107 Expressão de DegP de Escherichia coli e

Expressão de DegP de Escherichia coli e caracterização
de sua atividade de chaperona e protease
Giovanna Adamov Trevisan1,2, Ana Paula Mattos Arêas1,3
1
Universidade Federal do ABC
2
[email protected], [email protected]
Resumo: DegP é uma enzima de uma família de proteínas conservada e
importante na sobrevivência de bactérias. Neste projeto, esta proteína
será expressa em Escherichia coli recombinante e caracterizada quanto
às suas atividades de protease e chaperona dependentes de temperatura.
Na primeira parte do projeto, uma extensiva busca bibliográfica e
ferramentas de Bioinformática deverão auxiliar a coletar informações
importantes sobre a proteína em termos de estrutura e função.
Palavras chave: DegP, protease, chaperona, HtrA.
1. Introdução
A DegP é uma proteína conservada de choque térmico (uma HtrA de
Escherichia coli) que, dependendo da temperatura, possui dupla função: pode atuar
tanto como protease, em temperaturas mais elevadas, quanto como chaperona, em
temperaturas mais baixas. Em situações de estresse, num primeiro momento, DegP atua
como chaperona, na tentativa de evitar a perda de conformação de determinadas
proteínas ou recuperar proteínas desnaturadas pelo calor. Se a tentativa de renaturação
falhar, então DegP degradará essas proteínas, atuando como protease (Krojer e
colaboradores, 2002). Como E. coli possui um genoma compacto, a função de
chaperona e de protease é realizada pela mesma proteína, fazendo com que o gasto
energético de expressão desta em situações de estresse seja menor.
A atividade proteolítica da DegP aumenta rapidamente entre as temperaturas de
32ºC e 42ºC, enquanto ela é significantemente reduzida a baixas temperaturas e é
inibida apenas por DFP (diisopropilfluorofosfato). (Kim e Kim, 2005; Skorko-Glonek e
colaboradores, 2007)
1.1. DegP atua sem consumir ATP
As primeiras chaperonas descritas foram as Hsp (heat shock protein), proteínas
de choque térmico. São assim chamadas, pois sua taxa de síntese é aumentada com o
aumento da temperatura. Chaperonas reconhecem domínios hidrofóbicos que estão
expostos na superfície em seu estado não-nativo. Muitas chaperonas são ATPases, isto
é, enzimas que catalisam a hidrólise de ATP (adenosina trifosfato) em ADP (adenosina
difosfato) e Pi (fosfato inorgânico) (Voet e colaboradores, 2005). Enquanto a maioria
das proteínas de choque térmico envolvidas no controle de qualidade são proteínas
dependentes de ATP, DegP atua sem consumir ATP (Kim e Kim, 2005; Krojer e
colaboradores, 2002), que é uma característica de extremo interesse quando se pretende
trabalhar in vitro, já que, numa solução aquosa, o ATP seria rapidamente hidrolisado.
2.
Objetivo
Uma vez que o foco desta parte projeto é a caracterização da proteína DegP de
E.coli, antes da Parte Experimental, alguns dados desta proteína foram obtidos para o
bom desenvolvimento do projeto.
3.
Metodologia
A busca de artigos científicos sobre a DegP foi realizada no portal NCBI (National
Center for Biotechnology Information): www.ncbi.nlm.nih.gov.
O portal de Proteômica Expasy (Expert Protein Analysis System): www.expasy.ch
foi utilizado para a obtenção de pI (ponto isoelétrico), Massa Molecular, composição de
aminoácidos, estruturas secundárias, entre outras informações da proteína.
Após a caracterização da proteína, utilizando ferramentas de Bioinformática, a
proteína será expressa em E. coli recombinante e a sua atividade será estudada in vitro.
4.
Resultados e Discussão
4.1. Estrutura primária e secundária
O monômero de DegP tem 474 resíduos de aminoácidos e pode ser divido em:
sequência sinalizadora (resíduos 1-26), protease (resíduos 27-474), domínio PDZ1
(resíduos 280-371) e domínio PDZ2 (resíduos 377-466) (Expasy, indicação P0C0V0).
Além disso, o domínio protease contém uma região de inserção, chamada Q-Linker
(representada por Q na Figura 1).
Figura 1: Diagrama esquemático do arranjo dos domínios da proteína DegP. O
domínio da protease está colorido em azul claro, PDZ1 em vermelho, PDZ2 em azul
escuro e o Q-linker em verde claro. S indica seqüência sinalizadora. Q indica a região
de inserção (Q-linker). Figura adaptada de Kim e Kim, 2005.
Desconsiderando os resíduos de aminoácidos da sequência sinalizadora e
iniciando a contagem a partir do domínio Protease, os resíduos de aminoácidos nas
posições His105, Asp135 e Ser210 constituem uma tríade catalítica, sendo a DegP uma
serino-protease. (Lipinska e colaboradores, 1998; Krojer e colaboradores, 2002; Kim e
Kim, 2005)
A DegP possui apenas três tipos de estruturas secundárias, sendo: 9 Helix (ou αhélice), 24 Beta strand (ou folha-β) e 5 Turn (ou β-turn). (Expasy, indicação P0V0C0)
4.2. Estrutura terciária e quaternária
Para que a proteína DegP tenha função, seis de seus monômeros interagem entre
si formando um hexâmero. A formação do hexâmero ocorre via dimerização de
trímeros. (Krojer e colaboradores, 2002)
4.2.1. Domínio Protease e Q-Linker
O Q-linker, contido no domínio protease, é responsável pela interação entre os
trímeros de DegP para que ocorra a dimerização, formando assim o hexâmero de DegP.
A estrutura Loop LA, que corresponde ao Q-Linker, consiste num longo laço que se
projeta para fora, de dentro do sítio ativo, para a subunidade oposta. Loop LA é o
principal elemento na dimerização de trímeros. LA* é um Loop (laço) que pertence à
subunidade do trímero oposto. LA e LA* formam uma subunidade de folha-β. Desta
forma, o Loop LA da DegP forma uma parede lateral da cavidade proteolítica, que é
requerida para a diferenciação de substratos. (Kim e Kim, 2005)
4.2.2. Domínios PDZ
Domínios PDZ medeiam interações proteína-proteína. O hexâmero de DegP existe
em duas conformações, que representam dois estados funcionais diferentes. Esses
estados funcionais são regulados por 12 domínios PDZ do hexâmero (cada monômero
possui dois domínios PDZ) que quando abertos têm atividade de protease e quando
fechados têm função de chaperona. (Krojer e colaboradores, 2002)
O hexâmero de DegP forma uma cavidade interna e restringe o acesso do substrato
ao sítio ativo, que está localizado dentro da cavidade. Ou seja, os domínios PDZ
funcionam como porteiros da cavidade proteolítica. (Kim e Kim, 2005)
5.
Conclusão
A partir de uma busca bibliográfica detalhada, foi possível obter maiores
informações sobre como a proteína DegP é estruturada e como o enovelamento da
proteína ocorre, para que a realização do projeto em laboratório, como expressão e
caracterização desta proteína, seja mais eficiente.
6.
Referências Bibliográficas
Expasy Proteomics Server: http://www.uniprot.org/uniprot/P0C0V0. Acessado em
15/09/2009.
Kim, D.Y. e Kim, K.K. (2005) Structure and Function of HtrA Family Proteins, the Key
Players in Protein Quality Control. Journal of Biochimestry and Molecular
Biology, 38 (3): 266-274.
Krojer, T.; Garrido-Franco, M.; Huber, R.; Ehrmann, M. e Clausen, T. (2002) Crystal
structure of DegP (HtrA) reveals a new protease-chaperone machine. Nature. 416
(6879): 455-459.
Lipinska, B.; Zylicz, M. e Georgopoulos, C. (1998) The HtrA (DegP) Protein, Essential
for Escherichia coli Survival ate High Temperatures, Is an Endopeptidase. Journal
of Bacteriology. 172 (4): 1791-1797.
Skorko-Glonek, J.; Laskowska, E.; Sobiecka-Szkatula, A. e Lipinska, B. (2007)
Characterization of the chaperone-like activity of HtrA (DegP) protein from
Escherichia coli under the conditions of heat shock. Archives of Biochemistry and
Biophysics, 464: 80-89.
Voet, D.; Voet, J. e Pratt, C.W. (2005) Proteins: Three Dimensional Structure. Em
Fundamentals of Biochemistry, 2nd ed., John Wiley & Sons, cap. 6, p. 129-170.