Emerson Cruz de Oliveira - Teses e Dissertações

Transcrição

EMERSON CRUZ DE OLIVEIRA
ESTUDO DA EXPRESSÃO GÊNICA DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES DE ANIMAIS EM
PROCESSO DE RECUPERAÇÃO NUTRICIONAL E DOS EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE
O ESTRESSE OXIDATIVO DE ANIMAIS DESNUTRIDOS
Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação do
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração:
Bioquímica Metabólica e Fisiológica.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva
CO-ORIENTADORA: Prof.ª Dra. Maria Lúcia Pedrosa
OURO PRETO – MG
NOVEMBRO DE 2011
O482e
Oliveira, Emerson Cruz de.
Estudo da expressão gênica de enzimas antioxidantes de animais em
processo de recuperação nutricional e dos efeitos do exercício físico sobre o
estresse oxidativo de animais desnutridos [manuscrito] / Emerson Cruz de
Oliveira – 2011.
xviii, 118f.: il., color; graf.; tab.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eutáquio Silva.
Coorientadora: Profa. Dra. Maria Lúcia Pedrosa.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Bioquímica Metabólica e Fisiológica.
1. Desnutrição - Teses. 2. Exercícios físicos - Teses. 3. Estresse oxidativo Teses. 4. Expressão gênica - Teses. I. Silva, Marcelo Eustáquio. II. Pedrosa,
Maria Lúcia. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Título.
CDU: 577.15:612.39
Catalogação: [email protected]
OLIVEIRA, E. C.
APOIO FINANCEIRO
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX) e no
Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM) do Núcleo de Pesquisa em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, com o auxílio financeiro da CAPES,
CNPq, FAPEMIG e UFOP.
ii
OLIVEIRA, E.C.
DEDICATÓRIA
Ao Meu pai, Ervando Gonçalves de Oliveira. À Minha
mãe, Eva Maria da Cruz Oliveira. Meus irmãos,
Eneida, Magalice, Vanessa, Robson e Talitha. Vocês
me deram força para realizar esse trabalho
permanecendo do início ao fim apoiando e
entenderam que a distância às vezes foi necessária
para que ele fosse concluído, portanto ele é dedicado
a vocês.
iii
OLIVEIR, E.C.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva e à Prof. Dra.
Maria Lúcia Pedrosa, meus orientadores, pela
competência,
paciência,
exemplo
de
vida
e
principalmente pela amizade. É imensurável a
admiração que sinto por vocês. Certamente vocês
estão formando uma enorme família. Muito obrigado
por todos esses anos de convivência nesse ambiente
maravilhoso, que muito me fez lembrar a minha casa.
À Dra. Maísa Silva por ser um exemplo de
companheirismo, otimismo, presteza e alegria para o
LBM e para o LABNEX. Todos que um dia precisaram
de uma explicação ou ajuda com qualquer técnica
sempre puderam contar com a nossa decana. Seus
cadernos de protocolos ajudaram a todos que já
passaram pelos laboratórios e sua paciência, mesmo
com
minhas
dúvidas
em
conceitos
básicos,
permitiram que eu aprendesse muito mais do que eu
imaginei que fosse possível.
iv
OLIVEIRA, E. C.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por te me dado uma maravilhosa FAMÍLIA, pais exemplares e irmãos invejáveis.
Não há palavras para descrever sua bondade e amor.
Aos demais colegas do LABNEX e LBM, Aline Mayrink de Miranda, Ana Flávia Santos
Sampaio, Bárbara Moreira Quirino, Bianca Barros de Figueiredo, Bruno da Cruz Pádua,
Carlos Augusto Costa Cabral, Cíntia Lopes de Brito Magalhães, Danielle de Lima Ávila,
Fabiano Kenji Haraguchi, Fernanda Caetano Camini, Glaucy Rodrigues de Araujo, Joamyr
Victor Rossoni Júnior, Joyce Ferreira da Costa Guerra, Lorena Souza e Silva, Melina
Oliveira de Souza, Poliane Silva Maciel, Rogério Tadeu Ferreira, Sandra Camilo
Gonçalves, Simone de Fátima Viana da Cunha e Waleska Claudia Dornas Amaral, pela
paciência, auxílio, incentivo e amizade.
Ao Prof. Dr. Rinaldo Cardoso dos Santos por toda a ajuda, paciência, presteza e
principalmente pela qualidade de todas as contribuições, correções dos meus textos e
traduções. Aos demais professores da ENUT.
À Prof. Dra. Daniela Caldeira Costa pela excelente convivência, paciência e auxilio no LBM
e pela ajuda a todos os alunos do LABNEX. Aos demais professores do NUPEB e da UFOP.
Ao Jair Pastor Mota, pela amizade, descontração e por cuidar do laboratório como se
fosse a sua casa transmitindo esse sentimento a todos os alunos. Aos demais funcionários
da ENUT em especial a Maria Luíza Vieira (“Lulu”) assim como aos terceirizados em
especial ao Clodoaldo Pereira dos Santos.
À Maria Aparecida Trópia (“Cida”), secretária do NUPEB pela atenção e disponibilidade.
Aos demais funcionários da UFOP.
Ao Prof. Dr. Adailton Eustáquio de Magalhães e ao Prof. Dr. Paulo Ernesto Antonelli e
demais professores do CEDUFOP, meus colegas de trabalho e aos técnicos
administrativos.
v
OLIVEIRA, E. C.
AGRADECIMENTOS
Aos meus novos irmãos que escolhi aqui em Ouro Preto, Thiago Campos Borges
(“Mafalda”), Allan Cristian Gonçalves e Wanda Maria de Faria, pela amizade verdadeira,
preocupação, atenção, senso de humor e das boas gargalhadas. Sempre que as coisas
ficavam difíceis vocês me ajudavam a conseguir forças.
Às seleteiras, Sueli Moura Bertolino (também pelas orações) Nayara Carolina Quites,
Joelma Maria Cardoso Gomide, Liliane Cardoso Gomide, Alessandra Cardoso Castro
Souto, Ana Beatriz Bento Horta Barbosa, Ana Luiza Soares Cezário, Amanda Lima
Veríssimo, e ao Gislandro Hudson Torres Gonçalves (“Chatuba”- República K-zona) pela
amizade, companheirismo, pelo apoio nos momentos decisivos e por tornarem Ouro
Preto um local melhor pra se viver e se passar os finais de semana. Pelos filmes, séries,
jogos e almoços de domingo, além dos churrascos. Obrigado também pelas festas na
nossa República Seleta e pelos passeios noturnos quase sempre para a mesma
churrascaria.
Aos travados, André Luiz Barroso Almeida (“Goiabinha”), Guilherme Diniz Castanheira
(“Vô”), André Tolentino Silva (“Minho-k”), Lucas Edgard Campos da Costa (“Dubaldy”),
Gabriel Andrade Souza Grossi Ribeiro (“Minerin”), Juliano Henrique Fonseca Soares
(“Pirata”) e Lucas Soares Silva (“Goiano”), e as amigas/namoradas, Maíra Maciel,
Isadora Lupiano de Moura e Fernanda Nogueira Ribeiro pela companhia nos melhores
rocks e bailes de Ouro Preto, pelos melhores churrascos com o melhor churrasqueiro
(risos), nas melhores “palas", nos melhores “porres”, nas maiores “idiotices ditas,
dançadas ou coreografadas”, pelas ressacas homéricas e pela maior amizade que de tão
grande se tornou impossível de descrever. Agora, além da República Nostravamus vocês
terão que voltar a Ouro Preto para me visitar.
Aos demais amigos de Ouro Preto, Elias Campos Borges (“Ximbica”) e todo pessoal da
República Covil ao Líniker Fabrício de Sousa (“Gripado”) e ao Francismar S. Siqueira. Às
moradoras e ex-alunas da República Ovelha Negra.
vi
OLIVEIRA, E. C.
AGRADECIMENTOS
Mais uma vez à Vanessa Cruz de Oliveira a representante do clã Cruz de Oliveira que
esteve mais perto e me aguentou durante dois anos fazendo uma comidinha caseira de
dar inveja e demostrando muita preocupação comigo.
A todos os gênios da informática que inventaram dentre outras tantas coisas a Internet,
os programas estatísticos, as planilhas eletrônicas e os editores de texto. Sem essas
ferramentas eu não teria terminado o meu trabalho.
Aos gênios do Google que criaram um mecanismo de busca que me ajudou a encontrar
rapidamente artigos e textos difíceis de encontrar. “In Google We Trust!”
Muito Obrigado!
vii
OLIVEIRA, E.C.
SUMÁRIO
SUMÁRIO
RESUMO............................................................................................................................. x
ABSTRACT ......................................................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ xii
LISTA DE GRÁFICOS ......................................................................................................... xiii
ABREVIATURAS .............................................................................................................. xvii
INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................................. 3
Desnutrição................................................................................................................... 3
Recuperação nutricional ............................................................................................... 5
Estresse oxidativo ......................................................................................................... 7
Estresse oxidativo e exercício ....................................................................................... 9
Expressão gênica de enzimas antioxidantes .............................................................. 11
Desnutrição e exercício .............................................................................................. 14
Desnutrição e estresse oxidativo................................................................................ 20
OBJETIVOS ...................................................................................................................... 22
Objetivo Geral............................................................................................................. 22
Objetivos Específicos .................................................................................................. 22
MATERIAIS E MÉTODOS – PRIMEIRO EXPERIMENTO..................................................... 23
1) Animais e grupos experimentais ............................................................................ 23
2) Dietas e condições experimentais .......................................................................... 24
3) Teste Oral de Tolerância à Glicose (TOTG) ............................................................. 25
4) Eutanasia e coleta de material biológico ............................................................... 26
5) Dosagens bioquímicas ............................................................................................ 26
6) Marcadores de estresse oxidativo e enzimas antioxidantes ................................. 27
7) Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real ...................................................... 41
8) Tratamento estatístico ........................................................................................... 43
viii
OLIVEIRA, E.C.
SUMÁRIO
RESULTADOS DO EXPERIMENTO 1 – ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO, POR MEIO DE
MARCADORES DE ESTRESSE, DEFESAS ANTIOXIDANTES E EXPRESSÃO GÊNICA EM RATOS
NO PROCESSO DE RECUPERAÇÃO NUTRICIONAL........................................................... 45
Avaliação Nutricional, metabolitos sanguíneos e marcadores do estresse oxidativo no
soro. ............................................................................................................................ 45
Expressão gênica de enzimas antioxidantes no coração e músculo .......................... 48
Enzimas antioxidantes e marcadores de estresse oxidativo no fígado, coração e
músculo esquelético ................................................................................................... 50
DISCUSSÃO DO EXPERIMENTO 1 – ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO, POR MEIO DE
NO PROCESSO DE RECUPERAÇÃO NUTRICIONAL........................................................... 54
CONCLUSÃO - PRIMEIRO EXPERIMENTO ....................................................................... 65
MATERIAIS E MÉTODOS – SEGUNDO EXPERIMENTO .................................................... 66
1) Animais e grupos experimentais ............................................................................ 66
2) Treinamento Físico ................................................................................................. 68
3) Tratamento estatístico ........................................................................................... 69
RESULTADOS DO EXPERIMENTO 2 – ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO VIA MARCADORES
DE ESTRESSE E DEFESAS ANTIOXIDANTES EM ANIMAIS NO PROCESSO DE RECUPERAÇÃO
NUTRICIONAL E EXERCITADOS. ...................................................................................... 70
soro dos animais. ........................................................................................................ 70
Enzimas antioxidantes, marcadores de defesas antioxidantes e marcadores do estresse
oxidativo no fígado, coração e músculo esquelético. ................................................ 77
DISCUSSÃO DO EXPERIMENTO 2 – ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO VIA MARCADORES
DE ESTRESSE E DEFESAS ANTIOXIDANTES DE ANIMAIS EM PROCESSO DE RECUPERAÇÃO
NUTRICIONAL E EXERCITADOS. ...................................................................................... 84
CONCLUSÃO - SEGUNDO EXPERIMENTO ....................................................................... 93
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................... 94
ix
OLIVEIRA, E.C.
RESUMO
RESUMO
Os objetivos desse trabalho foram investigar a expressão gênica de enzimas antioxidantes
e marcadores de estresse oxidativo de animais em processo de recuperação nutricional,
assim como a influência do exercício físico sobre o estresse oxidativo desses animais. Os
resultados mostraram que os animais em processo de recuperação nutricional não
atingiram o peso corporal dos animais do grupo controle, além de apresentaram um
prejuízo na absorção de glicose. A desnutrição causou um maior estresse oxidativo no
soro, no músculo esquelético e no coração. No músculo esquelético houve aumento na
atividade da catalase, sem modificação na expressão gênica, fato oposto ao que ocorreu
com a superóxido-dismutase (CuZn-SOD). Houve ainda aumento na expressão de gamaglutamil-cisteína-sintase (γGCS) (músculo) e CuZn-SOD (coração) nos animais desnutridos
em comparação aos recuperados, fato contraditório com uma diminuição nos níveis de
glutationa no músculo, mas que justifica um aumento na atividade da CuZn-SOD no
coração. Ainda no coração, houve aumento na expressão de γGCS dos animais
recuperados em relação aos desnutridos, condizente com o aumento nos níveis de
glutationa. O treinamento físico aumentou o ganho de peso e o peso final dos animais
desnutridos assim como o estresse oxidativo no fígado e músculo. No coração dos
animais controles o exercício causou um maior estresse oxidativo fato oposto ao ocorrido
com desnutridos. No soro o treinamento gerou maior estresse nos animais recuperados.
Assim, sugere-se que o estresse oxidativo gerado pela desnutrição é reversível. O
treinamento gerou maior estresse oxidativo no fígado e músculo de animais desnutridos,
apesar de gerar também maior ganho de peso e peso corporal e níveis mais baixos de
oxidação de proteínas no coração.
Palavras chave: desnutrição, recuperação nutricional, exercício físico, estresse oxidativo e
expressão gênica.
x
OLIVEIRA, E. C.
ABSTRACT
ABSTRACT
This study aimed at investigating the gene expression of antioxidant enzymes and
markers of oxidative stress in animals in a nutritional recovery process, as well as the
influence of physical exercise on oxidative stress in these animals. The results showed
that animals in the nutritional recovery process did not reach the body weight of control
ones, and showed an impaired glucose uptake. Malnutrition caused a greater oxidative
stress in serum, skeletal muscle and heart. In skeletal muscle there was an increase in
catalase activity with no change in gene expression, as opposed to what happened with
superoxide dismutase (CuZn-SOD). There was also increased expression of gammaglutamyl-cysteine synthase (γGCS) (muscle) and CuZn-SOD (heart) in the malnourished
animals as compared to the recovered rats, a fact inconsistent with a decrease in
glutathione levels in muscle, but one that justifies increase in CuZn-SOD activity in the
heart. In this organ there was increased expression of γGCS amongst the recovered
animals in relation to the malnourished ones, which is consistent with increased levels of
glutathione. Exercise training increased the weight gain and final weight of the
malnourished animals as well as oxidative stress in liver and muscle. In the heart of the
control animals exercise caused a greater oxidative stress as opposed to what occurred in
the malnourished group. In the serum training generated greater stress in the recovered
animals. Thus it is suggested that oxidative stress generated by malnutrition is reversible.
The training led to increased oxidative stress in liver and muscle of malnourished animals,
although also generating greater weight gain and body weight and lower levels of protein
oxidation in the heart.
Keywords: malnutrition, nutritional recovery, physical exercise, oxidative stress and gene
expression.
xi
OLIVEIRA, E.C.
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição das dietas em gramas para cada 1000g de dieta.
25
xii
OLIVEIRA, E.C.
LISTA DE GRÁFICOS
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. - Divisão dos grupos experimentais - experimento I
24
Gráfico 2. Peso corporal inicial, peso corporal final, ganho de peso e ingetão alimentar de
animais dos grupos experimentais
46
Gráfico 3. Concentrações séricas de proteínas totais, albumina, glicose e teste oral de
tolerância à glicose de animais dos grupos experimentais
47
Gráfico 4. Atividade de alanina aminotransferase (ALT), atividade de aspartato
aminotransferase (AST), porcentagem de inibição da Superóxido Dismutase (SOD) e
concentração de sulfidrilas no soro de animais dos grupos experimentais
48
Gráfico 5. Razão de expressão do RNAm de zinco-superóxido dismutase (CuZn-SOD),
catalase e gama-glutamil-cisteina sintase (γ-GCS) no coração de animais dos grupos
experimentais
49
Gráfico 6. Razão de expressão do RNAm de zinco-superóxido dismutase (CuZn-SOD),
catalase e gama-glutamil-cisteina sintase (γ-GCS) no músculo gastrocnêmio de animais
dos grupos experimentais
50
Gráfico 7. Concentrações de glutationa, de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS), de proteína carbonilada e atividades da catalase e da superóxido dismutase
(CuZn-SOD) no coração de animais dos grupos experimentais
51
(CuZn-SOD) no músculo gastrocnêmio de animais dos grupos experimentais
52
(CuZn-SOD) no fígado de animais dos grupos experimentais
53
Gráfico 10. - Divisão dos grupos experimentais - experimento II
68
Gráfico 11. Peso inicial de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
(Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT
(Recuperado Treinado)
70
xiii
OLIVEIRA, E.C.
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 12. Peso final de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
(Recuperado Treinado).
71
Gráfico 13. Ganho de peso de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
(Recuperado Treinado)
71
Gráfico 14. Ingestão alimentar de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado);
DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x
RT (Recuperado Treinado)
72
Gráfico 15. Valores séricos de proteínas totais de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
(Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS
(Recuperado Sedentário) x RT (Recuperado Treinado)
73
Gráfico 16. Valores séricos de albumina de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle
Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado
Sedentário) x RT (Recuperado Treinado)
73
Gráfico 17. Valores séricos de glicose de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle
74
Gráfico 18. Teste oral de tolerância à glicose de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
74
Gráfico 19. Atividade sérica de ALT (alanina aminotransferase) de ratas CS (Controle
Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido
Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT (Recuperado Treinado)
75
Gráfico 20. Atividade sérica de AST (aspartato aminotransferase) de ratas CS (Controle
75
Gráfico 21. Atividade sérica de SOD (superóxido dismutase) de ratas CS (Controle
76
xiv
OLIVEIRA, E.C.
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 22. Valores séricos de sulfidrilas de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle
76
Gráfico 23. Atividade da catalase no fígado de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
77
Gráfico 24. Atividade da catalase no coração de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
78
Gráfico 25. Valores de atividade da catalase no músculo gastrocnêmio de ratas CS
(Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT
(Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT (Recuperado Treinado)
78
Gráfico 26. Valores de glutationa no fígado de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
79
Gráfico 27. Valores de glutationa no coração de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
79
Gráfico 28. Valores de glutationa no músculo gastrocnêmio de ratas CS (Controle
80
Gráfico 29. Valores de proteína carbonilada no fígado de ratas CS (Controle Sedentário) x
CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS
81
Gráfico 30. Valores de proteína carbonilada no coração de ratas CS (Controle Sedentário)
x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS
81
Gráfico 31. Valores de proteína carbonilada no músculo gastrocnêmio de ratas CS
(Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT
(Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT (Recuperado Treinado)
82
xv
OLIVEIRA, E.C.
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 32. Valores de TBARS no fígado de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle
82
Gráfico 33. Valores de TBARS no coração de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle
83
Gráfico 34. Valores de TBARS no músculo gastrocnêmio de ratas CS (Controle Sedentário)
x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS
83
xvi
OLIVEIRA, E. C.
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
AGL - ácidos graxos livres
AIN-93M - do inglês = american institute of nutrition rodent diets
ALT - alanina aminotransferase
AP-1 - do inglês = activator protein 1
ARE - do inglês = antioxidant responsive element
AST - aspartato aminotransferase
CAT - catalase
CEUA - comissão de ética no uso de animais
DMSO - dimetilsulfóxido
DNPH - 2,4-dinitrofenilhidrazina
DNTB - ácido 5,5´-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
EDTA - ácido etilenodiaminotetracético
ERO - espécies reativas de oxigênio
ERON - espécies reativas de oxigênio e nitrogênio
FAO - organização das nações unidas para agricultura e alimentação
GAPDH - gliceraldeído fosfato dehidrogenase
GPx - glutationa-peroxidase
GR - glutationa-redutase
GS - glutationa-sintase
GSH - glutationa-reduzida
GSSG - glutationa-oxidada
GST - glutationa-s-transferase
Keap1 - do inglês = Kelch-like ECH associating protein 1
MTT - brometo de (3-[4,5-dimetiltiazol-2H]-2,5-difeniltetrazolium)
NADPH - nicotinamida adenina dinucleotídeo
NF-kB - do inglês = nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
Nrf2 - do inglês = nuclear factor erythroid 2-related factor 2
qRT-PCR - reação em cadeia da polimerase quantitativa pós-transcrição reversa
xvii
OLIVEIRA, E. C.
ABREVIATURAS
RNAm - ácido ribonucleico mensageiro
rpm - rotações por minuto
SDS - dodecil sulfato de sódio
CuZn-SOD - superóxido-dismutase
SRN - síndrome de recuperação nutricional
SSA - solução de ácido sulfosalicílico
TBARS - substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA - ácido tricloroacético
TEA - cloreto de trietanolamina
TOTG - teste oral de tolerância à glicose
WST - (2-(4 iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio)
γ-GCS - gama-glutamil-cisteína-sintase
NQOs - quinona oxidoredutases
NADPH - nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
xviii
OLIVEIRA, E. C.
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
Estudar a desnutrição precoce é importante, pois seus efeitos podem ser
irreversíveis como demostrado em modelos animais (Venkatachalam e Ramanathan,
1964; Winick e Noble, 1966) e discutido em humanos (Martin, 1973). Um modelo animal
de desnutrição é uma inestimável ferramenta para se estudar quais os mecanismos
bioquímicos e moleculares que acarretam o retardo do crescimento e desenvolvimento,
quais colaboram para manutenção da vida, como o estresse oxidativo está envolvido
nesses processos e como a recuperação nutricional ou a prática de atividade física pode
modificar todo esse cenário.
O oxigênio (O2) é essencial à vida, entretanto durante a oxidação biológica ele
pode seguir vias alternativas que geram a produção de espécies reativas de oxigênio
(ERO) que danificam lipídeos, proteínas e até mesmo o DNA celular. As células se
protegem contra os danos causados por essas espécies reativas por meio de enzimas de
defesa como a superóxido-dismutase (CuZn-SOD), catalase (CAT) e glutationa-peroxidase
(GPx) além de moléculas antioxidantes como a vitamina E, a vitamina C e os flavonóides
vegetais (Smith e cols., 2007).
Durante o exercício físico intenso a captação oxigênio por todo o corpo é muito
maior do que ocorre durante o repouso (Sies e col., 1992). A utilização de oxigênio
durante o exercício extenuante pode aumentar com consequente aumento no fluxo de
elétrons através da mitocôndria no músculo ativo, fato que leva a uma maior produção
de espécies reativas de oxigênio (Davies e cols., 1982).
Leeuwenburgh e col. (1997) mostraram que o estresse oxidativo induzido pelo
exercício pode gerar adaptações em resposta ao treinamento e que tais adaptações
seriam tecido-específicas, sugerindo um mecanismo regulatório complexo. Da mesma
forma, também foi demonstrado que a peroxidação lipídica induzida pelo exercício físico
é transitória e que existe uma remoção dos produtos da peroxidação lipídica durante a
fase de recuperação do esforço físico em indivíduos saudáveis (Leaf e cols., 1997).
Em ratos adultos submetidos a um programa de treinamento regular com duração
de um ano, ficou comprovado que o treinamento prolonga a capacidade de resistência
1
OLIVEIRA, E. C.
INTRODUÇÃO
aeróbia e aumenta as defesas antioxidantes limitando, assim, o dano tecidual causado
por radicais livres (Venditti e Meo, 1997). Também foi demonstrado que o treinamento
aeróbio de ratos, melhora a capacidade miocárdica destes animais em combater um
maior estresse oxidativo (Belló e col., 1996).
Além disso, ratos desnutridos exercitados cresceram mais do que aqueles
mantidos inativos (Torun e Viteri 1994; Galdino e cols. 2000). Existem evidências de que o
exercício físico é benéfico para animais desnutridos (Fuge e cols., 1968; Crews e cols.,
1969; Hansen-Smith e cols., 1977; Oldfors e Sourander, 1985; Mello, 1994) e no processo
de recuperação nutricional (Galdino e cols., 2000; Galdino e Mello, 2000; Silva e cols.,
1999).
Entretanto, faltam informações quanto aos efeitos do exercício crônico de baixo
volume e baixa intensidade sobre o balanço entre fatores geradores de danos oxidativos
e defesa antioxidante de animais desnutridos e no processo de recuperação nutricional.
Além disso, faltam também informações mais consistentes em relação ao status
antioxidante numa condição de desnutrição proteica calórica precoce e do envolvimento
de alguns genes que codificam enzimas antioxidantes em animais em situação de
desnutrição e no processo de recuperação nutricional.
2
OLIVEIRA, E. C.
REVISÃO DE LITERATURA
Desnutrição
O número de pessoas desnutridas no mundo permanece próximo à marca de um
bilhão, apesar do declínio observado em 2010 (FAO, 2010). Não somente a insegurança
alimentar, definida como a condição na qual as pessoas não têm condições físicas, sociais
ou econômicas de ter acesso ao alimento, mas também muitas doenças contribuem para
essa situação.
Em virtude da variação dos quadros clínicos, uma definição precisa de desnutrição
torna-se difícil. Gómez (1946) propôs que a desnutrição seria um estado de diferentes
graus de intensidade e variadas manifestações clínicas produzidas pela deficiente
assimilação, pelo organismo, de quantidades adequadas dos diversos componentes do
complexo nutriente (proteínas, carboidratos, gorduras, sais minerais e vitaminas).
Barbosa (1954) define desnutrição como uma doença carencial, evolutiva, crônica,
exclusivamente vinculada à idade da lactância, que sob o denominador comum da fome,
afeta especificamente a nutrição e que causa alteração da função fundamental da célula,
o crescimento.
A desnutrição proteico-calórica é um estado em que as necessidades fisiológicas
por proteínas, calorias ou ambos não podem ser satisfeitos pela dieta (Shils e cols., 2003).
A desnutrição humana pode ser subdividida em dois subtipos (Marasmo e
Kwashiorkor), que são caracterizados pelos quadros clínicos que os indivíduos
apresentam, embora a patogenia seja uniforme: carência proteico-calórica.
O Marasmo é caracterizado pela ocorrência de uma adaptação à deficiência
calórica, assim, o decréscimo no consumo de nutrientes, sobretudo calorias, levaria a
criança a utilizar as suas próprias reservas, impedindo o aparecimento de sinais de
desnutrição. Como as necessidades de carboidratos não são supridas pela dieta, ocorreria
uma diminuição nos níveis de insulina (processo que ocorre no jejum prolongado), com
aumento nos níveis de glucagon, cortisol, epinefrina e hormônio do crescimento. A lipase
hormônio-sensível aumentaria a sua atividade e mobilizaria os ácidos graxos do tecido
3
OLIVEIRA, E. C.
adiposo. Os ácidos graxos na corrente sanguínea, ligados à albumina seriam levados ao
fígado e pela ação da carnitina entrariam na mitocôndria para dar início ao processo da ßoxidação. Os acetatos produzidos se ligariam à coenzima A, formando acetil-CoA que
pode seguir dois caminhos: entrar no ciclo do ácido cítrico, ou formar corpos cetônicos. O
aumento na concentração dos corpos cetônicos possibilitaria ao cérebro e sistema
nervoso uma opção de fonte de energia alternativa à glicose. Assim, a maior mobilização
de ácidos graxos possibilitaria uma diminuição da gliconeogênese, poupando aminoácidos
dos tecidos, levando a uma menor taxa de catabolismo proteico, com consequente
diminuição na produção da amônia que vai para o fígado. Como resultado desse processo
poderia ocorrer também uma diminuição na excreção da uréia (Mahan e Escott-Stump,
2005).
No Kwashiorkor ocorre uma ruptura no processo de adaptação, levando ao
aparecimento do fígado gorduroso e do edema, as principais características desse tipo de
desnutrição. Na deficiência, sobretudo de proteínas, há um menor estímulo no
hipotálamo, diferente do que ocorre na deficiência calórica, assim os níveis de cortisol
seriam elevados, porém menores do que no marasmo. Ainda em comparação ao
marasmo, há uma menor mobilização dos ácidos graxos e aminoácidos, que reflete em
um melhor estado dos tecidos adiposo e muscular no Kwashiorkor. Ocorre também uma
diminuição dos aminoácidos plasmáticos resultando em uma menor síntese de proteínas
plasmáticas, sobretudo albumina, evento responsável pelo surgimento do edema. Como
no Kwashiorkor a quantidade de dieta oferecida não é a causa da desnutrição, mas sim a
baixa concentração de proteínas, a cetose não seria possível, pois as concentrações de
carboidratos em níveis normais não possibilitariam uma diminuição nos níveis de insulina
(Mahan e Escott-Stump, 2005).
Dentre as manifestações que acontecem nos dois tipos de desnutrição, um
destaque especial pode ser dado para a hipoglicemia, pois esta pode estar relacionada à
morte súbita no caso do desnutrido (Marcondes e cols., 1976).
Foi demonstrado um prejuízo permanente no crescimento de ratos desnutridos
nas três primeiras semanas, mas o mesmo não ocorre com animais desnutridos da
terceira até a sétima semana de vida (Barnes e cols. 1973).
4
OLIVEIRA, E. C.
Recuperação nutricional
Para que se mantenha uma ótima saúde é necessário que o corpo se adapte
eficazmente às cíclicas alterações no fornecimento de energia e ao gasto energético
através de ajustes metabólicos adequados. Flexibilidade metabólica é o termo que
descreve a capacidade de coordenar a regulação do metabolismo energético durante os
períodos de reabastecimento energético e períodos de gasto de energia (Storlien e cols.,
2004).
Foi demonstrado que filhotes de ratas que foram desnutridas durante a gestação
demonstraram uma maior flexibilidade metabólica e foram capazes de regular facilmente
o metabolismo energético, passando de uma condição de armazenamento para uma de
utilização dos substratos quando a demanda imposta pelo exercício assim exigia (Miles e
cols., 2009).
O aumento no armazenamento e na utilização de glicose pelos filhotes de ratas
desnutridas na gestação sugere um novo paradigma para uma maior flexibilidade
metabólica, o que pode representar uma resposta adaptativa em que a prole é
metabolicamente melhor equipada para sobreviver em períodos de fornecimento
diminuído de energia, por meio de uma maior flexibilidade de armazenamento e de uso
de energia (Miles e cols., 2009).
Exposição intrauterina à desnutrição pode acarretar modificações que
posteriormente podem influenciar no desenvolvimento subsequente de alterações
cardiovasculares (Massin e cols., 2001). Foi sugerido que doenças coronarianas associadas
com períodos de restrição alimentar durante o período de crescimento podem ser
decorrentes de uma transição para uma condição de nutrição adequada (Barker, 1999).
Entretanto, poucos estudos investigaram o impacto de um estado permanente de
desnutrição, que foi estabelecido durante a gestação e continuou até a vida adulta, sobre
parâmetros do estresse oxidativo, associado à realização de exercício físico ou a um
reestabelecimento da nutrição adequada, ou seja, um processo de recuperação
nutricional.
Humanos desnutridos em tratamento apresentam um conjunto de manifestações
clínicas, bioquímicas e histológicas que podem, em conjunto, compor a Síndrome de
5
OLIVEIRA, E. C.
Recuperação Nutricional (SRN). Dentre as manifestações clínicas podemos citar: 1)
hepatomegalia; 2) distensão abdominal; 3) ascite; 4) rede venosa colateral; 5) alterações
de pele e fâneros; e 6) faces de lua cheia. As quatro primeiras são de interesse desse
trabalho e serão comentadas. Informações sobre as demais podem ser encontradas em
Marcondes e cols. (1976).
A diminuição das proteínas totais, albumina e globulina, com aumento quase
sempre, da gamaglobulina são revertidas com o tratamento, com exceção da fração
gamaglobulina, que aumenta ainda mais chegando à hipergamaglobulinemia. A diluição
do organismo desnutrido, traduzida pelo aumento de seus líquidos intra e extracelulares,
durante a recuperação aumenta ainda mais, e no término da SRN, volta aos valores
normais. Já a eosinofilia representaria uma tendência oposta ao que ocorre com todo o
organismo, pois existem evidências da hipertrofia das adrenais durante a desnutrição,
indicando uma hiperfunção da glândula que resultaria em eosinofilia sanguínea elevada
na recuperação. A manifestação histológica mais evidente ocorre no fígado e portanto,
antes do órgão voltar ao normal durante a recuperação nutricional, algumas alterações
podem ser observadas: o desaparecimento da esteatose é gradual e o tecido hepático
assume um quadro caracterizado pelo aumento do volume da célula, reduzido número de
grânulos intraprotoplasmáticos dando a impressão de células insufladas, esse aspecto
recebe o nome de “imagem de depleção protéica”, havendo aumento nas quantidades
absolutas de glicogênio, água e nitrogênio nas células. Essa mudança histológica seria
responsável pela hepatomegalia (Marcondes e cols., 1976).
Nesse sentido, Ashworth (1969) estudou a recuperação nutricional em oito
crianças entre dez meses e três anos, que apresentaram pesos entre 50% a 70% do peso
normal para altura. Durante a recuperação nutricional, a taxa de crescimento foi 15 vezes
maior do que a das crianças normais da mesma idade e cinco vezes maior do que outras
crianças com altura e peso semelhantes. Após atingirem o peso normal para altura, a
ingestão alimentar das crianças caiu para um nível aproximado ao das crianças normais
de mesma altura e peso, porém mais novas.
Assim, podemos concluir que a SRN ocorre em decorrência de uma ruptura com o
novo equilíbrio alcançado pelo desnutrido, pelas adaptações que possibilitam a
6
OLIVEIRA, E. C.
manutenção da vida. Essa ruptura traz como conseqüência um aumento na velocidade de
crescimento, e os sintomas apresentados seriam a expressão clínica das diferentes
velocidades de crescimento dos diversos órgãos e tecidos, gerando uma desarmonia
temporal no crescimento.
Estresse oxidativo
O oxigênio (O2) é essencial à vida, mas por meio de vários processos enzimáticos e
não enzimáticos que ocorrem rotineiramente nas células, ele pode receber um elétron e
formar as espécies reativas de oxigênio (ERO) que são radicais de oxigênio ou compostos
que podem ser prontamente convertidos nesses radicais reativos. O radical superóxido
(O2-), o radical hidroxil (OH●) e o não radical peróxido de hidrogênio (H2O2) são as
espécies reativas de oxigênio mais estudadas. O radical hidroxil pode formar peróxidos
lipídicos e malondialdeído a partir de lipídeos de membrana que contém ácidos graxos
poli-insaturados. O dano por espécies reativas de oxigênio é a causa direta de um estado
patológico quando ocorre um dano tecidual causado por exposição à radiação ionizante,
ou as espécies reativas de oxigênio podem ser responsáveis pela perpetuação do dano
causado por outro processo como uma lesão por isquemia-reperfusão (Smith e cols.,
2007). Além das ERO existem as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERON) que
são formadas a parir da combinação do óxido nítrico (NO) com o oxigênio ou como o
superóxido, formando o não radical peroxinitrito e o radical dióxido de nitrogênio.
Entretanto, as células se protegem contra os danos causados por ERO por meio da
atuação de enzimas de defesa antioxidante, além da ação de moléculas antioxidantes
(Smith e cols., 2007).
Uma das enzimas de defesa antioxidante é a superóxido-dismutase (CuZn-SOD),
que converte o ânion superóxido em peróxido de hidrogênio, o qual é neutralizado em
água e oxigênio molecular pela atividade de outras enzimas antioxidantes como catalase
(CAT) e da glutationa-peroxidase (GPx). A CAT reduz o peróxido de hidrogênio a água nos
peroxissomos, enquanto a GPx reduz o peróxido de hidrogênio a água e os peróxidos
lipídicos a álcoois não tóxicos no citosol e nas mitocôndrias, respectivamente. Após
7
OLIVEIRA, E. C.
exposição da glutationa-peroxidase ao peróxido de hidrogênio e/ou aos peróxidos
lipídicos, ocorre a oxidação da glutationa-reduzida (GSH) formando a glutationa-oxidada
(GSSH). Uma vez formada, a GSSH deve ser reduzida de volta à sua forma GSH pela
glutationa-redutase (GR) em um ciclo redox. A GSH é sintetizada pela ação consecutiva de
duas enzimas, a gama-glutamil-cisteína-sintase (γ-GCS) e a glutationa-sintase (GS). A
primeira enzima nesta seqüência, a γ-GCS, catalisa a etapa limitante da velocidade de
reação da biossíntese de GSH (Smith e cols., 2007).
Apesar de todos esses mecanismos de que a célula dispõe para se proteger, ainda
pode acontecer um desequilíbrio entre a produção de ERO e a capacidade de todos esses
sistemas de defesa antioxidante em neutralizá-las e prevenir seus efeitos deletérios,
gerando uma condição conhecida como estresse oxidativo (Sies, 1986). Porém, baseado
no papel das ERO sobre diversas vias de sinalização celulares, mais recentemente foi
proposto um novo conceito para estresse oxidativo, sendo este caracterizado por “um
distúrbio no controle da sinalização redox” (Jones, 2006).
As membranas das células e organelas contêm grandes quantidades de ácidos
graxos poli-insaturados. A fluidez da membrana relaciona-se à presença de cadeias
insaturadas dos fosfolipídios e do colesterol e danos desta camada lipídica tendem a
diminuir a fluidez da membrana. O ataque de algumas espécies reativas inicia o processo
de peroxidação lipídica que é uma reação em cadeia. Podemos dividir a peroxidação
lipídica nas etapas de iniciação, propagação e terminação. Estas etapas estão
apresentadas nas reações seguintes, onde L representa o lipídio:
Iniciação
=> LH + OH. (ou LO.) ———> L. + H2O (ou LOH)
Propagação => L. + O2 ———> LOO.
Propagação => LH + LOO. ———>L. + LOOH
Terminação => LOO. + L. ———> LOOL
8
OLIVEIRA, E. C.
Terminação => LOO. + LOO. ———> LOOL + O2
Segundo Ferreira e Matsubara (1997), a reação acima se inicia com o sequestro do
hidrogênio do ácido graxo poli-insaturado (LH) da membrana celular. Tal sequestro pode
ser realizado pelo OH. ou pelo LO. (radical alcoxila), com consequente formação do L.
(radical lipídico). Na primeira equação de propagação, o L. reage rapidamente com o O 2,
resultando em LOO. (radical peroxila), que, por sua vez, sequestra novo hidrogênio do
ácido graxo poli-insaturado, formando novamente o L. na segunda equação de
propagação. O término da lipoperoxidação ocorre quando os radicais (L. e LOO.)
produzidos nas etapas anteriores propagam-se até se destruírem.
A peroxidação lipídica pode levar à perda da fluidez e aumento da permeabilidade
das membranas, com liberação de nutrientes no espaço extracelular, e até mesmo a
ruptura da membrana e morte celular (Ferreira e Matsubara, 1997; Damasceno e cols.,
2002). As substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) são os principais
marcadores biológicos desse tipo de lesão em membranas celulares (Draper e Hadley,
1990).
Entre as várias modificações oxidativas ocorridas com aminoácidos e proteínas, a
carbonilação é considerada um marcador inicial de degradação proteica. A carbonilação
de proteínas pode também ser formada da reação de aldeídos (formados da peroxidação
lipídica) com proteínas. A presença de proteínas carboniladas em amostras de células e
tecidos tornou-se amplamente aceito como marcador de estresse oxidativo (Granot e
Kohen, 2004).
Estresse oxidativo e exercício
Especíes reativas de oxigênio podem ser geradas durante e após o exercício físico
nos músculos e nos tecidos que sofrem o processo de isquemia-reperfusão (Sjödin e cols.,
1990; Witt e cols., 1992; Alessio, 1993; Aruoma, 1994; Ji, 1995). Estima-se que 2 - 5% do
total de elétrons que se perdem vão formar ERO como o radical superóxido, o peróxido
de hidrogênio e o radical hidroxil (Boveris e Chance, 1973).
9
OLIVEIRA, E. C.
Durante o exercício podem ser apontadas como fontes de ERO: uma maior
oxidação de purinas, os danos a proteínas que contém ferro na sua composição, a
perturbação da homeostase do Ca2 (Jackson, 2000) e a indução da produção do ERO pelo
endotélio (Shi e col., 2001). A ativação de neutrófilos e sua infiltração no músculo após a
lesão pelo exercício também pode produzir ERO (Jones e cols., 1986), sendo uma das
causas da produção de ERO após o exercício.
Alterações nas enzimas antioxidantes induzidas pelo exercício também ocorrem
em outros tecidos além do músculo esquelético. Em eritrócitos de humanos o exercício
aeróbico (mas não anaeróbico) resultou em aumento na atividade da CuZn-SOD e na
atividade da GPx (Selamoglu e cols., 2000; Miyazaki e cols., 2001), embora não tenha sido
observada diferença para atividade da CAT.
A mudança de padrão de atividade em resposta ao exercício pode ser influenciada
pelo grau de treinamento. Em atletas treinados o exercício exaustivo foi capaz de
aumentar a atividade da CAT e da GPx, sem modificar a atividade da CuZn-SOD de
eritrócitos (Tauler e cols., 1999).
No músculo diafragma de ratos, o treinamento agudo (cinco dias) aumentou tanto
os mecanismos enzimáticos de defesa antioxidantes (CAT, GPx e CuZn-SOD), como os
mecanismos não enzimáticos (Vrabas e cols., 1999; Vincent e cols., 2000).
Também foi demonstrado que enzimas antioxidantes no fígado são afetadas pelo
exercício, com relatos tanto de aumento como de diminuição na atividade de CuZn-SOD,
CAT e GPx, sendo que algumas dessas diferenças em resposta ao exercício estão
relacionadas à hipertensão espontânea (Wilson e Johnson, 2000 ).
Aumentos transitórios nas atividades de enzimas antioxidantes (CAT, CuZn-SOD
GPx) podem ocorrem imediatamente (Ji e Fu, 1992; Ji e cols., 1992; Lawler e cols., 1993;
Laaksonen e cols., 1999; Terblanche, 1999) ou logo após o exercício (Criswell e cols.,
1993; Leeuwenburgh e cols., 1994). No entanto, o treinamento físico gera respostas
adaptativas mais duradouras no tecido (Kihlstrom, 1992; Alessio, 1993; Lawler e cols.,
1994; Kim e cols., 1996) melhorando, possivelmente, a capacidade antioxidante (Laughlin
e cols., 1990; Powers e Criswell, 1996).
10
OLIVEIRA, E. C.
Expressão gênica de enzimas antioxidantes
Durante o exercício aeróbico, o musculo esquelético pode produzir quantidades
significativas de ânion superóxido (O2-), devido ao aumento de consumo de oxigênio, que
pode se elevar em até 90 vezes em relação os valores obtidos em repouso (Ji, 1995; Ji e
cols., 1998; Sen, 2001; Khassaf e cols., 2003; Mastaloudis e cols., 2004). Os locais de
produção de ERO nos músculos são: o sistema xantina-oxidase no citosol, o complexo
NADPH-oxidase na membrana plasmática (Lagranha e cols., 2005), e a cadeia
transportadora de elétrons na mitocôndria (Bejma e Ji, 1999; Banerjee e cols., 2003).
Assim, alguns estudos têm demostrado que o treinamento aeróbio é capaz de gerar um
aumento na atividade da CAT, CuZn-SOD e GPx em ratos, demonstrando uma adapatação
que ocorre na tentativa de combater o maior extresse oxidativo gerado pelo exercício
(Meydani e cols., 1992; Jenkins, 1993; Powers e cols., 1994; Leeuwenburgh e cols., 1997;
Hollander e cols., 2000).
As espécies reativas de oxigênio podem modular a atividade das enzimas
antioxidantes, regulando os níveis de RNAm através da ativação de vias de sinalização
(Fulle e cols., 2004). De acordo com Franco e cols. (1999), o aumento dos níveis RNAm de
enzimas antioxidantes coincide com o aumento do dano oxidativo em proteínas,
apoiando a hipótese da relação entre aumento do estresse oxidativo levando ao aumento
da expressão de RNAm da enzimas antioxidantes. Na realidade, as espécies reativas de
oxigênio desempenham um papel muito importante na regulação de diversas funções
celulares, agindo como segundos mensageiros, e ativando fatores de transcrição
específicos, tais como o “activator protein 1” (AP-1) e o “nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells” (NF-kB) (Dalton e cols., 1999; Zhou e cols., 2001; Khassaf e
cols., 2003). Os elementos de resposta ao AP-1 e NF-kB estão presentes nas regiões
promotoras dos genes que codificam as enzimas antioxidantes (Zhou e cols., 2001). É a
combinação de AP-1 e NF-kB com outros fatores de transcrição sensíveis ao estado redox
que determina qual enzima antioxidante será induzida e em que medida.
AP-1 é um fator de transcrição dimérico composto de subunidades de ativação (cFos e C-Jun) e de subunidades inibitórias (Fra-1 e Fra-2), que podem gerar heterodímeros
diferentes modulando assim a expressão genes-alvo. O NF-kB também atua como um
11
OLIVEIRA, E. C.
fator dimérico que no citosol é mantido em um estado inativo quando ligado às
subunidades inibitórias (I-kB) (Catani e cols., 2004). Em células musculares, as espécies
reativas de oxigênio podem induzir a degradação das subunidades inibitórias ligadas às
subunidades p65, p50 e RelB do NF-kB, levando a uma translocação rápida de NF-kB para
o núcleo ativando a transcrição de genes específicos (Muller e cols., 1997). AP-1 também
é ativado por espécies reativas de oxigênio. O estresse oxidativo induz a ligação de
proteínas do complexo AP-1 (c-Fos e C-Jun) com o DNA (Gomez Del Arco e cols., 1997).
Zhou e cols. (2001) demostraram que o uso de inibidores específicos do NF-kB
bloquearam a expressão de enzimas antioxidantes como a catalasee e a glutationa
peroxidase, confirmando a hipótese de que as espécies reativas de oxigênio podem
modular os níveis de RNAm de enzimas antioxidantes pela ativação de fatores de
transcrição, como o NF-kB e AP-1.
A transcrição de enzimas do sistema de defesa antioxidante também pode ocorrer
através da ativação dos elementos de resposta antioxidante (ARE - antioxidant responsive
element) quando os mesmos são ativados pelo fator de transcrição Nrf2 (NF-E2-related
factor) (Masella e cols., 2005). O Nrf2 é um fator de transcrição sensível a modificações
no estado redox e se localiza no citoplasma em um complexo inativo ligado a proteína
repressora Keap1 (Kelch-like ECH associating protein 1). Após a exposição a estímulos próoxidante os resíduos de cisteína da Keap1 são oxidados ou mofdificados covalentemente
e o Nrf2 é libertado (Kensler e cols., 2007).
Semelhantemente ao que acontece com o NF-kB e o AP-1, o Nrf2 pode sofrer
translocação para o núcleo e formar um heterodímero com outros fatores de transcrição.
No caso do Nrf2 haveria formação do heterodímero com pequenas proteínas da família
maf, e então aconteceria a ligação com as sequências regulatórias dos ARE, na região
promotora de diversos genes alvo, ativando sua transcrição (Itoh e cols., 1997).
Dentre os genes alvo que apresentam a sequência de ARE na região promotora,
encontram-se os genes da γ-GCS (Chan e Kwong, 2000), GPx, CuZn-SOD, CAT e glutationaS-transferase (GST) (Kong e cols., 2001).
De acordo com Schoneich (2006), mais de 200 diferentes modificações póstranslacionais são induzidas por processos enzimáticos e não enzimáticos, e as
12
OLIVEIRA, E. C.
modificações de proteínas específicas acompanham o processo biológico de
envelhecimento.
Como o exercício pode aumentar o estresse oxidativo, conforme discutido
anteriormente, sua influencia na expressão gênica de enzimas antioxidantes vem sendo
estudada. Aoi e cols. (2004) demonstraram que o exercício agudo com duração de uma
hora pode aumentar a expressão nuclear de fatores de transquição como o p65, o CINC-1,
e o MCP-1 no músculo gastrocnemio de ratos.
Também foi demonstrado, em arteríolas coronárias, que o treinamento físico
aumentou o nível de expressão de CuZn-SOD, mas não afetou os níveis de Mn-SOD ou da
CAT (Rush e cols., 2000). Foi sugerido que isso pode aumentar a dilatação vascular,
permitindo uma eliminação mais rápida de ânion superóxido, fato que pode prolongar a
vida média do oxido nítrico nas células.
Além disso, foi descrito que uma sessão única de exercício pode ter um efeito
significativo sobre a expressão de enzimas antioxidantes. Hollander e cols. (2001)
demonstraram que o exercício exaustivo estimula a transcrição do RNAm de Mn-SOD de
fibras musculares do tipo IIa (mais oxidativas) no músculo vasto lateral de ratos. Eles
também observaram que CuZn-SOD foi aumentada após a sessão de exercícios, mas neste
caso o controle parecia ser pós-transcricional porque o nível de RNAm para esta proteína
não foi alterado.
Foi demonstrado ainda que mudanças na expressão de enzimas antioxidantes de
diversos tecidos de ratos (músculo esquelético, miocárdio, fígado e rim) persistiram por
pelo menos sete dias após o termino do exercício, indicando que tais mudanças não são
alterações transitórias de curto prazo (Hong e Johnson, 1995; Wilson e Johnson, 2000).
Não foram encontrados trabalhos que estudaram os efeitos da recuperação
nutricional de uma desnutrição protéica sobre a expressão de enzimas antioxidantes.
Assim, o presente trabalho investigou os efeitos da desnutrição e da recuperação
nutricional sobre a expressão dessas enzimas. Da mesma forma, os efeitos do
treinamento sobre a expressão de enzimas anitioxidantes de animais em processo de
recuperação nutricional também não foram avaliados até o momento.
13
OLIVEIRA, E. C.
Desnutrição e exercício
Há mais de 40 anos, Fuge e cols. (1968) estudaram exercício e desnutrição em
modelo animal. Eles utilizaram uma dieta com baixa concentração de proteínas (8% de
caseína) em termos de porcentagem do peso total da dieta em comparação à utilização
de ração comercial (25% de proteínas) no grupo controle. O protocolo de exercício foi a
corrida forçada em esteira rolante onde ao final de 3 meses os ratos correram 120
minutos/dia a uma velocidade de 31 metros/minuto com 8 graus de inclinação, com 12
“sprints” de um minuto a uma velocidade de 42 metros/minuto em intervalos de 10
minutos. Os autores avaliaram as atividades da citocromo oxidase, succinato oxidase e
succinato desidrogenase, além dos níveis de citocromo-C e mioglobina no músculo
esquelético e sugeriam que os animais desnutridos apresentam maior capacidade para
corrida em função de seu menor peso corporal.
Em outro trabalho os autores repetiram a dieta hipoproteica (8% de caseína) e
utilizaram como dieta controle uma dieta manipulada que continha 22% de caseína. Da
mesma forma ao final de 3 semanas os ratos correram 120 minutos/dia a uma velocidade
de 31 metros/minuto, com 8 graus de inclinação, com 12 “sprints” de um minuto a uma
velocidade de 42 metros/minuto em intervalos de 10 minutos. Nesse trabalho os autores
avaliaram a ingestão alimentar, peso corporal, ganho de peso, quantidade de água,
proteína, gordura e cinzas da carcaça dos animais e concluiram que o exercício acarreta
modificações na composição corporal, diminuindo a porcentagem de gordura da carcaça
desses animais, com conseqüente aumento da massa magra (Crews e cols., 1969).
No trabalho de Hansen-Smith e cols. (1977), foram utilizadas dietas contendo 27%
15% ou 8% de proteína por 10 semanas, ministradas “ad libitum” a três grupos de
animais, além de restrição no oferecimento em 35% das dietas contendo 27% e 15% a
outros dois grupos. Foi observado que os animais desnutridos apresentaram maior
consumo de oxigênio que animais controle, e ainda que a restrição protéica ou a restrição
na ingestão energética podem influenciar a performance de maneira diferente, não sendo
possível explicar a diferença baseando-se no peso corporal
14
OLIVEIRA, E. C.
Na década de 1980, Oldfors e Sourander (1985) utilizaram dietas contendo 14% de
proteína para animais controle e dietas contendo 1,5% de proteína para o grupo
desnutrido. No treinamento progressivo em esteira rolante que teve duração de 12
semanas, onde os ratos correram 60 minutos a 18 m/mim nas duas últimas semanas com
inclinação da esteira de 12 graus. Esses autores relataram que animais desnutridos
sedentários sofreram mais atrofia muscular que animais exercitados e que o treinamento
impediu a perda de mitocôndrias no sarcolema de animais desnutridos, porém
exercitados. Assim, surgiu a hipótese de que o músculo esquelético se adapta ao estado
nutricional e que essa adaptação pode ser alterada pela modificação das demandas
impostas ao músculo, como acontece no exercício. Essa hipótese, já naquela época, era
um forte argumento para se estudar atividade física e nutrição.
Mais tarde, Mello (1994) utilizou dieta controle contendo 25% de proteína e dieta
hipoprotéica contendo 6% de proteína para gerar desnutrição em ratas durante a
gestação e lactação. Os filhotes (fêmeas) também se alimentaram dessas dietas, do
nascimento até o sacrifício, que ocorreu aos 45 dias. Foi realizada uma única sessão de
exercício e foi possível observar que a desnutrição causou aumento nas concentrações
musculares de glicogênio, e que uma única sessão de exercício provocou grande
utilização desse substrato nos animais desnutridos. Os animais desnutridos foram capazes
de manter altas concentrações de glicose circulante, talvez em função dos níveis elevados
de ácidos graxos livres. Durante o exercício, glicose sanguínea e glicogênio muscular são
as principais fontes de carboidratos. Foi constatado por esse estudo que animais
desnutridos não mobilizariam o glicogênio de maneira significativa durante o exercício
agudo e sim utilizavam dos ácidos graxos livres (AGL) como substratos energéticos.
Em outro estudo foram utilizadas fêmeas onde o grupo controle recebeu 17% de
proteínas até 70 dias de idade, no grupo recuperado mães e filhotes receberam 6% de
proteína durante a gestação e lactação e posteriormente 17% de proteína do desmame
aos 70 dias, e o grupo desnutrido recebeu 6% de proteína da vida uterina até os 70 dias.
O exercício foi realizado a partir do 30º dia, e o protocolo consistia de 60 mim/dia, por 5
dias/semana, durante 40 dias. Os autores concluíram que o exercício pode ser
considerado como coadjuvante no processo de recuperação nutricional, uma vez que o
15
OLIVEIRA, E. C.
mesmo estimulou o crescimento linear sem causar prejuízos na homeostase bioquímica
do organismo (Silva e cols., 1999).
O estudo de Galdino e Mello (2000) utilizou uma dieta controle contendo 17% de
proteína e dieta para desnutrição contendo 6% de proteína durante 17 dias (gestação). O
treinamento em natação também se estendeu por 17 dias, com sobrecarga de 5% da
massa corporal afixado ao tronco, 5 dias por semana, durante 60 mim/dia. Os autores
observaram que o treinamento físico minimizou os efeitos deletérios da desnutrição e
não prejudicou a gestação e nem o desenvolvimento fetal de ratas Wistar.
Outro estudo do mesmo grupo (Galdino e cols., 2000) realizou uma desnutrição
intra-uterina e o desmame dos animais aos 21 dias. O treinamento consistia de
60mim/dia, cinco dias/semana, com sobrecarga 5% do peso corporal e foi realizado do
desmame aos noventa dias de vida. Os autores observaram também que a liberação de
insulina induzida pela glicose é reduzida em ratos que receberam a dieta com baixas
concentrações protéicas (6%), mas que esse efeito é contraposto pela maior sensibilidade
dos tecidos alvos à insulina, o que permite manter a glicemia em níveis normais. Essa
adaptação permite aos animais desnutridos preservar a sua habilidade de resposta ao
exercício aeróbio. Então, o treinamento aeróbico mostrou-se benéfico aos animais
desnutridos, pois causou maior crescimento corporal sem desregular a homeostasia da
glicose.
O trabalho mais recente no qual foram utilizadas dietas manipuladas, uma
contendo 17% e outra contendo 6% de proteína, foi o de Papoti e cols. (2003). Neste
trabalho, entretanto, não foi realizado um protocolo de treinamento, mas sim quatro
testes de esforço (natação) para determinar se a máxima fase estável de lactato sofre
influencia da recuperação nutricional.
Os demais trabalhos encontrados na literatura realizaram restrição protéica para
obter animais desnutridos e não mais dietas aprotéicas como fora feito no passado. A
restrição foi feita tanto em experimentos que utilizaram dietas manipuladas (Lewis e
cols., 1998), quanto em experimentos que utilizaram dietas comerciais (Agote e cols.,
2001; Gavete e cols., 2002; Lewis e cols., 1997; Santos-Cunha e cols., 2004).
16
OLIVEIRA, E. C.
Pelo exposto, observa-se que os poucos trabalhos que estudaram a desnutrição
associada ao exercício analisaram quase sempre os mesmos parâmetros gerando algumas
respostas e muitas perguntas sobre a maneira através da qual o exercício pode trazer
benefícios, mesmo para organismos desnutridos, ou em processo de recuperação
nutricional.
Mais recentemente, há cerda de 5 anos o modelo de desnutrição utilizado no
Laboratório de Nutrição Experimentol (Labnex) da Universidade Federal de Ouro Preto,
consistia em desnutrir os ratos utilizando uma dieta aproteica por 30 dias a partir dia do
desmame dos animais. Após 30 dias os animais desnutridos passavam a receber uma
dieta com 5% de proteína com o objetivo de manter o estado de desnutrição. Nesse
mesmo experimento o protocolo de exercício, consistia de uma adaptação ao meio
líquido com duração de uma semana, seguida de oito semanas de treinamento em
natação com duração de trinta minutos diários, cinco dias por semana, durante oito
semanas. Com esses protocolos observou-se que o treinamento em natação não alterou
os valores séricos de albumina e proteínas totais, entretanto gerou um aumento no peso
do fígado, em função de um maior acumulo de gordura. Em relação aos rins o aumento
do peso pode ser devido à adaptação de origem multifatorial à sobrecarga imposta pela
atividade física, uma vez que os valores séricos de creatinina e uréia, não foram alterados
pela atividade física, dieta ou interação entre os dois fatores. Os músculos sóleo e
extensor longo dos dedos apresentaram menor atrofia nos animais desnutridos treinados
e esse benefício foi mais pronunciado no sóleo. Estes resultados sugerem que as
características metabólicas do músculo se sobressaiam sobre a hipótese do músculo
atrofiar menos em função de suportar maior peso corporal durante exercício de corrida,
levantada por outros autores (Oliveira e cols. 2006 - a).
Estes mesmos protocolos foram usados para estudar os efeitos do treinamento
físico sobre a recuperação nutricional de uma desnutrição proteica. Observou-se que
parâmetros bioquímicos nutricionais como a concentração de uréia e creatinina, o ganho
de peso, a ingestão alimentar e a eficiência alimentar foram influenciados apenas pelo
estado nutricional e que o protocolo de treinamento não modificou tais parâmetros
(Noujeimi e cols., 2006). Observou-se também que o exercício não foi capaz de alterar as
17
OLIVEIRA, E. C.
concentrações séricas de glicose e albumina de ratos dos grupos controle, recuperado e
desnutrido, ao passo que esses parâmetros sofreram influencia do estado nutricional
(Oliveira e cols. 2006 - b).
Em outro trabalho do mesmo grupo observou-se que o treinamento em natação
promoveu maior ganho de peso nos ratos desnutridos e que o protocolo de recuperação
nutricional foi eficiente em promover a recuperação do peso dos animais recuperado
sedentário, mas o treinamento não foi capaz de aumentar significativamente o peso dos
animais recuperado treinado. Por outro lado, o treinamento melhorou a performance
aeróbia gerando uma menor concentração de lactato circulante nos animais treinados
(Noujeimi e cols., 2007).
No experimento seguinte, mais uma vez, observou-se que o treinamento em
natação promoveu maior ganho de peso nos ratos desnutridos. Por outro lado, os animais
recuperados apresentaram maior eficiência alimentar, com consequente aumento no
ganho de peso, mas o treinamento não alterou esse quadro. A elevação das
concentrações de uréia sérica sugeriu que tanto os animais desnutridos quanto os
recuperados apresentaram comprometimento da função renal (Oliveira e cols. 2007 - a).
Nesse experimento observou-se ainda que as concentrações séricas de colesterol total e
das frações de colesterol foram maiores nos animais desnutridos. Estes dados mostraram
que o treinamento em natação reduziu os níveis de colesterol nos animais recuperados
(Oliveira e cols. 2007 - b).
Conforme se observou nos experimentos anteriores, o peso dos animais
recuperado sendentário se igualou ao peso dos animais controle sedentário e controle
treinado, entretanto o treinamento não interferiu na recuperação nutricional, uma vez
que os pesos de recuperado sendentário e recuperado treinado também foram
estatisticamente iguais. Além da recuperação do peso corporal, as atividades de enzimas
hepáticas dos animais recuperados estavam mais próximas aos valores dos animais
controle, ao passo que animais desnutridos apresentaram um comprometimento
hepático devido à elevação da atividade de tais enzimas (Oliveira e cols., 2008 - a).
Havia sido descrito que crianças com desnutrição do tipo marasmática
apresentavam valores para atividade da paraoxonase menores que crianças eutróficas, o
18
OLIVEIRA, E. C.
que poderia resultar em um aumento no estresse oxidativo (Ece e cols., 2007), pois
acredita-se que a capacidade antioxidante atribuída à molécula de HDL se deva à ação
dessa enzima associada. Assim, avaliaou-se o estresse oxidativo e o perfil lipídico de
animais desnutridos e submetidos ao exercício físico de natação. Observou-se que o
treinamento aplicado causou aumento no peso corporal dos animais desnutrido treinado.
Observou-se ainda que a desnutrição promoveu um aumento significativo nas
concentrações séricas de colesterol total e colesterol HDL, e que o exercício não foi capaz
de reverter esse aumento. Os aumentos nas concentrações de HDL nos animais
desnutridos não foram seguidos de aumento na atividade da paraoxonase, isso sugere
que as moléculas de HDL dos animais desnutridos talvez não desempenhem a função
antioxidante esperada. Observou-se também que os animais desnutridos sofreram maior
estresse oxidativo, demonstrado pelo aumento nas concentrações das sulfidrilas e que
treinamento físico não interferiu nesse processo (Oliveira e cols., 2008 - b).
A partir de então, como os ratos recuperados sedentários sempre tinham um peso
corporal semelhante aos animais controle, optou-se por modificar o protocolo de
desnutrição. Desse momento em diante, iniciou-se a desnutrição no dia do nascimento
dos filhotes, substituindo a dieta das ratas que haviam parido por uma dieta hipoprotéica
(6% de caseína). Como consequência, as ratas produziam uma quantidade menor de leite,
que era dividida pelo mesmo número de filhotes das ratas mantidas em dieta
normoprotéica. No momento em que os filhotes começavam a se alimentar de dieta
sólida, além do leite materno, também era essa a dieta que eles tinham acesso. Os ratos
desnutridos permaneciam recebendo essa dieta durante todo o período do experimento,
ao passo que os animais do grupo recuperado passaram a receber a dieta do grupo
controle a partir do dia do desmame, ou seja, aos vinte e oito dias de vida. O protocolo de
treinamento em natação foi mantido, e assim, foi observado que o mesmo gera um maior
consumo alimentar sem, contudo, levar a um ganho de peso significativo, mesmo em
animais em processo de recuperação nutricional, agora de uma desnutrição proteica
iniciada no momento do nascimento. Com a mudança no protocolo de desnutrição os
animais não apresentaram uma recuperação nutricional no período estudado e que o
treinamento aplicado não foi capaz de interferir nesse processo (Oliveira e cols., 2009 - a).
19
OLIVEIRA, E. C.
Uma das adaptações que ocorrem na desnutrição é a diminuição dos níveis de
atividade física gerada pela baixa ingestão protéico-calórica. Se a carência persistir, o
organismo reage com a desaceleração do crescimento e, na tentativa de manter a
homeostase, lança mão de suas reservas energéticas incluindo as proteínas musculares.
Pouco se sabe sobre os efeitos crônicos da realização de exercício em organismos em
processo de recuperação nutricional e menos se sabe sobre marcadores da função renal
nesse contexto. Assim, estudou-se o efeito do treinamento físico crônico (24 semanas)
associado ou não à recuperação nutricional sobre marcadores bioquímicos da função
renal. Verificou-se que o protocolo de treinamento de 30 minutos diários, cinco dias por
semana, e com duração de 24 semanas não prejudicou a recuperação nutricional,
considerando os parâmetros avaliados (Oliveira e cols., 2009 - b). Usando o mesmo
protocolo, o treinamento associado à recuperação nutricional não afetou a função
hepática, pois não gerou aumento nas atividades de alanima aminotransferase (ALT) e
aspartato aminotransferase (AST) (Oliveira e cols., 2009 - c).
Por fim com esse novo modelo de desnutrição utilizado no Labnex observou-se
que os ratos em processo de recuperação nutricional apresentaram níveis de proteínas
totais e albumina menores que os controles, porém, o protocolo de treinamento em
natação reverteu este efeito (Silva e cols., 2010 - a). Além disso, a desnutrição diminuiu a
atividade da catalase e da superóxido dismutase, revelando uma alteração no balanço
redox dos animais. Porém, o treinamento físico reverteu estes efeitos, indicando ser
capaz de prevenir danos promovidos pelo estresse causado pela desnutrição (Silva e cols.,
2010 - b).
Desnutrição e estresse oxidativo
O estado nutricional da mãe é o mais importante fator maternal que pode
influenciar o retardo no crescimento intrauterino da prole (Villar e Belizan, 1982). A
desnutrição envolve a deficiência não apenas de macro nutrientes como as proteínas,
gorduras, carboidratos, mas também resulta em concentrações subfisiológicas de muitos
20
OLIVEIRA, E. C.
micronutrientes. Alguns sistemas de defesa antioxidante dependem dos micronutrientes
ou são os próprios micronutrientes (Evans e Halliwell, 2001).
As proteínas são fontes de aminoácidos para síntese de enzimas dos sistemas de
defesa antioxidante como a GSH, assim, poder-se-ia esperar uma diminuição nas defesas
antioxidantes como resultado da desnutrição. Foi demonstrado que crianças nascidas
com baixo peso para idade gestacional, filhas de mães desnutridas, apresentaram um
aumento na peroxidação lipídica e uma redução nos sistemas de defesa antioxidante
(CuZn-SOD, CAT e GSH) medidos no sangue do cordão umbilical em comparação com as
mesmas análises feitas com neonatos que tinham um adequado peso para idade
gestacional e eram filhos de mulheres bem nutridas. Entretanto, os autores assumiram
que o desenho experimental não permitiu inferir se o estresse oxidativo é causa ou efeito
do retardo no crescimento intrauterino (Gupta e cols., 2004).
Foi demonstrado que crianças marroquinas desnutridas apresentaram menores
concentrações de vitaminas antioxidantes (retinol, alfa tocoferol e carotenoides) e
minerais (zinco, cobre e selênio) além de uma elevação nos níveis de substâncias reativas
ao acido tiobarbitúrico (TBARS) em comparação com crianças saudáveis da mesma área
(Squali Houssaïni e cols., 1997).
De acordo com Squali Houssaïni e cols. (2001), a desnutrição proteico-calórica não
é necessariamente associada com a deficiência de ácidos graxos essenciais, mas essa
deficiência pode estar relacionada com o agravamento da desnutrição e dos parâmetros
inflamatórios. Estes autores afirmaram ainda que o desbalanço entre ácidos graxos poliinsaturados e os níveis de antioxidantes (selênio e vitamina E), associado com aumento
dos níveis de peroxidação lipídica (TBARS) presente em todos os indivíduos com
desnutrição moderada ou severa e que apresentavam ou não deficiência de ácidos graxos
essenciais, pode ser um marcador precoce de desnutrição proteico-calórica.
21
OLIVEIRA, E. C.
OBJETIVOS
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Investigar a influência dos marcadores de estresse oxidativo e o perfil de enzimas
antioxidantes de ratos no processo de recuperação nutricional, assim como a influência
do exercício físico sobre o estresse oxidativo em ratos desnutridos.
Objetivos Específicos
Investigar os efeitos da desnutrição proteica e da recuperação nutricional sobre a
expressão gênica de enzimas antioxidantes, sobre biomarcadores do estresse oxidativo e
sobre marcadores bioquímicos nutricionais.
Estudar os efeitos do treinamento físico em sobre biomarcadores do estresse
oxidativo e marcadores bioquímicos nutricionais em ratos desnutridos e em processo de
recuperação nutricional.
22
OLIVEIRA, E. C.
MATERIAIS E MÉTODOS 1
MATERIAIS E MÉTODOS – PRIMEIRO EXPERIMENTO
1) Animais e grupos experimentais
Foram utilizadas ratas Fischer distribuídas em dois grupos, de acordo com teor
proteico da dieta recebida do nascimento até o desmame (28 dias de vida), a saber:
a) Grupo Controle, ratas que receberam dieta AIN-93M (Reeves e cols., 1993) (Tabela 1);
b) Grupo Desnutrido, ratas que receberam dieta Hipoproteica (AIN-93M, modificado o
teor de caseína para 6%) (Tabela 1).
Após o desmame, aos 28 dias de idade, os animais foram subdivididos em três
grupos experimentais de acordo com o teor proteico da dieta recebida até o desmame e
após o desmame por mais nove semanas, o que caracterizou a segunda etapa do
experimento. Cada grupo continha 8 animais, e os grupos tinham as seguintes
características:
a) Controle: animais alimentados com dieta controle;
b) Desnutrido: animais alimentados com dieta hipoproteica;
c) Recuperado: animais alimentados com dieta hipoproteica até o desmame e
alimentados com dieta controle durante as nove semanas pós desmame. O gráfico 1
ilustra a divisão dos grupos.
23
OLIVEIRA, E. C.
MATERIAS E MÉTODOS 1
Controle
Controle (n=8)
Dieta Controle
Dieta Controle
28 dias
9 semanas
Recuperado (n=8)
24 ratas
Dieta Controle
Desnutrido
9 semanas
Dieta Hipoproteica
28 dias
Desnutrido (n=8)
Dieta Hipoproteica
9 semanas
Gráfico 1. - Divisão dos grupos experimentais - experimento I
2) Dietas e condições experimentais
A dieta controle utilizada foi a AIN-93M modificando-se as concentrações
proteicas para se obter uma dieta hipoproteica, conforme apresentado na Tabela I. A
mistura de vitaminas e a mistura de minerais foram manipuladas no próprio laboratório,
seguindo as recomendações de Reeves e cols. (1993). As dietas foram igualmente
preparadas e armazenadas sob refrigeração (- 4 °C), até o momento do uso.
Os animais receberam água filtrada e dieta ad libitum e foram mantidos em
gaiolas individuais em ambiente com ciclos de claro/escuro de doze horas e temperatura
de 25 ± 1 °C. Esse trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)
da Universidade Federal de Ouro Preto.
24
OLIVEIRA, E. C.
Tabela I. Composição das dietas em gramas para cada 1000g de dieta.
Composição
Dieta Controle AIN-93M
Dieta Hipoproteica
Amido de milho
715,5g
802,5g
Caseína
147,0g
60,0g
Sacarose
100g
100g
Óleo
40,0g
40,0g
Fibra
50,0g
50,0g
Mistura de Minerias1
35,0g
35,0g
Mistura de Vitaminas2
10,0g
10,0g
Colina
2,5g
2,5g
1
Mistura de Minerais (g/kg mistura): Carbonato de cálcio (357,00); Fosfato de potássio (250,00);
Cloreto de sódio (74,00); Sulfato de potássio (46,60); Citrato de potássio (28,00); Oxido de
magnésio (24,00); Citrato férrico (6,06); Carbonato de zinco (1,65); Carbonato de manganês
(0,63); Carbonato de cobre (0,30); Iodeto de potássio (0,01); Selenato de sódio (0,01025);
Paramolibidato de amônio (0,00795); Meta-silicato de sódio (1,45); Sulfato de potássio e cromo
(0,275); Ácido bórico (0,0815); Fluoreto de sódio (0,0635); Carbonato de níquel (0,0318); Cloreto
de lítio (0,0174); Vanadato de amônio (0,0066); Sacarose (209,806).
2
Mistura de Vitaminas (g/kg mistura): Ácido nicotínico (3,000); Pantotenato de cálcio (1,600); HCLpiridoxina (0,700); HCL-Tiamina (0,600); Riboflavina (0,600); Ácido fólico (0,200); Biotina (0,020);
Vitamina B-12 (cianocobalamina) (0.1% in manitol) (2,500); Vitamina E (all-rac-a-tocoferol
acetato) (500 lu/g) (15,00); Vitamina A (all-trans-retinil palmitato) (500,000 lu/g) (0,800); Vitamina
D3 (colecalciferol) (400,000 lu/g) (0,250); Vitamina K (filoquinona) (0,075); Sacarose (974,655).
3) Teste Oral de Tolerância à Glicose (TOTG)
O teste oral de tolerância à glicose foi realizado na última semana de experimento,
72 horas antes do sacrifício. Os animais permaneceram em jejum por 12 horas e amostras
de sangue foram coletadas da veia caudal antes (tempo 0) e após 30, 60 e 120 minutos da
administração, por gavagem, de uma solução de glicose (concentração final de 2g de
glicose por Kg de peso corporal) (Mello e cols., 2001). Os níveis de glicose foram
determinados através do glicosímetro digital (Accu-Check Active; Roche Diagnosis, Basel,
Switzerland). Após a coleta dos dados foi calculada a área total sob a curva para cada
animal aplicando a regra trapezoidal de forma automatizada utilizando-se o software
Prism® da GraphPad versão 4.03 para Windows, GraphPad Software, San Diego,
25
OLIVEIRA, E. C.
Califórnia, USA, www.graphpad.com. Os valores da área total sob a curva para cada
animal foram agrupados nos respectivos grupos experimentais e as comparações foram
feitas conforme os demais parâmetros.
4) Eutanasia e coleta de material biológico
Os animais foram pesados, anestesiados com isoflurano e sofreram eutanázia por
ensanguinação após um jejum de 8 horas. Cada gaiola foi cuidadosamente inspecionada e
o alimento e as bandejas colocadas sob as gaiolas para coletar as fezes foram retirados
para garantir que o animal não tivesse acesso sequer às próprias fezes durante o período
de jejum, evitando assim a coprofagia.
O sangue foi coletado por secção do plexo braquial e posteriormente centrifugado
a 10000 rpm (rotações por minuto) por 15 minutos para obtenção do soro e plasma, que
foram guardados sob refrigeração (- 4 °C). Todas as dosagens no soro ou plasma foram
realizadas em até quatro dias após o sacrifício.
Após a coleta do sangue o abdômen e o tórax de cada animal foram abertos para
coleta e pesagem do fígado e do rim. O gastrocnêmio da pata traseira esquerda de cada
animal também foi localizado, coletado e pesado em balança digital.
5) Dosagens bioquímicas
As dosagens foram realizadas de acordo com as orientações do fabricante dos kits
(Labtest Diagnóstica). Foram feitas dosagens das concentrações séricas de Albumina,
Proteínas Totais e Glicose. Também foram determinadas as atividades da Aspartato
Aminotransferase (AST), e da Alanina Aminotransferase (ALT). Para leitura das amostras
foram utilizados espectrofotômetros Femto 600 S, 600 PLUS e 700 S. As demais dosagens
foram feitas seguindo as metodologias a seguir.
26
OLIVEIRA, E. C.
6) Marcadores de estresse oxidativo e enzimas antioxidantes
a) Grupos Sulfidrilas no Soro
Princípio da técnica
Determinação de grupos sulfidrilas totais em amostras biológicas, utilizando o
reagente de Ellman (DNTB), conforme proposto por Sedlak e Lindsay (1968). Os grupos
tióis reagem com DNTB formando um composto colorido, que absorve luz a 412nm.
Reagentes utilizados e forma de preparo
1) Tampão Tris-HCl, pH = 8,2: Foram dissolvidos 24,22g de Trizma Base (121,1Da) e 8,32g
de Ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA; 416,21Da; 99%m/m) em 800mL de água
destilada. O pH foi ajustado em 8,2 usando HCl 3 mol/L. Quantidade suficiente de água
destilada foi adicionada para completar o volume final de 1.000mL. A solução final
continha 30mmol/L de Trizma Base e 3mmol/L de EDTA. A solução foi armazenada em
temperatura ambiente.
2) Tampão Tris-HCl, pH = 8,9: Foram dissolvidos 48,44g de Trizma Base (121,1Da) e 8,32g
de EDTA (416,21Da; 99%m/m) em 800mL de água destilada. Ajustou-se o pH em 8,9
usando HCl 3 mol/L. Quantidade suficiente de água destilada foi adicionada para
completar o volume final de 1.000mL. A solução final continha 30mmol/L de Trizma Base
e 3mmol/L de EDTA. A solução foi armazenada em temperatura ambiente.
3) Cloreto de Trietanolamina (TEA): Foram dissolvidos 1,33mL de cloreto de
trietanolamina (TEA; 185,7 Da) e quantidade suficiente de água destilada foi utilizada
para completar o volume final de 500mL.
27
OLIVEIRA, E. C.
4) Ácido Tricloroacético (TCA): Foram dissolvidos 10g de ácido tricloroacético (TCA;
163,4Da; 70%m/v; 1,63g/mL) em 70mL de água destilada. A solução foi agitada e água
destilada foi adicionada para completar o volume para 100mL.
5) Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-nitrobenzóico) (DTNB): Foram dissolvidos 10mg de ácido 5,5´ditio-bis-(2-nitrobenzóico) (DTNB; Reagente de Ellman; 396,3Da) em 14,71mL de metanol
(32,04Da; 0,79g/mL). Este reagente foi preparado no momento da dosagem e foi mantido
no gelo enquanto era utilizado.
6) Cisteína estoque: Foram dissolvidos 12mg de cisteína (121,16Da) em volume de TEA
suficiente para 5mL. A solução final continha 20mmol/L de cisteína. Este reagente foi
preparado no momento da dosagem e foi mantido no gelo enquanto era utilizado.
Curva padrão para sulfidrilas totais
Para determinar a concentração de sulfidrila foi feito um padrão dissolvendo
49,5µL de cisteína estoque em 949,5µL de TEA. Seis tubos de polipropileno foram
identificados e seguiu-se o seguinte procedimento de pipetagem:
TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
TUBO 4
TUBO 5
TUBO 6
Concentração (µMol/L)
0
50
100
250
500
1000
Padrão Cisteína (µL)
0
25
50
125
250
500
500
475
450
375
250
0
TEA (µL)
Procedimento de dosagem de sulfidrilas:
Para cada amostra, adicionaram-se 800µL de metanol, 150µL de Tris-HCl, pH = 8,2,
50µL de DTNB e 40µL de amostra (ou da série de padrões). Amostras ou padrões foram
centrifugados à 10000g durante 15 minutos à temperatura ambiente. O ponto de
concentração “zero” da curva padrão foi utilizado para zerar o espectrofotômetro e as
absorbâncias das amostras foram lidas em 412nm, à 25°C.
28
OLIVEIRA, E. C.
Cálculos
Foi feito um gráfico expressando a concentração do padrão (Eixo Y) X absorbância
do padrão (Eixo X). Após uma regressão linear, foi determinada a equação da reta. Esta
equação foi utilizada para determinar a concentração de sulfidrilas. Todas as
concentrações foram obtidas em mol/L.
b) Superóxido Dismutase no Soro
Utilizou-se o kit Fluka número 19160 (USA), que utiliza um sistema de geração de
ânions superóxido, xantina e xantina oxidase, e avalia a capacidade da solução teste, sob
condições padrões, em inibir a reação do ânion superóxido com o WST (2-(4 iodofenil)-3(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio). Esta reação quando ocorrida forma um composto
denominado formazan que absorve luz à 450nm (conforme mostra o esquema abaixo).
Preparo dos reagentes
1) WST – solução de trabalho: Foi diluído 1mL de WST em 19mL de solução tampão.
2) Solução de enzima de trabalho: Foram diluídos 15µL da solução de enzima com 2,5mL
do tampão diluído.
29
OLIVEIRA, E. C.
Procedimento de dosagem
Em uma placa de ELISA, procedeu-se a dosagem conforme o quadro abaixo:
Amostra
Branco 1
Branco 2
20µL
-
20µL
-
20µL
-
20µL
3 - WST de trabalho
200µL
200µL
200µL
200µL
4 - Enzima de trabalho
20µL
20µL
20µL
-
-
-
-
20µL
1 - Amostra
2 - H2O destilada
5 - Tampão diluído
Branco 3
A placa de ELISA foi incubada por 20 minutos à 37 °C e em seguida as absorbâncias
das amostras foram lidas à 450nm no leitor de ELISA.
Cálculos
Atividade (velocidade de inibição) =
[((A branco 1-A branco 3) – (A amostra – A branco 2))/( A branco 1-A branco 3))*100].
Portanto a atividade da enzima superóxido dismutase foi determinada através da
habilidade da superóxido dismutase contida no soro em inibir a reação do ânion
superóxido com o WST.
c) Superóxido Dismutase nos Tecidos
Este método é baseado na habilidade da superóxido dismutase presente na
amostra de remover o O2-, diminuindo assim a razão de auto oxidação do pirogalol.
Reagentes
30
OLIVEIRA, E. C.
1) Tampão Fosfato à 50mM; 2) Pirogalol à 15mM (PM = 126,11); 3) MTT (brometo de (3[4,5-dimetiltiazol-2H]-2,5-difeniltetrazolium) à 1,25mM (PM = 414,3); 4) DMSO
(dimetlsulfóxido)
Preparo do homogenato
Para cada 100mg de tecido foi adicionado 1mL de tampão fosfato (50mM). O
tampão estava gelado e o homogenato foi armazenado no gelo até a centrifugação por 10
minutos a 12000rpm à 4 °C. Em seguida foi retirado o sobrenadante para ser utilizado na
dosagem.
Ensaio:
1) Os reagentes e amostras foram pipetados em uma placa de Elisa conforme quadro
abaixo:
Amostra
Tampão
MTT (1,25mM)
Pirogalol (15mM)
Branco
------------
144L
6L
------------
Padrão
------------
129L
6L
15L
Amostra
30L
99L
6L
15L
2) A placa foi incubar por 5 minutos em estufa, à 37 °C.
3) A reação foi interrompida com 150L de DMSO adicionado em todos os poços.
4) A placa foi lida no leitor de ELISA à 570 nm.
Cálculo da Atividade Enzimática:
Como 1 unidade (U) de CuZn-SOD é responsável pela oxidação de 50% do pirogalol,
portanto:
Abs do padrão -------------1U de CuZn-SOD
Abs da amostra -------------
x
31
OLIVEIRA, E. C.
A concentração de CuZn-SOD no tecido foi dada em relação à concentração de
proteínas totais. A concentração de proteínas totais foi determinada (no mesmo
sobrenadante) utilizando-se método de Lowry e cols. (1951) (descrito abaixo). Portanto o
resultado foi expresso em U/mg de proteína.
d) Concentração de Glutationa Total em Tecidos
Utilizou-se o kit Sigma número CS0260. A glutationa está presente nas células
principalmente na sua forma reduzida (GSH) representando em torno de 90%, o restante
aparece na forma de glutationa oxidada (GSSG). Este kit utiliza um método cinético para
mensurar os níveis de glutationa total (GSH+GSSG) em amostras biológicas, através da
redução do DTNB (Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-nitrobenzóico)) à TNB.
Reações:
1) 2GSH + DTNB  GSSG + 2TNB
2) GSSG + NADPH + H+ Glutationa redutase 2GSH + NADP+
A combinação das duas reações:
DTNB + H+ + NADPH
Glutationa redutase 2TNB + NADP+
GSSG/GSH
Preparo dos reagentes de estoque
1) Solução de ácido sulfosalicílico (SSA) 5%.
2) Tampão fosfato 5 X (500mM), contendo 5mM EDTA.
32
OLIVEIRA, E. C.
3) Solução padrão estoque de glutationa: 0,3 mg de glutationa reduzida em 0,1mL de
água destilada.
4) Solução de estoque de DTNB: 8mg de DTNB foram diluídos em 5,33mL de
dimetilsulfóxido (DMSO), resultando em uma solução com 1,5mg/mL de concentração.
5) Estoque de NADPH (solução de 40mg/mL).
Preparação da amostra biológica
Uma porção de 100mg de tecido foi homogeneizado com 1mL de ácido de
sulfosalicílico 5% (SSA), e em seguida centrifugado a 10000g, por 10 minutos à 4 °C. O
sobrenadante foi retirado e utilizado como amostra biológica.
Preparo dos reagentes de trabalho
1) Solução de enzimas diluída: foram diluídas 15,2µL de glutationa redutase
(100unidades/mL) em 250µL de tampão fosfato 1x.
2) Solução de NADPH de trabalho: Da solução de estoque de NADPH anteriormente
preparada foram retirados 30µL para 7,5mL de tampão fosfato 1x.
3) Mistura de trabalho: 8mL de tampão 1x, 228µL da solução de enzimas diluída e 228µL
de DNPH solução de estoque.
4) Solução padrão de glutationa – preparada para a curva padrão: foram diluídas 10µL de
solução estoque de glutationa padrão com 2mL de ácido SSA à 5%.
Procedimento para dosagem
A confecção da curva padrão e as dosagens nas amostras foram feitas em placas
de Elisa. Os reagentes e a sequência de adições estão descritas nas tabelas abaixo.
33
OLIVEIRA, E. C.
Procedimento para curva padrão
Poço
1
2
3
4
5
[GSH] µM
50
25
12,5
6,25
3,125
Solução de GSH (µL)
50
25(tubo 1)
25(tubo 2)
25(tubo 3)
25(tubo 4)
-
25
25
25
25
0,5
0,25
0,125
0,062
0,0312
SSA 5% (µL)
nmoles de GSH em 10
µL de amostra
Procedimento para o teste
Amostra
SSA 5%
Mistura de trabalho
-
10 (µL)
150 (µL)
Padrão (tubos preparados para a curva)
10 (µL)
-
150 (µL)
Amostra
10 (µL)
-
150 (µL)
Branco
As amostras foram incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida,
50µL de NADPH foram adicionados às mesmas e o cronômetro disparado. As
absorbâncias das amostras foram lidas durante 5 minutos, no leitor de ELISA à 412 nm.
Cálculos
Foi feito um gráfico utilizando os pontos obtidos na curva padrão e foi
determinada a equação da reta. Esta equação foi utilizada para determinar a
concentração em nmoles de glutationa total em 10µL de amostra, e este valor convertido
para 1mL de amostra.
e) Atividade da Catalase nos tecidos
34
OLIVEIRA, E. C.
Determinação da atividade da enzima catalase baseado na sua capacidade de
converter o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio molecular, conforme
descrito por Aebi (1984).
Uma porção de 100mg de tecido foi homogeneizada com 1mL de tampão fosfato
0,1M, pH 7,2 e, em seguida, centrifugada por 10 minutos à 4 °C. O sobrenadante foi
retirado e utilizado como amostra biológica.
Em um tubo de polipropileno foram colocados 50L de tampão fosfato pH 7,2;
(0,1mM) e 40L de água destilada, o qual foi mantido em banho maria 30 °C por 1
minuto. Em seguida foram adicionados 10L da amostra e 900L de H2O2 (10mM). A
solução foi homogeneizada e o espectrofotômetro foi zerado com H2O2 (10mM) em
240nm. As absorbâncias das amostras foram determinadas a exatamente a cada minuto,
durante cinco minutos.
Cálculos
Considerando que 1U de catalase é equivalente a hidrólise de 1mol de H2O2 (ε =
39,4 L.mol-1.cm1) por minuto, conforme Aebi (1984). Usualmente a atividade dessa
enzima é representada em Unidade por mL de amostra. Calculou-se a atividade da
catalase segundo a lei de Lambert Beer.
A absorbância utilizada nessa expressão é o delta obtido das cinco absorbâncias
lidas (absorbância final – absorbância inicial / 4).
A atividade de catalase no tecido foi dada em relação à concentração de proteínas
totais. A concentração de proteínas totais foi determinada (no mesmo sobrenadante)
35
OLIVEIRA, E. C.
utilizando-se o método de Lowry e cols. (1951) (descrito abaixo). Portanto, o resultado foi
expresso em U/mg de proteína.
f) Proteína Carbonilada em Tecidos
A oxidação de proteína por espécies reativas de oxigênio leva à formação de
derivados carbonílicos. Estes podem ser mensurados por métodos sensíveis,
particularmente aqueles que utilizam o 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). O DNPH reage
com grupos carbonílicos gerando a hidrazona correspondente, a qual pode ser analisada
espectrofotometricamente. A determinação da concentração sérica de proteína
carbonilada foi realizada conforme descrito por Levine e cols. (1990).
Uma porção de 200mg do tecido foi homogeneizada com 1mL de tampão fosfato
50mM, pH: 6,7 contendo EDTA 1mM e em seguida, centrifugado a 10000g por 10 minutos
à 4 °C. O sobrenadante foi retirado e utilizado como amostra biológica.
1) Ácido Clorídrico 2,5M.
2) DNPH (2,4-dinitrofenilhidrazina): 0,01g de DNPH foi diluído em 10mL de HCL 2,5M
(preparado anteriormente) obtendo uma solução com 0,1% de DNPH. Esta solução foi
estocada no escuro à 4 °C. Esta solução é estável por uma semana.
3) Solução de TCA (ácido tricloroácetico) à 10%.
4) Dodecil Sulfato de Sódio - SDS à 6%.
5) Mistura de etanol e acetato de etila: em um béquer foi misturado 30mL de etanol e
30mL de acetato de etila. Esta mistura foi mantida refrigerada.
36
OLIVEIRA, E. C.
Para cada amostra utilizou-se dois tubos de polipropileno, um foi denominado de
Amostra (A) e outro de Controle (C).
Foram colocados 500L de homogeneizado de tecido em cada tubo (amostra (A) e
controle (C)). Em seguida, foram adicionados aos tubos 500L de TCA à 10%. Os tubos
foram misturados no vórtex e logo após, foram centrifugados (tubo A e C) à 5000g por
10minutos à 4 °C. Em seguida, foi adicionado ao tubo A 500L de DNPH (2,4dinitrofenilhidrazina) e ao tubo C 500L de HCL à 2,5M. Ambos foram mantidos no escuro
à temperatura ambiente por um período de 30 minutos e a cada intervalo de 15 minutos
os tubos foram misturados no vórtex. Em seguida, foram adicionados 500L de ácido
tricloroácetico (TCA) à 10% em cada tubo, que foram misturados no vórtex e
centrifugados à 5000g por 10minutos à 4 °C. O sobrenadante dos tubos foi descartado
após a centrifugação e 1mL da mistura de etanol com acetato de etila foi adicionado aos
tubos que em seguida foram misturados no vórtex. Uma nova centrifugação foi realizada.
Em seguida, o sobrenadante dos tubos A e C foram novamente descartados e à estes
tubos foram adicionados mais 1mL da mistura etanol e acetato de etila, os tubos foram
misturados no vórtex e novamente centrifugados. No final das centrifugações, o
sobrenadante dos tubos A e C foram descartados e foi adicionado em ambos os tubos
1mL de SDS à 6%, as soluções foram misturadas no vórtex e centrifugadas à 10000g por
10minutos à 4 °C. Ao final, o sobrenadante dos tubos foram retirados e transferidos para
cubeta, onde foram lidos no espectrofotômetro à 370nm.
Cálculos
A concentração de proteína carbonilada foi determinada utilizando-se a seguinte
equação de Lambert Berr: A  C.b.
Onde: A é a subtração da absorbância do tubo A (amostra) pela absorbância do tubo C
(controle); C é a concentração; b é o caminho óptico; e ε é o coeficiente de extinção
molar.
37
OLIVEIRA, E. C.
O conteúdo de proteína carbonilada foi calculado usando-se o coeficiente de
extinção molar de 22 000M-1 cm-1 e expresso por nmol de proteína carbonilada formada
por miligrama de proteína.
A concentração de proteína carbonilada no tecido foi dada em relação à
concentração de proteínas totais. A concentração de proteínas totais foi determinada (no
mesmo sobrenadante) utilizando-se método de Lowry e cols. (1951) (descrito abaixo).
Portanto, o resultado foi expresso em nmol/mg de proteína.
g) Concentração de TBARS em Tecidos
Determinação da concentração de TBARS baseada na capacidade do ácido
tiobarbitúrico (TBA) em se ligar a lipídeos oxidados, esta dosagem foi realizada conforme
descrito por Buege e Aust (1978).
Uma porção de 100mg de tecido foi homogeneizado com 1mL de tampão fosfato,
pH 7,4 e em seguida centrifugado por 10 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e
utilizado como amostra biológica.
Em cada tubo foram colocados 500L de homogeneizado, 250L de ácido
tricloroacético (TCA) à 28% dissolvido em HCl à 0,25N, 250L de ácido tiobarbitúrico à 1%
dissolvido em ácido acético 1:1 e 125L de BHT 5mM dissolvido em etanol. Os tubos
foram misturados no vórtex e colocados em banho maria a 95 °C por 15 minutos. Após
esse período, os tubos foram centrifugados por 10 minutos à 10000g. O sobrenadante foi
lido no espectrofotômetro à 535nm, que foi previamente zerado com água destilada.
38
OLIVEIRA, E. C.
Cálculos
A concentração de TBARS foi determinada utilizando-se o coeficiente de extinção
molar ε = 1,56 X 105 L.mol-1.cm-1, segundo a lei de Lambert Beer. Usualmente, essa
concentração é representada em nmoles por miligramas de proteína.
A concentração de TBARS no tecido foi dada em relação à concentração de
proteínas totais. A concentração de proteínas totais foi determinada (no mesmo
sobrenadante) utilizando-se o método de Lowry e cols. (1951) (descrito abaixo). Portanto,
o resultado foi expresso em nmol/mg de proteína.
h) Concentração de Proteínas Totais em Tecidos – Método de Lowry
O método é baseado nas ligações das proteínas, que em meio alcalino, ocorre com
os íons cobre (Cu2+) formando uma cor azul que é dependente, em parte, do índice de
tirosina e triptofano da amostra, já que os íons cobre catalisam a oxidação de
aminoácidos aromáticos. Este método foi descrito por Lowry e cols. (1951).
1) Reagente A: Foram dissolvidos 0,25g de sulfato de cobre e 0,5 de citrato de sódio em
100mL de água destilada. A solução foi armazenada, no escuro, em temperatura
ambiente.
2) Reagente B: Foram dissolvidos 5g de carbonato de sódio e 1g de hidróxido de sódio em
250mL de água destilada. A solução foi armazenada em temperatura ambiente.
3) Reagente C: No momento do teste foi adicionado 1mL do reagente A para cada 50mL
do reagente B.
4) Reagente D: No momento do teste foi adicionado 1mL de Folin-Ciocateau para cada
1mL de água destilada.
39
OLIVEIRA, E. C.
Curva padrão para proteínas totais:
Foram realizados quatro pontos para a curva seguindo o seguinte procedimento:
1) P1- 25µL de uma solução estoque de proteínas a 0,2mg/dL e o volume completado
com água destilada para 100mL. A concentração final obtida deste ponto foi de
0,05mg/mL.
2) P2- 7,5µL de uma solução estoque de proteínas a 2mg/dL e o volume completado com
água destilada para 100mL. A concentração final obtida deste ponto foi de 0,15mg/mL.
3) P3- 715µL de uma solução estoque de proteínas a 2mg/dL e o volume completado com
4) P4- 25µL de uma solução estoque de proteínas a 2mg/dL e o volume completado com
Procedimento de dosagem de proteínas totais:
Em um tubo de polipropileno foram pipetados 10µL de amostra ou padrão e
completados para 100µL com água destilada. O branco, usado para zerar o
espectrofotômetro, foi feito apenas com 100µL de água destilada. Posteriormente, foi
adicionado 1mL do reagente C em todos os tubos. A solução foi misturada no vórtex e
mantida a temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, foi adicionado 100µL do
reagente D em cada tubo. A solução foi misturada e mantida a temperatura ambiente, no
escuro, por 30 minutos. A leitura foi feita em espectrofotômetro à 660nm.
Cálculos
Foi feito um gráfico expressando a concentração do padrão (Eixo Y) x absorbância
do padrão (Eixo X). Foi determinada a equação da reta e essa equação foi utilizada para
determinar a concentração de proteínas totais nos homogenatos de tecidos. Todas as
concentrações foram obtidas em mg/mL.
40
OLIVEIRA, E. C.
7) Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real
Coleta do material
Após a eutanásia dos animais os tecidos foram congelados e mantidos a uma
temperatura de – 80 °C até serem processados.
Extração do RNA total
A extração do RNA total dos tecidos foi feita de acordo com as recomendações do
kit RNAgents® Total RNA Isolation System - (Promega Corporation, Madison, USA).
Resumidamente, 50mg de tecido foram homogeneizados com 600μl de solução
desnaturante. A separação da fase aquosa foi feita através da adição de 60μL de acetato
de sódio 2M e 600μL de fenol: clorofórmio, álcool isoamílico (25:24:1) e centrifugação a
10.000 rpm por 20 minutos a 4 °C. Para a precipitação do RNA adicionou-se, à fase
aquosa, igual volume de isopropanol, a mistura foi então incubada a -20 °C por 20
minutos e depois centrifugada a 10.000 rpm a 4 °C. O precipitado foi lavado com etanol
75% seco a temperatura ambiente por 15 minutos e posteriormente resuspendido com
100μL de água deionizada livre de RNAse. A concentração e pureza do RNA total foi
verificada a 260 e 280nm no espectrofotômetro Nano Vue da GE Healthcare (Reino
Unido).
Síntese do cDNA
O ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 2μg
de RNA total utilizando o kit Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription da Applied
Biosystems, (Foster City, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante. O meio de
reação continha 2μL de tampão 10x (500mM de KCl, 100mM deTris-HCl, 25mM de MgCl2,
pH 8,3), 0,8μL da mistura de desoxiribonucleotídeos trifosfato (dNTPs) 100mM, 2μL de
primers randômicos e 1μL da enzima transcriptase reversa MultiScribe (50U/μL). A reação
41
OLIVEIRA, E. C.
foi realizada nas seguintes condições: 10 minutos a 25 °C, seguido de 120 minutos a 37 °C
e 5 minutos a 85 °C no termociclador Biocycler modelo MJ96+.
Desenho dos primers
Os primers utilizados para a amplificação dos transcritos de interesse foram
desenhados de acordo com sequências de nucleotídeos publicadas por Xiong e cols.
(2010) para Catalase, γ−GCS, CuZn-SOD e GADH.
Especificidade dos iniciadores para qPCR
Antes de realizar o PCR quantitativo (qPCR), cada iniciador foi testado quanto à
sua eficiência de amplificação. A eficiência dos iniciadores foi realizada através de uma
curva utilizando-se diluições seriadas de 1000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01 nanogramas do cDNA
preparado. Cada reação foi feita em triplicata e consistiu de uma mistura de 12,5μl de 2X
SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1μl de 10μM de iniciador e 2μl de
cDNA de concentração correspondente. A reação foi incubada na máquina de PCR Tempo
Real ABI 7300 (Applied Biosystems). Depois de uma etapa inicial de 50 °C por 2min para
ativação da ampUNG e 95 °C por 10min para inativação ampUNG e ativação da TaqGOLD,
foram feitos 40 ciclos de 60 e 95 °C por 1min cada um. Em seguida, foi feito um gráfico a
partir dos valores do Ct e da concentração da amostra em cada uma das diluições. O
cálculo da eficiência da PCR foi feito a partir da inclinação das retas.
RT-PCR quantitativa em tempo real
Para a análise da expressão dos genes em estudo foi utilizada a técnica da reação
em cadeia da polimerase quantitativa pós-transcrição reversa (qRT-PCR). A quantificação
dos produtos formados durante os ciclos de amplificação foi realizada com o reagente
Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) que emite fluorescência. A
análise da expressão gênica foi feita através do cálculo relativo delta-Ct. O Ct é o primeiro
42
OLIVEIRA, E. C.
ciclo de amplificação no qual a fluorescência é detectada acima da linha basal. As reações
foram realizadas em placas de 96 poços, com um volume final de reação de 25μl que foi
feita em triplicata e consistiu de uma mistura de 12,5μl de 2X SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems), 1μl de 10 μM de iniciador (0,5μl de primer forward e 0,5μl de
primer reverse) e 2μl de cDNA.
A reação foi incubada em termociclador ABI 7300 (Applied Biosystems). Depois de
uma etapa inicial de 50 °C por 2 min para ativação da ampUNG e 95 °C por 10 min para
inativação ampUNG e ativação da TaqGOLD, foram feitos 40 ciclos de 60 e 95 °C por 1 min
cada. Posteriormente, foi feita uma curva de dissociação, o que indica a especificidade do
primer utilizado. A especificidade dos produtos obtidos foi confirmada pela análise das
curvas de dissociação do produto amplificado ao final de cada reação. O gerenciamento
do termociclador e a coleta dos dados gerados durante a amplificação foram realizados
pelo programa 7000 System SDS Software (Applied Biosystems). O valor do delta-Ct foi
calculado pela subtração do Ct do gene de referência (GAPDH) pelo Ct do gene alvo. A
partir do delta-Ct foi calculado o delta-delta-Ct, que consiste na subtração do delta-Ct dos
grupos testes pelo delta-Ct do grupo controle. A razão de expressão dos grupos foi
calculada a partir da fórmula: 2 - delta-delta-Ct
8) Tratamento estatístico
Os dados foram analisados quanto à normalidade utilizando-se o teste de
normalidade de D'Agostino e Pearson (omnibus K2 test). Depois de verificada a
normalidade, parte dos dados foi comparada pela Análise de Variância (Anova One Way),
adotando p < 0,05 para aceitar as diferenças significativas. O pós-teste escolhido foi o de
Tukey para comparações múltiplas, também adotando p < 0,05 para aceitar as diferenças
significativas. Para análise da expressão gênica, em função da natureza dos dados, foi
realizado o teste não paramétrico Kruskal-Wallis, seguido do teste para comparações
múltiplas de Dunn, ambos adotando p < 0,05 para aceitar as diferenças significativas. A
razão de expressão de RNAm é dada em função dos valores do grupo controle, por esse
motivo a barra correspondente a esse grupo aparece sem o desvio padrão. As análises
43
OLIVEIRA, E. C.
estatísticas e os gráficos foram feitos utilizando-se o software Prism® da GraphPad versão
4.03 para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, USA, www.graphpad.com.
44
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
RESULTADOS DO EXPERIMENTO 1 – ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO, POR MEIO DE
NO PROCESSO DE RECUPERAÇÃO NUTRICIONAL.
soro.
Após um período de desnutrição, que teve duração de 28 dias e que correspondeu
ao período da amamentação, os animais desnutridos foram redistribuídos em 2 grupos:
desnutrido e recuperado. Portanto, nesse momento a média de peso corporal dos
animais que permaneceram no grupo desnutrido e dos animais que foram alocados no
grupo recuperado foi estatisticamente igual e menor do que a média do peso corporal
dos animais do grupo controle (gráfico 2). Ao final do período de recuperação os animais
do grupo recuperado apresentaram peso estatisticamente maior que os animais do grupo
desnutrido, sendo, entretanto, esse peso estatisticamente menor que os animais do
grupo controle (gráfico 2). O ganho de peso e a ingestão alimentar dos animais do grupo
recuperado foram iguais aos apresentados pelos animais do grupo controle e ambos os
grupos foram superiores aos apresentados pelos do grupo desnutrido (gráfico 2).
45
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
Gráfico 2. Peso corporal inicial, peso corporal final, ganho de peso e ingetão alimentar de animais dos
grupos experimentais. Houve diferença significativa para Anova One Way (p < 0,0001 para peso corporal
inicial, peso corporal final e ganho de peso); (p = 0,0002 para ingestão alimentar). O Pós-teste de Tukey
indicou diferença significativa entre controle e desnutrido (*p < 0,001 para o peso corporal inicial, peso
corporal final e ganho de peso; *p < 0,05 para ingestão alimentar), entre controle e recuperado (*p < 0,001
para peso inicial) e entre desnutrido e recuperado (*p < 0,001 para peso final, ganho de peso e ingestão
alimentar). Valores apresentados em média ± desvio padrão. O grande grupo de animais desnutridos
representado aqui pelos grupos desnutrido + recuperado, apresentou peso inicial 36% menor que os
animais do grupo controle.
As concentrações séricas de proteínas totais e albumina nos animais do grupo
recuperado foram iguais às do grupo controle, e maiores do que as concentrações
apresentadas pelos desnutridos (gráfico 3). A concentração sérica de glicose nos animais
do grupo recuperado foi igual à apresentada pelos do grupo desnutrido e ambas foram
menores do que a apresentada pelo grupo controle (gráfico 3). Já para o teste oral de
tolerância à glicose, os animais desnutridos apresentaram os menores valores, com o
grupo recuperado apresentando valores intermediários e os maiores valores ficando com
o grupo controle (gráfico 3).
46
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
Gráfico 3. Concentrações séricas de proteínas totais, albumina, glicose e teste oral de tolerância à glicose
de animais dos grupos experimentais. Houve diferença significativa para Anova One Way (p = 0,0149 para
proteínas totais; p < 0,0001 para albumina e teste oral de tolerância à glicose e p = 0,0037 para glicose). O
Pós-teste de Tukey indicou diferença significativa entre controle e desnutrido (*p < 0,05 para proteínas
totais e glicose; *p < 0,001 para albumina e teste oral de tolerância à glicose) entre desnutrido e
recuperado (*p < 0,05 para proteínas totais e teste oral de tolerância à glicose; *p < 0,001 para albumina) e
entre controle e recuperado (*p < 0,01 para glicose e teste oral de tolerância à glicose). Valores
apresentados em média ± desvio padrão.
A atividade sérica da alanina aminotransferase, assim como a atividade sérica da
aspartato aminotransferase nos animais do grupo desnutrido, foi maior do que no grupo
controle e do que no recuperado (gráfico 4). A porcentagem de inibição da superóxido
dismutase sérica não foi diferente entre os animais dos grupos desnutrido e recuperado,
entretanto ambos foram menores que os valores apresentados pelo grupo controle
(gráfico 4). Os valores de sulfidrilas séricas foram menores nos animais do grupo
desnutrido em comparação ao controle (gráfico 4).
47
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
Gráfico 4. Atividade de alanina aminotransferase (ALT), atividade de aspartato aminotransferase (AST),
porcentagem de inibição da Superóxido Dismutase (SOD) e concentração de sulfidrilas no soro de animais
dos grupos experimentais. Houve diferença significativa para Anova One Way (p < 0,0001 para ALT, AST; p
= 0,0074 para SOD e p = 0,0060 para sulfidrilas). O Pós-teste de Tukey indicou diferença significativa entre
controle e desnutrido (*p < 0,001 para ALT e AST; *p < 0,01 para Sulfidrilas; *p < 0,05 para SOD), entre
desnutrido e recuperado (*p < 0,001 para ALT e AST) e entre controle e recuperado (*p < 0,01 para SOD).
Valores apresentados em média ± desvio padrão.
Expressão gênica de enzimas antioxidantes no coração e músculo
A razão de expressão do RNAm de CuZn-SOD no coração foi maior nos animais do
grupo desnutrido em relação à do grupo recuperado (gráfico 5), ao passo que a razão de
expressão do RNAm da catalase não apresentou diferenças significativas entre os grupos
(gráfico 5). Já a razão de expressão do RNAm da Gama-glutamil-cisteina sintase (γ-GCS)
apresentou-se maior no coração dos animais do grupo recuperado em relação à do grupo
desnutrido (gráfico 5).
48
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
Gráfico 5. Razão de expressão do RNAm de zinco-superóxido dismutase (CuZn-SOD), catalase e gamaglutamil-cisteina sintase (γ-GCS) no coração de animais dos grupos experimentais. Houve diferença
significativa para o teste de Kruskal-Wallis (p = 0,0398 para CuZn-SOD; p = 0,0443 para γ-GCS) e não houve
diferença para catalase (p =0,8212). O pós-teste de Dunn indicou diferença significativa entre desnutrido e
recuperado (*p < 0,05 para CuZn-SOD e para γ-GCS). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
No músculo gastrocnêmio, a razão de expressão do RNAm de CuZn-SOD foi maior
nos desnutridos, tanto na comparação com os controles como com os recuperados
(gráfico 6), a razão de expressão do RNAm da catalase também não apresentou
diferenças significativas entre os grupos (gráfico 6), ao passo que a razão de expressão do
RNAm da Gama-glutamil-cisteina sintase (γ-GCS) apresentou-se maior no músculo
gastrocnêmio dos animais do grupo desnutridos em relação aos animais do grupo
desnutrido (gráfico 6).
49
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
Gráfico 6. Razão de expressão do RNAm de zinco-superóxido dismutase (CuZn-SOD), catalase e gamaglutamil-cisteina sintase (γ-GCS) no músculo gastrocnêmio de animais dos grupos experimentais. Houve
diferença significativa para o teste de Kruskal-Wallis (p = 0,0113 para CuZn-SOD; p = 0,0174 para γ-GCS) e
não houve diferença para catalase (p =0,3919). O pós-teste de Dunn indicou diferença significativa entre
controle e desnutrido (*p < 0,05 para CuZn-SOD) e entre desnutrido e recuperado (*p < 0,05 para CuZn-SOD
e para γ-GCS). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
Enzimas antioxidantes e marcadores de estresse oxidativo no fígado, coração e músculo
esquelético
No coração, os animais do grupo desnutrido e os do grupo recuperado
apresentaram níveis elevados de glutationa na comparação com os do grupo controle
(gráfico 7). Os níveis de TBARS foram menores nos animais dos grupos desnutrido e
recuperado na comparação com os animais do grupo controle (gráfico 7). Os níveis de
proteína carbonilada apresentaram-se elevados nos animais do grupo desnutrido e os
animais dos grupos controle e recuperado apresentaram valores estatisticamente iguais
50
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
(gráfico 7). A atividade de CuZn-SOD também foi maior nos animais do grupo desnutrido
em comparação ao controle e ao recuperado (gráfico 7).
Gráfico 7. Concentrações de glutationa, de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), de
proteína carbonilada e atividades da catalase e da superóxido dismutase (CuZn-SOD) no coração de
animais dos grupos experimentais. Houve diferença significativa para Anova One Way (p < 0,0001 para
glutationa; p = 0,0008 para proteína carbonilada; p = 0,0023 para CuZn-SOD e TBARS). Não houve diferença
para Anova One Way (p = 0,8842 para catalase). O Pós-teste de Tukey indicou diferença significativa entre
controle e desnutrido (*p < 0,001 para glutationa e proteína carbonilada; *p < 0,01 para CuZn-SOD e
TBARS), entre controle e recuperado (*p < 0,001 para glutationa; *p < 0,05 TBARS) e entre desnutrido e
recuperado (* p < 0,01 para CuZn-SOD; *p < 0,05 para proteína carbonilada). Valores apresentados em
média ± desvio padrão.
A concentração de glutationa no músculo gastrocnêmio foi diminuída pela
desnutrição, entretanto, os valores dos animais do grupo controle e animais do grupo
recuperado não foram diferentes (gráfico 8). Os níveis de TBARS dos animais do grupo
desnutrido foram maiores do que aqueles apresentados pelos animais do grupo controle
51
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
e do grupo recuperado (gráfico 8). As concentrações de proteína carbonilada e a
atividade da CuZn-SOD não apresentaram diferenças (gráfico 8). A atividade da catalase
mostrou-se aumentada nos animais do grupo desnutrido em relação ao controle,
entretanto, os valores dos animais recuperados e controles apresentaram igualdade para
a atividade dessa enzima (gráfico 8).
proteína carbonilada e atividades da catalase e da superóxido dismutase (CuZn-SOD) no músculo
gastrocnêmio de animais dos grupos experimentais. Houve diferença significativa para Anova One Way (p
= 0,0008 para glutationa; p = 0,0126 para TBARS; p = 0,0491 para catalase). Não houve diferença para
Anova One Way (p = 0,5695 para proteína carbonilada; p = 0,6125 para CuZn-SOD). O Pós-teste de Tukey
indicou diferença significativa entre controle e desnutrido (*p < 0,01 para glutationa; *p < 0,05 para
catalase e TBARS) e entre desnutrido e recuperado (*p < 0,01 para glutationa; *p < 0,05 para TBARS).
A concentração de glutationa no fígado foi diminuída pela desnutrição,
entretanto, os valores dos animais do grupo controle e animais do grupo recuperado não
52
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 1
foram diferentes (gráfico 9). Os níveis de TBARS foram menores no fígado dos animais dos
grupos desnutrido e recuperado na comparação com os animais do grupo controle
(gráfico 9). A concentração de proteína carbonilada e a atividade da catalase não
apresentaram modificações no fígado (gráfico 9) ao passo que a atividade de CuZn-SOD
foi maior no fígado dos animais do grupo desnutrido em comparação com os do grupo
controle enquanto os animais recuperados apresentaram valores iguais, tanto ao grupo
controle quanto ao desnutrido (gráfico 9).
proteína carbonilada e atividades da catalase e da superóxido dismutase (CuZn-SOD) no fígado de
animais dos grupos experimentais. Houve diferença significativa para Anova One Way (p < 0,0001 para
glutationa e TBARS; p = 0,0329 para CuZn-SOD). Não houve diferença para Anova One Way (p = 0,4862 para
proteína carbonilada; p = 0,7656 para catalase). O Pós-teste de Tukey indicou diferença significativa entre
controle e desnutrido (*p < 0,001 para glutationa e TBARS; *p < 0,05 para CuZn-SOD), entre controle e
recuperado (*p < 0,001 para TBARS) e entre desnutrido e recuperado (*p < 0,001 para glutationa). Valores
apresentados em média ± desvio padrão.
53
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
DISCUSSÃO DO EXPERIMENTO 1 – ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO, POR MEIO DE
NO PROCESSO DE RECUPERAÇÃO NUTRICIONAL.
A dieta de desnutrição utilizada no presente experimento foi efetiva em produzir
um grupo de animais com peso corporal em média 36% menor do que o grupo controle
em apenas 28 dias (gráfico 2). O menor peso corporal de ratos submetidos à desnutrição
proteica foi relatado por outros autores (Escriva e cols., 1991; Gobatto e Mello, 1991;
Mello, 1994; Latorraca, 1998) e também pelo nosso grupo de pesquisa (Oliveira, 2007).
Os animais em processo de recuperação nutricional do presente experimento
ganharam peso (gráfico 2) se comparados aos animais desnutridos além de apresentarem
uma ingestão alimentar (gráfico 2) semelhante à do grupo controle, ambos maiores do
que o grupo desnutrido. Entretanto, o peso final (gráfico 2) permaneceu inferior ao dos
animais do grupo controle, apesar de ser também maior que o do grupo desnutrido.
Estudo prévio realizado em nosso laboratório, utilizando dieta aproteica por 30
dias, oferecida aos animais após o desmame, seguido de um período de recuperação
também de nove semanas demostrou que os animais do grupo recuperado atingiram
igualdade de peso com os animais do grupo controle (Oliveira, 2007). Isso sugere que
uma dieta deficiente em proteína ministrada logo após o nascimento pode gerar danos
que demoram mais para serem revertidos que uma dieta sem proteína oferecida após o
desmame, e/ou que o período de recuperação do presente experimento não foi
suficiente para se observar o retorno do peso dos animais aos níveis do grupo controle.
A recuperação nutricional também foi estudada em crianças e foi observado que
durante a recuperação nutricional, a taxa de crescimento foi 15 vezes maior do que a
apresentada por crianças normais da mesma idade e 5 vezes maior do que outras crianças
com altura e peso semelhantes (Ashworth, 1969).
Os animais do grupo recuperado do presente estudo apresentaram níveis de
glicose sérica (gráfico 3) iguais aos animais do grupo desnutrido no momento do sacrifício
e ambos foram menores que os animais do grupo controle. Existem duas hipóteses para
explicar a baixa concentração sérica de glicose em animais desnutridos e recuperados: a
primeira seria menor absorção intestinal de carboidratos e a segunda seria a maior
54
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
captação de glicose pelos tecidos periféricos, principalmente nos músculos e fígado em
função de uma maior sensibilidade à insulina.
Para testar a primeira hipótese foi realizado um teste oral de tolerância à glicose
(gráfico 3) e foi observado que uma parte da redução da glicemia se deve realmente a
uma menor absorção, pois os animais desnutridos e recuperados apresentaram uma área
sob a curva de glicemia menor do que os animais controle. Esse resultado sugere
anormalidade no processo absortivo da glicose e é oposto ao observado por Mello e Cury
(1989) que não observaram diferença entre animais submetidos à restrição proteica e
animais controle.
A substituição de proteínas por carboidratos com o objetivo de tornar as duas
dietas utilizadas no experimento isocalóricas torna a dieta hipoproteica hiperglicídica, o
que também parece causar déficit na absorção de carboidratos (Marcondes, 1976;
Gobatto, 1997).
Outra parte da redução da glicemia também pode ter ocorrido em função de
maior sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos dos animais desnutridos e
recuperados, pois já foi relatado que a sinalização da insulina em suas etapas iniciais
encontrou-se mais ativa em músculo e fígado de animais desnutridos (Carneiro e cols.,
1995; Reis e cols., 1997). Entretanto, a captação de glicose pelo músculo não foi alterada
pela desnutrição no trabalho de Prada (2005).
Foi demonstrado que a desnutrição crônica eleva a captação de glicose pelo
coração, uma adaptação semelhante ao que ocorre em situações de isquemia e hipóxia.
Possivelmente, essa adaptação é decorrente de uma maior translocação de GLUT-1 para a
superfície de células cardíacas, o que permitiria uma maior captação de glicose e,
consequentemente, a preservação da função miocárdica (Gavete e cols., 2002).
Anteriormente havia sido demostrado que a desnutrição acarreta uma diminuição da
captação de glicose em até 50% no músculo esquelético em situações basais (Agote e
cols., 2001). Essa diferença na adaptação pode ser explicada pelo fato do coração estar
em constante trabalho e dessa forma necessitar de constante suprimento de energia.
O coração utiliza preferencialmente ácidos graxos para obter energia (Taegtmeyer,
1994), mas também pode se utilizar de glicose em determinadas situações fisiológicas
55
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
como durante a vida fetal (Santalucía e cols., 1992) e durante o exercício, principalmente,
por ser a glicose um combustível essencial que dá suporte a uma ótima recuperação
funcional após momentos de isquemia e hipóxia miocárdicas (Russell e cols., 1999). A
utilização de glicose pelo miocárdio se inicia com a sua maior captação, que por sua vez
depende da translocação de carreadores como o GLUT-1 e GLUT-4. Entretanto, foi
demostrado que a expressão desses carreadores se encontra diminuída em função do
retardo de crescimento intrauterino decorrente da desnutrição materna (Tsirka e cols.,
2001).
As biomoléculas, principalmente as proteínas e a glutationa, possuem em sua
estrutura grupamentos sulfidrilas que têm a função de servir como alvo para os radicais
livres. Portanto, a diminuição dos grupamentos sulfidrilas pode indicar um maior estresse
oxidativo (Faure e Lafond, 1995). Foi observada uma redução nos grupamentos sulfidrilas
no soro (gráfico 4) dos animais desnutridos do presente experimento e,
interessantemente os animais do grupo recuperado apresentaram valores semelhantes
aos animais controle. Esse fato também ocorreu para os níveis séricos de proteínas totais
(gráfico 3) e albumina (gráfico 3). Diminuições nos níveis de proteínas totais e albumina
são encontradas em crianças desnutridas (Torun e Viteri, 1994) e em modelos animais
(Carneiro e cols., 1995; Reis e cols., 1997; Sidhu e cols., 2005; Oliveira, 2007).
Normalmente essas diminuições são encontradas quando ocorrem falhas hepáticas,
transtornos intestinais e renais, ou por hemorragia (Wilikinson e Menderall, 1963).
Em casos de inanição, as proteínas de reserva, especialmente do músculo
esquelético e do fígado, são degradadas para alimentar a neoglicogênese, ao mesmo
tempo em que ocorre diminuição das proteínas totais do plasma, provocando queda na
osmolaridade plasmática, o que resulta em saída de líquidos da corrente circulatória para
os tecidos (edema). No caso de doenças hepáticas, os níveis séricos das proteínas totais
podem diminuir devido a alterações de sua síntese, ou devido ao aumento de sua
degradação ou ainda devido à sua perda extra vascular (Rothschild e cols., 1972; Tavill,
1972).
A maioria das lesões hepáticas produzidas por drogas e/ou traumatismos é cálcio
dependente e envolve interação com o citocromo P-450 promovendo formação de
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OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
metabólitos e radicais livres que podem ser altamente reativos e tóxicos para as células
(Thomas e Reed, 1989; Bellomo e cols., 1991; Kedderis, 1996; Nishikawa e cols., 1994).
Esses radicais livres se ligam covalentemente em pontos críticos da membrana
celular dos hepatócitos, promovendo peroxidação lipídica, desintegrando o citoesqueleto,
alterando a morfologia e a funcionalidade mitocondrial, modificando o cálcio intracelular
e causando ativação de enzimas catabólicas que podem causar efeitos celulares
potencialmente deletérios (Nicotera e cols., 1990; Gincel e cols., 2001).
Como consequências desse processo ocorrem alterações nas concentrações de
diversas enzimas e proteínas, como por exemplo, aspartado aminotransferase (AST),
alanina aminotransferase (ALT), proteínas totais e albumina. Dessa forma, a
determinação bioquímica dos níveis destas enzimas e proteínas, inter-relacionadas,
constituem importantes marcadores da função hepática.
No presente estudo a diminuição das concentrações de proteínas totais (gráfico 3)
e albumina (gráfico 3) assim como o aumento da atividade de ALT (gráfico 4) e AST
(gráfico 4) nos animais desnutridos corroboram os dados de Sidhu e cols. (2005). A
redução dos níveis de albumina, ao menos em parte, pode ser explicada pela depleção
dos níveis de aminoácidos que servem de precursores para a síntese de albumina
reduzindo, consequentemente, também os valores de proteínas totais (Davenport e cols.,
1994). Kumari e cols. (1993) explicaram que durante uma lesão hepática os aminoácidos
são liberados em função da exagerada degradação do tecido. Na tentativa de metabolizar
esses aminoácidos, o processo de transaminação é elevado levando a aumento da
atividade de enzimas relacionadas com a AST e ALT.
A AST é uma enzima que catalisa a transaminação reversível de aspartato e αcetoglutarato em oxalacetato e glutamato. A AST está presente em muitos tecidos e
apresenta duas isoformas, a citosólica e a mitocondrial, sendo mais abundante no fígado
e nos músculos esqueléticos e, por isso, pode ser utilizada como indicador de danos
nesses tecidos (Reitman e Frankel, 1957; Cohen e Kaplan, 1979). Ela apresenta meia vida
sanguínea de 17 horas e nos hepatócitos localiza-se principalmente na mitocôndria (80%).
Elevações nos seus níveis séricos estão associadas à hepatite infecciosa e tóxica, à cirrose,
à obstrução biliar, ao fígado gorduroso (esteatose hepática), e ainda ocorre em casos de
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OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
hemólise, deficiência de selênio e vitamina E, ou após o exercício intenso (Van Der
Meulen e cols., 1991). Quando associada a valores diminuídos de colesterol e albumina
revelam, com razoável certeza, disfunções hepáticas (Chang e cols., 1986).
A ALT é uma enzima encontrada predominantemente no fígado, em menores
concentrações nos rins e em baixas concentrações no coração e nos músculos
esqueléticos (Latner e Skillen, 1961). Ela catalisa a transferência do grupo amina da
alanina para o α-cetoglutarato com a formação de glutamato e piruvato. A ALT tem meiavida sanguínea de 47 horas e no hepatócito localiza-se no citoplasma (90%) e na
mitocôndria (10%). Por esta razão, qualquer lesão tecidual ou doença que afete o
parênquima hepático liberará uma maior quantidade da enzima para a corrente
sanguínea, elevando os níveis séricos da ALT.
As causas mais comuns de elevação dos níveis da ALT são: hepatite virótica,
mononuclease infecciosa e lesão hepatocelular induzida por drogas (De Ritis e cols.,
1972). Nesses casos, a elevação nos níveis de ALT é praticamente a mesma da AST para
humanos. No caso de cirrose, hepatopatia alcoólica aguda, congestão hepática passiva,
obstrução dos ductos biliares extra-hepáticos e tumor metastático do fígado, os níveis da
ALT encontram-se normalmente menos elevados em relação aos da AST (Ross e cols.,
1951).
A atividade da ALT (gráfico 4) e da AST (gráfico 4) se apresentaram elevadas
apenas nos animais do grupo desnutrido e como a maioria das lesões hepáticas tem
relação com uma maior produção de radicais livres (Thomas e Reed, 1989; Bellomo e
cols., 1991; Kedderis, 1996; Nishikawa e cols., 1994), acreditávamos que o estresse
oxidativo nesse órgão poderia estar aumentado. Esses radicais livres se ligam
covalentemente em pontos críticos da membrana celular dos hepatócitos, promovendo
peroxidação lipídica, alterando a morfologia e a funcionalidade mitocondrial (Nicotera e
cols., 1990; Gincel e cols., 2001).
A albumina é a proteína mais abundante no plasma, perfazendo cerca de 50% do
total das proteínas. É sintetizada no fígado (cerca de 120 mg/kg diariamente) e contribui
com 80% da osmolaridade do plasma sanguíneo, sendo também uma importante reserva
proteica, bem como um transportador de ácidos graxos livres, aminoácidos, metais,
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OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
cálcio, hormônios e bilirrubina (Guyton, 2002). A única causa do aumento da albumina
plasmática (hiperalbuminemia) é a desidratação ou choque.
Normalmente, 40% da massa total de albumina estão no espaço intravascular,
enquanto 60% estão no extravascular. Na desnutrição, a maior perda acontece no “pool”
de albumina extravascular e foi mostrado ainda que a albumina no organismo desnutrido
se desloca do espaço extravascular para o intravascular (Cohen e Hansen, 1962; James e
Hay, 1968). Assim, a massa de albumina seria preservada durante pequenos períodos de
ingestão de dietas com baixa concentração de proteínas.
A concentração de albumina plasmática pode diminuir (hipoalbuminemia) em
várias situações, como por exemplo, em doenças hepáticas crônicas, na doença renal, em
estados de desnutrição, em infecções prolongadas, em queimaduras graves, ou em
hemorragia grave (Wilikinson e Menderall, 1963). Quando os níveis de albumina
encontram-se diminuídos e os níveis das globulinas, particularmente das gamaglobulinas,
encontram-se elevados (Havens-Jr. e cols. 1954), pode-se afirmar que uma doença
hepática crônica está estabelecida, primariamente devido a uma síntese diminuída da
albumina (Wilikinson e Menderall, 1963).
Crianças com kwashiorkor têm taxas de síntese de albumina reduzida, enquanto a
síntese de gamaglobulina se mantém inalterada (Cohen e Hansen, 1962). Aliado a isso,
após um período de sete a dez dias, foi observado em crianças desnutridas e em processo
de recuperação, que ocorre também uma diminuição na taxa de degradação da albumina
indicando, assim, uma resposta compensatória à baixa ingestão de proteínas (James e
Hay, 1968).
No presente trabalho a diminuição dos níveis séricos de albumina (gráfico 3)
concomitante com a redução dos níveis dos grupos sulfidrilas (gráfico 4) corroboram os
dados de Prada (2005). Como os níveis séricos de proteínas totais (gráfico 3) e albumina
foram restabelecidos no presente modelo de recuperação nutricional, a igualdade de
valores para grupamentos sulfidrilas entre animais do grupo recuperado e animais do
grupo controle também era esperada. Além disso, Flechner e cols. (2001) mostraram que
a recuperação nutricional de humanos é mais rápida quando é feita uma suplementação
com albumina e glutationa para pacientes desnutridos.
59
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
A análise da enzima superóxido dismutase no soro (gráfico 4) sugere que os
animais do grupo desnutrido e do grupo recuperado podem estar sofrendo um maior
estresse oxidativo. Bennett e cols. (1984) também demonstraram uma redução de 25%
na superóxido dismutase em eritrócitos de crianças desnutridas da Jamaica. Entretanto,
no presente experimento os valores de sulfidrilas séricas (gráfico 4) confirmaram tal
suposição apenas para os animais do grupo desnutrido, que apresentaram valores
inferiores aos animais do grupo controle. A igualdade de valores de sulfidrilas entre
animais dos grupos controle e recuperado pode indicar que esses últimos já estariam se
recuperando do estresse gerado pela desnutrição.
Sabe-se que na desnutrição os níveis plasmáticos de vitamina E, A e caroteno são
severamente diminuídos tanto em termos absolutos, como em relação às concentrações
de lipídeos (Golden e Ramdath 1987). McLaren e cols. (1968) afirmaram inclusive que os
níveis dessas vitaminas poderiam ser utilizados na classificação do grau da gravidade da
desnutrição em crianças. Também foi demonstrado que os níveis de selênio no sangue
são diminuídos pela desnutrição em crianças (Levine e Olson, 1970; Fondu e cols., 1978).
Consequentemente, os níveis de glutationa peroxidase, que contêm selênio em sua
estrutura, também se apresentaram reduzidos nessa população, principalmente em
estados avançados da patologia (Golden e Ramdath 1987). O resultado dessa deficiência
seria uma ineficiente remoção dos peróxidos orgânicos que poderiam ser convertidos em
produtos ainda mais tóxicos para célula (Esterbauer, 1982).
A expressão de CuZn-SOD no coração dos animais desnutridos (gráfico 5) foi maior
do que nos animais recuperados, ao passo que os valores dos animais do grupo controle
foram iguais tanto aos valores dos recuperados quanto dos desnutridos. Esse fato
acarretou aumento na a atividade enzimática de CuZn-SOD no coração dos animais
desnutridos (gráfico 7), enquanto controles e recuperados apresentaram valores
semelhantes. Como os níveis de proteínas carboniladas no coração dos animais
desnutridos (gráfico 7) também estavam aumentados sugere-se que a desnutrição causou
aumento do estresse, entretanto, para esse órgão, houve recuperação nutricional, pois os
animais do grupo recuperado apresentaram valores semelhantes aos do grupo controle
para os três parâmetros.
60
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
No músculo esquelético a expressão de CuZn-SOD foi maior nos animais
desnutridos (gráfico 6) enquanto controles e recuperados apresentaram valores
semelhantes, entretanto não houve diferença na atividade enzimática (gráfico 7). A
desnutrição também causou aumento na concentração de TBARS (gráfico 7), entretanto
houve reversão desses efeitos para ambos os parâmetros quando os animais foram
recuperados nutricionalmente.
Tarry-Adkins e cols. (2010) demonstraram que a desnutrição materna causou nos
filhotes uma redução na expressão da Mn-SOD no músculo esquelético, tanto após 3
como após 15 meses de vida, sugerindo uma diminuição da defesa antioxidante
localizada na mitocôndria. A expressão gênica da CuZn-SOD, por sua vez, estava
diminuída apenas após 15 meses, o que pode indicar uma menor diminuição da defesa
antioxidante no citoplasma em comparação ao que ocorre na mitocôndria. Apesar do
aumento do estresse oxidativo indicado pela diminuição das defesas antioxidantes nesse
modelo, apenas os níveis de peroxidação lipídica medidos na urina foram aumentados,
sem que os níveis de proteínas carboniladas no soro fossem modificados. Isso sugere que
a diminuição da expressão dos genes relacionados às defesas antioxidantes está
diretamente associada ao aumento da peroxidação lipídica observada em filhotes de
ratas desnutridas. Foi demonstrado também em outro estudo que a expressão de MnSOD no ventrículo esquerdo de ratos foi aumentada em 43% após o treinamento físico de
12 semanas em animais mais velhos, ao passo que os níveis de CuZn-SOD não sofreram
modificações em animais jovens nem velhos. Já a atividade tanto da Mn-SOD como da
CuZn-SOD foram maiores após o treinamento, independente da idade (Lawler e cols.,
2009).
A expressão da γ-GCS no coração dos animais recuperados foi maior do que nos
animais desnutridos (gráfico 5), entretanto os níveis de glutationa foram maiores nos
animais desnutridos e recuperados na comparação com os animais controle (gráfico 7).
Esperava-se que os animais recuperados apresentassem valores de glutationa superiores
apenas em comparação aos animais desnutridos, entretanto acredita-se que
modificações pós-transcricionais foram responsáveis por aumentar concentração de
61
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
glutationa no coração de animais desnutridos via maior uma maior tradução do RNAm em
proteína, por exemplo.
No músculo esquelético a expressão da γ-GCS (gráfico 6) foi diferente da
observado no coração, uma vez que os valores dos animais desnutridos foram superiores
aos valores dos animais recuperados, ao passo que os valores de glutationa foram
diminuídos apenas pela desnutrição. Tomando-se essas informações poder-se-ia afirmar
que houve recuperação nutricional, pois os valores dos animais recuperados se igualaram
aos valores dos animais controle. Acredita-se que os valores glutationa nos animais
desnutridos (gráfico 8) não foram restabelecidos, possivelmente em função de falta de
substratos. A normalização dos níveis de glutationa é um fato que depende de dois
fatores: primeiro a maior expressão da enzima que controla a etapa limitante de sua
síntese, fato que foi observado no presente experimento para os animais desnutridos, ao
menos em comparação aos animais recuperados; e segundo a existência de substratos
em quantidades ideais para formação da glutationa. O presente trabalho necessita ser
ampliado investigando-se os níveis dos precursores de glutationa no músculo esquelético
dos animais desnutridos, uma vez que a expressão gênica foi aumentada pela desnutrição
fato que deveria acarretar aumento nos níveis de glutationa e não sua diminuição.
Seelig e cols. (1984) demonstraram que tanto a deficiência em vitamina E como
em selênio resultaram em uma queda três vezes maior na expressão na subunidade
catalítica de γ-GCS hepática, resultando em queda nos níveis de glutationa. Liu e cols.
(1994) haviam demonstrado um aumento nos níveis de glutationa e γ-GCS no fígado de
rato, devido a uma suplementação dietética com selênio, indicando um papel do selênio
na homeostase hepática de glutationa. No entanto, a transcrição dos genes da
subunidade de γ-GCS parece ser controlada por uma variedade de fatores através de
mecanismos que ainda não estão totalmente conhecidos (Griffith, 1999). Acredita-se que
o mesmo pode acontecer no músculo esquelético para regulação da transcrição, além da
questão dos substratos discutida acima.
No músculo esquelético dos animais desnutridos houve também aumento na
concentração de TBARS (gráfico 8). Entretanto houve reversão deste efeito quando os
animais foram recuperados nutricionalmente.
62
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
Entre as várias modificações oxidativas ocorridas com aminoácidos e proteínas, a
carbonilação é considerada um marcador inicial de degradação proteica. A carbonilação
de proteínas pode também ser formada da reação de aldeídos (formados da peroxidação
lipídica) com proteínas. A presença de proteínas carboniladas em amostras de células e
tecidos tornou-se amplamente aceita como marcador de estresse oxidativo (Granot e
Kohen 2004).
Os níveis de proteína carbonilada no coração (gráfico 7) sugerem ainda que o
estresse oxidativo ocorrido no órgão difere do ocorrido no músculo esquelético (gráfico
8), que não apresentou diferenças significativas para esse parâmetro.
Não houve diferença para expressão do RNAm da catalase no coração (gráfico 8) e
nem no músculo (gráfico 6), apesar do aumento da atividade da catalase no músculo dos
animais desnutridos em relação aos controles (gráfico 8). Nesse caso também pode-se
dizer que houve recuperação nutricional, pois os valores dos animais recuperados se
igualaram aos valores dos animais controles. Sabe-se que o estresse oxidativo pode gerar
modificações pós-traducional na catalase via forforilação de resíduos de tirosina (Cao e
cols., 2003) e que em baixas concentrações de radicais a fosforilação pode estimular a
atividade da catalase, mas em altas concentrações o efeito é contrário podendo levar até
à degradação enzimática (Sadi e cols., 2008).
No fígado dos animais desnutridos a diminuição da concentração de glutationa
(gráfico 9) pode sugerir que o estresse oxidativo está aumentado, entretanto, os
marcadores de estresse utilizados no presente trabalho não dão suporte a tal hipótese
(gráfico 9 - proteína carbonilada no fígado; gráfico 9 - TBARS no fígado). Pélissier e cols.
(1993) também encontraram diminuição nos níveis de glutationa no fígado e no intestino
delgado, porém, aumento dos níveis de TBARS apenas para o intestino delgado de ratos
desnutridos. Os mesmos autores não observaram modificações para atividade de CuZnSOD em nenhum dos tecidos que avaliaram, entretanto, encontraram uma diminuição
para atividade de catalase no fígado, gerada pela desnutrição.
Os dados das enzimas superóxido dismutase, glutationa peroxidase ou redutase e
catalase muitas vezes são controversos na literatura. O aumento de suas expressões e,
consequentemente, de suas atividades pode ser devido a um mecanismo regulado a nível
63
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 1
transcricional (Kensler e cols., 2007). Em condições fisiológicas normais, o fator de
transcrição Nrf2 é mantido no citoplasma das células, pois forma um complexo com a
proteína repressora Keap1 (Itoh e cols., 2003). Entretanto, um aumento na produção de
ERO no organismo promove, no citoplasma, a dissociação desse complexo, fazendo com
que o Nrf2 fique ativado sendo transportado para o núcleo (Dahl e cols. 2001; De Vries e
cols., 2008). No núcleo este fator de transcrição se liga a elementos de resposta a
antioxidantes (ARE) na região promotora dos genes que transcrevem enzimas
antioxidantes. A ativação Nrf2-ARE induz a produção da superóxido dismutase, catalase,
glutationa peroxidase, glutationa reduzida, peroxiredoxinas, nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato (NADPH), quinona oxidoredutases (NQOs) e hemoxigenases. Juntas,
estas enzimas e peptídeos representam um potente mecanismo antioxidante de defesa.
Uma vez restabelecido o balanço redox, o Nrf2 é transportado para o citoplasma onde é
ubiquitinado e degradado (Kensler e cols., 2007). Esta pode ser uma explicação para o
resultado da atividade enzimática de CuZn-SOD no coração (gráfico 7) e da catalase no
músculo (gráfico 8) dos animais desnutridos no presente estudo, que podem estar
aumentados por este mecanismo de defesa do organismo ativado pelo aumento do
estresse, que por sua vez foi confirmado pelo aumento de proteína carbonilada no
coração (gráfico 7) e TBARS no músculo esquelético (gráfico 8), respectivamente.
Tomando os resultados em conjunto tem-se que a diminuição dos níveis de
glutationa no fígado (gráfico 9) pode ser considerada um fator indicativo de maior
estresse oxidativo no órgão causado pela desnutrição, fato esse revertido nos animais em
recuperação nutricional. Ao passo que no caso da atividade de CuZn-SOD no fígado
(gráfico 9), os dados também sugerem um aumento de estresse oxidativo produzido pela
desnutrição, entretanto, não revertido completamente pela recuperação nutricional, fato
que talvez tivesse ocorrido caso o período de recuperação nutricional fosse maior.
No presente estudo a desnutrição causou uma diminuição nas concentrações de
glutationa tanto no fígado (gráfico 9) como no músculo esquelético (gráfico 8).
Entretanto, o coração (gráfico 7) respondeu de maneira diferente à desnutrição, uma vez
que os animais dos grupos desnutrido e recuperado apresentaram níveis elevados de
glutationa na comparação com o controle.
64
OLIVEIRA, E. C.
CONCLUSÃO 1
CONCLUSÃO - PRIMEIRO EXPERIMENTO
A desnutrição causou aumento do estresse oxidativo em ratos, manifestado no
soro (diminuição de radicais sulfidrilas), no músculo esquelético (maior peroxidação
lipídica, aumento na atividade da catalase, diminuição dos níveis de glutationa) e no
coração (maior oxidação de proteínas, aumento na atividade da CuZn-SOD). Além disso, a
desnutrição causou prejuízo nos marcadores bioquímicos nutricionais como o peso
corporal, ganho de peso, ingestão alimentar, absorção de glicose e nos marcadores da
função hepática.
A recuperação nutricional reverteu as modificações na expressão do RNAm de
CuZn-SOD, no músculo gastrocnêmio dos ratos. As modificações nos marcadores do
estresse oxidativo causados pela desnutrição foram revertidos pela recuperação
nutricional. Dentre os parâmetros bioquímicos nutricionais, não houve recuperação
nutricional apenas no peso corporal e nos níveis séricos de glicose.
Assim, conclui-se que na desnutrição existe aumento do estresse oxidativo e que a
recuperação nutricional é capaz de reverter esses efeitos com exceção do peso corporal.
65
OLIVEIRA, E. C.
MATERIAIS E MÉTODOS – SEGUNDO EXPERIMENTO
1) Animais e grupos experimentais
Foram utilizadas ratas Fischer distribuídas em dois grupos, de acordo com o teor
proteico da dieta recebida do nascimento até o desmame (28 dias de vida) conforme a
seguir:
a) Grupo Controle, ratas que receberam dieta AIN-93M (Reeves e cols., 1993) (Tabela 1
página 25);
b) Grupo Desnutrido, ratas que receberam dieta Hipoproteica (AIN-93M, modificado o
teor de caseína para 6%) (Tabela 1 página 25).
Após o desmame, aos 28 dias de idade, os animais foram subdivididos em três
grupos experimentais de acordo com o teor proteico da dieta recebida até o desmame e
após o desmame. Cada grupo continha 16 animais, e os grupos apresentavam as
seguintes características:
a) Controle: animais alimentados com dieta controle;
b) Desnutrido: animais alimentados com dieta hipoproteica;
c) Recuperado: animais alimentados com dieta hipoproteica até o desmame e
alimentados com dieta controle durante as nove semanas pós desmame.
Nesse mesmo momento os grupos foram subdivididos de acordo com a realização
ou não de treinamento físico por mais nove semanas, o que caracterizou a segunda etapa
do experimento. Finalmente chegou-se aos seis grupos experimentais, cada grupo
contendo oito animais. As características dos grupos estão apresentadas a seguir:
66
OLIVEIRA, E. C.
a) Controle Sedentário (CS): animais alimentados com dieta controle; sem treinamento
físico;
b) Controle Treinado (CT): animais alimentados com dieta controle; realizaram
treinamento físico;
c) Desnutrido Sedentário (DS): animais alimentados com dieta hipoproteica; sem
d) Desnutrido Treinado (DT): animais alimentados com dieta hipoproteica; realizaram
e) Recuperado Sedentário (RS): animais alimentados com dieta hipoproteica até o
desmame e alimentados com dieta controle durante as nove semanas pós desmame; sem
f) Recuperado Treinado (RT): animais alimentados com dieta hipoproteica até o desmame
e alimentados com dieta controle durante as nove semanas pós desmame; realizaram
treinamento físico. O gráfico 10 ilustra a divisão dos grupos.
67
OLIVEIRA, E. C.
Controle sedentário
Controle
Dieta Controle
28 dias
(n=8) 9 semanas
Controle (n=16)
Dieta Controle
Controle treinado
(n=8) 9 semanas
Recuperado sedentário
48 ratas
Recuperado (n=16)
Dieta Controle
Desnutrido
(n=8) 9 semanas
Recuperado treinado
(n=8) 9 semanas
Dieta Hipoproteica
28 dias
Desnutrido sedentário
Desnutrido (n=16)
(n=8) 9 semanas
Dieta Hipoproteica
Desnutrido treinado
(n=8) 9 semanas
Gráfico 10. - Divisão dos grupos experimentais - experimento II
2) Treinamento Físico
Os animais treinados foram adaptados ao meio liquido (água a 31 ± 1 ºC) (Harri e
Kuusela, 1986) da seguinte forma: 1º e 2 º dias, 30 min em piscina com água rasa (três
centímetros de profundidade); 3º e 4º dias, duas séries de 15 min por 5 min de intervalo
em piscina com água a 50 cm de profundidade e no 5º dia, nadaram 30 min contínuos,
mantendo a mesma profundidade do dia anterior. Da segunda à nona semana os animais
treinados repetiram a sessão do quinto dia de adaptação, cinco dias por semana. Os
animais sedentários foram submetidos ao contato com a água, durante 30 min, em
68
OLIVEIRA, E. C.
piscina com água rasa (três centímetros de profundidade), durante todo o experimento
para passarem pelo mesmo estresse do manuseio diário.
3) Tratamento estatístico
Os dados foram analisados quanto à normalidade utilizando-se o teste de
normalidade de D'Agostino e Pearson (omnibus K2 test). Depois de verificada a
normalidade, os dados foram comparados pelo Test t não pareado, adotando p < 0,05
para aceitar as diferenças significativas. Foram comparados apenas os grupos no mesmo
estado nutricional, ou seja, os animais CS somente foram comparados aos CT. As análises
estatísticas foram feitas utilizando-se o software Prism® da GraphPad versão 4.03 para
Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, USA, www.graphpad.com.
As determinações bioquímicas e todos os demais procedimentos não descritos
nessa sessão haviam sido descritos previamente e foram realizados da forma como estão
descritos para o primeiro experimento.
69
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
RESULTADOS DO EXPERIMENTO 2 – ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO VIA
MARCADORES DE ESTRESSE E DEFESAS ANTIOXIDANTES EM ANIMAIS NO PROCESSO DE
RECUPERAÇÃO NUTRICIONAL E EXERCITADOS.
soro dos animais.
Após um período de desnutrição, que teve duração de 28 dias e que correspondeu
ao período da amamentação, os animais desnutridos foram redistribuídos em 2 grupos:
desnutrido e recuperado. No mesmo momento esses dois grupos assim como o grupo
controle foram subdivididos e adaptados ao exercício. Portanto, os pesos apresentados
no gráfico 11 correspondem ao peso dos animais antes do início do período de
treinamento físico. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos para o
teste t (gráfico 11).
Depois de uma semana de adaptação e oito semanas de treinamento físico apenas
os animais do grupo desnutrido treinado apresentaram maior peso corporal e maior
ganho de peso do que os animais do grupo desnutrido sedentário (gráficos 12 e 13).
Média de Peso Inicial
(gramas)
80
60
40
20
0
CS
CT
30
(gramas)
(gramas)
30
20
10
0
20
10
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 11. Peso inicial de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido
Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT (Recuperado Treinado). Não
houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p = 0,9668); Desnutridos (p = 0,4843); e entre
Recuperados (p = 0,8280). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
70
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
Média de Peso Final
(gramas)
200
150
100
50
0
CS
150
*
(gramas)
(gramas)
80
CT
60
40
20
0
100
50
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 12. Peso final de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido
Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT (Recuperado Treinado). Os
animais DT apresentaram valores superiores a DS (*p = 0,0164) teste t. Não houve diferença significativa
para o teste t entre Controles (p = 0,9423); e entre Recuperados (p = 0,9190). Valores apresentados em
Ganho de peso
(gramas)
150
100
50
0
CS
CT
60
150
Ganho de peso
(gramas)
Ganho de peso
(gramas)
*
40
20
0
100
50
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 13. Ganho de peso de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido
animais DT apresentaram valores superiores a DS (*p = 0,0088) teste t. Não houve diferença significativa
para o teste t entre Controles (p = 0,9657); e entre Recuperados (p = 0,9937). Valores apresentados em
Os animais CT e RT apresentaram maior ingestão alimentar do que os animais CS e
RS, respectivamente. Os animais DS e DT não apresentaram diferenças (gráfico 14).
71
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
Ingestão Alimentar
(gramas)
200
*
150
100
50
0
CS
CT
*
150
Ingestão Alimentar
(gramas)
Ingestão Alimentar
(gramas)
150
100
50
0
100
50
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 14. Ingestão alimentar de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido
animais CT apresentaram valores superiores aos animais CS (*p < 0,0001), teste t. Os animais RT
apresentaram valores superiores aos animais RS (*p = 0,0165), teste t. Não houve diferença significativa
para teste t entre os Desnutridos (p = 0,4903). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
Não houve diferença para os níveis séricos de proteínas totais (gráfico 15). Os
animais RS apresentaram valores séricos de albumina maiores do que os animais RT
(gráfico 16).
Os animais dos grupos controle, recuperado e desnutrido treinados apresentaram
valores de glicemia sérica abaixo dos valores apresentados pelos sedentários no mesmo
estado nutricional (gráfico 17).
Já o teste oral de tolerância à glicose confirmou a diminuição significativa apenas
para o grupo CT em relação a CS (gráfico 18).
A atividade de ALT foi maior nos animais sedentários em comparação aos
treinados nos três estados nutricionais (gráfico 19). Já a atividade de AST foi maior nos
animais sedentários em comparação aos treinados apenas na comparação feita entre
animais CS e CT (gráfico 20).
72
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
Proteínas Totais
(g/L)
100
80
60
40
20
0
CS
CT
80
Proteínas Totais
(g/L)
Proteínas Totais
(g/L)
80
60
40
20
0
60
40
20
0
DS
RS
DT
RT
Gráfico 15. Valores séricos de proteínas totais de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado);
DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT (Recuperado
Treinado). Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p = 0,5706); Desnutridos (p =
0,5613); e Recuperados (p = 0,1352). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
Albumina
(mol/L)
600
400
200
0
CS
CT
400
600
*
Albumina
(mol/L)
Albumina
(mol/L)
300
200
400
200
100
0
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 16. Valores séricos de albumina de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
(Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT (Recuperado
Treinado). Os animais do grupo RS apresentaram valores superiores aos animais RT (*p = 0,0099), teste t.
Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p = 0,9948); e entre Desnutridos (p =
0,8660). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
73
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
150
Glicose
(mmol/L)
*
100
50
0
CS
CT
150
80
100
Glicose
(mmol/L)
Glicose
(mmol/L)
*
100
*
50
60
40
20
0
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 17. Valores séricos de glicose de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
Treinado). Os animais do grupo CS apresentaram valores superiores aos animais CT (*p < 0,0001), teste t.
Os animais do grupo DS apresentaram valores superiores aos animais DT (*p < 0,0001), teste t. Os animais
do grupo RS apresentaram valores superiores aos animais RT (*p < 0,0001), teste t. Valores apresentados
15000
*
10000
5000
0
CS
6000
4000
2000
0
DS
DT
CT
Teste Oral de Tolerância à Glicose
(Média de área total sob a curva)
em média ± desvio padrão.
10000
8000
6000
4000
2000
0
RS
RT
Gráfico 18. Teste oral de tolerância à glicose de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado);
Treinado). Os animais do grupo CS apresentaram valores superiores aos animais CT (*p = 0,0042), teste t.
Não houve diferença significativa para o teste t entre Desnutridos (p = 0,7080); e entre Recuperados (p =
74
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
ALT
(U/mL)
60
*
40
20
0
CS
CT
*
80
*
60
ALT
(U/mL)
ALT
(U/mL)
60
40
40
20
20
0
0
DS
RS
DT
RT
Gráfico 19. Atividade sérica de ALT (alanina aminotransferase) de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
(Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado
Sedentário) x RT (Recuperado Treinado). Os animais do grupo CS apresentaram valores superiores aos
animais CT (*p = 0,0210), teste t. Os animais do grupo DS apresentaram valores superiores aos animais DT
(*p = 0,0053), teste t. Os animais do grupo RS apresentaram valores superiores aos animais RT (p = 0,0047),
teste t. Valores apresentados em média ± desvio padrão.
80
*
AST
(U/mL)
60
40
20
0
CS
CT
80
100
60
AST
(U/mL)
AST
(U/mL)
80
60
40
40
20
20
0
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 20. Atividade sérica de AST (aspartato aminotransferase) de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
Sedentário) x RT (Recuperado Treinado). Os animais do grupo CS apresentaram valores superiores aos
animais CT (*p = 0,0163), teste t. Não houve diferença significativa para o teste t entre Desnutridos (p =
0,4764); e entre Recuperados (p = 0,5980). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
75
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
Os animais RT apresentaram valores elevados de SOD no soro em comparação aos
animais RS (gráfico 21). Fato oposto ocorreu para valores de sulfidrilas totais, onde os
animais RS apresentaram valores mais elevados do que RT (gráfico 22).
100
SOD (%)
80
60
40
20
0
CS
CT
100
80
60
SOD (%)
SOD (%)
*
80
60
40
40
20
20
0
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 21. Atividade sérica de SOD (superóxido dismutase) de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
Sedentário) x RT (Recuperado Treinado). Os animais do grupo RT apresentaram valores superiores aos
animais RS (*p = 0,0010), teste t. Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p =
0,1224); e entre Desnutridos (p = 0,9779). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
400
Sulfidrilas
(µmol/L)
300
200
100
0
CT
400
400
300
300
Sulfidrilas
(µmol/L)
Sulfidrilas
(µmol/L)
CS
200
100
*
200
100
0
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 22. Valores séricos de sulfidrilas de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
Treinado). Os animais do grupo RS apresentaram valores superiores aos animais RT (*p = 0,0001), teste t.
Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p = 0,1413); e entre Desnutridos (p =
76
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
Enzimas antioxidantes, marcadores de defesas antioxidantes e marcadores do
estresse oxidativo no fígado, coração e músculo esquelético.
A atividade da catalase não foi influenciada pelo exercício em nenhum dos três
estados nutricionais e em nenhum dos órgãos estudados (gráficos 23, 24 e 25).
Os valores de glutationa no fígado dos animais do grupo RT apresentaram-se
elevados em comparação aos apresentados pelo grupo RS (gráfico 26). No coração o
efeito foi contrário, ou seja, os valores apresentados pelo grupo RS foram maiores do que
os do grupo RT (gráfico 27). Ainda no coração, houve um aumento na concentração de
glutationa no grupo CT em relação ao grupo CS (gráfico 27). Já para o músculo
esquelético, houve um aumento nos valores de glutationa no grupo DT em comparação
com DS (gráfico 28).
Catalase Fígado
(U/mg de proteína)
4
3
2
1
0
CS
CT
5
Catalase Fígado
(U/mg de proteína)
Catalase Fígado
(U/mg de proteína)
5
4
3
2
1
0
4
3
2
1
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 23. Atividade da catalase no fígado de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
0,3274) e entre Recuperados (p = 0,4109). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
77
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
Catalase Coração
(U/mg de proteína)
15
10
5
0
CS
CT
15
Catalase Coração
(U/mg de proteína)
Catalase Coração
(U/mg de proteína)
15
10
5
0
10
5
0
DS
RS
DT
RT
Gráfico 24. Atividade da catalase no coração de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado);
Catalase Músculo
(U/mg de proteína)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
CS
CT
1.0
Catalase Músculo
(U/mg de proteína)
Catalase Músculo
(U/mg de proteína)
1.5
1.0
0.5
0.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 25. Valores de atividade da catalase no músculo gastrocnêmio de ratas CS (Controle Sedentário) x
CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado
Sedentário) x RT (Recuperado Treinado). Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p
= 0,4539); Desnutridos (p = 0,6030); e entre Recuperados (p = 0,3107). Valores apresentados em média ±
desvio padrão.
78
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
Glutationa Fígado
(nmoles/mL)
30
20
10
0
CS
CT
40
Glutationa Fígado
(nmoles/mL)
Glutationa Fígado
(nmoles/mL)
15
10
5
0
*
30
20
10
0
DS
RS
DT
RT
Gráfico 26. Valores de glutationa no fígado de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
Treinado). Os animais do grupo RT apresentaram valores superiores aos apresentados pelos animais do
grupo RS (*p = 0,0322), teste t. Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p = 0,9783);
e entre Desnutridos (p = 0,6030). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
Glutationa Coração
(nmoles/mL)
150
*
100
50
0
CS
CT
(nmoles/mL)
(nmoles/mL)
*
100
150
100
50
0
80
60
40
20
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 27. Valores de glutationa no coração de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado);
Treinado). Os animais do grupo CT apresentaram valores superiores aos apresentados pelos animais do
grupo CS (*p = 0,0065), teste t. Os animais do grupo RS apresentaram valores superiores aos animais do
grupo RT (*p = 0,0002). Não houve diferença significativa para o teste t entre Desnutridos (p = 0,9856).
79
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
Glutationa Músculo
(nmoles/mL)
80
60
40
20
0
CS
CT
80
*
Glutationa Músculo
(nmoles/mL)
Glutationa Músculo
(nmoles/mL)
80
60
40
20
0
60
40
20
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 28. Valores de glutationa no músculo gastrocnêmio de ratas CS (Controle Sedentário) x CT
Sedentário) x RT (Recuperado Treinado). Os animais do grupo DT apresentaram valores superiores aos
apresentados pelos animais do grupo DS (*p = 0,0116), teste t. Não houve diferença significativa para o
teste t entre Controles (p = 0,1746); e entre Recuperados (p = 0,2122). Valores apresentados em média ±
desvio padrão.
Os níveis de proteínas carboniladas no fígado apresentaram-se elevados nos
animais do grupo DT em comparação a DS (gráfico 29). No coração, os níveis foram
maiores em animais CT em comparação a CS e em DS em relação a DT (gráfico 30). No
músculo esquelético, assim como no coração, aconteceu um aumento nos níveis de
proteínas carboniladas de CT na comparação com CS (gráficos 31 e 30 respectivamente),
entretanto, os valores de DT foram superiores aos valores de DS (gráfico 31), fato oposto
ao que havia ocorrido entre DS e DT para os níveis de proteínas carboniladas no coração
(gráfico 30).
Os níveis de TBAR no fígado foram superiores nos animais DT em comparação aos
valores apresentados por DS (gráfico 32). No coração e no músculo não foram observadas
diferenças para os níveis de TBARS (gráficos 33 e 34, respectivamente).
80
RESULTADOS 2
2.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
CS
CT
Proteína Carbonilada Fígado
(nmol/mg de proteína)
OLIVEIRA, E. C.
*
1.5
1.0
0.5
0.0
DS
DT
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
RS
RT
Gráfico 29. Valores de proteína carbonilada no fígado de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle
Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado Sedentário) x RT
(Recuperado Treinado). Os animais do grupo DT apresentaram valores superiores aos apresentados pelos
animais do grupo DS (*p = 0,0074), teste t. Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles
8
5
*
4
3
2
1
0
CS
*
6
4
2
0
DS
DT
CT
Proteína Carbonilada Coração
(p = 0,5401); e entre Recuperados (p = 0,1097). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
5
4
3
2
1
0
RS
RT
Gráfico 30. Valores de proteína carbonilada no coração de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle
(Recuperado Treinado). Os animais do grupo CT apresentaram valores superiores aos apresentados pelos
animais do grupo CS (*p = 0,0047), teste t. Os animais do grupo DS apresentaram valores superiores aos
apresentados pelos animais do grupo DT (*p = 0,0158), teste t. Não houve diferença significativa para o
teste t entre Recuperados (p = 0,6712). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
81
RESULTADOS 2
0.8
*
0.6
0.4
0.2
0.0
CS
*
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
DS
CT
Proteína Carbonilada Músculo
OLIVEIRA, E. C.
DT
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
RS
RT
Gráfico 31. Valores de proteína carbonilada no músculo gastrocnêmio de ratas CS (Controle Sedentário) x
CT (Controle Treinado); DS (Desnutrido Sedentário) x DT (Desnutrido Treinado); e RS (Recuperado
Sedentário) x RT (Recuperado Treinado). Os animais do grupo CT apresentaram valores superiores aos
apresentados pelos animais do grupo CS (*p = 0,0371), teste t. Os animais do grupo DT apresentaram
valores superiores aos apresentados pelos animais do grupo DS (*p = 0,0382), teste t. Não houve diferença
significativa para o teste t entre Recuperados (p = 0,1978). Valores apresentados em média ± desvio
padrão.
TBARS Fígado
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
CS
0.4
*
TBARS Fígado
TBARS Fígado
0.6
CT
0.4
0.2
0.0
0.3
0.2
0.1
0.0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 32. Valores de TBARS no fígado de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
Treinado). Os animais do grupo DT apresentaram valores superiores aos apresentados pelos animais do
grupo DS (*p = 0,0011), teste t. Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p = 0,8299);
e entre Recuperados (p = 0,3556). Valores apresentados em média ± desvio padrão.
82
OLIVEIRA, E. C.
RESULTADOS 2
TBARS Coração
15
10
5
0
CS
CT
10
TBARS Coração
TBARS Coração
8
6
4
2
0
8
6
4
2
0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 33. Valores de TBARS no coração de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle Treinado); DS
Treinado). Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p = 0,4984); Desnutrido (p =
TBARS Músculo
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
CS
CT
0.8
TBARS Músculo
TBARS Músculo
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.6
0.4
0.2
0.0
DS
DT
RS
RT
Gráfico 34. Valores de TBARS no músculo gastrocnêmio de ratas CS (Controle Sedentário) x CT (Controle
(Recuperado Treinado). Não houve diferença significativa para o teste t entre Controles (p = 0,9283);
Desnutrido (p = 0,6986); e entre Recuperados (p = 0,1189). Valores apresentados em média ± desvio
padrão.
83
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
DISCUSSÃO DO EXPERIMENTO 2 – ESTUDO DO ESTRESSE OXIDATIVO VIA MARCADORES
DE ESTRESSE E DEFESAS ANTIOXIDANTES DE ANIMAIS EM PROCESSO DE RECUPERAÇÃO
NUTRICIONAL E EXERCITADOS.
A saúde e o crescimento no período da infância e mesmo no início da vida adulta
dependem dos períodos intrauterino e neonatal. Quando a desnutrição ocorre em algum
dos dois períodos o crescimento fica prejudicado, levando a um estado de baixo peso e
baixa estatura (Marín e cols. 1995; Sawaya 2006). Entretanto, o organismo é capaz de se
adaptar à desnutrição através de modificações metabólicas e endócrinas. As adaptações
metabólicas estão relacionadas ao aumento do catabolismo para obtenção de energia
utilizando os próprios tecidos do organismo como fonte de substrato. Já as adaptações
endócrinas podem gerar diminuição na concentração de glicose, insulina e no fator de
crescimento semelhante à insulina (IGF) que são diretamente relacionados ao
crescimento fetal. Todas essas adaptações permitem a manutenção da vida, entretanto,
podem acarretar deficiência no crescimento e podem estar relacionadas à ocorrência de
baixo peso ao nascer (Barker, 1998).
Foi demonstrado que uma dieta hipoprotéica (8% de caseína) ministrada durante
a prenhez e lactação é capaz de gerar menor peso corporal e menor ganho de peso nos
filhotes de ratas a partir do quinto dia de vida (Araújo e cols. 2010). No presente trabalho,
optou-se por um protocolo de desnutrição apenas durante a lactação, ou seja, após o
nascimento dos filhotes: uma dieta contendo 6% de caseína como fonte proteica foi
ministrada para ratas por um período de 28 dias, momento no qual ocorreu o desmame
dos filhotes. Reproduzindo dados anteriores do laboratório, mais uma vez foi possível
obter um grupo de animais com média de peso de 20 gramas, enquanto o grupo controle
apresentava em média 60 gramas após o mesmo período (gráfico 11). Após 28 dias, os
animais desnutridos do presente estudo foram redistribuídos em dois grupos: o grupo
desnutrido, que permaneceu recebendo a dieta de desnutrição até o final do
experimento e o grupo recuperado, que passou a receber a mesma dieta ministrada ao
grupo controle, também até o final do experimento. Portanto, nesse momento não havia
diferença significativa para o peso corporal nesses dois grupos (gráfico 11).
84
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
Foi relatado que a desnutrição materna na gestação e lactação provoca nos
filhotes uma redução permanente do peso corporal, que pode permanecer mesmo após a
aplicação de um protocolo de recuperação nutricional (Ozanne, 2001; Passos e cols.
2000). Foi proposto ainda que a desnutrição ocorrida nesses períodos possa favorecer o
desenvolvimento de algumas doenças na idade adulta (Ozanne, 2001; Barker 1997; e
Godfrey e Barker, 2001). A maneira como a desnutrição precoce favorece o aparecimento
de doenças na idade adulta vem sendo investigada e acredita-se que um dos fatores seja
o rápido ganho de peso que ocorre em função da recuperação nutricional (Ong e cols,
2000), pois o rápido ganho de peso pode sobrecarregar órgãos como o fígado e o
pâncreas (Barker e Clark, 1997; Godfrey e Barker, 2001; e Osmond e Barker, 2000). Não
foi objetivo do presente trabalho comparar controle e recuperado, portanto a
comparação do ganho de peso entre os grupos em diferentes estados nutricionais não foi
realizada (gráfico 13).
Ashworth (1969) estudou a recuperação nutricional em crianças desnutridas entre
10 meses e 3 anos e observou que a taxa de crescimento foi 15 vezes maior do que a de
crianças eutróficas na mesma idade e 5 vezes maior do que a de outras crianças com
altura e peso semelhantes. Após atingirem o peso normal para altura, a ingestão
alimentar das crianças caiu para um nível aproximado ao das crianças eutróficas de
mesma altura e peso, porém mais jovens.
Já o exercício parece favorecer a recuperação nutricional (Torun e Viteri, 1994)
além de ter sido descrito que o mesmo pode atuar como coadjuvante no processo de
recuperação nutricional uma vez que estimula o crescimento linear sem causar prejuízos
na homeostase (Silva e cols., 1999).
Nesse sentido, concomitantemente com o período de desmame, os três grupos de
animais do presente estudo (controle, desnutrido e recuperado) foram subdivididos entre
sedentários e treinados formando, assim, os seis grupos experimentais. Assim, não havia
diferença significativa do peso corporal entre os animais que seriam treinados e aqueles
que permaneceriam sedentários, considerando um mesmo estado nutricional (gráfico
11). Dessa forma, foi possível investigar o efeito do exercício em cada situação nutricional
separadamente.
85
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
Após uma semana de adaptação ao exercício e oito semanas de treinamento
físico, apenas os animais do grupo DT apresentaram maior peso corporal (gráfico 12) e
maior ganho de peso (gráfico 13) do que os animais do grupo DS, sem, contudo
apresentar diferenças para ingestão alimentar (gráfico 14). Por outro lado os animais CT
e RT apresentaram uma maior ingestão alimentar do que os animais CS e RS
respectivamente (gráfico 14), sem apresentar maior ganho de peso (gráfico 13), ou maior
peso final (gráfico 12). Somente esses dados justificariam a investigação do mecanismo
pelo qual o protocolo de treinamento aeróbio agiu aumentando o ganho de peso e o peso
final dos animais desnutridos. O que se esperava era um aumento na ingestão alimentar,
com redução no ganho de peso e consequente diminuição no peso final. Os animais CT e
RT apresentaram o aumento esperado na ingestão alimentar (gráfico 14), entretanto para
esses animais o protocolo de treinamento certamente não tinha o volume e a intensidade
necessários para gerar perda de peso. Aumentar o volume ou a intensidade do
treinamento para gerar adaptações nos animais CT e RT poderia acarretar também uma
maior mortalidade dos animais DT, em função disso optamos nesse experimento por
manter um protocolo de treinamento que já havia se mostrado factível por animais
desnutridos, conforme dados do próprio laboratório (Oliveira, 2007).
O maior crescimento corporal de ratos DT comparados com os ratos DS já foi
relatado (Orton e cols., 1985; Sakamoto e Grunewald, 1987; Torun e Viteri, 1994; Galdino
e cols., 2000), assim como existem trabalhos nos quais nenhum efeito foi evidenciado
(Crews e cols., 1969; Babirak e cols., 1974).
Também foi desmonstrado que o exercício acarreta modificações na composição
corporal, diminuindo a porcentagem de gordura da carcaça de animais desnutridos, com
conseqüente aumento da massa magra (Crews e cols., 1969). O peso do músculo
gastrocnêmio dos animais DT do presente trabalho, assim como o peso corporal foram
maiores do que o dos animais DS (DS = 0,5638 ± 0,09777 e DT = 0,6460 ± 0,07183; p =
0,0368). Caso não houvesse diferença no peso corporal, o peso relativo poderia indicar
uma hipertrofia no músculo dos animais DT, entretanto, como as duas variáveis
aumentaram, o peso relativo do músculo não diferiu entre os grupos. Caso o aumento do
peso relativo tivesse ocorrido em função do aumento da massa magra como no trabalho
86
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
de Crews e cols. (1969), seria necessário explicar como animais que ingeriram a mesma
quantidade de dieta passaram por uma adaptação metabólica gerada pelo exercício que
permitiu uma diminuição no catabolismo gerado pela desnutrição substituindo-o por um
maior anabolismo muscular.
Dados de outro experimento realizado no laboratório mostram que o exercício
leva a uma maior expressão dos genes do anabolismo em concomitante diminuição na
expressão daqueles relacionados ao catabolismo (Haraguchi, 2011).
Por outro lado, caso o aumento de peso relativo tivesse ocorrido devido ao
aumento do tecido adiposo, teríamos indícios da contra indicação do exercício para
organismos desnutridos, pois o mesmo estaria colaborando ainda mais para o surgimento
de doenças metabólicas, cardíacas e a obesidade, que já são relatadas para aqueles que
foram pequenos ao nascer e tornaram-se acima do peso durante a infância (LangleyEvans e cols., 1998; Hales e Barker, 2001). O peso do fígado, rins e coração (dados não
mostrados) não foram diferentes em função da realização do treinamento em nenhum
dos estados nutricionais.
Gobatto (1997) relatou que animais no processo de recuperação nutricional e
exercitados apresentaram níveis de proteínas totais reduzidos em função do exercício
sem, contudo, apresentarem modificações nos valores de albumina, ao passo que Silva e
cols. (1999) não encontraram diferenças significativas para níveis de albumina e proteínas
totais em ratos no processo de recuperação nutricional e exercitados. Resultados obtidos
com humanos treinados também mostraram diminuição nos níveis de proteínas totais e,
nesse caso, foi sugerido que o maior volume plasmático observado nesses indivíduos
pode ter gerado a diminuição dos níveis de proteínas totais (Brotherhood e cols. 1975;
Wells e cols., 1982). Entretanto, análise do hematócrito de animais treinados não
apresentou diferença significativa em outro experimento (Gobatto, 1993). Os dados do
presente experimento mostraram que o treinamento reduziu os valores séricos de
albumina dos animais RT (gráfico 16), apesar de não haver diferença para os níveis séricos
de proteínas totais (gráfico 17).
Há relatos na literatura de que animais em processo de recuperação nutricional e
exercitados não apresentaram modificações nos níveis de glicemia sérica (Gobatto, 1997;
87
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
Silva e cols., 1999), assim como também há trabalhos mostrando que animais controle
exercitados não apresentaram diferenças para glicemia (Luciano, 1991). Estudos mostram
também que o treinamento pode gerar aumento nos níveis de glicose sérica em animais
controle (Gobatto, 1993). Os resultados do presente estudo são opostos aos
apresentados na literatura, pois a glicemia dos grupos treinados nos três estados
nutricionais estudados foram inferiores aos valores apresentados pelos animais
sedentários (gráfico 17). Um acompanhamento semanal da glicemia foi feito por Curi e
cols. (1990) e foi observado que em quatro semanas houve alternância dos resultados,
pois na primeira e última semanas foi observada diminuição nos níveis de glicemia dos
animais CT, aumento na terceira e ausência de diferença na segunda semana. Todos esses
dados indicam que a glicemia pode variar muito em função do tipo de treinamento o que
dificulta a formulação de uma explicação para tais modificações. Os trabalhos de Curi e
cols. (1990) e Luciano (1991) não utilizaram sobrecarga para aumentar a intensidade do
exercício, ao passo que no trabalho de Gobatto (1993) uma sobregarga de 5% do peso
corporal do animal era utilizada.
Com o objetivo de gerar mais dados para explicar modificações nos níveis
glicêmicos, foi feito também um teste oral de tolerância à glicose. Esse teste confirmou
uma diminuição significativa na área sob a curva para animais CT em relação à CS (gráfico
18). Tomados em conjunto esses dados indicam que o treinamento pode ter gerado, pelo
menos para o grupo CT, um aumento na captação de glicose pelos tecidos, o que
justificaria sua diminuição na corrente sanguínea durante o teste oral de tolerância à
glicose. Gobatto (1997) não encontrou diminuição da glicose sanguínea por efeito do
treinamento, entretanto relatou um aumento significativo na captação de glicose pelo
músculo sóleo isolado de animais treinados tanto controle como recuperados. Como no
teste oral de tolerância à glicose apenas os animais CT apresentaram maior capacidade de
baixar a glicemia após a ingestão da solução de glicose, acredita-se que animais em
processo de recuperação nutricional ainda apresentam defcit na captação de glicose
pelos tecidos e que o exercício, mesmo baixando os níveis da glicemia de jejum, não
gerou adaptação suficiente para modificar a captação de glicose pelo tecido nos amimais
RT.
88
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
Amelink e cols. (1988) verificaram que a atividade da AST era aumentada em 1%,
em ratos machos, logo após uma sessão de treinamento em esteira, no entanto, o mesmo
não era observado em fêmeas, indicando que as modificações na atividade dessa enzima
parecem ter relação com o genero, sendo menor nas fêmeas. Koutedakis e cols. (1993),
comparando indivíduos treinados e não treinados, verificaram que o exercício aumenta
de forma aguda a atividade de AST e da ALT, e o nível de aptidão e a duração do exercício
correlacionam-se às atividades dessas enzimas.
No presente experimento não objetivou-se analisar os efeitos agudos do exercício
sobre as atividades das duas enzimas, mas sim se o treinamento afetaria de forma crônica
essas atividades nos três estados nutricionais. Portanto, sacrificamos os animais 72 horas
após a última sessão de exercício. Assim, o que pode ser observado é o efeito do
treinamento de nove semanas, onde ficou evidenciado que a atividade de ALT foi maior
nos animais sedentários em comparação aos treinados nos três estados nutricionais
(gráfico 19). Já a atividade de AST foi maior nos animais CS em comparação com CT
(gráfico 20).
Foi demonstrado que ratas Sprague-Dawley treinadas cronicamente em esteira
rolante (com uma velocidade de 1,6 km/h, por 2 horas, em 5 dias por semana, durante 8
semanas) apresentaram aumento na concentração de malondialdeido no coração e no
músculo, tanto em comparação com animais sedentários, como na comparação com
animais que realizaram exercício agudo (velocidade de 0.8 km/h, por 10 minutos, durante
3 dias). Já para o fígado o resultado foi diferente, para esse órgão os animais que
realizaram o protocolo agudo apresentaram maiores valores na comparação com os
outros dois grupos (Liu e cols. 2000). Os dados do presente estudo mostraram que os
níveis de TBARS no fígado foram superiores nos animais DT em comparação aos valores
apresentados pelos animais DS, corroborando o aumento da peroxidação lipídica por
efeito do exercício apenas para animais desnutridos (gráfico 32). Não encontramos
modificações no coração e nem no tecido muscular.
No trabalho de Liu e cols. (2000) também foi mostrado que os níveis de proteína
carbonilada estavam diminuídos no fígado dos animais que realizaram o treinamento
crônico, tanto em comparação ao controle, quanto em relação aos animais que
89
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
realizaram o exercício agudo. Os autores mostraram também que o músculo esquelético
dos animais treinados cronicamente apresentaram maiores níveis de proteínas
carboniladas apenas em comparação aos controles e que nenhum dos protocolos de
exercício modificou esses níveis no coração. No presente estudo o treinamento também
gerou um aumento nos níveis de proteínas carboniladas no músculo esquelético dos
animais CT na comparação com CS, e DT em comparação aos animais DS (gráfico 31). Já
os níveis de proteínas carboniladas no coração de animais CT foram maiores que CS, ao
passo que nos animais desnutridos o efeito do exercício foi o oposto, ou seja, animais DS
apresentaram valores superiores a DT (gráfico 30). Estes dados de proteínas carboniladas
no fígado contrariam os dados de Liu e cols. (2000), ou seja, o treinamento aumentou os
níveis de proteínas carboniladas, entretanto, esse fato acorreu apenas para animais
desnutridos (gráfico 29)
Ainda no trabalho de Liu e cols. (2000) foi realizada a mensuração dos níveis de
glutationa reduzida e glutationa oxidada. Os autores observaram que para o coração
houve um aumento nos níveis de glutationa reduzida apenas nos animais que realizaram
o exercício agudo e que os níveis de glutationa oxidada e a razão glutationa
oxidada/glutationa reduzida não foram modificados. No músculo esquelético eles
observaram o contrário, ou seja, diminuição nos níveis de glutationa reduzida, também
sem outras modificações.
No presente estudo não foi realizada a mensuração isolada dos níveis de
glutationa reduzida e/ou glutationa oxidada, mas foi mensurada a concentração de
glutationa total, ou seja, glutationa reduzida + glutationa oxidada. No coração dos
animais controle o treinamento também gerou um aumento na concentração de
glutationa total (gráfico 27). Já nos animais recuperados os níveis de glutationa total
foram maiores nos animais sedentários (gráfico 27). No músculo esquelético dos animais
desnutridos houve um aumento na concentração de glutationa total gerado pelo
treinamento (gráfico 28).
Kim e cols. (1996) mostraram que o exercício provocou aumento na atividade da
glutationa peroxidase hepática, além de elevar os níveis citosólicos de glutationa sem,
entretanto, modificar a atividade da superoxido dismutase. Além disso, já havia sido
90
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
mostrado que o exercício exaustivo pode causar diminuição dos níveis de glutationa
hepática e muscular (Lew e cols. 1985). No presente trabalho a concentração de
glutationa total hepática apresentou-se elevada como resultado do treinamento apenas
para os animais RT (gráfico 26).
Foi observado em camundongos que os níveis de Catalase e SOD no soro foram
elevados apenas quando os animais treinados receberam uma suplementação com
proteínas ou oligopeptídeos (massa molecular inferior a 3000 Da), ambos, derivados de
peixe de água doce (Ren e cols., 2011). Esses autores mostraram ainda que, quando
administrados na mesma dose, os peptídeos foram mais efetivos na elevação dos níveis
de SOD que a suplementação de proteínas. Eles acreditam que a maior proteção
antioxidante foi responsável pelo melhor desempenho físico dos camundongos
suplementados com os peptídeos e treinados. Somani e cols. (1995) também haviam
mostrado que tanto exercício agudo como crônico são capazes de elevar os níveis da
atividade da SOD nos glóbulos vermelhos isolados de ratos. No presente experimento o
treinamento gerou elevações nos níveis séricos de SOD apenas para animais recuperados
(gráfico 21). Powers e Lennon (1999) explicam que durante a fadiga as defesas
antioxidantes se tornam mais fracas, portanto a melhoria da atividade de enzimas
antioxidantes pode ajudar a suportar o exercício por mais tempo, atrasando a fadiga.
Também foi descrito que ratos e ratas, submetidos a uma única sessão de
exercício físico de natação com duração de uma hora sem adição de sobrepeso
apresentaram aumento na atividade da catalase no fígado, coração, rim e pulmão em
comparação aos animais sedentários. Especificamente para o fígado e coração, as
porcentagens de aumento foram de 462% e 302% para machos e 436% e 251% para
fêmeas, respectivamente (Terblanche, 1999). Aumento na atividade da catalase no fígado
por efeito do exercício também já havia sido observado por Kim e cols. (1996), da mesma
forma que também já havia sido descrito um aumento na atividade da catalase no
coração de animais que foram exercitados em uma única sessão de corrida exaustiva
(Somani e cols., 1995). No presente trabalho a atividade da catalase não foi influenciada
pelo exercício em nenhum dos três estados nutricionais e em nenhum dos órgãos
estudados (gráficos 23, 24 e 25). Baird e Samis (1971) afirmaram que em circunstâncias
91
OLIVEIRA, E. C.
DISCUSSÃO 2
normais a catalase se encontra em steady-state, ou seja, a taxa de síntese e degradação
da enzima se adapta à necessidade do momento, facilitando que a mesma se mantenha
em níveis constantes. Somani e cols., (1995) relataram que a atividade da glutationa
peroxidase no coração de ratos foi aumentada tanto pelo exercício agudo, como pelo
crônico, o que levou os autores a postular que existe a possibilidade que o grau de
estresse oxidativo causado pelo exercício agudo seja semelhante ao do exercício crônico
e que a diferença reside na maior capacidade dos tecidos de animais treinados de
combater o estresse.
92
OLIVEIRA, E. C.
CONCLUSÃO 2
CONCLUSÃO - SEGUNDO EXPERIMENTO
O treinamento de animais desnutridos causou maior estresse oxidativo no fígado
(maior peroxidação lipídica, maior oxidação de proteínas) e músculo gastrocnêmio (maior
oxidação de proteínas), ao passo que no coração desses animais causou uma diminuição
da oxidação de proteínas.
O treinamento físico aumentou o ganho de peso corporal e o peso corporal final
dos animais desnutridos sem modificar a ingestão alimentar. Já nos animais recuperados
e controles o treinamento aumentou a ingestão alimentar sem modificar o ganho de peso
corporal ou o peso corporal final.
Nos animais controle o treinamento causou maior estresse oxidativo no coração e
músculo gastrocnêmio (maior oxidação de proteínas).
Nos animais recuperados o treinamento causou maior estresse oxidativo no soro
(aumento nos níveis de SOD, diminuições nos níveis de sulfidrilas e albumina).
Conclui-se que o treinamento gerou maior estresse oxidativo no fígado e músculo
gastrocnêmio de animais desnutridos, apesar de gerar também maiores ganhos de peso
corporal e peso corporal final, além de níveis mais baixos de oxidação de proteínas no
coração. Nos animais recuperados o treinamento causou maior estresse oxidativo no soro
e nos animais controles maior estresse oxidativo no coração e no músculo gastrocnêmio.
93
OLIVEIRA, E. C.
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