelle 4 - 1 zeigt die Markerprofile, die in einem
strittigen Abstammungsfall erhoben wurden.
69
Marker
Mutter
Kind
PGM
PGV
CcD Ee
8 / 10
CcD Ee
8 / 10
CcD Ee
9 / 10
Ccd ee
7/8
B
17 / 19
AB
17 / 15
B
16 / 15
AB
17 / 18
1
2
Chr 1
Chr 1
3
4
Chr 2
Chr 3
Rh
F13B
(STR)
acP
D3S1358
5
6
7
Chr 4
Chr 4
Chr 4
Gc
FGA
MNSs
1F
21 / 22
MSs
1F-1S
22 /22.2
MNS
1F
19 / 23
Mss
1F –1S
21 /22.2
MNS
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Chr 5
Chr 7
Chr 8
Chr 9
Chr 11
ACTBP2
D7S1517
D8S1179
AB0
TH01
17 / 26
20 / 22
15 / 15
A1
7/8
26 / 28.2
20 / 23
15 / 13
A1
7 / 9.3
20 / 24
18 / 23
16 / 13
0
9.3 / 9.3
17 /28.2
19 /20
17 / 19
0
7 / 9.3
Chr 12
Chr 12
Chr 12
VWA
CD4
D12S391
17 / 19
5 / 10
19 / 21
19 / 14
10 / 11
19 / 24
15 / 17
6 / 6
18 / 25
18 / 14
10 / 11
20 / 24
17
18
19
20
21
22
Chr 15
10 / 11
11 / 11
FES/FPS
Chr 18
D18S51
17 / 18
18 / 20
Chr 21
D21S11
37 / 28
28 /31
Wahrscheinlichkeiten:
PGM + PGV mit allen MKG
PGM + PGV ohne MNSs, D12S391,CD4
11 / 12
18/ 21
30 / 31
8 /10
19/20
28 / 30
23
24
nur PGM
nur PGM
mit allen MKG
ohne MNSs, D12S391, CD4
p = 13,71
p = 55,98
25
26
nur PGV
nur PGV
mit allen MKG
ohne MNSs, D12S391, CD4
p = 99,99992
p = 99,996
MKG
MKG
MKG
MKG
MKG
18Systeme/13Chr.
15Systeme/13Chr.
18Systeme/13Chr.
15Systeme/13Chr.
p= 99,996
p= 99,59
18Systeme/13Chr.
15Systeme/13Chr.
Tabelle 4 - 1: Abstammungstest in einer Defizienzfamilie mit verstorbenem Putativvater, an dessen Stelle
die Putativgroßmutter (PGM) und der Putativgroßvater (PGV) untersucht werden konnten. Die Zeilen
21, 23 und 25 enthalten das Ergebnis der Berechnung der Verwandtschaftswahrscheinlichkeit berechnet
unter Einbeziehung mehrerer Marker einer Kopplungsgruppe (MKG). In Zeile 22, 24 und 25 wurde
richtigerweise pro Kopplungsgruppe nur ein Marker in die Berechnung einbezogen. Das wechselseitige
Weglassen jeweils einer Person aus der Großelterngeneration (Zeilen 23-26) veranschaulicht das Problem.
Mit den in Abstammungstests häufig angewandten 18 Markern von 13 Chromosomen sollte
die Frage nach der Verwandtschaftswahrscheinlichkeit zwischen dem strittigen Kind und den
Putativgroßeltern und somit zum Putativvater geklärt werden. Das Spektrum enthält mit FGA
und MNSs Marker einer Kopplungsgruppe auf dem Chr. 4 und mit VWA, CD4 und D12S391
Marker einer Kopplungsgruppe vom Chr. 12. Berechnet man die
Verwandtschaftswahrscheinlichkeit p unter Einbeziehung aller Personen, ist die Frage der
Kopplung einiger Marker nicht von größerer Bedeutung. Stünde aber jeweils nur eine Person
aus der großelterlichen Generation zur Untersuchung an, würde die unkritische Einbeziehung
gekoppelter Marker zu groben Fehleinschätzungen führen. Erst wenn man bei der Berechnung
der Großmutterwahrscheinlichkeit einen Marker der Kopplungsgruppe FGA-MNSs und zwei
Marker der Kopplungsgruppe CD4-VWA-D12S391 aus der Berechnung eliminiert, kommt
70
man zu der realen Verwandtschaftswahrscheinlichkeit von p = 55,98% im Gegensatz zum
falschen Ergebnis von p = 13,71% . Das Beispiel demonstriert die bekannte Tatsache, dass im
Abstammungsgutachten gekoppelte Marker nicht wie voneinander unabhängige
Informationen behandelt werden dürfen. Die Tatsache, dass die Nutzung von gekoppelten
genetischen Markern für forensische Anwendungen zu Fehlern führen kann, ist allgemein
bekannt. Sie wird aber im Schrifttum der forensischen Medizin bis auf wenige Ausnahmen
kaum diskutiert. Kopplungsungleichgewichte spielen außer für das HLA-System [178] im
forensisch relevanten Schrifttum zu autosomalen forensischen Markern kaum eine Rolle. DeBenedictis et al [54] veröffentlichen allerdings Untersuchungen zu einem möglichen Linkage
disequilibrium zwischen TPOX und APO B und schließen ein solches aus.
Probleme von gekoppelter Vererbung und von Kopplungsungleichgewicht kann man
vollständig umgehen, wenn man nur solche Marker kombiniert einsetzt, die auf
unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind. Eigentlich wäre ein derartiges Vorgehen
uneingeschränkt realisierbar, denn bei 22 Autosomen könnte man ein komfortables 22Markerset mit Lokalisationen auf 22 unterschiedlichen Chromosomen evaluieren. Es ist
jedoch zu konstatieren, dass in vielen Fällen auch ungekoppelte Marker bereitgestellt werden
können, die auf einem und demselben Chromosom liegen. Somit ist der Spielraum noch
größer optimale Systeme auszuwählen. Die heute üblichen Testkits sind bereits weitestgehend
bedarfsgerecht und umgehen die Problematik von Kopplung und Kopplungsungleichgewicht.
Nur ganz ausnahmsweise enthalten sie gekoppelte Marker. Eine solche Ausnahme ist mit dem
Powerplex 16 (Promega) hinsichtlich des Chr22 gegeben. Hier sind die enggekoppelten
Systeme D21S11 und Penta-D kombiniert - ein Umstand, der bei Anwendung des Kits
bedacht werden muss.
Für den Spurenfall bzw. für den unkomplizierten Abstammungstest (Terzettenfall) ist
normalerweise die Nutzung einer Multiplex-PCR rechnerisch ausreichend. Sonderfälle
erfordern eine Erweiterung des Markerspektrums. Auch die Philosophie, Systeme aus
unterschiedlichen Systemkategorien einsetzen zu wollen, ist zu unterstützen. In jedem Fall
muss die Auswahl der Zusatzsysteme sinnvoll, d. h. unter Berücksichtigung der Lokalisation
vorgenommen werden. Unser Anwendungsbeispiel zeigt, dass im Defizienzfall eine
diesbezüglich unkritische Auswahl zu falschen Aussagen führen kann. Analoges gilt für
vermeintlich „normale Terzettenfälle“ mit isoliertem Ausschluss. Hier ist gelegentlich der
Mutationsfall vom Verwandtschaftsfall, in dem der Bruder oder Vater des PV wahrer Vater
ist, nicht ohne größere Anstrengungen zu unterscheiden. Zu Beginn eines
71
Abstammungsgutachtens ist es aber meist unbekannt, ob ein PV-Verwandtschaftsfall vorliegt.
Für den Einsatz gekoppelter Marker im Verwandtschaftsfall gilt: Ebenso wie ChrY-Marker in
PV-Geschwisterfällen keine Ausschlusskraft besitzen, bilden autosomale Kopplungsgruppen
eine abgeschwächte Analogie zum ChrY. Das Allelsharing zwischen Kind und PV betrifft
hier naturgemäß häufig gleich die ganze Kopplungsgruppe gemeinsam oder alternativ nicht
gemeinsam. Deshalb ist die Nutzung gekoppelter Marker nur dann zulässig, wenn man sich
der Kopplung bewusst ist und die Ergebnisse sachkundig interpretiert. Die hier vorgestellte
Übersicht zur Kartierung forensisch genutzter genetischer Marker soll die Beurteilung
erleichtern. Sie soll in der Zukunft in einer regelmäßig aktualisierten Form zugänglich sein.
4.2
Zusammenfassung und Aussicht
Die kombinierte Anwendung genetischer Marker in der forensischen Spurenkunde und im
Abstammungsnachweis erfordert eine genaue Kenntnis deren Lokalisation. Diese Arbeit
lokalisiert die forensischen Marker zytogenetisch und genetisch in den Ideogrammen der 22
Autosomen. Diesbezügliche Informationen wurden aus Gendatenbanken zusammengetragen,
die ohne Zugangsbeschränkungen im World Wide Web aufgesucht werden können. Es fanden
Marker Berücksichtigung, die mittels Medline für den Zeitraum von 1990 bis 06/2001 aus den
Zeitschrifen Int J Legal Med, J Forensic Sci und Forensic Sci Int herausgefiltert werden
konnten. Auch Marker, die im gleichen Zeitraum in den Proceedings der ISFG (vormals
ISFH) genannt worden sind, wurden aufgenommen.
Mit der Fokussierung der Forensischen Genetik hat sich das Interesse in der jüngeren
Vergangenheit vor allem den STRs zugewendet. Die Informativität der einzelnen Marker ist
im Vergleich zu den klassischen Markern um ein Vielfaches gestiegen. Die heute
angewandten STRs haben meist zwischen 10 und 25 Allele, manche jedoch noch viel mehr.
Das Resultat davon ist, dass man die Anzahl der genutzten Marker drastisch reduzieren
konnte. Ein unkomplizierter Abstammungsfall kommt heute mit der Anwendung des Testkits
Powerplex 16 (15 autosomale Marker) oder dem SGM plus (12 autosomale Marker) aus. Nur
in komplizierten Defizienzfällen wird die Anzahl erhöht, wobei jetzt auch meist die
gonosomalen Marker (ChrY oder ChrX ) genutzt werden oder 3 - 6 autosomale Single-Locus
Sonden eingesetzt werden. Als ein zusätzliches positives Ergebnis dieser Entwicklung ist zu
verzeichnen, dass die Übersichtlichkeit zugenommen hat. Auch ohne große Mühe kann man
72
die Lokalisierung der Marker überprüfen. Meist sind die STRs in einem Testkit vom
Hersteller so kombiniert worden, dass keine gekoppelten Marker zum Einsatz kommen.
In letzter Zeit zeichnet sich jedoch für die Forensische Genetik ein methodischer Umbruch ab.
Führende Wissenschaftler propagieren ein Umschwenken auf die Methode der SNP-Analyse
[253]. Der enorme technische Fortschritt hinsichtlich der Genshiptechnik ermöglicht es in
Kürze, mit effektiven Methoden eine Vielzahl SNPs zu analysieren. Das Argument dafür, ist
dass SNPs eine extrem geringe Neigung zur Mutation zeigen. Die geringe Informativität pro
SNP kann durch die Vielzahl von Einzelinformationen ausgeglichen werden. Anzumerken ist
in dieser Hinsicht aber, dass mit der Einführung einer großen Anzahl von Einzelmarkern die
Übersicht zur Kopplungsproblematik leicht verloren geht. Es wird von hoher Bedeutung sein,
die SNPs Sortimente so zusammen zustellen, dass diese ungekoppelt sind. Wie gezeigt wurde,
kann der Einsatz von gekoppelten Markern im Defizienzgutachten zu Fehlern führen. Man
mag einwenden, dass ein bestimmtes Gesamtergebnis vom Vorhandensein einer Kopplung
zwischen wenigen Markern das Ergebnis kaum verfälschen kann. Obwohl diese Feststellung
sicher zutrifft, darf daraus dennoch keine Sorglosigkeit erwachsen. Es ist bekannt, dass in der
Rechtsprechung jeder auch noch so geringe Formfehler ein Gutachten oder sogar ein Urteil zu
Fall bringen kann. Die Wichtigkeit der tatsächlichen und der formalen Richtigkeit eines
Befundes ist von höchster Bedeutung.
Daraus folgt, dass bei der Etablierung der SNP-Analytik in der Rechtsmedizin die Frage der
Lokalisierung von vornherein sehr ernst genommen werden sollte. Es erscheint sinnvoll, in
absehbarer Zeit eine Übersicht zur Kartierung der in der Rechtsmedizin genutzten SNPs zu
erstellen.
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88
6 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
89
Abbildung 1: Die Organisation des menschlichen Genoms..................................................... 15
Abbildung 2: Gregor Johann Mendel....................................................................................... 24
Abbildung 3: Thomas Hunt Morgan ........................................................................................ 25
Abbildung 4: Herstellung von Mensch-Hamster-Hybridzellkulturen...................................... 30
Abbildung 5: NCBI-Ideogram ................................................................................................. 43
Abbildung 8: Distanzratio weiblich/männlich der genetischen Lage von Markern ................ 48
90
7 TABELLENVERZEICHNIS
91
Tabelle 1 - 1: Zur zeitl. Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der Blutgruppens. ........ 10
Tabelle 1 - 2: Zur zeitl. Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der Proteinsysteme ....... 11
Tabelle 1 - 3: Zur zeitl. Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der Enzymsysteme........ 12
Tabelle 1 - 4: Zur zeit. Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der HLA-Systeme .......... 13
Tabelle 1 - 5: Methoden und Techniken in der Rechtsmedizin ............................................... 17
Tabelle 1 - 6: Zur zeitl. Abfolge der Entdeckungen auf dem Gebiet der DNA-Systeme ........ 22
Tabelle 2 - 1: PCR-Bedingungen für D3S1358 ....................................................................... 38
Tabelle 2 - 2: PCR-Bedingungen für D7S1517 ....................................................................... 39
Tabelle 2 - 3: PCR-Bedingungen für SE33 (ACTBP2) ........................................................... 40
Tabelle 4 - 1: Abstammungstest in einer Defizienzfamilie...................................................... 70
92
DANKSAGUNG
93
III
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. R. Szibor für die Überlassung des Themas,
für seine hilfreichen Anmerkungen und kritischen Betrachtungen.
Für die ausgezeichnete und intensive Betreuung bei der Anfertigung der Arbeit möchte ich
mich bei Herrn Prof. Dr. D. Krause ganz herzlich bedanken.
Frau Doreen Exner danke ich für die Unterstützung bei der Medline-Recherche.
Ein besonderer Dank geht an meine Eltern, für ihr Verständnis und die vielen aufmunternden
Worte während der Anfertigung der Arbeit.
94
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNGEN
95
IV
Selbstständigkeitserklärung
Ich erkläre, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung der
angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe.
Magdeburg, 05.12.2004
________________________
Sebastian Lieske
Erklärung zur Bewerbung
Ich erkläre, dass ich mich mit der vorliegenden Arbeit an keiner anderen Hochschule um den
akademischen Grad doctor medicinae beworben habe und dass ich weder früher noch
gegenwärtig die Eröffnung eines Verfahrens zum Erwerb des o.g. akademischen Grades an
einer anderen Hochschule beantragt habe. Ich übertrage der Medizinischen Fakultät das
Recht, weitere Kopien meiner Dissertation herzustellen und zu vertreiben.
________________________
Sebastian Lieske
96
CURRICULUM VITAE
97
V
Persönliche Daten:
Name
: Sebastian Lieske
Geboren
: 15.03.1976, in Magdeburg
Staatsangehörigkeit : deutsch
Ausbildung:
1982-1990
: Polytechnische Oberschule „Heinrich-Reichel“, Magdeburg
1990-1994
: Geschwister-Scholl-Gymnasium, Magdeburg
1994
: Abitur
1994-1995
: Zivildienst, Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg
1996
: Immatrikulation, Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg
1998
: Ärztliche Vorprüfung
1999
: 1. Staatsexamen
2002
: 2. Staatsexamen
04/ 2003
: 3. Staatsexamen
seit 05/ 2003
: Arzt im Praktikum an der Klinik für Unfall- Hand- und
Wiederherstellungschirurgie, St. Salvator Krankenhaus, Halberstadt
________________________
Sebastian Lieske
98
PUBLIKATIONSVERZEICHNIS
99
VI
1. Gläß F, Lieske S, Kasten E (1999) Was denken Patienten über Ärzte? Was halten Ärzte
von ihren Patienten? Zeitschrift für Medizinische Psychologie 2, 85-93
2. Szibor R, Lieske S, Beck N, Krause D (2002) Zur Lokalisation forensisch genutzter Marker
im menschlichen Genom - Ergebnisse einer World-Wide-Web-Datenbankrecherche.
Rechtsmedizin 2, 65-76
100

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