Preparo de meios de cultura para ensaios de degradabilidade in vitro
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Preparo de meios de cultura para ensaios de degradabilidade in vitro
Preparo de meios de cultura para ensaios de degradabilidade in vitro: uma ideia luminosa! Romualdo S. Fukushima1*, Paul J. Weimer2, Daniel A. Kunz3 1 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP, Brasil. 2 U.S. Dairy Forage Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, and Department of Bacteriology, University of Wisconsin - Madison, Madison, Wisconsin, United States of America. 3 Department of Biological Sciences, University of North Texas, Denton, Texas, United States of America. * Autor correspondente: [email protected] Resumo O meio de cultura para o cultivo de microrganismos estritamente anaeróbios, incluindo-se os da flora do trato gastrointestinal de animais domésticos, deve ser anaeróbio. Esta condição é altamente desejável nos ensaios de degradabilidade ruminal. O aminoácido cisteína é um dos agentes redutores mais empregados para a obtenção da anaerobiose no meio de cultura, por sua ausência de toxicidade, baixo custo e facilidade de manipulação. Entretanto, a ação da cisteína é muito lenta (2-3 horas para reduzir o meio de cultura), o que torna inconveniente quando o meio é necessário com urgência ou em grandes quantidades. O tempo necessário para completa redução de meio de cultura contendo resazurina (um indicador colorido da condição redox) foi substancialmente menor quando o meio foi artificialmente iluminado com uma lâmpada incandescente. A intensidade da luz teve impacto no tempo de redução: tubos contendo meio de cultura mantidos no escuro nunca atingiram nível desejado de anaerobiose (avaliado por espectroscopia pela descoloração da resazurina) enquanto que tubos sujeitos à iluminação ordinária de laboratório foram reduzidos em cerca de 2 horas. Quando os tubos foram submetidos a alta intensidade luminosa (equivalente a uma lâmpada de 100 watts), a anaerobiose foi alcançada em menos de 20 minutos. A cisteína continuou a ser elemento necessário para a descoloração da resazurina. Evidências de que a anaerobiose foi atingida com sucesso foi a constatação de que cinco cepas de bactérias ruminais, quatro espécies de Clostridium e uma de Thermoanaerobacter exibiram semelhante crescimento (em termos de lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo) em meio de cultura reduzido através de alta iluminação ou em meio reduzido da maneira convencional. Foi demonstrada direta correlação entre o efeito fotocatalítico e decréscimo no teor de oxigênio dissolvido no meio de cultura. Palavras-chave: anaerobiose, cisteína, luz, meio de cultura, resazurina Introdução O cenário mais provável para a origem e evolução da vida, aponta para uma atmosfera ausente de oxigênio. Portanto, os primeiros microrganismos seriam anaeróbios (Wächtershäuser, 2000). Após o aparecimento de O2, vários ambientes anaeróbios foram preservados, o que permitiu a sobrevivência de microrganismos capazes de utilizarem substratos através das vias fermentativas e processos de respiração anaeróbia (Huber & Wächtershäuser, 1998). Nos dias atuais, ecosistemas anaeróbios continuam largamente distribuídos no mundo e incluem estuários, pântanos, e ambientes controlados pelo homem (aterros sanitários, tonéis de fermentação – etanol, digestores de resíduos animais) bem como o trato gastrointestinal do homem e animais domésticos (Hobson, 1988; Hungate, 1950). Ainda, muitos microrganismos anaeróbios são patógenos, com sérias implicações nas saúdes humana e animal. Enquanto que algumas espécies de microrganismos toleram breves exposições ao oxigênio (anaeróbios facultativos), outras espécies podem ser mortas apenas por breve exposição. Cultivo destas cepas requerem, portanto, meios de cultura com total ausência de oxigênio. Preparo de meios para anaeróbios estritos tipicamente envolve extenso borbulhamento com gás carbônico (CO2) para deslocar o O2 dissolvido e rígido selamento com rolhas de borracha especiais (Hungate, 1950; Balch & Wolfe, 1976). Além disso, muitas cepas bacterianas requerem agentes redutores; alguns, como o ditionito de sódio, agem rapidamente, mas geram produtos tóxicos. Outros, como o sulfito de sódio, precipitam metais essenciais e são relativamente tóxicos para muitas bactérias ruminais. Sais de titânio (III) são tidos como atóxicos, mas são caros e de difícil manuseio. O aminoácido cisteína (Cys) é frequentemente utilizado como agente redutor pelo seu baixo custo, baixa toxicidade e ausência de efeitos colaterais indesejáveis. Entretanto, a velocidade com que ela reduz o meio de cultura é muito baixa, várias horas (tipicamente, 2-3 horas). Para auxiliar na detecção da condição anaeróbia, um indicador colorido, a resazurina (RNO), é usado. Uma observação empírica que uma técnica de laboratório de microrganismos ruminais (P. A. Tirabasso) fez ao autor correspondente deste artigo, de que o preparo de meios eram mais rápidos em dias ensolarados do que em dias nublados, inspirou-nos a examinar os efeitos da luz no preparo de meios de cultura dependentes de Cys e usando RNO como indicador (Fukushima et al., 2002; 2003). Muito embora há trabalhos na literatura descrevendo ações da RNO em algumas situações (Prütz et al., 1996; Rasmussen & Nicolaisen, 1999), não há nenhuma descrição de ação fotolítica da Cys sobre a RNO em promover anaerobiose e assim, acelerar a confecção de meios de cultura para microrganismos anaeróbios. Material e métodos Os materiais e métodos que foram empregados nos trabalhos de Fukushima et al. (2002; 2003) são descritos a seguir: Efeito da intensidade luminosa No experimento que avaliou o efeito da intensidade luminosa, os meios de cultura foram acondicionados em tubos de vidro e hermeticamente selados com rolhas de borracha próprios para o cultivo de microrganismos anaeróbios. Foi empregado o meio de cultura proposto por Scott & Dehority (1965) – 10 mL. Como indicador redox, foi usado RNO na concentração de 2,0 mg/L. Cada tubo foi inoculado com 0,4 mL de uma solução estoque de cloridrato de cisteína (2,5% m/v). Os meios basais continham ainda minerais e ácidos graxos voláteis, além de outros nutrientes. A iluminação dos tubos foi realizada com duas lâmpadas de halogênio (500 W cada), montadas em um suporte, posicionando as lâmpadas em ângulo de 45° e a 40 cm da bancada, em um laboratório totalmente desprovido de luz. Os tubos foram iluminados com seis intensidades de luz (seis tratamentos, quatro tubos cada tratamento); a intensidade luminosa, controlada através de um reostato e um fotodetector, variou de 0 (escuro), 10, 45, 90, 180 a 360 μE/m2 × s (E = Einstein, unidade de intensidade luminosa). Borbulhamento com CO2 foi de 90 minutos para todos tubos, antes da exposição luminosa. As leituras de absorbâncias (540 nm) foram realizadas a cada dois minutos, em um espectrofotômetro. Efeito do tempo de gaseamento com CO2 No experimento avaliando o efeito do tempo de borbulhamento com gás CO2 no meio de cultura, os tempos foram de 15, 30, 45, 60, 75 ou 90 minutos. Note-se que o CO2 deve ser isento de O2, o que é obtido pela passagem forçada do gás CO2 através de uma coluna de vidro contendo filamentos de cobre arranjados em uma resistência elétrica, sendo então aquecidos a alta temperatura. Neste experimento, os tubos foram submetidos a duas situações de exposição de luz: 360 μE/m2 × s (alta intensidade luminosa) ou zero de luz (escuro). Leituras de absorbância foram registradas a cada dois minutos para os tubos da alta luminosidade e a cada 30 minutos para os tubos mantidos no escuro. Monitoramento de oxigênio dissolvido Objetivando verificar se a redução do meio de cultura contend Cys e RNO, catalizada pela irradiação luminosa, foi acompanhada pelo concomitante desaparecimento do oxigênio dissolvido, o teor de oxigênio foi mensurado através de um eletrodo, na presença e ausência de iluminação. Crescimento microbiano Nos meios de cultura experimentais, foram cultivados microrganismos tipicamente da flora ruminal (Lachnospira multipara, Prevotella ruminicola, Ruminococcus flavefaciens, Selenomonas ruminantium e Streptococcus bovis), bactérias do grupo Clostridium (Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum e Clostridium perfringens) e uma bactéria encontrada em sedimentos de gêisers (Thermoanaerobacter saccharolyticum). O meio de cultura para o cultivo de bactérias ruminais foi um meio celulolítico (Weimer et al., 1984); para o experimento com o grupo de bactérias dos gêneros Clostridium e Thermoanaerobacter, foi empregado o meio de cultura proposto por Scott & Dehority (1965). Duas condições experimentais foram testadas: após a adição de todos reagentes, incluindo Cys, os tubos foram expostos a alta intensidade luminosa (370-380 μE/m2 × s) ou baixa intensidade luminosa, cerca de 10 μE/m2 × s, que foi o valor detectado na bancada de um laboratório convencional com lâmpadas fluorescents no teto. Após o tratamento luminoso, um inóculo microbiano de 0,3 mL, proveniente de uma cultura estoque, foi injetado em cada tubo, aquecido a 39°C. Os conteúdos dos tubos foram misturados por inversão antes das leituras de absorbância a 540 nm. Os parâmetros relativos ao desenvolvimento microbiano, lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo foram calculados a partir dos valores de absorbância. Resultados e Discussão Efeito da intensidade luminosa A luz teve substancial efeito na redução dos meios de cultura (Fig. 1). Nas duas maiores intensidades (360 e 180 μE/m2 × s) virtualmente total redução ocorreu em menos de 20 minutos. Para fins de comparação, uma lâmpada incandescente de 100 W irá produzir uma intensidade luminosa de cerca de 370 μE/m2 × s, medido a 11 cm da fonte luminosa. Os tubos mantidos no escuro ou aqueles que receberam 10 μE/m2 × s (que é a típica iluminação de um laboratório convencional), nunca alcançaram redução durante o periodo de avaliação, constatação que comprova a observação rotineira de que os tubos só alcançam o necessário grau de anaerobiose após 2-3 horas de gaseamento com CO2. Rasmussen & Nicolaisen (1999) observaram insignificante aumento nos níveis de RNO reduzido nos meios de cultura de células de mamíferos mantidos durante dois dias no escuro. Figura 1. Efeito da intensidade da luz (μE/m2 × s) no tempo da redução fotocatalítica da resazurina pela cisteína. O tempo necessário para totalmente reduzir a RNO foi diretamente proporcional à intensidade da luz (Fig. 2). Em outras palavras, até o limite testado, quanto maior foi a intensidade luminosa, mais rápida foi a reação fotocatalítica. 3 Y = 2.42 – 0.533X R2 = 0.968 2 Log T 1 0 0 1 2 3 Log I Figura 2. Efeito da intensidade da luz no tempo necessário para totalmente reduzir a resazurina. Não houve diferenças quanto ao tipo de luz empregada para reduzir a RNO. Tanto a lâmpada incandescente como a fluorescente, na intensidade de 10 μE/m2 × s, tiveram o mesmo comportamento (Fig. 3). Desta maneira, a hipótese de influência do calor irradiado da lâmpada incandescente é infundada. Entretanto, a presença do agente catalílico Cys foi essencial, para ambos tipos de lâmpadas. A redução do meio é resultante da doação de elétrons que ocorre quando da união covalente de duas moléculas de Cys para formar a cistina. Entretanto, o papel mediado pela luz e o mecanismo pela qual ela acelera a redução da Figura 3. Influências do tipo de lâmpada e presença do agente redutor cisteína. RNO pela Cys, ainda é desconhecido. Observe-se que a intensidade de luz testada foi de 10 μE/m2 × s, o que explica que redução total não foi alcançada nas duas horas que durou o experimento. Rasmussen & Nicolaisen (1999) observaram que a redução da RNO em meio de cultura de células mamíferas foi significativamente aumentada pela exposição à luz fluorescente, 8 horas por dia, portanto estes autores recomendaram que tais meios de cultura sejam minimamente expostos à luz. Foi demonstrado que a RNO catalizou eficientemente a fotoxidação de outros agentes redutores, tais como NADH, GSH, e dopamina (Prütz et al., 1996). Polímeros produzidos ao aquecer aminoácidos em um meio marinho modificado catalizaram a reação entre desidrogenação do NADH e redução da RNO, e esta reação foi também acelerada pela luz (Okihana, 1982). Efeito do tempo de borbulhamento O borbulhamento do meio de cultura com CO2 é feito objetivando o deslocamento do O2 dissolvido, e a concentração de CO2 dissolvido é dependente do tempo de gaseificação, até alcançar um plateau de saturação. Quando os tubos foram mantidos no escuro, o tempo de borbulhamento não teve influência na redução da RNO pela Cys (Fig. 4, painel superior) e nunca alcançaram redução, mesmo após 20 horas de monitoramento. Entretanto, sob alta intensidade luminosa, a redução da RNO foi mais rápida (10 min) nos tubos gaseificados por 75 min do que naqueles borbulhados por 45 ou 15 min (20 e 30 min, respectivamente) (Fig. 4, painel inferior). Figura 4. Efeito do tempo de gaseificação com CO2 no tempo de redução dos meios de cultura. Painel superior: tubos mantidos no escuro; painel inferior: tubos que foram expostos à luz. Sumarizando, houve efeito positivo do tempo de borbulhamento de CO2 na redução do meio. Entretanto, o tempo menor de borbulhamento, 15 minutos, foi rapidamente compensado no tempo de estabelecimento da anaerobiose, de apenas 20 minutos. Estabelecese nesta observação não apenas a vantagem do tempo como também economia no consumo do gás CO2. Prütz et al. (1996) observaram que com a iluminação de uma solução saturada de N2, a RNO foi eficazmente descolorida, com concomitante aumento de sua forma oxidada e perda de NADH. Estes autores também reportaram que adição de O2 ao tampão causou drástica queda na reação fotocatalítica, particularmente nas taxas de redução da RNO. Monitoramento do desaparecimento de O2 Objetivando estabelecer se a aceleração da redução do meio de cultura catalizada pela exposição a alta intensidade luminosa, na presença de Cys e RNO, era acompanhada pela concomitante queda no teor de O2 dissolvido, foi conduzido um ensaio onde o efeito da luz no consumo de O2 foi avaliado através de um eletrodo. O raciocínio simples implicava que poderia ocorrer redução no meio de cultura e o teor de O2 dissolvido mudar pouco, fato que inviabilizaria o crescimento de microrganismos anaeróbios. Na Fig. 5 pode-se visualizar que inicialmente a luz não teve efeito na redução, provavelmente porque o meio de cultura fora previamente saturado com ar comprimido, portanto, o meio estava com alta concentração de O2 dissolvido. Destaque-se que esta fora uma situação artificial, objetivando apenas avaliar uma situação extrema, que não seria o rotineiro em um laboratório. Esta constatação, entretanto, enfatiza a importância de parcial redução do meio, que é facilmente obtida com apenas 15 min de borbulhamento com CO2 (Fig. 4). Após parcial redução ser atingida, o consumo de O2 foi fortemente influenciado pela luz, de tal maneira que são visíveis os efeitos de “luz acesa” e “luz apagada” (Fig. 5). Esta observação encontra respaldo na resposta redutora à iluminação (Fig. 1). Em outras palavras, de fato ocorre redução no teor de O2 dissolvido quando o meio de cultura é iluminado. Figura 5. Efeito da incidência da luz no consumo de O2 dissolvido no meio de cultura. Crescimento microbiano Enquanto que os experimentos anteriores estabeleceram claramente a efetividade da luz na redução da RNO, na presença de Cys, e concomitante desaparecimento do O2 dissolvido no meio, ainda era necessário provar que microrganismos anaeróbios poderiam crescer tão bem em meio exposto à alta radiação luminosa como no meio preparado de maneira convencional. Portanto, em um experimento (Fukushima et al., 2002) cinco cepas de bactérias ruminais foram cultivadas em meio reduzido a alta (360 μE/m2 × s) ou baixa intensidade luminosa (laboratório convencional - 10 μE/m2 × s). Em um outro experimento (Fukushima et al., 2003) três cepas de Clostridium e uma de Thermoanaerobacter foram testados. Para todas as cepas ensaiadas, não houve diferenças significativas entre as duas intensidades de luz em termos de lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo (Tab. 1). Os dados indicam que os benefícios advindos de iluminar o meio de cultura com uma lâmpada para acelerar o seu preparo não comprometem a utilidade do meio. Este mesmo procedimento pode ser generalizado e empregado em outras situações onde há cultivo de microrganismos anaeróbios (ou anaeróbios facultativos) fermentadores, tais como ensaios de degrabilidade ruminal, estudos em saneamento básico, produção de etanol de primeira geração, cervejarias, indústrias vinícolas, etc., onde se deseja processos fermentativos mais rápidos e otimização dos processos industriais. Tabela 1. Crescimento de bactérias anaeróbias em meios de cultura preparados de maneira convencional (Baixa intensidade luminosa) ou alta intensidade luminosa (Alta) Lag time Bactéria Baixa Taxa de crescimento Crescimento máximo (h-1) (OD540) Alta Baixa Alta Baixa Alta Lachnospira multipara 3.25±0.47 3,04±0,47 0,49±0,06 0,46±0,06 1,18±0,05 1,17±0,03 Prevotella ruminicola 0,08±0,03 0,25±0,3 0,56±0,02 0,56±0,03 1,41±0,01 1,42±0,03 Ruminococcus flavefaciens 1,76±0,93 0,93±0,72 0,27±0,01 0,27±0,01 0,7±0,04 0,79±0,06 Selenomonas ruminantium 1,22±0,24 1,09±0,06 0,61±0,01 0,61±0,03 1,19±0,03 1,21±0,04 Streptococcus bovis 1,57±0,18 1,33±0,16 1,23±0,03 1,23±0,03 1,41±0,04 1,37±0,03 Clostridium butyricum 3,3±0,5 3,0±1,2 0,49±0,06 0,46±0,06 1,18±0,05 1,17±0,03 Clostridium pasteurianum 0,08±0,03 0,25±0,3 0,56±0,02 0,56±0,03 1,41±0,01 1,42±0,03 Clostridium perfringens 1,76±0,93 0,93±0,72 0,27±0,01 Thermoanaerobacter saccharolyticum 1,22±0,24 1,09±0,06 0,61±0,01 0,61±0,03 1,19±0,03 1,21±0,04 0,27±0 0,7±0,04 0,79±0,06 Conclusões Intensa iluminação (por exemplo, com uma ordinária lâmpada de 100 W) de meio de cultura para microrganismos anaeróbios contendo Cys como agente redutor e RNO como indicador redox conduz a rápida obtenção da anaerobiose. Ao lado do tempo economizado (2-3 horas pelo método convencional versus 20-25 minutos usando a lâmpada), outras vantagens incluem redução do tempo de gaseificação do meio de cultura com CO2 e eliminação da purga de O2 contido no gás CO2 pela passagem forçada de CO2 através de filamentos de cobre superaquecidos. Esta aceleração no preparo do meio de cultura não resulta na formação de compostos inibitórios, pois o crescimento (medido em termos de lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo) de bactérias estritamente anaeróbias foi o mesmo do obtido com o meio de cultura preparado de maneira convencional, sob baixa intensidade luminosa. Desta forma, nós sugerimos a utilização desta simples técnica, que em nada afeta a rotina do laboratório, para acelerar o preparo de meios de cultura para bactérias anaeróbias. Referências Balch W.E.; Wolfe R.S. New approach to the cultivation of methanogenic bacteria: 2mercaptoethanesulfonic acid (HS-CoM)-dependent growth of Methanobacterium ruminatium in a pressurized atmosphere. Applied Environmental Microbiology, v.32, p.781–791, 1976. Fukushima, R.S.; Weimer, P.J.; Kunz, D. Photocatalytic interaction of resazurin N-oxide with cysteine optimizes preparation of anaerobic culture medium. Anaerobe, v.8, p.29-34, 2002. Fukushima, R.S.; Weimer, P.J.; Kunz, D. Use of photocalytic reduction to hasten preparation of culture media for saccharolytic clostridium species. Brazilian Journal of Microbiology , v.33, p.1-5, 2003. Hobson, P.N. The rumen microbial ecosystem. Elsevier, New York, 1988, 527p. Huber, C.; Wächtershäuser, G. Peptides by activation of amino acids with CO on (NiFe)S surfaces: implications for the origin of life. Science, v.281, p. 670-672, 1998. Hungate R.E. The anaerobic, mesophilic, cellulolytic bacteria. Bacteriological Reviews, v.14, p.1–49, 1950. Okihana H. Formation and catalytic activity of high molecular weight soluble polymers produced by heating amino acids in a modified sea medium. Origins of Life, v.12, p.153– 163, 1982. Prütz W.A.; Butler J.; Land E.J. Photocatalytic and free radical interactions of the heterocyclic N-Oxide resazurin with NADH, GSH and Dopa. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.327, p.239–248, 1996. Rasmussen E.S.; Nicolaisen G.M. Stability of resazurin in buffers and mammalian cell culture media. In Vitro Molecular Toxicology, v.12, p.195–202, 1999. Scott H.W.; Dehority B.A Vitamin requirements of several cellulolytic rumen bacteria. Journal of Bacteriology, v.89, p.1169–1175, 1965. Wächtershäuser, G. Life as we don’t know it. Science, v.289, p.1307-1308, 2000. Weimer, P.J.; Wagner, L.W.; Knowlton, S.; Ng, T.K. Thermophilic anaerobic bacteria which ferment hemicellulose: characterization of organisms and identification of plasmids. Archives of Microbiology, v.138, p.31- 36, 1984.