Minos E. Carvalho(Estratégias de Análise Proteônicas)
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Minos E. Carvalho(Estratégias de Análise Proteônicas)
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Estratégias de análises proteômicas Minos E. Carvalho Setembro de 2012 Proteoma Genômica Transcriptômica Proteômica Metabolômica ● Proteoma é o equivalente protéico do genoma. WILKINS et al, 1996 Definições Expressão protéica; Proteômica comparativa; (Paralelo quantitativo com uma proteína padrão ou de um estado fisiológico) “snapshots”; “Spot” de proteínas. Código genético Seqüência de 3 nucleotídeos do DNA : códon A seqüência destes códons no DNA é copiada em RNAm Codifica um aminoácido, unidade básica da estrutura das proteínas A seqüência dos aminoácidos dá origem a diferentes proteínas Códons A importância das Proteínas Por serem: Fenômenos biológicos: Enzimas; Produção de energia; Anticorpos; Defesa imunológica; Hormônios; Contração muscular; Componentes estruturais; Atividade neuroquímica; Receptores celulares; Reprodução; Etc... Etc... Sousa et al.,1999. As proteínas e biomarcadores... Aplicações Avaliar proteínas expressas ou reprimidas: Efeito de fármacos; Condições patológicas; Diferenciação celular; Comparação de variedades da mesma espécie; Respostas celulares a estímulos externos diversos; etc... Introdução Estudos Proteômicos Possibilita: Caracterizar panoramas protéicos; Identificar modificações de perfis protéicos; Buscar isoformas de proteínas; Modificações pós-traducionais. Bendixen, 2005; Pan et al., 2005. Modificações Pós-Traducionais Fosforilação; Acetilação; Glicolisação; Sulfonação; Etc... Resíduos de aminoácidos fosforilados. (A)fosfoserina, (B) fosfotirosina e (C) fosfotreonina Proteínas Moonlighting Apresentam mais de uma função dentro de uma mesma célula ou do mesmo organismo... Não podem ser produtos: diferentes processamentos de RNAs; de fusões de genes; da existência de isoformas. Fosfoglucose isomerase, uma proteína moonlighting Catalisa o segundo passo da glicólise [a interconversão da glucose-6-fosfato (G6P) em frutose-6-fosfato (F6P)]. Em células tumorais podem causar o aumento na mobilidade de células tumorais. Mapas protéicos 1o proteoma completo foi reportado por Ghaemmaghami et al., 2003; Caracterizações em espécies de produção: Suínos: Lamestch et al., 2002; Bovinos: Bouley et al., 2004; Aves: Doherty et al., 2004. Análise do mapa “In silico” Exemplo: Mapa protéico em suínos Estudo no pós abate (L. dorsi) LAMETSCH et al., 2003. Procedimentos: Avaliação da expressão protéica Eletroforese Bi-Dimensional: • 1ª Dimensão Separação das isoelétrico; - Focalização isoelétrica proteínas por ponto Ettan IPGphor (GE Healthcare) • 2ª Dimensão - Corrida eletroforética Separação por massa molecular; Cuba de eletroforese Avaliação da expressão protéica Análise do mapa “In silico”: • Os géis 2-DE são analisados com o auxílio de softwares Exemplo: ImageMaster Platinum (Amersham Biosciences); • Os “spots”: detectados e quantificados; Procedimentos: Avaliação da expressão protéica Análise do mapa “In silico”: • Os géis 2-DE são analisados; • Os “spots” são: detectados e quantificados; intensidade dos spots estado protéico coloração identificação de 500 – 2000 proteínas BOULEY et al, 2004. Procedimentos: Avaliação da expressão protéica Digestão in-gel das proteínas: Enzimas: Tripsina, Endoproteinase (Lys-C e Arg-C), Elastase, Quimotripsina, Pepsina e Pronase. Sequenciamento de peptídeos por LC-MS/MS Espectros de Sequenciamentos Inten.(x100,000) 735.94 7.0 642.42 490.96 6.0 5.0 4.0 3.0 428.62 2.0 1.0 485.62 368.47 0.0 300 350 400 450 679.89 577.37 500 550 600 650 700 746.93 750 800 850 900 950m/z Inten.(x100,000) 893.21 1.75 942.81 1.50 1.25 1.00 848.41 998.16 0.75 1060.50 771.57 0.50 0.25 567.20 1211.69 737.98 1304.95 545.24 0.00 500 1131.10 662.83 600 700 1220.49 800 900 1000 1100 1200 1300 1413.47 1400 1541.66 1500 1600 m/z Espectro de Sequenciamento interpretado I/LMGAVGGAI/LQI/LW..... Bioinformática: Banco de dados e ferramentas Bancos de Dados de proteínas mais utilizados em bioinformática Genbank: www.ncbi.nlm.nih.gov Banco de dados americano de seqüências de DNA e proteínas. PDB: www.rcsb.org/pdb Armazena estruturas tridimensionais resolvidas de proteínas. PIR: www-nbrf.georgetown.edu Banco de proteínas anotadas. SWISS-PROT: www.expasy.ch/spro Armazena seqüências de proteínas e suas respectivas características moleculares, anotado manualmente por uma equipe de especialistas. INTERPRO: www.ebi.ac.uk/interpro Banco de dados de famílias e domínios. Objetivos dos dados gerados dos estudos proteômicos Esclarecer as proteínas envolvidas nas rotas metabólicas; Identificar novos alvos farmacológicos e marcadores biológicos relacionados ao estabelecimento do fenômeno ou progressão; Identificação de moléculas bioativas a extratos naturais; Caracterização de respostas celulares a novas drogas, doenças e ambientes. Representação da distribuição funcional das proteínas no músculo Semitendinosus de bovinos Metabólicas (25,5%) Estruturais (17%) Sistema de Defesa (16%) Contráteis (14,5%) Outras (25,5%) Não identificadas (1,5%) % de proteínas identificadas BOULEY et al, 2004. Dinâmica protéica Chaze, et al. 2008. Um potencial marcador Amostras L. dorsi: biopsia e 1h postmortem Força de cisalhamento: 7 dias 178 animais Extremos 13 animais A peroxiredoxina – 6 pode ser um potencial marcador para maciez da carne bovina na análise protéica antes e logo após o abate. Jia et al, 2009. Trabalho do Grupo de Biotecnologia Animal Dep. Zootecnia - ESALQ Estratégia Experimental: Expressão protéica dos valores extremos para maciez da carne 4% menor maciez (6 animais) 4% maior maciez (6 animais) Informações descritivas dos extremos de força de cisalhamento Extremos Menor FC Maior FC 1 1FC0 Característica N MÉDIA DP6 CV%7 MIN MAX FC01 6 6,504 1,07 16,6 4,52 7,75 FC72 6 3,084 0,76 24,9 1,97 4,34 FC143 6 2,014 0,51 25,8 1,65 3,02 Espessura de Gordura 6 8,175 1,33 16,2 7,00 10,00 pH(24h) 6 5,57 0,16 2,8 5,38 5,85 FC01 6 9,344 1,43 15,4 7,22 11,60 FC72 6 7,584 0,77 10,2 6,30 8,43 FC143 6 5,584 1,55 27,7 3,54 7,49 Espessura de Gordura 6 6,175 2,40 38,8 4,00 10,00 pH(24h) 6 5,67 0,24 4,2 5,36 5,97 = força cisalhamento 24 horas pos abate, 2FC7 = força cisalhamento com 7 dias de maturação , 3FC14 = força cisalhamento com 14 dias de maturação, 4valores em kgf/cm2, 5valor em milímitros, 6DP=desvio padrão e 7CV=coeficiente de variação pI P M pI pI SDS-PAGE 2º Dimensão P M P M Coomassie G250 Focalização Isoelétrica Eletroforese 1º Dimensão 2D - I 6 Análise de Imagem Extração Proteínas Maceração I 2 Tecido Análise do mapa “In silico” Software: ImageMaster Platinum (Amersham Biosciences) Análise da expressão diferencial Grupos comparativos da intensidades dos volumes (carne com maior maciez versus menor maciez) Spots diferencialmente expressos pH 4 176: Complex III subunit 1 241 1: Acyl-CoA binding domain cantaining protein 6 122: Alpha-actin-1 236: HSP70-1 7 150: Alpha-actin-1 327: Beta-LG 170 130 255 100 70 135 55 138: uncharacterized 126 40 112: Tropomyosin-1 35 239 matchs 25 15 54: MLC1/MLC3 59: HSPB1 297: MLC2F 50: HSPB1 106: HSPB1 Identificação das proteínas Digestão in-gel das proteínas: Enzimas: Tripsina Sequenciamento de peptídeos MS/MS Laboratório Max Feffer Genética de Plantas Departamento de Genética ESALQ-USP, Piracicaba, SP. SYNAPT G2 HDMS - Waters Resultados Proteínas em maior expressão no grupo de maior maciez da carne Spot Identificação Score Massa (KDa) teórica/aparente Acesso Uniprot Expressão no menor força de cisalhamento 50 Heat shock protein beta 1 178 22,39/21 Q3T149 ↑ 106 Heat shock protein beta-1 267 22,39/34 Q3T149 ↑ 122 Actin, alpha skeletical muscle 386 42,05/36 P68138 ↑ 138 Uncharacterized protein 102 35,35/37 F1MBK8 ↑ 327 Beta-lactoglobulin 190 19,88/36 P02754 ↑ Resultados Proteínas em menor expressão no grupo de maior maciez da carne Spot 1 Identificação Acyl-CoA-binding domain-cantaining protein 6 Score Massa (KDa) teórica/aparente Acesso Uniprot Expressão na menor força de cisalhamento 194 31,27/54 A2VDR2 ↓ 54 Myosin light chain 1/3, muscle isoform 208 20,93/21 A0JNJ5 ↓ 59 Heat shock protein beta-1 323 22,39/22 Q3T149 ↓ 112 Tropomyosin alpha -1 chain 143 32,69/35 Q5KR49 ↓ 150 Actin, alpha skeletical muscle 335 42,05/38 P68138 ↓ 270 52,7/44 P31800 ↓ 265 70,25/65 Q27975 ↓ 246 19,01/15 Q0P571 ↓ 176 236 297 Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial Heat shock 70 kDa protein 1A Myosin regulatory light chain 2, skeletal muscle isoform Proteínas HSP –“heat shock proteins” Características das HSP - É a forma mais efetiva de proteção ao calor - Induzidas quando temperatura aumenta 10°C acima da ótima - Protegem as proteínas, membranas e organelas durante o estresse por calor - HSP são rapidamente transcritas pelo núcleo - Atuam como chaperonas moleculares (proteínas que previnem associações impróprias entre proteínas) Proteínas HSP –“heat shock proteins” Funções das HSP - previnem a agregação das proteínas - ajudam as proteínas desnaturadas a refazerem-se - auxiliam no dobramento das novas proteínas Localização Núcleo-Citoplasma-Cloroplastos-Mitocôndrias-Retículo endoplasmático Conclusões • Primeiro estudo de proteômico do tecido muscular com bovinos de origem Bos taurus indicus (Nelore); • Estratégia de comparar extremos para os valores de força de cisalhamento foi eficiente; • Os resultados confirmam algumas proteínas já associadas com a maciez da carne em outras raças; • Novas proteínas foram identificadas com associação com a maciez da carne na raça Nelore; • O processo de amaciamento da carne está envolvido com a expressão de várias proteínas. Exercício Bioinformática Exemplo: Identifique e caracterize essas amostras através das seqüências peptídicas obtidas pelos espectros analisados. Ferramentas de Bioinformática BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ - Protein Blast) e UNIPROT (http://www.uniprot.org/) • • • • • • • • Amostra A: VAHTVCQTGESTKPSSK Amostra B: AAVEEGIVPGGGTALAR Amostra C: IKPYDEYYVWR Amostra D: GKCYGEDVLQANNLPSSR Amostra E: RDKRNGIILKKEILK Amostra F: ASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAI Amostra G: KKEGIE WTFIDFGMDL AACIELIEKP Amostra H: FEARK KEEEELIALK ERIEKR Exercício Bioinformática Exemplo: Identifique e caracterize essas amostras através das seqüências peptídicas obtidas pelos espectros analisados. Ferramentas de Bioinformática BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ - Protein Blast) e UNIPROT (http://www.uniprot.org/) • • • • • • • • Amostra A: VAHTVCQTGESTKPSSK Amostra B: AAVEEGIVPGGGTALAR Amostra C: IKPYDEYYVWR Amostra D: GKCYGEDVLQANNLPSSR Amostra E: RDKRNGIILKKEILK Amostra F: ASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAI Amostra G: KKEGIE WTFIDFGMDL AACIELIEKP Amostra H: FEARK KEEEELIALK ERIEKR Obrigado....